JP2020505934A - 異常ヘモグロビン症の治療用組成物及び方法 - Google Patents

異常ヘモグロビン症の治療用組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、異常ヘモグロビン症の治療のためのゲノム編集システム、試薬及び方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４５５，４６４号明細書に対する優先権を主張し、この出願の全体は、その全体が参照により本明細書に援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に援用される。２０１８年１月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７６０３−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２５８，８３７バイトのサイズである。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム型リピート））は、細菌においてウイルスの攻撃を防御するための適応免疫システムとして進化した。ウイルスへの曝露時、ウイルスＤＮＡの短いセグメントが細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含むこのＲＮＡがウイルスゲノム中の配列へのＣａｓ９タンパク質のターゲティングを媒介する。Ｃａｓ９タンパク質がウイルス標的を切断し、それによってサイレンシングする。
近年、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが真核細胞のゲノム編集に応用されるようになっている。部位特異的一本鎖切断（ＳＳＢ）又は二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入により、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて標的配列を改変することが可能になる。
理論によって拘束されるものではないが、本発明は、一部には、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることにより、修飾された細胞の例えば子孫、例えば赤血球細胞子孫において胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現が増加し、及び／又はβグロビン（例えば、疾患原因突然変異を有するβグロビン遺伝子）の発現が低下するように、例えば本明細書に記載されるとおりの非欠失ＨＰＦＨ領域において細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ））を修飾することができ、修飾された細胞（例えば、修飾ＨＳＰＣ）を用いることにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病及びβサラセミアを治療し得るという発見に基づく。一態様において、ＨＰＦＨ突然変異又は欠失地図が不明であるゲノムの領域を標的とする、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）への、例えば本明細書に記載されるとおりの遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲシステムの導入により、生物中に効率的に生着し、生着された生物中で長期間持続し、（増加した胎児ヘモグロビン発現を有する赤血球細胞への分化を含めて）分化することが可能な修飾ＨＳＰＣ（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ以上のインデルを含むＨＳＰＣ）が生成されることが意外にも示された。さらに、これらの修飾ＨＳＰＣは、幹細胞性を維持しながら幹細胞を増加及び増殖させる条件下、例えば（例えば、本明細書に記載されるとおりの）幹細胞増殖剤の存在下においてエキソビボで培養されることが可能である。例えば、本明細書に記載されるとおりの遺伝子編集システム、例えばＣＲＩＳＰＲシステムが、鎌状赤血球病患者に由来するＨＰＳＣ中に導入される場合、修飾された細胞及びその子孫（例えば、赤血球系子孫）は、意外にも、胎児ヘモグロビンの上方制御を示すだけでなく、非修飾細胞集団に対して鎌状βグロビンの有意な減少並びに鎌状赤血球の数の有意な減少及び正常赤血球の数の増加も示す。
したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム）を提供する。かかるシステム並びに本明細書に記載される方法及び細胞では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子のいずれも使用し得る。
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、
ａ）非欠失ＨＦＰＨ領域（例えば、ヒト非欠失ＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的であり；
ｂ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｃ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｄ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｅ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｆ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｇ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｈ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；又は
ｉ）これらの組み合わせ
である標的化ドメインを含む。
実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号７２のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、ａ）配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１若しくは配列番号６７；又はｂ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号５４のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号６７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、上記の配列のいずれかの断片を含む（例えば、それからなる）標的化ドメインを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される領域及び／又は特性をさらに有し得る。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、前述の標的化ドメインのいずれかの断片を含む。実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’又は３’核酸のいずれも含まない。実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列からなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｃｒＲＮＡの一部分及びｔｒａｃｒの一部分は、ハイブリダイズして配列番号１８２又は１８３を含むフラッグポールを形成する。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は、配列番号１８４を含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部及び存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は、配列番号１８５を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｔｒａｃｒは、配列番号２２４又は配列番号２２５を含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｔｒａｃｒは、任意選択で、さらなる１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む配列番号２３２を含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｃｒＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：ａ）配列番号１８２；ｂ）配列番号１８３；ｃ）配列番号１９９；ｄ）配列番号２００；ｅ）配列番号２０１；ｆ）配列番号２０２；又はｇ）配列番号２２６を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｔｒａｃｒは、５’から３’に、ａ）配列番号１８７；ｂ）配列番号１８８；ｃ）配列番号２０３；ｄ）配列番号２０４；ｅ）配列番号２２４；ｆ）配列番号２２５；ｇ）配列番号２３２；ｈ）配列番号２２７；ｉ）（配列番号２２８；ｊ）配列番号２２９；ｋ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；ｌ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｋ）のいずれか；又はｍ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを５’末端に（例えば、５’側端に）さらに含む上記ａ）〜ｌ）のいずれかを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置される。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置され、標的化ドメインを含む核酸分子は、任意選択で標的化ドメインの直ちに３’側に配置された配列番号２０１を含み、ｔｒａｃｒを含む核酸分子は、配列番号２２４を含む、例えばそれからなる。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号２０１又は配列番号２０２を含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｔｒａｃｒは、配列番号１８７又は１８８及び任意選択で第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号１８７又は１８８の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部であって、配列番号１８９を含む第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、例えば、ｔｒａｃｒは、標的化ドメインの３’側に配置される。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側且つｔｒａｃｒの５’側に配置されたループを含む。実施形態において、ループは、配列番号１８６を含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：（ａ）配列番号１９５；（ｂ）配列番号１９６；（ｃ）配列番号１９７；（ｄ）配列番号１９８；（ｅ）配列番号２３１；又は（ｆ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記核酸分子は、前記標的化ドメイン及び任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置された配列番号２３１を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ分子を含む核酸分子の１つ又は任意選択で２つ以上は、
ａ）前記１つ又は複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｂ）前記１つ又は複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｃ）前記１つ又は複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｄ）前記１つ又は複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｅ）前記１つ又は複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；
ｆ）前記１つ又は複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の５’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；又は
ｆ）これらの任意の組み合わせ
を含む。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号７４；
（ｂ）配列番号７５；又は
（ｃ）配列番号７６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号７９；
（ｂ）配列番号８０；又は
（ｃ）配列番号８１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号８３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号８３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号８４；
（ｂ）配列番号８５；又は
（ｃ）配列番号８６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号８７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号８７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号８８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号８８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号８９；
（ｂ）配列番号９０；又は
（ｃ）配列番号９１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号９２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号９２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号９４；
（ｂ）配列番号９５；又は
（ｃ）配列番号９６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号９９；
（ｂ）配列番号１００；又は
（ｃ）配列番号１０１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１０２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１０２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１０３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１０３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１０４；
（ｂ）配列番号１０５；又は
（ｃ）配列番号１０６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１０８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１０８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１０９；
（ｂ）配列番号１１０；又は
（ｃ）配列番号１１１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１１２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１１２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１１３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１１３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１１４；
（ｂ）配列番号１１５；又は
（ｃ）配列番号１１６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１１７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１１７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１１８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１１８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１１９；
（ｂ）配列番号１２０；又は
（ｃ）配列番号１２１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１２２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１２２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１２３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１２３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１２４；
（ｂ）配列番号１２５；又は
（ｃ）配列番号１２６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１２７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１２７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１２８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１２８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１２９；
（ｂ）配列番号１３０；又は
（ｃ）配列番号１３１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１３２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１３２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１３３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１３３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１３４；
（ｂ）配列番号１３５；又は
（ｃ）配列番号１３６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１３７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１３７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１３８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１３８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１３９；
（ｂ）配列番号１４０；又は
（ｃ）配列番号１４１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１４２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１４２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１４３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１４３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１４４；
（ｂ）配列番号１４５；又は
（ｃ）配列番号１４６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１４７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１４７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１４８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１４８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１４９；
（ｂ）配列番号１５０；又は
（ｃ）配列番号１５１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１５２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１５２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１５４；
（ｂ）配列番号１５５；又は
（ｃ）配列番号１５６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１５９；
（ｂ）配列番号１６０；又は
（ｃ）配列番号１６１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１６３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１６３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１６４；
（ｂ）配列番号１６５；又は
（ｃ）配列番号１６６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１６７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１６７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１６８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１６８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１６９；
（ｂ）配列番号１７０；又は
（ｃ）配列番号１７１
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１７２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１７４；
（ｂ）配列番号１７５；又は
（ｃ）配列番号１７６
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
ある態様において、本発明は、配列：
（ａ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子を提供する。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、
ａ）ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；及び／又は
ｂ）ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域においてｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域においてｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間に形成される。実施形態において、インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、集団の細胞の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、インデルは、ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチド又はＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。実施形態において、集団の細胞の少なくとも約１５％は、ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデル及びＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む。前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む集団の細胞のパーセンテージは、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％だけ、ＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む集団の細胞のパーセンテージと異なる。実施形態において、インデルは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって計測される。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加される。実施形態において、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、前記集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団におけるＦ細胞のパーセンテージは、ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団におけるＦ細胞のパーセンテージに対して少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約２５％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％増加する。実施形態において、前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部（例えば、遺伝子、例えば遺伝子のコード領域内）のオフターゲットインデルは、形成されない。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部（例えば、遺伝子、例えば遺伝子のコード領域内）のオフターゲットインデルは、細胞の集団の細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない。
前述の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり（又は細胞の集団は、それを含み）、例えばヒト細胞であり、例えば、細胞は、ＨＳＰＣであり（又は細胞の集団は、それを含み）、例えば、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋であり、例えばＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である。実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来である。他の実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって同種異系由来である。
ある態様において、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、ゲノム編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）及び／又は方法は、以下の特性の１つ以上を含むか又はそれをもたらす、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞に関する：
（ａ）本明細書に記載される細胞の集団の細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、インデルは、表２〜７に示されるインデルから選択され、任意選択で、集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
（ｂ）本明細書に記載される細胞（例えば、細胞の集団）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
（ｃ）本明細書に記載される細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；
（ｄ）本明細書に記載される細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｅ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、本明細書に記載される細胞において形成されず、例えば、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部（例えば、遺伝子、例えば遺伝子のコード領域内）のオフターゲットインデルは、形成されず；
（ｆ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部（例えば、遺伝子、例えば遺伝子のコード領域内）のオフターゲットインデルは、本明細書に記載される細胞の集団の細胞の約５％超、例えば、約１％超、例えば、約０．１％超、例えば、約０．０１％超において検出されず；
（ｇ）本明細書に記載される細胞又はその子孫は、任意選択で、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、移植後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、それを移植される患者で検出可能、例えば骨髄で検出可能又は末梢血で検出可能であり、任意選択で、インデルは、表２〜７に示されるインデルから選択され、任意選択で、インデルは、大規模欠失インデルであり；
（ｈ）本明細書に記載される細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対して低下した割合の鎌状赤血球（例えば、鎌状赤血球の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低い割合）を含み；及び／又は
（ｉ）本明細書に記載される細胞又は細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対して低下したレベル（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低いレベル）の鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）を産生する細胞を含む。
ある態様において、本発明は、
１）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前述のｇＲＮＡの態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子；
２）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前述のｇＲＮＡの態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前述のｇＲＮＡの態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子；
４）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前述のｇＲＮＡの態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；又は
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される第１のｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡの態様及び実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子を含み、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をさらに含む組成物を提供し、例えば、Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であり、例えば、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５を含む。態様において、Ｃａｓ９分子は、（ａ）配列番号２３３；（ｂ）配列番号２３４；（ｃ）配列番号２３５；（ｄ）配列番号２３６；（ｅ）配列番号２３７；（ｆ）配列番号２３８；（ｇ）配列番号２３９；（ｈ）配列番号２４０；（ｉ）配列番号２４１；（ｊ）配列番号２４２；（ｋ）配列番号２４３又は（ｌ）配列番号２４４を含む、例えばそれからなる。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子及び第３のｇＲＮＡ分子；又は第２のｇＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択で第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む組成物を提供し、ここで、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子であり、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子であり、組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列に相補的である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子内又は領域内の標的配列に相補的である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、６０００ヌクレオチド以下、５０００ヌクレオチド以下、５００以下、４００ヌクレオチド以下、３００以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下又は１０ヌクレオチド以下だけ離れた標的配列に相補的である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、ＨＢＧ１プロモーター領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＨＢＧ２プロモーター領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含む。前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本組成物は、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子を含み（例えば、それからなり）、ここで、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）例えば、本明細書に記載される非欠失ＨＰＦＨ領域から独立して選択され、それを標的にし、且つ異なる標的配列に相補的であり；（ｂ）表１のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；ｃ）表２のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；又は（ｄ）表３ａのｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり、（ｅ）表３ｂのｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；又は（ｆ）前述の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的である。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本組成物は、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子を含み、
ａ）第１のｇＲＮＡ分子は、
ｉ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７（ｈｇ３８）；
ｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７（ｈｇ３８）；
ｉｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７（ｈｇ３８）；又は
ｉｖ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７（ｈｇ３８）
の中に少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含む）を含む標的配列に相補的であり；
ｂ）第２のｇＲＮＡ分子は、
ｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４（ｈｇ３８）；
ｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４（ｈｇ３８）；又は
ｉｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１（ｈｇ３８）
の中に少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含む）を含む標的配列に相補的である。
ある態様において、組成物のｇＲＮＡ分子成分に関して、本組成物は、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子からなる。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本組成物は、鋳型核酸を含み、鋳型核酸は、第１のｇＲＮＡ分子の標的配列に又はその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施形態において、鋳型核酸は、（ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２Ａ及びＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビン若しくはその断片；又は（ｂ）ヒトγグロビン若しくはその断片をコードする核酸を含む。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本組成物は、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される。
前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、前記組成物の前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０ｕＭ未満、例えば約３ｕＭ未満、例えば約１ｕＭ未満、例えば約０．５ｕＭ未満、例えば約０．３ｕＭ未満、例えば約０．１ｕＭ未満の濃度である。実施形態において、ＲＮＰは、約１ｕＭの濃度である。実施形態において、ＲＮＰは、約２ｕＭの濃度である。実施形態において、前記濃度は、例えば、本明細書に記載されるとおりの細胞を含む組成物中のＲＮＰの濃度であり、任意選択で、細胞及びＲＮＰを含む組成物は、エレクトロポレーションに好適である。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する。実施形態において、本核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、例えば、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり、又は例えば、プロモーターは、Ｕ６プロモーター又はＨＩプロモーターである。
前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本核酸は、Ｃａｓ９分子、例えば配列番号２０５、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３又は配列番号２４４のいずれかを含む、例えばそれからなるＣａｓ９分子をさらにコードする。実施形態において、前記核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター、例えばＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。
ある態様において、本発明は、前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。実施形態において、本ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択される。
ある態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、
１）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子）及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子；
２）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子）及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子）をコードする核酸及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子；
４）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子）をコードする核酸及び例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする核酸；
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
７）本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物；又は
８）本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様及び実施形態のいずれかのベクター
と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法を提供する。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される。別の態様において、ｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される。ある態様において、２つ以上の組成物は、同時に又は逐次的に送達される。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、細胞は、動物細胞であり、例えば、細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えば、細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされた細胞の集団を含む組成物中に配置される。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血又は臍帯血から単離されている。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来、例えば自己由来である。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、ａ）改変は、１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルをもたらし；又はｂ）改変は、ＨＢＧ１プロモーター領域において１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間において、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失をもたらす。本方法の態様において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入又は欠失であり、例えば単一のヌクレオチド欠失である。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、本方法は、細胞の集団であって、集団の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％は、改変されている、例えばインデルを含む、細胞の集団をもたらす。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％高い割合）を有する。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される方法、例えば前述の方法の態様及び実施形態のいずれかの方法によって改変された細胞を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される方法、例えば前述の方法の態様及び実施形態のいずれかの方法によって得ることが可能な細胞を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される第１のｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様又は実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子又は本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様又は実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば前述の核酸の態様又は実施形態のいずれかの核酸、又は本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様又は実施形態のいずれかのベクターを含む細胞を提供する。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、本細胞は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば配列番号２０５、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３又は配列番号２４４のいずれか１つを含むＣａｓ９分子をさらに含む。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、本細胞は、本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様又は実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子又は前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、又はそれを含むことになり、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、同一でない標的化ドメインを含む。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、胎児ヘモグロビンの発現は、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞又はその子孫に対して前記細胞又はその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫）において増加される。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、細胞は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの分化細胞に対して少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、本細胞は、幹細胞増殖剤、例えばａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又はｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）から選択される幹細胞増殖剤と接触させたもの、例えばエキソビボで接触させたものである。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールである。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、本細胞は、ａ）本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様又は実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；又はｂ）ＨＢＧ１プロモーター領域において本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様又は実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様又は実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失を含む。ある態様において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入又は欠失であり、例えば、インデルは、単一のヌクレオチド欠失である。
前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される細胞のある態様において、細胞は、動物細胞であり、例えば、細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞である。ある態様において、細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血又は臍帯血から単離されている。実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって同種異系由来である。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞の集団、例えば本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞を含む細胞の集団を提供する。態様において、本発明は、細胞の集団を提供し、ここで、細胞の集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）は、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞である。態様において、細胞の集団（例えば、細胞の集団の細胞）は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、同じタイプの修飾されていない細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約１７％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％高い割合）を有する。態様において、分化細胞の集団のＦ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。
前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、１）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；又は５）２ｅ６〜１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇを含む細胞の集団を提供する。実施形態において、細胞の集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％）は、ＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、本集団の細胞の少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、本細胞の集団は、臍帯血、末梢血（例えば、動員末梢血）又は骨髄に由来し、例えば骨髄に由来する。実施形態において、本細胞の集団は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる。実施形態において、本細胞の集団は、それが投与される患者にとって自己由来である。他の実施形態において、本細胞の集団は、それが投与される患者にとって同種異系由来である。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を含む組成物を提供する。ある態様において、本組成物は、薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適な薬学的に許容可能な媒体を含む。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞、本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団又は本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞、本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団又は本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、哺乳類における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供する。態様において、異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアである。態様において、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病である。
ある態様において、本発明は、
（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；及び
（ｃ）例えば、本明細書に記載される第１のｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子；第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子；本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物；又は本明細書に記載されるベクター、例えば前述の態様及び実施形態のいずれかのベクターを前記細胞に導入するステップを含む、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法を提供する。本方法の態様において、前記ステップ（ｃ）の導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞に対して増加した胎児ヘモグロビンを産生する。本方法の態様において、幹細胞増殖剤は、ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又はｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）である。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールである。態様において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。態様において、細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む。態様において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えばそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えばそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。態様において、細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。態様において、細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、例えば約１ｕＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度、例えば約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度で含む。態様において、細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度で含む。態様において、細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む。
細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｂ）の培養は、ステップ（ｃ）の導入前の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入前の培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間である。前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｂ）の培養は、ステップ（ｃ）の導入後の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入後の培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、又は約３日の期間であり、又は約４日の期間である。前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、細胞の集団は、例えば、ステップ（ｂ）によって培養されていない細胞に対して少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍だけ増殖される。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーションを含む。態様において、エレクトロポレーションは、１〜５パルス、例えば１パルスを含み、各パルスは、７００ボルト〜２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、且つ１０ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のパルス持続時間を有する。態様において、エレクトロポレーションは、１パルスを含む、例えばそれからなる。態様において、パルス（又は２以上のパルス）電圧は、１５００〜１９００ボルトの範囲であり、例えば１７００ボルトである。態様において、１パルス又は２以上のパルスのパルス持続時間は、１０ｍｓ〜４０ｍｓの範囲であり、例えば２０ｍｓである。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である。前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離される。前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離される。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ａ）で提供される細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされている。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｃ）の導入後、細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｃ）の導入後、細胞（例えば、細胞の集団）は、ａ）第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；又はｂ）ＨＢＧ１プロモーター領域において第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失を含む。
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ｃ）の導入後、細胞の集団の細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含む。
ある態様において、本発明は、本明細書に記載される、例えば前述の細胞調製方法の態様及び実施形態のいずれかに記載される、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）を提供する。
ある態様において、本発明は、ヒト患者の異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。態様において、異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアである。態様において、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病である。
ある態様において、本発明は、ヒト患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。態様において、ヒト患者は、β−サラセミアに罹患している。態様において、ヒト患者は、鎌状赤血球病に罹患している。
異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約３ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約３ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約３ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり約３ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。異常ヘモグロビン症を治療する方法又は胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法の態様において、ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個の細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個のＣＤ３４＋細胞（例えば、本明細書に記載される細胞）を含む組成物を投与される。
ある態様において、本発明は、薬剤として使用するための、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子；本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかの核酸；本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様及び実施形態のいずれかのベクター；本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
ある態様において、本発明は、薬剤の製造に使用するための、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子；本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかの核酸；本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様及び実施形態のいずれかのベクター；本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
ある態様において、本発明は、疾患の治療に使用するための、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子；本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかの核酸；本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様及び実施形態のいずれかのベクター；本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
ある態様において、本発明は、疾患の治療に使用するための、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば前述のｇＲＮＡ分子の態様及び実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子；本明細書に記載される組成物、例えば前述の組成物の態様及び実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば前述の核酸の態様及び実施形態のいずれかの核酸；本明細書に記載されるベクター、例えば前述のベクターの態様及び実施形態のいずれかのベクター；本明細書に記載される細胞、例えば前述の細胞の態様及び実施形態のいずれかの細胞；又は本明細書に記載される細胞の集団、例えば前述の細胞の集団の態様及び実施形態のいずれかの細胞の集団を提供し、ここで、疾患は、異常ヘモグロビン症、例えばβ−サラセミア又は鎌状赤血球病である。
編集の７日後のＨｂＦ誘導。試験される各ｇＲＮＡ標的配列について、モックトランスフェクションに基づいてバックグラウンドレベルに対して補正された誘導されたＨｂＦ発現を有する細胞のパーセンテージが、標準偏差を示すエラーバーと共に平均として示される。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２に対するｇＲＮＡ Ｇ８が陽性対照としての役割を果たす。１７％における点線は、分析について選択される閾値レベルを示す。説明文で示されるように、様々な灰色の陰影は、ＨｂＦ誘導の程度をＨＢＧ１又はＨＢＧ２標的遺伝子座における編集の程度に関連付ける。 ＨＢＧ１標的遺伝子座における編集効率。試験される各ｇＲＮＡについて、ＮＧＳによって検出されるインデルのパーセンテージが、標準偏差を示すエラーバーと共に平均として示される。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２に対するｇＲＮＡ Ｇ８が陽性対照としての役割を果たす。ＮＧＳデータを得られなかった２つのガイドが矢印によって示される。 ＨＢＧ２標的遺伝子座における編集効率。試験される各ｇＲＮＡについて、ＮＧＳによって検出されるインデルのパーセンテージが、標準偏差を示すエラーバーと共に平均として示される。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２に対するｇＲＮＡ Ｇ８が陽性対照としての役割を果たす。ＮＧＳデータを得られなかった１６のガイドが矢印によって示される。 高性能ｇＲＮＡ標的配列の位置（例えば、７日目に１７％超のＨｂＦ上方制御）、ＨＢＧ１プロモーター領域における公知の非欠失ＨＰＦＨ多型及び転写因子結合部位の概説。図は、出現順にそれぞれ配列番号２９３〜３１２を開示している。 高性能ｇＲＮＡ標的配列の位置（例えば、７日目に１７％超のＨｂＦ上方制御）、ＨＢＧ２プロモーター領域における公知の非欠失ＨＰＦＨ多型及び転写因子結合部位の概説。図は、出現順にそれぞれ配列番号３１３〜３３２を開示している。 ＮＧＳ及びフローサイトメトリーによって判定したときの、種々のＣａｓ９変異体によるＣＤ３４＋ＨＳＰＣの標的Ｂ２Ｍ遺伝子座における編集効率。ＮＬＳ＝ＳＶ４０ ＮＬＳ；Ｈｉｓ６（配列番号２４７）又はＨｉｓ８（配列番号２４８）は、それぞれ６個（配列番号２４７）又は８個（配列番号２４８）のヒスチジン残基を指し；ＴＥＶ＝タバコエッチウイルス切断部位；Ｃａｓ９＝野生型化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９−突然変異体又は変異体は、指示されるとおりである）。 指示される標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰによるＨＳＰＣのエレクトロポレーション後の赤血球系分化の７日後（黒色のバー）、１４日後（薄い灰色のバー）又は２１日後（濃い灰色のバー）におけるフローサイトメトリーによるＨｂＦ陽性細胞の検出及び定量化。各時点におけるｓｇＲＮＡで処理されていない対照培養物についてのＨｂＦ＋細胞のパーセンテージは、差し引かれている。平均値＋標準偏差が示される（ｎ＝２つのテクニカルレプリケート）。 指示される標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰによるＨＳＰＣのエレクトロポレーション後の赤血球系分化の７日後（白抜きの黒色のバー）、１４日後（白抜きの薄い灰色のバー）又は２１日後（白抜きの濃い灰色のバー）におけるフローサイトメトリーによるＨｂＦ陽性細胞の検出及び定量化。各時点におけるｓｇＲＮＡで処理されていない対照培養物についてのＨｂＦ＋細胞のパーセンテージは、差し引かれている。２人の独立した細胞ドナーの平均値（バー）が各ドナー（丸＝第１のドナー、三角＝第２のドナー）についての値と共に示される。 指示される標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰによるエレクトロポレーション後の細胞又はｓｇＲＮＡで処理されていない対照細胞からの、実施例に記載されるとおりの指示される反応：Ｐ１、Ｐ２又はＰ３からのＰＣＲ産物の可視化。予想される産物は、以下のとおりである。Ｐ１：野生型／小さいインデルアレル又は４．９ｋｂの反転アレルについて７．７ｋｂ、４．９ｋｂの欠失アレルについて２．８ｋｂ。Ｐ２：野生型／小さいインデルアレルについて３．８ｋｂ、４．９ｋｂの欠失又は４．９ｋｂの反転アレルについて産物なし。Ｐ３：４．９ｋｂの反転アレルについて１．８ｋｂ、野生型／小さいインデルアレル又は４．９ｋｂの欠失アレルについて産物なし。Ｌ＝ＤＮＡリファレンスラダー。＊＝このバンドからのＤＮＡを単離し、次世代シーケンシングに供した。 ４．９ｋｂの欠失を定量化するためのデジタルドロップレットＰＣＲアッセイのためのプライマー及びプローブ結合部位のゲノム位置を示す概略図。プライマー（５．２ｋｂのＦｗｄ及び５．２ｋｂのＲｅｖ）並びにプローブ（ＦＡＭプローブ）は、ＨＢＧ２の下流及びＨＢＧ１の上流の遺伝子間部位に結合する。プローブは、ＨＢＧ２の上流の第２の結合部位を有するが、その領域は、プライマーによって結合されない。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおける標的化ドメインが位置する領域が示される。２つの標的化ドメイン領域間にある配列が欠失している場合、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２の間のプライマー／プローブ結合部位が失われるであろう。 ＧＣＲ−００６７標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰによるエレクトロポレーション後の細胞試料のためのＨＳＰＣサブ集団のソーティングスキーム。指示される細胞表面マーカーに標的化された免疫染色後の細胞蛍光のドットプロットが示される。以下の集団を示されるようにソートした：Ｐ５＝ＣＭＰ（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８＋）、Ｐ９＝ＭＰＰ（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−）、Ｐ１０＝ＳＴ−ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ＋）、Ｐ１１＝ＬＴ−ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋）。全ＣＤ３４＋細胞もソートした（図示せず）。 ＧＣＲ−００６７標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰによるエレクトロポレーション後のソートされたＨＳＰＣサブ集団のパーセント編集。ＨＢＧ１インデル及びＨＢＧ２インデルは、それぞれＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域標的化ドメインに又はその近傍にあるＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングによって同定される小さい挿入及び欠失のパーセンテージを示す（前述される４．９ｋｂの欠失又は反転を有するアレルが増幅されないことに留意されたい）。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失は、実施例に記載されるデジタルドロップレットＰＣＲアッセイによって決定した際の、４．９ｋｂの欠失を有するアレルのパーセンテージを示す。全編集は、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失のパーセンテージを、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失を有さないパーセンテージに加算し、それにＨＢＧ２インデルのパーセンテージを掛けることによって計算される概算値である。 図１３：図１３Ａは、ＧＣＲ−００６７の標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡの導入後の記載される細胞型におけるＨＢＧ１遺伝子座において観察されて全てのインデルの合計を示す。インデルが配列され、最も高頻度に観察されるインデルが各バーの上部に示される。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子座の間の大規模４．９ｋｂ欠失を含む細胞の分画は、このアッセイにおいて定量化されない。最も高頻度のインデルの各々のバー内の数は、野生型ゲノム配列とのヌクレオチドの差の数を示す（−は、欠失を示し；＋は、挿入を示す）。図１３Ｂは、ＧＣＲ−００６７の標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡの導入後の記載される細胞型におけるＨＢＧ２遺伝子座において観察された全てのインデルの合計を示す。インデルが配列され、最も高頻度に観察されるインデルが各バーの上部に示される。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子座の間の大規模４．９ｋｂ欠失を含む細胞の分画は、このアッセイにおいて定量されない。最も高頻度のインデルの各々のバー内の数は、野生型ゲノム配列とのヌクレオチドの差の数を示す（−は、欠失を示し；＋は、挿入を示す）。ＣＭＰ＝ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８＋細胞；ＭＰＰ＝ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−細胞；ＳＴ−ＨＳＣ＝ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ＋細胞；及びＬＴ−ＨＳＣ＝ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋細胞。 （上記のとおり。） 指示される標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ又はｓｇＲＮＡで処理されていない対照培養物によるエレクトロポレーション後の、指示されるサブタイプ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（濃い灰色のバー）、ＣＦＵ−Ｇ／Ｍ／ＧＭ（中間の灰色のバー）又はＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ（薄い灰色のバー）に対応するコロニーのパーセンテージ。平均値＋／−標準偏差が示される（ｎ＝２人の独立したドナー）。 指示されるように、ＧＣＲ−００６７標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ又はｓｇＲＮＡで処理されていない対照培養物によるエレクトロポレーション後の、化合物４を含む培地中における全有核細胞（ＴＮＣ）、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）及びＣＤ３４及びＣＤ９０二重陽性細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）の増殖倍数。平均値＋／−標準偏差が示される（ｎ＝２人の独立したドナー）。３人の独立した細胞ドナーの平均値（バー）が各ドナー（四角＝ドナーＡ、三角＝ドナーＢ、丸＝ドナーＣ）についての値と共に示される。編集された培養物及び対照培養物の間の差は、対応のないｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって非有意（ｎｓ）であった。 フローサイトメトリーによる細胞集団の代表的なゲーティング。指示される細胞表面マーカー、又はアイソタイプ対照（アイソタイプ）に標的化された免疫染色後の細胞蛍光のドットプロットが示される。太字のボックスで示されるゲートは、指示される集団のパーセンテージを定量化するのに使用され、アイソタイプ対照で標識された細胞を除外するように設定された。ＤＡＰＩ陰性として予めゲーティングされ、細胞前方散乱及び側方散乱ゲート内にある生存細胞のみが示され、Ｃａｓ９単独でエレクトロポレートされたドナーＣに由来する。 ＧＣＲ−００６７標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ（黒色のバー）又はｓｇＲＮＡで処理されていない対照培養物（灰色のバー）によるエレクトロポレーション後の、フローサイトメトリーによって評価した際の、指示される細胞表面表現型を有する細胞のパーセンテージ。細胞を、化合物４を含む培地中におけるＲＮＰのエレクトロポレーションの２日後に増殖させ、図１６に記載されるようにフローサイトメトリーによって評価した。平均値＋標準偏差が示される（ｎ＝３人の独立したドナー）。対応のないｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）による、所与の集団についての編集された細胞と未編集細胞との間の有意差はなかった。 図１８：図１８Ａは、Ｃａｓ９で及びｓｇＲＮＡなしでモック編集された（ｍｏｃ ｅｄｉｔｅｄ）鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１）に由来する、モック編集されたＨＳＣにおけるグロビンサブユニットのＣＥ−ＭＳ定量化である。細胞が赤血球系統へと分化した後、細胞は、正常レベルのａ−グロビン、鎌状同型接合性（ｓｉｃｋｌｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）のため正常ｂ−グロビンがないこと、高いレベルの鎌状ｂ−グロビンサブユニット、及び低いレベルの胎児ｇ−グロビンを示した。図１８Ｂは、鎌状赤血球患者（ＳＣＤ１）に由来するゲノム編集されたＨＳＰＣにおけるグロビンサブユニットのＣＥ−ＭＳ定量化である。ＨＳＣを編集した後、試料患者に由来する赤血球系細胞は、胎児ｇ−グロビンの４０％の上方制御及びそれと同時の鎌状ｂ−グロビンサブユニットの５０％の下方制御を示した。 （上記のとおり。） 遺伝子編集された細胞の生着を調べるための概略プロトコル。Ｃａｓ９及びＣＲ００１１２８（ｓｇ１１２８）の標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡで遺伝子編集されたＨＳＣの移植。５０万個のヒトＣＤ３４＋細胞をｇＲＮＡでモック編集するか、又はｓｇ１１２８で遺伝子編集した後、２Ｇｙ照射したＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）レシピエントに注入した。マウスに４、８、１２、１６週間で出血させ、骨髄細胞を移植後１６週間で採取した。 図１９に示される実験プロトコルを用いた移植後１６週間での骨髄再構成。 図１９に示される実験プロトコルを用いた複数の時点での末梢血及び骨髄中の骨髄、Ｂ、及びＴリンパ系細胞の再構成。Ｎ＝５／群、データは、最小から最大の４つの独立した実験を示す。 ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（ｓｇ−Ｇ１１２８；ｓｇ１１２８とも呼ばれる）の赤血球系特異的エンハンサー領域からのｇＲＮＡと比較した、γグロビンプロモーター領域（ｓｇ−Ｇ０００８、ｓｇ−Ｇ００５１、ｓｇ−Ｇ００１０、ｓｇ−Ｇ００４８、ｓｇ−Ｇ００６７）からのｓｇＲＮＡで編集されたＨＳＣの幹細胞機能を評価するための移植試験の概略図。細胞を、エレクトロポレーション後２４時間、培養物中に入れておいた。エレクトロポレーション前及び後の培養条件は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ＋ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ；７５０ｎＭの化合物４であった。 図２３：図２３は、ＮＳＧマウスにおける２０週間にわたるヒト生着及び系統分析である。図２３Ａ）１８週間にわたる末梢血キメラ；図２３Ｂ）１８週間での末梢血中における系統分布。骨髄分析：図２３Ｃ）９週でのヒト細胞の骨髄分析；図２３Ｄ）９週での骨髄におけるヒト細胞のヒトＣＤ４５＋生着及び系統分布；図２３Ｅ）生着後２０週での骨髄におけるヒトＣＤ４５＋生着；図２３Ｆ）２０週間での骨髄における生着細胞の系統分布。 （上記のとおり。） 図２４：図２４Ａは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（ｓｇ１１２８）の赤血球系特異的エンハンサー領域からのｓｇＲＮＡと比較した、γグロビンプロモーター領域（ｓｇ−Ｇ０００８、ｓｇ−Ｇ００５１、ｓｇ−Ｇ００１０、ｓｇ−Ｇ００４８、ｓｇ−Ｇ００６７）との相同性を有するｓｇＲＮＡで編集されたＨＳＣの生着効率である。移植後８週間でのＮＳＧマウスにおけるヒト細胞生着を示す。Ｎ＝１０／群、３つの独立した実験。グラフは、プールされたデータを示す。図２４Ｂは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（ｓｇ１１２８）の赤血球系特異的エンハンサー領域からのｓｇＲＮＡと比較した、γグロビンプロモーター領域（ｓｇ−Ｇ０００８、ｓｇ−Ｇ００５１、ｓｇ−Ｇ００１０、ｓｇ−Ｇ００４８、ｓｇ−Ｇ００６７）との相同性を有するｓｇＲＮＡで編集されたＨＳＣの生着効率である。移植後２０週間でのＮＳＧマウスにおけるヒト細胞生着を示す。Ｎ＝１０／群、３つの独立した実験。グラフは、プールされたデータを示す。 （上記のとおり。） 遺伝子編集されたＣＤ３４＋細胞を移植されたＮＳＧマウスの多系統再構成。Ｎ＝１０／群、１つの代表的な実験からのデータ。 高い編集効率が移植前及び移植後に維持された。「移植前（Ｐｒｅ−Ｘｐｔ）」：移植前であるが、編集時にＮＧＳによって測定した際の、ヒトＣＤ３４＋細胞における個々のｓｇＲＮＡの編集効率及びインデルパターン。「移植の８週間後（８ ｗｋｓ Ｐｏｓｔ−Ｘｐｔ）」：ＮＧＳによって測定した際の、マウスにおける骨髄移植の８週間後のヒトＣＤ３４＋細胞における編集効率及びインデルパターン。「移植の２０週間後（２０ ｗｋｓ Ｐｏｓｔ−Ｘｐｔ）」：ＮＧＳによって測定した際の、マウスにおける骨髄移植の２０週間後のヒトＣＤ３４＋細胞における編集効率及びインデルパターン。１群当たりトリプリケートで行われたエレクトロポレーション、１つの代表的な実験からのデータ。この図に関連して使用される際、「インデル」は、２００ｎｔ未満の全てのインデルの合計を指し；「大規模欠失」は、各ｇＲＮＡについての予想されるＨＢＧ１及びＨＢＧ２結合部位の間の配列の欠失を指す。 ＲＮＰによる編集後のＣＤ３４＋細胞のＮＧＳ分析。ｓｇＲＮＡ標的特異的領域がｘ軸に示される。図２７Ａ：ＲＮＰのエレクトロポレーションの２日後のＣＤ３４＋細胞のＮＧＳ分析。図２７Ｂ：移植の９週間後（２７Ｂ）に編集された骨髄ＣＤ３４＋細胞を移植されたＮＳＧマウスからの全骨髄のＮＧＳ分析。図２７Ｃ：移植の２０週後に編集された骨髄ＣＤ３４＋細胞を移植されたＮＳＧマウスからの全骨髄のＮＧＳ分析。挿入インデルが黒色で示され、欠失インデル（ｇＲＮＡ ｓｇ−Ｇ５１、ｓｇ−Ｇ４８及びｓｇ−Ｇ６７の各々についての結合ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的配列の間の領域の切り出しを含む大規模欠失を除外する）が灰色で示される。全編集％がバーの高さによって表される。Ｎ＝１０、データが１つの独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして示される。 遺伝子編集された長期間生着したヒトＨＳＣは、赤血球系細胞分化時に増加したレベルのＨｂＦを産生することが可能であった。５万個のヒトＣＤ３４＋細胞を、８週間又は２０週間移植されたＮＳＧマウスの骨髄からソートした。ソートされた細胞を赤血球系分化培地に１４〜２１日間播種した。培養物中の成熟赤血球をＨｂＦ発現についてアッセイし、フローサイトメトリーによってＨｂＦ＋細胞の数を計数した。モック対照は、ｇＲＮＡを含まないＣａｓ９により編集されたＣＤ３４＋細胞を表し、遺伝子編集された対照群と同様の方法でＮＳＧマウスに移植した。Ｎ＝１０／群、３つの独立した実験。 ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２ガイドＲＮＡについてのオフターゲット活性を、Ｃａｓ９過剰発現ＨＥＫ−２９３細胞においてｄｓＤＮＡオリゴ挿入方法を用いて評価した。検出されたオンターゲット部位（白抜きの丸）及び潜在的オフターゲット部位（黒丸）が示され；ｙ軸は、検出の頻度を示す。全てのｇＲＮＡを、ＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名によって示される標的化ドメインを有するｄｇＲＮＡ形式において試験した。 ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２ガイドＲＮＡについてのオフターゲット活性を、Ｃａｓ９過剰発現ＨＥＫ−２９３細胞においてｄｓＤＮＡオリゴ挿入方法を用いて評価した。検出されたオンターゲット部位（白抜きの丸）及び潜在的オフターゲット部位（黒丸）が示され；ｙ軸は、検出の頻度を示す。ｇＲＮＡを、ＣＲｘｘｘｘｘ識別名によって示される標的化ドメインを有するｄｇＲＮＡ形式、又はＧｘｘｘｘｘｘ識別名によって示される標的化ドメインを有するｓｇＲＮＡ形式のいずれかにおいて試験した。 図３１：図３１Ａは、遺伝子編集時の健常な個体の動員末梢血に由来する細胞のうちのＣＤ３４＋細胞数である。細胞を０日目に解凍し、３日目のエレクトロポレーション前に３日間培養した。エレクトロポレーション後１０日間にわたるＩＳＨＡＧＥによるＣＤ３４＋細胞数の計数。２つの独立した実験をデュプリケートで行った。合計Ｎ＝５。グラフは、１つの実験からのデータを平均値±ＳＥＭで示す。図３１Ｂは、遺伝子編集時の健常な個体の動員末梢血に由来する細胞のうちのＣＤ３４＋細胞増殖である。細胞を０日目に解凍し、３日目のエレクトロポレーション前に３日間培養した。編集時の３、７、及び１０日目の総単核細胞の増殖。２つの独立した実験をデュプリケートで行った。合計Ｎ＝５。グラフは、１つの実験からのデータを平均値±ＳＥＭで示す。図３１Ｃは、遺伝子編集時の健常な個体の動員末梢血に由来する細胞のうちのＣＤ３４＋細胞生存率。細胞を０日目に解凍し、３日目のエレクトロポレーション前に３日間培養した。編集後の同じ時点での単核細胞の生存率。２つの独立した実験をデュプリケートで行った。合計Ｎ＝５。グラフは、１つの実験からのデータを平均値±ＳＥＭで示す。 （上記のとおり。） （上記のとおり。） 図３２：図３２Ａは、健常な個体の末梢血から動員されたＣＤ３４＋細胞におけるｓｇ１１２８及びｓｇ００６７の編集効率である。ｓｇ１１２８（ＥＳＨのＢＣＬ１１Ａ＋５８領域を標的にする）及びｓｇ００６７（ＨｂＧ−１及びＨｂＧ−２遺伝子クラスターを標的にする）を用いた編集時の、ＮＧＳによって捕捉されるインデルのパーセンテージが示される。小さいインデルのみがこのｓｇＲＮＡによって生成されたため、このグラフは、ｓｇ１１２８についての全編集効率も示す。６つ以上の独立した実験を、デュプリケート又はトリプリケートで行った（ｎ＝２〜３／実験）。図３２Ｂは、健常な個体の末梢血から動員されたＣＤ３４＋細胞におけるｓｇ１１２８及びｓｇ００６７の編集効率である。Ａ．ｓｇ００６７（ＨｂＧ−１及びＨｂＧ−２遺伝子クラスターを標的にする）を用いた編集時の、ＮＧＳによって捕捉されるインデルのパーセンテージ。ｓｇ００６７の全編集効率及び編集パターンが示される。ｓｇ００６７の編集パターンは、５ｋｂの大規模欠失（黒色のバーによって示される）及びより小さいインデル（灰色のバーによって示される）からなる。６つ以上の独立した実験を、デュプリケート又はトリプリケートで行った（ｎ＝２〜３／実験）。 （上記のとおり。） ＢＣＬ１１ＡのＣＲＩＳＰＲノックダウン又はＨＢＧ１／２領域におけるインデル／欠失形成時の、患者試料からの赤血球系細胞におけるｇ−グロビン転写物の変化倍数。健常なドナーの動員末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、前の手順に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の１１日目に細胞を培養物から採取し、ＧＡＰＤＨに対して正規化しながら、ｇ−グロビン及びｂ−グロビン転写物を測定するためにｑＰＣＲに供した。実験をそれぞれデュプリケートで独立して２回行った（ｎ＝２〜３／実験）。データは、１つの試験からのプールされたドナーの平均値±ＳＥＭを示す。 遺伝子編集時の健常な個体からのＨｂＦ＋細胞の計数。健常なドナーの動員末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、前の手順に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の１０日目に細胞を抗ＨｂＦ−ＦＩＴＣ抗体で染色して、フローサイトメトリーによってＨｂＦ＋細胞を計数した。実験をそれぞれデュプリケートで独立して２回行った（ｎ＝２〜３／実験）。データは、１つの試験からの平均値±ＳＤを示す。 ［図３５Ａ］遺伝子編集時の鎌状赤血球病個体の末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞の増殖及び生存率。細胞をエレクトロポレーション前に６〜１０日間培養した。Ｄ０は、エレクトロポレーションの日を指す。エレクトロポレーション後１０日間にわたるＩＳＨＡＧＥによるＣＤ３４＋細胞の絶対数が示される。Ｎ＝４、データは、平均値±ＳＥＭを示す。４つの独立した実験をデュプリケートで行った。バーは、各時点で左から右にモック、ｓｇ１１２８、ｓｇ００６７である。 ［図３５Ｂ］遺伝子編集時の鎌状赤血球病個体の末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞の増殖及び生存率。細胞をエレクトロポレーション前に６〜１０日間培養した。Ｄ０は、エレクトロポレーションの日を指す。エレクトロポレーション後１０日間にわたるＩＳＨＡＧＥによるＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが示される。Ｎ＝４、データは、平均値±ＳＥＭを示す。４つの独立した実験をデュプリケートで行った。バーは、各時点で左から右にモック、ｓｇ１１２８、ｓｇ００６７である。 ［図３５Ｃ］遺伝子編集時の鎌状赤血球病個体の末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞の増殖及び生存率。細胞をエレクトロポレーション前に６〜１０日間培養した。Ｄ０は、エレクトロポレーションの日を指す。編集時の３、７、及び１０日目の総単核細胞の増殖が示される。Ｎ＝４、データは、平均値±ＳＥＭを示す。４つの独立した実験をデュプリケートで行った。バーは、各時点で左から右にモック、ｓｇ１１２８、ｓｇ００６７である。 ［図３５Ｄ］遺伝子編集時の鎌状赤血球病個体の末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞の増殖及び生存率。細胞をエレクトロポレーション前に６〜１０日間培養した。Ｄ０は、エレクトロポレーションの日を指す。編集後３、７及び１０日での単核細胞の生存率が示される。Ｎ＝４、データは、平均値±ＳＥＭを示す。４つの独立した実験をデュプリケートで行った。バーは、各時点で左から右にモック、ｓｇ１１２８、ｓｇ００６７である。 鎌状赤血球病患者試料からのＣＤ３４＋細胞におけるｓｇ１１２８及びｓｇ００６７の編集効率。ｓｇ００６７の編集パターンを大規模欠失（灰色）及び小さいインデルの合計（黒色）によって示した。データは、４人の異なる鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜４）からのＣＤ３４＋細胞を用いてデュプリケートで行われた４つの独立した編集実験の平均値±ＳＥＭを示す。 コロニー形成単位アッセイによって測定した際のＨＳＰＣのインビトロ多系統分化能。ＢＦＵ−Ｅ＝バースト形成単位、赤血球系；ＣＦＵ−ＧＭ＝コロニー形成単位、顆粒球、単球；ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＝コロニー形成単位、顆粒球、赤血球系、単球、巨核球。グラフは、３人の異なる鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜３）からのＣＤ３４＋細胞からの３つの独立した実験を示す。実験をトリプリケートで行った。データは、平均値±ＳＥＭを表す。 ＢＣＬ１１ＡのＣＲＩＳＰＲノックダウン又はｇ−グロビン遺伝子クラスターにおけるインデル／欠失形成時の、患者試料からの赤血球系細胞におけるｇ−グロビン転写物の変化倍数。３人の鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜３）に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、実施例に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の１１日目に細胞を培養物から採取し、ＧＡＰＤＨに対して正規化しながら、ｇ−グロビン及びｂ−グロビン転写物を測定するためにｑＰＣＲに供した。実験をデュプリケートで行った。データは、プールされたドナーの平均値±ＳＥＭを示す。 遺伝子編集時の鎌状赤血球病患者試料におけるＨｂＦ＋細胞の計数。３人の鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜３）に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、実施例に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の１１、１４、及び２１日目に細胞を抗ＨｂＦ−ＦＩＴＣ抗体で染色して、フローサイトメトリーによってＨｂＦ＋細胞を計数した。実験をデュプリケートで行った。データは、平均値±ＳＥＭを示す。ＳＣＤ１〜３からの結果が１１日目に示され；ＳＣＤ−１及びＳＣＤ−２からの結果が１４日目に示され；ＳＣＤ−２及びＳＣＤ−３からの結果が２１日目に示される。 フローサイトメトリーによる遺伝子編集された鎌状赤血球病患者試料における胎児ヘモグロビン発現の測定。３人の鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜３）に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、実施例に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の１１、１４、及び２１日目に細胞を抗ＨｂＦ−ＦＩＴＣ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって各細胞のＨｂＦ発現強度を測定した。実験をデュプリケートで行った。データは、平均値±ＳＥＭを示す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。ＳＣＤ１〜３からの結果が１１日目に示され；ＳＣＤ−１及びＳＣＤ−２からの結果が１４日目に示され；ＳＣＤ−２及びＳＣＤ−３からの結果が２１日目に示される。 患者試料のＣＲＩＳＰＲ編集時の正常細胞に対する鎌状赤血球の数の計数。３人の鎌状赤血球病患者（ＳＣＤ１〜３）に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲによって編集し、前の手順に記載されるようにインビトロで赤血球系統へと分化させた。赤血球系分化の２１日目に細胞を４日間にわたって％低酸素チャンバーに入れ、固定した後、単一細胞イメージングフローサイトメトリーを行った。図４１Ａ（左側のパネル）は、単一細胞イメージングによって計数した際の、遺伝子編集された患者試料における鎌状赤血球の数の変化を示す。図４１Ｂ（右側のパネル）は、単一細胞イメージングによって計数される、患者試料における遺伝子編集後の正常細胞の数の変化を示す。各実験をデュプリケートで３つの独立した実験を行った。各患者からの４万個の単一細胞画像を計数した。グラフは、プールされたデータからの平均値±ＳＥＭを示す。
定義
用語「ＣＲＩＳＰＲシステム」、「Ｃａｓシステム」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、一緒になって標的配列でＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子による核酸の修飾を誘導し達成するのに必要且つ十分なＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子とｇＲＮＡ分子とを含む分子の組を指す。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質とを含む。Ｃａｓ９又は修飾Ｃａｓ９分子を含むかかるシステムは、本明細書では「Ｃａｓ９システム」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」と称される。一例において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ分子とは複合体化してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し得る。
用語「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」又は「ｇＲＮＡ」は同義的に使用され、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子（典型的にはｇＲＮＡ分子と複合体化している）が標的配列へ特異的に誘導されるよう促進する核酸分子の組を指す。一部の実施形態において、前記誘導は、ｇＲＮＡの一部分がＤＮＡに（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインを介して）ハイブリダイズすることを通じて、及びｇＲＮＡ分子の一部分がＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子に（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）結合することにより達成される。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は単一の連続するポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」などと称される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、それ自体が通常ハイブリダイゼーションを通じて会合する能力を有する複数の、通常２つのポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「デュアルガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」などと称される。ｇＲＮＡ分子について以下にさらに詳細に記載するが、概して標的化ドメインとｔｒａｃｒとを含むものである。実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは単一のポリヌクレオチドに配置される。他の実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個のポリヌクレオチドに配置される。
用語「標的化ドメイン」とは、この用語がｇＲＮＡに関連して使用されるとき、標的配列、例えば、細胞の核酸内、例えば遺伝子内の標的配列を認識する、例えばそれに相補的であるｇＲＮＡ分子の一部分である。
用語「ｃｒＲＮＡ」は、この用語がｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、標的化ドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用してフラッグポール領域を形成する領域とを含むｇＲＮＡ分子の一部分である。
用語「標的配列」は、ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的、例えば完全に相補的な核酸の配列を指す。実施形態において、標的配列は、ゲノムＤＮＡ上に配置されている。実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼ又は他のエフェクター活性を有するタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えばＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列に（ＤＮＡの同じ鎖上又は相補鎖上のいずれかで）隣接している。実施形態において、標的配列は、グロビン遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子内又は遺伝子座内、例えばβグロビン又は胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現に影響を及ぼす遺伝子内又は遺伝子座内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、非欠失ＨＰＦＨ領域内にある標的配列であり、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域内にある。
用語「フラッグポール」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒとが互いに結合するか又はハイブリダイズするｇＲＮＡの一部分を指す。
用語「ｔｒａｃｒ」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの一部分を指す。実施形態において、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。実施形態において、ｔｒａｃｒは、フラッグポールの一部を形成する核酸配列を含む。
用語「Ｃａｓ９」又は「Ｃａｓ９分子」は、ＤＮＡ切断に関与する細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの酵素を指す。Ｃａｓ９には、野生型タンパク質並びにその機能性及び非機能性突然変異体も含まれる。実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である。
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴ又はＵ、及びＧとＣの塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体にわたってＡがＴ又はＵと対を形成し、及びＧがＣと対を形成する核酸分子並びに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
「鋳型核酸」は、相同組換え修復又は相同的組換えに関連して使用されるとき、切断部位における遺伝子修復（挿入）のためＣＲＩＳＰＲシステムドナー配列によって修飾部位に挿入される核酸を指す。
「インデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子を含む組成物、例えばＣＲＩＳＰＲシステムへの曝露後に生じる、参照核酸と比べた１つ以上のヌクレオチド挿入、１つ以上のヌクレオチド欠失又はヌクレオチド挿入及び欠失の組み合わせを含む核酸を指す。インデルは、ｇＲＮＡ分子を含む組成物に曝露した後の核酸を例えばＮＧＳによってシーケンシングすることにより決定し得る。インデルの部位に関して、インデルは、それが参照部位から約１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチドの範囲内に少なくとも１つの挿入又は欠失を含むか、又は前記参照部位の一部又は全てとオーバーラップしている（例えば、ｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な部位とオーバーラップしているか、又はそれから１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチドの範囲内にある少なくとも１つの挿入又は欠失を含む）場合、参照部位（例えば、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な部位）「にあるか又はその近傍にある」と言われる。実施形態において、インデルは、例えば、約１ｋｂ超、約２ｋｂ超、約３ｋｂ超、約４ｋｂ超、約５ｋｂ超、約６ｋｂ超、又は約１０ｋｂ超の核酸を含む大規模欠失である。実施形態において、大規模欠失の５’末端、３’末端又は５’及び３’末端の両方は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的配列に又はその近傍に配置されている。実施形態において、大規模欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域内に配置される例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域内に配置される例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的配列との間に配置される約４．９ｋｂのＤＮＡを含む。
「インデルパターン」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子を含む組成物への曝露後に生じるインデルの組を指す。ある実施形態において、インデルパターンは、出現頻度を基準として上位３つのインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、出現頻度を基準として上位５つのインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、全シーケンシングリードに対して約１％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、全シーケンシングリードに対して約５％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、インデルシーケンシングリードの総数（すなわち非修飾参照核酸配列からなるのでないリード）に対して約１０％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、上位５つの最も高頻度に観察されるインデルの任意の３つを含む。インデルパターンは、例えば、本明細書に記載される方法により、例えばｇＲＮＡ分子に曝露した細胞の集団の細胞をシーケンシングすることにより決定し得る。
「オフターゲットインデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインの標的配列以外の部位に又はその近傍にあるインデルを指す。かかる部位は、ｇＲＮＡの標的化ドメインの配列に対して例えば１、２、３、４、５個又はそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。例示的実施形態において、かかる部位は、インシリコで予想されるオフターゲット部位の標的シーケンシングを用いるか、又は当該技術分野において公知の挿入法によって検出される。本明細書に記載されるｇＲＮＡに関して、オフターゲットインデルの例は、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部の配列において形成されたインデルである。例示的実施形態において、オフターゲットインデルは、遺伝子の配列内、例えば遺伝子のコード配列内で形成される。
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
量、時間的持続などの計測可能な値に言及するときの用語「約」は、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動を（かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして）包含することが意図される。
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含めて、抗原となり得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、したがって免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、ある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定はされないが、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれること、及びこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成するか若しくは生体試料から得ることができ、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることは容易に明らかである。かかる生体試料には、限定はされないが、組織試料、細胞又は他の生物学的成分を含む体液が含まれ得る。
用語「自己由来」は、後にそれが再び導入されることになる同じ個体に由来する任意の材料を指す。
用語「同種異系由来」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系由来であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系由来材料は、抗原として相互作用するのに遺伝的に十分に異なるものであり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
「〜に由来する」は、その用語が本明細書において使用されるとき、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に対するプロセス又は供給源の限定は含意又は包含しない。
用語「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド中の特異的ヌクレオチド配列が、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれか及びそれから生じる生物学的特性を有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成用鋳型としての役割を果たす固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生物学的システムでタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一で、通常配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写用鋳型として用いられる非コード鎖との両方が、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称され得る。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を全て含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載されるとおりの化合物、製剤、材料、又は組成物が特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織又は系由来の又はその内部で産生される任意の材料を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞の内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含め、多くのベクターが当該技術分野において公知である。したがって、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物もさらに含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む。他の発現用エレメントは宿主細胞によって供給するか、又はインビトロ発現系に供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれるもの）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当該技術分野において公知のもの全てが含まれる。
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間、又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらはその位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は９０％相同である。
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は互いに隣接し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は注入技法を含む。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列がまた、黙示的に、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限は課されない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当該技術分野では、一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当該技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、又はこれらの組み合わせが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構、又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか又はそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
本明細書でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に関連して使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体が、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するため修飾することができる。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加される一連のアデノシンである。一過性発現用のコンストラクトの好ましい実施形態において、ポリＡは５０〜５０００（配列番号１９０）、好ましくは６４より多く、より好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００又は４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的又は酵素的に修飾することができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分又はその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化はＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終了した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコンの中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、又は修飾細胞など、１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる障害、例えば異常ヘモグロビン症の進行、重症度及び／又は持続期間の低減又は改善、又は障害、例えば異常ヘモグロビン症の１つ以上の症状（好ましくは、１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、患者には認識できない、異常ヘモグロビン症障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメータの改善を指す。他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか、又は両方を指す。他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症又はβ−サラセミアの症状の低減又は安定化を指す。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の膜を越えてシグナルを伝える分子及び分子複合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞はインビトロで培養される。他の態様において、これら細胞はインビトロで培養されない。
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患状態の低減、抑制、寛解、又は根絶によって達成される。
用語「予防」とは、本明細書で使用されるときに疾患又は疾患状態の予防又は防御的治療を意味する。
用語「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」は、外因性核酸及び／又はタンパク質を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸及び／又はタンパク質をトランスフェクトされた、形質転換された、又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、タンパク質又は核酸）を認識してそれと結合する分子であって、しかし試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しない分子を指す。
用語「生物学的に均等」は、参照用量又は参照量の参照化合物によって生じる効果と均等な効果を生じさせるのに必要な量の参照化合物以外の薬剤を指す。
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば異常ヘモグロビン症を指す。実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は治療の開始前又は開始時点で治療に抵抗性であり得る。他の実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は治療中に抵抗性になり得る。不応性異常ヘモグロビン症は抵抗性異常ヘモグロビン症とも称される。
「再発性」は、本明細書で使用されるとき、改善期間後、例えば、ある療法、例えば異常ヘモグロビン症療法の先行治療後に異常ヘモグロビン症などの疾患（例えば、異常ヘモグロビン症）又は疾患の徴候及び症状が再来することを指す。
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式による記載は単に便宜上のものであり、簡潔にするために過ぎないことが理解されなければならず、本発明の範囲を柔軟性なく限定するものと解釈されてはならない。したがって、範囲の記載は、あらゆる可能な部分的範囲並びにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したものと見なされなければならない。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲並びにその範囲内にある個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示したものと見なされなければならない。別の例として、９５〜９９％の同一性のような範囲には、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するあるものが含まれ、及び９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性などの部分的範囲が含まれる。これは範囲の広さとは無関係に適用される。
用語「ＢＣＬ１１ａ」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーター近接領域配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質であるＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ、及び前記タンパク質をコードする遺伝子を、全てのイントロン及びエクソンと共に指す。この遺伝子はＣ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、胎児ヘモグロビン産生の抑制において役割を果たすことが分かっている。ＢＣＬ１１ａは、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ジンクフィンガータンパク質）、ＣＴＩＰ１、ＥＶＩ９、エコトロピックウイルス組込み部位９タンパク質ホモログ、ＣＯＵＰ−ＴＦ相互作用タンパク質１、ジンクフィンガータンパク質８５６、ＫＩＡＡ１８０９、ＢＣＬ−１１Ａ、ＺＮＦ８５６、ＥＶＩ−９、及びＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａとしても知られる。この用語にはＢＬＣ１１ａのあらゆるアイソフォーム及びスプライス変異体が包含される。ＢＣＬ１１ａをコードするヒト遺伝子は染色体位置２ｐ１６．１にマッピングされる（Ｅｎｓｅｍｂｌによる）。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースを参照することができ、及びヒトＢＣＬ１１ａのゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＣ＿０００００２．１２を参照することができる。ＢＣＬ１１ａ遺伝子は、全てのイントロン及びエクソンを含め、このゲノム位置を指す。ＢＣＬ１１ａには複数の既知のアイソタイプがある。
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１をコードするｍＲＮＡの配列はＮＭ＿０２２８９３を参照することができる。
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１のペプチド配列は以下である。
Figure 2020505934
他のＢＣＬ１１ａタンパク質アイソフォームの配列は以下に提供される。
アイソフォーム２：Ｑ９Ｈ１６５−２
アイソフォーム３：Ｑ９Ｈ１６５−３
アイソフォーム４：Ｑ９Ｈ１６５−４
アイソフォーム５：Ｑ９Ｈ１６５−５
アイソフォーム６：Ｑ９Ｈ１６５−６
本明細書で使用されるとき、ヒトＢＣＬ１１ａタンパク質には、その完全長にわたってＢＣＬ１１ａアイソフォーム１〜６と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するタンパク質も包含され、ここで、かかるタンパク質はなおもＢＣＬ１１ａの機能の少なくとも１つを有する。
用語「グロビン遺伝子座」は、本明細書で使用されるとき、胚（ε）、胎児（Ｇ（γ）及びＡ（γ））、成人グロビン遺伝子（γ及びβ）、遺伝子座制御領域及びＤＮアーゼＩ高感受性部位の遺伝子を含むヒト１１番染色体の領域を指す。
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴ又はＵ、及びＧとＣの塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体にわたってＡがＴ又はＵと対を形成し、及びＧがＣと対を形成する核酸分子並びに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
用語「非欠失ＨＰＦＨ」は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症をもたらし、成人赤血球細胞における胎児ヘモグロビンの増加を特徴とする、１つ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失を含まない突然変異を指す。例示的実施形態において、非欠失ＨＰＦＨは、Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｏｓｋｉ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆａｎｃｙ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，８ｔｈ Ｅｄ．，２０１５，Ｏｒｋｉｎ ＳＨ，Ｆｉｓｈｅｒ ＤＥ，Ｌｏｏｋ Ｔ，Ｌｕｘ ＳＥ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ Ｄ，Ｎａｔｈａｎ ＤＧ，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ（この内容全体が、参照により本明細書に援用される）に記載される突然変異、例えば表２１−５に記載される非欠失ＨＰＦＨ突然変異である。用語「非欠失ＨＰＦＨ領域」は、非欠失ＨＰＦＨを含むか又はその近傍にあるゲノム部位を指す。例示的実施形態において、非欠失ＨＰＦＨ領域は、ＨＢＧ１プロモーター領域の核酸配列（Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、ｈｇ３８；−鎖）、ＨＢＧ２プロモーター領域の核酸配列（Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、ｈｇ３８；−鎖）、又はこれらの組み合わせである。例示的実施形態において、非欠失ＨＰＦＨ領域は、Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｏｓｋｉ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆａｎｃｙ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，８ｔｈ Ｅｄ．，２０１５，Ｏｒｋｉｎ ＳＨ，Ｆｉｓｈｅｒ ＤＥ，Ｌｏｏｋ Ｔ，Ｌｕｘ ＳＥ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ Ｄ，Ｎａｔｈａｎ ＤＧ，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓに記載される（例えば、その中の表２１−５に記載される）非欠失ＨＰＦＨの１つ以上を含む。例示的実施形態において、非欠失ＨＰＦＨ領域は、ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８における核酸配列；又はｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８における核酸配列；又はｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８における核酸配列；又はｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８における核酸配列；又はｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８における核酸配列；又はこれらの組み合わせである。
「ＢＣＬ１１ａエンハンサー」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ＢＣＬ１１ａの発現又は機能に影響を及ぼす、例えばそれを増進させる核酸配列を指す。例えば、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３４２，２０１３，ｐｐ．２５３−２５７を参照されたい。ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、例えば、ある種の細胞型、例えば赤血球系統の細胞においてのみ作用することが可能であり得る。ＢＣＬ１１ａエンハンサーの一例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列（例えば、ｈｇ３８に記録されているとおりの位置＋５５：Ｃｈｒ２：６０４９７６７６〜６０４９８９４１；＋５８：Ｃｈｒ２：６０４９４２５１〜６０４９５５４６；＋６２：Ｃｈｒ２：６０４９０４０９〜６０４９１７３４にあるか又はそれに対応する核酸）である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋６２領域である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋５８領域である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋５５領域である。
用語「造血幹細胞・前駆細胞」又は「ＨＳＰＣ」は、同義的に使用され、造血幹細胞（「ＨＳＣ」）及び造血前駆細胞（「ＨＰＣ」）の両方を含む細胞の集団を指す。かかる細胞は、例えば、ＣＤ３４＋として特徴付けられる。例示的実施形態において、ＨＳＰＣは、骨髄から単離される。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは、末梢血から単離される。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは、臍帯血から単離される。ある実施形態において、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞として特徴付けられる。
「幹細胞増殖剤」は、本明細書で使用されるとき、細胞、例えばＨＳＰＣ、ＨＳＣ及び／又はＨＰＣを、前記薬剤がない同じ細胞型と比べて速い速度で増殖させる、例えば数を増加させる化合物を指す。例示的な一態様において、幹細胞増殖剤はアリール炭化水素受容体経路の阻害剤である。幹細胞増殖剤のさらなる例は以下に提供する。実施形態において、増殖、例えば数の増加はエキソビボで達成される。
「生着」又は「生着する」は、レシピエント、例えば哺乳類又はヒト対象の体内への細胞又は組織、例えばＨＳＰＣの集団の取込みを指す。一例において、生着は、レシピエントにおける生着細胞の成長、増殖及び／又は分化を含む。一例では、ＨＳＰＣの生着は、レシピエントの体内における前記ＨＳＰＣの赤血球系細胞への分化及び成長を含む。
用語「造血前駆細胞」（ＨＰＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製能が限られた、且つ造血ヒエラルキー内における位置に応じて多系統分化（例えば、骨髄、リンパ）、単系統分化（例えば、骨髄又はリンパ）又は細胞型限定的分化（例えば、赤血球系前駆細胞）の潜在的能力を有する原始的な造血細胞を指す（Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１２）。
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製して、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、及び単球（例えば、単球、マクロファージ）を含むより成熟した血球細胞に分化する能力を有する未熟血球細胞を指す。本明細書全体を通じて、ＨＳＣは、幹細胞と同義的に記載される。当該技術分野において、かかる細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含むことも又は含まないこともあることが公知である。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上記に定義した幹細胞特性を有する細胞のサブ集団を占めると考えられる。ＨＳＣが、原始的前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞）及び／又は特異的造血系統（例えば、リンパ系前駆細胞）にコミットした前駆細胞を生じさせることができる多能性細胞であることは、当該技術分野において周知である。特異的造血系統にコミットした幹細胞は、Ｔ細胞系統、Ｂ細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統及び／又はリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統のものであり得る。さらに、ＨＳＣは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。ＳＴ−ＨＳＣは、ＬＴ−ＨＳＣよりも高活性且つ高増殖性である。しかしながら、ＬＴ−ＨＳＣは、無制限の自己複製を有する（すなわち、これは、成人期を通して生存する）一方、ＳＴ−ＨＳＣは、自己複製が限られている（すなわち、これは、限られた期間のみ生存する）。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、これらのＨＳＣのいずれを使用することもできる。ＳＴ−ＨＳＣは、高増殖性であり、したがってＨＳＣ及びその子孫の数が急速に増加するため、任意選択でＳＴ−ＨＳＣが有用である。造血幹細胞は、任意選択で血液製剤から入手される。血液製剤には、造血起源の細胞を含む身体又は身体の臓器から得られた製剤が含まれる。かかる供給源には、未分画骨髄、臍帯、末梢血（例えば、動員末梢血、例えば、Ｇ−ＣＳＦ又はＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）などの動員剤で動員したもの、又はＧ−ＣＳＦ及びＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）の組み合わせ）、肝臓、胸腺、リンパ液及び脾臓が含まれる。前述の粗製又は未分画血液製剤の全ては、造血幹細胞特徴を有する細胞を当業者に公知の方法でエンリッチすることができる。ある実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞として特徴付けられる。
細胞との関連において「増殖」又は「増殖する」は、同じであっても又は同じでなくてもよい細胞の初期細胞集団からの１つ又は複数の特徴的細胞型の数の増加を指す。増殖に使用される初期細胞は、増殖によって生じる細胞と同じでなくてもよい。
「細胞集団」は、生物学的供給源、例えば血液製剤又は組織から単離された、且つ２つ以上の細胞に由来する真核生物哺乳類、好ましくはヒトの細胞を指す。
「エンリッチされた」は、細胞集団との関連で使用されるとき、１つ以上のマーカー、例えばＣＤ３４＋の存在に基づき選択された細胞集団を指す。
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その表面にＣＤ３４マーカーを発現する細胞を指す。ＣＤ３４＋細胞は、例えばフローサイトメトリー及び蛍光標識抗ＣＤ３４抗体を用いて検出及びカウントすることができる。
「ＣＤ３４＋細胞がエンリッチされた」は、細胞集団がＣＤ３４マーカーの存在に基づき選択されていることを意味する。したがって、選択方法後の細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは、ＣＤ３４マーカーに基づく選択ステップ前の初期細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージよりも高い。例えば、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞をエンリッチした細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％を占め得る。
用語「Ｆ細胞」及び「Ｆ−細胞」は、胎児ヘモグロビンを含有及び／又は産生する（例えば、発現する）細胞、通常、赤血球（例えば、赤血球細胞）を指す。例えば、Ｆ−細胞は、検出可能なレベルの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。例えば、Ｆ−細胞は、少なくとも５ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有又は産生する細胞である。胎児ヘモグロビンのレベルは、本明細書に記載されるアッセイを用いるか、又は当該技術分野において公知の他の方法、例えば抗胎児ヘモグロビン検出試薬を用いたフローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法、又は酵素結合免疫吸着アッセイにより計測し得る。
特に指定されない限り、全てのゲノム又は染色体座標はｈｇ３８に基づく。
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、組成物及び方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた真核細胞におけるゲノム編集に関する。詳細には、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、組成物及び方法は、グロビンレベルの調節に関し、例えば、グロビン遺伝子及びタンパク質の発現及び産生の調節において有用である。本ｇＲＮＡ分子、組成物及び方法は、異常ヘモグロビン症の治療において有用であり得る。
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、以下にさらに詳しく記載するとおり幾つものドメインを有し得るが、しかしながら、ｇＲＮＡ分子は、典型的には、少なくともｃｒＲＮＡドメイン（標的化ドメインを含む）とｔｒａｃｒとを含む。ＣＲＩＳＰＲシステムの一成分として使用される本発明のｇＲＮＡ分子は、標的部位に又はその近傍にあるＤＮＡの修飾（例えば、配列の修飾）に有用である。かかる修飾には、例えば標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現の低下又は消失をもたらす欠失及び／又は挿入が含まれる。これらの使用及びさらなる使用について、以下にさらに詳しく説明する。
ある実施形態では、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメイン及びフラッグポールの一部を形成する領域（すなわちｃｒＲＮＡフラッグポール領域）を含有する）；ループ；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なドメイン、及びヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマットをとり得る（５’から３’に）：
［標的化ドメイン］−［ｃｒＲＮＡフラッグポール領域］−［任意選択の第１のフラッグポール伸長部］−［ループ］−［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質に結合する。
ある実施形態では、二分子の、すなわちｄｇＲＮＡが、２つのポリヌクレオチド；第１のポリヌクレオチド、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメイン及びフラッグポールの一部を形成する領域を含有し；及び第２のポリヌクレオチド、好ましくは５’から３’に、ｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なドメイン、及びヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマットをとり得る（５’から３’に）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［標的化ドメイン］−［ｃｒＲＮＡフラッグポール領域］−［任意選択の第１のフラッグポール伸長部］−［任意選択の第２のフラッグポール伸長部］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質に結合する。
一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１に記載される標的化ドメイン、又は表１に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９又は２０個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むか又はそれからなる標的化ドメインを含むか又はそれからなる。
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’から３’に、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１８２）を含む。
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’から３’に、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１８３）を含む。
一部の態様において、ループは、５’から３’に、ＧＡＡＡ（配列番号１８６）を含む。
一部の態様において、ｔｒａｃｒは、５’から３’に、
Figure 2020505934
を含み、好ましくは配列番号１８２を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
一部の態様において、ｔｒａｃｒは、５’から３’に、
Figure 2020505934
を含み、好ましくは配列番号１８３を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＵ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＵ核酸（配列番号２４９）を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＵ核酸（配列番号２４９）を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＵ核酸、例えば４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、例えば４個のＵ核酸を含む。
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＡ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＡ核酸（配列番号２５０）を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的なＡ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＡ核酸（配列番号２５０）を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＡ核酸、例えば４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、例えば４個のＡ核酸を含む。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子のポリヌクレオチドの１つ以上が５’末端にキャップを含み得る。
ある実施形態において、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメインを含有する；ｃｒＲＮＡフラッグポール領域；第１のフラッグポール伸長部；ループ；第１のｔｒａｃｒ伸長部（第１のフラッグポール伸長部の少なくとも一部分に相補的なドメインを含有する）；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なドメイン、及びＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含む。一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１に記載される標的化ドメイン、又は表１に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９又は２０個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチド、例えば、表１に記載される標的化ドメイン配列の３’側の１７、１８、１９又は２０個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むか又はそれからなる標的化ドメインを含む。
第１のフラッグポール伸長部及び／又は第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む態様において、フラッグポール、ループ及びｔｒａｃｒ配列は上記に記載したとおりであり得る。一般に任意の第１のフラッグポール伸長部及び第１のｔｒａｃｒ伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第１のフラッグポール伸長部及び第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（配列番号１８４）を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、配列番号１８４からなる。
一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、５’から３’に、ＣＡＧＣＡ（配列番号１８９）を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号１８９からなる。
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは２つの核酸分子を含む。一部の態様において、ｄｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’に、標的配列に相補的な標的化ドメイン；ｃｒＲＮＡフラッグポール領域；任意選択で第１のフラッグポール伸長部；及び任意選択で第２のフラッグポール伸長部を含有する第１の核酸と；好ましくは５’から３’に、任意選択で第１のｔｒａｃｒ伸長部；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なドメイン、及びＣａｓ、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含む第２の核酸（本明細書ではｔｒａｃｒと称され得る）、及び少なくとも、Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子を結合するドメインを含む）とを含む。第２の核酸は、加えて、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＵ核酸（配列番号２４９）を含み得る。第２の核酸は、加えて又は代わりに、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＡ核酸を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＡ核酸（配列番号２５０）を含み得る。一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１に記載される標的化ドメイン、又は表１に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９又は２０個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むか又はそれからなる標的化ドメインを含む。
ｄｇＲＮＡが関わる態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、任意選択の第１のフラッグポール伸長部、任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部及びｔｒａｃｒ配列は上記に記載したとおりであり得る。
一部の態様において、任意選択の第２のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＵＵＵＧ（配列番号１８５）を含む。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子（及びｄｇＲＮＡ分子の場合、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及び／又はｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の３’側の１、２、３、４、又は５ヌクレオチド、５’側の１、２、３、４、又は５ヌクレオチド、又は３’側及び５’側の両方の１、２、３、４、又は５ヌクレオチドは、以下の第ＸＩＩＩ節にさらに詳しく説明するとおり、修飾核酸である。
これらのドメインについて以下に手短に考察する：
１）標的化ドメイン：
標的化ドメインの選択に関する指針については、例えば、Ｆｕ Ｙ ｅｌ ａｌ．ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｌ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照することができる。
標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的、例えば少なくとも８０、８５、９０、９５、又は９９％相補的、例えば完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。標的化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含むことになり、一方、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは塩基チミン（Ｔ）を含むことになる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列との標的化ドメインの相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメインと標的配列との対において、標的化ドメイン中のウラシル塩基は標的配列中のアデニン塩基と対合し得ることが理解される。
ある実施形態において、標的化ドメインは、５〜５０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１５〜３０、例えば１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。実施形態において、前述の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドは、表１に記載される標的化ドメインからの５’−１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。実施形態において、前述の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドは、表１に記載される標的化ドメインからの３’−１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。
理論によって拘束されるものではないが、標的化ドメインの３’末端に配置された標的化ドメインの８、９、１０、１１又は１２個の核酸が標的配列のターゲティングに重要であると考えられ、したがって標的化ドメインの「コア」領域と称され得る。ある実施形態において、コアドメインは標的配列に完全に相補的である。
標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖が、本明細書では標的配列と称される。一部の態様において、標的配列は染色体上に配置され、例えば遺伝子内の標的である。一部の態様において標的配列は遺伝子のエクソン内に配置される。一部の態様において標的配列は遺伝子のイントロン内に配置される。一部の態様において、標的配列は、目的の遺伝子の調節エレメントの結合部位、例えばプロモーター又は転写因子結合部位を含むか又はそれに近接している（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又は１０００核酸以内にある）。ドメインのヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
２）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域：
フラッグポールは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒの両方からの一部分を含む。ｃｒＲＮＡフラッグポール領域はｔｒａｃｒの一部分に相補的であり、ある実施形態では、少なくとも一部の生理条件下、例えば通常の生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なｔｒａｃｒの一部分との相補性を有する。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は５〜３０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は５〜２５ヌクレオチド長である。ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、細菌ＣＲＩＳＰＲアレイからのリピート配列の天然に存在する一部分と相同性を共有するか又はそれに由来し得る。ある実施形態において、これは本明細書に開示されるｃｒＲＮＡフラッグポール領域、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と少なくとも５０％の相同性を有する。
ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号１８２を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号１８２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号１８２の少なくとも５、６、７、８、９、１０、又は１１ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号１８３を含む。ある実施形態において、フラッグポールは、配列番号１８３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号１８３の少なくとも５、６、７、８、９、１０、又は１１ヌクレオチドを含む。
ドメインのヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に記載される修飾を有し得る。
３）第１のフラッグポール伸長部
第１のｔｒａｃｒ伸長部を含むｔｒａｃｒが使用されるとき、ｃｒＲＮＡは第１のフラッグポール伸長部を含み得る。一般に任意の第１のフラッグポール伸長部及び第１のｔｒａｃｒ伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第１のフラッグポール伸長部及び第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
第１のフラッグポール伸長部は、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドに相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（配列番号１８４）を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、配列番号１８４からなる。一部の態様において第１のフラッグポール伸長部は、配列番号１８４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性である核酸を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
３）ループ
ループは、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡフラッグポール領域（又は存在する場合には任意選択で第１のフラッグポール伸長部）をｔｒａｃｒ（又は存在する場合には任意選択で第１のｔｒａｃｒ伸長部）と連結する役割を果たす。ループはｃｒＲＮＡフラッグポール領域とｔｒａｃｒとを共有結合的又は非共有結合的に連結し得る。ある実施形態において、この連結は共有結合性である。ある実施形態において、ループはｃｒＲＮＡフラッグポール領域とｔｒａｃｒとを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは第１のフラッグポール伸長部と第１のｔｒａｃｒ伸長部とを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒのドメインとの間に介在する共有結合であるか、又はそれを含む。典型的には、ループは１ヌクレオチド以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを含む。
ｄｇＲＮＡ分子では、２つの分子は、ｃｒＲＮＡの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域）とｔｒａｃｒの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なｔｒａｃｒのドメイン）との間のハイブリダイゼーションによって会合することができる。
多様なループがｓｇＲＮＡにおける使用に好適である。ループは共有結合からなり得、又は１又は数ヌクレオチドほどの短さ、例えば、１、２、３、４、又は５ヌクレオチド長であり得る。ある実施形態において、ループは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ヌクレオチド長であるか又はそれを超える。ある実施形態において、ループは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、又は２〜５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ループは天然に存在する配列と相同性を共有するか又はそれに由来する。ある実施形態において、ループは、本明細書に開示されるループと少なくとも５０％の相同性を有する。ある実施形態において、ループは、配列番号１８６を含む。
ドメインのヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に記載される修飾を有し得る。
４）第２のフラッグポール伸長部
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、又は存在する場合には第１のフラッグポール伸長部の３’側に、本明細書において第２のフラッグポール伸長部と称される追加的な配列を含み得る。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、又は２〜４ヌクレオチド長である。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であるか又はそれを超える。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、配列番号１８５を含む。
５）Ｔｒａｃｒ：
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の結合に必要な核酸配列である。理論によって拘束されるものではないが、各Ｃａｓ９種が特定のｔｒａｃｒ配列に関連付けられると考えられる。ｔｒａｃｒ配列はｓｇＲＮＡ及びｄｇＲＮＡの両方のシステムで利用される。ある実施形態において、ｔｒａｃｒは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｔｒａｃｒからの配列を含むか又はそれに由来する。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール部分にハイブリダイズする一部分、例えば少なくともある生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なｃｒＲＮＡフラッグポール領域との相補性を有する一部分（ときに本明細書においてｔｒａｃｒフラッグポール領域又はｃｒＲＮＡフラッグポール領域に相補的なｔｒａｃｒドメインと称されることもある）を有する。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域とハイブリダイズするｔｒａｃｒのドメインは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは連続している。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは不連続であり、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ（配列番号１９１）を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡ（配列番号１９２）を含む。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するｔｒａｃｒの配列の５’側のｔｒａｃｒ上に配置される。
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子にさらに結合するドメインをさらに含む。理論によって拘束されるものではないが、異なる種のＣａｓ９は異なるｔｒａｃｒ配列に結合すると考えられる。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、本明細書に開示されるＣａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１９３）
を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１９４）
を含む。
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号１８７を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号１８８を含む。
ｔｒａｃｒのヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、ｇＲＮＡの５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方に逆位脱塩基残基を含む。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、ポリヌクレオチドの５’末端の残基間に１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの５’残基間、最初の３つの５’残基の各々の間、最初の４つの５’残基の各々の間、又は最初の５つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含む。実施形態において、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分は、それに代えて又は加えて、ポリヌクレオチドの３’末端の残基間に１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの３’残基間、最初の３つの３’残基の各々の間、最初の４つの３’残基の各々の間、又は最初の５つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含み（例えば、５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含み、例えばそれからなり）、且つ最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含む（例えば、３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）。ある実施形態において、上記に記載されるホスホロチオエート修飾のいずれかが、ポリヌクレオチドの５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方における逆位脱塩基残基と組み合わされる。かかる実施形態において、逆位脱塩基ヌクレオチドはリン酸結合又はホスホロチオエート結合によって５’及び／又は３’ヌクレオチドに連結され得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、２’Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドを１つ以上含む。実施形態において、５’残基の最初の１、２、３つ又はそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、３’残基の最初の１、２、３つ又はそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、５’残基の最初の１、２、３つ又はそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、且つ３’残基の最初の１、２、３つ又はそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。ある実施形態において、５’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、且つ３’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、５’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、且つ末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、２’Ｏ−メチル修飾のいずれか、例えば上記に記載したとおりのものが、１つ以上のホスホロチオエート修飾、例えば上記に記載したとおりのもの、及び／又は１つ以上の逆位脱塩基修飾、例えば上記に記載したとおりのものと組み合わされ得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、且つ最初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾を含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、且つ末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、最初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、及び５’末端及び３’末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ及び／又はｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、及び末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、及び５’末端及び３’末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号２５１）
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；及び
ｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号２５１）
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；及び
ｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号２５２）
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；及び
ｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号２５２）
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；及び
ｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート結合を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２５３）
（式中、Ｎは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；及び
ｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、及び＊はホスホロチオエート結合を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
Figure 2020505934
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、及びＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端及び／又は３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
６）第１のＴｒａｃｒ伸長部
ｇＲＮＡが第１のフラッグポール伸長部を含む場合、ｔｒａｃｒは第１のｔｒａｃｒ伸長部を含み得る。第１のｔｒａｃｒ伸長部は、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドに相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号１８９を含む。一部の態様において第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号１８９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の相同性である核酸を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部又は全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、標的化ドメインの３’側に配置された以下を含み得る：
Figure 2020505934
ｅ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｄ）のいずれか；
ｆ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｄ）のいずれか；又は
ｇ）５’末端（例えば、５’側端、例えば、標的化ドメインの５’側）に、少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｆ）のいずれか。実施形態において、上記ａ）〜ｇ）のいずれかは、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される。
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、
［標的化ドメイン］−
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなる。
一部の実施形態において、ｄｇＲＮＡは以下を含み得る：
５’から３’に、好ましくは標的化ドメインの直ちに３’側に配置された以下を含むｃｒＲＮＡ：
ａ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１８２）；
ｂ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１８３）；
ｃ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号１９９）；
ｄ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号２００）；
ｅ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２０１）；
ｆ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２０２）；又は
ｇ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ （配列番号２２６）：
及び５’から３’に以下を含むｔｒａｃｒ：
Figure 2020505934
ｋ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；
ｌ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；又は
ｍ）５’末端に（例えば、５’側端に）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｌ）のいずれか。
ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば転写にＵ６プロモーターが使用される場合、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば転写にＨＩプロモーターが使用される場合、３’配列ＵＵＵＵを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて変わり得る数の３’Ｕを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、Ｔ７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えばインビトロ転写を用いてＲＮＡ分子が作成される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えばｐｏｌ−ＩＩプロモーターを用いて転写がドライブされる場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される）、配列番号２０１を含む、例えばそれからなる配列と、
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される）、配列番号２０２を含む、例えばそれからなる配列と、
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２２６）を含む、例えばそれからなる配列と、
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２２６）を含む、例えばそれからなる配列と、
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインの直ちに３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２０１）を含む、例えばそれからなる配列と、
Figure 2020505934
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ＩＩ．非欠失ＨＰＦＨ領域を指向するｇＲＮＡ標的化ドメイン
以下の表に、本発明のｇＲＮＡ分子のための、及び本発明の様々な態様、例えばグロビン遺伝子、例えば胎児ヘモグロビン遺伝子又はヘモグロビンβ遺伝子の発現の改変に用いられる、非欠失ＨＰＦＨ領域を指向する標的化ドメインを提供する。
Figure 2020505934
Figure 2020505934
Figure 2020505934
Figure 2020505934
Figure 2020505934
以下の表２は、ｇＲＮＡ分子に含まれる場合、実施例に記載される方法に従って７日で（例えば、修飾ＨＳＰＣから分化した赤血球細胞において）胎児ヘモグロビンの少なくとも１７％の増加をもたらす標的化ドメインを示す。これらの標的化ドメインのいずれかを含むｇＲＮＡ分子は、本明細書においてまとめてＴｉｅｒ ２ ｇＲＮＡ分子と呼ばれる。
Figure 2020505934
以下の表３ａ及び表３ｂは、ｇＲＮＡ分子に含まれる場合、実施例に記載される方法に従って７日で（例えば、修飾ＨＳＰＣから分化した赤血球細胞において）胎児ヘモグロビンの最も多い増加をもたらす標的化ドメインを示す。これらの標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子は、本明細書においてまとめてＴｉｅｒ １（例えば、Ｔｉｒｒ １ａ又はＴｉｅｒ １ｂ）ｇＲＮＡ分子と呼ばれる。
Figure 2020505934
Figure 2020505934
ＩＩＩ．ｇＲＮＡの設計方法
ｇＲＮＡの設計方法が、標的配列の選択、設計及び検証方法を含め、本明細書に記載される。例示的標的化ドメインも本明細書に提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込むことができる。
標的配列の選択及び検証方法並びにオフターゲット分析については、例えば、Ｍａｌｉ ｅｌ ａｌ．，２０１３ ＳＣＩＥＮＣＥ ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，２０１３ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ ｅｔ ａｌ，２０１４ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭ ＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１４ ＮＡＴ ＭＥＴＨＯＤＳ ｌｌ（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ ｅｌ ａｌ，２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ Ａ ｅｌ ａｌ，２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
例えば、ソフトウェアツールを使用してユーザーの標的配列の範囲内でｇＲＮＡの選択を最適化する、例えば、ゲノムにわたる全オフターゲット活性を最小限に抑えることができる。オフターゲット活性は切断以外であり得る。ツールは、可能なｇＲＮＡの選択毎に、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いて、特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）に至るまでのミスマッチ塩基対を含有するゲノムにわたる全てのオフターゲット配列（例えば、ＮＡＧ ＰＡＭ又はＮＧＧ ＰＡＭのいずれかの前にあるもの）を同定し得る。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に導き出された重み付けスキームを用いて予想し得る。次に、可能な各ｇＲＮＡが、その総合的な予想オフターゲット切断に従い順位付けされる。上位順位のｇＲＮＡが、オンターゲット切断が最大でオフターゲット切断が最小である可能性が高いものに相当する。他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動試薬設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用のプライマー設計、及び次世代シーケンシングによるオフターゲット切断のハイスループット検出及び定量化用のプライマー設計もツールに含まれ得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり判定することができる。
ソフトウェアアルゴリズムを用いて潜在的ｇＲＮＡ分子の初期リストを作成し得るが、切断効率及び特異性は必ずしも予測値を反映しているとは限らず、ｇＲＮＡ分子は、典型的には、特定の細胞株、例えば初代ヒト細胞株、例えばヒトＨＳＰＣ、例えばヒトＣＤ３４＋細胞でスクリーニングして、例えば、切断効率、インデル形成、切断特異性及び所望の表現型の変化を決定する必要がある。これらの特性は本明細書に記載される方法によってアッセイし得る。
本発明の態様において、ＧＣＲ−０００１の標的化ドメイン（配列番号１、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−０００６の標的化ドメイン（配列番号６、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−０００８の標的化ドメイン（配列番号８、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００９の標的化ドメイン（配列番号９、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００１０の標的化ドメイン（配列番号１０、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００１１の標的化ドメイン（配列番号１１、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００１２の標的化ドメイン（配列番号１２、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００２８の標的化ドメイン（配列番号２８、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００３４の標的化ドメイン（配列番号３４、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００４５の標的化ドメイン（配列番号４５、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００４６の標的化ドメイン（配列番号４６、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００４７の標的化ドメイン（配列番号４７、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００４８の標的化ドメイン（配列番号４８、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００５０の標的化ドメイン（配列番号５０、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００５１の標的化ドメイン（配列番号５１、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００５３の標的化ドメイン（配列番号５３、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００５４の標的化ドメイン（配列番号５４、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００５８の標的化ドメイン（配列番号５８、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００６２の標的化ドメイン（配列番号６２、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００６３の標的化ドメイン（配列番号６３、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
本発明の態様において、ＧＣＲ−００６７の標的化ドメイン（配列番号６７、下に下線を引かれた非修飾配列）を含むｇＲＮＡ、例えば以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞及び他の態様及び実施形態において有用である。
Figure 2020505934
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は、隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、及び「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵ）は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば、本明細書に記載される本発明の方法、細胞、及び他の態様及び実施形態において特に有用である。
ＩＶ．Ｃａｓ分子
Ｃａｓ９分子
好ましい実施形態において、Ｃａｓ分子はＣａｓ９分子である。本明細書に記載される方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を使用することができる。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子が本明細書における開示の多くの主題であるが、本明細書に挙げる他の種のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、それに由来するＣａｓ９分子、又はそれをベースとするＣａｓ９分子も同様に使用することができる。換言すれば、他のＣａｓ９分子、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及び／又は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書に記載されるシステム、方法及び組成物で用いられ得る。さらなるＣａｓ９種としては、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アリサイクリフィルス・デニトリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラド（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｄ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスティス属種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、黄色球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サブドリグラヌルム属種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、又はベルミネフォロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
Ｃａｓ９分子は、その用語が本明細書において使用されるとき、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒのドメインの配列）と相互作用し、且つｇＲＮＡ分子と協力して標的配列及びＰＡＭ配列を含む部位に局在化する（例えば、それを標的化するか又はそこにホーミングする）ことのできる分子を指す。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は標的核酸分子の切断能を有し、これは本明細書では活性Ｃａｓ９分子と称され得る。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は以下の活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活性、すなわち核酸分子の一本鎖、例えば非相補鎖又は相補鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち二本鎖核酸の両方の鎖を切断して二本鎖切断を作り出す能力、これはある実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；及びヘリカーゼ活性、すなわち二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
ある実施形態において、酵素的に活性なＣａｓ９分子は両方のＤＮＡ鎖を切断して二本鎖切断を生じさせる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は一方の鎖のみ、例えば、ｇＲＮＡがハイブリダイズする方の鎖、又はｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性とＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、活性な又は切断コンピテントなＨＮＨ様ドメインと、不活性な又は切断インコンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、不活性な又は切断インコンピテントなＨＮＨ様ドメインと、活性な又は切断コンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子が標的核酸と相互作用してそれを切断する能力は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある実施形態において、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。異なる細菌種の活性Ｃａｓ９分子は異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある実施形態において、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧを認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｍａｌｉ ｅｌ ａｉ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい。ある実施形態において、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧＮＧ及びＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝Ａ又はＴ）を認識し、これらの配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０、及びＤｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。ある実施形態において、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧ又はＮＡＡＲ（Ｒ−Ａ又はＧ）を認識し、この配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１ ３９０−１４００を参照されたい。
ある実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）を認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｒａｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，ｖｏｌ．５２０，２０１５，ｐｐ．１８６−１９１を参照されたい。ある実施形態において、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＥＡＲＬＹ ＥＤＩＴＩＯＮ ２０１３，１−６を参照されたい。Ｃａｓ９分子がＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２，３３７：８１６に記載される形質転換アッセイを用いて決定することができる。
幾つかのＣａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と併せてコア標的ドメインにホーミングする（例えば、標的化又は局在化される）能力を有するが、標的核酸を切断する能力は有しない、又は効率的な比率で切断する能力は有しない。切断活性を全く有しない、又は実質的に有しないＣａｓ９分子は、本明細書では、不活性Ｃａｓ９（酵素的に不活性なＣａｓ９）、デッドＣａｓ９、又はｄＣａｓ９分子と称され得る。例えば、不活性Ｃａｓ９分子は切断活性を欠き、又は実質的に低い、例えば本明細書に記載されるアッセイによって計測したときに参照Ｃａｓ９分子の２０、１０、５、１又は０．１％未満の切断活性を有し得る。
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子については、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３；１０：５，７２７−７３７に記載される。かかるＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、又はクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。例としては、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ １０２７０、ＭＧＡＳ １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ−１）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、株ＬＭＤ−９）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、株ＳＰＩＮ ２００２６）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、株ＵＡ １５９、ＮＮ２０２５）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、株ＮＣＴＣ１ １５５８）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、株ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２０６９）、Ｓ．エクイナス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ ９８１２、ＭＧＣＳ １２４）、Ｓ．ディスガラクティアエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＧＧＳ １２４）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ ７００３３８）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、株Ｆ０２１１）、Ｓ．アガラクティアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株Ｆ６８５４）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、例えば、株Ｃｌｉｐ ｌ ２６２）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、株ＤＳＭ １５９５２）、又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、株１，２３１，４０８）のＣａｓ９分子が挙げられる。さらなる例示的Ｃａｓ９分子は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１−６）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子又は不活性Ｃａｓ９分子は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列又は天然に存在するＣａｓ９分子配列、例えば、本明細書に挙げられるか又はＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３，１０：５，’Ｉ２’Ｉ−Τ，１，Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１−６に記載される種のＣａｓ９分子と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、又は４０％以下のアミノ酸残基が異なるか、それと１、２、５、１０又は２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下だけ異なるか、又はそれと同一である。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
Ｃａｓ９：
Figure 2020505934
Figure 2020505934
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Figure 2020505934
Figure 2020505934
と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、又は４０％以下のアミノ酸残基が異なるか、それと１、２、５、１０又は２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下だけ異なるか、又はそれと同一である。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、正電荷アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジン）に対して非荷電又は非極性アミノ酸、例えばアラニンを前記位置に導入する１つ以上の突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、突然変異は、Ｃａｓ９のｎｔ溝にある１つ以上の正電荷アミノ酸に対する突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５の８５５位における突然変異、例えば、配列番号２０５の８５５位における非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５と比べて配列番号２０５の８５５位にのみ、例えば、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を有する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５の８１０位における突然変異、１００３位における突然変異、及び／又は１０６０位における突然変異、例えば配列番号２０５の８１０位、１００３位、及び／又は１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５と比べて配列番号２０５の８１０位、１００３位、及び１０６０位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５の８４８位における突然変異、１００３位における突然変異、及び／又は１０６０位における突然変異、例えば配列番号２０５の８４８位、１００３位、及び／又は１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５と比べて配列番号２０５の８４８位、１００３位、及び１０６０位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１５年１２月１日、Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７においてオンラインで利用可能）に記載されるとおりのＣａｓ９分子である。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号２０５の８０位に突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の８０位にロイシンを含む（すなわちＣ８０Ｌ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号２０５の５７４位に突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の５７４位にグルタミン酸を含む（すなわちＣ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号２０５の８０位における突然変異及び５７４位における突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の８０位にロイシン、及び配列番号２０５の５７４位にグルタミン酸を含む（すなわちＣ８０Ｌ突然変異及びＣ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の溶解特性を改善すると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号２０５の１４７位に突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の１４７位にチロシンを含む（すなわちＤ１４７Ｙ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号２０５の４１１位に突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の４１１位にスレオニンを含む（すなわちＰ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号２０５の１４７位における突然変異及び４１１位における突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の１４７位にチロシン、及び配列番号２０５の４１１位にスレオニンを含む（すなわちＤ１４７Ｙ突然変異及びＰ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の例えば酵母におけるターゲティング効率を改善すると考えられる。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号２０５の１１３５位に突然変異を含み、例えば、配列番号２０５の１１３５位にグルタミン酸を含む（すなわちＤ１１３５Ｅ突然変異を有する配列番号２０５を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子のＮＡＧ ＰＡＭ配列と比べたＮＧＧ ＰＡＭ配列に対する選択性を改善すると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、特定の位置に非荷電又は非極性アミノ酸、例えばアラニンを導入する１つ以上の突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５の４９７位における突然変異、６６１位における突然変異、６９５位における突然変異及び／又は９２６位における突然変異、例えば配列番号２０５の４９７位、６６１位、６９５位及び／又は９２６位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号２０５の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５と比べて配列番号２０５の４９７位、６６１位、６９５位、及び９２６位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子によるオフターゲット部位の切断を低減すると考えられる。
Ｃａｓ９分子に対する本明細書に記載される突然変異は、組み合わされ得、本明細書に記載される融合又は他の修飾のいずれかと組み合わせて、そのＣａｓ９分子を本明細書に記載されるアッセイで試験し得ることが理解されるであろう。
本明細書に開示される本発明の実施には、様々なタイプのＣａｓ分子を使用することができる。一部の実施形態において、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。他の実施形態において、他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型又はＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用され得る。例示的Ｃａｓ分子（及びＣａｓシステム）については、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｉ，ＰＬｏＳ ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ ２００５，１（６）：ｅ６０及びＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２０１ １，９：４６７−４７７（両方の参考文献の内容が全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；又はｇＲＮＡ分子と一緒になって標的核酸に局在化する能力。
改変Ｃａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に関連する能力；及び核酸上の部位を標的化する（又はそこに局在化する）能力（例えば、ＰＡＭ認識及び特異性）を含め、幾つもの特性を有する。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はこれらの特性の全て又は一部を含み得る。典型的な実施形態において、Ｃａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協力して核酸の部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、又はヘリカーゼ活性はＣａｓ９分子でより広く異なり得る。
所望の特性を有するＣａｓ９分子は、幾つもの方法で、例えば、親の、例えば天然に存在するＣａｓ９分子の改変によって所望の特性を有する改変Ｃａｓ９分子を提供することにより作製し得る。例えば、親Ｃａｓ９分子と比べた１つ以上の突然変異又は違いを導入することができる。かかる突然変異及び違いには、置換（例えば、保存的置換又は非必須アミノ酸の置換）；挿入；又は欠失が含まれる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子と比べて１つ以上の突然変異又は違い、例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０個以上の突然変異、２００、１００、又は８０個未満の突然変異を含み得る。
ある実施形態において、１つ又は複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に実質的な効果を及ぼさない。ある実施形態において、１つ又は複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に対して実質的な効果を及ぼす。ある実施形態において、例示的活性には、ＰＡＭ特異性、切断活性、及びヘリカーゼ活性の１つ以上が含まれる。１つ又は複数の突然変異は、例えば、１つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイン；ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインの外側の領域に存在し得る。一部の実施形態において、１つ又は複数の突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに存在する。一部の実施形態において、１つ又は複数の突然変異はＨＮＨ様ドメインに存在する。一部の実施形態において、突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインの両方に存在する。
詳細な配列、例えば置換が、ターゲティング活性、切断活性などの１つ以上の活性に影響を及ぼし得るか否かは、例えば、その突然変異が保存されたものかどうかを判定することにより、又は第ＩＩＩ節に記載される方法により、判定又は予想することができる。ある実施形態において、「非必須」アミノ酸残基とは、Ｃａｓ９分子との関連において使用されるとき、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効にすることなく、又はより好ましくはそれを実質的に改変することなくＣａｓ９分子、例えば天然に存在するＣａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から改変することのできる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基の変化は実質的な活性（例えば、切断活性）の喪失をもたらす。
改変されたＰＡＭ認識を有するか又はＰＡＭ認識のないＣａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）について上記に記載したＰＡＭ認識配列を認識することができる。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は天然に存在するＣａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子との関連性がないＰＡＭ特異性、又はそれが最も近い配列相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子との関連性がないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓ９分子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識を改変する、例えばＣａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列を改変してオフターゲット部位を減少させる、及び／又は特異性を向上させるか、又はＰＡＭ認識要件をなくすことができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識配列の長さを増加させ、及び／又はＣａｓ９特異性を高い同一性レベルとなるよう向上させて、オフターゲット部位を減少させ、且つ特異性を高めることができる。ある実施形態において、ＰＡＭ認識配列の長さは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０又は１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ配列を認識する、及び／又はオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子は、定方向進化を用いて作成することができる。Ｃａｓ９分子の定方向進化に用いることのできる例示的方法及びシステムについては、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｌ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、例えば本明細書に記載される方法によって評価することができる。
非切断型及び修飾切断型Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子と異なる切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子と以下のとおり異なり得る：例えば天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したときに二本鎖切断の切断（エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）を調整する、例えば低下又は増加させるその能力；例えば天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したときに核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖又は核酸分子の相補鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調整する、例えば低下又は増加させるその能力；又は核酸分子、例えば二本鎖又は一本鎖核酸分子を切断する能力を除去し得る。
修飾切断型活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性及びＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はＣａｓ９ニッカーゼであり、例えばＤＮＡの一本鎖のみを切断する。ある実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは配列番号２０５の１０位における突然変異及び／又は８４０位における突然変異を含み、例えば、配列番号２０５に対するＤ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａ突然変異を含む。
非切断型不活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、改変Ｃａｓ９分子は、核酸分子を（二本鎖核酸分子又は一本鎖核酸分子のいずれも）切断しない、又は核酸分子を著しく低い効率で、例えば、本明細書に記載されるアッセイによって例えば計測したときに参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１又は０．１％未満の効率で切断する不活性Ｃａｓ９分子である。参照Ｃａｓ９分子は、天然に存在する非修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子など、天然に存在するＣａｓ９分子であり得る。ある実施形態において、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性又は相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子である。ある実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子は、実質的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性及びＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を欠いている。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はｄＣａｓ９である。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９−５７７。
触媒的に不活性なＣａｓ９分子が転写リプレッサーと融合し得る。不活性Ｃａｓ９融合タンパク質はｇＲＮＡと複合体化し、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって指定されるＤＮＡ配列に局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、それが標的ＤＮＡを切断することはない。転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインを不活性Ｃａｓ９に融合すると、ｇＲＮＡによって指定される任意のＤＮＡ部位にそのエフェクターを動員することが可能になる。Ｃａｓ９融合タンパク質を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に標的化すると、そのプロモーター領域へのポリメラーゼの結合、例えば転写因子（例えば、転写活性化因子）とのＣａｓ９融合及び／又は核酸への転写エンハンサーの結合を遮断し、又はそれに影響を及ぼして、転写活性化を増加させるか又は阻害することができる。或いは、転写リプレッサーとのＣａｓ９融合物を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に標的化することを用いて、転写活性化を低下させることができる。
不活性Ｃａｓ９分子と融合させ得る転写リプレッサー又は転写リプレッサードメインには、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ又はＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）又はＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が含まれ得る。
別の実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子が、クロマチンを修飾するタンパク質と融合し得る。例えば、不活性Ｃａｓ９分子が、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰｌ）、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ ｌ、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１，ＲＩＺ１）、ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＳｐＬｓｄｌ／Ｓｗ，ｌ／Ｓａｆｌ １０、Ｓｕ（ｖａｒ）３−３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈｌ、ＪＡＲＩＤ １Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤＩＢ／ＰＬＵ−Ｉ、ＪＡＲ１Ｄ １Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓｌ、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａｌ、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔｌ、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ１１）及びＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴ１，ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮＴ３ｂ、ＭＥＴ１）と融合し得る。不活性Ｃａｓ９−クロマチン修飾分子融合タンパク質を使用してクロマチン状態を改変し、標的遺伝子の発現を低下させることができる。
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合し得る。代替的実施形態において、異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質の内側部分（すなわちＮ末端又はＣ末端以外の部分）に融合し得る。
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が標的核酸に結合してそれを切断する能力は、例えば、本明細書の第ＩＩＩ節に記載される方法によって判定することができる。Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９又は不活性Ｃａｓ９のいずれかの、単独での、又はｇＲＮＡ分子との複合体での活性も、遺伝子発現アッセイ及びクロマチンに基づくアッセイ、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）及びクロマチンインビボアッセイ（ＣｉＡ）を含め、当該技術分野において周知の方法によって判定し得る。
他のＣａｓ９分子融合物
実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９は、さらなる活性を付与する１つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得る。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は１つ以上の核移行配列（ＮＬＳ）、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるＮＬＳを含み得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、アミノ末端に又はその近傍に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを超えるＮＬＳを含むか、カルボキシ末端に又はその近傍に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれを超えるＮＬＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端に１つ以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端に１つ以上のＮＬＳ）である。２つ以上のＮＬＳが存在するとき、各々は、他と独立して選択され得、したがって２つ以上のコピーに単一のＮＬＳが存在することも、及び／又は１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在することもある。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮ末端又はＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸、又はそれを超える範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した正電荷リジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２０７）を有するヌクレオプラスミンバイパータイトＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２０８）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２０９）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２１０）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン−αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２１１）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２１２）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２１３）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２１４）；マウスｃ−ａｂ１ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２１５）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２１６）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２１７）；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２１８）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２１９）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２２０）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２２１）を含むか又はそれに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。他の好適なＮＬＳ配列は当該技術分野において公知である（例えば、Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２００７）７２：１３，１４３９−１４５７；Ｌａｎｇｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：８，５１０１−５）。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、例えばＣａｓ９分子のＮ端側に配置された、ＳＶ４０のＮＬＳ配列を含む。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列及びＣａｓ９分子のＣ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列を含む。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列及びＣａｓ９分子のＣ端側に配置されたヌクレオプラスミンのＮＬＳ配列を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、この分子は、例えばＮ末端又はＣ末端に、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ（６）タグ（配列番号２４７）又はＨｉｓ（８）タグ（配列番号２４８）をさらに含み得る。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子が特異的に認識されることを可能にする１つ以上のアミノ酸配列、例えばタグを含み得る。一実施形態において、タグは、ヒスチジンタグ、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるヒスチジンアミノ酸を含むヒスチジンタグである。実施形態において、ヒスチジンタグはＨｉｓ６タグ（６個のヒスチジン）（配列番号２４７）である。他の実施形態において、ヒスチジンタグはＨｉｓ８タグ（８個のヒスチジン）（配列番号２４８）である。実施形態において、ヒスチジンタグは、リンカーによってＣａｓ９分子の１つ以上の他の部分と分離され得る。実施形態において、リンカーはＧＧＳである。かかる融合物の例は、Ｃａｓ９分子ｉＰｒｏｔ１０６５２０である。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、プロテアーゼによって認識される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る（例えば、プロテアーゼ切断部位を含む）。実施形態において、切断部位はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり、例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２３０）を含む。一部の態様においてプロテアーゼ切断部位、例えばＴＥＶ切断部位は、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ６（配列番号２４７）又はＨｉｓ８タグ（配列番号２４８）とＣａｓ９分子の残りの部分との間に配置される。理論によって拘束されるものではないが、かかる導入により、タグを例えばＣａｓ９分子の精製に使用し、次に続いて切断して、タグがＣａｓ９分子の機能を妨げないようにすることが可能になると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ及びＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、及びＣ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号２４７）を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓタグを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号２４７））、Ｎ末端ＮＬＳ、及びＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ及びＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号２４７））を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ及びＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号２４７））を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−Ｈｉｓタグを含み）、例えば、ここで、ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０６））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ８タグ（配列番号２４８））、Ｎ末端切断ドメイン（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断ドメイン（例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２３０）を含む））、Ｎ末端ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号２０６）、及びＣ末端ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号２０６）を含む（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−ＴＥＶ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）。前述の実施形態のいずれにおいてもＣａｓ９は配列番号２０５の配列を有する。或いは、前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９は、例えば本明細書に記載されるとおりの、配列番号２０５のＣａｓ９変異体の配列を有する。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９分子は、Ｈｉｓタグと分子の別の部分との間にリンカー、例えばＧＧＳリンカーを含む。上記に記載される例示的Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を以下に提供する。「ｉＰｒｏｔ」識別名は図６０のものと一致する。
Figure 2020505934
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Ｃａｓ９分子をコードする核酸
Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子又は不活性Ｃａｓ９分子をコードする核酸が本明細書に提供される。
Ｃａｓ９分子をコードする例示的核酸は、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１３，３９９（６１２１）：８１９−８２３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＣＥＬＬ ２０１３，１５３（４）：９１０−９１８；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１３，３９９（６１２１）：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば第ＸＩＩＩ節に記載するとおり、化学的に修飾することができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは以下の特性の１つ以上、例えば全てを有する：これはキャッピングされている、ポリアデニル化されている、５−メチルシチジン及び／又はプソイドウリジンで置換されている。
加えて又は代わりに、合成核酸配列は、コドン最適化され得、例えば少なくとも１つのまれな頻度のコドン又は低頻度のコドンが高頻度のコドンに置き換えられている。例えば、合成核酸は、例えば本明細書に記載される哺乳類発現系における発現に例えば最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を導くことができる。
以下に、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的コドン最適化核酸配列を提供する。
Figure 2020505934
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以下に、配列番号２４４を含むＣａｓ９分子をコードする例示的コドン最適化核酸配列を提供する。
Figure 2020505934
Figure 2020505934
Figure 2020505934
上記のＣａｓ９配列をＣ末端でペプチド又はポリペプチドと融合させる場合（例えば、Ｃ末端で転写リプレッサーと融合した不活性Ｃａｓ９）、終止コドンは取り除かれるであろうことが理解される。
Ｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子の産生のための核酸、ベクター及び細胞も本明細書において提供される。ポリペプチド分子の組換え産生は、当業者に公知の技術を用いて行われ得る。例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子などのポリペプチド分子の組換え産生のための分子及び方法が本明細書に記載される。本明細書との関連において使用するとき、「組換え」分子及び産生は、目的の分子をコードする核酸に関してトランスジェニック又は染色体導入である動物（例えば、マウス）から単離されるポリペプチド、それから調製されるハイブリドーマ、この分子を発現するように変換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される分子、組換え、コンビナトリアルライブラリから単離される分子、及び分子（又はその一部分）をコードする遺伝子の全て又は一部分を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製又は単離される分子など、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離される全てのポリペプチド（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）を含む。組換え産生は、宿主細胞、例えば本明細書に記載される分子、例えばＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子をコードする核酸を含む宿主細胞に由来し得る。
例えば、本明細書に記載されるとおりの分子（例えば、Ｃａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子）をコードする核酸分子が本明細書において提供される。配列番号２３３〜配列番号２４４のいずれか１つをコードするか、又は配列番号２３３〜配列番号２４４のいずれかの断片をコードするか、又は配列番号２３３〜配列番号２４４のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子が具体的に提供される。
上記の核酸分子のいずれかを含む、例えば本明細書に記載されるとおりのベクターが本明細書において提供される。実施形態において、前記核酸分子は、プロモーター、例えばベクターが導入される宿主細胞内で作動可能なプロモーターに作動可能に連結される。
本明細書に記載される１つ以上の核酸分子及び／又はベクターを含む宿主細胞が本明細書において提供される。実施形態において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞である。実施形態において、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。実施形態において、宿主細胞は、酵母又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。実施形態において、宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。かかる宿主細胞は、本明細書に記載される組換え分子、例えば、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９又はｇＲＮＡ分子の産生に使用され得る。
ＶＩ．候補分子の機能分析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｌ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
ＶＩＩ．鋳型核酸（核酸導入用）
用語「鋳型核酸」又は「ドナー鋳型」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾、例えば切断された標的配列に又はその近傍に挿入される核酸を指す。ある実施形態において、標的配列の又はその近傍の核酸配列が、典型的には１つ又は複数の切断部位に又はその近傍に鋳型核酸の配列の一部又は全てを有するように修飾される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖ＤＮＡである。
実施形態において、鋳型核酸は、グロビンタンパク質、例えばβグロビンをコードする配列を含み、例えばβグロビン遺伝子を含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは１つ以上の突然変異、例えば抗鎌状化突然変異を含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｔ８７Ｑを含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｇ１６Ｄを含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｅ２２Ａを含む。ある実施形態において、βグロビン遺伝子は、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２Ａ及びＴ８７Ｑを含む。実施形態において、鋳型核酸は、１つ以上の調節エレメント、例えば、プロモーター（例えば、ヒトβグロビンプロモーター）、３’エンハンサー、及び／又はグロビン遺伝子座制御領域の少なくとも一部分（例えば、１つ以上のＤＮアーゼＩ高感受性部位（例えば、ヒトグロビン遺伝子座のＨＳ２、ＨＳ３及び／又はＨＳ４））をさらに含む。
他の実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンをコードする配列を含み、例えばγグロビン遺伝子を含む。実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンタンパク質の２つ以上のコピーをコードする配列を含み、例えば、２つ以上、例えば２つのγグロビン遺伝子配列を含む。実施形態において、鋳型核酸は１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーをさらに含む。
ある実施形態において、鋳型核酸は、相同組換え修復イベントに関与することによって標的位置の構造を改変する。ある実施形態において、鋳型核酸は標的位置の配列を改変する。ある実施形態において、鋳型核酸は標的核酸への修飾された、又は天然に存在しない塩基の取込みをもたらす。
本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異は、本明細書で考察する手法の１つを用いて修正し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修正される。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた相同的組換え（ＨＲ）によって修正される。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって修正される。他の実施形態において、目的の分子をコードする核酸が、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾された部位に又はその近傍に挿入され得る。実施形態において、鋳型核酸は、例えば本明細書に記載されるとおりの、目的の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節エレメント、例えば１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。
ＨＤＲ又はＨＲ修復及び鋳型核酸
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同的組換え（ＨＲ）を用いて標的配列を改変し、及びゲノムの突然変異を修正（例えば、修復又は編集）することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列の改変は、ドナー鋳型又は鋳型核酸に基づく修復によって起こると考えられる。例えば、ドナー鋳型又は鋳型核酸が標的配列の改変をもたらす。プラスミドドナー又は線状二本鎖鋳型を相同的組換えの鋳型として使用し得ることが企図される。さらに、一本鎖ドナー鋳型を標的配列とドナー鋳型との間の代替的相同組換え修復方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の改変の鋳型として使用し得ることが企図される。ドナー鋳型によって達成される標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存し得る。Ｃａｓ９による切断には、二本鎖切断、１つの一本鎖切断、又は２つの一本鎖切断が含まれ得る。
ある実施形態において、突然変異は単一の二本鎖切断又は２つの一本鎖切断のいずれによっても修正することができる。ある実施形態において、突然変異は、（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的配列の各側に切断が生じる２つの二本鎖切断、（４）標的配列の各側に二本鎖切断及び２つの一本鎖切断が生じる１つの二本鎖切断及び２つの一本鎖切断、（５）標的配列の各側に一対の一本鎖切断が生じる４つの一本鎖切断、又は（６）１つの一本鎖切断を作り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び鋳型を提供することにより修正し得る。
二本鎖切断の媒介による修正
ある実施形態において、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性とＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを有するＣａｓ９分子、例えば野生型Ｃａｓ９によって二本鎖切断が達成される。かかる実施形態には単一のｇＲＮＡのみが必要である。
一本鎖切断の媒介による修正
他の実施形態において、ニッカーゼ活性、例えばＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性又はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子によって２つの一本鎖切断、すなわちニックが達成される。かかる実施形態には、各一本鎖切断の配置につき１つずつ、２つのｇＲＮＡが必要である。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。
ある実施形態において、ニッカーゼはＨＮＨ活性を有し、例えば、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えばＤ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子である。Ｄ１０ＡはＲｕｖＣを不活性化する。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、そこにＮＧＧ ＰＡＭを有しない相補鎖）を切断することになる。他の実施形態において、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｈ８４０ＡはＨＮＨを不活性化する。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ ＰＡＭを有し、且つその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）を切断する。
ニッカーゼ及び２つのｇＲＮＡを使用して２つの一本鎖ニックを配置する実施形態において、１つのニックは、標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは、−鎖上にある。ＰＡＭは、外側に面している。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが約０〜５０、０〜１００、又は０〜２００ヌクレオチドだけ分離されるように選択することができる。ある実施形態において、２つのｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的な標的配列間にオーバーラップはない。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、オーバーラップせず、５０、１００、又は２００ヌクレオチドほども分離されている。ある実施形態において、２つのｇＲＮＡを使用すると、例えばオフターゲット結合が減少することにより特異性が増加し得る（Ｒａｎ ｅｌ ａｌ．，ＣＥＬＬ ２０１３）。
ある実施形態では、単一のニックを使用してＨＤＲが誘導され得る。本明細書では、単一のニックを使用して所与の切断部位におけるＨＤＲ、ＨＲ又はＮＨＥＪ率を増加させ得ることが企図される。
標的位置に対する二本鎖切断又は一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断点又は一本鎖切断点は、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、距離は５０、１００、２００、３００、３５０又は４００ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点は、末端リセクション間に切断点がエキソヌクレアーゼ媒介性の除去を受ける領域内にあるように、標的位置に十分に近くなければならないと考えられる。ドナー配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得ることに伴い、標的位置と切断点との間の距離が離れ過ぎている場合、末端リセクションに突然変異が含まれないこともあり、したがって修正されないこともある。
ｇＲＮＡ（単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ）及びＣａｓ９ヌクレアーゼがＨＤＲ媒介性又はＨＲ媒介性の修正を誘導する目的で二本鎖切断を誘導する実施形態において、切断部位は標的位置から０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）だけ離れている。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５又は７５〜１００ｂｐ）だけ離れている。
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化した２つのｇＲＮＡ（独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ）がＨＤＲ媒介性の修正を誘導する目的で２つの一本鎖切断を誘導する実施形態において、近い方のニックは標的位置から０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）だけ離れており、及び２つのニックは、理想的には互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下だけ離れている（例えば、互いに９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０又は５ｂｐ以下だけ離れている）。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５又は７５〜１００ｂｐ）だけ離れている。
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断（すなわち１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）、及び２つの一本鎖切断又は対をなす一本鎖切断（すなわち２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。二本鎖切断又は対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、又は４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）だけ離れている。
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、２つの標的配列に二本鎖切断（すなわち１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）及び２つの一本鎖切断又は対をなす一本鎖切断（すなわち２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて挿入部位の上流（すなわち５’側）の標的配列を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて下流（すなわち３’側）の標的配列を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、挿入部位のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される上流（すなわち５’側）の標的配列を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される下流（すなわち３’側）の標的配列を標的化する）。二本鎖切断又は対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）である。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、又は４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）だけ離れている。
相同性アームの長さ
相同性アームは、例えばリセクションされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることを可能にするため、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域のところまで延在しなければならない。全長は、プラスミドサイズ又はウイルスパッケージング限界などのパラメータによって制限され得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント、例えばＡＬＵリピート、ＬＩＮＥリピートまでは延在しない。鋳型は同じ又は異なる長さの２つの相同性アームを有し得る。
例示的相同性アーム長さは、少なくとも２５、５０、１００、２５０、５００、７５０又は１０００ヌクレオチドを含む。
標的位置とは、本明細書で使用されるとき、Ｃａｓ９分子依存的過程によって修飾される標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、修飾Ｃａｓ９分子による標的核酸の切断及び鋳型核酸によって導かれる標的位置の修飾、例えば修正であり得る。ある実施形態において、標的位置は、１つ以上のヌクレオチドが付加される標的核酸上の２つのヌクレオチド間、例えば隣接ヌクレオチド間の部位であり得る。標的位置は、鋳型核酸によって改変、例えば修正される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の範囲内にある。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の上流又は下流にある。
典型的には、鋳型配列は標的配列との切断媒介性又は触媒性の組換えを起こす。ある実施形態において、鋳型核酸は、Ｃａｓ９媒介性の切断イベントによって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含む。ある実施形態において、鋳型核酸は、第１のＣａｓ９媒介性イベントで切断される標的配列上の第１の部位と、第２のＣａｓ９媒介性イベントで切断される標的配列上の第２の部位との両方に対応する配列を含む。
ある実施形態において、鋳型核酸は、翻訳配列のコード配列の改変を生じさせる配列、例えばタンパク質産物における１つのアミノ酸の別のアミノ酸との、例えば突然変異アレルを野生型アレルに転換する、野生型アレルを突然変異アレルに転換する、及び／又は終止コドンを導入する置換、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、又はナンセンス突然変異を生じさせる配列を含み得る。
他の実施形態において、鋳型核酸は、非コード配列の改変、例えば、エクソン又は５’若しくは３’非翻訳又は非転写領域の改変を生じさせる配列を含み得る。かかる改変には、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、及びシス作用又はトランス作用制御エレメントの改変が含まれる。
鋳型核酸は、組み込まれたときに以下を生じさせる配列を含み得る：
ポジティブ制御エレメントの活性の低下；
ポジティブ制御エレメントの活性の増加；
ネガティブ制御エレメントの活性の低下；
ネガティブ制御エレメントの活性の増加；
遺伝子の発現の低下；
遺伝子の発現の増加；
障害又は疾患に対する抵抗性の増加；
ウイルス侵入に対する抵抗性の増加；
突然変異の修正又は望ましくないアミノ酸残基の改変；
遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失又は低下、例えば、酵素の酵素活性の増加、又は遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加。
鋳型核酸は、以下を生じさせる配列を含み得る：
標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド又はそれを超える配列の変化。
ある実施形態において、鋳型核酸は、２０±１０、３０±１０、４０±１０、５０±１０、６０±１０、７０±１０、８０±１０、９０±１０、１００±１０、１１０±１０、１２０±１０、１３０±１０、１４０±１０、１５０±１０、１６０±１０、１７０±１０、１８０±１０、１９０±１０、２００±１０、２１０±１０、２２０±１０、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００又は３０００超のヌクレオチド長である。
鋳型核酸は、以下の成分を含む：
［５’相同性アーム］−［挿入配列］−［３’相同性アーム］。
相同性アームは染色体への組換えをもたらし、これにより、望ましくないエレメント、例えば突然変異又はシグネチャを置換配列に置き換えることができる。ある実施形態において、相同性アームは最も遠位の切断部位に隣接する。
ある実施形態において、５’相同性アームの３’末端は置換配列の５’末端の隣の位置である。ある実施形態において、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。
ある実施形態において、３’相同性アームの５’末端は置換配列の３’末端の隣の位置である。ある実施形態において、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。
本明細書では、一方又は両方の相同性アームを短縮することにより特定の配列リピートエレメント、例えば、Ａｌｕリピート、ＬＩＮＥエレメントが含まれることを回避し得ることが企図される。例えば、５’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回避し得る。他の実施形態では、３’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回避し得る。一部の実施形態では、５’及び３’相同性アームの両方を短縮して特定の配列リピートエレメントが含まれることを回避し得る。
本明細書では、突然変異の修正用の鋳型核酸を一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として用いられるように設計し得ることが企図される。ｓｓＯＤＮを使用するとき、５’及び３’相同性アームは最大約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ｂｐ長までの範囲となり得る。ｓｓＯＤＮについては、オリゴヌクレオチド合成が改善され続けるように、より長い相同性アームも企図される。
遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪ手法
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪを用いてまた、目的の遺伝子の配列を除去する（例えば、欠失させる）こともできる。
理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態において、本明細書に記載される方法に関連するゲノム改変は、ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪ及びＮＨＥＪ修復経路のエラープローン的性質に頼るものであると考えられる。ＮＨＥＪはＤＮＡの二本鎖切断を、その両端を共につなぎ合わせることによって修復する。しかしながら、概して、２つの適合性のある末端が二本鎖切断による形成時そのままに完全にライゲートされる場合に限り、元の配列が復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は高頻度で酵素的処理の対象となるため、それらの末端が再びつなぎ合わされる前に一方又は両方の鎖にヌクレオチドの付加又は除去が生じる。この結果、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列に挿入及び／又は欠失（インデル）突然変異が存在することになる。これらの突然変異の３分の２はリーディングフレームを改変し、したがって非機能性タンパク質を生じ得る。加えて、リーディングフレームを維持するが、多量の配列を挿入し、又は欠失させる突然変異が、タンパク質の機能を破壊し得る。重要な機能ドメインにおける突然変異はタンパク質の重要でない領域における突然変異と比べて許容されない可能性が高いため、これは遺伝子座依存的である。
ＮＨＥＪによって作成されるインデル突然変異は本質的に予測不可能である。しかしながら、所与の切断部位で特定のインデル配列が優先され、集団中に多く出現する。欠失の長さは幅広く異なり得、最も一般的には１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐ超にも容易に達し得る。挿入はそれより短い傾向があり、切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入を達成することが可能であり、その場合、挿入された配列は、ゲノムの他の領域まで又は細胞中に存在するプラスミドＤＮＡまで至ることが多い。
ＮＨＥＪは変異原性過程であるため、特定の最終配列の作成が不要である限り、ＮＨＥＪを用いて小さい配列モチーフを欠失させることができる。二本鎖切断が短い標的配列の近傍に標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失突然変異は多くの場合に望ましくないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大きいＤＮＡセグメントの欠失については、その配列の各側に１つずつ、２つの二本鎖切断を導入すると、末端間でＮＨＥＪが生じ、介在配列全体が除去され得る。これらの手法は両方とも、特異的ＤＮＡ配列の欠失に用いることができる。しかしながら、ＮＨＥＪのエラープローンの性質は、なおも修復部位にインデル突然変異を生じさせ得る。
本明細書に記載される方法及び組成物では、ＮＨＥＪ媒介性インデルの作成に、二本鎖切断Ｃａｓ９分子及び一本鎖、又はニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用することができる。遺伝子、例えば目的の遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域を標的とするＮＨＥＪ媒介性インデルを用いて目的の遺伝子をノックアウトする（すなわちその発現を消失させる）ことができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード領域は、転写開始部位の直後、コード配列の最初のエクソンの範囲内、又は転写開始部位から５００ｂｐ（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００又は５０ｂｐ未満）の範囲内の配列を含む。
標的位置に対する二本鎖又は一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的でｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を作成する実施形態において、ｇＲＮＡ、例えば単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡ分子は、標的位置のヌクレオチドにごく接近して１つの二本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜５００ｂｐ（例えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｂｐ未満）だけ離れている。
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的で２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化して２つの一本鎖切断を誘導する実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドのＮＨＥＪ修復をもたらすため２つの一本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、本質的に二本鎖切断を模倣して、異なる鎖上の同じ位置に、又は互いから数ヌクレオチド以内に切断を置くように構成される。ある実施形態において、近い方のニックは標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｂｐ未満）だけ離れており、及び２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、又は４０〜４５ｂｐ）にあり、互いから１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）だけ離れている。ある実施形態において、ｇＲＮＡは標的位置のヌクレオチドのいずれかの側に一本鎖切断を配置するように構成される。
本明細書に記載される方法及び組成物では、標的位置の両側への切断の作成に、二本鎖切断Ｃａｓ９分子及び一本鎖、又はニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用することができる。標的位置の両側に二本鎖又は対をなす一本鎖切断を作成して、２つのカット間にある核酸配列を除去し得る（例えば、２つの切断間にある領域が欠失する）。一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断を置き（すなわち１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）及び２つの一本鎖切断又は対をなす一本鎖切断を置く（すなわち２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（又はキメラ）又はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子又は経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。１つ又は複数の二本鎖切断又は対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には、標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、又は４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）だけ離れている。
他の実施形態において、鋳型核酸の挿入はマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）によって媒介され得る。例えば、Ｓａｋｓｕｍａ ｅｔ ａｌ．，「ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＰＩＴＣｈシステムと共に用いたＭＭＥＪに基づく遺伝子ノックイン（ＭＭＥＪ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＩＴＣｈ ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １１，１１８−１３３（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．１４０、２０１５年１２月１７日オンライン発表（この内容は全体として参照により援用される）を参照されたい。
ＶＩＩＩ．２つ以上のｇＲＮＡ分子を含むシステム
理論によって拘束されることを意図するものではないが、意外にも、本明細書では、連続核酸上でごく近接して位置する２つの標的配列を（例えば、各々がそのそれぞれの標的配列に又はその近傍に一本鎖又は二本鎖切断を誘導する２つのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体によって）標的化すると、２つの標的配列間に位置する核酸配列（又は核酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の切り出し（例えば、欠失）が誘導されることが示されている。一部の態様において、本開示は、連続核酸、例えば染色体、例えばそのイントロン、エクソン及び調節エレメントを含めた遺伝子又は遺伝子座上でごく近接した標的配列を標的化する標的化ドメインを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子の使用を提供する。この使用は、例えば、２つ以上のｇＲＮＡ分子を１つ以上のＣａｓ９分子と共に（又は２つ以上のｇＲＮＡ分子及び／又は１つ以上のＣａｓ９分子をコードする核酸を）細胞に導入することにより得る。
一部の態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子の標的配列は、連続核酸上で少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、又は１５，０００ヌクレオチドだけ離れ、連続核酸上で２５，０００ヌクレオチド以下だけ離れて位置する。実施形態において、これらの標的配列は、約４０００〜約６０００ヌクレオチドだけ離れて位置する。ある実施形態において、これらの標的配列は、約４０００ヌクレオチドだけ離れて位置する。ある実施形態において、これらの標的配列は、約５０００ヌクレオチドだけ離れて位置する。ある実施形態において、これらの標的配列は、約６０００ヌクレオチドだけ離れて位置する。
一部の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ同じ遺伝子内又は遺伝子座内の配列を標的とする。例示的態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子の標的配列は、ＨＢＧ１プロモーター領域内に位置する。例示的態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子の標的配列は、ＨＢＧ２プロモーター領域内に位置する。別の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ２つ以上の異なる遺伝子内又は遺伝子座内の配列を標的とする。例示的態様において、ｇＲＮＡ分子の１つ以上の標的配列は、ＨＢＧ１プロモーター領域内に位置し、他のｇＲＮＡ分子の１つ以上の標的配列は、ＨＢＧ２プロモーター領域内に位置する。
一部の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子を複数、例えば、２つ以上、例えば２つ含む組成物及び細胞を提供し、ここで、複数のｇＲＮＡ分子は、１５，０００未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２，０００未満、１１，０００未満、１０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満、７，０００未満、６，０００未満、５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満、２，０００未満、１，０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、又は３０未満のヌクレオチドだけ離れた配列を標的とする。ある実施形態において、これらの標的配列は二重鎖核酸の同じ鎖上にある。ある実施形態において、これらの標的配列は二重鎖核酸の異なる鎖上にある。
一実施形態において、本発明は、二重鎖核酸の同じ又は異なる鎖上で２５，０００未満、２０，０００未満、１５，０００未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２，０００未満、１１，０００未満、１０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満、７，０００未満、６，０００未満、５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満、２，０００未満、１，０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、又は３０未満のヌクレオチドだけ離れて配置された２つのｇＲＮＡ結合部位間に配置された核酸を切り出す（例えば、欠失させる）方法を提供する。ある実施形態において、この方法は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位間に配置されたヌクレオチドの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又は１００％の欠失をもたらす。実施形態において、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位の１つ以上の範囲内にある１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位間の領域外にある１つ以上のヌクレオチドも含む。
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えばプロモーター結合部位、エンハンサー領域、又はリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（又は介在配列の一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の上方制御又は下方制御を生じさせる。他の実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子に隣接する配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（又はその一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の欠失を生じさせる。
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、表１、例えば表２又は例えば表３ａ若しくは表３ｂの標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、本明細書に記載される方法によってエキソビボで前記ｇＲＮＡによって編集されたＨＳＰＣから（例えば、編集後７日で）分化した赤血球細胞の集団におけるＦ細胞の数の少なくとも１５％の上方制御をもたらすｇＲＮＡ分子の標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子又は領域、例えばＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域内の配列に相補的な標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子又は領域の配列に相補的な標的化ドメインを例えばＨＢＧ１プロモーター領域内で１つ及びＨＢＧ２プロモーター領域内で１つ含む。
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えばプロモーター結合部位、エンハンサー領域、又はリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（又は介在配列の一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の上方制御又は下方制御を生じさせる。別の態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（又は介在配列の一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の欠失を生じさせる。例として、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ１遺伝子に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメイン（例えば、ＨＢＧ１プロモーター領域内の標的配列を標的化する１つのｇＲＮＡ分子、及びＨＢＧ２プロモーター領域内の標的配列を標的化する第２のｇＲＮＡ分子）を含み、ＨＢＧ１遺伝子が切り出される。
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表１から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、上記の表２に挙げられる標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、上記の表３ａに挙げられるｇＲＮＡの標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、上記の表３ｂに挙げられる標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
非欠失ＨＰＦＨ領域、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域内の配列を標的化する標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子は、例えば、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域（例えば、ａ＋５５、＋５８又は＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域）内の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子及び／又は欠失ＨＰＦＨ遺伝子座の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子と共にさらに使用され得る。かかる欠失ＨＰＦＨ遺伝子座は、当該技術分野において公知であり、例えばＳａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４（参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものである。
ＩＸ．ｇＲＮＡの特性
さらに、意外にも、本明細書では、単一のｇＲＮＡ分子が２つ以上の遺伝子座（例えば、高い配列相同性を有する遺伝子座）内に標的配列を有し得ること、及びかかる遺伝子座が同じ染色体上、例えば約１５，０００ヌクレオチド未満、約１４，０００ヌクレオチド未満、約１３，０００ヌクレオチド、約１２，０００ヌクレオチド未満、約１１，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約９，０００ヌクレオチド未満、約８，０００ヌクレオチド未満、約７，０００ヌクレオチド未満、約６，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約４，０００ヌクレオチド未満、又は約３，０００ヌクレオチド未満以内に（例えば、約４，０００〜約６，０００ヌクレオチドだけ離れて）存在する場合、かかるｇＲＮＡ分子は、介在配列（又はその一部分）の切り出しをもたらし、それにより、有益な効果、例えば（本明細書に記載されるとおり）修飾ＨＳＰＣから分化した赤血球細胞内の胎児ヘモグロビンの上方制御をもたらし得ることが示されている。したがって、ある態様において、本発明は、２つの遺伝子座、例えば同じ染色体上の遺伝子座に標的配列を有する、例えば（例えば、表１に記載されるとおり）ＨＢＧ１プロモーター領域及びＨＢＧ２プロモーター領域に標的配列を有するｇＲＮＡ分子を提供する。理論によって拘束されるものではないが、かかるｇＲＮＡは、２つ以上の位置に（例えば、２つの領域の各々における標的配列に）ゲノムの切断をもたらし得ること、及びその後の修復が介在核酸配列の欠失をもたらし得ることが考えられる。同様に、理論によって拘束されるものではないが、前記介在配列の欠失は、１つ以上のタンパク質の発現又は機能に所望の効果を与え得る。
さらに、意外にも、本明細書では、１つのみの遺伝子又は領域内の配列に相補的な、例えば（ＨＢＧ２プロモーター領域内でなく）ＨＢＧ１プロモーター領域内の標的配列に相補的な、又は（ＨＢＧ１プロモーター領域内でなく）ＨＢＧ２プロモーター領域内の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子が、（本明細書に記載されるとおり）修飾ＨＳＰＣから分化した赤血球細胞内の胎児ヘモグロビンの有意な上方制御をもたらし得ることが示されている。態様において、したがって、本発明は、単一の非欠失ＨＰＦＨ領域内、例えば（例えば、表１に記載されるとおり）ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域内の標的配列に相補的であるが、任意の他の遺伝子又は領域において完全に（例えば、１００％）相補的な標的配列マッチを有さない標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
さらに、意外にも、本明細書では、ｇＲＮＡ分子及び前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが、同じ細胞型、送達方法及びｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ成分を使用すると複数の実験にわたって同様又は同一のインデルパターンを生じることが示されている。理論によって拘束されるものではないが、ある種のインデルパターンが他よりも有利であり得ると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」（例えば、１塩基対又は２塩基対の挿入又は欠失、又はｎ／３（式中、ｎ＝挿入又は欠失におけるヌクレオチドの数）が整数でない場合の任意の挿入又は欠失）をもたらす挿入及び／又は欠失を主に含むインデルが機能タンパク質の発現を低下又は消失させるのに有益であり得る。同様に、「大規模欠失」（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりｇＲＮＡについての第１及び第２の結合部位間に配置された配列を含む、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、又は３０ヌクレオチドより多い、例えば１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、５ｋｂ超又は１０ｋｂ超の欠失）を主に含むインデルも、同様に機能タンパク質の発現に効果を及ぼし得る、例えばプロモーター結合部位などの重要な調節配列の除去、又は遺伝子座の構造若しくは機能の改変に有益であり得る。所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって誘導されるインデルパターンは、意外にも、本明細書に記載されるとおり、所与の細胞型、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲシステムにわたって一貫して再現されることが分かっているが、所与の細胞においてｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムの導入時にいずれかの単一のインデル構造が必ず生じるわけではない。
したがって、本発明は、例えば、大規模欠失で主に構成されるインデルパターン又は構造を有する有益なインデルパターン又は構造を作り出すｇＲＮＡ分子を提供する。かかるｇＲＮＡ分子は、試験細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）又は目的の細胞、例えばＨＳＰＣ細胞で候補ｇＲＮＡ分子によって作り出されたインデルパターン又は構造を本明細書に記載されるとおりＮＧＳによって評価することにより選択し得る。実施例に示すとおり、所望の細胞集団に導入されると、ｇＲＮＡの標的配列に又はその近傍に大規模欠失を有する細胞が大きい割合を占める細胞の集団をもたらすｇＲＮＡ分子が発見されている。場合によっては、大規模欠失インデル形成の比率は、７５％、８０％、８５％、９０％又はそれを超える高さである。したがって本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位に又はその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりの大規模欠失を有する細胞が少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）を占める細胞の集団を提供する。本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位に又はその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりの大規模欠失を有する細胞が少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）を占める細胞の集団も提供する。
したがって、本発明は、本発明の治療方法に用いられるｇＲＮＡ分子を選択する方法であって、１）目的の標的に対する複数のｇＲＮＡ分子を提供することと、２）前記ｇＲＮＡ分子の使用によって作り出されるインデルパターン又は構造を評価することと、３）フレームシフト突然変異、大規模欠失又はこれらの組み合わせで主に構成されるインデルパターン又は構造を形成するｇＲＮＡ分子を選択することと、４）前記選択されたｇＲＮＡを本発明の方法において使用することとを含む方法を提供する。
したがって、本発明は、本発明の治療方法に用いられるｇＲＮＡ分子を選択する方法であって、１）例えば２つ以上の位置に標的配列を有する、目的の標的に対する複数のｇＲＮＡ分子を提供することと、２）前記ｇＲＮＡ分子の使用によって作り出されるインデルパターン又は構造を評価することと、３）例えば前記ｇＲＮＡ分子に曝露される細胞の集団の少なくとも約２５％又はそれを上回る細胞において、２つの標的配列間に位置する核酸配列を含む配列の切り出しを形成するｇＲＮＡ分子を選択することと、４）前記選択されたｇＲＮＡ分子を本発明の方法において使用することとを含む方法を提供する。
本発明は、さらに、細胞を改変する方法、及び改変された細胞を提供し、ここで、その細胞型では、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで常に特定のインデルパターンが作製される。本明細書に記載されるｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される最も出現頻度が高い上位５つのインデルを含め、インデルパターンが実施例の方法を用いて決定され得、例えば実施例に開示される。実施例に示すとおり、細胞の集団が作成され、ここで、細胞の大きい割合が上位５つのインデルの１つを含む（例えば、集団の細胞の３０％超、４０％超、５０％超、６０％超又はそれを超えて上位５つのインデルの１つが存在する細胞の集団。したがって、本発明は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される上位５つのインデルのいずれか１つのインデルを含む細胞、例えばＨＳＰＣ（本明細書に記載されるとおりの）を提供する。さらに、本発明は、例えば、ＮＧＳによって評価したとき、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを含む細胞が高いパーセンテージを占める細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団（本明細書に記載されるとおりの）を提供する。インデルパターン分析との関連において使用するとき、「高いパーセンテージ」は、集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）の細胞が所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを含むことを指す。他の実施形態において、細胞の集団は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを有する細胞が少なくとも約２５％（例えば約２５％〜約６０％、例えば約２５％〜約５０％、例えば約２５％〜約４０％、例えば約２５％〜約３５％）を占める。
特定のｇＲＮＡ分子が、標的細胞型のゲノム内にあるオフターゲット配列（例えば、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲット配列）にインデルを生成しない、又はオフターゲット部位（例えば、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲット配列）では標的部位におけるインデル生成頻度に対して極めて低い頻度（例えば、集団中の細胞の＜５％）でインデルを生じることも発見されている。したがって、本発明は、標的細胞型においてオフターゲットインデル形成を呈しない、又は５％未満の頻度のオフターゲットインデル形成、例えば５％の未満の頻度でＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲット部位にインデルを生じるｇＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。実施形態において、本発明は、標的細胞型においていかなるオフターゲットインデル形成も呈しないｇＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。したがって、本発明は、さらに、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位に又はその近傍にインデル（例えば、フレームシフトインデル、又は例えば本明細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生じる上位５つのインデルのいずれか１つ）を含むが、ｇＲＮＡ分子のいかなるオフターゲット部位にもインデルを含まない、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のいかなるオフターゲット部位にもインデルを含まない、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えば細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。他の実施形態において、本発明は、さらに、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位に又はその近傍にインデル（例えば、フレームシフトインデル、又は例えば本明細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生じる上位５つのインデルのいずれか１つ）を有する細胞が少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％を占めるが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位にインデル、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部の任意のオフターゲット部位にインデルを含む細胞は５％未満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満を占める、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。他の実施形態において、本発明は、さらに、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域内に（例えば、ｇＲＮＡの標的配列に少なくとも９０％相同な配列に又はその近傍に）インデルを有する細胞が少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％を占めるが、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部の任意のオフターゲット部位に又はその近傍にインデルを含む細胞は５％未満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満を占める、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団、例えば、ＨＳＰＣの集団を提供する。実施形態において、オフターゲットインデルは、遺伝子の配列内、例えば遺伝子のコード配列内に形成される。実施形態において、オフターゲットインデルは、例えば本明細書に記載されるとおりの遺伝子の配列内、例えば目的の細胞における遺伝子のコード配列内に形成されない。
Ｘ．送達／コンストラクト
成分、例えばＣａｓ９分子又はｇＲＮＡ分子、又は両方は、種々の形態で送達、製剤化、又は投与することができる。非限定的な例として、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、（１つ以上の組成物に）製剤化し、ゲノム編集イベントが所望される細胞に直接送達又は投与することができる。或いは、１つ以上の成分、例えばＣａｓ９分子又はｇＲＮＡ分子、又は両方をコードする核酸を（１つ以上の組成物に）製剤化して送達又は投与することもできる。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供され、及びＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは、別個の核酸分子上にコードされる。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは同じ核酸分子上にコードされる。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、及びＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、１つ以上の修飾を伴い提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、及びＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとして提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、及びＣａｓ９分子は、タンパク質として提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供され、及びＣａｓ９分子は、タンパク質として提供される。
送達、例えばＲＮＰの（例えば、本明細書に記載されるとおりのＨＳＰＣ細胞への）送達は、例えば、エレクトロポレーション（例えば、当該技術分野において公知のとおりの）又は細胞膜を核酸及び／又はポリペプチド分子に対して透過性にする他の方法により達成し得る。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、例えば、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）のプログラムＣＭ−１３７を用いて送達される。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約８００ボルト〜約２０００ボルト、例えば約１０００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１２００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１４００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１６００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１７００ボルトの電圧を用いて、例えば１７００ボルトの電圧で送達される。実施形態において、パルス幅／パルス長は約１０ｍｓ〜約５０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ〜約４０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ〜約３０ｍｓ、例えば約１５ｍｓ〜約２５ｍｓ、例えば約２０ｍｓ、例えば２０ｍｓである。実施形態において、１、２、３、４、５つ、又はそれを超える、例えば２つ、例えば１つのパルスが用いられる。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約１７００ボルト（例えば、１７００ボルト）の電圧、約２０ｍｓ（例えば、２０ｍｓ）のパルス幅を用いて、単一（１つ）のパルスを用いて送達される。実施形態において、エレクトロポレーションはＮｅｏｎエレクトロポレーターを使用して達成される。膜透過性にするためのさらなる技法は当該技術分野において公知であり、例えば、セルスクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）（例えば、国際公開第２０１５／０２３９８２号パンフレット及び国際公開第２０１３／０５９３４３号パンフレット（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）、ナノニードル（例えば、Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔ．，１４；５３２−３９、又は米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５８号明細書（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）及びナノストロー（例えば、Ｘｉｅ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，７（５）；４３５１−５８（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）が挙げられる。
成分がＤＮＡにコードされて送達される場合、ＤＮＡは、典型的には、発現を生じさせるため、例えばプロモーターを含む制御領域を含むことになる。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡに有用なプロモーターとしては、Ｈ１、ＥＦ−１ａ及びＵ６プロモーターが挙げられる。同様の、又は異なる強度のプロモーターを選択して、成分の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、核移行シグナル（ＮＬＳ）、例えばＳＶ４０ ＮＬＳを含み得る。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子又はｇＲＮＡ分子用のプロモーターは、独立に、誘導性、組織特異的、又は細胞特異的であり得る。
Ｃａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり対象に投与し、又は細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＤＮＡ及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルス又は非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用して）、又はこれらの組み合わせによって送達することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルス、プラスミド、ミニサークル又はナノプラスミド）によって送達される。
ベクターは、Ｃａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。ベクターは、例えばＣａｓ９分子配列に融合した、シグナルペプチド（例えば、核移行、核小体移行、ミトコンドリア移行のための）をコードする配列も含み得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合した１つ以上の核移行配列（例えば、ＳＶ４０由来）を含み得る。
ベクターには、１つ以上の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、及びスプライスアクセプター又はドナーが含まれ得る。一部の実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される（例えば、ＣＭＶプロモーター）。他の実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（例えば、Ｕ６プロモーター）。一部の実施形態において、プロモーターは調節型プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。他の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはウイルスプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは非ウイルスプロモーターである。
一部の実施形態において、ベクター又は送達媒体はミニサークルである。一部の実施形態において、ベクター又は送達媒体はナノプラスミドである。
一部の実施形態において、ベクター又は送達媒体はウイルスベクター（例えば、組換えウイルスの作成用）である。一部の実施形態において、ウイルスはＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態において、ウイルスはＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
例示的ウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。
一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞を感染させる。他の実施形態において、ウイルスは非分裂細胞を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれることができる。一部の実施形態において、ウイルスは例えばヒトにおける免疫が低下するように操作される。一部の実施形態において、ウイルスは複製コンピテントである。他の実施形態において、ウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複製及び／又はパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の遺伝子に置き換えられているか、又は欠失している。一部の実施形態において、ウイルスはＣａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子の一過性発現を生じさせる。他の実施形態において、ウイルスはＣａｓ９分子及び／又はｇＲＮＡ分子の持続的な、例えば少なくとも１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、１年、２年、又は永久的な発現を生じさせる。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂまで様々で、例えば少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、又は５０ｋｂであり得る。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレトロウイルスによって送達される。一部の実施形態において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組込みを可能にする逆転写酵素を含む。一部の実施形態において、レトロウイルスは複製コンピテントである。他の実施形態において、レトロウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複製及びパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の遺伝子に置き換えられているか、又は欠失している。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは複製欠損であり、例えば、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を含まない。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えアデノウイルスによって送達される。一部の実施形態において、アデノウイルスは、ヒトにおける免疫が低下するように操作される。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えＡＡＶによって送達される。一部の実施形態において、ＡＡＶはそのゲノムを宿主細胞、例えば本明細書に記載されるとおりの標的細胞のゲノムに組み込むことができる。一部の実施形態において、ＡＡＶは自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一体にアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。本開示の方法において使用し得るＡＡＶ血清型には、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ及び／又はＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ及び／又はＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖ及び／又はＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ １０が含まれ、またＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６などのシュードタイプＡＡＶも本開示の方法において使用することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つ以上のハイブリッドによって送達される。
パッケージング細胞を使用して、宿主又は標的細胞を感染させる能力を有するウイルス粒子が形成される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングすることのできる２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングすることのできるψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主又は標的細胞への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられている。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主又は標的細胞における遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損したウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスで付与される。これ以降、ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされ、細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクターの複製及びＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いているため多量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性が高い熱処理によって低減することができる。
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型及び／又は組織型認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替的なウイルスエンベロープ糖タンパク質を有し、細胞型特異的受容体で操作されており（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体、成長因子などの標的リガンドを取り込むようなウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）、及び／又はウイルス糖タンパク質を認識する一端と、標的細胞表面の部分を認識する他端とを含む二重特異性を有する分子架橋を有するように操作されている（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン及び化学的コンジュゲーション）シュードタイプであり得る。
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型特異的発現を実現する。例えば、組織特異的プロモーターを構築して、標的細胞においてのみトランス遺伝子（Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ）が発現するように制限することができる。ベクターの特異性は、トランス遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存的制御によっても媒介され得る。ある実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との高い融合効率を有する。例えば、融合コンピテントな赤血球凝集素（ＨＡ）などの融合タンパク質を組み込んで細胞へのウイルスの取込みを増加させることができる。ある実施形態において、ウイルスベクターは核移行能力を有する。例えば、細胞壁の破壊が（細胞分裂中に）必要である、したがって非分裂細胞に感染しないウイルスを改変してウイルスのマトリックスタンパク質に核移行ペプチドを組み込み、それにより非増殖細胞の形質導入を可能にすることができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは、非ベクターベースの方法により（例えば、ネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を用いて）送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカ又はケイ酸塩（オルモシル（Ｏｒｍｏｓｉｌ））、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、又はこれらの組み合わせにより送達することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクター及び非ベクターベースの方法の組み合わせにより送達される。例えば、ビロソームは、不活化ウイルス（例えば、ＨＩＶ又はインフルエンザウイルス）と組み合わせたリポソームを含み、これにより、ウイルス方法又はリポソーム方法のいずれか単独と比べて、例えば呼吸上皮細胞においてより効率的な遺伝子トランスファーがもたらされ得る。
ある実施形態において、送達媒体は非ウイルスベクターである。ある実施形態において、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子の表面に対するペイロードに付加される）である。例示的無機ナノ粒子としては、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ ｌｖｌｎ０２）、又はシリカが挙げられる。ナノ粒子の外表面は正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができ、それによりペイロードの付加（例えば、コンジュゲーション又は捕捉）が可能となる。ある実施形態において、非ウイルスベクターは有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内部へのペイロードの捕捉）。例示的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びプロタミンで被覆されている中性ヘルパー脂質及び脂質コーティングで被覆された核酸複合体と共にカチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲシステム又はＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその成分をコードする核酸、例えばベクターのトランスファー用の例示的脂質及び／又はポリマーとしては、例えば、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、国際公開第２００５／０６０６９７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４０２１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレット、国際公開第２０１３／１０３４６７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１５／０９５３４６号パンフレット（前述の各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。ある実施形態において、媒体は、標的細胞によるナノ粒子及びリポソームのアップデート（ｕｐｄａｔｅ）を増加させるためのターゲティング修飾、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖類、及び細胞透過性ペプチドを有する。ある実施形態において、媒体は融合性及びエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。ある実施形態において、媒体は、酸によって惹起されるコンホメーション変化を受ける（例えば、それによりカーゴのエンドソームエスケープが加速する）。ある実施形態において、刺激によって切断可能なポリマーが、例えば細胞内コンパートメントにおける放出のため使用される。例えば、還元細胞環境で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。
ある実施形態において、送達媒体は生物学的非ウイルス送達媒体である。ある実施形態において、媒体は、弱毒化細菌（例えば、侵入性だが弱毒化されていて発病及びトランス遺伝子の発現を防ぐように天然に、又は人工的に操作されたもの（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ある種のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、及び修飾大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、栄養向性及び組織特異的向性を有して特異的組織を標的とする細菌、修飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。ある実施形態において、媒体は、遺伝子修飾されたバクテリオファージ（例えば、大きいパッケージング能力、低い免疫原性を有し、哺乳類プラスミド維持配列を含み、且つ組み込まれた標的リガンドを有する操作されたファージ）である。ある実施形態において、媒体は哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子を作成（例えば、「空の」粒子を精製し、続いてエキソビボでウイルスを所望のカーゴとアセンブルすることにより）することができる。媒体は、標的リガンドを組み込んで標的組織特異性を改変させるように操作することもできる。ある実施形態において、媒体は生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、対象に由来する球構造体に分解される赤血球細胞である赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングは、様々な組織又は細胞特異的リガンドの付加によって実現することができる）、又は分泌エキソソーム−エンドサイトーシス起源の対象（すなわち患者）由来膜結合型ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から作製することができ、したがって標的リガンドの必要性なしに細胞によって取り込まれ得る）である。
ある実施形態において、Ｃａｓシステムの成分、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達されるのと同じ時点で送達される。ある実施形態において、核酸分子はＣａｓ９システムの成分の１つ以上の送達の（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、又は４週間未満）前又は後に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓ９システムの成分の１つ以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれによっても送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、且つＣａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする。
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子又は不活性Ｃａｓ９融合タンパク質）及び／又はｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡは、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり、細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＲＮＡ及び／又はｇＲＮＡコードＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、又はこれらの組み合わせによって送達することができる。
タンパク質としてのＣａｓ９分子の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子又は不活性Ｃａｓ９融合タンパク質）は、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、セルスクイージング又はアブレーション（例えば、ナノニードルによる）又はこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡによるか、又はｇＲＮＡにより、例えばｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に予め複合体化することによって達成し得る。
ある態様において、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子はタンパク質として送達され、且つｇＲＮＡ分子は１つ以上のＲＮＡとして（例えば、本明細書に記載されるとおりのｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡとして）送達される。実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞への送達前に、リボ核タンパク質複合体（「ＲＮＰ」）としてｇＲＮＡ分子と複合体化される。実施形態において、ＲＮＰは、例えば本明細書に記載される細胞に、当該技術分野において公知の任意の方法、例えばエレクトロポレーションによって送達することができる。本明細書に記載されるとおり、及び理論によって拘束されるものではないが、細胞に送達されるＲＮＰの濃度が低下する場合でも、例えば本明細書に記載される標的細胞において標的配列に高い％編集率（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、又は＞９９％）をもたらすｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子を使用することが好ましい。この場合にも、理論によって拘束されるものではないが、標的細胞において（低いＲＮＰ濃度の場合を含め）標的配列の高い％編集率を生じるｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを低下した又は低い濃度で送達することは、オフターゲット編集イベントの頻度及び数を低減し得るため有益であり得る。一態様において、低い又は低下した濃度のＲＮＰを使用する場合、以下の例示的手順を用いてｄｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを作成することができる：
１．Ｃａｓ９分子及びｔｒａｃｒを溶液中に高濃度（例えば、細胞に送達される最終ＲＮＰ濃度よりも高い濃度）で提供し、これらの２つの成分を平衡化させる；
２．ｃｒＲＮＡ分子を提供し、成分を平衡化させる（それによりＲＮＰの高濃度溶液を形成する）；
３．ＲＮＰ溶液を所望の濃度に希釈する；
４．前記所望の濃度の前記ＲＮＰを標的細胞に例えばエレクトロポレーションによって送達する。
上記の手順は、上記のステップ２を省略し、且つステップ１において、溶液中に高濃度のＣａｓ９分子及びｓｇＲＮＡ分子を提供して成分を平衡化させることにより、ｓｇＲＮＡ分子で用いるように改良し得る。実施形態において、Ｃａｓ９分子及び各ｇＲＮＡ成分は溶液中に１：２比（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ）、例えば１：２モル比のＣａｓ９：ｇＲＮＡ分子で提供される。ｄｇＲＮＡ分子が使用される場合、比、例えばモル比は１：２：２（Ｃａｓ９：ｔｒａｃｒ：ｃｒＲＮＡ）である。実施形態において、ＲＮＰは２０ｕＭ以上の濃度、約２０ｕＭ〜約５０ｕＭの濃度で形成される。実施形態において、ＲＮＰは１０ｕＭ以上の濃度、例えば約１０ｕＭ〜約３０ｕＭの濃度で形成される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に１０ｕＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１ｕＭ〜約１０ｕＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に３ｕＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１ｕＭ〜約３ｕＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に１ｕＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１ｕＭ〜約１ｕＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に０．３ｕＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１ｕＭ〜約０．３ｕＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約３ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約２ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約１ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．３ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．１ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０５ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０３ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０１ｕＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される。実施形態において、ＲＮＰは、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣ細胞に、エレクトロポレーションにより、例えば本明細書に記載されるエレクトロポレーション条件を用いて送達される。
態様において、遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）の成分及び／又は遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）の１つ以上の成分をコードする核酸は、細胞を機械的に揺動させることにより、例えば細胞を制限する孔又はチャネルに前記細胞を通すことにより細胞に導入される。かかる揺動は、例えば本明細書に記載されるとおりの、遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）の成分及び／又は遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）の１つ以上の成分をコードする核酸を含む溶液中で行われ得る。実施形態において、揺動は、例えば本明細書に記載されるとおり、例えば、実施例及びＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／５４１１０号明細書（参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり、ＴＲＩＡＭＦシステムを用いて行われる。
成分のバイモーダル送達又は差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分及びｇＲＮＡ分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性及び安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、又は本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式又は差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、又は鋳型核酸に異なる薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、又は臓器に異なる組織分布、異なる半減期、又は異なる時間分布をもたらし得る。
幾つかの送達様式、例えば、細胞、又は細胞の子孫において例えば自己複製又は細胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現及び存在をもたらす。
ＸＩ．治療方法
本明細書に記載されるＣａｓ９システム、例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子及び１つ以上のＣａｓ９分子は、哺乳類、例えばヒトにおける疾患の治療に有用である。用語「〜を治療する」、「治療された」、「治療している」、及び「治療」には、ｃａｓ９システム、例えば１つ以上のｇＲＮＡ分子及び１つ以上のｃａｓ９分子を細胞に投与することにより、疾患の症状、合併症、又は生化学的徴候を予防し、又はその発生を遅延させること、疾患、病態、又は障害の症状を軽減し、又はそのさらなる発症を阻止又は阻害することが含まれる。治療には、本発明のｇＲＮＡ分子（又は２つ以上のｇＲＮＡ分子）の導入により、又は本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの導入により、又は本明細書に記載される前記細胞の調製方法のいずれかによって修飾された１つ以上の細胞、例えばＨＳＰＣ（例えば、その集団）の投与により、疾患の症状、合併症、又は生化学的徴候を予防し、又はその発生を遅延させること、疾患、病態、又は障害の症状を軽減し、又はそのさらなる発症を阻止又は阻害することも含まれ得る。治療は予防的であり得（それにより疾患を予防し、又はその発生を遅延させるか、又はその臨床的若しくは準臨床的症状の発現を予防する）、又は疾患発現後の症状の療法的抑制又は軽減であり得。治療は、本明細書に記載される療法的手段によって計測することができる。したがって、本発明の「治療」方法には、細胞へのｃａｓ９システム（例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子及び１つ以上のＣａｓ９分子）の導入によって改変された細胞を対象に投与することにより、疾患又は病態の１つ以上の症状を治癒し、その重症度を低減し、又はそれを改善すること、かかる治療がない場合の予想を超えて対象の健康又は生存を延ばすことも含まれる。例えば、「治療」には、対象の疾患症状の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超える軽減が含まれる。
本明細書、例えば表１に記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むＣａｓ９システム並びに方法及び細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）は、異常ヘモグロビン症の治療に有用である。
異常ヘモグロビン症
異常ヘモグロビン症には、赤血球細胞（ＲＢＣ）の産生低下及び／又は破壊増加（溶血）がある遺伝的原因の幾つもの貧血症が含まれる。それらには、酸素濃度を維持する能力の低下が付随する異常ヘモグロビンの産生をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。かかる障害の中には、正常なβ−グロビンを十分な量で産生できないことが関係するものもあれば、正常なβ−グロビンを全く産生できないことが関係するものもある。β−グロビンタンパク質に関連するこれらの障害は、一般にβヘモグロビン異常症と称される。例えば、β−サラセミアは、β−グロビン遺伝子の発現の部分的又は完全な欠損がＨｂＡ欠損又は欠如につながることによって起こる。鎌状赤血球貧血は、β−グロビン構造遺伝子の点突然変異が異常な（鎌状の）ヘモグロビン（ＨｂＳ）の産生につながることによって起こる。ＨｂＳは、特に脱酸素化条件下で重合し易い。ＨｂＳ ＲＢＣは正常ＲＢＣと比べて脆弱で溶血を起こし易く、最終的に貧血につながる。
ある実施形態において、αグロビン又はβグロビンの遺伝的欠陥が、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子、例えばＣＲＩＳＰＲシステムを用いた相同組換えによって修正される。
ある実施形態において、αグロビン又はβグロビンの野生型（例えば、非突然変異型）コピーをコードする遺伝子が、例えば、セーフハーバー部位、例えばＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム及び方法を用いた相同組換えによって細胞のゲノムに挿入される。
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子を用いて異常ヘモグロビン症関連遺伝子が標的化される。例示的標的としては、例えば、γ−グロビン遺伝子の制御に関連する遺伝子が挙げられる。ある実施形態において、標的は非欠失ＨＰＦＨ領域である。
胎児ヘモグロビンは（またヘモグロビンＦ又はＨｂＦ又はα２γ２も）、２つの成人α−グロビンポリペプチド及び２つの胎児β様γ−グロビンポリペプチドの四量体である。ＨｂＦは、ヒト胎児における子宮内発育期の最後の７ヵ月間及び新生児における生後約６ヵ月までの間の主要な酸素輸送タンパク質である。機能上、胎児ヘモグロビンは、発育中の胎児に母体の血流から酸素がより良好に届くように、酸素を成人型よりも高い親和性で結合可能である点が、成人ヘモグロビンと最も異なる。
新生児では、胎児ヘモグロビンは生後約６ヵ月までにほぼ完全に成人ヘモグロビンに置き換わる。成人では、胎児ヘモグロビンの産生を薬理学的に再活性化することができ、これは異常ヘモグロビン症などの疾患の治療に有用である。例えば、特定の異常ヘモグロビン症患者では、高レベルのγ−グロビン発現がβ−グロビン遺伝子産生の欠損又は障害を部分的に代償することができ、これらの疾患における臨床的重症度を改善し得る。ＨｂＦレベル又はＦ−細胞（ＨｂＦを含有する赤血球）数の増加は、異常ヘモグロビン症、例えば重症型β−サラセミア及び鎌状赤血球貧血の疾患重症度を改善することができる。
意外にも発見されたように、ＨｂＦレベル又はＦ細胞数の増加は、細胞、例えばＨＳＰＣ及び／又はＨＳＰＣ（例えば、本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子によって修飾ＨＳＰＣ）から分化した細胞内の１つ以上の非欠失ＨＰＦＨ領域におけるインデル形成に関連し得る。ある実施形態において、細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。
鎌状赤血球症
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害を持つ人は異型ヘモグロビン分子（ヘモグロビンＳ）を有し、これによって赤血球細胞が歪んで鎌状、又は三日月形の形状になり得る。この障害に特有の特徴としては、低赤血球細胞数（貧血症）、反復感染、及び周期性疼痛発作が挙げられる。
ＨＢＢ遺伝子の突然変異が鎌状赤血球症を引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ−グロビン作製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の異なる突然変異によって様々なバージョンのβ−グロビンが生じる。１つの特定のＨＢＢ遺伝子突然変異は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）として知られる異常なバージョンのβ−グロビンを作り出す。ＨＢＢ遺伝子の他の突然変異は、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）及びヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）など、さらなる異常なバージョンのβ−グロビンにつながる。ＨＢＢ遺伝子突然変異は、異常に低いレベルのβ−グロビン、すなわちβサラセミアも生じさせ得る。
鎌状赤血球症の人では、ヘモグロビン中のβ−グロビンサブユニットの少なくとも１つがヘモグロビンＳに置き換わっている。鎌状赤血球症の一般的な型である鎌状赤血球貧血では、ヘモグロビン中の両方のβ−グロビンサブユニットがヘモグロビンＳに置き換わる。他のタイプの鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中の一方のβ−グロビンサブユニットのみがヘモグロビンＳに置き換わる。他方のβ−グロビンサブユニットは、ヘモグロビンＣなど、別の異常変異体に置き換わる。例えば、鎌状ヘモグロビンＣ（ＨｂＳＣ）症の人は、β−グロビンの代わりにヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含むヘモグロビン分子を有する。ヘモグロビンＳを産生する突然変異とβサラセミアとが一緒に起こる場合、個体はヘモグロビンＳ−βサラセミア（ＨｂＳβＴｈａｌ）症を有する。
βサラセミア
βサラセミアは、ヘモグロビンの産生が低下する血液障害である。βサラセミアの人では、低レベルのヘモグロビンが体の多くの箇所の酸素欠乏につながる。罹患者は、赤血球細胞の不足も有し（貧血）、そのため青白い皮膚、脱力感、疲労、及びより重篤な合併症も生じ得る。βサラセミアの人は血液凝固異常を発症するリスクが高い。
βサラセミアは症状の重症度に応じて２つのタイプ：重症型サラセミア（クーリー貧血としても知られる）及び中間型サラセミアに分けられる。これらの２つのタイプのなかでは、重症型サラセミアがより重篤である。
ＨＢＢ遺伝子の突然変異がβサラセミアを引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ−グロビン作製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の幾つかの突然変異が任意のβ−グロビンの産生を妨げる。β−グロビンが存在しない場合、β−ゼロ（Ｂ０）サラセミアと称される。他のＨＢＢ遺伝子突然変異は何らかのβ−グロビンの産生が可能であるものの量が低下し、すなわちβ−プラス（Ｂ＋）サラセミアである。両方のタイプをもつ人が、重症型サラセミア及び中間型サラセミアと診断されている。
ある実施形態において、第１の遺伝子又は遺伝子座を標的とするＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、第２の遺伝子、例えば第２の遺伝子の突然変異によって特徴付けられる障害が治療される。例として、第１の遺伝子を、例えば編集又はペイロード送達によって標的化することにより、第２の遺伝子、例えば突然変異体の第２の遺伝子の影響を代償するか、又はそれからのさらなる損傷を抑えることができる。ある実施形態において、対象が保因する第１の遺伝子の１つ又は複数のアレルは、障害の原因ではない。例えば本明細書に示されるように、非欠失ＨＰＦＨ領域、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域にインデル形成を含むｇＲＮＡ分子は、（本明細書に記載されるとおりの）修飾ＨＳＰＣから分化した赤血球細胞における胎児ヘモグロビンの上方制御をもたらすことができ、理論によって拘束されるものではないが、かかる胎児ヘモグロビン上方制御は、鎌状突然変異を有するＨＢＢ遺伝子を代償し、補正する。
一態様において、本発明は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の増加を必要としている哺乳類、例えばヒトの治療に関する。
一態様において、本発明は、異常ヘモグロビン症と診断された、又はその発症リスクがある哺乳類、例えばヒトの治療に関する。
一態様において、異常ヘモグロビン症は、βヘモグロビン異常症である。一態様において、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症である。一態様において、異常ヘモグロビン症は、βサラセミアである。
異常ヘモグロビン症の治療方法
別の態様において、本発明は治療方法を提供する。態様において、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム及び／又は細胞を使用して、それを必要としている患者が治療される。態様において、患者は哺乳類、例えばヒトである。態様において、患者は異常ヘモグロビン症を有する。実施形態において、患者は鎌状赤血球症を有する。実施形態において、患者はβサラセミアを有する。
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、及び本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を哺乳類、例えばヒトに投与することを含む。
一態様において、本治療方法は哺乳類に細胞集団を投与することを含み、ここで、細胞集団は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、及び本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムを投与された哺乳類、例えばヒト由来の細胞集団である。一実施形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子又はＣＲＩＳＰＲシステムの投与はインビボで達成される。一実施形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子又はＣＲＩＳＰＲシステムの投与はエキソビボで達成される。
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、及び本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、又は一時的にそれらを含んでいた細胞、又は前記細胞の子孫を含む細胞集団の有効量を哺乳類、例えばヒトに投与することを含む。一実施形態において、細胞は、哺乳類にとって同種異系由来である。一実施形態において、細胞は、哺乳類にとって自己由来である。一実施形態において、細胞は、哺乳類から採取され、エキソビボで操作されて、哺乳類に戻される。
態様において、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、及び本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、又は一時的にそれらを含んでいた細胞、又は前記細胞の子孫は、幹細胞又は前駆細胞を含む。一態様において、幹細胞は、造血幹細胞である。一態様において、前駆細胞は、造血前駆細胞である。一態様において、細胞は、造血幹細胞及び造血前駆細胞の両方を含み、例えばＨＳＰＣである。一態様において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において、細胞は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない。一態様において、細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋幹細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において、細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０−細胞を含む、例えばそれからなる。ある態様において、細胞は、上記に記載される又は本明細書に記載される細胞型の１つ以上を含む集団である。
一実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はβ−サラセミアを治療する方法、又はそれを必要としている哺乳類、例えばヒトの胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）哺乳類からＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供する、例えば採取又は単離するステップ；
ｂ）前記細胞をエキソビボで、例えば細胞培養培地中に、任意選択で少なくとも１つの幹細胞増殖剤を含む組成物の有効量の存在下で提供するステップであって、それにより前記ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ；
ｃ）ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を、有効量の、本明細書に記載される標的化ドメイン、例えば表１に記載される標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、又は前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、例えば本明細書に記載される少なくとも１つのｃａｓ９分子、又は前記ｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載される１つ以上のＲＮＰをコードする核酸とを含む組成物に、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムに接触させるステップ；
ｄ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少なくとも一部）に少なくとも１つの修飾を生じさせるステップであって、それにより、例えば、前記ＨＳＰＣが赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したとき、例えばステップｃ）により接触させていない細胞に対して胎児ヘモグロビン発現が増加するステップ；及び
ｆ）前記修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む細胞の集団を哺乳類に戻すステップ
を含む。
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳類にとって同種異系由来である。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳類にとって自己由来である。態様において、ＨＳＰＣは、骨髄から単離される。態様において、ＨＳＰＣは、末梢血、例えば動員末梢血から単離される。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離される。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離される。他の態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ及びＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）の組み合わせ）が投与された対象から単離される。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離される。実施形態において、細胞は、異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病に罹患している患者、又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者に由来する。
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団をＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）についてエンリッチするステップをさらに含む。本方法の実施形態において、前記エンリッチ後、細胞、例えばＨＳＰＣの集団は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない。
実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも７０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも７５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも８０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも８５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも９０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも９５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳類に戻される細胞の集団は、少なくとも９９％の生存細胞を含む。生存率は、代表的な一部の細胞の集団を例えば当該技術分野において公知のとおりの細胞生死判別マーカーに関して染色することにより決定し得る。
別の実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はβ−サラセミアを治療する方法、又はそれを必要としている哺乳類、例えばヒトの胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）例えば哺乳類の骨髄から、哺乳類のＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供する、例えば採取又は単離するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離するステップ；
ｃ）前記ＣＤ３４＋細胞をエキソビボで提供し、及び前記細胞を例えば細胞培養培地中、少なくとも１つの幹細胞増殖剤、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．５〜約０．７５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む組成物の有効量の存在下で培養するステップであって、それにより前記ＣＤ３４＋細胞の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ；
ｄ）ＣＤ３４＋細胞の集団の細胞に、有効量の、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と、例えば本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子とを含む組成物を導入するステップであって、例えば、任意選択でＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰの形態であり、及び任意選択で前記導入は、前記細胞への前記ＲＮＰの、例えば本明細書に記載されるとおりのエレクトロポレーションによる導入である、ステップ；
ｅ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少なくとも一部）に少なくとも１つの遺伝子修飾を生じさせるステップであって、それにより、ステップｄ）で導入されたｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的なゲノム部位に又はその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを作り出すステップ；
ｆ）任意選択で、加えて、前記導入後に、例えば細胞培養培地中、少なくとも１つの幹細胞増殖剤、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．５〜約０．７５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む組成物の有効量の存在下で前記細胞を培養するステップであって、それにより細胞が少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍に増殖するステップ；
ｇ）前記細胞を凍結保存するステップ；及び
ｈ）細胞を哺乳類に戻すステップであって、哺乳類に戻される細胞が、１）赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持しており；２）赤血球細胞に分化したとき、例えばステップｅ）のｇＲＮＡによって修飾されていない細胞に対して高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む、ステップ
を含む。
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳類にとって同種異系由来である。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳類にとって自己由来である。態様において、ＨＳＰＣは骨髄から単離される。態様において、ＨＳＰＣは、末梢血、例えば動員末梢血から単離される。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離される。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離される。他の態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ及びＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）の組み合わせ）が投与された対象から単離される。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離される。実施形態において、細胞は、異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病に罹患している患者、又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者に由来する。
上記の方法の実施形態において、記載されるステップｂ）は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない細胞の集団をもたらす。
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団がＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）に関してエンリッチされることをさらに含む。
これらの方法のさらなる実施形態において、増加した胎児ヘモグロビン発現を分化する能力を有する修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）の集団が凍結保存され、哺乳類への再導入まで貯蔵される。実施形態において、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力、及び／又は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したときに高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する能力を有するＨＳＰＣの凍結保存された集団が解凍され、次に哺乳類に再導入される。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳類の内因性造血前駆細胞又は幹細胞を除去又は低減するため化学療法及び／又は放射線療法を含む。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳類の内因性造血前駆細胞又は幹細胞を除去又は低減するため化学療法及び／又は放射線療法ステップを含まない。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳類の内因性造血前駆細胞又は幹細胞を部分的に低減する（例えば、部分的リンパ球枯渇）ため化学療法及び／又は放射線療法を含む。実施形態において、患者が完全リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療された後、修飾ＨＳＰＣが哺乳類に再導入される。実施形態において、患者が部分的リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療された後、修飾ＨＳＰＣが哺乳類に再導入される。
実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるとおりの（例えば、表１に挙げられる標的化ドメインを含む、非欠失ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡと複合体化した例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子を含むＲＮＰと接触させる。
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物２である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物３である。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールである。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールであり、２〜０．１マイクロモル、例えば、１〜０．２５マイクロモル、例えば、０．７５〜０．５マイクロモルの濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットに記載される分子（例えば、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの実施例１に記載される分子）である。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約１時間〜約１５日の期間、例えば約１２時間〜約１２日の期間、例えば約１２時間〜４日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約１日〜約２日の期間、例えば約１日の期間又は約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触させるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培養である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む細胞培養培地中で約１日以下、例えば、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む細胞培養培地中で約１時間〜約１５日の期間、例えば約１２時間〜約１０日の期間、例えば約１日〜約１０日の期間、例えば約１日〜約５日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約２日〜約４日の期間、例えば約２日、約３日又は約４日の期間の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、細胞は、約１時間〜約２０日の期間、例えば約６〜１２日の期間、例えば約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、又は約１２日の期間にわたってエキソビボで培養される（例えば、前記接触させるステップの前に培養される、及び／又は前記接触させるステップの後に培養される）。
実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約１００万個の細胞（例えば、少なくとも約１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約２００万個の細胞（例えば、少なくとも約２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約３００万個の細胞（例えば、少なくとも約３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約４００万個の細胞（例えば、少なくとも約４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約５００万個の細胞（例えば、少なくとも約５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約６００万個の細胞（例えば、少なくとも約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも１００万個の細胞（例えば、少なくとも１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも２００万個の細胞（例えば、少なくとも２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも３００万個の細胞（例えば、少なくとも３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも４００万個の細胞（例えば、少なくとも４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも５００万個の細胞（例えば、少なくとも５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも６００万個の細胞（例えば、少なくとも６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約１００万個の細胞（例えば、約１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約２００万個の細胞（例えば、約２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約３００万個の細胞（例えば、約３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約４００万個の細胞（例えば、約４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約５００万個の細胞（例えば、約５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約６００万個の細胞（例えば、約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり約２×１０６個の細胞（例えば、約２×１０６個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０６個の細胞（例えば、約２×１０６個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳類に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり２×１０６個の細胞（例えば、約２×１０６個のＣＤ３４＋細胞）から患者の体重１ｋｇ当たり１０×１０６個の細胞（例えば、約２×１０６個のＣＤ３４＋細胞）の間を含む。実施形態において、修飾された細胞を含む細胞は、患者に注入される。実施形態において、修飾ＨＳＰＣを含む細胞が患者に注入される前に、患者は、リンパ球枯渇療法で治療され、例えばブスルファンで治療され、例えば完全なリンパ球枯渇ブスルファン投与計画で治療され、又は例えば減少した強度のブスルファンリンパ球枯渇投与計画で治療される。
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳類への細胞の再導入から少なくとも１５日、例えば少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又は少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するその循環ＣＤ３４＋細胞の少なくとも８０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノム部位に又はその近傍にインデルを含むことになる。理論によって拘束されるものではないが、意外にも、本明細書では、遺伝子編集システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、例えば本明細書に記載されるとおりのＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２領域を標的とするｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが、ＨＳＰＣに導入されるときに観察されるインデル及びインデルパターン（大規模欠失を含む）、及びそれらの細胞が、生物に移植され、特定のｇＲＮＡが、生物における編集された細胞集団及びその子孫において依然として検出可能なインデル及びインデルパターン（大規模インデルを含む）を含む細胞を産生し、８週間、１２週間、１６週間又は２０週間超にわたって持続することが発見された。理論によって拘束されるものではないが、生物（例えば、患者）への導入後、例えば１６週間より長く又は２０週間より長く、検出可能な細胞集団内で持続するインデルパターン又は特定のインデル（大規模欠失を含む）細胞集団が、生物又は患者への導入時に１つ以上のインデル（大規模欠失を含む）を喪失する細胞（又はその子孫）より長期の、例えば本明細書に記載される疾患又は病態（例えば、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア）の改善をもたらすのに有益であり得る。実施形態において、インデル又はインデルパターンの持続は、（例えば、前記細胞の赤血球系子孫における）上方制御された胎児ヘモグロビンに関連している。したがって、実施形態において、本開示は、生物、例えば患者への導入後、８週間超、１２週間超、１６週間超又は２０週間超にわたって、血液及び／又は骨髄）中で持続する（例えば細胞集団又はその子孫において、例えば依然として検出可能な）１つ以上のインデル（大規模欠失を含む）を含む、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳類への細胞の再導入から少なくとも１５日、例えば少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又は少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するその骨髄ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノム部位に又はその近傍にインデルを含むことになる。
実施形態において、哺乳類に再導入されるＨＳＰＣは、インビボで赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化可能であり、及び前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビン、例えば、１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビン、例えば、１細胞当たり約９〜約１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生して、例えばそれにより哺乳類の異常ヘモグロビン症が治療される。
細胞が増加した胎児ヘモグロビンを有すると特徴付けられるとき、それには、その細胞の子孫、例えば分化した子孫が増加した胎児ヘモグロビンを呈する実施形態が含まれることは理解されるであろう。例えば、本明細書に記載される方法において、改変又は修飾ＣＤ３４＋細胞（又は細胞集団）は増加した胎児ヘモグロビンを発現しないこともあるが、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化すると、細胞は増加した胎児ヘモグロビン、例えば、同様の条件下にある非修飾又は非改変細胞に対して増加した胎児ヘモグロビンを発現する。
ＸＩＩ．培養方法及び細胞の製造方法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、又は修飾されることになる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えば造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の培養方法を提供する。
ＤＮＡ修復経路阻害剤
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のｇＲＮＡ分子によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性ＤＮＡ修復機構（例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等）の各々の産物であると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生じないＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択又はエンリッチし得ると考えられる。したがって、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、方法及び他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例としては、例えば、国際公開第２０１４／１３０９５５号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。実施形態において、阻害剤はＤＮＡＰＫｃ阻害剤、例えばＮＵ７４４１である。
幹細胞増殖剤
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、又は修飾されることになる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を、薬剤で処理されていない細胞に対して増殖速度の増加、増殖レベルの増加、又は生着の増加をもたらす１つ以上の薬剤と共に培養することに関する。かかる薬剤は、本明細書では幹細胞増殖剤と称される。
ある態様において、薬剤で処理されていない細胞に対して増殖速度の増加又は増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤、例えば幹細胞増殖剤には、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）経路の阻害剤である薬剤が含まれる。態様において、幹細胞増殖剤は、国際公開第２０１３／１１０１９８号パンフレットに開示される化合物又は国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットに開示される化合物である（これらの内容は全体として参照により援用される）。
一態様において、薬剤で処理されていない細胞に対して増殖速度の増加又は増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、例えば、国際公開第２０１３／１１０１９８号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示されるとおり、ピリミド［４，５−ｂ］インドール誘導体である。一実施形態において、薬剤は、化合物１（（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン）：
化合物１
Figure 2020505934
である。
別の態様において、薬剤は、化合物２（メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート）：
化合物２：
Figure 2020505934
である。
別の態様において、薬剤で処理されていない細胞に対して増殖速度の増加又は増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示される薬剤である。
一実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物３：４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール、すなわち以下の構造を有する国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの実施例１の化合物：
化合物３：
Figure 2020505934
である。
別の態様において、幹細胞増殖剤は（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール（（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、すなわち以下の構造を有する国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット）に係る化合物１５７Ｓ：
（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール：
Figure 2020505934
である。
実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子及び／又はＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前に、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、又はこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子及び／又はＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入した後、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、又はこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子及び／又はＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前及び導入した後の両方に、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、又はこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）に接触させる。
実施形態において、幹細胞増殖剤は、同じ培地中にあるが幹細胞増殖剤の非存在下であるＨＳＰＣに対してＨＳＰＣの増殖レベルを増加させるのに有効な量で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は約０．０１〜約１０ｕＭ、例えば約０．１ｕＭ〜約１ｕＭの範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は細胞培養培地中に約１ｕＭ、約９５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、又は約１０ｎＭの濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度で存在する。
実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールであり、これは細胞培養培地中に約０．０１〜約１０マイクロモル（ｕＭ）の範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールであり、これは細胞培養培地中に約０．１〜約１マイクロモル（ｕＭ）の範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールであり、これは細胞培養培地中に約０．７５マイクロモル（ｕＭ）の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールであり、これは細胞培養培地中に約０．５マイクロモル（ｕＭ）の濃度で存在する。前述のいずれの実施形態においても、細胞培養培地は化合物１をさらに含む。
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの混合物である。
実施形態において、本発明の細胞は、ＣＤ３４＋細胞の２〜１０，０００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２〜１０００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２〜１００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２０〜２００倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。本明細書に記載されるとおり、１つ以上の幹細胞増殖剤との接触は、細胞を例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムに接触させる前、細胞を例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムに接触させた後、又はこれらの組み合わせであり得る。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位に又はその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも２倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールに接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位に又はその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも４倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールに接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位に又はその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも５倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールに接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも３０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも４０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも６０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。実施形態において、細胞は、約１〜６０日、例えば約１〜５０日、例えば約１〜４０日、例えば約１〜３０日、例えば１〜２０日、例えば約１〜１０日、例えば約７日、例えば約１〜５日、例えば約２〜５日、例えば約２〜４日、例えば約２日、又は例えば約４日の期間にわたって１つ以上の幹細胞増殖剤に接触させる。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約１時間〜約１０日の期間、例えば約１２時間〜約５日の期間、例えば約１２時間〜４日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約１日〜約２日の期間、例えば約１日の期間又は約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触させるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培養である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む細胞培養培地中で約１日以下、例えば、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．２５ｕＭ〜約１ｕＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、約０．７５〜０．５マイクロモルの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む細胞培養培地中で約１時間〜約１４日の期間、例えば約１２時間〜約１０日の期間、例えば約１日〜約１０日の期間、例えば約１日〜約５日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約２日〜約４日の期間、例えば約２日の期間、約３日又は約４日の期間にわたってエキソビボで培養される。
実施形態において、細胞培養培地は化学限定培地である。実施形態において、細胞培養培地は、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）をさらに含有し得る。実施形態において、細胞培養培地は、それに代えて又は加えて、例えば、ＨＳＣ Ｂｒｅｗ、ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有し得る。実施形態において、細胞培養培地は無血清である。実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、Ｌ−グルタミン、及び／又はペニシリン／ストレプトマイシンが補足され得る。実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、及びＬ−グルタミンが補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びヒトインターロイキン−６が補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が補足されるが、ヒトインターロイキン−６は補足されない。他の実施形態において、培地には、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が補足されるが、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）又はヒトインターロイキン−６は補足されない。培地中に存在するとき、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、及び／又はＬ−グルタミンは、それぞれ約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約２５ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。実施形態において、補足される成分の各々は同じ濃度である。他の実施形態において、補足される成分の各々は異なる濃度である。ある実施形態において、培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び５０ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む。ある実施形態において、培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、及び５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、且つＩＬ−６を含まない。実施形態において、培地は、幹細胞増殖剤、例えば、０．７５μＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールをさらに含む。実施形態において、培地は、幹細胞増殖剤、例えば、０．５μＭの濃度の（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールをさらに含む。実施形態において、培地は、１％のＬ−グルタミン及び２％のペニシリン／ストレプトマイシンをさらに含む。実施形態において、細胞培養培地は無血清である。
ＸＩＩ．併用療法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、又は本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）を１つ以上の他の治療モダリティ及び／又は薬剤と併用した使用を企図する。したがって、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子で修飾された細胞の使用に加えて、異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の「標準」療法も対象に投与し得る。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、追加的な幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植が含まれ得る。幹細胞移植は同種異系由来又は自己由来であり得る。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、輸血及び／又は鉄キレート化（例えば、除去）療法が含まれ得る。公知の鉄キレート化剤としては、例えば、デフェロキサミン及びデフェラシロクスが挙げられる。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法としては、例えば、葉酸補充、又はヒドロキシウレア（例えば、５−ヒドロキシウレア）を挙げることができる。異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法はヒドロキシウレアであり得る。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば１日１０〜３５ｍｇ／ｋｇ、例えば１日１０〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば本明細書に記載されるとおりの、本発明の細胞（又は細胞の集団）、例えばＣＤ３４＋細胞（又は細胞の集団）の前及び／又は後に投与される。
１つ以上の追加的な療法剤としては、例えば、抗ｐ−セレクチン抗体、例えばＳｅｌＧ１（Ｓｅｌｅｘｙｓ）を挙げることができる。Ｐ−セレクチン抗体については、例えば、国際公開第１９９３／０２１９５６号パンフレット、国際公開第１９９５／０３４３２４号パンフレット、国際公開第２００５／１００４０２号パンフレット、国際公開第２００８／０６９９９９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６１７号明細書、米国特許第５８００８１５号明細書、米国特許第６６６７０３６号明細書、米国特許第８９４５５６５号明細書、米国特許第８３７７４４０号明細書及び米国特許第９０６８００１号明細書（これらの各々の内容は全体として本明細書に援用される）に記載されている。
１つ以上の追加的な薬剤としては、例えば、胎児ヘモグロビンを上方制御する小分子を挙げることができる。かかる分子の例としては、ＴＮ１（例えば、Ｎａｍ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１１，６，７７７−７８０，ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｍｄｃ．２０１０００５０５（本明細書において参照により援用される）に記載されるとおり）が挙げられる。
１つ以上の追加的な療法としては、照射又は当該技術分野において公知の他の骨髄アブレーション療法も挙げることができる。かかる療法の例はブスルファンである。かかる追加的な療法は、本発明の細胞を対象に導入する前に実施され得る。ある実施形態において、本明細書に記載される治療方法（例えば、本明細書に記載される方法によって修飾された（例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで例えばＨｂＦ産生が増加するように修飾された）細胞（例えば、ＨＳＰＣ）の投与を含む治療方法）であり、本方法は、骨髄アブレーションステップを含まない。実施形態において、本方法は部分的骨髄アブレーションステップを含む。
本明細書に記載される療法（例えば、ＨＳＰＣ、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて修飾されたＨＳＰＣの集団を投与することを含む）は、追加的な療法剤と併用することもできる。ある実施形態において、追加的な療法剤はＨＤＡＣ阻害薬、例えばパノビノスタットである。ある実施形態において、追加的な療法薬は、国際公開第２０１４／１５０２５６号パンフレットに記載される化合物、例えば、国際公開第２０１４／１５０２５６号パンフレットの表１に記載される化合物、例えばＧＢＴ４４０である。ＨＤＡＣ阻害薬の他の例としては、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）が挙げられる。１つ以上の追加的な薬剤としては、例えばＤＮＡメチル化阻害薬を挙げることができる。かかる薬剤は、ＢＣＬ１１ａ活性が低下した細胞におけるＨｂＦ誘導を増加させることが示されている（例えば、Ｊｉａｎ Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４，９９３（２０１１）；ＤＯＩ：０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１１０５３（本明細書において参照により援用される））。他のＨＤＡＣ阻害薬としては、当該技術分野において公知の任意のＨＤＡＣ阻害薬、例えば、トリコスタチンＡ、ＨＣ毒素、ＤＡＣＩ−２、ＦＫ２２８、ＤＡＣＩ−１４、デピュディシン（ｄｅｐｕｄｉｃｉｎ）、ＤＡＣＩ−１６、チュバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）、ＮＫ５７、ＭＡＺ１５３６、ＮＫ１２５、スクリプタイド、ピロキサミド、ＭＳ−２７５、ＩＴＦ−２３５７、ＭＣＧ−Ｄ０１０３、ＣＲＡ−０２４７８１、ＣＩ−９９４、及びＬＢＨ５８９が挙げられる（例えば、Ｂｒａｄｎｅｒ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０（ｖｏｌ．１０７：２８），１２６１７−１２６２２（本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい）。
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、又は本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）と、共療法剤又は共療法とは、同じ製剤で又は別個に投与することができる。別個に投与する場合、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、又は本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞は、共療法薬又は共療法の前、その後、又はそれと同時に投与することができる。一方の薬剤が他方の薬剤の投与に数分間〜数週間の範囲にわたる間隔で先行又は後続し得る。２つ以上の異なる種類の療法剤が別個に対象に適用される実施形態では、概して各送達時点間に著しく長い期間が経過しないことが確実にされ、したがってこれらの異なる種類の薬剤はなおも有利には標的組織又は細胞に併用効果を発揮し得る。
ＸＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び核酸
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは核酸、例えば、特にｇＲＮＡに存在し、しかし他の形態のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又はｓｉＲＮＡにも存在し得る。本明細書に記載されるとおり「ヌクレオシド」は、五炭糖分子（ペントース又はリボース）又はその誘導体、及び有機塩基、プリン又はピリミジン又はその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとおり、「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして定義される。
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、以下の１つ以上を含み得る：
（ｉ）非連結リン酸酸素の一方又は両方、及び／又はリン酸ジエステル骨格連結における連結リン酸酸素の１つ以上の改変、例えば置換；
（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換；
（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換；
（ｉｖ）非カノニカル核酸塩基によるものを含めた、天然に存在する核酸塩基の修飾又は置換；
（ｖ）リボース−リン酸骨格の置換又は修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾若しくは置換、又は部分、キャップ若しくはリンカーのコンジュゲーション；及び
（ｖｉｉ）糖の修飾又は置換。
上記に列挙する修飾を組み合わせて、２、３、４個、又はそれを超える修飾を有し得る修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供することができる。例えば、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドは修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が修飾され、例えば、全ての塩基が修飾リン酸基を有し、例えば、全てがホスホロチオエート基である。ある実施形態において、単分子又はモジュラーｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、又は実質的に全てがホスホロチオエート基に置換されている。実施形態において、ｇＲＮＡの５つの３’末端塩基の１つ以上及び／又は５つの５’末端塩基の１つ以上がホスホロチオエート基で修飾されている。
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド、例えば本明細書に記載されるとおりの修飾を有するヌクレオチドは、核酸、例えば「修飾核酸」に取り込まれ得る。一部の実施形態において、修飾核酸は、１、２、３個又はそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾核酸中の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％）が修飾ヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによる分解を受け易いものであり得る。例えば、ヌクレアーゼは核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書に記載される修飾核酸は１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含有し、それにより例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入し得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、及び修飾核酸は、インビボ及びエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し得る。用語「自然免疫応答」には、サイトカインの発現及び放出、特にインターフェロンの誘導、及び細胞死に関わる、概してウイルス又は細菌起源の、一本鎖核酸を含めた外因性核酸に対する細胞応答が含まれる。一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、及び修飾核酸は、核酸との主溝相互作用パートナーの結合を破壊し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、及び修飾核酸は、インビボ及びエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し、また核酸との主溝相互作用パートナーの結合も破壊し得る。
化学基の定義
本明細書で使用されるとき、「アルキル」とは、直鎖状又は分枝状の飽和炭化水素基を指すことが意図される。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピル及びイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０、２〜約２０、１〜約１２、１〜約８、１〜約６、１〜約４、又は１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
本明細書で使用されるとき、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなど、単環式又は多環式（例えば、２、３又は４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一部の実施形態において、アリール基は６〜約２０個の炭素原子を有する。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。本明細書で使用されるとき、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、且つ１つ以上の三重結合を有することを特徴とする直鎖状又は分枝状炭化水素鎖を指す。例示的なアルキニル基としては、限定はされないが、エチニル、プロパルギル、及び３−ヘキシニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基に置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基に置換されている基を含む。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、又は多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、限定はされないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価ラジカルを指す。代表的なヘテロシクリルとしては、限定なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」は、ヘテロ芳香環系の一価ラジカルを指す。ヘテロアリール部分の例としては、限定はされないが、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられる。
リン酸骨格修飾
リン酸基
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのリン酸基が、酸素の１つ以上を異なる置換基に置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの修飾リン酸による非修飾リン酸部分のホールセール置換を含み得る。一部の実施形態において、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカー又は非対称電荷分布の荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート類、ボラノホスフェート類、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート類、ホスホロアミデート類、アルキル又はアリールホスホネート類及びリン酸トリエステル類が挙げられる。一部の実施形態において、リン酸骨格部分における非架橋リン酸酸素原子の１つが以下の基：硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）、又はＯＲ（式中、Ｒは、例えばアルキル又はアリールであり得る）のいずれかに置換され得る。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかしながら、非架橋酸素の１つを上記の原子又は原子団の１つに置換すると、リン原子をキラルにすることができる。すなわち、このように修飾されたリン酸基のリン原子はステレオジェン中心である。ステレオジェニックなリン原子は「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。
ホスホロジチオエート類では両方の非架橋酸素が硫黄によって置換される。ホスホロジチオエート類のリン中心はアキラルであり、これがオリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げる。一部の実施形態において、一方又は両方の非架橋酸素に対する修飾は、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えばアルキル又はアリールであり得る）から独立して選択される基による非架橋酸素の置換も含み得る。
リン酸リンカーは、架橋酸素（すなわちリン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミデート類）、硫黄（架橋ホスホロチオエート類）及び炭素（架橋メチレンホスホネート類）で置換することによっても修飾し得る。この置換は、連結酸素のいずれか、又は連結酸素の両方に行うことができる。
リン酸基の置換
リン酸基は非リン含有連結基によって置換することができる。一部の実施形態において、荷電リン酸基が中性部分によって置換され得る。
リン酸基を置換することのできる部分の例としては、限定なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣することのできる足場も構築することができ、ここで、リン酸リンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチドサロゲートに置換される。一部の実施形態において、核酸塩基はサロゲート骨格によってテザー係留することができる。例としては、限定なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。
糖修飾
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に１つ以上の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が幾つもの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基によって修飾又は置換され得る。一部の実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化して２’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、核酸の安定性を増進し得る。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒し得る。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）；ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、０（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈ又は任意選択で置換され得るアルキルであり得、及びｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数であり得る）を挙げることができる。一部の実施形態において、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、２’ヒドロキシルが例えばＣｉ−６アルキレン又はＣｊ−６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合され得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を挙げることができ、ここで、例示的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、又はアミノ架橋；Ｏ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、０（ＣＨ２）ｎ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）を挙げることができる。一部の実施形態において、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を挙げることができる。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわちデオキシリボース糖、例えば部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分におけるもの）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、又はヨード）；アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（ここで、アミノは、例えば本明細書に記載されるとおりであり得る）、−ＮＨＣ（０）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニル（これらは任意選択で、例えば本明細書に記載されるとおりのアミノによって置換され得る）を挙げることができる。
糖基は、リボースの対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素も含有し得る。したがって、修飾核酸は、例えばアラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のγ位にα結合、例えばα−ヌクレオシドを有し得る。修飾核酸は、Ｃ−に核酸塩基を欠く「脱塩基」糖も含み得る。これらの脱塩基糖は、構成糖原子の１つ以上でもさらに修飾され得る。修飾核酸は、Ｌ型の１つ以上の糖、例えばＬ−ヌクレオシドも含み得る。
概して、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、限定なしに、リボースの酸素の（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、又は例えばメチレン若しくはエチレンなどのアルキレンによる）置換；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置換する）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホルアミデート骨格も有するモルホリノなど、追加の炭素又はヘテロ原子を有する６員又は７員環を例えば形成する）を含み得る。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、多環型（例えば、トリシクロ；及び「アンロックド」型、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡ又はＳ−ＧＮＡ（リン酸ジエステル結合に付加されたグリコール単位によってリボースが置換されている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ａ−Ｌ−トレオフラノシル−（３’−→２’）によってリボースが置換されている））を含み得る。
核酸塩基に対する修飾
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。これらの核酸塩基を修飾し、又は完全に置換して、修飾核酸に組み込むことのできる修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン又はピリミジン類似体から独立して選択することができる。一部の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する及び合成の誘導体を含み得る。
ウラシル
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジン又は５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ＾Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍｓＵ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ＼ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（ｘｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（Ｔｒｎ５ｓ２Ｕ）、ｌ−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ιτι’ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、ｌ−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ’ｓ＼｜／）、４−チオ−ｌ−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ’Ｖ）、２−チオ−ｌ−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎｌ−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、ｌ−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピルプソイドウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル］））−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、ａ−チオ−ウリジン、２’−０−メチル−ウリジン（Ｕｒｎ）、５，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−０−メチル−プソイドウリジン（ψπι）、２−チオ−２’−０−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−０−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、ｌ−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−ａｒａ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−ａｒａ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類、キサンチン、及びヒポキサンチンが挙げられる。
シトシン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−ｌ−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−ｌ−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、ａ−チオ−シチジン、２’−０−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−０−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−０−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−０−トリメチル−シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−ａｒａ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、及び２’−ＯＨ−ａｒａ−シチジンが挙げられる。
アデニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ’Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、ａ−チオ−アデノシン、２’−０−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ５Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−０−トリメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、ｌ，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ’Ａｍ）、２’−０−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−ａｒａ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−ａｒａ−アデノシン、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
グアニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的核酸塩基及びヌクレオシドとしては、限定なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ’ｌ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱｉ）、アーケオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メト（ｍｅｔｈ）チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、ａ−チオ−グアノシン、２’−０−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ３／４ｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、ｌ−メチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−０−メチル−イノシン（Ｉｍ）、ｌ，２’−０−ジメチル−イノシン（ｍ’ｌｍ）、０６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−０−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、０６−メチル］）−グアノシン、０６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−ａｒａ−グアノシン、及び２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態において、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端で修飾され得る。この実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化し、同時にリボース環を開環すると、修飾ヌクレオシド（Ｕは非修飾又は修飾ウリジンであり得る）を得ることができる。
別の実施形態において、３’末端Ｕは２’３’環状リン酸で修飾され得る（Ｕは非修飾又は修飾ウリジンであり得る）。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つ以上を取り入れることにより、分解に対して安定化させ得る３’ヌクレオチドを含有し得る。この実施形態において、例えばウリジンは、修飾ウリジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、及び５−ブロモウリジンに置換するか、又は本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかに置換することができ、アデノシン及びグアノシンは、修飾アデノシン及びグアノシン、例えば８位の修飾、例えば８−ブロモグアノシンに置換するか、又は本明細書に記載される修飾アデノシン又はグアノシンのいずれかに置換することができる。一部の実施形態において、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンをｇＲＮＡに取り入れることができる。一部の実施形態において、Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンをｇＲＮＡに取り入れることができる。一部の実施形態において、糖修飾リボヌクレオチドを取り入れることができ、例えば、ここで、２’ＯＨ基が、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、メチル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であり得る）；又はシアノ（−ＣＮ）から選択される基に置換される。一部の実施形態において、リン酸骨格が本明細書に記載されるとおり、例えばホスホチオエート基で修飾され得る。一部の実施形態において、ｇＲＮＡのオーバーハング領域のヌクレオチドが、各々独立して、２−Ｆ ２’−０−メチル，チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びこれらの任意の組み合わせなど、限定はされないが２’−糖修飾型を含め、修飾型又は非修飾型ヌクレオチドであり得る。
ある実施形態において、ＲＮＡ分子、例えばｇＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つ以上又は全てがデオキシヌクレオチドである。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりの複数のｇＲＮＡ分子、又は本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子で修飾された１つ以上の細胞を含む細胞（例えば、細胞の集団、例えば、造血幹細胞の、例えばＣＤ３４＋細胞の集団）を、１つ以上の薬学的又は生理学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン類、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、治療（又は予防）しようとする疾患に適切な方法で投与し得る。投与の分量及び頻度は、患者の状態並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決まることになるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定され得る。
一実施形態において、本医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、マウス抗体、ヒトプール血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、望ましくないＣＲＩＳＰＲシステム成分、細菌及び真菌からなる群から選択される夾雑物を実質的に含まず、例えば、検出可能なレベルの夾雑物は存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｏｍｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、及びＡ群化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からなる群から選択される少なくとも１つである。
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植込み又は移植によることを含め、任意の好都合な方法で行われ得る。本明細書に記載される組成物は、患者に対し、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、又は腹腔内に投与され得る。一態様において、本発明の組成物は患者に対して皮内又は皮下注射によって投与される。一態様において、本発明の細胞組成物はｉ．ｖ．注射によって投与される。
患者に投与する上記の治療の投薬量は、治療下の病態及び治療の被投与者の詳細な性質によって異なり得る。ヒト投与についての投薬量のスケーリングは、当該技術分野で認められている手法に従い実施することができる。
細胞
本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子、又は前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含む細胞にも関する。
ある態様において本細胞は、本明細書に記載される方法によって作製される細胞である。
実施形態において、細胞は、造血幹細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞；ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋幹細胞である。実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋幹細胞である。実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０−幹細胞である。実施形態において、細胞は、ヒト造血幹細胞である。実施形態において、細胞は、自己由来である。実施形態において、細胞は、同種異系由来である。
実施形態において、細胞は骨髄、例えば自己由来の骨髄に由来する。実施形態において、細胞は末梢血、例えば、動員末梢血、例えば自己由来の動員末梢血に由来する。動員末梢血を用いる実施形態において、細胞は、動員剤を投与された患者から単離される。実施形態において、動員剤はＧ−ＣＳＦである。実施形態において、動員剤はＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）である。実施形態において、動員剤はＧ−ＣＳＦとＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００））との組み合わせを含む。実施形態において、細胞は臍帯血、例えば、同種異系由来の臍帯血に由来する。実施形態において、細胞は、異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病に罹患している患者、又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者に由来する。
実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。実施形態において、細胞はヒト細胞である。実施形態において、細胞は、異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病に罹患している患者、又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者に由来する。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列に又はその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内に）修飾又は改変、例えばインデルを含む細胞を提供する。実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、多系統の細胞に分化する能力を維持しており、例えば赤血球系統の細胞に分化する能力を維持している。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０回又はそれを超える倍加を起こしているか、又はそれを起こす能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の倍加を起こしているか、又はそれを起こす能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加を呈し、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を呈する、及び／又はそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加を呈し、及び／又はそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力があり、例えば少なくとも６ピコグラム、例えば少なくとも７ピコグラム、少なくとも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、又は少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加を呈し、及び／又はそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力があり、例えば、約６〜約１２、約６〜約７、約７〜約８、約８〜約９、約９〜約１０、約１０〜約１１又は約１１〜約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列に又はその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内に）修飾又は改変、例えばインデルを有する細胞を含む細胞の集団を提供する。実施形態において、例えば本発明のｇＲＮＡ及び／又はＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本明細書に記載されるとおり例えばＮＧＳによって計測したとき、集団の細胞の少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、修飾又は改変を有する（例えば、少なくとも１つの修飾又は改変を有する）。実施形態において、例えば本発明のｇＲＮＡ及び／又はＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本明細書に記載されるとおり例えばＮＧＳによって計測したとき、少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％は、修飾又は改変を有する（例えば、少なくとも１つの修飾又は改変を有する）。実施形態において、細胞の集団はＣＤ３４＋細胞を含み、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％のＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、多系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持しており、例えば赤血球系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持している。実施形態において、細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０回又はそれを超える集団倍加を起こしているか、又はそれを起こす能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の集団倍加を起こしているか、又はそれを起こす能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を呈する、及び／又はそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力がある。実施形態において、改変又は修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加を呈し、及び／又はそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラム、例えば少なくとも７ピコグラム、少なくとも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、又は少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。実施形態において、改変又は修飾された細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、同様の非修飾又は非改変細胞に対して胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベル及び／又はタンパク質レベル）の増加を呈し、及び／又はそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり約６〜約１２、約６〜約７、約７〜約８、約８〜約９、約９〜約１０、約１０〜約１１又は約１１〜約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ４個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ５個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ８個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ９個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１０個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１１個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１２個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ１３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個の細胞を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％）のＨＳＰＣ、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含み得る。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、約６０％のＨＳＰＣ、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含み得る。ある実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、約３ｅ７個の細胞を含み、及び約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。本願全体を通じて使用されるとき、科学的記数法［数字］ｅ［数字］には、その通常の意味が与えられる。したがって、例えば、２ｅ６は、２×１０６又は２，０００，０００に相当する。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり２ｅ６〜１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子、又は前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、及び本発明のＣａｓ９分子、又は前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含み得る。ある実施形態において、本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子と本発明のＣａｓ９分子とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含み得る。
本発明の細胞は、好ましくは、本発明のｇＲＮＡ分子を含むように、例えば本明細書に記載される方法、例えばエレクトロポレーション又はＴＲＩＡＭＦ（参照により全体として本明細書に援用される特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／５４１１０号明細書に記載されるとおり）によってエキソビボで修飾される。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下又は阻害されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞に対して低下したβグロビン（例えば、鎌状突然変異を含むヘモグロビンβ）発現レベルを有し得る。別の例として、本発明の細胞は、非修飾細胞に対して増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有し得る。それに代えて、又は加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞に対して増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球細胞を生じ得る、例えばそれに分化し得る。実施形態において、増加した胎児ヘモグロビンレベルは、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％又は少なくとも約５０％である。それに代えて、又は加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞に対して低下したβグロビン（例えば、本明細書において鎌状βグロビンとも呼ばれる、鎌状突然変異を含むヘモグロビンβ）発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球細胞を生じ得る、例えばそれに分化し得る。実施形態において、低下した鎌状βグロビンレベルは、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％又は少なくとも約５０％である。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下又は阻害されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞に対して低下したヘモグロビンβ、例えば突然変異型又は野生型ヘモグロビンβの発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞を提供する。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型又は野生型ヘモグロビンβのレベルの低下を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型又は野生型ヘモグロビンβのレベルの低下を呈する。実施形態において、誘導、例えば分化は、インビボで（例えば、患者、例えば異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβサラセミアに罹患している患者において）達成される。実施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、それから誘導された、例えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞である。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば増加しているか、又は促進されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞に対して増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞を提供する。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈する。実施形態において、誘導、例えば分化は、インビボで（例えば、患者、例えば異常ヘモグロビン症患者、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβサラセミアに罹患している患者において）達成される。実施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、それから誘導された、例えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞である。
別の態様において、本発明は、細胞に導入される１つ又は複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ分子の標的配列）に（例えば、その範囲内に）又はその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内に）インデルを含む細胞に関する。実施形態において、インデルはフレームシフトインデルである。実施形態において、細胞は、大規模欠失、例えば１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ又はそれを超える欠失を含む。実施形態において、大規模欠失は、前記細胞に導入される１つ又は複数のｇＲＮＡ分子の２つの結合部位間に配置された核酸を含む。実施形態において、欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域に配置された本明細書に記載されるｇＲＮＡの標的配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域に配置された本明細書に記載されるｇＲＮＡの標的配列との間に配置された約４９００ｎｔを含む、例えばそれからなる。実施形態において、インデル、例えば、欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列に又はその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内に）インデルを含む細胞を含む細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるもの）、例えばＨＳＰＣの集団に関する。実施形態において、インデルはフレームシフトインデルである。実施形態において、細胞集団は、大規模欠失、例えば１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ又はそれを超える欠失を含む細胞を含む。実施形態において、大規模欠失は、前記細胞に導入される１つ又は複数のｇＲＮＡ分子の２つの結合部位間に配置された核酸を含む。実施形態において、欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域に配置された本明細書に記載されるｇＲＮＡの標的配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域に配置された本明細書に記載されるｇＲＮＡの標的配列との間に配置された約４９００ｎｔを含む、例えばそれからなる。実施形態において、集団の細胞の１％、０．５％、０．１％又は０．００１％未満が、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含む（例えば、集団の細胞がそのような欠失を含まない）。実施形態において、集団の細胞の２０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の３０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の４０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の５０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の６０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の７０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の８０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の９０％〜１００％が、前記大規模欠失、１つ又は複数のインデルを含む。実施形態において、細胞の集団は複数の細胞型に分化する能力を保持しており、例えば、例えば赤血球細胞、例えば対象、例えばヒトにおける赤血球系統の細胞に分化する能力を維持している。実施形態において、編集された細胞（例えば本明細書に記載されるとおりの、例えばＨＳＰＣ細胞、例えばＣＤ３４＋細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の任意のサブ集団）は、例えば、細胞培養液中で増殖する、例えば、細胞培養液中、例えば本明細書に記載される細胞培養培地、例えば１つ以上の幹細胞増殖剤、例えば化合物４を含む細胞培養培地中で例えば１、２、３、４、５、６、７日又はそれを超えて後（例えば、約１又は約２日後）に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍又はそれを超えて増殖する能力を維持している（及び／又は増殖する）。実施形態において、編集され、且つ分化した細胞（例えば、赤血球細胞）は、増殖する能力、例えば、例えば実施例に記載されるとおりの赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中で７日後に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍又はそれを超えて増殖する能力、及び／又は例えば、例えば実施例に記載されるとおりの赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中、又は対象（例えば、哺乳類、例えばヒト）において２１日後に少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１１００倍、少なくとも１２００倍、少なくとも１３００倍、少なくとも１４００倍、少なくとも１５００倍又はそれを超えて増殖する能力を維持している。
ある実施形態において、本発明は、集団の細胞の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％が、例えば本明細書に記載されるとおりの大規模欠失又は１つ以上のインデルを含む細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団を提供する。理論によって拘束されるものではないが、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子又はＣＲＩＳＰＲシステムを細胞の集団に導入すると、前記集団にインデル及び／又は大規模欠失のパターンが生じ、したがって、インデル及び／又は大規模欠失を含む集団の各細胞が同じインデル及び／又は大規模欠失を呈しないこともあると考えられる。実施形態において、インデル及び／又は大規模欠失は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な部位に又はその近傍に、１つ以上の核酸を含み；ここで、前記細胞は、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持している；及び／又は同様の非修飾細胞の集団から分化した細胞に対して、細胞の集団から分化した前記細胞は増加した胎児ヘモグロビンレベルを有する（例えば、集団はより高い％Ｆ細胞を有する）。実施形態において、細胞の集団はエキソビボで、例えば、１つ以上の幹細胞増殖剤（例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む）を含む培地中で少なくとも２倍の増殖を起こしている。実施形態において、細胞の集団はエキソビボで、例えば、１つ以上の幹細胞増殖剤（例えば、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールを含む）を含む培地中で少なくとも５倍の増殖を起こしている。
実施形態において、インデルは、約５０未満のヌクレオチド、例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満又は約２５未満のヌクレオチドである。実施形態において、インデルは約２５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約２０ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約１５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約１０ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約９ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約９ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約７ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約６ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約４ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約３ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約２ヌクレオチド未満である。前述の実施形態のいずれにおいても、インデルは少なくとも１ヌクレオチドである。実施形態において、インデルは１ヌクレオチドである。実施形態において、大規模欠失は約１ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は約２ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は約３ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は約４ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は約５ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は約６ｋｂのＤＮＡを含む。実施形態において、大規模欠失は、例えば、ＨＢＧ１プロモーター領域内の標的配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域内の標的配列との間に配置された約４．９ｋｂのＤＮＡを含む。
実施形態において、細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるもの）は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムに関連する最も高頻度で検出されるインデルのいずれか１、２、３、４、５、又は６つを含むインデル及び／又は大規模欠失のパターンを含み、例えば、表７−２に記載されるインデル及び大規模欠失の１、２、３、４、５、又は６つを含む（例えば、ＨＢＧ１標的配列に又はその近傍に検出されるインデル及び大規模欠失の１、２、３、４、５又は６つを含み、及び／又はＨＢＧ２標的配列に又はその近傍に検出されるインデル及び大規模欠失の１、２、３、４、５又は６つを含む）。実施形態において、インデル及び／又は大規模欠失は、本明細書に記載される方法、例えばＮＧＳ又はｑＰＣＲによって検出される。
ある態様において、細胞又は細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるもの）は、例えば本明細書に記載される方法によって検出したとき、オフターゲット部位にインデル又は大規模欠失を含まない。
実施形態において、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団（例えば、鎌状赤血球病患者に由来する）の子孫、例えば分化した子孫、例えば赤血球系（例えば、赤血球）子孫は、非修飾細胞より低いレベルの鎌状βグロビン及び／又はより高いレベルのγグロビンを産生する。実施形態において、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団（例えば、鎌状赤血球病患者に由来する）の子孫、例えば分化した子孫、例えば赤血球系（例えば、赤血球）子孫は、非修飾細胞より低いレベルの鎌状βグロビン及びより高いレベルのγグロビンを産生する。実施形態において、鎌状βグロビンは、非修飾細胞より少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％又は少なくとも約５０％低いレベルで産生される。実施形態において、γグロビンは、非修飾細胞より少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％高いレベルで産生される。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの、修飾ＨＳＰＣ又は前記ＨＳＰＣから分化した（例えば、エキソビボで又は患者の体内で分化した）赤血球系細胞の集団を提供し、ここで、細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％がＦ細胞である。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団に対してより高い割合のＦ細胞を含有する（又はそれを含有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団に対してＦ細胞の少なくとも２０％の増加、例えば少なくとも２１％の増加、少なくとも２２％の増加、少なくとも２３％の増加、少なくとも２４％の増加、少なくとも２５％の増加、少なくとも２６％の増加、少なくとも２７％の増加、少なくとも２８％の増加、又は少なくとも２９％の増加を有する（又はそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団に対してＦ細胞の少なくとも３０％の増加、例えば少なくとも３５％の増加、少なくとも４０％の増加、少なくとも４５％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも５５％の増加、少なくとも６０％の増加、少なくとも６５％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも７５％の増加、少なくとも８０％の増加、少なくとも８５％の増加、少なくとも９０％の増加又は少なくとも９５％の増加を有する（又はそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ又は複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団に対してＦ細胞の１０〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、２５％〜８０％、２５％〜７０％、２５％〜６０％、２５％〜５０％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、３０％〜４０％、又は３０％〜３５％の増加を有する（又はそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団、例えば本明細書に記載される方法によって作製されるとおりの細胞の集団は、それを必要としている患者に例えば治療有効量で導入したとき、前記患者の異常ヘモグロビン症、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば鎌状赤血球症及び／又はβサラセミアを治療するのに十分な数の細胞及び／又は十分な％Ｆ細胞の増加を含む。実施形態において、Ｆ細胞の増加は、例えば本明細書に記載されるとおりの赤血球系分化アッセイで計測されるとおりである。
本明細書に記載される実施形態及び態様のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、方法及び／又はＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかによって修飾されるとおりの、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生するＦ細胞を含む細胞、例えば細胞の集団に関する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり平均６．０〜７．０ピコグラム、７．０〜８．０、８．０〜９．０、９．０〜１０．０、１０．０〜１１．０、又は１１．０〜１２．０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞又は細胞の集団、（例えば、インデル、例えば、表７−２に記載される大規模欠失又はインデルを含む）（又はその子孫）は、それが導入される対象の細胞において検出可能であり、例えば本明細書に記載される方法を用いて、例えばインデルを検出することによって依然として検出可能である。実施形態において、細胞又は細胞の集団（又はその子孫）は、前記細胞又は細胞の集団が対象に導入された後、それが少なくとも１０週間、少なくとも１４週間、少なくとも１６週間、少なくとも１８週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、少なくとも４０週間、少なくとも５０週間、又はより長い期間にわたって導入される前記対象において検出可能である。
実施形態において、１つ以上のインデル（例えば、表７−２に記載される大規模欠失又はインデル）は、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団が導入された対象の細胞（例えば、骨髄及び／又は末梢血の細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）において検出可能であり、例えば、本明細書に記載される方法、例えばＮＧＳによって依然として検出可能である。実施形態において、１つ以上のインデルは、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団が対象に導入された後、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団が少なくとも１０週間、少なくとも１４週間、少なくとも１６週間、少なくとも１８週間、少なくとも２０週間、少なくとも３０週間、少なくとも４０週間、少なくとも５０週間、又はより長い期間にわたって導入された前記対象の細胞（例えば、骨髄及び／又は末梢血の細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）において検出可能である。実施形態において、前記１つ以上のインデルの検出のレベルは、時間と共に低下しないか、又は移植前に計測した又は移植後２週間若しくは移植後８週間で計測した検出のレベル（例えば、１つ以上のインデルを含む細胞のパーセンテージ）に対して、例えば移植後２０週間で計測したとき、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満又は５０％未満（例えば移植前のインデル検出のレベルに対して又は移植後２週間若しくは移植後８週間での検出のレベルに対して）低下する。
前述の実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明の細胞及び／又は細胞の集団は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含まない細胞を含む、例えばそれからなる。
治療方法
送達タイミング
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達されるのと同時に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達される前又はその後（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、又は４週間未満）に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、且つＣａｓ９分子成分及び／又はｇＲＮＡ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする。
成分のバイモーダル送達又は差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分及びｇＲＮＡ分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性及び安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、又は本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式又は差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、鋳型核酸、又はペイロードに異なる薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、又は臓器に異なる組織分布、異なる半減期、又は異なる時間分布をもたらし得る。
幾つかの送達様式、例えば、細胞、又は細胞の子孫において例えば自己複製又は細胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現及び存在をもたらす。例としては、ウイルス送達、例えばアデノ随伴ウイルス又はレンチウイルス送達が挙げられる。
例として、成分、例えばＣａｓ９分子及びｇＲＮＡ分子は、身体、又は特定のコンパートメント、組織若しくは臓器における送達された成分がもたらす半減期又は持続性の点で異なる様式によって送達することができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、かかる様式によって送達することができる。Ｃａｓ９分子成分は、持続性がより低い、又は身体又は特定のコンパートメント若しくは組織若しくは臓器へのその曝露量がより低い様式によって送達することができる。
より一般的には、ある実施形態において、第１の送達様式を用いて第１の成分が送達され、及び第２の送達様式を用いて第２の成分が送達される。第１の送達様式は第１の薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織又は臓器における成分又は成分をコードする核酸の分布、持続性、又は曝露量であり得る。第２の送達様式は第２の薬力学的又は薬物動態学的特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織又は臓器における成分又は成分をコードする核酸の分布、持続性、又は曝露量であり得る。
ある実施形態において、第１の薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性又は曝露量は、第２の薬力学的又は薬物動態学的特性よりも限定的である。
ある実施形態において、第１の送達様式は、薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性又は曝露量を最適化する、例えば最小限に抑えるように選択される。
ある実施形態において、第２の送達様式は、薬力学的又は薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性又は曝露量を最適化する、例えば最大化するように選択される。
ある実施形態において、第１の送達様式は、比較的持続性の高いエレメント、例えば核酸、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスの使用を含む。かかるベクターは比較的持続性が高いため、それから転写された産物は比較的持続性が高いものとなり得る。
ある実施形態において、第２の送達様式は、比較的一過性のエレメント、例えばＲＮＡ又はタンパク質を含む。
ある実施形態において、第１の成分はｇＲＮＡを含み、及び送達様式は比較的持続性が高く、例えばｇＲＮＡはプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子の転写は、遺伝子がタンパク質産物をコードせず、且つｇＲ Ａは単独では作用できないため、生理学的影響がほとんどないものであり得る。第２の成分、Ｃａｓ９分子は一過性方式で、例えばｍＲＮＡとして、又はタンパク質として送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が短期間のみ存在して活性であることが確実にされる。
さらに、成分を異なる分子型で又は互いに相補的な異なる送達ベクターによって送達することにより、安全性及び組織特異性を増進させることができる。
差次的送達様式を用いると、パフォーマンス、安全性及び有効性を増進させることができる。例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低下させることができる。免疫原性成分、例えばＣａｓ９分子を持続性の低い様式で送達すると、細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞の表面上に提示されるため、免疫原性が低下し得る。２パート送達システムはこのような欠点を緩和することができる。
差次的送達様式を用いて、異なる、しかしオーバーラップする標的領域に成分を送達することができる。標的領域のオーバーラップ外での活性複合体の形成は最小限に抑えられる。したがって、ある実施形態において、第１の成分、例えばｇＲＮＡ分子が、第１の空間分布、例えば組織分布をもたらす第１の送達様式によって送達される。第２の成分、例えばＣａｓ９分子が、第２の空間分布、例えば組織分布をもたらす第２の送達様式によって送達される。ある実施形態において、第１の様式は、リポソーム、ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、及び核酸、例えばウイルスベクターから選択される第１のエレメントを含む。第２の様式は、この群から選択される第２のエレメントを含む。ある実施形態において、第１の送達様式は第１の標的化エレメント、例えば細胞特異的受容体又は抗体を含み、第２の送達様式はそのエレメントを含まない。ある実施形態において、第２の送達様式は第２の標的化エレメント、例えば第２の細胞特異的受容体又は二次抗体を含む。
Ｃａｓ９分子がウイルス送達ベクター、リポソーム、又はポリマーナノ粒子で送達されるとき、単一組織のみの標的化が所望され得る場合に複数の組織に送達されて治療活性が生じる可能性がある。２パート送達系はこの難題を解消し、組織特異性を増進させることができる。ｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子が、異なるが重複もある組織向性を有する別々の送達媒体にパッケージングされる場合、完全に機能性の複合体は、両方のベクターによって標的化される組織においてのみ形成される。
候補Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、及び候補ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野において公知の方法により、又は本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｌ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８ １６−８２１に記載されている。
さらなる態様は、以下に列挙される実施形態に記載される。
実施形態：
１．ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、ｃｒＲＮＡは、
ａ）非欠失ＨＦＰＨ領域（例えば、ヒト非欠失ＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的であり；
ｂ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｃ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｄ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｅ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｆ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｇ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｈ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；又は
ｉ）これらの組み合わせ
である標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
２．標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号７２又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３．標的化ドメインは、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６７又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、実施形態２に記載のｇＲＮＡ分子。
４．標的化ドメインは、
ａ）配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号６７若しくはその断片；又は
ｂ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５４若しくはその断片
のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、実施形態２に記載のｇＲＮＡ分子。
５．標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる、実施形態２〜４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
６．記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、実施形態５に記載のｇＲＮＡ分子。
７．記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、実施形態５に記載のｇＲＮＡ分子。
８．記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’又は３’核酸のいずれも含まない、実施形態５に記載のｇＲＮＡ分子。
９．標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列からなる、実施形態２〜８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１０．ｃｒＲＮＡの一部分及びｔｒａｃｒの一部分は、ハイブリダイズして配列番号１８２又は１８３を含むフラッグポールを形成する、先行する実施形態のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１１．フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は、配列番号１８４を含む、実施形態１０に記載のｇＲＮＡ分子。
１２．フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部及び存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は、配列番号１８５を含む、実施形態１０又は１１に記載のｇＲＮＡ分子。
１３．ｔｒａｃｒは、配列番号２２４又は配列番号２２５を含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１４．ｔｒａｃｒは、任意選択で、さらなる１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む配列番号２３２を含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１５．ｃｒＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
ａ）配列番号１８２；
ｂ）配列番号１８３；
ｃ）配列番号１９９；
ｄ）配列番号２００；
ｅ）配列番号２０１；
ｆ）配列番号２０２；又は
ｇ）配列番号２２６
を含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１６．ｔｒａｃｒは、５’から３’に、
ａ）配列番号１８７；
ｂ）配列番号１８８；
ｃ）配列番号２０３；
ｄ）配列番号２０４；
ｅ）配列番号２２４；
ｆ）配列番号２２５；
ｇ）配列番号２３２；
ｈ）配列番号２２７；
ｉ）（配列番号２２８；
ｊ）配列番号２２９；
ｋ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；
ｌ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｋ）のいずれか；又は
ｍ）少なくとも１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６又は７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを５’末端に（例えば、５’側端に）さらに含む上記ａ）〜ｌ）のいずれか
を含む、実施形態１〜９又は１５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１７．標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置され、標的化ドメインを含む核酸分子は、任意選択で標的化ドメインの直ちに３’側に配置された配列番号２０１を含み、ｔｒａｃｒを含む核酸分子は、配列番号２２４を含む、例えばそれからなる、実施形態１〜９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１８．フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号２０１又は配列番号２０２を含む、実施形態１３〜１４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
１９．ｔｒａｃｒは、配列番号１８７又は１８８及び任意選択で第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号１８７又は１８８の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部であって、配列番号１８９を含む第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２０．標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置される、実施形態１〜１９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２１．標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、ｔｒａｃｒは、標的化ドメインの３’側に配置される、実施形態１〜１９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２２．標的化ドメインの３’側且つｔｒａｃｒの５’側に配置されたループをさらに含む、実施形態２１に記載のｇＲＮＡ分子。
２３．ループは、配列番号１８６を含む、実施形態２２に記載のｇＲＮＡ分子。
２４．５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
（ａ）配列番号１９５；
（ｂ）配列番号１９６；
（ｃ）配列番号１９７；
（ｄ）配列番号１９８；
（ｅ）配列番号２３１；又は
（ｆ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか
を含む、実施形態１〜９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２５．標的化ドメインとｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記核酸分子は、前記標的化ドメイン及び任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置された配列番号２３１を含む、例えばそれからなる、実施形態１〜９又は２１〜２４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２６．ｇＲＮＡ分子を構成する核酸分子の１つ又は任意選択で２つ以上は、
ａ）前記１つ又は複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｂ）前記１つ又は複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｃ）前記１つ又は複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｄ）前記１つ又は複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｅ）前記１つ又は複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の３’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；
ｆ）前記１つ又は複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目及び末端から２番目の５’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；又は
ｆ）これらの任意の組み合わせ
を含む、実施形態１〜２５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
２７．配列：
（ａ）配列番号７４；
（ｂ）配列番号７５；又は
（ｃ）配列番号７６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
２８．
（ａ）配列番号７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
２９．配列：
（ａ）配列番号７９；
（ｂ）配列番号８０；又は
（ｃ）配列番号８１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３０．
（ａ）配列番号８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号８３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号８３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３１．配列：
（ａ）配列番号８４；
（ｂ）配列番号８５；又は
（ｃ）配列番号８６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３２．
（ａ）配列番号８７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号８７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号８８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号８８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３３．配列：
（ａ）配列番号８９；
（ｂ）配列番号９０；又は
（ｃ）配列番号９１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３４．
（ａ）配列番号９２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号９２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３５．配列：
（ａ）配列番号９４；
（ｂ）配列番号９５；又は
（ｃ）配列番号９６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３６．
（ａ）配列番号９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３７．配列：
（ａ）配列番号９９；
（ｂ）配列番号１００；又は
（ｃ）配列番号１０１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３８．
（ａ）配列番号１０２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１０２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１０３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１０３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
３９．配列：
（ａ）配列番号１０４；
（ｂ）配列番号１０５；又は
（ｃ）配列番号１０６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４０．
（ａ）配列番号１０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１０８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１０８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４１．配列：
（ａ）配列番号１０９；
（ｂ）配列番号１１０；又は
（ｃ）配列番号１１１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４２．
（ａ）配列番号１１２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１１２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１１３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１１３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４３．配列：
（ａ）配列番号１１４；
（ｂ）配列番号１１５；又は
（ｃ）配列番号１１６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４４．
（ａ）配列番号１１７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１１７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１１８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１１８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４５．配列：
（ａ）配列番号１１９；
（ｂ）配列番号１２０；又は
（ｃ）配列番号１２１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４６．
（ａ）配列番号１２２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１２２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１２３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１２３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４７．配列：
（ａ）配列番号１２４；
（ｂ）配列番号１２５；又は
（ｃ）配列番号１２６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４８．
（ａ）配列番号１２７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１２７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１２８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１２８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
４９．配列：
（ａ）配列番号１２９；
（ｂ）配列番号１３０；又は
（ｃ）配列番号１３１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５０．
（ａ）配列番号１３２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１３２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１３３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１３３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５１．配列：
（ａ）配列番号１３４；
（ｂ）配列番号１３５；又は
（ｃ）配列番号１３６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５２．
（ａ）配列番号１３７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１３７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１３８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１３８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５３．配列：
（ａ）配列番号１３９；
（ｂ）配列番号１４０；又は
（ｃ）配列番号１４１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５４．
（ａ）配列番号１４２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１４２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１４３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１４３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５５．配列：
（ａ）配列番号１４４；
（ｂ）配列番号１４５；又は
（ｃ）配列番号１４６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５６．
（ａ）配列番号１４７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１４７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１４８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１４８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５７．配列：
（ａ）配列番号１４９；
（ｂ）配列番号１５０；又は
（ｃ）配列番号１５１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５８．
（ａ）配列番号１５２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１５２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
５９．配列：
（ａ）配列番号１５４；
（ｂ）配列番号１５５；又は
（ｃ）配列番号１５６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６０．
（ａ）配列番号１５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６１．配列：
（ａ）配列番号１５９；
（ｂ）配列番号１６０；又は
（ｃ）配列番号１６１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６２．
（ａ）配列番号１６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１６３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１６３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６３．配列：
（ａ）配列番号１６４；
（ｂ）配列番号１６５；又は
（ｃ）配列番号１６６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６４．
（ａ）配列番号１６７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１６７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１６８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１６８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６５．配列：
（ａ）配列番号１６９；
（ｂ）配列番号１７０；又は
（ｃ）配列番号１７１
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６６．
（ａ）配列番号１７２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６７．配列：
（ａ）配列番号１７４；
（ｂ）配列番号１７５；又は
（ｃ）配列番号１７６
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６８．
（ａ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子。
６９．
ａ）ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；及び／又は
ｂ）ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域においてｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域においてｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間に形成される、実施形態１〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７０．インデルは、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まず、任意選択で、インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない、実施形態６９に記載のｇＲＮＡ分子。
７１．ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、集団の細胞の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される、実施形態１〜７０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７２．インデルは、ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチド又はＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態６９〜７１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７３．集団の細胞の少なくとも約１５％は、ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデル及びＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む、実施形態７１〜７２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７４．ＨＢＧ１プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む集団の細胞のパーセンテージは、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％だけ、ＨＢＧ２プロモーター領域の少なくとも１つのヌクレオチドを含むインデルを含む集団の細胞のパーセンテージと異なる、実施形態７１〜７３に記載のｇＲＮＡ分子。
７５．インデルは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって計測される、実施形態６９〜７４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７６．ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加される、実施形態１〜７５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７７．ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、前記集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団におけるＦ細胞のパーセンテージは、ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団におけるＦ細胞のパーセンテージに対して少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％例えば、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％増加される、実施形態７６に記載のｇＲＮＡ分子。
７８．前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、実施形態７６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
７９．ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されない、実施形態１〜７８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
８０．ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えばＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、細胞の集団の細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、実施形態１〜７８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
８１．細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞である（又は細胞の集団は、それを含む）、実施形態６９〜８０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
８２．細胞は、ＨＳＰＣである（又は細胞の集団は、それを含む）、実施形態８１に記載のｇＲＮＡ分子。
８３．ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋である、実施形態８２に記載のｇＲＮＡ分子。
８４．ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である、実施形態８３に記載のｇＲＮＡ分子。
８５．細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来である、実施形態６９〜８４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
８６．細胞は、前記細胞を投与される患者にとって同種異系由来である、実施形態６９〜８４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
８７．
１）実施形態１〜８６のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子；
２）実施形態１〜８６のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）実施形態１〜８６のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
４）実施形態１〜８６のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；又は
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。
８８．実施形態１〜８６のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子を含む組成物であって、任意選択で、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物。
８９．Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、実施形態８７又は８８に記載の組成物。
９０．Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５を含む、実施形態８７〜８９に記載の組成物。
９１．Ｃａｓ９分子は、
（ａ）配列番号２３３；
（ｂ）配列番号２３４；
（ｃ）配列番号２３５；
（ｄ）配列番号２３６；
（ｅ）配列番号２３７；
（ｆ）配列番号２３８；
（ｇ）配列番号２３９；
（ｈ）配列番号２４０；
（ｉ）配列番号２４１；
（ｊ）配列番号２４２；
（ｋ）配列番号２４３；又は
（ｌ）配列番号２４４
を含む、例えばそれからなる、実施形態８７〜８９に記載の組成物。
９２．第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する、実施形態８８〜９１のいずれかに記載の組成物。
９３．第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子及び第３のｇＲＮＡ分子；又は第２のｇＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択で第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、実施形態１〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり、組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列に相補的である、実施形態８７〜９２のいずれかに記載の組成物。
９４．第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子内又は領域内の標的配列に相補的である、実施形態９３に記載の組成物。
９５．第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、６０００ヌクレオチド以下、５０００ヌクレオチド以下、５００以下、４００ヌクレオチド以下、３００以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下又は１０ヌクレオチド以下だけ離れた標的配列に相補的である、実施形態９３又は９４に記載の組成物。
９６．第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子及び任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、ＨＢＧ１プロモーター領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＨＢＧ２プロモーター領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含む、実施形態９３に記載の組成物。
９７．第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子を含み、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）実施形態１に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；
（ｂ）実施形態２に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；
ｃ）実施形態３に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；又は
（ｄ）実施形態４に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的であり；又は
（ｅ）実施形態２７〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、且つ異なる標的配列に相補的である、実施形態９４〜９５のいずれかに記載の組成物。
９８．第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子を含み、
ａ）第１のｇＲＮＡ分子は、
ｉ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７（ｈｇ３８）；
ｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７（ｈｇ３８）；
ｉｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７（ｈｇ３８）；又は
ｉｖ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７（ｈｇ３８）
の中に少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含む）を含む標的配列に相補的であり；
ｂ）第２のｇＲＮＡ分子は、
ｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４（ｈｇ３８）；
ｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４（ｈｇ３８）；又は
ｉｉｉ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１（ｈｇ３８）
の中に少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、２０個の連続するヌクレオチドを含む）を含む標的配列に相補的である、実施形態９４〜９６のいずれかに記載の組成物。
９９．組成物のｇＲＮＡ分子成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子からなる、実施形態８７〜１０８のいずれかに記載の組成物。
１００．前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば実施形態９０又は９１のいずれかのＣａｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある、実施形態８７〜１０９のいずれか１つに記載の組成物。
１０１．鋳型核酸を含み、鋳型核酸は、第１のｇＲＮＡ分子の標的配列に又はその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む、実施形態８７〜１００のいずれかに記載の組成物。
１０２．鋳型核酸は、
（ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２Ａ及びＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビン若しくはその断片；又は
（ｂ）ヒトγグロビン若しくはその断片をコードする核酸
を含む、実施形態１０１のいずれかに記載の組成物。
１０３．エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、実施形態８７〜１０２のいずれかに記載の組成物。
１０４．前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０ｕＭ未満、例えば約３ｕＭ未満、例えば約１ｕＭ未満、例えば約０．５ｕＭ未満、例えば約０．３ｕＭ未満、例えば約０．１ｕＭ未満の濃度であり、任意選択で、前記ＲＮＰの濃度は、約２ｕＭであるか又は約１ｕＭであり、任意選択で、組成物は、細胞、例えばＨＳＰＣの集団をさらに含む、実施形態８７〜１０３のいずれかに記載の組成物。
１０５．実施形態１〜６８のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
１０６．核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態１０５に記載の核酸配列。
１０７．プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである、実施形態１０６に記載の核酸配列。
１０８．プロモーターは、Ｕ６プロモーター又はＨＩプロモーターである、実施形態１０７に記載の核酸配列。
１０９．核酸は、Ｃａｓ９分子をさらにコードする、実施形態１０５〜１０８のいずれかに記載の核酸配列。
１１０．Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３又は配列番号２４４のいずれかを含む、実施形態１０９に記載の核酸配列。
１１１．前記核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態１０９〜１１０のいずれかに記載の核酸配列。
１１２．プロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、実施形態１１１に記載の核酸配列。
１１３．実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
１１４．レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態１１３に記載のベクター。
１１５．細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、
１）実施形態１〜６８のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
２）実施形態１〜６８のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）実施形態１〜６８のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
４）実施形態１〜６８のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
７）実施形態８７〜１０４のいずれかに記載の組成物；又は
８）実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター
と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法。
１１６．ｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．ｇＲＮＡ分子又はｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される、実施形態１１５に記載の方法。
１１８．２つ以上の組成物は、同時に又は逐次的に送達される、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．細胞は、動物細胞である、実施形態１１５〜１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．細胞は、哺乳類細胞、霊長類又はヒト細胞である、実施形態１１５〜１１８のいずれかに記載の方法。
１２１．細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態１１５〜１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、実施形態１１５〜１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされた細胞の集団を含む組成物中に配置される、実施形態１１５〜１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血又は臍帯血から単離されている、実施形態１１５〜１２４のいずれかに記載の方法。
１２６．細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来であり、任意選択で、患者は、異常ヘモグロビン症患者であり、任意選択で、患者は、鎌状赤血球病又はサラセミア、任意選択でβサラセミアに罹患している、実施形態１１５〜１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．
ａ）改変は、１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルをもたらし；及び／又は
ｂ）改変は、ＨＢＧ１プロモーター領域において１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間において、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失をもたらし、任意選択で、欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、実施形態１１５〜１２６のいずれかに記載の方法。
１２８．インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入又は欠失である、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．方法は、例えば、細胞の集団であって、集団の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％は、改変されている、例えばインデルを含む、細胞の集団をもたらし、任意選択で、インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない、実施形態１２７〜１２９のいずれかに記載の方法。
１３１．改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する、実施形態１１５〜１３０のいずれかに記載の方法。
１３２．改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％高い割合）を有する、実施形態１１５〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、実施形態１１５〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３４．実施形態１１５〜１３３のいずれかに記載の方法によって改変された細胞又は実施形態１１５〜１３３のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な細胞。
１３５．表７−２に記載されるインデルを含む細胞であって、任意選択で、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない細胞。
１３６．実施形態１〜６８のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、又は実施形態８７〜１０４のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、又は実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
１３７．Ｃａｓ９分子を含む、実施形態１３６に記載の細胞。
１３８．Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３又は配列番号２４４のいずれかを含む、実施形態１３７に記載の細胞。
１３９．細胞は、実施形態１〜６８のいずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子又は実施形態１〜６８のいずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、又はそれを含むことになり、第１のｇＲＮＡ分子及び第２のｇＲＮＡ分子は、同一でない標的化ドメインを含む、実施形態１３４〜１３８のいずれかに記載の細胞。
１４０．胎児ヘモグロビンの発現は、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞又はその子孫に対して前記細胞又はその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫）において増加される、実施形態１３４〜１３９のいずれかに記載の細胞。
１４１．細胞は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する、実施形態１３４〜１３９のいずれかに記載の細胞。
１４２．分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの分化細胞に対して少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、実施形態１４０〜１４１のいずれかに記載の細胞。
１４３．幹細胞増殖剤と接触されている、実施形態１３４〜１４２のいずれかに記載の細胞。
１４４．幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
である、実施形態１４３に記載の細胞。
１４５．幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールである、実施形態１４４に記載の細胞。
１４６．
ａ）実施形態１〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
ｂ）ＨＢＧ１プロモーター領域において実施形態１〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において実施形態１〜６８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失
を含み、任意選択で、欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、細胞、例えば実施形態１３４〜１４５のいずれかに記載の細胞。
１４７．インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入又は欠失である、実施形態１４６に記載の細胞。
１４８．インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、実施形態１４６〜１４７のいずれかに記載の細胞。
１４９．細胞は、動物細胞である、実施形態１３４〜１４８のいずれかに記載の細胞。
１５０．細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞である、実施形態１４９に記載の細胞。
１５１．細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、実施形態１３４〜１５０のいずれかに記載の細胞。
１５２．細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態１３４〜１５１のいずれかに記載の細胞。
１５３．細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、実施形態１５２に記載の細胞。
１５４．細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血又は臍帯血から単離されている、実施形態１３４〜１５３のいずれかに記載の細胞。
１５５．細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来であり、任意選択で、患者は、異常ヘモグロビン症患者であり、任意選択で、患者は、鎌状赤血球病又はサラセミア、任意選択でβサラセミアに罹患している、実施形態１３４〜１５４のいずれかに記載の細胞。
１５６．細胞は、前記細胞を投与される患者にとって同種異系由来である、実施形態１３４〜１５４のいずれかに記載の細胞。
１５７．実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞を含む細胞の集団。
１５８．集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）は、実施形態１３４〜１５６のいずれか１つに記載の細胞である、実施形態１５７に記載の細胞の集団。
１５９．分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、例えば、同じタイプの修飾されていない細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約１７％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％高い割合）を有する、実施形態１５７〜１５８のいずれかに記載の細胞の集団。
１６０．分化細胞の集団のＦ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、実施形態１５９に記載の細胞の集団。
１６１．
１）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；
２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；
３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；
４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ；又は
５）２ｅ６〜１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／細胞が投与される患者の体重ｋｇ
を含む、実施形態１５７〜１６０のいずれかに記載の細胞の集団。
１６２．集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％）は、ＣＤ３４＋細胞である、実施形態１５７〜１６１のいずれかに記載の細胞の集団。
１６３．集団の細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、実施形態１６２に記載の細胞の集団。
１６４．臍帯血、末梢血（例えば、動員末梢血）又は骨髄に由来し、例えば骨髄に由来する、実施形態１５７〜１６３のいずれかに記載の細胞の集団。
１６５．哺乳類細胞、例えばヒト細胞を含み、例えばそれからなり、任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、実施形態１５７〜１６４のいずれかに記載の細胞の集団。
１６６．（ｉ）細胞の集団が投与される患者に対して自己由来であるか、又は（ｉｉ）細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、実施形態１５７〜１６５のいずれかに記載の細胞の集団。
１６７．細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば実施形態１５７〜１６５のいずれかに記載の細胞の集団であって、表７−２に記載されるとおりのインデルパターンを含み、任意選択で、表７−２に記載されるインデルパターンのインデルは、集団の細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％において検出可能である、細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば実施形態１５７〜１６５のいずれかに記載の細胞の集団。
１６８．実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団を含む組成物。
１６９．薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適な薬学的に許容可能な媒体を含む、実施形態１６８に記載の組成物。
１７０．異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞、実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団又は実施形態１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
１７１．哺乳類における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞、実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団又は実施形態１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
１７２．異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、実施形態１７０に記載の方法。
１７３．細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法であって、
（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；及び
（ｃ）実施形態１〜８６のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、実施形態１〜８６のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、実施形態８７〜１０４、又は１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、又は実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。
１７４．前記ステップ（ｃ）の導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞に対して増加した胎児ヘモグロビンを産生する、実施形態１７３に記載の方法。
１７５．幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
である、実施形態１７３〜１７４のいずれかに記載の方法。
１７６．幹細胞増殖剤は、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールである、実施形態１７５に記載の方法。
１７７．細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、実施形態１７３〜１７６のいずれかに記載の方法。
１７８．細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む、実施形態１７７に記載の方法。
１７９．細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む、実施形態１７７〜１７８に記載の方法。
１８０．前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、実施形態１７９に記載の方法。
１８１．細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む、実施形態１７８〜１８０のいずれかに記載の方法。
１８２．細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、実施形態１８１に記載の方法。
１８３．細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度で含む、実施形態１７３〜１８２のいずれかに記載の方法。
１８４．細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｕＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度で含む、実施形態１８３に記載の方法。
１８５．細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度で含む、実施形態１８４に記載の方法。
１８６．細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度で含む、実施形態１８５に記載の方法。
１８７．細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む、実施形態１８６に記載の方法。
１８８．ステップ（ｂ）の培養は、ステップ（ｃ）の導入前の培養期間を含む、実施形態１７３〜１８７のいずれかに記載の方法。
１８９．ステップ（ｃ）の導入前の培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間であり、又は約１日の期間である、実施形態１８８に記載の方法。
１９０．ステップ（ｂ）の培養は、ステップ（ｃ）の導入後の培養期間を含む、実施形態１７３〜１８９のいずれかに記載の方法。
１９１．ステップ（ｃ）の導入後の培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、又は約３日の期間であり、又は約４日の期間である、実施形態１９０に記載の方法。
１９２．細胞の集団は、例えば、ステップ（ｂ）によって培養されていない細胞に対して少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍だけ増殖される、実施形態１７３〜１９１のいずれかに記載の方法。
１９３．ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーションを含む、実施形態１７３〜１９２のいずれかに記載の方法。
１９４．エレクトロポレーションは、１〜５パルス、例えば１パルスを含み、各パルスは７００ボルト〜２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、且つ１０ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のパルス持続時間を有する、実施形態１９３に記載の方法。
１９５．エレクトロポレーションは、１パルスを含む、実施形態１９４に記載の方法。
１９６．パルス電圧は、１５００〜１９００ボルトの範囲であり、例えば１７００ボルトである、実施形態１９４〜１９５のいずれかに記載の方法。
１９７．パルス持続時間は、１０ｍｓ〜４０ｍｓの範囲であり、例えば２０ｍｓである、実施形態１９４〜１９６のいずれかに記載の方法。
１９８．ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である、実施形態１７３〜１９７のいずれかに記載の方法。
１９９．ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離される、実施形態１９８に記載の方法。
２００．
（ｉ）ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離され、任意選択で、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、サラセミアは、βサラセミアであり；又は
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は、末梢血から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の末梢血から単離され、任意選択で、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、サラセミアは、βサラセミアであり；任意選択で、末梢血は、動員末梢血であり、任意選択で、動員末梢血は、Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせを用いて動員される、実施形態１９９に記載の方法。
２０１．ステップ（ａ）で提供される細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされている、実施形態１７３〜２００のいずれかに記載の方法。
２０２．ステップ（ｃ）の導入後、細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される、実施形態１７３〜２０１のいずれかに記載の方法。
２０３．ステップ（ｃ）の導入後、細胞（例えば、細胞の集団）は、
ａ）第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
ｂ）ＨＢＧ１プロモーター領域において第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての配列を含む欠失
を含み、任意選択で、インデル、例えば欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、実施形態１７３〜２０２のいずれかに記載の方法。
２０４．ステップ（ｃ）の導入後、細胞の集団の細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない、実施形態１７３〜２０３のいずれかに記載の方法。
２０５．実施形態１７３〜２０４のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）。
２０６．異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞、実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団又は実施形態２０５に記載の細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
２０７．ヒト患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、実施形態１３４〜１５６のいずれかに記載の細胞、実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団又は実施形態２０５に記載の細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法。
２０８．異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、実施形態２０６に記載の方法。
２０９．ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の、実施形態２０５に記載の細胞、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の、実施形態２０５に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物が投与される、実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の方法。
２１０．ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、実施形態２０５に記載の細胞、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、実施形態２０５に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物が投与される、実施形態２０９に記載の方法。
２１１．ヒト患者は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個の、実施形態２０５に記載の細胞、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６〜約１０ｅ６個の、実施形態２０５に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物が投与される、実施形態２０９に記載の方法。
２１２．薬剤として使用するための、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団。
２１３．薬剤の製造に使用するための、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団。
２１４．疾患の治療に使用するための、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団。
２１５．疾患の治療に使用するための、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団であって、疾患は、異常ヘモグロビン症である、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団。
２１６．疾患の治療に使用するための、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団であって、異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、実施形態１〜８６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、実施形態８７〜１１４若しくは１６８〜１６９のいずれかに記載の組成物、実施形態１０５〜１１２のいずれかに記載の核酸、実施形態１１３〜１１４のいずれかに記載のベクター、実施形態１３４〜１５６若しくは２０５のいずれかに記載の細胞又は実施形態１５７〜１６７のいずれかに記載の細胞の集団。
実施例１ − 例示的な一般的な方法
ガイド選択及び設計
目的の領域内にあるＰＡＭを同定するため、インシリコでヒト参照ゲノム及びユーザー定義による目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード調節領域等）を使用して初期ガイド選択を実施した。同定されたＰＡＭの各々について分析を実施し、統計が報告された。例えば、本明細書に記載されるとおり、効率及び有効性を決定するための幾つもの方法に基づきｇＲＮＡ分子をさらに選択し、順位付けした。この実施例は、ＣＲＩＳＰＲシステム、ｇＲＮＡ及び本明細書に記載される本発明の他の態様をアッセイするのに使用され得る手順のための実験の詳細を提供する。特定の実験に用いられたこれらの一般的な手順に対する任意の変更が、該当する実施例において示される。
本実施例全体を通じて、以下の実験では、ｓｇＲＮＡ分子又はｄｇＲＮＡ分子のいずれかを使用した。特に指示がない限り、ｄｇＲＮＡ分子を使用した場合、ｇＲＮＡは以下を含む。
ｃｒＲＮＡ：［標的化ドメイン］−［配列番号２０１］
ｔｒａｃｒ（ｔｒＲＮＡ）：配列番号２２４
特に指示がない限り、ｓｇＲＮＡ分子を用いる実験では、以下の配列を使用した。
［標的化ドメイン］−［配列番号１９５］−ＵＵＵＵ
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）並びにオンターゲット切断効率及びインデル形成に関する分析
ゲノムにおける標的位置の編集（例えば、切断）効率を決定するため、ディープシーケンシングを利用して、非相同末端結合によって導入された挿入及び欠失の存在を同定した。
要約すると、標的部位に関するＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム範囲を編集及び未編集試料においてＰＣＲ増幅した。得られたアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリに変換し、シーケンシングした。シーケンシングリードをヒト参照ゲノムとアラインメントし、変異体コーリング（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ）分析に供して、目的の標的領域における配列変異体及びその頻度を決定するのを可能にした。データを様々なクオリティフィルタ（ｑｕａｌｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）に供し、公知の変異体又は未編集試料のみにおいて同定された変異体を除外した。編集率パーセンテージを、オンターゲット部位におけるリード（野生型及び突然変異体リード）の総数に対する、目的のオンターゲット部位において発生する全ての挿入又は欠失イベント（すなわちオンターゲット部位における挿入及び欠失リードのパーセンテージとして定義した。ＮＧＳ分析プロセスの詳細な説明が、実施例２．１に記載される。
ＲＮＰ作成
Ｃａｓ９タンパク質にｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを加えると活性Ｃａｓ９ リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）が形成され、これはｃｒＲＮＡによって指定される標的領域への結合及び標的ゲノムＤＮＡの特異的切断を媒介する。ｔｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡをＣａｓ９に負荷することによってこの複合体を形成した。これはＣａｓ９にコンホメーション変化を引き起こし、Ｃａｓ９によるｄｓＤＮＡへの結合及び切断が可能になるものと考えられる。
ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを別々に９５℃で２分間変性させ、室温に戻した。Ｃａｓ９タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）に加え、次にそこにｔｒＲＮＡ及び様々なｃｒＲＮＡを（別個の反応で）加え、３７℃で１０分間インキュベートすると、それにより活性ＲＮＰ複合体が形成された。この複合体をエレクトロポレーション及び他の方法によってＨＥＫ−２９３及びＣＤ３４＋造血細胞を含めた多様な細胞に送達した。
ＣＤ３４＋ ＨＳＣへのＲＮＰの送達
ＣＤ３４＋ ＨＳＣにＣａｓ９ ＲＮＰを送達した。
ＣＤ３４＋ ＨＳＣを解凍し、ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で一晩培養した（約５００，０００細胞／ｍｌ）。約９０，０００細胞をアリコートに分け、それぞれのＲＮＰ送達反応毎にペレット化した。次に細胞を６０ｕｌ Ｐ３ヌクレオフェクション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、続いてそこに活性ＲＮＰを加えた。次にトリプリケート（２０ｕＬ／エレクトロポレーション）でＨＳＣをエレクトロポレートした（例えば、Ｌｏｎｚａ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプログラムＣＡ−１３７を使用してヌクレオフェクションした）。エレクトロポレーション後直ちにＨＳＣにＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地（ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ及びペニシリン／ストレプトマイシン含有）を加え、これを少なくとも２４時間培養した。次にＨＳＣを回収し、Ｔ７Ｅ１、ＮＧＳ、及び／又は表面マーカー発現分析に供した。
ＨＳＣ機能アッセイ
ＣＤ３４＋ ＨＳＣは、フローサイトメトリー又はインビトロコロニー形成アッセイなど、既知の技法を用いて幹細胞表現型に関してアッセイし得る。例として、製造者のプロトコルを用いたＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するインビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦＣ）により、細胞をアッセイした。簡潔に言えば、１〜１．２５ｍｌ ｍｅｔｈｏｃｕｌｔに≦１００ｕｌ容積中の５００〜２０００個のＣＤ３４＋細胞を加える。この混合物を４〜５秒間激しくボルテックスして完全に混合し、次に室温に少なくとも５分間放置した。シリンジを使用して１〜１．２５ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ＋細胞を３５ｍｍディッシュ又は６ウェルプレートのウェルに移した。１２〜１４日後に製造者のプロトコルに従いコロニーの数及び形態を評価した。
インビボ異種移植
ＨＳＣは、機能的には、その自己複製能力により、及び多系統分化について定義される。この機能性はインビボでのみ評価することができる。ヒトＨＳＣ機能を決定する際のゴールドスタンダードは、一連の突然変異によって重度免疫不全となり、したがってヒト細胞のレシピエントとしての役割を果たすことができるＮＯＤ−ＳＣＩＤ γマウス（ＮＳＧ）への異種移植によるものである。編集後のＨＳＣをＮＳＧマウスに移植し、誘導された編集がＨＳＣ機能に影響しないことを検証した。これらの実施例においてより詳細に記載されるとおり、定期的な末梢血分析を用いてヒトキメラ及び系統発達を評価し、２０週後の二次移植を用いて機能性ＨＳＣの存在を確立した。
実施例２．１ 成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）における非欠失ＨＰＦＨ領域編集
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造業者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナー由来のＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、各５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９５１４）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９４１３）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）及びヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ００６３）並びに１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）及び５００ｎＭの化合物４を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を用いて４〜６日間増殖させた。この実施例全体を通じて（そのサブ実施例を含め）、プロトコルがその細胞を「増殖させた」と指示する場合、この培地を使用した。この培地はこの実施例全体を通じて（そのサブ実施例を含め）「幹細胞増殖培地」、又は「増殖培地」とも称される。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、初めに各６μｇのｃｒＲＮＡ（４．５μＬ中）及びｔｒａｃｒ（２．５２μＬ中）を別個のチューブにおいて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質（２μＬ中）を１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。なし／対照条件については、Ｔｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体にｃｒＲＮＡではなく媒体を加えた。遠心によってＨＳＰＣを回収し、Ｌｏｎｚａエレクトロポレーションキット（カタログ番号Ｖ４ＸＰ−３０３２ Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ Ｐ３ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ４−Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｘ Ｋｉｔ Ｓ）に付属するＰ３緩衝液＋補足物中に２．８×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを４０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。各レプリケートについて、２１μＬのＲＮＰ／細胞混合物を、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ Ｐ３ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ４−Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｘ Ｋｉｔ Ｓに移した。Ｌｏｎｚａトランスフェクションシステム（４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｕｎｉｔ）でプロトコルＣＭ−１３７を用いてエレクトロポレーションを実施した。デュプリケートの２１μＬのエレクトロポレーションを実施した。
インビトロ赤血球新生及びＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エレクトロポレーション後、直ちに、ＩＭＤＭ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＨ３０２２８．０１）、３３０μｇ／ｍＬのヒトホロトランスフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｉａカタログ番号７７７ＴＲＦ０２９）、１０μｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１１３８２１１）、２ＩＵ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、ｐａｒｔ ＃Ｈ３３９３）、５％のヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、２．５Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポエチン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００−０６４）、及び１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）からなる２５０μＬの予め温めた赤血球系分化培地（ＥＤＭ）に細胞を移した。７日までの最初の培養期間中、ＥＤＭには、１．３８μＭのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、及び５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１０７７９−５９８）をさらに補足して、ＥＤＭ−Ｉを作製した。４日後、細胞培養物を新鮮培地に希釈した。培養物は、上記の培養条件において合計７日間維持し、７日経った時点で、細胞の半分をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。簡潔に言えば、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６３；ＰＢＳ中１：１０００）に再懸濁して、３０分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、１／５０希釈の抗ＣＤ７１−ＢＶ７１１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｌｃ．ＢＤ ５６３７６７）及び抗ＣＤ２３５ａ−ＡＰＣ（ＢＤ ５５１３３６）抗体で３０分間染色した。次に細胞を洗浄し、続いて製造業者の指示に従い固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で固定化し、及び１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で透過処理した。次に細胞を５０μＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液中１／４０希釈の抗ＨｂＦ−ＰＥ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｐａｒｔ ＃ＭＨＦＨ０４）と共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を０．２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨｂＦ発現に関して分析した。結果はＦｌｏｗｊｏを使用して分析し、及びデータは、生存ＣＤ７１陽性赤血球系細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ細胞）の％として提示した。
残りの７日目の培養細胞から、条件当たり８０，０００個を、１１日目までのさらなる分化のためにＥＤＭ−ＩＩ培養培地中に移した。ＥＤＭ−ＩＩは、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦのみを補足したＥＤＭ−Ｉからなる。１１日目に、細胞を計数し、条件当たり２００，０００個の細胞をさらなる補足物なしでＥＤＭ中に移した。１４日目に、細胞を７日目と同様にＨｂＦ発現の分析のために染色したが、表面マーカーを、細胞の凝集を防ぐために染色から除外した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの７日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済み及び未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。編集効率並びに挿入及び欠失（インデル）のパターンを決定するため、文献に記載されるとおり標的部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ産物を作成し、次にこれを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。未編集試料（Ｃａｓ９及びＴｒａｃｒのみからなるＲＮＰをエレクトロポレートした）における対応する配列のパーセント編集率は、典型的には１％未満であり、３％を超えることはなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシング。製造業者の推奨に従い１．８×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＰＣＲアンプリコンを精製した。製造業者の推奨に従いＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、アンプリコンを定量化した。以下の変更を加えて製造業者の推奨に従いＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを作成した。タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、Ｗａｎｇら（ＰＭＩＤ：２４０７１９０８；参照により本明細書に援用される）によって既に記載される、５ｎｇの精製されたＰＣＲ産物、０．１５ｕｌのＮｅｘｔｅｒａタグメント酵素及びタグメンテーション緩衝液を使用して、５ｕｌの最終容積で実施した。タグメンテーションされたアンプリコンを、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ ｉｎｄｅｘ ＰＣＲプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の最終濃度を使用して、５０ｕｌの最終容積でＰＣＲ増幅した。使用したＰＣＲサイクル条件は以下のとおりであった：７２℃で３分、９８℃で２分及び９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、及び７２℃で３分を１５サイクル。次に、製造業者の推奨に従い１．０×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、シーケンシングライブラリを精製した。製造業者の推奨に従いＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、シーケンシングライブラリを定量化し、シーケンシングのために等モルでプールした。シーケンシングライブラリを、製造業者の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従いＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで１５０塩基ペアエンドリードによりシーケンシングした。アンプリコンにつき最低の１０００倍シーケンシングカバレッジが生成された。
ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析。デフォルトパラメータを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ分析ソフトウェア（ＭｉＳｅｑレポーター、バージョン２．６．２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してアンプリコン特異的ＦＡＳＴＱシーケンシングデータファイルを作成した（Ｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０，３８（６）：１７６７−７１，ＰＭＩＤ：２００１５９７０）。次に、標準Ｐｅｒｌスクリプトラッパーを用いて一体に結合した一連のパブリックドメインソフトウェアパッケージからなる内部開発の変異体分析パイプラインでＦＡＳＴＱファイルを処理した。使用したワークフローは５段階に分けられた。
ステージ１、ＰＣＲプライマー並びにオンターゲット及びオフターゲット配列ＱＣ：オンターゲット部位及びオフターゲット部位の両方について、２０ヌクレオチドｇＲＮＡ標的化ドメイン配列＋ＰＡＭ配列及び標的特異的ＰＣＲプライマー配列（左及び右、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａ配列はなし）を、ＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．２９＋、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）を用いてヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。複数のゲノム位置を含むオンターゲット部位及びオフターゲット部位にフラグを立てた。
ステージ２、シーケンサーファイル解凍：ｇｚｉｐスクリプト（バージョン１．３．１２）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにより作成されたＦＡＳＴＱ．ＧＺファイルを解凍してＦＡＳＴＱファイルにし、ファイル当たりのリード数を計算した。リードのないファイルは以降の分析から除外した。
ステージ３、配列リードアラインメント及びクオリティトリミング：ＢＷＡ−ＭＥＭアライナー（バージョン０．７．４−ｒ３８５、Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５（１４）：１７５４−６０、ＰＭＩＤ：１９４５１１６８）を使用して、「ハードクリッピング」を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ配列のリードの３’末端及び低品質塩基をトリミングして、ＦＡＳＴＱファイルのシーケンシングリードをヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。ＢＡＭファイル形式（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９ ２５（１６）：２０７８−９，ＰＭＩＤ：１９５０５９４３）の得られたアラインメント後のリードを、ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプト（バージョン０．１．１９−４４４２８ｃｄ、Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９ ２５（１６）：２０７８−９，ＰＭＩＤ：１９５０５９４３）を使用してＦＡＳＴＱファイルに変換した。次にＢＷＡ−ＭＥＭアライナーを今回は「ハードクリッピング」なしで使用して、ＦＡＳＴＱファイルを再びヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。
ステージ４、変異体（ＳＮＰ及びインデル）分析：アレル頻度検出限界を＞＝０．０００１に設定したＶａｒＤｉｃｔバリアントコーラー（開発者ＺｈｏｎｇＷｕ Ｌａｉによって改良されたバージョン１．０「Ｃａｓ９アウェア（Ｃａｓ９ ａｗａｒｅ）」、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１６，４４（１１）：ｅ１０８，ＰＭＩＤ：２７０６０１４９）を使用して、アラインメントされたリードのＢＡＭファイルを処理し、変異体（ＳＮＰ及びインデル）を同定した。Ｃａｓ９アウェアＶａｒＤｉｃｔコーラーはパブリックドメインパッケージに基づくが、変異イベントのアラインメント領域における反復配列に起因して生成された曖昧な変異体コールを、ＰＡＭ配列の５’側の３塩基に位置するｇＲＮＡ標的化ドメイン配列の潜在的Ｃａｓ９ヌクレアーゼ切断部位の方へ動かすことができる。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプトを使用してサンプルアンプリコン当たりのリードカバレッジを計算し、オンターゲット部位及びオフターゲット部位が＞１０００倍配列カバレッジでカバーされたかどうかを決定した。＜１０００倍配列カバレッジの部位にフラグを立てた。
ステージ５、ｄｂＳＮＰフィルタリング及び処理済み／未処理判別分析：同定された変異体は、ｄｂＳＮＰに見られる公知の変異体（ＳＮＰ及びインデル）に関してフィルタリングした（ビルド１４２、Ｓｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１，２９（１）：３０８−１１，ＰＭＩＤ：１１１２５１２２）。処理済みサンプルの変異体をさらにフィルタリングして、以下を除外した：１）未編集対照サンプルに同定される変異体；２）ＶａｒＤｉｃｔ鎖バイアスが２：１の変異体（ここでは参照配列を支持するフォワード及びリバースリードカウントがバランスしているが、非参照変異体コールについてはアンバランスである）；３）潜在的Ｃａｓ９切断部位の両側＞５ｂｐに位置する変異体；４）シングルヌクレオチド変異体。
結果：
ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域内の特異的配列を（例えば、それらの配列又はその近傍におけるインデル形成によって）標的化して破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、ＨｂＦタンパク質の含有量が高い赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、本明細書において「Ｆ細胞」と呼ばれることがある）の産生が可能になるという意外な結果を本発明者らは本明細書において示した。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミア及びＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。本明細書において、エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、且つ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞及び組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。本明細書において、エレクトロポレーションによる予め複合体化したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の送達が、ほぼ送達直後に、効率的且つ特異的ゲノム編集をもたらし、細胞内で分解されるため、オフターゲット効果が低下することを本発明者らは示す。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミド及びウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化し得る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換え化膿レンサ球菌（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２３６）を精製し、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡ標的化ドメインのリスト及び配列は、表１に示す。ｇＲＮＡ配列の大部分は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域の両方において完全な標的又は１つ若しくは２つのみのミスマッチを有する。この状況は、ヒトβグロビン遺伝子座内のＨＢＧ遺伝子の重複による。「材料及び方法」に記載されるとおりのエレクトロポレーションにより、ＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ＨＳＰＣへとエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に、細胞を増殖させた。理論によって拘束されるものではないが、活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
Figure 2020505934
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ゲノム編集済み及び未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビン及び赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。これらのｇＲＮＡ ＲＮＰをＨＳＰＣに送達すると、エレクトロポレーション後７日目にモックエレクトロポレート細胞（１６．９％）と比較して、ＨｂＦを含有する子孫赤血球系細胞のパーセンテージが（６２．７５％まで）増加した（表４）。１４日目のＨｂＦ誘導レベルのさらなる増加により、最も良好に機能するｄｇＲＮＡ配列についての高い誘導レベルが確認されたが（表４）、対照において検出されるバックグラウンドＨｂＦレベルは、７日目と比較してより高い。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察され、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２領域へのｇＲＮＡの幾つかは、ｇ８より高い％Ｆ細胞レベルをもたらした。エレクトロポレーション後７日目に単離されたＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物も次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメイン及びＴｒａｃｒのｃｒＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物の多くでは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域における高いゲノム編集パーセンテージが観察されたが（表４、図１）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９及びＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。詳細には、７日目のモックトランスフェクト対照バックグラウンドより１７％超高いＨｂＦ＋細胞をもたらしたｄｇＲＮＡ処理は、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２標的遺伝子座のいずれかにおいて５．９２％〜７７．８４％の範囲の編集済みアレルを有していた（表４、図２及び図３）。ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域のいずれかに対する選択的特異性を有する一部のガイドは、それらが特異的な遺伝子座において優先的な編集を示した（例えばＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−００１１及びＧＣＲ−００１２は、ＨＢＧ１をより効率的に編集し、ＧＣＲ−００３４、ＧＣＲ−００４６、ＧＣＲ−００５１、ＧＣＲ−００５２、ＧＣＲ−００５４及びＧＣＲ−００５８は、ＨＢＧ２をより効率的に編集する）。この相関の顕著且つ意外な例外は、ＧＣＲ−０００８であり、これは、ＨＢＧ１遺伝子座の標的配列に特異的であるが、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子座の両方を効率的に編集し、高いＨｂＦ誘導ももたらす。ＧＣＲ−０００８は、ＨＢＧ２遺伝子座における標的配列との単一のミスマッチを有し、これは、効率的なオフターゲット編集がこの部位で起こることを示唆している。試験される７２ｇＲＮＡの幾つかの標的配列は、遺伝性高胎児ヘモグロビン（ＨＰＦＨ）発現に関連する幾つかのアノテーションされた（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）ヒト突然変異に重なるか又はその近傍の領域並びにＨＢＧ１及びＨＢＧ２の両方の近位プロモーター領域における転写因子の公知の結合部位に位置する（図４及び図５）。意外にも、最も良好に機能するｇＲＮＡの群は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子（例えば、それぞれ、ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７；ｈｇ３８及びｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４；ｈｇ３８（図４及び図５）に位置する）におけるプロモーター機能のこれらの公知の領域の外部の配列を標的とする。これらのｇＲＮＡは、ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００６、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−０００９、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００１１、ＧＣＲ−００１２、ＧＣＲ−００３４、ＧＣＲ−００４６、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１、ＧＣＲ−００５４、ＧＣＲ−００５８及びＧＣＲ−００６７を含む。別の良好に機能するｇＲＮＡ（ＧＣＲ−００２８）は、非欠失ＨＰＦＨ突然変異に関連していないＨＢＧ１及びＨＢＧ２（それぞれ、ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７；ｈｇ３８及びｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１；ｈｇ３８（図４及び図５））の両方の近位プロモーター領域における転写因子結合部位（ＴＡＴＡボックス）を標的とする。
実施例２．２：成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＨＳＰＣにおけるγグロビンプロモーター領域編集 − ｓｇＲＮＡ形式を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した選択部位における評価
方法：
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人健常ドナー骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａカタログ番号２Ｍ−１０１Ｄ）。細胞を解凍し、次に６日間増殖させた。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、各１２μｇのｓｇＲＮＡ、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質及び１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）を、１０ｕｌの総容積中で組み合わせて、次に３７℃で５分間インキュベートした。なし／対照条件については、ｓｇＲＮＡではなく媒体を添加した。Ｐ３緩衝液＋補足物における細胞密度は、３．９×１０６／ｍＬであった。
インビトロ赤血球新生及びＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。１１日目に、細胞を、さらなる補足物なしでＥＤＭに移した。１４日目及び１８日目に、細胞をペレット化し、さらなる補足物なしで新鮮なＥＤＭに再懸濁した。１４日目及び２１日目に、細胞のアリコートを、ＨｂＦ発現の分析のために取った。細胞を７日目と同様に染色したが、表面マーカーを、細胞の凝集を防ぐために染色から除外し、抗ＨｂＦ抗体を１：２０希釈で使用した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済み及び未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。後述されるＮＧＳ分析は、Ｃａｓ９単独でエレクトロポレートされた対照試料において有意な編集を示さなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
結果：
Ｆ細胞の産生をもたらすＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域内の特異的配列の標的化した破壊は、ｓｇＲＮＡ形式のｇＲＮＡを用いても達成され得ることを本発明者らは本明細書において示した。
Figure 2020505934
成人骨髄由来のＨＳＰＣに、組換え化膿レンサ球菌（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２３６）及びｓｇＲＮＡ形式の指示されるｇＲＮＡから形成されたＲＮＰ複合体をエレクトロポレートした。得られたゲノム編集済み及び未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビン及び赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。これらのｇＲＮＡ ＲＮＰをＨＳＰＣに送達すると、エレクトロポレーション後７日目にモックエレクトロポレート細胞（３９．０％）と比較して、ＨｂＦを含有する子孫赤血球系細胞のパーセンテージが（７４．６％まで）増加した（表５）。１４日目及び２１日目のＨｂＦ誘導レベルのさらなる増加により、最も良好に機能するｓｇＲＮＡ配列についての高い誘導レベルが確認された（表５）。エレクトロポレーション後３日目に単離されたＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物も次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。所与の標的化ドメインのＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物の多くでは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域における高いゲノム編集パーセンテージ（大規模欠失を除く）が観察されたが（表５）、ｓｇＲＮＡを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９のみ）では観察されなかった。
実施例２．１において７日目のＨｂＦ＋赤血球系細胞の＞１７％の増加を有する選択された標的化部位が、本研究に含まれていた。この実験設計は、実施例２．１において上述されるものと２つの点が大きく異なっていた：ｇＲＮＡ形式（ｄｇＲＮＡではなくｓｇＲＮＡ）及びＨＳＰＣ供給源（異なるドナー及び動員末梢血由来ではなく骨髄由来）。理論によって拘束されるものではないが、試験間の未編集細胞培養物におけるＨｂＦ＋細胞のベースラインパーセンテージの差は、ＨＳＰＣ供給源間の固有の差に起因し得る。これらの差にかかわらず、ＧＣＲ−４７を除く全ての標的化部位が、７日目にＨｂＦ＋赤血球系細胞の＞１７％の増加に依然として関連していた（図７）。この増加は、ＧＣＲ−００６７について２１日目まで維持された（図７）。加えて、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２又はその両方における＞２５％のインデル形成が、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１、ＧＣＲ−００５３、ＧＣＲ−００６３及びＧＣＲ−００６７で観察された（表５）。ｄｇＲＮＡ形式（表４）と同様に、ｓｇＲＮＡ形式のＧＣＲ−０００８は、オンターゲットＨＢＧ１部位及びオフターゲットＨＢＧ２部位の両方において効率的な編集に関連していた（表５）。本研究におけるＧＣＲ−００４７によるより低いＨｂＦ＋細胞誘導が、低下した編集と関連していたかどうかは不確定であった。特に、７日目及び１４日目に、＞１７％のＨｂＦ＋細胞誘導は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子（例えば、それぞれ、ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７；ｈｇ３８及びｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４；ｈｇ３８（図４及び図５）に位置する）におけるプロモーター機能の公知の領域の外部の標的化配列、特に、ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１、ＧＣＲ−００５４及びＧＣＲ−００６７に関連していた（図７）。これらのうち、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００４８及びＧＣＲ−００６７は、２１日目のＨｂＦ＋細胞の＞１０％の増加及びＨＢＧ１、ＨＢＧ２又はその両方における＞２５％のインデルも有していた（表５及び図７）。
実施例２．３：成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＨＳＰＣにおけるγグロビンプロモーター領域編集 − ｓｇＲＮＡ形式を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した編集パターンのさらなる分析
方法：
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人健常なドナーの骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａカタログ番号２Ｍ−１０１Ｄ及びＨｅｍａｃａｒｅカタログ番号ＢＭ３４−Ｃ）。細胞を解凍し、次に６日間増殖させた。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、各１２μｇのｓｇＲＮＡ、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質及び１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）を、１０ｕｌの総容積中で組み合わせて、次に３７℃で５分間インキュベートした。なし／対照条件については、ｓｇＲＮＡではなく媒体を添加した。Ｐ３緩衝液＋補足物における細胞密度は、３．９×１０６／ｍＬであった。
インビトロ赤血球新生及びＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。１１日目に、細胞を、さらなる補足物なしでＥＤＭに移した。１４日目及び１８日目に、細胞をペレット化し、さらなる補足物なしで新鮮なＥＤＭに再懸濁した。１４日目及び２１日目に、細胞のアリコートを、ＨｂＦ発現の分析のために取った。細胞を７日目と同様に染色したが、表面マーカーを、細胞の凝集を防ぐために染色から除外し、抗ＨｂＦ抗体を１：２０希釈で使用した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済み及び未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。後述されるＮＧＳ分析は、Ｃａｓ９単独でエレクトロポレートされた対照試料において有意な編集を示さなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
反転及び大規模欠失の検出のための非定量的ＰＣＲ。以下のプライマー組を用いて、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２の領域におけるｇＤＮＡを増幅した。Ｐ１：フォワードプライマー５’−ＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＴ−３’（配列番号２５７）、リバースプライマー５’−ＴＴＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２５８）、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の欠失について約２．８ｋｂの産物が予想され、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の反転について約７．７ｋｂの産物が予想され、大規模欠失又は反転なしでは約７．７ｋｂの産物が予想された（個別に、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２標的／オフターゲット部位における未編集又はより小さいインデル）。Ｐ２：フォワードプライマー５’−ＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号２５９）、リバースプライマー５’−ＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＣＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号２６０）、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の欠失について産物は予想されず、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の反転について産物は予想されず、大規模欠失又は反転なしでは約３．８ｋｂの産物が予想された（個別に、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２標的／オフターゲット部位における未編集又はより小さいインデル）。Ｐ３：フォワードプライマー５’−ＧＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＧＡ−３’（配列番号２６１）、リバースプライマー５’−ＴＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＴ−３’（配列番号２６２）、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の欠失について産物は予想されず、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の間の反転について約１．７５ｋｂの産物が予想され、大規模欠失又は反転なしでは、産物は予想されなかった（個別に、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２標的／オフターゲット部位における未編集又はより小さいインデル）。ＰＣＲ産物を、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、８及び１０ｋｂバンドを含むリファレンスラダーと共に、アガロースゲルにおいて可視化した（Ｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｎ３２３２Ｌ）。選択された産物を、指示されるとおりに単離し、実施例２．１に記載されるとおりにＮＧＳに供した。
大規模欠失の定量化。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおける標的化部位間の大規模欠失を、製造業者の推奨に従いコピー数決定のための非競合アッセイ形式でデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量化した。簡潔に言えば、ｇＤＮＡを、プローブ用ｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ｄＵＴＰなし）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３０２４）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ制限酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１０４Ｓ）及び各プライマープローブミックスと組み合わせて、プローブ用ドロップレット生成オイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３００５）及びＱＸ２００ドロップレットジェネレータ（ＢｉｏＲａｄ）により生成されたドロップレットと共にＤＧ８カートリッジに移した。ドロップレットを、９６−Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）においてＰＣＲに供した後、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（ＢｉｏＲａｄ）により検出した。ｕｌ当たりのコピーを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた分析によって決定した。カスタムプライマープローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＰＺＷ７６Ｒ、ＰＮ４３３１３４８、フォワードプライマー：ＡＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＧＣ（配列番号２６３）、リバースプライマー：ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧ（配列番号２６４）、ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：ＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧ（配列番号２６５））を用いて、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２遺伝子間領域内のｇＤＮＡを増幅した。ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ、ヒト、ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４４０３３２６）を、参照アンプリコンとして使用した。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーは、製造業者の報告された線形範囲内であった。欠失パーセントを、１００％×（１−ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーの比率）として報告した。未編集の対照試料は、２．４％の欠失パーセントを計算し、これは、アッセイにおけるバックグラウンドを反映し得る。
結果：
Ｆ細胞の産生につながるＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域内の特異的配列の標的化した破壊が、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２標的又はオフターゲット部位における両方のインデル並びに介在領域の欠失及び反転に関連していることを本発明者らは本明細書において示した。アンプリコンのＮＧＳ分析により、この観察が確認される。
Figure 2020505934
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２人の独立したドナーからの成人骨髄由来のＨＳＰＣに、組換え化膿レンサ球菌（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２３６）及びｓｇＲＮＡ形式の指示されるｇＲＮＡから形成されたＲＮＰ複合体をエレクトロポレートした。増加したｓｇＲＮＡは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子（例えば、それぞれ、ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７；ｈｇ３８及びｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４；ｈｇ３８（図４及び図５）に位置する）におけるプロモーター機能の公知の領域の外部に標的化配列を有していた。得られたゲノム編集済み及び未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビン及び赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。これらのｇＲＮＡ ＲＮＰをＨＳＰＣに送達すると、エレクトロポレーション後７、１４及び２１日目にモックエレクトロポレート細胞と比較して、ＨｂＦを含む子孫赤血球系細胞のパーセンテージが増加した（表６及び７）。含まれる標的化部位は全て、全ての時点−７、１４及び２１日目に両方のドナーに由来するＨｂＦ＋赤血球系細胞の＞１７％の増加に関連していた（図８）。エレクトロポレーション後３日目に単離されたＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物も次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。標的化ドメインＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１及びＧＣＲ−００６７を有するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした両方のドナーに由来する細胞培養物では、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域の両方における高いゲノム編集パーセンテージ（５３％〜９２％のインデル）が観察されたが（表６及び７）、ｓｇＲＮＡを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９のみ）では観察されなかった。標的化ドメインＧＣＲ−００１０は、両方のドナーに由来する細胞培養物のＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域の両方における低下したもののかなりの編集パーセンテージ（１７％〜２８％のインデル）に関連していた一方；ＧＣＲ−０００１は、２人のドナーにおいてＨＢＧ２（１％及び１％）と比較してＨＢＧ１における効率的且つ選択的な編集（５９％及び６２％）に関連していた（表６及び７）。
ＧＣＲ−００４８及びＧＣＲ−００６７標的化ドメインは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２の両方に存在し、他の標的化ドメインは、他のプロモーターにおける潜在的ミスマッチオフターゲット部位を伴いＨＢＧ１（ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８及びＧＣＲ−００１０）又はＨＢＧ２（ＧＣＲ−００５１）のいずれかに存在する。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的／オフターゲット部位の両方における同時の切断は、介在する４．９ｋｂのゲノム配列の欠失及び／又は反転をもたらす可能性を有し；本明細書において、「４．９ｋｂ」又は「ＨＢＧ１−ＨＢＧ２」又は「大規模」反転若しくは欠失と呼ばれることもある。したがって、一連の３つの異なるＰＣＲ反応を用いて、この領域の欠失又は反転を有するゲノムの存在を検出した。Ｐ２反応は、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失又は反転を有さないゲノム配列が増幅されて３．８ｋｂの産物が得られる一方、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失又は反転を有する配列が増幅されないように設計された。ほぼこのサイズのバンドが、全ての試料において検出され（図９）、各個別のＨＢＧ１又はＨＢＧ２標的化部位におけるより小さいインデルの検出と一致していた（表６及び７）。Ｐ３反応は、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２反転ゲノム配列が増幅されて１．７ｋｂの産物が得られる一方、この反転を有さない又はＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失あり／なしの配列が増幅されないように設計された。ほぼこのサイズのバンドが、指示される標的化ドメインを有するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした培養物において検出されたが、未編集の対照培養物において検出できなかった（図９）。最後に、Ｐ１反応は、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失を有さない配列並びに反転したＨＢＧ１−ＨＢＧ２領域を有する配列の増幅が両方とも７．７ｋｂの産物を産生する一方、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失を含む配列の増幅が２．８ｋｂの産物をもたらすように、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的化領域の両方にわたるように設計された。実際に、未編集の対照試料は、約８ｋｂにおける顕著な上側バンド及び約２．８ｋｂにおけるかすかな、潜在的に非特異的なバンドを有していた。対照的に、指示される標的化ドメインを有するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした培養物は、約２．８ｋｂにおける顕著なバンド及び約８ｋｂにおけるかすかなバンドを有していた（図９）。星印で示された各バンドからのＤＮＡを単離し、次世代シーケンシングに供し、予測される配列（記載されるとおり、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２反転又は欠失を有するか又は有さない）の増幅としてのその同一性を確認した。
ＨＢＧ１及びＨＢＧ２編集部位にわたる領域のさらなる配列特徴付けのために、第４の長距離ＰＣＲ条件（Ｐ４）は、ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１及びＧＣＲ−００６７のためのＨＢＧ１及びＨＢＧ２編集部位を包含する６１９２ｂｐ領域を増幅するように開発された。ゲノム編集された試料の増幅は、２つのアンプリコン部位（１．２ｋｂ及び６．２ｋｂ）をもたらす一方、未編集の試料は１つのアンプリコン部位（６．２ｋｂ）のみを生成する。６．２ｋｂ及び１．２ｋｂアンプリコンの配列分析は、１．２ｋｂのアンプリコンが、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２切断部位間の４．９ｋｂの欠失の結果である一方、６．２ｋｂのアンプリコンは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２編集部位における野生型及び様々なインデルアレルからなることを示す。シーケンシング分析は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２切断部位（ここで、配列が、２つの部位間で切り出された）間の低レベルの反転が、反対方向にゲノムに再度組み込まれたことも示す。この分析は、定量的でないが、反転は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２切断部位にわたる小さいパーセンテージ（＜１％）のシーケンシングリードにおいて検出されるに過ぎないため、非常に低頻度であるようである。
これらの結果を総合すると、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２標的／オフターゲット部位のいずれかにおけるインデルに加えて、指示される標的化ドメインを有するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレートした培養物は、介在するＨＢＧ１−ＨＢＧ２領域の欠失又は反転を有する編集されたアレルを含むことを示唆する。したがって、編集後の所与のアレルは、ＨＢＧ１−ＨＢＧ１反転、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失、ＨＢＧ１部位に局在化されたインデル、ＨＢＧ２部位に局在化されたインデル、又は介在領域の修飾を含まないＨＢＧ２部位に局在化されたインデルと共にＨＢＧ１部位に局在化されたインデルであり得る。ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１及びＧＣＲ−００６７で編集することによって生成された最も一般的なオンターゲット編集修復パターン変異体が、表７−２に示される。示される変異体は、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子座において生成された局在化インデル並びにＨＢＧ１及びＨＢＧ２切断部位間の配列の切り出しによって引き起こされる大規模４．９ｋｂ欠失である。局在化インデルは、実施例２．１に記載されるとおりＰＣＲ及びＮＧＳ分析を用いて特徴付けられた。定量的ｄｄＰＣＲアッセイが、介在するＨＢＧ１−ＨＢＧ２領域の大規模４．９ｋｂ欠失を有するアレルの頻度を決定するように開発された（図１０）。簡潔に言えば、ＨＢＧ１プロモーター（図１０に示される５．２ｋｂのＦｗｄ及びＲｅｖプライマーの間）の上流の領域のコピー数が、本方法に記載されるとおりＲＰＰＨ１遺伝子座におけるコピー数に関して定義された。局在化されたより小さいインデルのアレル頻度は、総インデル頻度に対するものでないが、これは、ＮＧＳのＨＢＧ１又はＨＢＧ２部位の増幅が、４．９ｋｂの反転又は欠失を含むアレルにおいて起こらないためである。例えば、ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００１について、４．９ｋｂの欠失の頻度は、３５．２％であり、残りの６４．８％（反転を無視して、１００％〜３５．２％）は、野生型とより小さい局在化インデルとの混合物である。したがって、９％の単一の塩基対Ａ塩基欠失は、総インデル頻度の５．８％、すなわち６４．８％のうちの９％であり得る。表７−２に示されるアレル頻度は、実験間でわずかに変化し、絶対値と見なされるべきではない。
Figure 2020505934
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ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター標的化部位間の大規模４．９ｋｂ欠失の高い頻度を含む、γグロビン遺伝子座における高い全編集頻度が、指示される標的化ドメインのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰを細胞にエレクトロポレートした後、観察された。示されるオンターゲット編集パターンは、記載されるとおり、赤血球系分化後に増加したＦ細胞を生成した細胞において同定された。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子のインデルパターンは、ＨＢＧ１遺伝子座において検出される最も高頻度の１、２、３、４、５又は６つのインデルを含む。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子のインデルパターンは、ＨＢＧ２遺伝子座において検出される最も高頻度の１、２、３、４、５又は６つのインデルを含む。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子のインデルパターンは、例えば、表７−２に記載されるとおりの（ただし約４．９ｋｂの欠失を二重計算しない）、ＨＢＧ１遺伝子座において検出される最も高頻度の１、２、３、４、５又は６つのインデル及びＨＢＧ２遺伝子座において検出される最も高頻度の１、２、３、４、５又は６つのインデルを含む。
実施例２．４：γグロビンプロモーター領域編集後のＨＳＰＣの単離されたサブ集団における例示的編集パターン
方法：
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造業者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナー由来のＧ−ＣＳＦ動員末梢血（Ｈｅｍａｃａｒｅカタログ番号Ｍ００１Ｆ−ＧＣＳＦ−３）からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーション前に２日間増殖させた。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、各１２μｇのｓｇＲＮＡ、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質及び１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）を、１０ｕｌの総容積中で組み合わせて、次に３７℃で５分間インキュベートした。Ｐ３緩衝液＋補足物における細胞密度は、１．３×１０８／ｍＬであった。７回のレプリケートエレクトロポレーションを、ＧＣＲ−００６７を用いて行い、細胞をエレクトロポレーション後に組み合わせた。なし／対照条件については、細胞をエレクトロポレーション又はＣａｓ９の添加なしで増殖培地中にＰ３緩衝液から直接移した。ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーションの後、細胞を、フローサイトメトリー細胞ソーティングの前にさらに３日間増殖させた。
造血幹細胞・前駆細胞サブ集団における編集効率の分析のためのフローサイトメトリー細胞ソーティング。エレクトロポレーションの３日後に編集された細胞培養物を収集し、２％のＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ−１１）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４６−０３４−ＣＬ）を補足したＨＢＳＳからなるＦＡＣＳ染色緩衝液（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＨ３０５８８．０１）中の抗ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４８０５７）、抗ＣＤ３８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６０６７７）、抗ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５９８６９）、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６３９６３）、抗ＣＤ４９ｆ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６２５９８）と共にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄し、細胞生存率を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）の添加によって決定した。多色ＦＡＣＳ分析を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行った。陰性及び陽性細胞集団の判別を、対照染色細胞培養物を用いてゲートセットによって決定し、ここで、各抗体を、アイソタイプ及びフルオロクロムコンジュゲートマッチ非特異的対照抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５０８５４、５５４６８０、５６３４３７、５５７８７２、及び５６２６０２）で個別に置き換えた。ソートされた細胞の純度を、ソート後の純度チェックによって確認した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後に、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９５０４）を使用して未編集ＨＳＰＣ及び編集済みＨＳＰＣのソートされたサブ集団からゲノムＤＮＡを調製した。後述されるＮＧＳ分析は、対照未編集試料において有意な編集を示さなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
大規模欠失の定量化。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおける標的化部位間の大規模欠失を、製造業者の推奨に従いコピー数決定のための非競合アッセイ形式でデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量化した。簡潔に言えば、ｇＤＮＡを、プローブ用ｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ｄＵＴＰなし）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３０２４）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ制限酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１０４Ｓ）及び各プライマープローブミックスと組み合わせて、プローブ用ドロップレット生成オイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３００５）及びＱＸ２００ドロップレットジェネレータ（ＢｉｏＲａｄ）により生成されたドロップレットと共にＤＧ８カートリッジに移した。ドロップレットを、９６−Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）においてＰＣＲに供した後、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（ＢｉｏＲａｄ）により検出した。ｕｌ当たりのコピーを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた分析によって決定した。カスタムプライマープローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＰＺＷ７６Ｒ、ＰＮ４３３１３４８、フォワードプライマー：ＡＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＧＣ（配列番号２７０）、リバースプライマー：ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧ（配列番号２７１）、ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：ＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧ（配列番号２７２））を用いて、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２遺伝子間領域内のｇＤＮＡを増幅した。ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ、ヒト、ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４４０３３２６）を、参照アンプリコンとして使用した。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーは、製造業者の報告された線形範囲内であった。欠失パーセントを、１００％×（１−ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーの比率）として報告した。未編集の対照試料は、１３％までの欠失パーセントを計算し、これは、アッセイにおけるバックグラウンドを反映し得る。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団は、生着する長期造血幹細胞を含む、共有特性を有する細胞にさらに富むさらなるマーカーと共に、生着、自己複製及び細胞運命の様々な可能性を有する細胞を含むものと考えられる（Ｎｏｔｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１ Ｊｕｌ ８；３３３（６０３９）：２１８−２１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０１２１９；Ｈｕｎｔｓｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｓｅｐ ２４；１２６（１３）：１６３１−３．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１５−０７−６６０６７０；それぞれ参照により全体として本明細書に援用される）。理論によって拘束されるものではないが、かかるサブ集団は、移植後の様々な時点で造血系を再構成し得るため、遺伝子編集された細胞の移植における特定の治療効果を有し得る。したがって、細胞をフローサイトメトリーに供し、ＨＳＰＣサブ集団における編集効率を特徴付けた。示される手法を用いて、５つの細胞集団、まずＣＤ３４＋細胞、続いてＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋及びＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−細胞についての４方向ソートを単離した（図１１）。これらのソートされる集団の各々を、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的部位局在化領域を個別にシーケンシングすることにより、且つ介在するＨＢＧ１−ＨＢＧ２領域の欠失の検出により編集について分析した。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失（すなわち切り出し）頻度は、サブ集団にわたって一貫して高く、６９〜８１パーセントの範囲であった（図１２）。個別に、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおいて局在化された増幅、及びＮＧＳを用いて、各部位（小さいインデル）における編集％を決定した。両方のプロモーターに標的化することによって引き起こされる反転又は欠失を有するアレルは、アッセイにおいて増幅されなかった。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失又は反転を有さないアレルの中で、編集は、サブ集団にわたって同様に高く、ＨＢＧ１について５３〜７３パーセントの範囲及びＨＢＧ２について７５〜９１パーセントの範囲であった。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失ゲノムのパーセンテージを、ＨＢＧ２における編集を有する非ＨＢＧ１−ＨＢＧ２欠失ゲノムのパーセンテージと組み合わせることにより、最小全編集を推定した（最小全編集＝％欠失＋％非欠失［反転を無視して１００−％欠失］×ＨＢＧ２における編集％）。ＨＢＧ１における局在化された小さいインデルは含まれなかったが、これは、ＨＢＧ１における編集％のどういう割合がＨＢＧ１のみに局在化されたインデルを有するアレルであったか、及びどういう割合がＨＢＧ１及びＨＢＧ２の両方において共に存在するインデルを有するアレルであったかを、本発明者らが決定することができなかったためである。最小全編集は、サブ集団にわたって９２〜９７パーセントの範囲であると推定された。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２標的部位に局在化されたインデルの編集パターンは、サブ集団にわたる最も高頻度に観察される編集パターンでサブ集団にわたっても同様であった。全てのサブ集団及び各部位、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２について、上位３つのインデルパターンは、６ｂｐの欠失、５ｂｐの欠失及び１ｂｐの欠失（図１３Ａ（ＨＢＧ１遺伝子座）；図１３Ｂ（ＨＢＧ２遺伝子座））を含んでいた。要約すると、定義されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋長期造血幹細胞を含む、総ＨＳＰＣ及び副分画（ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎ）間の一貫した編集頻度及びパターンは、ＨＳＰＣ移植のための本明細書に記載される遺伝子編集法の有用性を裏付ける。
実施例２．５：γグロビンプロモーター領域編集後のＨＳＰＣのコロニー形成能力
方法：
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人健常ドナーの骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａカタログ番号２Ｍ−１０１Ｄ）。細胞を解凍し、次に、ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーション前に２日間増殖させた。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、各１２μｇのｓｇＲＮＡ、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質及び１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）を、１０ｕｌの総容積中で組み合わせて、次に３７℃で５分間インキュベートした。Ｐ３緩衝液＋補足物における細胞密度は、６．６４×１０６／ｍＬであった。２回のエレクトロポレーションレプリケートを、２人の独立したドナーの各々からの細胞を用いて行った。なし／対照条件については、ｓｇＲＮＡではなく媒体を添加した。ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーション後、細胞を増殖培地に戻した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後に、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９５０４）を使用して未編集ＨＳＰＣ及び済みＨＳＰＣのソートされたサブ集団からゲノムＤＮＡを調製した。後述されるＮＧＳ分析は、Ｃａｓ９単独でエレクトロポレートされた対照試料において有意な編集を示さなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
大規模欠失の定量化。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおける標的化部位間の大規模欠失を、製造業者の推奨に従いコピー数決定のための非競合アッセイ形式でデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量化した。簡潔に言えば、ｇＤＮＡを、プローブ用ｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ｄＵＴＰなし）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３０２４）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ制限酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１０４Ｓ）及び各プライマープローブミックスと組み合わせて、プローブ用ドロップレット生成オイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３００５）及びＱＸ２００ドロップレットジェネレータ（ＢｉｏＲａｄ）により生成されたドロップレットと共にＤＧ８カートリッジに移した。ドロップレットを、９６−Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）においてＰＣＲに供した後、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（ＢｉｏＲａｄ）により検出した。ｕｌ当たりのコピーを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた分析によって決定した。カスタムプライマープローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＰＺＷ７６Ｒ、ＰＮ４３３１３４８、フォワードプライマー：ＡＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＧＣ（配列番号２７３）、リバースプライマー：ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧ（配列番号２７４）、ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：ＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧ（配列番号２７５））を用いて、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２遺伝子間領域内のｇＤＮＡを増幅した。ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ、ヒト、ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４４０３３２６）を、参照アンプリコンとして使用した。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーは、製造業者の報告された線形範囲内であった。欠失パーセントを、１００％×（１−ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーの比率）として報告した。未編集の対照試料は、９％までの欠失パーセントを計算し、これは、アッセイにおけるバックグラウンドを反映し得る。
コロニー形成単位細胞アッセイ。ＲＮＰ送達の２日後、製造業者の推奨に従いＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４０３３４）を使用してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてフローサイトメトリーによって生存細胞を計数した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用して生存不能細胞を判別した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して、分析を行った。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイについて、細胞及び１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）メチルセルロース培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加し、１ｍＬを、ＳｍａｒｔＤｉｓｈプレート（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてトリプリケートでプレーティングした。培養ディッシュを加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。プレーティング後１４日目に、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、培養物をイメージングした。コロニーマーカーソフトウェア（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、コロニーを手動でソートした。ウェル当たりのコロニー数（３つのウェルの平均）を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ １ｍｌ当たりのプレーティングされる細胞数（２２６〜３１８の範囲であった）で除して、１０００を乗じることにより、１０００細胞当たりのＣＦＵ頻度を求めた。
結果：
ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域内の特異的配列を標的化して破壊した後、コロニー形成アッセイにおけるＨＳＰＣ機能が、Ｆ細胞の産生に関連していることを本発明者らは本明細書において示した。ゲノム編集済み及び未編集ＨＳＰＣを、コロニー形成単位アッセイを使用して、前駆細胞組成及び分化能について評価した。コロニーをカウントし、赤血球系前駆細胞（ＣＦＵ−赤血球系［ＣＦＵ−Ｅ］及びバースト形成単位−赤血球系［ＢＦＵ−Ｅ］）、顆粒球及び／又はマクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−顆粒球、マクロファージ［ＣＦＵ−ＧＭ］；ＣＦＵ−顆粒球［ＣＦＵ−Ｇ］；及びＣＦＵ−マクロファージ［ＣＦＵ−Ｍ］）、又は多能性前駆細胞（ＣＦＵ−顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球［ＣＦＵ−ＧＥＭＭ］）に由来するものとして分類した。
Figure 2020505934
Figure 2020505934
指示されるｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロプレートした両方のドナーは、効率的な編集、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター標的／オフターゲット部位に局在化された両方のインデル、介在領域の欠失を有していた（表８及び９）。編集された培養物は、全コロニー形成能の低下に関連しており（表８及び９）、これは、おそらく、編集を受けた細胞の低下した適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）を示す。この総コロニー数の減少にかかわらず、赤血球系、顆粒球／マクロファージ、及び多能性コロニーが全て、少なくとも１つのドナーにおいて観察された（表８及び９）。さらに、未編集及び編集済み試料間のコロニータイプの割合の最小の差があり（図１４）、これは、これらの標的部位において編集された細胞培養物が、スキューした（ｓｋｅｗｅｄ）分化能を有さなかったことを示す。
実施例２．６：γグロビンプロモーター領域編集後のインビトロでのＨＳＰＣの細胞増殖
方法：
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人健常ドナーの骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａカタログ番号２Ｍ−１０１Ｄ及びＨｅｍａｃａｒｅカタログ番号ＢＭ３４−Ｃ）。細胞を解凍し、次に、ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーション前に２日間増殖させた。
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、及びＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、各１２μｇのｓｇＲＮＡ、１２μｇのＣＡＳ９タンパク質及び１μＬの１０×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロール及び新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）を、１０ｕｌの総容積中で組み合わせて、次に３７℃で５分間インキュベートした。Ｐ３緩衝液＋補足物における細胞密度は、１×１０７〜２．５×１０７／ｍＬであった。１回のエレクトロポレーションレプリケートを、３人の独立したドナーの各々からの細胞を用いて行った。なし／対照条件については、ｓｇＲＮＡではなく媒体を添加した。ＲＮＰ複合体によるエレクトロポレーション後、細胞を増殖培地に戻した。
ゲノムＤＮＡ調製及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＱＥ０９０５０）又はＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９５０４）を使用して未編集及び編集済みＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。後述されるＮＧＳ分析は、Ｃａｓ９単独でエレクトロポレートされた対照試料において有意な編集を示さなかった。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
細胞増殖及びフェノタイピング。ＲＮＰ送達の２日後、製造業者の推奨に従いＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４０３３４）を使用してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてフローサイトメトリーによって生存細胞を計数した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用して生存不能細胞を判別し、及びＣＤ３４＋及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞含有量を、２％のＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＦＢ−１１）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４６−０３４−ＣＬ）を捕捉したＨＢＳＳからなるＦＡＣＳ染色緩衝液（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号ＳＨ３０５８８．０１）中の抗ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４８０５７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４０６６６又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号２５−０３４９−４２５）及び抗ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５９８６９）の包含によって決定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して、分析を行った。次に、細胞を、２．０×１０４個又は１．０×１０５個の生存細胞／ｍｌのいずれかで増殖培地に播種し、７日間培養した。１．０×１０５／ｍｌで播種される培養では、新鮮な培地を、３又は４倍希釈のために培養期間中に添加した。７日間の培養の後、細胞を、上記のようにもう１回計数した。７日間の培養の後、細胞を、以下の抗体パネルを用いた染色の後、表面マーカー発現についてさらに分析した。パネル１：ＣＤ３８（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０９２６、クローンＨＢ７）、ＣＤ１３３エピトープ１（ＰＥコンジュゲート、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０−０８０−８０１、クローンＡＣ１３３）、ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ９０（ＡＰＣコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃ ５５９８６９、クローン５Ｅ１０）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐｅ−Ｃｙ７コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃２５−０４５８−４２、クローンＨＩ１００）に特異的な抗体。パネル２：ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ３３（ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３３３９４６、クローンＰ６７．６）、ＣＤ１４（ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０２７０、クローンＭφＰ９）、ＣＤ１５（ＰＥコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０１９０５、クローンＨＩ９８）。パネル３：ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ４１ａ（ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６１４２２、クローンＨＩＰ８）、ＣＤ７１（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５５５３６、クローンＭ−Ａ７１２）、ＣＤ１９（ＰＥコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０７２０、クローンＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ５６（ＡＰＣコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１８３１０、クローンＨＣＤ５６）。並行して、対応するアイソタイプ対照抗体パネルを使用して培養物を染色した。生存不能細胞はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色によって判別した。染色した試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞表面タンパク質発現に関して分析した。結果はＦｌｏｗｊｏを使用して分析し、データはＤＡＰＩ陰性生存細胞集団の％として提示した。
結果：
Ｆ細胞の産生に関連した、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域内の特異的配列の標的化した破壊の後、ＨＳＰＣがインビトロで典型的な細胞組成で増殖し得ることを本発明者らは本明細書において示した。ゲノム編集済み及び未編集ＨＳＰＣを、ＨＳＰＣの増殖を促進する培養条件における増殖能及び細胞組成について評価した。ＧＣＲ−００６７を含むＲＮＰをエレクトロポレートしたレプリケートの独立したドナーは、効率的な編集を有していた（表９−２）。
Figure 2020505934
編集された培養物は、全増殖能の低下に関連しており、これは、おそらく、編集を受けた細胞の少し低下した適応度を示すが、これは、３人の独立した細胞ドナーにわたって有意に達しなかった（図１５）。同様の低下が、全ＣＤ３４＋集団と同様に造血幹細胞に富むＣＤ３４＋ＣＤ９０＋集団内で観察され、これは、この集団が異なる結果を達成しないことを示す（図１５）。これらの培養条件下で、ＨＳＰＣ及び分化した子孫の両方が、存在することが予想され、したがって、細胞組成を、細胞表面マーカーのより包括的なパネルの発現についてさらに分析した。これらの細胞集団の判別は、図１６において例示される。細胞組成は、３人の独立した細胞ドナーにわたってゲノム編集済み及び未編集培養物間で同様であり、対応のないｔ検定によれば、所与の集団に有意差はなかった（図１７）。ＣＤ３３＋集団についての大きいエラーバーは、ゲノム編集済み及び未編集培養物の両方においてごくわずかなＣＤ３３＋細胞を有する単一のドナーによるものである（図１７）。
実施例３：Ｃａｓ９変異体の評価
ＣＤ３４＋造血幹細胞における評価
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のノックアウト効率を計測することにより、１４個の精製化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳＰｙＣａｓ９）タンパク質を評価した。これらのタンパク質は３群に分けた：第１群は、選択性が向上したＳＰｙＣａｓ９変異体からなった（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８４（ｅ１．０、ｅ１．１及びＫ８５５Ａ）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０（ＨＦ））。第２群は、数及び／又は位置が異なるＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）及び切断可能なＴＥＶ部位を伴う又は伴わない６×ヒスチジン（Ｈｉｓ６）（配列番号２４７）又は８×ヒスチジン（Ｈｉｓ８）タグ（配列番号２４８）を含む野生型ＳＰｙＣａｓ９、及び２つのシステイン置換（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５７４Ｅ）（構造研究用にＣａｓ９を安定化させることが報告されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ １５６：９３５））を有するＳＰｙＣａｓ９タンパク質からなった。第３群は、異なるプロセスによって作製した同じ組換えＳＰｙＣａｓ９からなった（図６）。Ｂ２ＭノックアウトはＦＡＣＳ及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定した。
方法
材料
１．Ｎｅｏｎエレクトロポレーション機器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ５０００）
２．Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ１０２５）
３．ｃｒＲＮＡ（ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵの標的化ドメイン配列（配列番号２７６）、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列に相補的、配列番号２０１と融合）
４．ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２２４）
５．Ｃａｓ９保存緩衝液：２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
６．骨髄由来ＣＤ３４＋ ＨＳＣ（Ｌｏｎｚａ、２Ｍ−１０１Ｃ）
７．細胞培養培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳｔｅｍＳｐａｍ ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＳｐａｍ ＣＣ−１００含有）
８．ＦＡＣＳ洗浄緩衝液：ＰＢＳ中２％ＦＣＳ
９．ＦＡＣＳブロック緩衝液：ＰＢＳ１ｍＬ当たり、０．５ｕｇマウスＩｇＧ、１５０ｕｇ Ｆｃブロック、２０ｕＬ ＦＣＳを添加
１０．Ｃｈｅｌｅｘ懸濁液：Ｈ２Ｏ中１０％Ｃｈｅｌｅｘ １００（ｂｉｏＲａｄ、カタログ番号１４２−１２５３）
１１．抗Ｂ２Ｍ抗体：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１６３０４
プロセス
Ｌｏｎｚａの推奨に従い細胞を解凍して成長させ、２〜３日おきに培地を加える。５日目、細胞を２００×ｇで１５分間ペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞をＮＥＯＮキットのＴ−緩衝液に２×１０４／ｕＬで再懸濁し、氷上に置く。Ｃａｓ９タンパク質をＣａｓ９保存緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをＨ２Ｏで１００ｕＭに再構成する。各０．８ｕＬのＣＡＳ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを０．６ｕＬのＣａｓ９保存緩衝液と混合することによりリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作製し、室温で１０分間インキュベートする。７ｕＬのＨＳＣをＲＮＰ複合体と２分間混合し、１０ｕＬ全てをＮｅｏｎピペットティップに移し、１７００ｖ、２０ｍｓ及び１パルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後直ちに、３７℃、５％ＣＯ２で予めキャリブレーションした１ｍｌ培地が入った２４ウェルプレートのウェルに細胞を移す。エレクトロポレーション後７２時間でＦＡＣＳ及びＮＧＳ分析のため細胞を回収する。
ＦＡＣＳ：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０ｕＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに取り、細胞をペレット化する。２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）−ＰＢＳで１回洗浄する。細胞に５０ｕＬ ＦＡＣＳブロック緩衝液を加え、氷上で１０分間インキュベートし、１ｕＬ ＦＩＴＣ標識Ｂ２Ｍ抗体を加え、３０分間インキュベートする。１５０ｕＬ ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄し、続いてもう１回２００ｕＬ ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄する。細胞を２００ｕＬ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁してＦＡＣＳ分析を行った。
ＮＧＳ試料調製：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０ｕＬの細胞懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、１ｍＬ ＰＢＳを加え、細胞をペレット化する。１００ｕＬのＣｈｅｌｅｘ懸濁液を加え、９９℃で８分間インキュベートして１０秒間ボルテックスし、続いて９９℃で８分間インキュベートし、１０秒間ボルテックスする。１０，０００×ｇで３分間遠心することにより樹脂をペレットダウンさせて、上清ライセートをＰＣＲに使用する。４ｕＬライセートを取り、Ｔｉｔａｎｉｕｍキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ番号６３９２０８）を使用して、且つ製造者の指示に従い、ｂ２ｍプライマー（ｂ２ｍｇ６７Ｆ：ＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号２７７）、ｂ２ｍｇ６７Ｒ：ＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴ（配列番号２７８））でＰＣＲ反応を行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：９８℃で５分を１サイクル；９５℃で１５秒、６２℃で１５秒、及び７２℃で１分を３０サイクル；及び最後に７２℃で３分を１サイクル。このＰＣＲ産物をＮＧＳに使用した。
アンプリコンのＮＧＳライブラリ調製及びシーケンシングを、実施例２．１に記載されるとおりに行った。ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析を、実施例２．１に記載されるとおりに行った。
統計：ＦＡＣＳによるＢ２Ｍ ＫＯ細胞のパーセンテージ及びＮＧＳによるインデルのパーセンテージを用いてＣＡＳ９切断効率を評価する。この実験はＣａｓ９を固定効果として設計した。各実験は、入れ子型変量効果として、ドナー内に入れ子になっている。したがって、ＦＡＣＳ及びＮＧＳデータの分析には混合線形モデルを適用した。
結果
実験及びドナーのばらつきを正規化するため、本発明者らは、２つのＳＶ４０ ＮＬＳが野生型ＳＰｙＣａｓ９に隣接し、且つタンパク質のＣ末端のＨｉｓ６タグ（配列番号２４７）を含む元の設計であるｉＰｒｏｔ１０５０２６に対する各タンパク質の相対活性をグラフ化した（図６）。統計的分析は、参照Ｃａｓ９タンパク質ｉＰｒｏｔ１０５０２６と比較して、ｉＰｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５１８、ｉＰｒｏｔ１０６５２０及びｉＰｒｏｔ１０６５２１のＨＳＣにおけるＢ２Ｍのノックアウトに有意な差はないが、試験した他の変異体（ＰＩＤ４２６３０３、ｉＰｒｏｔ１０６５１９、ｉＰｒｏｔ１０６５２２、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、ｉＰｒｏｔ１０６６５８、ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、ｉＰｒｏｔ１０６７４７、ｉＰｒｏｔ１０６８８４）はＨＳＣにおけるＢ２Ｍのノックアウトに参照ｉＰｒｏｔ１０５０２６に対して大きい有意差があることを示している。本発明者らは、Ｈｉｓ６タグ（配列番号２４７）をＣ末端からＮ末端に動かしても（ｉＰｒｏｔ１０６５２０）、タンパク質の活性に影響が及ばないことを見出した（図６）。ＮＬＳがタンパク質のＣ末端に配置された場合に限り、活性を維持するのに１つのＮＬＳで十分であった（ｉＰｒｏｔ１０６５２１対ｉＰｒｏｔ１０６５２２、図６）。プロセス１から精製したタンパク質は、一貫してプロセス２及び３よりも高いノックアウト効率を有した（ｉＰｒｏｔ１０６３３１対ｉＰｒｏｔ１０６５４５及びＰＩＤ４２６３０３、図６）。一般に、既報告の向上した選択性を有するＳＰｙＣａｓ９変異体は、野生型ＳＰｙＣａｓ９ほど活性でなかった（ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６及びｉＰｒｏｔ１０６７４７、図６）。興味深いことに、ｉＰｒｏｔ１０６８８４は標的化部位を切断しなかった。これは、この変異体が哺乳類細胞における論理的な標的化部位の最大２０％を切断できなかったというＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌによる報告と一致する（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０）。最後に、２つのシステイン置換を含むＣａｓ９変異体（ｉＰｒｏｔ１０６５１８）は高レベルの酵素活性を維持した（図６）。
実施例４．キャピラリー電気泳動質量分析法による遺伝子編集の際のヘモグロビンサブユニット変化の定量化
ＨＳＣの遺伝子編集の際、フローサイトメトリーによって胎児ヘモグロビン産生を捕捉することに加えて、赤血球系細胞内の個々のヘモグロビンサブユニットの変化も、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）によって測定した。鎌状赤血球患者の末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞は、Ｃａｓ９タンパク質（２つのＮＬＳ及び１つのＨｉｓ Ｔａｇ、ｉＰｒｏｔ１０６３３１を有する）の存在下で及びガイドＲＮＡなしでモック編集するか、又はＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ ｓｇ００６７の両方の存在下で遺伝子編集し、前述されるとおり培養物中で赤血球系統に分化させた。赤血球系分化の１４日目に、各条件からの同じ数の細胞を、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を認識するＦＩＴＣコンジュゲート抗体で染色し、細胞をフローサイトメトリーに供し、遺伝子編集の際のＨｂＦ誘導を定量化した。フローサイトメトリーにより、ＨｂＦ＋細胞の３０〜５０％の上方制御が報告された（表１０）。並行して、条件当たり様々な量の赤血球細胞（６００万、１２００万、６６００万、及び９９００万個）を採取し、ＣＥ−ＭＳに供し、α−グロビン、正常β−グロビン（ＨｂＢ）、鎌状βグロビン（ＨｂＳ）、及び胎児γ−グロビン（ＨｂＦ）サブユニットを定量化し、データを、入力細胞の量で正規化した。ＣＥ−ＭＳは、６００個の細胞／ｕｌ程度の濃度で全てのグロビンサブユニットを検出することができた。結果は、編集された鎌状赤血球患者試料が、γ−グロビンの約４０％の増加及び鎌状βグロビンの同時の５０％の減少を有していたことを示した（図１８）。
Figure 2020505934
実施例５．遺伝子編集された造血幹細胞（ＨＳＣ）は、長期生着が可能であり、多系統再構成を支持する。
遺伝子編集されたＨＳＣの幹細胞機能を評価するために、編集されたヒトＨＳＣを、免疫不全マウスに移植して、長期造血再生を調べた。５０万個のヒト骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を、０日目に解凍し、モックＲＮＰ複合体（Ｃａｓ９単独及びｇＲＮＡなし）又はＣａｓ９及びＣＲ００１１２８の標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡ（本明細書においてｓｇ１１２８と呼ばれることがある）
Figure 2020505934
ＡＵＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＵＵＣＣ（配列番号１８０）の標的化ドメイン配列を含む）で形成されたＲＮＰ複合体を３日目にエレクトロポレートした。その後、細胞を、実施例２．１に記載される同じ濃度及び培地に維持し、培養の６日目に、各処理からの全ての細胞を、２ Ｇｒａｙ亜致死照射ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに移植した（図１９）。本発明者らは、移植後１６週間でレシピエントの骨髄における約３０〜４０％のヒト細胞生着を観察した。さらに、この生着レベルは、モック処理対照と同等であり、これは、遺伝子編集が、ＨＳＣの長期生着能を損なわないことを示唆する（図２０）。遺伝子編集された、移植されたＨＳＣは、移植後４、８、１２、１６週間の時点で正常な骨髄、Ｂリンパ系、及びＴリンパ系細胞再生を持続していた（図２１）。このデータは、遺伝子編集されたＨＳＣは、長期生着が可能であり、移植後１６週間までを含む正常な多系統再構成を支持することを実証している。
実施例６．遺伝子編集された、長期間生着したＨＳＣは、持続した胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）産生が可能であった。
別個の研究において、本発明者らは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系特異的エンハンサー領域からのｇＲＮＡ（ｓｇ−Ｇ１１２８）と比較して、γグロビンプロモーター領域からのｇＲＮＡ（表１１中のｓｇ−Ｇ０００８、ｓｇ−Ｇ００５１、ｓｇ−Ｇ００１０、ｓｇ−Ｇ００４８、ｓｇ−Ｇ００６７）で遺伝子編集されたＨＳＣの幹細胞機能を評価した。これらのｇＲＮＡで編集されたヒトＨＳＣを、免疫不全ＮＳＧマウスに移植して、造血再生を調べた（図２２）。
Figure 2020505934
実験手順
ＣＤ３４＋解凍及び培養
骨髄ＣＤ３４＋細胞を解凍し、培養した。各バイアルの１００万個の骨髄ＣＤ３４＋細胞を、液体窒素から取り出し、７０％のエタノールを噴霧し、３７℃の水浴中で小さい氷ペレットが残るまで急速に解凍した。バイアルに７０％のエタノールを噴霧し、拭き取った。５ｍｌのピペットを用いて、バイアルの内容物を、５０ｍｌのファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブに移した。冷結保存バイアルを１ｍｌの予め温めたＩＭＤＭ、１０％のＦＢＳで１回すすぎ、５０ｍｌのファルコンチューブに滴下して添加し；２５ｍｌの予め温めたＩＭＤＭ、１０％のＦＢＳを、穏やかに回転させて混合しながら、２分間にわたって細胞にゆっくりと添加した。細胞を、１０分間にわたって３００ｇで回転させた。２８００万個のＣＤ３４＋細胞を、０．２〜０．５×１０ｅ６個の細胞／ｍｌで、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ／ＩＬ６／Ｆｌｔ３Ｌ／ＴＰＯ＋５００ｎＭの化合物４＋１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で培養した。
ＲＮＰエレクトロポレーション
解凍の４８時間後、細胞に、１）Ｃａｓ９のみ；又は２）（上述されるとおりの）ｓｇ１１２８を含むＣａｓ９ ＲＮＰ複合体、又は表１１中のｓｇＲＮＡのうちの１つをエレクトロポレートした。簡潔に言えば、ＲＮＰを、Ｃａｓ９タンパク質対ｓｇＲＮＡの１：２モル比を用いて調製して、１０ｕＭのＣａｓ９及び２０ｕＭのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ混合物を得た。５ｕｌの１０ｕＭのＲＮＰを、２０ｕｌのＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中の１００万個のＣＤ３４＋細胞に添加した。２２ｕｌのエレクトロポレーション混合物を、９６ウェルエレクトロポレーションプレートの１つのウェルに移し、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ９６−ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ又はＬｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、プログラムＣＡ−１３７を用いてエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの直後に、８０ｕｌの培養培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ／ＩＬ６／Ｆｌｔ３Ｌ／ＴＰＯ＋５００ｎＭの化合物４＋１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を、エレクトロポレートされた試料に添加した。
エレクトロポレーションの２４時間後、マウス当たり５０万個の出発細胞同等物を移植した。３０，０００〜１００，０００個の細胞を、赤血球系分化のために使用して、編集後のＨｂＦ誘導を評価した。残りの細胞を、編集頻度のＮＧＳ分析のためにさらに２４時間にわたって培養物に入れておいた（エレクトロポレーション後、合計４８時間）。
移植
１０匹のＮＳＧマウス／条件に、移植の４〜２４時間前に、ＲａｄＳｏｕｒｃｅ Ｘ線照射器を用いて２００ Ｒａｄ、又はセシウム１３８照射器を用いて２ Ｇｒａｙを照射した。マウス当たり５０万個の出発細胞同等物を、尾静脈注射によって移植した。移植後、マウスを、４〜８週間にわたって抗生物質投与計画に供した。マウスを、機関の動物飼育手順及び承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに従って処理した。４、８、１２、１６及び２０週間の時点で、末梢血を、生着及び系統分析のために尾静脈を切ることによって採取した。８〜９週間及び２０週間の時点で、骨髄を、分析（前のプロトコル、例えば、実施例２．１に記載されるとおり、フローサイトメトリー、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ及びＮＧＳ）並びに前のプロトコルに記載されるとおり赤血球系分化のためのｈＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞のソーティングのために採取した。２０週間の時点で、ｈＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞ソート及び赤血球系分化を行った。
図２２は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系特異的エンハンサー領域からのｇＲＮＡ（ｓｇ−Ｇ１１２８；ｓｇ１１２８とも呼ばれる）と比較して、γグロビンプロモーター領域からのｓｇＲＮＡ（ｓｇ−Ｇ０００８、ｓｇ−Ｇ００５１、ｓｇ−Ｇ００１０、ｓｇ−Ｇ００４８、ｓｇ−Ｇ００６７）で編集されたＨＳＣの幹細胞機能を評価するための移植試験の概略図を示す。５０万個のヒトＣＤ３４＋細胞を、０日目に解凍し、モックＲＮＰ複合体（Ｃａｓ９単独及びｇＲＮＡなし）又はＣａｓ９（ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓ６（配列番号２４７として開示される「Ｈｉｓ６」））及び様々なｇＲＮＡで形成されたＲＮＰ複合体のいずれかを３日目にエレクトロポレートした。６日目に、各条件からの全ての細胞を採取し、２Ｇｙ亜致死照射ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに移植した（図２２）。マウスを、移植後４、８、１２、１６、及び２０週間の時点で出血させた。移植後８及び２０週間の時点で、動物からの骨髄細胞も採取して、骨髄におけるヒト細胞生着を調べた。
結果
編集ＨＳＣは、長期生着が可能であり、ＮＳＧマウスにおける多系統分化を支持する。
結果は、γグロビンプロモーター領域からのｓｇＲＮＡが、移植後８週間で、ｓｇ−Ｇ１１２８に匹敵する平均で２０〜４０％の骨髄生着を達成したことを示した。早い時点からの生着が、短命の造血前駆細胞に起因し得る一方、より長い時点（２０週間）での生着は、長期ＨＳＣによる再構成の証明である。試験されたｓｇＲＮＡは、移植後２０週間の時点で５〜２２％の骨髄生着を示した（図２３Ａ〜Ｆ及び２４Ａ及び２４Ｂ）。本発明者らが、約５００，０００個のみのモック又はゲノム編集されたＣＤ３４＋細胞を各マウスに注射して、かかるレベルの生着を達成したことに留意することが重要である。この生着レベルは、１００万個のゲノム編集されたＣＤ３４＋細胞を移植する他の試験と同様であり、これは、本発明の細胞の高度に効率的な生着を示す。さらに、本発明者らは、全ての遺伝子編集された群をモック編集された対照と比較した際に、移植後４、８、１２、１６、２０週間の時点での骨髄、Ｂリンパ系、及びＴリンパ系細胞の正常な回復を観察した（図２３Ａ〜Ｆ及び２５）。これらのデータは、任意の公知のＨＰＦＨに位置しないｇＲＮＡを有するγグロビンプロモーター領域を標的とすることにより、ゲノム編集手法が、長期のＨＳＣの生着能に影響を与えず、新たな宿主に移植した際にその多系統再構成機能を改変しないことを実証している。対照的に、本発明者らは、他の報告される手法と比較して５０％少ない細胞を注入することによって確実な生着を達成することができる。要約すると、これらのｓｇＲＮＡによって編集されたＨＳＣは、長期の造血を持続するために造血幹細胞ニッチにおける確実な多系統再構成と共に長期の生着が可能である。
高い編集効率が、移植前及び移植後に維持された。
本発明者らは、実験手順に記載されるとおり、ＮＧＳによって試験されたｓｇＲＮＡの編集効率を調べた。遺伝子編集の３日後、１００，０００個の遺伝子編集されたヒトＣＤ３４＋細胞を、モック編集されたＣＤ３４＋細胞と共に、ＮＧＳ分析に供した。残りの細胞を、前述されるとおりにＮＳＧレシピエントに移植した。移植後８週間及び２０週間の時点で、移植されたＮＳＧマウスからの骨髄細胞を採取し、１００，０００個のソートされたヒトＣＤ４５＋細胞を、ＮＧＳに供し、編集効率を測定した。結果は、ｓｇＲＮＡ ｓｇ−Ｇ１１２８、ｓｇ−Ｇ００４８、及びｓｇ−Ｇ００６７が、８０〜９０％の編集を達成した一方、ｓｇ−Ｇ００１０は、約４５％の編集を示したことを示す（図２６）。移植前の編集効率を、８又は２０週間の移植後と比較すると、結果は、造血幹細胞・前駆細胞集団における編集イベントが、移植期間全体を通して長期間維持されたことを示した。このデータは、移植された個体における編集された細胞の持続性を実証している。本発明者らはさらに、移植後２０週間の時点でｓｇ−Ｇ１１２８についてわずかに増加した編集効率を観察し、これは、編集された細胞が、骨髄微小環境によって選択されたか、又は移植時に生存上優位であることを示唆している。
別の独立した移植の反復では、ＮＧＳ分析は、試験されるｇＲＮＡで達成される編集の範囲を示し、ｓｇ−Ｇ１１２８は、エレクトロポレーションの２日後に９０％超の編集をもたらす（図８Ａ）。編集は、移植後９及び２０週間の時点で単離されたヒトＣＤ３４＋細胞でも検出された（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。
遺伝子編集、長期生着ＨＳＣは、胎児ヘモグロビンの増加した産生を持続した。
ＮＳＧマウスは、赤血球系成熟を可能にする適切なヒトサイトカインを欠いているため、赤血球系発生を支持しない。しかしながら、生着したヒトＨＳＣが、赤血球系分化を誘導するための（これらの実施例の他の箇所に記載されるとおりの）赤血球系分化培地に入れられたマウス骨髄から採取され得る。データは、遺伝子編集され、２０週間生着したＨＳＣは、モック編集され、移植されたＨＳＣと比較して、高いレベルのＨｂＦを産生することが可能であったことを示す（図２８）。
実施例７．オフターゲットインデルパターン分析
潜在的ｇＲＮＡオフターゲット遺伝子座のインシリコ同定
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１及びＧＣＲ−００６７のＨＧＢ１／ＨＢＧ２領域のサブセットについての潜在的オフターゲット遺伝子座を以下のとおり同定した。各ｇＲＮＡについて、ＢＦＡＳＴ配列アライナー（バージョン０．６．４ｆ、Ｈｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４（１１），ｅ７７６７，ＰＭＩＤ：１９９０７６４２）を使用して、最大５ヌクレオチドまでのミスマッチを許容する標準パラメータを用いて、２０ヌクレオチドｇＲＮＡ標的化ドメイン配列をヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。Ｃａｓ９カノニカル５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭ配列に隣接して５’側にある部位のみを含むように同定された遺伝子座をフィルタリングした（すなわち５’−オフターゲット遺伝子座−ＰＡＭ−３’）。ＢＥＤＴｏｏｌｓスクリプト（バージョン２．１１．２、Ｑｕｉｎｌａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０ ２６（６）：８４１−２，ＰＭＩＤ：２０１１０２７８）を用いて、５ヌクレオチドミスマッチを有する部位をＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対して、エクソンとしてアノテートされた遺伝子座のみを含むようにさらにフィルタリングした（Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４ ４２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７５６−６３，ＰＭＩＤ：２４２５９４３２）。ＨＧＢ１／ＨＢＧ２領域ｇＲＮＡについて同定された潜在的オフターゲット遺伝子座のカウントを、表１２に示す。
Figure 2020505934
ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるオフターゲット分析
ゲノムＤＮＡ抽出
製造業者の推奨に従いＱｕｉｃｋ−ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、３日目に、ＲＮＰ編集済み及び未編集骨髄由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを単離した。
潜在的オフターゲット部位の標的増幅用ＰＣＲプライマー設計
Ｐｒｉｍｅｒ３（バージョン２．３．６、Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１２ ４０（１５）：ｅ１１５，ＰＭＩＤ：２２７３０２９３）を使用して、アンプリコンの中心にｇＲＮＡ標的化ドメイン配列が位置する約１６０〜３００塩基対長のアンプリコンサイズ範囲を目標とするデフォルトパラメータを用いて、ＨＢＧ１／ＨＢＧ２領域ｇＲＮＡ（ＧＣＲ−０００１、ＧＣＲ−０００８、ＧＣＲ−００１０、ＧＣＲ−００４８、ＧＣＲ−００５１及びＧＣＲ−００６７）について同定された、０〜３ミスマッチを有する潜在的オフターゲット遺伝子座（及びオンターゲット遺伝子座）を標的とするＰＣＲアンプリコンを設計した。得られたＰＣＲプライマー対及びアンプリコン配列は、ヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対して配列をＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．１９、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）することによりユニークさを調べた。２つ以上のアンプリコン配列をもたらすプライマー対は破棄し、設計し直した。表３は、設計した成功するＰＣＲプライマー対のカウントを示す。
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリ調製、定量化及びシーケンシング
製造業者の推奨を用いてＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して、ＲＮＰ編集済み（ｇＲＮＡ当たり２レプリケート）及び未編集（ｇＲＮＡ当たり２レプリケート）のＨＳＰＣからのゲノムＤＮＡを定量化した。各試料について、二連続ＰＣＲ反応を用いて、個々のオフターゲット遺伝子座（及びオンターゲット遺伝子座）を標的とするＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを作成した。最初のＰＣＲでは、ユニバーサルなＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング適合配列をテール付加した標的特異的ＰＣＲプライマー（上記で設計した）を使用して標的遺伝子座を増幅した。２回目のＰＣＲでは、シーケンシング時の多重化を可能にするサンプルバーコードを含め、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング適合配列を最初のＰＣＲアンプリコンに加えた。ＰＣＲ １は１０μＬの最終容積で実施し、各反応には、約６．５ｎｇのｇＤＮＡ（約１０００細胞相当）、０．２５μＭの最終濃度のＰＣＲ １プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１×最終濃度のＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００−１４０）が含まれた。ＰＣＲ １左プライマーは、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２７９）で５’テールが付加され（すなわち５’−テール−標的特異的左プライマー−３’）、及び右プライマーは、配列５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２８０）で５’テールが付加された（すなわち５’−テール−標的特異的右プライマー−３’）。ＰＣＲ １は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：９８℃で１分を１サイクル；９８℃で１０秒、６３℃で２０秒、及び７２℃で３０秒を２５サイクル；７２℃で２分を１サイクル。次にヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ９９３２）を使用してＰＣＲ １を１００に対して１で希釈し、ＰＣＲ ２への入力として使用した。ＰＣＲ ２は１０μＬの最終容積で実施し、各反応には、２μＬの希釈したＰＣＲ １産物、０．５μＭの最終濃度のＰＣＲ ２プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１×最終濃度のＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００−１４０）が含まれた。使用したＰＣＲ ２左プライマー配列は５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号２８１）であり、使用したＰＣＲ ２右プライマー配列は５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ−３’（配列番号２８２）であった（式中、ＮＮＮＮＮＮＮＮは、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロセスの一部としてサンプル多重化に使用した８ヌクレオチドバーコード配列を意味する）。ＰＣＲ ２は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：７２℃で３分を１サイクル；９８℃で２分を１サイクル；９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、及び７２℃で２分を１５サイクル。ここで、実行可能となったＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリであるＰＣＲ ２アンプリコンを、製造業者の推奨に従いＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ６３８８２）を使用してクリーンアップした。次に、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３６７６６０）及びＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリ末端に特異的なプライマー（フォワードプライマー配列５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ−３’（配列番号２８３）及びリバースプライマー配列５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ−３’（配列番号２８４））を使用した標準的なｑＰＣＲ定量化方法を用いて、クリーンなＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを定量化した。次にＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを等モルでプールし、製造業者の推奨に従いＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ−１０２−３００３）を使用してＭｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＳＹ−４１０−１００３）で３００塩基ペアエンドリードによってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに供した。各レプリケートにおいて各遺伝子座につき最低１０００倍の配列カバレッジが生成された。編集済み及び未編集試料のＰＣＲ、クリーンアップ、プール及びシーケンシングは別個に実施して、試料間のクロスコンタミネーション又はそれから生成されるＰＣＲアンプリコンのいかなる可能性も回避した。
ＮＧＳシーケンシングデータＱＣ及び変異体分析
方法は、以下の変更を加えて、実施例２．１にあるとおりである。分析のステージ５では、合計インデル頻度が＞２％（約１０〜２０個超の細胞における編集）の部位を考慮し、ゲノム参照配列とのリードアラインメントの目視検査を可能にするＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶバージョン２．３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，９（１）：２４−６，ＰＭＩＤ：２１２２１０９５）を使用して、潜在的な活性編集部位をリードアラインメントレベルでさらに調べた。
大規模欠失の定量化。
ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーターにおける標的化部位間の大規模欠失を、製造業者の推奨に従いコピー数決定のための非競合アッセイ形式でデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量化した。簡潔に言えば、ｇＤＮＡを、プローブ用ｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ｄＵＴＰなし）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３０２４）、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ制限酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１０４Ｓ）及び各プライマープローブミックスと組み合わせて、プローブ用ドロップレット生成オイル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１８６３００５）及びＱＸ２００ドロップレットジェネレータ（ＢｉｏＲａｄ）により生成されたドロップレットと共にＤＧ８カートリッジに移した。ドロップレットを、９６−Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）においてＰＣＲに供した後、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（ＢｉｏＲａｄ）により検出した。ｕｌ当たりのコピーを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いた分析によって決定した。カスタムプライマープローブセット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＰＺＷ７６Ｒ、ＰＮ４３３１３４８、フォワードプライマー：ＡＣＧＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＧＣ（配列番号２８５）、リバースプライマー：ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧ（配列番号２８６）、ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：ＡＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧ（配列番号２８７））を用いて、ＨＢＧ１−ＨＢＧ２遺伝子間領域内のｇＤＮＡを増幅した。ＴａｑＭａｎ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ、ヒト、ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号４４０３３２６）を、参照アンプリコンとして使用した。ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーは、製造業者の報告された線形範囲内であった。欠失パーセントを、１００％×（１−ＨＢＧ１−ＨＢＧ２及びＲＮａｓｅ Ｐアンプリコンについてのｕｌ当たりのコピーの比率）として報告した。未編集の対照試料は、２％までの欠失パーセントを計算し、これは、アッセイにおけるバックグラウンドを反映し得る。
ＨＢＧ１／ＨＢＧ２領域インシリコオフターゲット分析結果
表１３は、特徴付けが成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計又はＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き評価される。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００１：ＨＢＧ１オンターゲット部位はロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約５８％であった一方、ｇＲＮＡ標的化ドメイン配列
Figure 2020505934
に対して２つのミスマッチ（ここで及び下記において、小文字で示される）を有する相同ＨＢＧ２標的部位は最小の局在化編集を示した。しかしながら、４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約３４％の頻度で起こっていることを示した。さらなる分析は、両方のレプリケートで約２６％の平均インデル頻度を有する１つの陽性オフターゲット部位を同定した。この部位は、ｇＲＮＡ標的化ドメイン配列
Figure 2020505934
に対して３つのミスマッチを有し、Ｙ染色体上の塩基対位置２１，４７０，４７５〜２１，４７０，４９７における遺伝子間に位置する。このオフターゲット部位における編集が、遺伝子発現又は細胞生存率に悪影響を及ぼしたかどうかは不明であり、さらなる分析が必要とされる。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−０００８：ＨＢＧ１オンターゲット部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約８８％であった。ｇＲＮＡ標的化ドメイン配列
Figure 2020505934
に対して１つのミスマッチを有する相同ＨＢＧ２標的部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約８５％であった。４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約５０％の頻度で起こっていることを示した。他の部位は編集を示さなかった。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−００１０：ＨＢＧ１オンターゲット部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約３２％であった。ｇＲＮＡ標的化ドメイン配列
Figure 2020505934
に対して１つのミスマッチを有する相同ＨＢＧ２標的部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約２７％であった。４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約３３％の頻度で起こっていることを示した。他の部位は編集を示さなかった。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−００４８：ＨＢＧ１及びＨＢＧ２オンターゲット部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は、両方の部位で約８６％であった。４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約４５％の頻度で起こっていることを示した。他の部位は編集を示さなかった。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−００５１：ＨＢＧ２オンターゲット部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約８８％であった。ｇＲＮＡ標的化ドメイン配列
Figure 2020505934
に対して１つのミスマッチを有する相同ＨＢＧ１標的部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度は約５９％であった。４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約４０％の頻度で起こっていることを示した。他の部位は編集を示さなかった。
ｇＲＮＡ ＧＣＲ−００６７：ＨＢＧ１及びＨＢＧ２オンターゲット部位は、ロバストな局在化編集を示し、平均インデル頻度はそれぞれ約７４％及び７８％であった。４．９ｋｂの欠失のｄｄＰＣＲ分析は、それが約６２％の頻度で起こっていることを示した。他の部位は編集を示さなかった。
上述される局在化インデル頻度は、総インデル頻度に対するものではなく、大規模４．９ｋｂ欠失の頻度を考慮に入れない。
Figure 2020505934
バイアスされない（ｕｎｂｉａｓｅｄ）オフターゲット分析
オリゴ挿入に基づくアッセイ（例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３３，１８７−１９７；２０１５を参照されたい）を用いて、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２を標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的オフターゲットゲノム部位を決定した。これらの実験において、Ｃａｓ９ＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸを使用してｇＲＮＡ（１５ｎＭのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒ）及び挿入オリゴ（１０ｎＭ）でトランスフェクトした。アッセイは、Ｃａｓ９による切断から生じるか又は生じないことがある、ゲノムの二本鎖破断に組み込まれるオリゴの同定に依存する。
１つの実験において、ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２を標的とするｇＲＮＡ（図２９中の指示される標的化ドメインを含むデュアルガイドＲＮＡ）を、ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞においてスクリーニングし、結果を図２９にプロットする。別個の実験において、同じ方法を用いて、ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞においてＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２を標的とする同じｇＲＮＡの幾つか並びに追加的なｇＲＮＡ（図３０における指示される標的化ドメインを含むデュアルガイド及びシングルガイドＲＮＡを含む）をスクリーニングし、結果を図３０にプロットする。実験は、図３０に示されるデータと共に、バランスを取られたＧ／Ｃ含有量及びヒトゲノムとの最小の相補性を有する別の挿入オリゴを使用し、且つ公開されたＴｓａｉらの方法と比較してＰＣＲステップに対する他の修正を加え、感度を改善し、偽陽性を減少させた。両方の実験において、アッセイは、予想された標的配列及び１つ以上の潜在的オフターゲット部位において高効率の編集を検出した。
オンターゲット部位以外のゲノムの部位における挿入オリゴの検出が、Ｃａｓ９の潜在的オフターゲット効果を同定するが、潜在的オフターゲット部位の標的ディープシーケンシングを用いて、その潜在的な部位が本当にＣａｓ９によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定し得る。このために、ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞を、挿入オリゴを有さない以外は前の２つの実験において使用されるｇＲＮＡで（２５ｎＭのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒにおいて）同様にトランスフェクトする実験を行った。図２９及び３０に示される同定された潜在的オフターゲット部位の各々のアンプリコンディープシーケンシングを用いて、インデル（Ｃａｓ９切断イベントを示す）がＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞株における潜在的オフターゲット部位に存在したかどうかを同定した。この実験の結果は、オリゴ挿入アッセイによって同定された潜在的オフターゲット部位の大部分が、以下の表１４に示される幾つかの例外を除いて、ｇＲＮＡのトランスフェクション後に検出可能なインデルを有していなかったことを示した。注目すべきことには、潜在的オフターゲットを検出するためにこれらの実験において使用されるＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞は、構成的にＣａｓ９を過剰発現し、目的の様々な細胞型（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）において一時的な送達様式（例えば、ＲＮＰ送達）と比較して、より多い数の潜在的オフターゲット「ヒット」をもたらすようである。
Figure 2020505934
本明細書に記載される方法を用いて、潜在的オフターゲット部位を、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９編集されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて調べ、ＣＤ３４＋細胞型において編集がないことを示した。
実施例８
実験手順
健常なドナーの動員末梢血（ｍＰＢ）から採取したＣＤ３４＋細胞を培養し、実施例６において前述されるのと同じ条件で遺伝子編集した。前の段落に記載される同じ方法を使用して、細胞をその生物学的機能について特徴付けた。
動員末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞は、編集時に、そのＣＤ３４＋細胞数、増殖能、及び生存率を維持する。
患者に移植されるＣＤ３４＋細胞の数は、骨髄移植の成功に直接相関している。したがって、本発明者らは、臨床的に許容可能な方法、ＩＳＨＡＧＥを使用して、遺伝子編集時に、１０日の期間にわたってＣＤ３４＋細胞のパーセンテージを計数した。結果は、ｓｇ１１２８又はｓｇ００６７による編集のいずれも、モック編集された対照と比較した際にＣＤ３４＋細胞数に影響を与えなかったことを示す（図３１）。細胞がエレクトロポレーション後３日間培養物中に維持されたに過ぎない、本発明者らの細胞プロセスの総持続時間では、ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは約９０％に維持された（図３１Ａ）。遺伝子編集はまた、ＣＤ３４＋細胞が増殖する能力に影響を与えず（図３１Ｂ）、エレクトロポレーション後のその生存率は７０〜９０％の範囲であった（図３１Ｃ）。本発明者らは、エレクトロポレーション後３日目に約２倍の細胞増殖、エレクトロポレーション後７日目に約１０倍の増殖、及びエレクトロポレーション後１０日目に１５〜２５倍の増殖を観察した（図３１Ｂ）。
健常な個体の動員末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞は、骨髄細胞供給源又は鎌状赤血球病患者に由来するＣＤ３４＋細胞と比較して、同様の編集効率を示す。
Ｓｇ１１２８が、健常なドナーのｍＰＢに由来するＣＤ３４＋細胞における約７０〜７５％の編集効率を示した一方、００６７は、＞９５％の総編集効率を示した（大規模５ｋｂ欠失及び小さいインデルを含む）（図３２）。これらのｓｇＲＮＡからの編集効率は、健常なドナーからの骨髄由来のＣＤ３４＋細胞又は鎌状赤血球病患者からの末梢血由来のＣＤ３４＋細胞（他の実施例を参照）を含む、異なる供給源からの細胞において同様であった。各ｓｇＲＮＡの編集効率及び編集パターンは両方とも試験される全てのドナーにわたって高度に一貫していたことに留意することが重要である。
ＢＣＬ１１ＡのＣＲＩＳＰＲノックダウン又はｇ−グロビン遺伝子クラスターの突然変異は、ｇ−グロビン転写物及びＦ細胞産生を増加させる。
ｓｇ１１２８によるＢＣＬ１１Ａのノックダウン、又はｓｇ００６７によるｇ−グロビン遺伝子クラスターにおける潜在的ＢＣＬ１１Ａ結合部位の突然変異は両方とも、ｇ−グロビン転写物を有意に増加させ（図３３）これは、モック編集された対照と比較してＦ細胞産生の１５〜２０％の上方制御をもたらす（図３４）。要約すると、ｓｇ１１２８及びｓｇ００６７は、高い効率でＣＤ３４＋細胞を編集し、高度に一貫した編集パターンを生成することができる。編集された細胞は、本発明者の６日の細胞処理手順の最後まで約９０％のＣＤ３４＋細胞数を維持する。細胞の増殖能及び生存率は、遺伝子編集手順によって損なわれなかった。編集されたＣＤ３４＋細胞は、赤血球細胞へと分化すると、有意に高いレベルのｇ−グロビン転写物を発現し、これは、増加した数のＦ細胞産生につながる。これは、ヘモグロビン発現を改善し、Ｆ細胞数は、鎌状赤血球病の血液学的特徴を救い得る。
実施例９：鎌状赤血球病患者に由来する遺伝子編集されたＨＳＰＣのインビトロ生着及び特徴付け
実験手順
鎌状赤血球病患者に由来するＣＤ３４＋細胞を培養し、実施例８において前述されるのと同じ条件で遺伝子編集した。前の実施例に記載される同じ方法を使用して、細胞をその生物学的機能について特徴付けた。
鎌状赤血球病個体に由来するＣＤ３４＋細胞は、編集時にそのＣＤ３４＋免疫表現型及び生存率を維持する。
原始的細胞状態を維持する造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、ＣＤ３４を発現するはずである。これは、移植時の生着可能な造血幹細胞に関連する最も重要な臨床的指標の１つであり、移植の成功は、移植されるＣＤ３４＋細胞の数に直接相関している。したがって、本発明者らは、臨床的に許容可能な方法、ＩＳＨＡＧＥを使用して、編集時に、鎌状赤血球病個体の末梢血から得られたＣＤ３４＋細胞の数を計数した。結果は、ｓｇ１１２８又はｓｇ００６７による編集のいずれも、モック編集された対照と比較した際にＣＤ３４＋細胞数に影響を与えなかったことを示す（図３５Ａ及び図３５Ｂ）。Ｄ３４＋細胞のパーセンテージは、編集時に３日目に約８０％に維持された（図３５Ｂ）。遺伝子編集はまた、患者由来のＣＤ３４＋細胞が増殖する能力に影響を与えず（図３５Ｃ）、エレクトロポレーション（Ｄ０におけるエレクトロポレーション）後のその生存率は、１０日の期間にわたって計測した全ての時点で７５％超であった（図３５Ｄ）。
鎌状赤血球病個体に由来するＣＤ３４＋細胞は、健常なドナーに由来するＣＤ３４＋細胞と比較して同様の編集効率を示す。
Ｓｇ１１２８が、鎌状赤血球患者に由来するＣＤ３４＋細胞における約６５％編集効率を示した一方、ｓｇ００６７は、患者試料において８０〜９５％の編集効率を示した（図３６）。編集効率のレベルは、健常なドナーからの骨髄又は動員末梢血に由来するＣＤ３４＋細胞のいずれかを用いて得られたものと同様である。（実施例２．１に記載されるとおり）ＮＧＳによって計測した際の各ガイドＲＮＡの編集パターンは、異なる患者にわたっても高度に一貫していた。
遺伝子編集は、鎌状赤血球病個体に由来するＣＤ３４＋細胞のインビトロ多系統分化能を損なわない。
コロニー形成単位アッセイによって計測した際に、遺伝子編集された造血幹細胞・前駆細胞は、赤血球系、顆粒球、単球、及び巨核球系統へと完全に分化することが可能であった（図３７）。
ＢＣＬ１１ＡのＣＲＩＳＰＲノックダウン又はｇ−グロビン遺伝子クラスターの突然変異は、ｇ−グロビン転写物、Ｆ細胞産生、及び胎児ヘモグロビン発現を増加させる。
ｓｇ１１２８によるＢＣＬ１１Ａのノックダウン、又はｓｇ００６７によるｇ−グロビンクラスターにおけるインデル／欠失の形成のいずれも、ｇ−グロビン転写物を有意に増加させ（図３８）、フローサイトメトリーによって計測した際にＦ細胞の数を増加させた（図３９）。さらに、Ｆ細胞の胎児ヘモグロビン発現強度は、フローサイトメトリーによって計測した際に細胞当たり基準で改善された（図４０）。
患者由来のＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集は、鎌状赤血球数の有意な減少及び正常細胞数の増加をもたらした。
最後に、遺伝子編集が鎌状赤血球形態を救い得るかどうかを理解するために、本発明者らは、鎌状赤血球病患者に由来するＣＤ３４＋細胞をＣＲＩＳＰＲで編集し、これらの細胞を赤血球細胞へと分化させ、これらの細胞を４日間にわたって低酸素チャンバーに入れて、鎌状赤血球形態を誘導した。細胞を抗ＨｂＦ−ＦＩＴＣ抗体で共染色し、チャンバー内で固定し、イメージングフローサイトメトリーに供し、細胞当たり１つの単一画像を捕捉した。単一細胞イメージングフローサイトメトリーは、細胞長及びＨｂＦの発現に基づいて、正常細胞に対して鎌状赤血球をハイスループットで区別することができる（各患者からの４０，０００の単一細胞画像を、データ分析に使用した）。結果は、ｓｇ１１２８又はｓｇ００６７のいずれかによる遺伝子編集が、鎌状赤血球数を約４０％減少させ（図４１Ａ）、それと同時に正常細胞数を１．２倍増加させることができたことを示す（図４１Ｂ）。鎌状赤血球数の減少及びそれと同時の正常赤血球数の増加の複合作用は、臨床に適用したときに患者に大きい利益をもたらすであろう。
要約すると、ｓｇ１１２８及びｓｇ００６７は、鎌状赤血球病患者に由来するＣＤ３４＋細胞を高い効率で編集し、高度に一貫した編集パターンを生成することができる。編集された細胞をモック編集された対照群と比較した際に、ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージ、細胞増殖能、及び細胞の生存率は、遺伝子編集手順によって損なわれなかった。編集されたＣＤ３４＋細胞は、赤血球へと分化すると、有意に高いレベルのｇ−グロビン転写物を発現した。これは、増加した数のＦ細胞につながり、細胞当たりのＨｂＦ発現も増加させた。高ＨｂＦ発現Ｆ細胞の数の増加及び鎌状赤血球の数の減少は、本発明者らの単一細胞イメージングフローサイトメトリー分析において反映された。本発明者らは、モック編集された対照と比較した際に、遺伝子編集された群における鎌状赤血球の５０％の減少、及びそれと同時に、編集された群における高ＨｂＦ発現正常赤血球の１．２倍の増加を観察した。遺伝子編集時の鎌状赤血球数の減少と、それと同時の高ＨｂＦ発現正常赤血球の増加とのこの複合作用は、臨床に適用したときに患者に大きい利益をもたらすはずである。総合すると、これらのデータは、ｂ−グロビン異常症を治療するための細胞療法の手段としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノム編集の開発を裏付けるものである。
配列表と本明細書に記載される配列との間に相違がある範囲において、本明細書に記載される配列が正しい配列であると見なされるべきである。特に指示されない限り、全てのゲノム位置はｈｇ３８に基づく。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許又は特許出願が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に指示されたものとして参照により全体として本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、又はルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様及び変形形態が当業者によって本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる態様及び均等な変形形態の全てを含むものと解釈されることが意図される。

Claims (92)

  1. ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、
    ａ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｂ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｃ）非欠失ＨＦＰＨ領域（例えば、ヒト非欠失ＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的であり；
    ｄ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｅ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｆ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｇ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
    ｈ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；又は
    ｉ）これらの組み合わせ
    である標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
  2. 前記標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号７２又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  3. 前記標的化ドメインは、配列番号６７、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
  4. 前記標的化ドメインは、
    ａ）配列番号６７、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１若しくはその断片；又は
    ｂ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５４若しくはその断片
    のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
  5. 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  6. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、請求項５に記載のｇＲＮＡ分子。
  7. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、請求項５に記載のｇＲＮＡ分子。
  8. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’又は３’核酸のいずれも含まない、請求項５に記載のｇＲＮＡ分子。
  9. 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、請求項２〜８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  10. 前記標的化ドメインは、配列番号６７を含む、例えばそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  11. デュアルガイドＲＮＡ分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  12. シングルガイドＲＮＡ分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  13. （ａ）配列番号１９５；
    （ｂ）配列番号２３１；又は
    （ｃ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）又は（ｂ）のいずれか
    を含み、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列は、任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置される、請求項１２に記載のｇＲＮＡ分子。
  14. 配列：
    （ａ）配列番号１７４；
    （ｂ）配列番号１７５；又は
    （ｃ）配列番号１７６
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  15. （ａ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
    （ｄ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  16. ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；及び／又は
    ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間に形成される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  17. 前記インデルは、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まず、任意選択で、前記インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
  18. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  19. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞（例えば、細胞の集団）に導入されると、
    （ａ）胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加され、任意選択で、胎児ヘモグロビンの前記発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団における胎児ヘモグロビンの発現のレベルに対して、少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約２５％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％だけ増加され；
    （ｂ）前記細胞又は細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
    （ｃ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；及び／又は
    （ｄ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  20. 前記細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり（又は細胞の集団は、それを含み）、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  21. 前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである（又は細胞の集団は、それを含む）、請求項２０に記載のｇＲＮＡ分子。
  22. 前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  23. １）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子；
    ２）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ３）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
    ４）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
    ５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；又は
    ６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
    を含む組成物。
  24. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物であって、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、組成物。
  25. 前記Ｃａｓ９分子は、
    （ａ）配列番号２３３；
    （ｂ）配列番号２３４；
    （ｃ）配列番号２３５；
    （ｄ）配列番号２３６；
    （ｅ）配列番号２３７；
    （ｆ）配列番号２３８；
    （ｇ）配列番号２３９；
    （ｈ）配列番号２４０；
    （ｉ）配列番号２４１；
    （ｊ）配列番号２４２；
    （ｋ）配列番号２４３；又は
    （ｌ）配列番号２４４
    を含む、例えばそれからなる、請求項２３又は２４に記載の組成物。
  26. 前記第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０ｕＭ未満、例えば約３ｕＭ未満、例えば約１ｕＭ未満、例えば約０．５ｕＭ未満、例えば約０．３ｕＭ未満、例えば約０．１ｕＭ未満の濃度であり、任意選択で、前記ＲＮＰの前記濃度は、約２ｕＭであるか又は約１ｕＭであり、任意選択で、前記組成物は、細胞、例えばＨＳＰＣの集団をさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
  30. 請求項２９に記載の核酸を含むベクターであって、任意選択で、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択されるベクター。
  31. 細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、
    １）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
    ２）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ３）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
    ４）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；
    ６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
    ７）請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物；又は
    ８）請求項３０に記載のベクター
    と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法。
  32. 前記細胞は、動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされた細胞の集団を含む組成物中に配置される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ａ）前記改変は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルをもたらし；及び／又は
    ｂ）前記改変は、前記ＨＢＧ１プロモーター領域において前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間において、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失をもたらし、任意選択で、前記欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. （ａ）細胞の集団であって、前記集団の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％は、改変されている、例えばインデルを含む、細胞の集団をもたらし、任意選択で、前記インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の前記細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
    （ｂ）前記改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
    （ｃ）前記改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；及び／又は
    （ｄ）前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞又は請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
  40. 表７−２に記載されるインデルを含む細胞であって、任意選択で、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない細胞。
  41. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、又は請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、又は請求項３０に記載のベクターを含む細胞。
  42. 分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し、任意選択で、前記分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの分化細胞に対して少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
  43. 幹細胞増殖剤と接触されている、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の細胞。
  44. 前記幹細胞増殖剤は、
    ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
    ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
    ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
    ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
    ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール）との組み合わせ
    である、請求項４３に記載の細胞。
  45. 細胞、例えば請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の細胞であって、
    ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
    ｂ）前記ＨＢＧ１プロモーター領域において請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失
    を含み、任意選択で、前記欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、細胞、例えば請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の細胞。
  46. 動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
  47. ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の細胞。
  48. 前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
  49. 前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の細胞。
  50. 請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団であって、任意選択で、前記集団の前記細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％）は、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の細胞である、細胞の集団。
  51. 分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、同じタイプの修飾されていない細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約１７％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；任意選択で、前記分化細胞の集団の前記Ｆ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項５０に記載の細胞の集団。
  52. １）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
    ２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
    ３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
    ４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；又は
    ５）２ｅ６〜１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ
    を含む、請求項５０又は５１に記載の細胞の集団。
  53. 前記集団の前記細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％）は、ＣＤ３４＋細胞であり、任意選択で、前記集団の前記細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  54. 臍帯血、末梢血（例えば、動員末梢血）又は骨髄に由来し、例えば骨髄に由来する、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  55. 哺乳類細胞、例えばヒト細胞を含み、例えばそれからなり、任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  56. （ｉ）前記細胞の集団が投与される患者に対して自己由来であるか、又は（ｉｉ）前記細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  57. 細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の細胞の集団であって、表７−２に記載されるとおりのインデルパターンを含み、任意選択で、表７−２に記載される前記インデルパターンの前記インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％において検出可能である、細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  58. 請求項３９〜５７のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物であって、任意選択で、薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適な薬学的に許容可能な媒体を含む組成物。
  59. 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項３９〜５７のいずれか一項に記載の細胞若しくは細胞の集団又は請求項５８に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
  60. 哺乳類における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項３９〜５７のいずれか一項に記載の細胞若しくは細胞の集団又は請求項５８に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
  61. 前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、請求項６０に記載の方法。
  62. 細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法であって、
    （ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；
    （ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；及び
    （ｃ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸又は請求項３０に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
    を含む方法。
  63. ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞に対して増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記幹細胞増殖剤は、
    ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
    ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
    ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
    ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
    ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
    である、請求項６２又は６３に記載の方法。
  65. 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、任意選択で、前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含み；任意選択で、前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）及び存在する場合にはヒトＩＬ−６をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、任意選択でそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、任意選択で約１ｕＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度又は約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ステップ（ｂ）の前記培養は、ステップ（ｃ）の前記導入前の培養期間を含み、任意選択で、ステップ（ｃ）の前記導入前の前記培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間である、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. ステップ（ｂ）の前記培養は、ステップ（ｃ）の前記導入後の培養期間を含み、任意選択で、ステップ（ｃ）の前記導入後の前記培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、又は約３日の期間であり、又は約４日の期間である、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記細胞の集団は、少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍だけエキソビボで増殖される、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. ステップ（ｃ）の前記導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離される、請求項７１に記載の方法。
  73. （ｉ）ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離され、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、前記サラセミアは、βサラセミアであり；又は
    （ｉｉ）ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、末梢血から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の末梢血から単離され、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、前記サラセミアは、βサラセミアであり；任意選択で、前記末梢血は、動員末梢血であり、任意選択で、前記動員末梢血は、Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせを用いて動員される、請求項７２に記載の方法。
  74. ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関してエンリッチされる、請求項６２〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される、請求項６２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、
    ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
    ｂ）前記ＨＢＧ１プロモーター領域において前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失
    を含み、任意選択で、前記インデル、例えば欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、請求項６２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. （ａ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞の集団の前記細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、前記インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
    （ｂ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
    （ｃ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；
    （ｄ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
    （ｅ）ステップ（ｃ）の前記導入後、オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；及び／又は
    （ｆ）ステップ（ｃ）の前記導入後、例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、請求項６２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 請求項６２〜７７のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）。
  79. 細胞、例えば改変された細胞、例えば請求項７８に記載の細胞であって、
    （ａ）前記細胞の集団の前記細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、前記インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
    （ｂ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
    （ｃ）前記細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；
    （ｄ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
    （ｅ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；
    （ｆ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されず；及び／又は
    （ｇ）前記細胞又はその子孫は、任意選択で、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、移植後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、それを移植される患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択される、細胞、例えば改変された細胞、例えば請求項７８に記載の細胞。
  80. 動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、請求項７８又は７９に記載の細胞。
  81. ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の細胞。
  82. 前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の細胞。
  83. 前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
  84. 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
  85. ヒト患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法。
  86. 前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物が投与される、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記細胞若しくは細胞の集団又はその子孫は、任意選択で、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、前記ヒト患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表２−７に挙げられるインデルから選択され；任意選択で、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超における参照細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）での前記インデルの検出のレベルは、投与の直前の前記細胞の集団における前記インデルの検出のレベルに対して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下だけ低下される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 薬剤として使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項２３〜２８又は５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載のベクター、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
  90. 薬剤の製造に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項２３〜２８又は５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載のベクター、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
  91. 疾患の治療に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項２３〜２８又は５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載のベクター、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
  92. 疾患の治療に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項２３〜２８又は５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載のベクター、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団であって、前記疾患は、異常ヘモグロビン症であり、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミア（例えば、β−サラセミア）である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項２３〜２８又は５８のいずれか一項に記載の組成物、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載のベクター、請求項３９〜５７又は７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
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