JP7461368B2 - タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子を同定するためのcrispr/casスクリーニングプラットフォーム - Google Patents
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Description
この出願は、2019年3月18日に出願された米国出願第62/820,086号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ファイル544635SEQLIST.txtに記述された配列表は、75.7キロバイトであり、2020年3月16日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
[発明を実施するための形態]
Casタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。CRISPR/Cas相乗的活性化メディエーター(SAM)対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。Casタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ脱凝集または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためにそのような細胞を作成および使用する方法が提供される。CRISPR/Cas相乗的活性化メディエーター(SAM)対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングするためのそのような細胞を作製および使用する方法が提供される。そのような細胞をタウ播種活性またはタウ凝集に感作するための試薬および方法もまた提供される。タウ凝集を誘導するための試薬および方法もまた提供される。
A.Cas/Tauバイオセンサー細胞およびSAM/タウバイオセンサー細胞
第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン(例えば、タウ微小管結合ドメイン(MBD)を含む)および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを発現するだけでなく、Cas9などのCasタンパク質も発現する細胞が本明細書に開示される。第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン(例えば、タウ微小管結合ドメイン(MBD)を含む)および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを発現するだけでなく、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質、および1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質も発現する細胞もまた本明細書に開示される。第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメインは、安定して発現され得、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインは、安定して発現され得る。例えば、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメインをコードするDNAは、ゲノム的に組み込むことができ、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインをコードするDNAは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、Casタンパク質は、Cas/タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、Casタンパク質をコードするDNAは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、キメラCasタンパク質および/またはキメラアダプタータンパク質は、SAM/タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、キメラCasタンパク質をコードするDNAは、ゲノム的に組み込むことができ、かつ/またはキメラアダプタータンパク質をコードするDNAは、ゲノム的に組み込むことができる。細胞は、タウ凝集陰性であり得るか、またはタウ凝集陽性であり得る。
微小管関連タンパク質タウは、微小管の集合および安定性を促進するタンパク質であり、主にニューロンにおいて発現される。タウは、ニューロンの微小管を安定させ、したがって軸索伸長を促進する役割を果たす。アルツハイマー病(AD)およびタウオパチーと呼ばれる関連する神経変性疾患のファミリーでは、タウタンパク質は、異常に過剰リン酸化され、神経原線維変化として現れるフィラメントの束(対らせん状フィラメント)に凝集する。タウオパチーは、脳内の異常なタウ沈着を特徴とする不均一な神経変性状態のグループである。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞はまた、Casタンパク質をコードする核酸(DNAまたはRNA)を含む。任意に、Casタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたCasコード配列を含む。同様に、本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞はまた、1つ以上の転写活性化ドメイン(例えば、VP64)に融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質をコードする核酸(DNAまたはRNA)も含む。任意に、キメラCasタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラCasコード配列を含む。
本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞は、1つ以上の転写活性化ドメイン(例えば、VP64)に融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質をコードする核酸(DNAまたはRNA)だけでなく、任意に、1つ以上の転写活性化ドメインに融合された(例えば、p65およびHSF1に融合された)アダプタータンパク質(例えば、MS2コートタンパク質(MCP))を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸(DNAまたはRNA)も含み得る。任意に、キメラCasタンパク質および/またはキメラアダプタータンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラCasタンパク質コード配列および/またはゲノム的に組み込まれたキメラアダプタータンパク質コード配列を含む。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。Cas/タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。同様に、本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。SAM/タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。細胞は、任意の供給源からのものであり得る。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌(例えば、酵母)細胞であり得る。そのような細胞は、魚細胞もしくは鳥細胞であり得るか、またはそのような細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、もしくはラット細胞などの哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ギニアブタ)、家畜(例えば、雌牛および去勢雄牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ブタおよびイノシシなどのブタ種)が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。特定の例では、Cas/タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞(例えば、HEK293T細胞)である。同様に、特定の例では、SAM/タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞(例えば、HEK293T細胞)である。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメイン、およびCasタンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態(例えば、DNA、RNA、またはタンパク質)で細胞に導入され得る。同様に、本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメイン、キメラCasタンパク質、およびキメラアダプタータンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態(例えば、DNA、RNA、またはタンパク質)で細胞に導入され得る。「導入すること」は、配列が細胞の内部にアクセスできるように、核酸またはタンパク質を細胞に提示することを含む。本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも1つの細胞の内部にアクセスできることのみに依存する。核酸およびタンパク質を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。任意に、標的化ベクターを使用することができる。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。細胞は、Agg[-]細胞またはAgg[+]細胞であり得る。例えば、培養物または組成物は、Agg[-]細胞を含み得る。一例では、培地は、本明細書の他の場所に開示されているように、Agg[+]細胞からの馴化培地を含む。任意に、培養物または組成物中の細胞は、Agg[-]細胞であり、Agg[+]細胞と共培養されていない。培地は、馴化培地および新鮮な培地の混合物を含み得る。一例として、馴化培地と新鮮な培地との比は、例えば、約10:1、約9:1、約8:1、約7:1、約6:1、約5:1、約4:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、または約1:10であり得る。例えば、馴化培地と新鮮な培地との比率は、約5:1~約1:1、約4:1~約2:1、または約3:1であり得る。例えば、それは、約90%の馴化培地および約10%の新鮮な培地、約85%の馴化培地および約15%の新鮮な培地、約80%の馴化培地および約20%の新鮮な培地、約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地、約70%の馴化培地および約30%の新鮮な培地、約65%の馴化培地および約35%の新鮮な培地、約60%の馴化培地および約40%の新鮮な培地、約55%の馴化培地および約45%の新鮮な培地、約50%の馴化培地および約50%の新鮮な培地、約45%の馴化培地および約55%の新鮮な培地、約40%の馴化培地および約60%の新鮮な培地、約35%の馴化培地および約65%の新鮮な培地、約30%の馴化培地および約70%の新鮮な培地、約25%の馴化培地および約75%の新鮮な培地、約20%の馴化培地および約80%の新鮮な培地、約15%の馴化培地および約85%の新鮮な培地、または約10%の馴化培地および約90%の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。一例では、それは、少なくとも約50%の馴化培地および約50%以下の新鮮な培地を含む培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。特定の例では、それは、約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地で、遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み得る。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム)またはリン脂質を含む。任意に、培地は、リポフェクタミンまたはリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム)またはリン脂質を含まない。任意に、培地は、リポフェクタミンを含まない。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。本明細書に開示されるSAM/タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。一例では、培地は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む。細胞は、Agg[-]細胞またはAgg[+]細胞であり得る。例えば、培養物または組成物は、Agg[-]細胞を含み得る。任意に、培養物または組成物中の細胞は、Agg[-]細胞であり、Agg[+]細胞と共培養されていない。培地は、新鮮な培地および細胞溶解物の混合物を含み得る。
本明細書に開示されるCRISPRnスクリーニング方法は、ゲノムワイドgRNAノックアウトライブラリなどのCRISPRガイドRNA(gRNA)ノックアウトライブラリを利用する。Cas9などのCasヌクレアーゼは、特定の標的配列を標的とするように設計されたgRNAを介して、特定のゲノム遺伝子座で二本鎖切断を誘導するようにプログラムされ得る。Casタンパク質の標的化特異性は短いgRNAによって付与されるため、プールされたゲノムスケールの機能的スクリーニングが可能である。そのようなライブラリは、mRNAを標的化することによりタンパク質発現を低減するshRNAライブラリなどのライブラリに比べていくつかの利点を有する。対照的に、gRNAライブラリは、遺伝子のゲノムコード領域に導入されたフレームシフト変異を介してノックアウトを達成する。
「ガイドRNA」または「gRNA」は、Casタンパク質(例えば、Cas9タンパク質)に結合し、かつCasタンパク質を標的DNA内の特定の位置に標的化するRNA分子である。ガイドRNAは、「DNA標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の2つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、RNA中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Cas9のものなど、いくつかのgRNAは、「アクチベーターRNA」(例えば、tracrRNA)および「ターゲッターRNA」(例えば、CRISPR RNAまたはcrRNA)の2つの別個のRNA分子を含み得る。他のgRNAは、単一RNA分子(単一RNAポリヌクレオチド)であり、これはまた「単一分子gRNA」、「単一ガイドRNA」、または「sgRNA」と称され得る。例えば、WO2013/176772、WO2014/065596、WO2014/089290、WO2014/093622、WO2014/099750、WO2013/142578、およびWO2014/131833を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Cas9の場合、シングルガイドRNAは、tracrRNAに融合したcrRNAを含み得る(例えば、リンカーを介して)。例えば、Cpf1の場合、標的配列への結合を達成するためにcrRNAのみが必要とされる。「ガイドRNA」および「gRNA」という用語は、二重分子(すなわち、モジュラー)gRNAおよび単一分子gRNAの両方を含む。
ガイドRNAの標的DNAには、結合に十分な条件が存在する場合に、gRNAのDNA標的セグメントが結合するDNAに存在する核酸配列が含まれる。好適なDNA/RNA結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なDNA/RNA結合条件(例えば、無細胞系における条件)は、当該技術分野で知られている(例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。gRNAに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的DNAの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である(したがって、Casタンパク質またはgRNAに相補的ではない)標的DNAの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞株は、タウの播種または凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなCas/タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウの播種または凝集を評価することを含み得る。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞株は、タウ凝集の遺伝的修飾因子(例えば、タウ凝集を防止するか、またはタウ凝集を防止すると予期される)をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなCas/タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ凝集を評価することを含み得る。
本明細書に開示されるCas/タウバイオセンサー細胞株は、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子(例えば、タウ脱凝集を促進する)をスクリーニングする方法で使用され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるようなタウ凝集陽性Cas/タウバイオセンサー細胞の集団を提供すること、複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを導入すること、および標的細胞におけるタウ脱凝集を評価することを含み得る。
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端から始まって先へ(すなわち、各行で左から右へ)進み3’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の1本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ(すなわち、各行で左から右へ)進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、慢性外傷性脳症(CTE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。
FRET[+]細胞における濃縮sgRNAとしてのタウ凝集の修飾因子遺伝子を明らかにするために、凝集物のないCas9発現タウ-CFP/タウ-YFPバイオセンサー細胞(Agg[-])に、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、2つのヒトゲノムワイドCRISPR sgRNAライブラリで形質導入した。図4を参照されたい。各CRISPR sgRNAライブラリは、機能的ノックアウトのために5’構成的エクソンを標的とし、遺伝子あたり平均約3のsgRNAをカバーする(組み合わせた2つのライブラリにおいて遺伝子あたり合計6のgRNA)。読み取りカウントの分布(つまり、ライブラリ内の各gRNAの表現)は正常であり、各ライブラリで同様であった。sgRNAは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが2つ以下のsgRNAを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは、1000の非標的化対照sgRNAを含む19,050のヒト遺伝子および1864のmiRNAをカバーする。ライブラリを、感染多重度(MOI)<0.3で、sgRNAあたり>300細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ピューロマイシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のsgRNAの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。ピューロマイシンの選択は、1μg/mLでの形質導入の24時間後に開始した。5つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
異常なタウタンパク質凝集のプロセスを変更する遺伝子および経路をさらに同定するために、転写活性化(hSAM)CRISPRa sgRNAライブラリを使用してゲノムワイドスクリーニングを行い、タウ疾患関連タンパク質凝集体によって「播種される」細胞の可能性を調節する遺伝子(すなわち、転写活性化された場合に、タウ線維化タンパク質の供給源に曝露されたときに細胞をタウ凝集体形成により感受性にさせる遺伝子)を同定するためのプラットフォームが開発された。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況においてタウ凝集体を形成するニューロンの感受性を支配するタウ細胞間凝集体増殖のメカニズムおよび遺伝的経路を解明し得る。
FRET[+]細胞における濃縮sgRNAとしてのタウ凝集の修飾因子遺伝子をさらに明らかにするために、凝集物のないSAM発現タウ-CFP/タウ-YFPバイオセンサー細胞(Agg[-])に、各標的遺伝子を転写活性化するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、ヒトゲノムワイドCRISPR hSAM sgRNAライブラリで形質導入した。ライブラリのsgRNAは、転写開始部位の200bp上流内の部位を標的とし、遺伝子あたりの平均カバレッジは約3のsgRNAである。sgRNAは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが2つ以下のsgRNAを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは18,946のヒト遺伝子をカバーする。ライブラリを、感染多重度(MOI)<0.3で、sgRNAあたり>300細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞は、ゼオシンの選択の下で増殖し、細胞ごとに固有のsgRNAの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。5つの独立したスクリーニング複製を一次スクリーニングで使用した。
次に、破壊されたときにタウの凝集を低減する標的遺伝子を同定したかった(種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって)。タウの凝集を防止するsgRNAのそのようなスクリーニングを開発するには、強力で大量に簡単に生成することができる播種活性の供給源が必要であった。この実施例に記載されるように、タウ-YFP Agg[+]クローン18からの全細胞溶解物が、タウ凝集およびFRETシグナルを誘導することができるが、タウ-YFP Agg[-]からの溶解物は誘導しないことを発見した。全細胞溶解物は、馴化培地または組換えタウ線維よりも(リポフェクタミンを含まない)タウ活性の播種においてはるかにより強力である。より大きな割合の細胞(例えば、>50%)で凝集(FRET)を誘導するために、全細胞溶解物をリポフェクタミンと組み合わせて使用してみた。また、それ自体が細胞に対して毒性のない緩衝液中に細胞溶解物を収集する方法を開発する必要があった。本明細書に記載される実験では、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+プロテアーゼ阻害剤を使用して細胞を収集し、超音波処理して細胞を溶解した。3分間超音波処理した細胞溶解物が最良に働いた。
実施例2のスクリーニングの目標は、破壊されたときに、弱いタウ播種材料で刺激されたときにタウ凝集体の形成を促進する修飾因子遺伝子を同定することであった。対照的に、この実施例でされるスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびFRET誘導を引き起こす強力なタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ-YFP Agg[+]クローン18細胞からの超音波処理した全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。このアプローチを採用して、破壊されたときにタウ凝集を低減する標的遺伝子を同定した(種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって)。図22を参照されたい。
実施例6と同様に、この実施例でされるスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびFRET誘導を引き起こす強力なタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ-YFP Agg[+]クローン18細胞からの超音波処理した全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。このアプローチを採用して、転写活性化されたときにタウ凝集を低減する標的遺伝子を同定した(種の取り込みをブロックする、オリゴマーまたは線維の形成を阻害する、それらの分解を促進することによって、またはいくつかの他のメカニズムによって)。図26を参照されたい。
上記の実施例では、タウ凝集の正および負の調節因子の同定を目的として、2つの一連のゲノムワイドスクリーニングを実施した。最初のスクリーニングでは、破壊されたときに、弱いタウ播種材料で刺激されたときにタウ凝集体の形成を促進する修飾因子遺伝子を同定した。この「最小播種」材料は、タウ-YFP凝集体[+]細胞から収集された馴化培地で構成され、7B10C3細胞に直接適用され、3日間のインビトロ(DIV)後に約0.1%のFRET[+]細胞を誘発する。対照的に、2番目のスクリーニングでは、通常、大部分の細胞でタウ凝集およびFRET誘導を引き起こす強力または最大のタウ播種材料でバイオセンサー細胞を処理した。この「最大播種」材料は、タウ-YFP凝集体[+]細胞からの超音波処理された全細胞溶解物で構成され、リポフェクタミントランスフェクション試薬が適用されている。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)Casタンパク質、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記Casタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
(f)ステップ(c)での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を増強する、方法。
(項目2)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Casタンパク質が、配列番号21を含み、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号22に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目1~4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目1~5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
各ガイドRNAが、構成的エクソンを標的とする、項目1~6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
各ガイドRNAが、5’構成的エクソンを標的とする、項目7に記載の方法。
(項目9)
各ガイドRNAが、第1のエクソン、第2のエクソン、または第3のエクソンを標的とする、項目1~8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質と、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第1のレポーター連結された第1のタウリピートドメインと、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記キメラCasタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
(f)ステップ(c)での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を増強する、方法。
(項目11)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記キメラCasタンパク質が、VP64転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、N末端からC末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質、核局在化シグナル、および前記VP64転写活性化因子ドメインを含む、項目10~12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記アダプタータンパク質が、MS2コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記1つ以上の転写活性化ドメインが、p65転写活性化ドメインおよびHSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、N末端からC末端に、前記MS2コートタンパク質、核局在化シグナル、前記p65転写活性化ドメイン、および前記HSF1転写活性化ドメインを含み、項目10~13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記キメラCasタンパク質が、配列番号36を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号38に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目10~14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号37を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号39に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目10~15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目10~16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目10~17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
各ガイドRNAが、転写開始部位の200bp上流内のガイドRNA標的配列を標的とする、項目10~18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる1つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる2つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第1のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第1のループ内にあり、第2のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第2のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号33に示される配列を含み、
任意に、1つ以上のガイドRNAの各々が、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分に融合したCRISPR RNA(crRNA)部分を含む単一のガイドRNAであり、前記第1のループが、配列番号17の残基13~16に対応するテトラループであり、前記第2のループが、配列番号17の残基53~56に対応するステムループ2である、項目10~19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
ステップ(c)が約3日~約9日である、項目1~20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
ステップ(c)が約6日である、項目21に記載の方法。
(項目23)
ステップ(d)が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目1~22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約1日~約7日間置いた後に採取された、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約4日間置いた後に採取された、項目24に記載の方法。
(項目26)
ステップ(d)が、約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地中で前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目23~25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記遺伝子修飾された細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目23~26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
ステップ(e)が約2日~約6日である、項目1~27のいずれかに記載の方法。
(項目29)
ステップ(e)が約4日である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対であり、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目1~29のいずれかに記載の方法。
(項目31)
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目1~30のいずれかに記載の方法。
(項目32)
前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAが濃縮されているとみなされる、項目1~31のいずかに記載の方法。
(項目33)
ステップ(f)が、ステップ(c)の第1の時点および/またはステップ(c)の第2の時点で、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含む、項目1~32のいずれかに記載の方法。
(項目34)
ステップ(c)の前記第1の時点が、前記細胞集団を培養する第1の継代であり、前記第2の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中である、項目33に記載の方法。
(項目35)
ステップ(c)の前記第1の時点が、培養の約3日後であり、ステップ(c)の前記第2の時点が、培養の約6日後である、項目34に記載の方法。
(項目36)
(1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(c)の前記第1の時点およびステップ(c)の前記第2の時点の両方で、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、および/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とする少なくとも2つの固有のガイドRNAの存在量が、ステップ(c)の前記第1の時点またはステップ(c)の前記第2の時点のいずれかで、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化がタウ凝集を増強する、項目33~35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
以下のステップ:
(1)ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(c)での前記培養された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(f)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を増強する、項目1~36のいずれかに記載の方法。
(項目38)
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)Casタンパク質、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記Casタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団の第1のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、前記播種された細胞集団の第2のサブセットに形成せず、凝集陰性細胞集団を生成する、培養することと、
(f)ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定すること、ならびに/またはステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を防止し、かつ/または
ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
(項目39)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記Casタンパク質が、配列番号21を含み、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号22に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目38~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目38~42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
各ガイドRNAが、構成的エクソンを標的とする、項目38~43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
各ガイドRNAが、5’構成的エクソンを標的とする、項目44に記載の方法。
(項目46)
各ガイドRNAが、第1のエクソン、第2のエクソン、または第3のエクソンを標的とする、項目38~45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質と、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第1のレポーター連結された第1のタウリピートドメインと、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記キメラCasタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団の第1のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成し、凝集陰性細胞集団を生成するために前記播種された細胞集団の第2のサブセットに形成されない、培養することと、
(f)ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定すること、ならびに/またはステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化がタウ凝集を防止し、かつ/または
ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化がタウ凝集を促進または増強する、方法。
(項目48)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記キメラCasタンパク質が、VP64転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、N末端からC末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質、核局在化シグナル、および前記VP64転写活性化因子ドメインを含む、項目47~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記アダプタータンパク質が、MS2コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記1つ以上の転写活性化ドメインが、p65転写活性化ドメインおよびHSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、N末端からC末端に、前記MS2コートタンパク質、核局在化シグナル、前記p65転写活性化ドメイン、および前記HSF1転写活性化ドメインを含み、項目47~50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記キメラCasタンパク質が、配列番号36を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号38に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目47~51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号37を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号39に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目47~52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目47~53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目47~54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
各ガイドRNAが、転写開始部位の200bp上流内のガイドRNA標的配列を標的とする、項目47~55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる1つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる2つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第1のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第1のループ内にあり、第2のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第2のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号33に示される配列を含み、
任意に、1つ以上のガイドRNAの各々が、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分に融合したCRISPR RNA(crRNA)部分を含む単一のガイドRNAであり、前記第1のループが、配列番号17の残基13~16に対応するテトラループであり、前記第2のループが、配列番号17の残基53~56に対応するステムループ2である、項目47~56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
ステップ(c)が約3日~約13日である、項目38~57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
ステップ(c)が、約7日~約10日であるか、約7日であるか、または約10日である、項目58に記載の方法。
(項目60)
ステップ(d)が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培地の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、項目38~59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記培地中の前記細胞溶解物が、約1~約5μg/mLの濃度である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記細胞溶解物を含む前記培地が、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む、項目60または61に記載の方法。
(項目63)
前記細胞溶解物を含む前記培地が、約1.5~約4μL/mLの濃度でリポフェクタミンを含む、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記遺伝子修飾された細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目60~63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
ステップ(e)が約1日~約3日である、項目38~64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
ステップ(e)が約2日である、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対であり、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目38~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目38~67のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団および/またはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAがステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団および/またはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ガイドRNAがステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは
前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団および/またはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAがステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団および/またはステップ(d)での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ガイドRNAがステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる、項目38~68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
ステップ(f)が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含み、かつ/またはステップ(f)が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含む、項目38~69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
ステップ(c)の前記第1の時点が、前記細胞集団を培養する第1の継代である、項目70に記載の方法。
(項目72)
ステップ(c)の前記第1の時点が、培養の約3日後であり、ステップ(c)の前記第2の時点が、培養の約7日後または培養の約10日後である、項目71に記載の方法。
(項目73)
(I)遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
(1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(3)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の前記第3の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ならびに/または
(4)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団およびステップ(d)の前記第4の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合に、タウ凝集を防止し、あるいは
(II)遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
(1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(3)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の前記第3の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(d)の前記第2の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ならびに/または
(4)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団およびステップ(d)の前記第4の時点での前記播種された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する、項目70~72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
(I)以下のステップ:
(1)ステップ(e)で生成された前記凝集陰性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(e)で生成された前記凝集陰性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団またはステップ(d)での前記播種された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(f)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を予防し、あるいは
(II)以下のステップ:
(1)ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(e)で生成された前記凝集陰性細胞集団またはステップ(d)での前記播種された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(f)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、項目38~73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
タウ凝集および/または脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)Casタンパク質、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することであって、前記細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記Casタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、前記培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、
(d)前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団を同定することと、
(e)ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定すること、ならびに/またはステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ脱凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ脱凝集を促進し、かつ/または
ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
(項目76)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記Casタンパク質が、配列番号21を含み、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号22に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目75~78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目75~79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
各ガイドRNAが、構成的エクソンを標的とする、項目75~80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
各ガイドRNAが、5’構成的エクソンを標的とする、項目81に記載の方法。
(項目83)
各ガイドRNAが、第1のエクソン、第2のエクソン、または第3のエクソンを標的とする、項目75~82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
タウ凝集および/または脱凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質と、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第1のレポーター連結された第1のタウリピートドメインと、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することであって、前記細胞が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞である、提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記キメラCasタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成し、前記培養することが、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団をもたらす、培養することと、
(d)前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団を同定することと、
(e)ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定すること、ならびに/またはステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ脱凝集を促進し、かつ/または
ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮、またはステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団および/もしくはステップ(c)の1つ以上の時点での培養された細胞集団に対して、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団におけるガイドRNAの枯渇が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、方法。
(項目85)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記キメラCasタンパク質が、VP64転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、N末端からC末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質、核局在化シグナル、および前記VP64転写活性化因子ドメインを含む、項目84~86のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
前記アダプタータンパク質が、MS2コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記1つ以上の転写活性化ドメインが、p65転写活性化ドメインおよびHSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、N末端からC末端に、前記MS2コートタンパク質、核局在化シグナル、前記p65転写活性化ドメイン、および前記HSF1転写活性化ドメインを含み、項目84~87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
前記キメラCasタンパク質が、配列番号36を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号38に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目84~88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号37を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号39に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目84~89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、項目84~90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、項目84~91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
各ガイドRNAが、転写開始部位の200bp上流内のガイドRNA標的配列を標的とする、項目84~92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる1つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる2つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第1のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第1のループ内にあり、第2のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第2のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号33に示される配列を含み、
任意に、1つ以上のガイドRNAの各々が、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分に融合したCRISPR RNA(crRNA)部分を含む単一のガイドRNAであり、前記第1のループが、配列番号17の残基13~16に対応するテトラループであり、前記第2のループが、配列番号17の残基53~56に対応するステムループ2である、項目84~93のいずれか一項に記載の方法。
(項目95)
ステップ(c)が約3日~約14日である、項目75~94のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
ステップ(c)が約10日~約14日である、項目95に記載の方法。
(項目97)
ステップ(d)が、細胞周期の進行を同期させて、主にS期に濃縮された細胞集団を得ることを含む、項目75~96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記同期が、二重チミジンブロックによって達成される、項目97に記載の方法。
(項目99)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対であり、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団および前記凝集陰性細胞集団が、フローサイトメトリーによって同定される、項目75~98のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
存在量が次世代シーケンシングによって決定される、項目75~99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団および/またはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAがステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団および/またはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ガイドRNAがステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているとみなされ、あるいは
前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団および/またはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAがステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において濃縮されているとみなされ、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団および/またはステップ(c)の1つ以上の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ガイドRNAがステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において枯渇しているとみなされる、項目75~100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
ステップ(e)が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含み、かつ/またはステップ(e)が、ステップ(e)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含む、項目75~101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
ステップ(c)の前記第1の時点が、前記細胞集団を培養する第1の継代であり、前記第2の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中である、項目102に記載の方法。
(項目104)
ステップ(c)の前記第1の時点が、培養の約7日後であり、ステップ(c)の前記第2の時点が、培養の約10日後である、項目103に記載の方法。
(項目105)
(I)遺伝子が、タウ脱凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
(1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(3)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ならびに/または
(4)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合に、タウ脱凝集を促進し、あるいは
(II)遺伝子が、タウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、
(1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ならびに/または
(3)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団、ステップ(c)の前記第1の時点での前記培養された細胞集団、およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合、ならびに/または
(4)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(d)での前記凝集陽性細胞集団およびステップ(c)の前記第2の時点での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(d)での前記凝集陰性細胞集団において少なくとも1.5倍低い場合に、タウ凝集を促進または増強する、項目102~104のいずれか一項に記載の方法。
(項目106)
(I)以下のステップ:
(1)ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(e)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(e)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(e)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(e)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団またはステップ(c)の前記第1の時点もしくは前記第2の時点での前記培養された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(e)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を予防し、あるいは
(II)以下のステップ:
(1)ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(e)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(e)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入され様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(e)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(e)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(d)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(d)で同定された前記凝集陰性細胞集団またはステップ(c)の前記第1の時点もしくは前記第2の時点での前記培養された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(e)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を促進または増強する、項目75~105のいずれか一項に記載の方法。
(項目107)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、項目1~106のいずれかに記載の方法。
(項目108)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目1~107のいずれかに記載の方法。
(項目109)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウP301S変異を含む、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウ4リピートドメインを含む、項目1~109のいずれかに記載の方法。
(項目111)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、配列番号11を含む、項目1~110のいずれかに記載の方法。
(項目112)
前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じである、項目1~111のいずれかに記載の方法。
(項目113)
前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウP301S変異を含むタウ4リピートドメインを含む、項目1~112のいずれかに記載の方法。
(項目114)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光タンパク質である、項目1~113のいずれかに記載の方法。
(項目115)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対である、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記第1のレポーターが、シアン蛍光タンパク質(CFP)であり、前記第2のレポーターが、黄色蛍光タンパク質(YFP)である、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記細胞が、真核細胞である、項目1~116のいずれかに記載の方法。
(項目118)
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目117に記載の方法。
(項目119)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目118に記載の方法。
(項目120)
前記細胞が、HEK293T細胞である、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記複数の固有のガイドRNAが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドRNAのうちの1つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、項目1~120のいずれかに記載の方法。
(項目122)
前記複数の固有のガイドRNAが、100以上の遺伝子、1000以上の遺伝子、または10000以上の遺伝子を標的とする、項目1~121のいずれかに記載の方法。
(項目123)
前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、項目1~122のいずれかに記載の方法。
(項目124)
複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目1~123のいずれかに記載の方法。
(項目125)
少なくとも3つの標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目124に記載の方法。
(項目126)
約3~約6個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記複数の固有のガイドRNAが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、項目1~126のいずれかに記載の方法。
(項目128)
前記複数の固有のガイドRNAの各々が、別個のウイルスベクター内にある、項目127に記載の方法。
(項目129)
前記複数の固有のガイドRNAが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、項目127または128に記載の方法。
(項目130)
前記細胞集団が、約0.3未満の感染多重度で感染する、項目127~129のいずれか一項に記載の方法。
(項目131)
前記複数の固有のガイドRNAが、選択マーカーと共に前記細胞集団に導入され、ステップ(b)が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む、項目1~130のいずれかに記載の方法。
(項目132)
前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンSデアミナーゼから選択される、項目132に記載の方法。
(項目134)
ステップ(b)において前記複数の固有のガイドRNAが導入される前記細胞集団が、固有のガイドRNAあたり約300個を超える細胞を含む、項目1~133のいずれかに記載の方法。
(項目135)
Casタンパク質、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを含む、1つ以上の細胞の集団。
(項目136)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目135に記載の細胞集団。
(項目137)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目136に記載の細胞集団。
(項目138)
前記Casタンパク質が、配列番号21を含み、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号22に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目137に記載の細胞集団。
(項目139)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目135~138のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目140)
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目135~139のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目141)
1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質と、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第1のレポーター連結された第1のタウリピートドメインと、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインと、を含む、1つ以上の細胞の集団。
(項目142)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目141に記載の細胞集団。
(項目143)
前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9である、項目142に記載の細胞集団。
(項目144)
前記キメラCasタンパク質が、VP64転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、N末端からC末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質、核局在化シグナル、および前記VP64転写活性化因子ドメインを含む、項目141~143のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目145)
前記アダプタータンパク質が、MS2コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記1つ以上の転写活性化ドメインが、p65転写活性化ドメインおよびHSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、N末端からC末端に、前記MS2コートタンパク質、核局在化シグナル、前記p65転写活性化ドメイン、および前記HSF1転写活性化ドメインを含み、項目141~144のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目146)
前記キメラCasタンパク質が、配列番号36を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号38に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目141~145のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目147)
前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号37を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号39に示される配列を含むコード配列によってコードされる、項目141~146のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目148)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、項目141~147のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目149)
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、項目141~148のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目150)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、項目135~149のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目151)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目135~150のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目152)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウP301S変異を含む、項目151に記載の細胞集団。
(項目153)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウ4リピートドメインを含む、項目135~152のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目154)
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、配列番号11を含む、項目135~153のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目155)
前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じである、項目135~154のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目156)
前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウP301S変異を含むタウ4リピートドメインを含む、項目135~155のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目157)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光タンパク質である、項目135~156のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目158)
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対である、項目157に記載の細胞集団。
(項目159)
前記第1のレポーターが、シアン蛍光タンパク質(CFP)であり、前記第2のレポーターが、黄色蛍光タンパク質(YFP)である、項目158に記載の細胞集団。
(項目160)
前記細胞が、真核細胞である、項目135~159のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目161)
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目160に記載の細胞集団。
(項目162)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目161に記載の細胞集団。
(項目163)
前記細胞が、HEK293T細胞である、項目162に記載の細胞集団。
(項目164)
前記細胞が、インビトロである、項目135~163のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目165)
前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在していない、項目135~164のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目166)
前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在する、項目135~165のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目167)
項目135~166のいずれか一項に記載の細胞集団、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含む培養培地を含む、インビトロ培養物。
(項目168)
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約1日~約7日間置いた後に採取された、項目167に記載のインビトロ培養物。
(項目169)
前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約4日間置いた後に採取された、項目168に記載のインビトロ培養物。
(項目170)
前記培養培地中に約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地を含む、項目167~169のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
(項目171)
前記細胞集団が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する前記培養されたタウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目167~170のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
(項目172)
項目135~166のいずれか一項に記載の細胞集団、およびタウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培養培地を含む。インビトロ培養物。
(項目173)
前記培地中の前記細胞溶解物が、約1~約5μg/mLの濃度である、項目172に記載のインビトロ培養物。
(項目174)
前記細胞溶解物を含む前記培地が、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬をさらに含む、項目173に記載のインビトロ培養物。
(項目175)
前記細胞溶解物を含む前記培地が、約1.5~約4μL/mLの濃度でリポフェクタミンを含む、項目174に記載のインビトロ培養物。
(項目176)
前記細胞溶解物が、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中に前記細胞を収集した後、約2分~約4分間の前記タウ凝集陽性細胞の超音波処理によって生成された、項目172~175のいずれか一項に記載のインビトロ培養物。
(項目177)
タウ凝集を誘導するための馴化培地を生成する方法であって、
(a)タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、
(b)培地中で前記タウ凝集陽性細胞集団を培養して、馴化培地を生成することと、
(c)前記馴化培地を採取することと、を含む、方法。
(項目178)
前記タウ凝集陽性細胞が、ステップ(b)でコンフルエントになるまで培養される、項目177に記載の方法。
(項目179)
前記馴化培地が、ステップ(c)において前記コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約1日~約7日間置いた後に採取される、項目178に記載の方法。
(項目180)
前記馴化培地が、ステップ(c)において前記コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約4日間置いた後に採取される、項目179に記載の方法。
(項目181)
タウ凝集陽性細胞の集団を生成する方法であって、
(a)項目177~180のいずれか一項に記載の方法に従ってタウ凝集を誘導するために馴化培地を生成することと、
(b)前記馴化培地を含む培養培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養して、前記タウ凝集陽性細胞集団を生成することと、を含む、方法。
(項目182)
前記培養培地中に約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地を含む、項目181に記載の方法。
(項目183)
前記細胞集団が、前記馴化培地を生成するための前記方法で使用される前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目181または182に記載の方法。
(項目184)
前記タウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目181~183のいずれか一項に記載の方法。
(項目185)
前記タウリピートドメインが、タウP301S変異を含む、項目181~184のいずれか一項に記載の方法。
(項目186)
前記タウリピートドメインが、タウ4リピートドメインを含む、項目181~185のいずれか一項に記載の方法。
(項目187)
前記タウリピートドメインが、配列番号11を含む、項目181~186のいずれか一項に記載の方法。
(項目188)
タウ凝集を誘導するための培養されたタウ凝集陽性細胞から細胞溶解物を含む培地を生成する方法であって、
(a)タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在するタウ凝集陽性細胞集団を提供することと、
(b)プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液に前記タウ凝集陽性細胞を収集することと、
(c)前記タウ凝集陽性細胞を約2分~約4分間超音波処理して、前記細胞溶解物を生成することと、
(d)前記細胞溶解物を増殖培地に添加することと、を含む、方法。
(項目189)
前記増殖培地中の前記細胞溶解物が、約1~約5μg/mLの濃度である、項目188に記載の方法。
(項目190)
ステップ(d)において、リポフェクタミンまたは別のトランスフェクション試薬を前記増殖培地に添加することをさらに含む、項目189に記載の方法。
(項目191)
ステップ(d)が、約1.5~約4μL/mLの濃度でリポフェクタミンを添加することを含む、項目190に記載の方法。
(項目192)
タウ凝集陽性細胞の集団を生成する方法であって、
(a)項目188~191のいずれか一項に記載の方法に従って、培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む培地を生成することと、
(b)培養されたタウ凝集陽性細胞からの細胞溶解物を含む前記培地中でタウリピートドメインを含むタンパク質を含む細胞集団を培養することと、を含む、方法。
(項目193)
前記細胞集団が、前記馴化培地を生成するための前記方法で使用される前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、項目192に記載の方法。
(項目194)
前記タウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、項目192または193に記載の方法。
(項目195)
前記タウリピートドメインが、タウP301S変異を含む、項目192~194のいずれか一項に記載の方法。
(項目196)
前記タウリピートドメインが、タウ4リピートドメインを含む、項目192~195のいずれか一項に記載の方法。
(項目197)
前記タウリピートドメインが、配列番号11を含む、項目192~196のいずれか一項に記載の方法。
Claims (28)
- タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)Casタンパク質、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメイン、および第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインを含む細胞集団を提供することであって、
前記細胞が哺乳動物細胞であり、
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが蛍光タンパク質であり、前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対である、提供すること、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)ゲノムの編集および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記Casタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
(f)ステップ(c)での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記接触が、前記タウ播種剤の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み、前記タウ播種剤が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含み、前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に1日~7日間置いた後に採取され、
ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の破壊が、タウ凝集を増強する、方法。 - 前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、任意に、前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9タンパク質であり、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号21を含み、任意に、前記Casタンパク質が、配列番号22に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、または
前記Casタンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項1または2に記載の方法。 - 各ガイドRNAが、構成的エクソンを標的とし、任意に、各ガイドRNAが、5’構成的エクソンを標的とする、または
各ガイドRNAが、第1のエクソン、第2のエクソン、または第3のエクソンを標的とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - タウ凝集の遺伝的修飾因子をスクリーニングする方法であって、
(a)1つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含むキメラCasタンパク質と、1つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第1のレポーターに連結された第1のタウリピートドメインと、第2のレポーターに連結された第2のタウリピートドメインと、を含む細胞集団を提供することであって、
前記細胞が哺乳動物細胞であり、
前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが蛍光タンパク質であり、前記第1のレポーターおよび前記第2のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対である、提供することと、
(b)複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドRNAを含むライブラリを前記細胞集団に導入することと、
(c)転写活性化および拡大を可能にするために前記細胞集団を培養することであって、前記複数の固有のガイドRNAが、前記キメラCasタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらし、遺伝子修飾された細胞集団を生成する、培養することと、
(d)前記遺伝子修飾された細胞集団をタウ播種剤と接触させて、播種された細胞集団を生成することと、
(e)タウ凝集体の形成を可能にするために前記播種された細胞集団を培養することであって、前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインの凝集体が、前記播種された細胞集団のサブセットに形成されて、凝集陽性細胞集団を生成する、培養することと、
(f)ステップ(c)での前記遺伝子修飾された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団における前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することと、を含み、
前記接触が、前記タウ播種剤の存在下で、前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含み、前記タウ播種剤が、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する培養されたタウ凝集陽性細胞から採取された馴化培地を含み、前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に1日~7日間置いた後に採取され、
ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)で同定された前記凝集陽性細胞集団におけるガイドRNAの濃縮が、前記ガイドRNAによって標的とされた遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子であることを示し、前記ガイドRNAによって標的とされた前記遺伝子の転写活性化が、タウ凝集を増強する、方法。 - 前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、任意に、前記Casタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9タンパク質であり、
前記キメラCasタンパク質が、VP64転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、N末端からC末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Casタンパク質、核局在化シグナル、および前記VP64転写活性化因子ドメインを含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号36を含み、任意に、前記キメラCasタンパク質が、配列番号38に示される配列を含むコード配列によってコードされ、
前記アダプタータンパク質が、MS2コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記1つ以上の転写活性化ドメインが、p65転写活性化ドメインおよびHSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、N末端からC末端に、前記MS2コートタンパク質、核局在化シグナル、前記p65転写活性化ドメイン、および前記HSF1転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号37を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号39に示される配列を含むコード配列によってコードされる、
請求項5に記載の方法。 - 前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、または
前記キメラCasタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第1のレポーターに連結された前記第1のタウリピートドメイン、および前記第2のレポーターに連結された前記第2のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項5または6に記載の方法。 - 各ガイドRNAが、転写開始部位の200bp上流内のガイドRNA標的配列を標的とし、
各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる1つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドRNAが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる2つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第1のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第1のループ内にあり、第2のアダプター結合エレメントが、前記1つ以上のガイドRNAの各々の第2のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号33に示される配列を含み、
任意に、1つ以上のガイドRNAの各々が、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)部分に融合したCRISPR RNA(crRNA)部分を含む単一のガイドRNAであり、前記第1のループが、配列番号17の残基13~16に対応するテトラループであり、前記第2のループが、配列番号17の残基53~56に対応するステムループ2である、請求項5~7のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(c)が約3日~約9日であり、任意に、ステップ(c)が約6日である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記馴化培地が、コンフルエントなタウ凝集陽性細胞上に約4日間置いた後に採取された、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、約75%の馴化培地および約25%の新鮮な培地中で前記遺伝子修飾された細胞集団を培養することを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子修飾された細胞集団が、前記タウ凝集陽性細胞と共培養されない、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)が約2日~約6日であり、任意に、ステップ(e)が約4日である、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 存在量が次世代シーケンシングによって決定される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記ガイドRNAの存在量が、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、ガイドRNAが濃縮されているとみなされる、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)が、ステップ(c)の第1の時点および/またはステップ(c)の第2の時点で、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において前記複数の固有のガイドRNAの各々の存在量を決定することを含み、
任意に、ステップ(c)の前記第1の時点が、前記細胞集団を培養する第1の継代であり、前記第2の時点が、ゲノム編集および拡大または転写活性化および拡大を可能にするために、前記細胞集団の培養の途中であり、
任意に、ステップ(c)の前記第1の時点が、培養の約3日後であり、ステップ(c)の前記第2の時点が、培養の約6日後である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。 - (1)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とするガイドRNAの存在量が、ステップ(c)の前記第1の時点およびステップ(c)の前記第2の時点の両方で、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、および/または
(2)前記複数の固有のガイドRNAの合計集団に対する前記遺伝子を標的とする少なくとも2つの固有のガイドRNAの存在量が、ステップ(c)の前記第1の時点またはステップ(c)の前記第2の時点のいずれかで、ステップ(c)での前記培養された細胞集団に対して、ステップ(e)での前記凝集陽性細胞集団において少なくとも1.5倍高い場合、遺伝子がタウ凝集の遺伝的修飾因子とみなされ、前記遺伝子の破壊または転写活性化がタウ凝集を増強する、請求項16に記載の方法。 - 以下のステップ:
(1)ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団に、前記複数の固有のガイドRNAのうちのどれが存在するかを同定すること、
(2)式nCn’*(x-n’)C(m-n)/xCmを使用して、ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAが存在するランダム確率を計算することであって、
式中、xが、ステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
mが、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAであり、
nが、前記遺伝子を標的とするステップ(b)で前記細胞集団に導入された様々な固有のガイドRNAであり、
n’が、前記遺伝子を標的とする、ステップ(f)(1)で同定された様々な固有のガイドRNAである、計算すること、
(3)ステップ(f)(1)で同定された前記ガイドRNAの平均濃縮スコアを計算することであって、
ガイドRNAの前記濃縮スコアが、ステップ(e)で生成された前記凝集陽性細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量を、ステップ(c)での前記培養された細胞集団における前記ガイドRNAの相対存在量で割ったものであり、
相対存在量が、前記ガイドRNAの読み取りカウントを、前記複数の固有のガイドRNAの合計集団の読み取りカウントで割ったものである、計算すること、および
(4)前記遺伝子を標的とするガイドRNAが、存在する前記ランダム確率を大幅に下回り、濃縮スコアの閾値を上回っている場合に前記遺伝子を選択することが、タウ凝集の遺伝的修飾因子として遺伝子を同定するためにステップ(f)で施され、前記遺伝子の破壊または転写活性化が、タウ凝集を増強する、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、かつ/または
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含み、任意に、前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウP301S変異を含む、かつ/または
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、タウ4リピートドメインを含む、かつ/または
前記第1のタウリピートドメインおよび/または前記第2のタウリピートドメインが、配列番号11を含む、かつ/または
前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じである、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のタウリピートドメインおよび前記第2のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウP301S変異を含むタウ4リピートドメインを含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のレポーターが、シアン蛍光タンパク質(CFP)であり、前記第2のレポーターが、黄色蛍光タンパク質(YFP)である、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞であり、任意に、前記細胞が、HEK293T細胞である、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の固有のガイドRNAが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドRNAのうちの1つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の固有のガイドRNAが、100以上の遺伝子、1000以上の遺伝子、または10000以上の遺伝子を標的とする、または
前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化され、
任意に、少なくとも3つの標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化され、
任意に、約3~約6個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。 - 前記複数の固有のガイドRNAが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入され、
任意に、前記複数の固有のガイドRNAの各々が、別個のウイルスベクター内にあり、
任意に、前記複数の固有のガイドRNAが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入され、
任意に、前記細胞集団が、約0.3未満の感染多重度で感染する、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記複数の固有のガイドRNAが、選択マーカーと共に前記細胞集団に導入され、ステップ(b)が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含み、
任意に、前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与し、
任意に、前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンSデアミナーゼから選択される、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(b)において前記複数の固有のガイドRNAが導入される前記細胞集団が、固有のガイドRNAあたり約300個を超える細胞を含む、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。
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