RU2819350C2

RU2819350C2 - Скрининговая платформа crispr/cas для идентификации генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка

Info

Publication number: RU2819350C2
Application number: RU2021127294A
Authority: RU
Inventors: Марин ПРИССЕТТ; Мэттью КОСС; Вен Фьюри; Брайан Замбрович
Original assignee: Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2024-05-17

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающему в себя: обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, культивирование указанной популяции клеток, приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка, культивирование указанной засеянной популяции клеток, а также определение содержания каждой из указанного множества гидовых РНК. Также раскрыт способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя: обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, культивирование указанной популяции клеток, приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка, культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием положительной в отношении агрегации популяции клеток, а также определение содержания каждой из указанного множества гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток. Изобретение эффективно для скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 29 ил., 6 табл., 8 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет относительно заявки США 62/820086, поданной 18 марта 2019 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в полном ее объеме и для всех целей.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ПОСРЕДСТВОМ EPS WE В

[0002] Перечень последовательностей записан в файле 544635SEQLIST.txt, имеющем размер 75,7 килобайт, был создан 16 марта 2020 г. и включен в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Аномальная агрегация или фибриллизация белков является определяющим признаком многих заболеваний, в частности, ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), лобно-височная деменция (ЛВД), боковой амиотрофический склероз (БАС), хроническая травматическая энцефалопатия (ХТЭ), болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ) и другие. Во многих из данных заболеваний фибриллизация определенных белков в нерастворимые агрегаты является не только характерным признаком заболевания, но также считается причинным фактором нейротоксичности. Кроме того, данные заболевания характеризуются распространением совокупной патологии через центральную нервную систему в соответствии со стереотипными паттернами процессом, который коррелирует с прогрессированием заболевания. Таким образом, идентификация генов и генетических путей, которые модифицируют процессы аномальной агрегации белков или распространения агрегатов от клетки к клетке, имеет большое значение для лучшего понимания этиологии нейродегенеративных заболеваний, а также для разработки стратегий терапевтического вмешательства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] В данном документе представлены способы скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, способы получения кондиционированной среды для индукции агрегации тау-белка или для сенсибилизации к ней и способы создания популяции клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка. В данном документе также представлены биосенсорные клетки Cas-тау или популяции таких клеток, а также in vitro культуры биосенсорных клеток Cas-тау и кондиционированная среда. Также в данном документе представлены биосенсорные клетки CRISPR/Cas медиатора синергической активации (SAM)-Tay или популяции таких клеток, а также in vitro культуры биосенсорных клеток SAM-тау и кондиционированная среда.

[0005] В одном аспекте представлены способы скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка. Некоторые из таких способов (CRISPRn) могут включать в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным белком Cas, а указанный белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток; (d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток; (е) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием положительной в отношении агрегации популяции клеток; и (f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной генетически модифицированной популяцией клеток из стадии (с), при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что указанное нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

[0006] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[0007] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[0008] В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[0009] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. Необязательно, белок Cas содержат последовательность с SEQ ID NO: 21. Необязательно, белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

[0010] В некоторых из таких способов белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0011] В некоторых из таких способов клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T.

[0012] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов. В некоторых из таких способов указанная библиотека представляет собой полногеномную библиотеку.

[0013] В некоторых способах нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей (например, на около трех, на около четырех или на около шести) в каждом из целевого множества генов.

[0014] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон. Необязательно, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

[0015] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции. Необязательно, каждое из множества уникальных гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе. Необязательно, множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции. В некоторых из таких способов популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

[0016] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы, бластицидин-S-дезаминазы и белка устойчивости к блеомицину.

[0017] В некоторых из таких способов популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят множество уникальных гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на уникальную гидовую РНК.

[0018] В некоторых из таких способов стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 9 суток. Необязательно, стадия (с) имеет продолжительность около 6 суток.

[0019] В некоторых из таких способов стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии кондиционированной среды, собранной от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток. Необязательно, стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды. В некоторых из таких способов указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[0020] В некоторых из таких способов стадия (е) имеет продолжительность от около 2 суток до около 6 суток. Необязательно, стадия (е) имеет продолжительность около 4 суток. В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), и положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (е) идентифицируется с помощью проточной цитометрии.

[0021] В некоторых из таких способов содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения. В некоторых из таких способов гидовая РНК считается обогащенной, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с).

[0022] В некоторых из таких способов стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени на стадии (с) и (или) во второй момент времени на стадии (с). Необязательно, первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Необязательно, первый момент времени на стадии (с) наступает после около трех суток культивирования, а второй момент времени на стадии (с) наступает после около шести суток культивирования.

[0023] В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена усиливает агрегацию тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена, как ожидается, усиливает агрегацию тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) как в первый момент времени на стадии (с), так и во второй момент времени на стадии (с); и (или) (2) содержание по меньшей мере двух уникальных гидовых РНК, нацеленных на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) либо в первый момент времени на стадии (с), либо во второй момент времени на стадии (с).

[0024] В некоторых из таких способов на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена усиливает агрегацию тау-белка (или как потенциального генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена, как ожидается, усиливает агрегацию тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной культивируемой популяции клеток на стадии (с), и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

[0025] Некоторые из таких способов (CRISPRa) могут включать в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, содержащий адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерным белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов с образованием генетически модифицированной популяции клеток; (d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток; (е) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения популяции положительных в отношении агрегации клеток; и (f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной генетически модифицированной популяцией клеток из стадии (с), при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что указанная активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

[0026] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[0027] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[0028] В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[0029] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно при этом указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В некоторых из таких способов адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2 и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 36, необязательно при этом указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38. В некоторых из таких способов химерный адаптерный белок содержит последовательность с SEQ ID NO: 37, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

[0030] В некоторых из таких способов химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0031] В некоторых из таких способов клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T.

[0032] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов. В некоторых из таких способов указанная библиотека представляет собой полногеномную библиотеку.

[0033] В некоторых способах нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей (например, на около трех, на около четырех или на около шести) в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на около трех целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[0034] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Необязательно, адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. В некоторых из таких способов каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-РНК (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-РНК (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13-16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из последовательности с SEQ ID NO: 17.

[0035] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции. Необязательно, каждое из множества уникальных гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе. Необязательно, множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции. В некоторых из таких способов популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

[0036] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы, бластицидин-S-дезаминазы и белка устойчивости к блеомицину.

[0037] В некоторых из таких способов популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят множество уникальных гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на уникальную гидовую РНК.

[0038] В некоторых из таких способов стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 9 суток. Необязательно, стадия (с) имеет продолжительность около 6 суток.

[0039] В некоторых из таких способов стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии кондиционированной среды, собранной от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток. Необязательно, стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды. В некоторых из таких способов указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[0040] В некоторых из таких способов стадия (е) имеет продолжительность от около 2 суток до около 6 суток. Необязательно, стадия (е) имеет продолжительность около 4 суток. В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), и положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (е) идентифицируется с помощью проточной цитометрии.

[0041] В некоторых из таких способов содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения. В некоторых из таких способов гидовая РНК считается обогащенной, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с).

[0042] В некоторых из таких способов стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени на стадии (с) и (или) во второй момент времени на стадии (с). Необязательно, первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Необязательно, первый момент времени на стадии (с) наступает после около трех суток культивирования, а второй момент времени на стадии (с) наступает после около шести суток культивирования.

[0043] В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена усиливает агрегацию тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена, как ожидается, усиливает агрегацию тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) как в первый момент времени на стадии (с), так и во второй момент времени на стадии (с); и (или) (2) содержание по меньшей мере двух уникальных гидовых РНК, нацеленных на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) либо в первый момент времени на стадии (с), либо во второй момент времени на стадии (с).

[0044] В некоторых из таких способов на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена усиливает агрегацию тау-белка (или как потенциального генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена, как ожидается, усиливает агрегацию тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы nCn' * (х-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной культивируемой популяции клеток на стадии (с), и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

[0045] В другом аспекте представлены дополнительные способы скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка. Некоторые из таких способов (CRISPRn) могут включать в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с белком Cas, а белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток; (d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток; (е) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в первой субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения популяции положительных в отношении агрегации клеток и не образуются во второй субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения популяции отрицательных в отношении агрегации клеток; и (f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, и (или) при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

[0046] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких способов белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 21, необязательно при этом указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

[0047] В некоторых из таких способов белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0048] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон. Необязательно, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

[0049] Некоторые из таких способов (CRISPRa) включают в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, содержащий адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерный белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной генной экспрессии с образованием генетически модифицированной популяции клеток; (d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток; (е) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в первой субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения популяции положительных в отношении агрегации клеток и не образуются во второй субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения популяции отрицательных в отношении агрегации клеток; и (f) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, и (или) при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (е), и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

[0050] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно при этом указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В некоторых из таких способов адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2 и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 36, необязательно при этом указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38. В некоторых из таких способов химерный адаптерный белок содержит последовательность с SEQ ID NO: 37, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

[0051] В некоторых из таких способов химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0052] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Необязательно, адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. Необязательно, каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-РНК (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-РНК (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13 - 16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из последовательности с SEQ ID NO: 17.

[0053] В некоторых из таких способов стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 13 суток. В некоторых из таких способов стадия (с) имеет продолжительность от около 7 суток до около 10 суток, имеет продолжительность около 7 суток или имеет продолжительность около 10 суток.

[0054] В некоторых из таких способов стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Необязательно, клеточный лизат в среде находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл. В некоторых из таких способов среда, содержащая клеточный лизат, дополнительно содержит липофектамин или другой реагент для трансфекции. Необязательно, среда, содержащая клеточный лизат, содержит липофектамин в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл. В некоторых из таких способов указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[0055] В некоторых из таких способов стадия (е) имеет продолжительность от около

1 суток до около 3 суток. Необязательно, стадия (е) имеет продолжительность около 2 суток. В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), а положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток и отрицательная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (е) идентифицируются с помощью проточной цитометрии. В некоторых из таких способов содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения.

[0056] В некоторых из таких способов гидовая РНК считается обогащенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), или при этом гидовая РНК считается обогащенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и (или) указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d).

[0057] В некоторых из таких способов стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени, и (или) при этом стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени. Необязательно, первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток. Необязательно, первый момент времени на стадии (с) наступает после около 3 суток культивирования, а второй момент времени на стадии (с) наступает после около 7 суток культивирования или после около 10 суток культивирования.

[0058] В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает агрегацию тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, предотвращает агрегацию тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени. В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует или усиливает агрегацию тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени; и (или) (4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е) и указанной засеянной популяцией клеток из стадии (d) во второй момент времени. [0059] В некоторых из таких способов на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает агрегацию тау-белка (или как потенциального генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена, как ожидается, предотвращает агрегацию тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), или указанной засеянной популяции клеток, полученной на стадии (d), и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. В некоторых из таких способов на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка (или как потенциального генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует или усиливает агрегацию тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы nCn' * (х-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), или указанной засеянной популяции клеток, полученной на стадии (d), и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

[0060] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[0061] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[0062] В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[0063] В некоторых из таких способов клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T.

[0064] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов. В некоторых из таких способов указанная библиотека представляет собой полногеномную библиотеку.

[0065] В некоторых способах нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей (например, на около трех, на около четырех или на около шести) в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на около трех целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[0066] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции. Необязательно, каждое из множества уникальных гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе. Необязательно, множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции. В некоторых из таких способов популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

[0067] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы, бластицидин-S-дезаминазы и белка устойчивости к блеомицину.

[0068] В некоторых из таких способов популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят множество уникальных гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на уникальную гидовую РНК.

[0069] В другом аспекте представлены способы скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации и (или) дезагрегации тау-белка. Некоторые из таких способов (CRISPRn) включают в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, при этом указанные клетки являются положительными в отношении агрегации тау-белка клетками, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с белком Cas, а белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток, и при этом указанное культивирование приводит к образованию положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток; (d) идентификацию указанной положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и указанной отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток; и (е) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, и (или) при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

[0070] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких способов белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 21, необязательно при этом указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

[0071] В некоторых из таких способов белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0072] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон. Необязательно, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

[0073] Некоторые из таких способов (CRISPRa) включают в себя: (а) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, содержащий адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, при этом указанные клетки являются положительными в отношении агрегации тау-белка клетками, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии; (b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов; (с) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерным белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной генной экспрессии с образованием генетически модифицированной популяции клеток, и при этом указанное культивирование приводит к образованию положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток; (d) идентификацию указанной положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и указанной отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток; и (е) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), и (или) определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), при этом обогащение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), или при этом истощение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, и (или) при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), или при этом истощение гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, идентифицированной на стадии (d), и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, способствует или усиливает агрегацию тау-белка.

[0074] В некоторых из таких способов белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно при этом указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В некоторых из таких способов адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2 и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В некоторых из таких способов химерный белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 36, необязательно при этом указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38. В некоторых из таких способов химерный адаптерный белок содержит последовательность с SEQ ID NO: 37, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

[0075] В некоторых из таких способов химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток. В некоторых из таких способов нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

[0076] В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции. В некоторых из таких способов каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. Необязательно, первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Необязательно, адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. Необязательно, каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-РНК (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-РНК (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13 - 16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53 - 56 из последовательности с SEQ ID NO: 17.

[0077] В некоторых из таких способов стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 14 суток. Необязательно, стадия (с) имеет продолжительность от около 10 суток до около 14 суток или от около 12 суток до около 14 суток.

[0078] В некоторых из таких способов стадия (d) включает в себя синхронизацию прохождения клеточного цикла для получения популяции клеток, преимущественно обогащенной в S-фазе. Необязательно, указанная синхронизация достигается с помощью двойного тимидинового блока.

[0079] В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), а положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток и отрицательная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток на стадии (d) идентифицируются с помощью проточной цитометрии. В некоторых из таких способов содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения.

[0080] В некоторых из таких способов гидовая РНК считается обогащенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), или при этом гидовая РНК считается обогащенной в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с), и при этом гидовая РНК считается истощенной в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d), если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и (или) указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени из стадии (с).

[0081] В некоторых из таких способов стадия (е) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени, и (или) при этом стадия (е) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (е), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени. Необязательно, первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток или активации транскрипции и увеличения числа клеток. Необязательно, первый момент времени на стадии (c) наступает после около 7 суток культивирования, а второй момент времени на стадии (с) наступает после около 10 суток культивирования.

[0082] В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует дезагрегации тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует дезагрегации тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени. В некоторых из таких способов ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка (или потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует или усиливает агрегацию тау-белка), если: (1) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (2) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (3) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d), указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени; и (или) (4) содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (d) по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток из стадии (d) и указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) во второй момент времени.

[0083] В некоторых из таких способов на стадии (е) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует дезагрегации тау-белка (или как потенциального генетического модификатора дезагрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует дезагрегации тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), или культивируемой популяции клеток из стадии (с) в первый момент времени или во второй момент времени, и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. В некоторых из таких способов на стадии (е) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует или усиливает агрегацию тау-белка (или как потенциального генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции данного гена, как ожидается, способствует или усиливает агрегацию тау-белка): (1) идентификация того, какие гидовые РНК из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d); (2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где x представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), где m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), где n представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на данный ген, и где n' представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), которые нацелены на данный ген; (3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (е) (1), при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (d), или культивируемой популяции клеток из стадии (с) в первый момент времени или во второй момент времени, и при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК; и (4) выбор данного гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

[0084] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[0085] В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких способов первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[0086] В некоторых из таких способов первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[0087] В некоторых из таких способов клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T.

[0088] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов. В некоторых из таких способов указанная библиотека представляет собой полногеномную библиотеку.

[0089] В некоторых способах нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей (например, на около трех, на около четырех или на около шести) в каждом из целевого множества генов. Необязательно, нацеливание происходит в среднем на около трех целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[0090] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции. Необязательно, каждое из множества уникальных гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе. Необязательно, множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции. В некоторых из таких способов популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

[0091] В некоторых из таких способов множество уникальных гидовых РНК вводят в популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству. Необязательно, маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы. Необязательно, маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы, бластицидин-S-дезаминазы и белка устойчивости к блеомицину.

[0092] В некоторых из таких способов популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят множество уникальных гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на уникальную гидовую РНК.

[0093] В другом аспекте представлены биосенсорные клетки Cas-тау или популяции таких клеток. Некоторые из таких клеток включают в себя популяцию из одной или большего числа клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером.

[0094] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[0095] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[0096] В некоторых из таких клеток первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[0097] В некоторых из таких клеток белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. Необязательно, белок Cas содержат последовательность с SEQ ID NO: 21. Необязательно, белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

[0098] В некоторых из таких клеток белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в указанной клетке. В некоторых из таких клеток нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в указанную клетку.

[0099] В некоторых из таких клеток клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T. Некоторые из таких клеток находятся in vitro.

[00100] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, не присутствуют стабильно в агрегированном состоянии. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, присутствуют стабильно в агрегированном состоянии.

[00101] В другом аспекте представлены культуры in vitro биосенсорных клеток Cas-тау и кондиционированная среда. Некоторые такие культуры in vitro включают в себя любую из популяций клеток, описанных выше или в другой части данного документа, и культуральную среду, содержащую кондиционированную среду, собранную от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00102] В некоторых таких культурах in vitro кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток.

[00103] В некоторых таких культурах in vitro культуральная среда содержит около 75% кондиционированной среды и около 25% свежей среды. В некоторых таких культурах in vitro популяцию клеток не культивируют совместно с культивируемыми клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00104] В другом аспекте представлены биосенсорные клетки SAM-тау или популяции таких клеток. Некоторые из таких клеток включают в себя популяцию из одной или большего числа клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером.

[00105] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации. Необязательно, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S.

[00106] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

[00107] В некоторых из таких клеток первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки. Необязательно, первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Необязательно, первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

[00108] В некоторых из таких клеток белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых из таких клеток химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно при этом указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В некоторых из таких клеток адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2 и при этом один или большее число доменов активации транскрипции в химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В некоторых из таких клеток химерный белок Cas содержит последовательность с SEQ ID NO: 36, необязательно при этом указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38. В некоторых из таких клеток химерный адаптерный белок содержит последовательность с SEQ ID NO: 37, необязательно при этом указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

[00109] В некоторых из таких клеток химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в указанной клетке. В некоторых из таких клеток нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в указанную клетку.

[00110] В некоторых из таких клеток клетки представляют собой эукариотические клетки. Необязательно, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетки представляют собой клетки человека. Необязательно, клетки представляют собой клетки HEK293T. Некоторые из таких клеток находятся in vitro.

[00111] В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, не присутствуют стабильно в агрегированном состоянии. В некоторых из таких клеток первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, присутствуют стабильно в агрегированном состоянии.

[00112] В другом аспекте представлены культуры in vitro биосенсорных клеток SAM-тау и кондиционированная среда. Некоторые такие культуры in vitro включают в себя любую из популяций клеток, описанных выше или в другой части данного документа, и культуральную среду, содержащую кондиционированную среду, собранную от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00113] В некоторых таких культурах in vitro кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от около 1 суток до около 7 суток. Необязательно, кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток.

[00114] В некоторых таких культурах in vitro культуральная среда содержит около 75% кондиционированной среды и около 25% свежей среды. В некоторых таких культурах in vitro популяцию клеток не культивируют совместно с культивируемыми клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00115] В другом аспекте предоставлены культуры in vitro биосенсорных клеток Cas-тау или биосенсорных клеток SAM-тау и культуральная среда, содержащая клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Некоторые такие культуры in vitro включают в себя любую из популяций клеток, описанных выше или в другой части данного документа.

[00116] В некоторых таких культурах in vitro клеточный лизат в среде находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл. В некоторых таких культурах in vitro среда, содержащая клеточный лизат, дополнительно содержит липофектамин или другой реагент для трансфекции. Необязательно, среда, содержащая клеточный лизат, содержит липофектамин в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл. В некоторых таких культурах in vitro клеточный лизат получали с помощью воздействия ультразвуком на указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки в течение от около 2 минут до около 4 минут после сбора клеток в буфере, содержащем ингибиторы протеаз.

[00117] В другом аспекте представлены способы получения кондиционированной среды для индукции агрегации тау-белка или сенсибилизации к ней. Некоторые из таких способов включают в себя: (а) обеспечение популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии; (b) культивирование указанной популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток в среде для получения кондиционированной среды; и (с) сбор указанной кондиционированной среды.

[00118] В некоторых из таких способов указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки культивируют на стадии (b) до конфлюентности. Необязательно, кондиционированную среду собирают после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, на стадии (с) в течение от около 1 суток до около 7 суток. Необязательно, кондиционированную среду собирают после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, на стадии (с) в течение около 4 суток.

[00119] В другом аспекте представлены способы создания популяции клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка. Некоторые из таких способов включают в себя: (а) получение кондиционированной среды для индукции агрегации тау-белка в соответствии с любым из способов, описанных выше или в другой части данного документа; и (b) культивирование популяции клеток, содержащих белок, который содержит домен тау-белка, содержащий повторы, в культуральной среде, содержащей кондиционированную среду, для получения популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток.

[00120] В некоторых из таких способов культуральная среда содержит около 75% кондиционированной среды и около 25% свежей среды. В некоторых из таких способов популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, используемыми в способе получения кондиционированной среды.

[00121] В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию, способствующую агрегации. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию тау-белка P301S. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11.

[00122] В другом аспекте представлены способы получения среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, для индукции агрегации тау-белка. Некоторые из таких способов включают в себя: (а) обеспечение популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии; (b) сбор указанных положительных в отношении агрегации тау-белка клеток в буфере, содержащем ингибиторы протеаз; (с) воздействие ультразвуком на указанные положительные в отношении агрегации тау-белка клетки в течение от около 2 минут до около 4 минут для получения указанного клеточного лизата; и (d) добавление указанного клеточного лизата к среде для выращивания клеток.

[00123] В некоторых из таких способов клеточный лизат в среде для выращивания клеток находится в концентрации, составляющей от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл. Некоторые из таких способов дополнительно включают в себя добавление липофектамина или другого реагента для трансфекции в среду для выращивания клеток на стадии (d). Необязательно, стадия (d) включает в себя добавление липофектамина в концентрации, составляющей от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл.

[00124] В другом аспекте представлены способы создания популяции клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка. Некоторые из таких способов включают в себя: (а) получение среды, содержащей клеточный лизат из культивируемых положительных в отношении агрегации тау-белка клеток в соответствии с любым из указанных выше способов; и (b) культивирование популяции клеток, содержащих белок, который содержит домен тау-белка, содержащий повторы, в среде, содержащей клеточный лизат из культивируемых положительных в отношении агрегации тау-белка клеток.

[00125] В некоторых из таких способов популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, используемыми в способе получения кондиционированной среды.

[00126] В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию, способствующую агрегации. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит мутацию тау-белка P301S. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержит домен тау-белка с четырьмя повторами. В некоторых из таких способов содержащий повторы домен тау-белка содержат последовательность с SEQ ID NO: 11.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[00127] На фиг. 1 (не в масштабе) представлено схематическое изображение изоформы тау-белка 2N4R. Линии тау-биосенсоров включают в себя только тау-4RD-YFP и тау-4RD-CFP в качестве трансгенов, но не полный 2N4R.

[00128] На фиг. 2 представлено схематическое изображение того, как образование агрегатов отслеживается с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в линиях клеток-биосенсоров тау-белка. Белок тау^4RD-CFP возбуждается фиолетовым светом и излучает синий свет. Слитый белок тау^4RD-YFP возбуждается синим светом и излучает желтый свет.Если агрегации нет, то возбуждение фиолетовым светом не приведет к FRET. Если есть агрегация тау-белка, то возбуждение фиолетовым светом приведет к FRET и излучению желтого света.

[00129] На фиг. 3А показана относительная экспрессия иРНК Cas9 в клонах биосенсорных клеток тау^4RD-CFP/ тау^4RD-YFP (TCY), трансдуцированных лентивирусными экспрессионными конструкциями для Cas9, по сравнению с клоном Cas9Hl, который представляет собой ранее выделенный контрольный клон TCY с недостаточной экспрессией Cas9.

[00130] На фиг. 3В показана эффективность разрезания локуса PERK и локуса SNCA в клонах TCY Cas9 через трое и семеро суток после трансдукции с использованием единых гидовых РНК (егРНК, англ. «sgRNA»), нацеленных па PERK и SNCA, соответственно.

[00131] На фиг. 4 представлено схематическое изображение стратегии нарушения целевых генов в биосенсорной клетке TCY Cas9 с использованием полногеномной библиотеки егРНК CRISPR/Cas9.

[00132] На фиг. 5 представлено схематическое изображение получения субклонов тау^4RD-YFP, положительных относительно агрегации тау-белка (Аг[+]), содержащих стабильно распространяющиеся агрегаты тау-белка, когда клетки тау^4RD-YFP засеяны фибриллами тау^4RD. Также представлено изображение, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии, на котором показан субклон с агрегатами тау-белка.

[00133] На фиг. 6 представлено схематическое изображение того, что кондиционированная среда от субклонов тау^4RD-YFP Аг[+], собранная через трое суток от конфлюэнтных клеток, может обеспечить источник активности по агрегации тау-белка, тогда как среда от субклонов тау^4RD-YFP Аг[-] такой активности не обеспечивает. Кондиционированную среду наносили на клетки-реципиенты в виде смеси, состоящей из 75% кондиционированной среды и 25% свежей среды. Для каждого из данных клонов показаны изображения, полученные с помощью анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). На оси x отображен CFP (возбуждение лазером при 405 нм), а на оси у - FRET (возбуждение от излучения CFP). Верхний правый квадрант является FRET[+], нижний правый квадрант -CFP[+], а нижний левый квадрант является дважды отрицательным.

[00134] На фиг. 7 представлено схематическое изображение стратегии полногеномного нуклеазного скрининга CRISPR (CRISPRn) для идентификации генов-модификаторов, которые способствуют агрегации тау-белка.

[00135] На фиг. 8 представлено схематическое изображение концепций содержания и обогащения для анализов по технологии секвенирования нового поколения (СНП, англ. «NGS») с использованием полногеномного скрининга CRISPRn.

[00136] На фиг. 9 представлено схематическое изображение схемы вторичного скрининга в отношении целевых генов 1-14, идентифицированных при полногеномном скрининге генов-модификаторов, которые способствуют агрегации тау-белка.

[00137] На фиг. 10 представлен график, показывающий индукцию FRET кондиционированной средой, способствующей агрегации тау-белка, в биосенсорных клетках TCY Cas9, трансдуцированных лентивирусными экспрессионными конструкциями для егРНК, нацеленных на целевые гены 1-14. Вторичный скрининг подтвердил, что целевые гены 2 и 8 модулируют восприимчивость клеток к засеву / агрегации тау-белка.

[00138] На фиг. 11 представлены изображения, полученные с помощью анализа FACS для биосенсорных клеток TCY Cas9, трансдуцированных лентивирусными экспрессионными конструкциями для rPHKl целевого гена 2, гРНК5 целевого гена 8, ненацеленной гРНК и без гРНК (гРНК гидовая РНК, англ. «gRNA»). Клетки культивировали в кондиционированной среде или свежей среде. На оси x отображен CFP (возбуждение лазером при 405 нм), а на оси у FRET (возбуждение от излучения CFP). Верхний правый квадрант является FRET[+], нижний правый квадрант CFP[+], а нижний левый квадрант является дважды отрицательным. Нарушение целевого гена 2 или 8 увеличивает образование агрегатов тау-белка в ответ на кондиционированную среду, способствующей агрегации тау-белка, но не в ответ на свежую среду.

[00139] На фиг. 12 представлено схематическое изображение схемы вторичного скрининга в биосенсорных клетках TCY Cas9, трансдуцированных лентивирусными экспрессионными конструкциями для егРНК, нацеленных на целевые гены 2 и 8, включая анализ экспрессии иРНК, анализ экспрессии белка и анализ FRET. Две егРНК использовали против целевого гена 2 (g1 и g3), одну егРНК использовали против целевого гена 8 (g5), а ненацеленную егРНК (g3) использовали в качестве ненацеленного контроля.

[00140] На фиг. 13 показана относительная экспрессия целевого гена 2 и целевого гена 8 в биосенсорных клетках TCY Cas9, определенная с помощью кПЦР-РВ на 6-е сутки после трансдукции лентивирусными экспрессионными конструкциями для егРНК.

[00141] На фиг. 14 показана экспрессия белка 2 (кодируемого целевым геном 2) и белка 8 (кодируемого целевым геном 8) в биосенсорных клетках TCY Cas9, определенная с помощью вестерн-блоттинга на 13-е сутки после трансдукции лентивирусными экспрессионными конструкциями для егРНК.

[00142] На фиг. 15 показана агрегация тау-белка, измеренная на основании процентного содержания клеток FRET[+] в биосенсорных клетках TCY Cas9 на 10-е сутки после трансдукции лентивирусными экспрессионными конструкциями для егРНК. Липофектамин не применялся.

[00143] На фиг. 16 показана экспрессия целевого гена 2 и целевого гена 8 в клонах клеток TCY Cas9 с нокдауном, определенная с помощью вестерн-блоттинга.

[00144] На фиг. 17 показана экспрессия агрегации тау-белка в клонах клеток TCY Cas9 с нокдауном целевого гена 2 и целевого гена 8, определенная на основании FRET.

[00145] На фиг. 18 показаны экспрессия целевого гена 2 и целевого гена 8 в клонах клеток TCY Cas9 с нокдауном, определенная с помощью вестерн-блоттинга, и фосфорилирование тау-белка в положениях S262 и S356 в указанных клонах, определенное с помощью вестерн-блоттинга.

[00146] На фиг. 19 показано, что лизат из цельных клеток клона 18 тау-YFP Аг[+] способен индуцировать агрегацию тау-белка и сигнал FRET в клетках-биосенсорах тау-белка. Были исследованы различные количества лизата из цельных клеток, а также были исследованы различные условия обработки ультразвуком для получения лизата.

[00147] На фиг. 20 показано, что лизат из цельных клеток клона 18 тау-YFP Аг[+] способен индуцировать агрегацию тау-белка и сигнал FRET в клетках-биосенсорах тау-белка. Были исследованы различные количества лизата из цельных клеток, а также были исследованы различные количества липофектамина.

[00148] На фиг. 21 показано, что лизат из цельных клеток клона 18 тау-YFP Аг[+] способен индуцировать агрегацию тау-белка и сигнал FRET в клетках-биосенсорах тау-белка, а лизат из цельных клеток клонов Аг[-] такой способности не имеет.Были исследованы различные количества лизата из цельных клеток, а также были исследованы различные количества липофектамина.

[00149] На фиг. 22 представлено схематическое изображение стратегии полногеномного нуклеазного скрининга CRISPR (CRISPRn) для идентификации генов-модификаторов, которые препятствуют агрегации тау-белка.

[00150] Фиг. 23 представляет собой график, показывающий идентификацию генов с однозначно обогащенными егРНК в образцах FRET[-].

[00151] Фиг. 24 представляет собой график, показывающий идентификацию генов с однозначно истощенными егРНК в образцах FRET[-].

[00152] На фиг. 25 представлено схематическое изображение стратегии вторичного скрининга для подтверждения идентифицированных генов-модификаторов, которые препятствуют агрегации тау-белка.

[00153] На фиг. 26 представлено схематическое изображение стратегии полногеномного активирующего скрининга CRISPR (CRISPRa) для идентификации генов-модификаторов, которые препятствуют агрегации тау-белка.

[00154] На фиг. 27 представлено схематическое изображение стратегии полногеномного нуклеазного скрининга CRISPR (CRISPRn) для идентификации генов-модификаторов, которые способствуют дезагрегации тау-белка.

[00155] На фиг. 28 показано гейтирование, используемое для сортировки популяций клеток Аг[+], вкрапления[+] и Аг[-].

[00156] На фиг. 29 представлено схематическое изображение стратегии тимидинового блока в полногеномном нуклеазном скрининге CRISPR (CRISPRn) для идентификации генов-модификаторов, которые способствуют дезагрегации тау-белка.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[00157] Термины «белок», «полипептид» и «пептид», используемые в контексте данного документа взаимозаменяемо, включают в себя полимерные формы любой длины, состоящие из аминокислот, включая кодируемые и некодируемые аминокислоты, и химически или биохимически модифицированные либо дериватизированные аминокислоты. Данные термины также включают в себя модифицированные полимеры, такие как полипептиды, имеющие модифицированные пептидные каркасы. Термин «домен» относится к любой части белка или полипептида, имеющей конкретную функцию или структуру.

[00158] Указывают, что у белков есть «N-конец» и «С-конец». Термин «N-конец» относится к началу белка или полипептида, оканчивающемуся аминокислотой со свободной аминогруппой (-NH2). Термин «С-конец» относится к концу аминокислотной цепи (белка или полипептида), оканчивающейся свободной карбоксильной группой (-СООН).

[00159] Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид», используемые в контексте данного документа взаимозаменяемо, включают в себя полимерные формы любой длины, состоящие из нуклеотидов, включая рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или их аналоги либо их модифицированные версии. Они включают в себя одно-, двух- и многоцепочечные ДНК или РНК, геномные ДНК, кДНК, гибриды ДНК РНК и полимеры, содержащие пуриновые основания, пиримидиновые основания или другие встречающиеся в природе, химически модифицированные, биохимически модифицированные, не встречающиеся в природе или дериватизированные нуклеотидные основания.

[00160] Указывают, что нуклеиновые кислоты имеют «5'-концы» и «3'-концы», потому что мононуклеотиды реагируют с образованием олигонуклеотидов таким образом, что 5'-фосфат одного пентозного кольца мононуклеотида присоединяется к 3'-кислороду соседнего мононуклеотида в одном направлении через фосфодиэфирную связь. Конец олигонуклеотида называется «5'-концом», если его 5'-фосфат не связан с 3'-кислородом пентозного кольца мононуклеотида. Конец олигонуклеотида называется «3'-концом», если его 3'-кислород не связан с 5'-фосфатом другого пентозного кольца мононуклеотида. Можно сказать, что последовательность нуклеиновой кислоты, даже если она находится внутри по отношению к более крупному олигонуклеотиду, имеет 5'- и 3'-концы. Либо в линейной, либо в кольцевой молекуле ДНК дискретные элементы упоминаются как «расположенные в направлении к 5'» или «расположенные в направлении к 3'».

[00161] Термин «геномно интегрированный» относится к нуклеиновой кислоте, которая была введена в клетку таким образом, что данная нуклеотидная последовательность интегрировалась в геном данной клетки. Для стабильного включения нуклеиновой кислоты в геном клетки можно использовать любой протокол.

[00162] Термин «нацеливающий вектор» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая может быть введена в целевое положение в геноме клетки путем гомологичной рекомбинации, лигирования, опосредованного негомологичным соединением концов, или любым другим способом рекомбинации.

[00163] Термин «вирусный вектор» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая включает в себя по меньшей мере один элемент вирусного происхождения и включает в себя элементы, достаточные для упаковки в частицу вирусного вектора или допускающие указанную упаковку. Вектор и (или) частица могут быть использованы с целью переноса ДНК, РНК или других нуклеиновых кислот в клетки либо ex vivo, либо in vivo. Известны многочисленные формы вирусных векторов.

[00164] Термин «дикий тип» включает в себя реально существующие объекты, имеющие структуру и (или) активность, как обнаруживается в нормальном (в отличие от мутантного, болезненного, измененного и т.д.) состоянии или контексте. Гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

[00165] Термин «эндогенная последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в природе внутри клетки или организма. Например, эндогенная последовательность МАРТ клетки или организма относится к нативной последовательности МАРТ, которая естественным образом встречается в локусе МАРТ внутри клетки или организма.

[00166] «Экзогенные» молекулы или последовательности включают в себя молекулы или последовательности, которые обычно не присутствуют в клетке в данной форме. Нормальное присутствие включает в себя присутствие в зависимости от конкретной стадии развития и условий окружающей среды клетки. Экзогенная молекула или последовательность, например, может включать в себя мутированную версию соответствующей эндогенной последовательности внутри клетки, такую как гуманизированная версия эндогенной последовательности, или может включать в себя последовательность, соответствующую эндогенной последовательности внутри клетки, но в другой форма (т.е. не в хромосоме). Напротив, эндогенные молекулы или последовательности включают в себя молекулы или последовательности, которые обычно присутствуют в данной форме в конкретной клетке на конкретной стадии развития в определенных условиях окружающей среды.

[00167] Термин «гетерологичный» при использовании в контексте нуклеиновой кислоты или белка, указывает на то, что данная нуклеиновая кислота или данный белок содержат по меньшей мере два сегмента, которые в природе не встречаются вместе в одной и той же молекуле. Например, термин «гетерологичный», когда он используется в отношении сегментов нуклеиновой кислоты или сегментов белка, указывает, что данная нуклеиновая кислота или данный белок содержат две или большее число субпоследовательностей, которые не находятся в такой взаимосвязи друг с другом (например, соединенные вместе) в природе. В качестве одного примера, «гетерологичная» область вектора нуклеиновой кислоты представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты внутри другой молекулы нуклеиновой кислоты или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, который не обнаруживается в ассоциации с указанной другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область вектора нуклеиновой кислоты может включать в себя кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, не обнаруживаемыми в ассоциации с указанной кодирующей последовательностью в природе. Аналогичным образом, «гетерологичная» область белка представляет собой сегмент из аминокислот внутри другой молекулы белка или присоединенный к другой молекуле белка, не обнаруживаемый в ассоциации с указанной другой молекулой белка в природе (например, слитый белок или белок с меткой). Подобным образом, нуклеиновая кислота или белок могут содержать гетерологичную метку или гетерологичную последовательность секреции или локализации.

[00168] Термин «локус» относится к конкретному местоположению гена (или значимой последовательности), последовательности ДНК, последовательности, кодирующей полипептид, или положению на хромосоме генома организма. Например, «локус МАРТ» может относиться к определенному местоположению гена МАРТ, последовательность ДНК МАРТ, последовательности, кодирующей ассоциированный с микротрубочками тау-белок, или положению МАРТ на хромосоме генома организма, который был идентифицирован как такой, в котором находится такая последовательность. «Локус МАРТ» может содержать регуляторный элемент гена МАРТ, включая, например, энхансер, промотор, 5'- и (или) 3'-нетранслируемую область (НТО, англ. «UTR»), или их комбинацию.

[00169] Термин «ген» относится к последовательности ДНК в хромосоме, которая кодирует продукт (например, РНК-продукт и (или) продукт-полипептид) и включает в себя кодирующую область, прерванную некодирующими нитронами, и последовательность, расположенную смежно с указанной кодирующей областью как на 5'-конце, так и на 3'-конце, таким образом, что ген соответствует полноразмерной иРНК (включая 5'- и 3' не транслируемые последовательности). Термин «ген» также включает в себя другие некодирующие последовательности, включая регуляторные последовательности (например, промоторы, энхансеры и сайты связывания факторов транскрипции), сигналы полиаденилирования, участок внутренней посадки рибосомы, сайленсеры, изолирующие последовательности и области прикрепления к матриксу. Эти последовательности могут быть расположены вблизи кодирующей области гена (например, в пределах 10 т. п. о.) или в отдаленных сайтах, и они влияют на уровень или скорость транскрипции и трансляции данного гена.

[00170] Термин «аллель» относится к вариантной форме гена. Некоторые гены имеют множество различных форм, которые расположены в одной и той же позиции, или генетическом локусе, на хромосоме. Диплоидный организм имеет два аллеля в каждом генетическом локусе. Каждая пара аллелей отражает собой генотип определенного генетического локуса. Генотипы описываются как гомозиготные, если есть два идентичных аллеля в определенном локусе, и как гетерозиготные, если эти два аллеля различаются.

[00171] «Промотор» представляет собой регуляторную область ДНК, обычно содержащую ТАТА-бокс, которая способна направлять РНК-полимеразу II с целью инициации синтеза РНК в соответствующем сайте инициации транскрипции для конкретной полинуклеотидной последовательности. Промотор может дополнительно включать в себя другие области, которые влияют на скорость инициации транскрипции. Описанные в данном документе промоторные последовательности модулируют транскрипцию функционально связанного полинуклеотида. Промотор может проявлять активность в одном или нескольких типах клеток, описанных в данном документе (например, в клетке человека, плюрипотентной клетке, эмбрионе на одноклеточной стадии, дифференцированной клетке или их комбинации). Промотор может представлять собой, например, конститутивно активный промотор, условный промотор, индуцибельный промотор, ограниченный во времени промотор (например, промотор, регулируемый развитием) или ограниченный в пространстве промотор (например, клеточно-специфический или тканеспецифический промотор). Примеры промоторов можно найти, например, в патентном документе WO 2013/176772, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00172] Термин «функциональная связь» или «функционально связанный (-ая, -ые)» включает в себя контактное расположение двух или большего числа компонентов (например, промотора и другого элемента последовательности), таким образом, что оба компонента функционируют нормально и допускают возможность того, что по меньшей мере один из данных компонентов может опосредовать функцию, которая воздействует на по меньшей мере один из других компонентов. Например, промотор может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор контролирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на присутствие или отсутствие одного либо нескольких факторов регуляции транскрипции. Функциональная связь может включать в себя случаи, когда такие последовательности расположены смежно друг с другом или действуют в транс-положении (например, регуляторная последовательность может действовать на расстоянии, чтобы контролировать транскрипцию кодирующей последовательности).

[00173] Термин «вариант» относится к нуклеотидной последовательности, отличающейся от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на один нуклеотид), или к последовательности белка, отличающейся от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на одну аминокислоту).

[00174] Термин «фрагмент» по отношению к белку означает белок, который имеет меньшую длину или содержит меньше аминокислот, чем полноразмерный белок. Термин «фрагмент» по отношению к нуклеиновой кислоте означает нуклеиновую кислоту, которая имеет меньшую длину или содержит меньше нуклеотидов, чем полноразмерная нуклеиновая кислота. Фрагмент может представлять собой, например, N-концевой фрагмент (т.е. удалена С-концевая часть белка), С-концевой фрагмент (т.е. удалена N-концевая часть белка) или внутренний фрагмент.

[00175] «Идентичность последовательностей», или «идентичность», в контексте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании последовательностей для максимального соответствия в указанном окне сравнения. Когда процент идентичности последовательностей используется в отношении белков, тогда положения остатков, которые не идентичны, часто отличаются по консервативным аминокислотным заменам, в которых аминокислотные остатки заменены на другие аминокислотные остатки с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность) и, следовательно, не меняют функциональных свойств данной молекулы. Когда последовательности отличаются по консервативным аминокислотным заменам, процент идентичности последовательностей может быть увеличен для корректировки относительно консервативного характера замены. Указывают, что последовательности, отличающиеся по таким консервативным заменам, имеют «сходство последовательностей», или «сходство». Средства для выполнения данной корректировки хорошо известны. Обычно это включает в себя оценку консервативной замены как частичного, а не полного несоответствия, что тем самым увеличивает процент идентичности последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается оценка, равная 1, а неконсервативной замене присваивается оценка, равная нулю, то консервативной замене присваивается оценка, равная от нуля до 1. Оценка консервативных замен рассчитывается, например, так, как реализовано в программе PC/GENE (bitelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния, США).

[00176] «Процент идентичности последовательностей» включает в себя значение, определенное путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (наибольшее количество полностью совпадающих остатков) в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с референсной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания данных двух последовательностей. Данный процент рассчитывается путем определения числа положений, в которых одно и то же основание нуклеиновой кислоты или один и тот же аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих положений, с последующим делением числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножением полученного результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей. Если не указано иное (например, более короткая последовательность включает в себя связанную гетерологичную последовательность), окно сравнения представляет собой полную протяженность более короткой из двух сравниваемых последовательностей.

[00177] Если не указано иное, значения идентичности / сходства последовательностей включает в себя значение, полученное с использованием программного обеспечения GAP версии 10 с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 50 за открытие гэпа и штрафа в 3 за удлинение гэпа, а также оценочной матрицы nwsgapdna.cmp; % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 8 за открытие гэпа и штрафа в 2 за удлинение гэпа, а также оценочной матрицы BLOSUM62; или с помощью любой эквивалентной программы. «Эквивалентная программа» включает в себя любую программу для сравнения последовательностей, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей генерирует выравнивание, имеющее идентичные совпадения нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичный процент идентичности последовательностей по сравнению с соответствующим выравниванием, созданным в программе GAP версии 10.

[00178] Термин «консервативная аминокислотная замена» относится к замене аминокислоты, которая обычно присутствует в данной последовательности, на другую аминокислоту аналогичного размера, заряда или полярности. Примеры консервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин или лейцин, на другой неполярный остаток. Аналогичным образом, примеры консервативных замен включают в себя замену одного полярного (гидрофильного) остатка на другой, например, замену аргинина на лизин и наоборот, замену глутамина на аспарагин и наоборот или замену глицина на серии и наоборот.Кроме того, замена основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин, на другой остаток, или замена одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой кислотный остаток представляют собой дополнительные примеры консервативных замен. Примеры неконсервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) аминокислотного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин или метионин, на полярный (гидрофильный) остаток, такой как цистеин, глутамин, глутаминовая кислота или лизин, и (или) замену полярного остатка на неполярный остаток. Типовая классификация аминокислот обобщенно приведена ниже.

[00180] Термин «гомологичная» последовательность (например, последовательность нуклеиновой кислоты) включает в себя последовательность, которая либо идентична, либо по существу сходна с известной референсной последовательностью таким образом, что она, например, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична известной референсной последовательности. Гомологичные последовательности могут включать в себя, например, ортологичную последовательность и паралогичные последовательности. Гомологичные гены, например, обычно происходят от общей предковой последовательности ДНК либо в результате видообразующего события (ортологичные гены), либо в результате события генетической дупликации (паралогичные гены). «Ортологичные» гены включают в себя гены разных видов, которые произошли от общего предкового гена путем видообразования. Ортологи обычно сохраняют одну и ту же функцию в ходе эволюции. «Паралогичные» гены включают в себя гены, связанные посредством дупликации в геноме. Паралоги могут развить новые функции в ходе эволюции.

[00181] Термин «in vitro» включает в себя искусственную среду и процессы либо реакции, которые происходят в искусственной среде (например, в пробирке, в выделенной клетке или клеточной линии). Термин «in vivo» включает в себя естественную среду (например, клетку, или организм, или тело) и процессы либо реакции, которые происходят в естественной среде. Термин «ех vivo» включает в себя клетки, которые были удалены из организма индивида, а также процессы или реакции, которые происходят в таких клетках.

[00182] Термин «репортерный ген» относится к нуклеиновой кислоте, имеющей последовательность, кодирующую продукт гена (обычно фермент), которая поддается легкому и количественному анализу, когда конструкция, содержащая последовательность репортерного гена, функционально связанную с гетерологичным промотором и (или) энхансерным элементом, вводится в клетки, которые содержат (или которые могут быть получены так, чтобы они содержали) факторы, необходимые для активации промоторных и (или) энхансерных элементов. Примеры репортерных генов включают в себя, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие бета-галактозидазу (lacZ), гены бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), гены люциферазы светлячка, гены, кодирующие бета-глюкуронидазу (GUS), и гены, кодирующие флуоресцентные белки. «Репортерный белок» относится к белку, кодируемому репортерным геном.

[00183] Термин «флуоресцентный репортерный белок», используемый в контексте данного документа, означает репортерный белок, который определяется на основе флуоресценции, при этом флуоресценция может исходить либо непосредственно от репортерного белка, либо от эффекта репортерного белка на флуорогенный субстрат, либо от белка с аффинностью к связыванию с флуоресцентно меченным соединением. Примеры флуоресцентных белков включают в себя зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP и ZsGreen1), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP и ZsYellow1), синие флуоресцентные белки (например, BFP, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire и T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, CFP, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1 и Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, RFP, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, мономер DsRed, тандем HcRed, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry и Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, мономерный Kusabira-Orange, mTangerine и tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок, присутствие которого в клетках можно определить с помощью способов проточной цитометрии.

[00184] Репарация в ответ на двухцепочечные разрывы (ДТТР. англ. «DSB») происходит главным образом посредством двух консервативных путей репарации ДНК: гомологичная рекомбинация (ГР, англ. «HR») и негомологичное соединение концов (НГСК, англ. «NHEJ»). См. работу Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22: 886 - 897, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Точно так же репарация целевой нуклеиновой кислоты, опосредованная экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, может включать в себя любой процесс обмена генетической информацией между двумя указанными полинуклеотидами.

[00185] Термин «рекомбинация» включает в себя любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами и может происходить по любому механизму. Рекомбинация может происходить посредством гомологически направленной репарации (ТНР, англ. «HDR») или гомологичной рекомбинации (ГР). ГНР или ГР включает в себя вид репарации нуклеиновой кислоты, который может требовать гомологии нуклеотидной последовательности, использует «донорную» молекулу в качестве матрицы для репарации «целевой» молекулы (т.е. той, в которой произошел двух цепочечный разрыв) и приводит к передаче генетической информации от донора к целевой молекуле. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, такой перенос может включать в себя исправление ошибки спаривания нуклеотидов гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной целевой молекулой и донором, и (или) зависимый от синтеза отжиг цепи, при котором донор используется для повторного синтеза генетической информации, которая станет частью целевой молекулы, и (или) связанные процессы. В некоторых случаях донорный полинуклеотид, часть донорного полинуклеотида, копия донорного полинуклеотида или часть копии донорного полинуклеотида интегрируется в целевую ДНК. См. работы Wang et al. (2013) Cell 153: 910 - 918; Mandalos et al. (2012) PLCS' ONE 7: e45768: 1 - 9; и Wang et al. (2013) NatBiotechnol. 31: 530 - 532, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00186] НГСК включает в себя репарацию двух цепочечных разрывов в нуклеиновой кислоте путем прямого лигирования концов данных разрывов друг с другом или с экзогенной последовательностью без необходимости в гомологичной матрице. Лигирование несмежных последовательностей с помощью НГСК часто может приводить к делециям, вставкам или транслокациям вблизи сайта двухцепочечного разрыва. Например, НГСК может также привести к нацеленной интеграции экзогенной донорной нуклеиновой кислоты посредством прямого лигирования концов разрывов с концами указанной экзогенной донорной нуклеиновой кислоты (т.е. захвату на основе НГСК). Такая нацеленная интеграция, опосредованная НГСК, может быть предпочтительной для вставки экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, когда пути гомологически направленной репарации (ГНР) не могут быть легко использованы (например, в неделящихся клетках, первичных клетках и клетках, в которых плохо осуществляется репарация ДНК на основе гомологии). В дополнение к этому, в отличие от гомологически направленной репарации, не требуется знание больших областей идентичности последовательностей, фланкирующих сайт расщепления, что может быть полезно при попытке направленной вставки в организмы, о геномной последовательности геномов которых имеется лишь ограниченное знание. Интеграция может происходить посредством лигирования тупых концов между экзогенной донорной нуклеиновой кислотой и расщепленной геномной последовательностью или посредством лигирования липких концов (т.е. концов, имеющих 5'- или 3'-выступы) с использованием экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, фланкированной выступами, которые совместимы с теми, которые генерируются нуклеазным агентом в указанной расщепленной геномной последовательности. См., например, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290 и Maresca et al. (2013) Genome Res. 23 (3): 539 - 546, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Если лигированы тупые концы, может потребоваться резекция целевой последовательности и (или) донорной последовательности для создания областей микрогомологии, необходимых для соединения фрагментов, что может создать нежелательные изменения в указанной целевой последовательности.

[00187] Композиции или способы, «содержащие» или «включающие в себя» один или большее число из перечисленных элементов, могут включать в себя другие элементы, не перечисленные специально. Например, композиция, которая «содержит» или «включает в себя» белок, может содержать белок отдельно или в комбинации с другими ингредиентами. Переходная фраза «состоящий (-ая, -ие) по существу из» означает, что объем формулы изобретения следует интерпретировать как включающий в себя указанные в данной формуле изобретения элементы, а также те элементы, которые не оказывают существенное влияние на основную (-ые) и новую (-ые) характеристику (-и) заявленного изобретения. Таким образом, термин «состоящий (-ая, -ие) по существу из» при использовании в формуле данного изобретения не предназначен для интерпретации как эквивалентный термину «содержащий (-ая, -ие)».

[00188] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное далее событие или обстоятельство может или не может произойти, и что данное описание включает в себя случаи, в которых данное событие или данное обстоятельство происходит, и случаи, когда данное событие или данное обстоятельство не происходит.

[00189] Обозначение диапазона значений включает в себя все целые числа в пределах данного диапазона или все целые числа, определяющие данный диапазон, а также все поддиапазоны, определяемые целыми числами в пределах данного диапазона.

[00190] Если иное явным образом не следует из контекста, термин «около» охватывает значения в пределах стандартной погрешности измерения (например, стандартной ошибки среднего - СОС, англ. «SEM») для указанного значения.

[00191] Термин «и (или)» относится к и охватывает любые и все возможные комбинации одного или большего числа связанных перечисленных элементов, а также отсутствие комбинаций в случае интерпретации как альтернативы («или»).

[00192] Термин «или» относится к любому одному члену конкретного перечня, а также включает в себя любую комбинацию элементов данного перечня.

[00193] Формы единственного числа включают в себя соответствующие им формы множественного числа, если из контекста явным образом не следует иное. Например, термины «белок» или «по меньшей мере один белок» могут включать в себя множество белков, включая их смеси.

[00194] «Статистически значимое» означает p≤0,05.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор

[00195] Представлены готовые к Cas-белку клетки-биосенсоры тау-белка, а также способы получения и применения таких клеток для скрининга в отношении генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка. Представлены готовые к медиатору синергической активации (SAM) CRISPR/Cas клетки-биосенсоры тау-белка, а также способы получения и применения таких клеток для скрининга в отношении генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка. Представлены готовые к Cas-белку клетки-биосенсоры тау-белка, а также способы получения и применения таких клеток для скрининга в отношении генетических модификаторов дезагрегации тау-белка. Представлены готовые к медиатору синергической активации (SAM) CRISPR/Cas клетки-биосенсоры тау-белка, а также способы получения и применения таких клеток для скрининга в отношении генетических дезагрегации тау-белка. Также представлены реагенты и способы сенсибилизации таких клеток к активности засева тау-белка или агрегации тау-белка. Также представлены реагенты и способы индукции агрегации тау-белка.

[00196] Чтобы идентифицировать гены и пути, которые модифицируют процессы аномальной агрегации тау-белка, была разработана платформа для проведения скринингов с использованием библиотек егРНК нуклеаз CRISPR (например, CRISPR/Cas9) (CRISPRn) для идентификации генов, которые регулируют возможность клеток быть «засеянными» агрегатами тау-белка, связанными с заболеваниями (например, генов, нарушение которых делает клетки более восприимчивыми к образованию агрегатов тау-белка при воздействии источника фибриллизованного тау-белка). Чтобы дополнительно идентифицировать гены и пути, которые модифицируют процессы аномальной агрегации тау-белка, была разработана платформа для проведения скринингов с использованием библиотек егРНК активации CRISPR (CRISPRa) для идентификации генов, которые регулируют возможность клеток быть «засеянными» агрегатами тау-белка, связанными с заболеваниями (например, генов, активация транскрипции которых делает клетки более восприимчивыми к образованию агрегатов тау-белка при воздействии источника фибриллизованного тау-белка). Аналогичным образом была разработана платформа для проведения скринингов с использованием библиотек егРНК нуклеаз CRISPR (например, CRISPR/Cas9) (CRISPRn) для идентификации генов, нарушение которых предотвращает агрегацию тау-белка или способствует дезагрегации тау-белка. Аналогичным образом была разработана платформа для проведения скринингов с использованием библиотек егРНК активации CRISPR (CRISPRa) для идентификации генов, активация транскрипции которых предотвращает агрегацию тау-белка или способствует дезагрегации тау-белка. Термин «засеивающие» относится к одному или большему числу белков, которые вызывают агрегацию других белков с аналогичным доменом агрегации. Активность образца на предмет засева относится к способности образца зарождать (т.е. индуцировать) агрегацию белка с аналогичным доменом агрегации. Идентификация таких генов может пролить свет на механизмы распространения агрегатов тау-белка от клетки к клетке и на генетические пути, которые регулируют восприимчивость нейронов к формированию агрегатов тау-белка в контексте нейродегенеративных заболеваний.

[00197] В указанных скринингах применяется линия клеток-биосенсоров тау-белка (например, линия клеток человека или HEK293T), состоящая из клеток, стабильно экспрессирующих содержащий повторы домен тау-белка (например, домен тау-белка, содержащий четыре повтора - тау_4RD) с патогенной мутацией (например, патогенной мутацией P301S), связанный с уникальными репортерами, которые могут действовать вместе как внутриклеточный биосенсор, который при агрегировании производит обнаруживаемый сигнал. В одном неограничивающем примере клеточные линии содержат два трансгена, стабильно экспрессирующих варианты ассоциированного с заболеванием белка, слитые с флуоресцентным белком CFP (например, eCFP) или флуоресцентным белком YFP (например, eYFP) - тау^4RD-CFP/ тау^4RD-YFP (TCY), где содержащий повторы домен тау-белка (4RD) содержит патогенную мутацию P301S. В данных биосенсорных линиях агрегация белков тау-CFP/тау-YFP производит сигнал резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) -результат переноса энергии флуоресценции от донора CFP к акцептору YFP. Термин CFP (голубой флуоресцентный белок) при использовании в контексте данного документа включает в себя eCFP (усиленный голубой флуоресцентный белок), а термин YFP (желтый флуоресцентный белок) при использовании в контексте данного документа включает в себя eYFP (усиленный желтый флуоресцентный белок). Клетки, положительные в отношении FRET, содержащие агрегаты тау-белка, могут быть отсортированы и выделены с помощью метода проточной цитометрии. В исходном состоянии нестимулированные клетки экспрессируют репортеры в стабильном растворимом виде с минимальным сигналом FRET. При стимуляции (например, липосомная трансфекция засеваемыми частицами) репортерные белки образуют агрегаты, производя сигнал FRET. Клетки, содержащие агрегаты, можно выделить с помощью метода FACS. Стабильно размножающиеся клеточные линии, содержащие агрегаты, Аг[+], могут быть выделены путем клонального серийного разведения клеточных линий Аг[-].

[00198] В данную линию клеток-биосенсоров тау-белка было внесено несколько модификаций, чтобы сделать ее пригодной для генетического скрининга с использованием библиотек CRISPRn. Во-первых, данные клетки-биосенсоры тау-белка были модифицированы путем введения Cas-экспрессирующего трансгена (например, Cas9 или SpCas9) для применения в скринингах CRISPRn. Во-вторых, были разработаны реагенты и способ для сенсибилизации клеток к активности засева тау-белка и агрегации тау-белка. Была разработана клеточная линия, в которой агрегаты тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах с течением времени. Эти клетки использовали для получения кондиционированной среды путем сбора среды, которая находилась с конфлюентными клетками в течение некоторого периода времени. Эту кондиционированную среду затем можно наносить на наивные клетки-биосенсоры тау-белка в таком соотношении, чтобы агрегация тау-белка могла быть индуцирована в небольшом проценте этих реципиентных клеток, тем самым сенсибилизируя их к активности засева тау-белка и агрегации тау-белка. Кондиционированная среда без совместного культивирования ранее не применялась в данном контексте в качестве засеивающего агента. Тем не менее кондиционированная среда особенно полезна для крупномасштабных полногеномных скринингов, поскольку тау-фибриллы, полученные in vitro, являются ограниченным ресурсом. В дополнение к этому, кондиционированная среда является более подходящей с физиологической точки зрения, поскольку она продуцируется и секретируется клетками, а не in vitro.

[00199] Данные клеточные линии были использованы для разработки способа скрининга, в котором Cas-экспрессирующие клетки-биосенсоры тау-белка, не содержащие агрегатов (Аг[-]), трансдуцировали с помощью библиотеки гидовых РНК CRISPR для введения нокаут-мутаций в каждый целевой ген. После культивирования клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, данные клетки выращивали в кондиционированной среде, чтобы сенсибилизировать их к активности засева, и идентифицировали те клетки, в которых происходила агрегация тау-белка. Были идентифицированы гидовые РНК, которые были обогащены в субпопуляции, положительной в отношении агрегации тау-белка, по сравнению с более ранними моментами времени в течение редактирования генома и увеличения числа данных клеток, чтобы идентифицировать гены, которые могут регулировать восприимчивость клеток к засеву тау-белка при воздействии внешнего источника засеивающей активности тау-белка.

[00200] Аналогичным образом, в данную линию клеток-биосенсоров тау-белка было внесено несколько модификаций, чтобы сделать ее пригодной для генетического скрининга с использованием библиотек CRISPRa (например, для применения с системой медиатора синергической активации (SAM) CRISPR/Cas). В иллюстративной системе SAM несколько доменов активации взаимодействуют и вызывают активацию транскрипции, превышающую ту, которая могла бы быть вызвана любым одним фактором в одиночку. Например, иллюстративная система SAM включает в себя химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, VP64), и химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок (например, белок оболочки MS2 (МСР)), слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, слитый с р65 и HSF1). МСР естественным образом связывается со шпильками MS2. В иллюстративной системе SAM белок МСР взаимодействует со стержневыми петлями MS2, сконструированными в CRISPR-ассоциированную егРНК, и тем самым перемещает связанные факторы транскрипции в соответствующее местоположение в геноме.

[00201] Во-первых, данные клетки-биосенсоры тау-белка были модифицированы путем введения одного или большего числа трансгенов, экспрессирующих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, VP64), и химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок (например, белок оболочки MS2 (МСР)), слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, слитый с р65 и HSF1). Несмотря на то, что в данном документе описаны системы SAM, также можно применять другие системы CRISPRa, такие как белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, при этом такие системы не включают в себя также и химерный адаптерный белок. В таких случаях клетки-биосенсоры тау-белка могут быть модифицированы путем введения трансгена, экспрессирующего химерный белок Cas.

[00202] Во-вторых, были разработаны реагенты и способ для сенсибилизации клеток к активности засева тау-белка и агрегации тау-белка. Была разработана клеточная линия, в которой агрегаты тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах с течением времени. Эти клетки использовали для получения кондиционированной среды путем сбора среды, которая находилась с конфлюентными клетками в течение некоторого периода времени. Эту кондиционированную среду затем можно наносить на наивные клетки-биосенсоры тау-белка в таком соотношении, чтобы агрегация тау-белка могла быть индуцирована в небольшом проценте этих реципиентных клеток, тем самым сенсибилизируя их к активности засева тау-белка и агрегации тау-белка. Кондиционированная среда без совместного культивирования ранее не применялась в данном контексте в качестве засеивающего агента. Тем не менее кондиционированная среда особенно полезна для крупномасштабных полногеномных скринингов, поскольку тау-фибриллы, полученные in vitro, являются ограниченным ресурсом. В дополнение к этому, кондиционированная среда является более подходящей с физиологической точки зрения, поскольку она продуцируется и секретируется клетками, а не in vitro.

[00203] Данные клеточные линии были использованы для разработки способа скрининга, в котором SAM-экспрессирующие клетки-биосенсоры тау-белка, не содержащие агрегатов (Аг[-]), трансдуцировали с помощью библиотеки гидовых РНК CRISPRa для активации транскрипции каждого целевого гена. После культивирования клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, данные клетки выращивали в кондиционированной среде, чтобы сенсибилизировать их к активности засева, и идентифицировали те клетки, в которых происходила агрегация тау-белка. Были идентифицированы гидовые РНК, которые были обогащены в субпопуляции, положительной в отношении агрегации тау-белка, по сравнению с более ранними моментами времени в течение редактирования генома и увеличения числа данных клеток, чтобы идентифицировать гены, которые могут регулировать восприимчивость клеток к засеву тау-белка при воздействии внешнего источника засеивающей активности тау-белка.

II. Линии биосенсорных клеток Cas/may и SAM/may, и способы их получения

А. Биосенсорные клетки Cas/тау и биосенсорные клетки SAM/тау

[00204] В данном документе описаны клетки, не только экспрессирующие первый содержащий повторы домен тау-белка (например, содержащий домен связывания микротрубочек (MBD) тау-белка), связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, но также экспрессирующие белок Cas, такой как Cas9. В данном документе также описаны клетки, не только экспрессирующие первый содержащий повторы домен тау-белка (например, содержащий домен связывания микротрубочек (MBD) тау-белка), связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, но также экспрессирующие химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, и химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции. Первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, может стабильно экспрессироваться, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, может стабильно экспрессироваться. Например, ДНК, кодирующая первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, может быть геномно интегрирована, и ДНК, кодирующая второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, может быть геномно интегрирована. Подобным образом, белок Cas может стабильно экспрессироваться в биосенсорных клетках Cas/тау. Например, ДНК, кодирующая белок Cas, может быть геномно интегрирована. Аналогичным образом, химерный белок Cas и (или) химерный адаптерный белок могут стабильно экспрессироваться в биосенсорных клетках SAM/тау. Например, ДНК, кодирующая химерный белок Cas, может быть геномно интегрирована, и (или) ДНК, кодирующая химерный адаптерный белок, может быть геномно интегрирована. Данные клетки могут быть отрицательными в отношении агрегации тау-белка или могут быть положительными в отношении агрегации тау-белка.

1. Тау-белок и содержащий повторы домен тау-белка, связанный с репорт ерами

[00205] Связанный с микротрубочками тау-белок представляет собой белок, который способствует сборке и стабильности микротрубочек, и преимущественно экспрессируется в нейронах. Тау-белок играет роль в стабилизации микротрубочек нейронов и, таким образом, способствует разрастанию аксонов. При болезни Альцгеймера (БА) и семействе родственных нейродегенеративных заболеваний, называемых таупатиями, тау-белок аномально гиперфосфорилирован и агрегирован в пучки филаментов (парные спиральные нити), которые проявляются в виде нейрофибриллярных клубков. Таупатии представляют собой группу гетерогенных нейродегенеративных патологических состояний, характеризующихся отложением аномального тау-белка в головном мозге.

[00206] Содержащий повторы домен тау-белка может происходить из тау-белка любого животного или млекопитающего, такого как человек, мышь или крыса. В одном конкретном примере содержащий повторы домен тау-белка происходит из тау-белка человека. Иллюстративному тау-белку человека присвоен учетный номер UniProt Р10636. Тау-белки являются продуктами альтернативного сплайсинга из одного гена, который у человека обозначается как МАРТ (связанный с микротрубочками тау-белок). Содержащий повторы домен тау-белка несет в себе мотивы последовательности, ответственные за агрегацию (т.е. это домен из тау-белка, склонный к агрегации). В зависимости от сплайсинга содержащий повторы домен тау-белка содержит либо три, либо четыре повторяющихся области, которые составляют склонное к агрегации ядро данного белка, которое часто называют содержащим повторы доменом (RD). В частности, содержащий повторы домен тау-белка представляет собой ядро области связывания микротрубочек и несет в себе гексапептидные мотивы в R2 и R3, которые ответственны за агрегацию тау-белка. В головном мозге человека существует шесть изоформ тау-белка, длина которых варьирует от 352 до 441 аминокислоты. Данные изоформы различаются на карбоксильном конце в зависимости от наличия трех или четырех содержащих повторы доменов (R1-R4) в дополнение к наличию или отсутствию одного или двух содержащих вставки доменов на аминоконце. Содержащие повторы домены, расположенные в карбоксиконцевой половине тау-белка, как полагают, важны для связывания микротрубочек, а также для патологической агрегации тау-белка в парные спиральные филаменты (ПСФ, англ. «PHF»), которые являются основными составляющими нейрофибриллярных клубков, обнаруживаемых при таупатиях. Иллюстративные последовательности для четырех содержащих повторы доменов (R1-R4) представлены в SEQ ID NO: 1-4, соответственно. Иллюстративные кодирующие последовательности для четырех содержащих повторы доменов (R1-R4) представлены в SEQ ID NO: 5-8. Иллюстративная последовательность для домена тау-белка с четырьмя повторами представлена в SEQ ID NO: 9. Иллюстративная кодирующая последовательность для домена тау-белка с четырьмя повторами представлена в SEQ ID NO: 10. Иллюстративная последовательность для домена тау-белка с четырьмя повторами с мутацией P301S представлена в SEQ ID NO: 11. Иллюстративная кодирующая последовательность для домена тау-белка с четырьмя повторами с мутацией P301S представлена в SEQ ID NO: 12.

[00207] Содержащий повторы домен тау-белка, используемый в биосенсорных клетках Cas/тау или биосенсорных клетках SAM/тау, может содержать связывающий микротрубочки домен тау-белка (MBD). Содержащий повторы домен тау-белка, используемый в биосенсорных клетках Cas/тау или биосенсорных клетках SAM/тау, может содержать один, или большее число, или все четыре содержащих повторы домена (R1-R4). Например, содержащий повторы домен тау-белка может содержать, состоять по существу из, или состоять из одной, или большего числа, или всех из последовательностей с SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4, или из последовательностей, которые по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентичны последовательностям с SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4. В одном конкретном примере содержащий повторы домен тау-белка представляет собой домен тау-белка с четырьмя повторами (R1-R4), обнаруживаемый в нескольких изоформах тау-белка. Домен тау-белка с четырьмя повторами может быть использован вместо полноразмерного тау-белка, поскольку он надежно формирует фибриллы в культивируемых клетках. Например, содержащий повторы домен тау-белка может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 9 или последовательности с SEQ ID NO: 11, или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 9 или последовательности с SEQ ID NO: 11. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая содержащий повторы домен тау-белка, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 12 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 12, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 11. В другом конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 10 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 10, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 9. Первый и второй содержащие повторы домены тау-белка в клетках, описанных в данном документе, могут быть одинаковыми, похожими или разными.

[00208] Один или оба из указанных первого содержащего повторы домена тау-белка, связанного с первым репортером, и второго содержащего повторы домена тау-белка, связанного со вторым репортером, могут стабильно экспрессироваться в клетках. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один или оба из указанных первого содержащего повторы домена тау-белка, связанного с первым репортером, и второго содержащего повторы домена тау-белка, связанного со вторым репортером, могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток и функционально связаны с промоторами, активными в клетке.

[00209] Содержащие повторы домены тау-белка, используемые в клетках, описанных в данном документе, также могут содержать патогенную мутацию тау-белка, такую как мутация, способствующая агрегации. Такая мутация может представлять собой, например, мутацию, которая связана с (например, сегрегируется с) таупатией или вызывает таупатию. В качестве одного из примеров, указанная мутация может представлять собой сенсибилизирующую к агрегации мутацию, которая сенсибилизирует тау-белок к засеву, но не приводит к тому, что тау-белок легко агрегирует сам по себе. Например, указанная мутация может представлять собой мутацию P301S, связанную с заболеванием. Под мутацией P301S понимается мутация P301S тау-белка человека или соответствующая мутация в другом тау-белке при оптимальном выравнивании с тау-белком человека. Мутация P301S в тау-белке проявляет высокую сенсибилизацию к засеву, но не приводит к агрегации сама по себе. Таким образом, хотя на исходном уровне репортерные тау-белки, содержащие мутацию P301S, существуют в клетке в стабильной растворимой форме, воздействие экзогенных факторов засева тау-белка приводит к агрегации репортерного тау-белка. Другие мутации тау-белка включают в себя, например, K280del, P301L, V337M, P301L/V337M и K280del/I227P/I308P.

[00210] Первый содержащий повторы домен тау-белка может быть связан с первым репортером, а второй содержащий повторы домен тау-белка может быть связан со вторым репортером любыми способами. Например, репортер может быть слит с содержащим повторы доменом тау-белка (например, как часть слитого белка).

[00211] Первый репортер и второй репортер могут представлять собой пару уникальных репортеров, которые могут действовать вместе как внутриклеточный биосенсор, который производит детектируемый сигнал при агрегировании первого и второго белков. В качестве одного из примеров, репортеры могут представлять собой флуоресцентные белки, и для измерения агрегации белков может быть использован резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). В частности, первый и второй репортеры могут представлять собой FRET-napy. Примеры FRET-nap (донорный и акцепторный флуорофоры) хорошо известны. См., например, работу Bajar et al. (2016) Sensors (Basel) 16 (9): 1488, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Иллюстративные методики флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света при волне одной длины (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции при волне большей длины. Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному хромофору безызлучательным образом посредством дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Например, донор энергии FRET может представлять собой первый репортер, а акцептор энергии FRET может представлять собой второй репортер. В качестве альтернативы, донор энергии FRET может представлять собой второй репортер, а акцептор энергии FRET может представлять собой первый репортер. В конкретном примере первый и второй репортеры представляют собой CFP и YFP. Иллюстративные белковые и кодирующие последовательности для CFP представлены, например, в SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно. Иллюстративные белковые и кодирующие последовательности для YFP представлены, например, в SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно. В качестве конкретного примера, CFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 13 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 13. В качестве другого конкретного примера, YFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 15 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 15.

[00212] В качестве другого примера можно использовать стратегию комплементации белковых фрагментов для обнаружения агрегации. Например, сплит-люцифераза может использоваться для получения биолюминесценции из субстрата, а первый и второй репортеры могут представлять собой амино-(NLuc) и карбокси-(CLuc) концевые фрагменты люциферазы. Примеры люциферазы включают в себя люциферазу Renilla, люциферазу светлячка, люциферазу жука-щелкуна и люциферазу Metridia.

[00213] В одном неограничивающем примере биосенсорные клетки, описанные в данном документе, содержат два трансгена, стабильно экспрессирующих варианты ассоциированного с заболеванием тау-белка, слитые с флуоресцентным белком CFP или флуоресцентным белком YFP, соответственно (Tay^4RD)-CFP/Tay^4RD)-YFP(TCY)), при этом содержащий четыре повтора домен тау-белка (4RD) содержит патогенную мутацию P301S. В данных биосенсорных линиях агрегация белков тау-CFP/Tay-YFP производит FRET-сигнал, который является результатом переноса энергии флуоресценции от донора CFP к акцептору YFP. Клетки, положительные в отношении FRET, содержащие агрегаты тау-белка, могут быть отсортированы и выделены с помощью метода проточной цитометрии. В исходном состоянии нестимулированные клетки экспрессируют репортеры в стабильном растворимом виде с минимальным сигналом FRET. При стимуляции (например, липосомная трансфекция засеваемыми частицами) репортерные белки образуют агрегаты, производя сигнал FRET.

[00214] Описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау могут быть положительными в отношении агрегации тау-белка (Аг[+]) клетками, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, что означает, что агрегаты содержащего повторы домена тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах со временем. В качестве альтернативы, описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау могут быть отрицательными в отношении агрегации тау-белка (Аг[-]).

2. Белки Cas и химерные белки Cas

[00215] Описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау также содержат нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие белки Cas. Необязательно, указанный белок Cas стабильно экспрессируется. Необязательно, указанные клетки содержат геномно интегрированную последовательность, кодирующую белок Cas. Аналогичным образом, биосенсорные клетки SAM/тау, описанные в данном документе, также содержат нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие химерные белки Cas, содержащие белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, VP64). Необязательно, указанный химерный белок Cas стабильно экспрессируется. Необязательно, указанные клетки содержат геномно интегрированную последовательность, кодирующую химерный белок Cas.

[00216] Белки Cas являются частью систем коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/связанных с CRISPR (Cas) систем. Системы CRISPR/Cas включают в себя транскрипты и другие элементы, участвующие в экспрессии генов Cas или регулирующие активность генов Cas. Система CRISPR/Cas может представлять собой, например, систему типа I, систему типа II, систему типа III или систему типа V (например, подтип VA или подтип VB). В описанных в данном документе способах и композициях можно применять системы CRISPR/Cas путем использования комплексов CRISPR (содержащих гидовую РНК (гРНК) в комплексе с белком Cas) для сайт-направленного связывания или расщепления нуклеиновых кислот.

[00217] Системы CRISPR/Cas, применяемые в описанных в данном документе композициях и способах, могут быть не встречающимися в природе. «Не встречающаяся в природе» система включает в себя то, что было создано деятельностью человека, например, один или большее число компонентов системы, измененных или мутированных по сравнению с тем состоянием, в котором они встречаются в природе, по меньшей мере по существу не содержащих по меньшей мере одного другого компонента, с которым они естественным образом связаны в природе, или связанных по меньшей мере с одним другим компонентом, с которым они не связаны естественным образом. Например, в некоторых системах CRISPR/Cas применяются не встречающиеся в природе комплексы CRISPR, содержащие гРНК и белок Cas, которые не встречаются вместе в природе, применяется белок Cas, который не встречается в природе, или применяется иРНК, которая не встречается в природе.

[00218] Белки Cas обычно содержат по меньшей мере один домен, распознающий или связывающий РНК, который может взаимодействовать с гидовыми РНК. Белки Cas также могут содержать нуклеазные домены (например, ДНКазные домены или РНКазные домены), ДНК-связывающие домены, геликазные домены, домены межбелкового взаимодействия, домены димеризации и другие домены. Некоторые такие домены (например, домены ДНКазы) могут происходить из природного белка Cas. Другие такие домены могут быть добавлены для получения модифицированного белка Cas. Нуклеазный домен обладает каталитической активностью в отношении расщепления нуклеиновой кислоты, которое включает в себя разрыв ковалентных связей молекулы нуклеиновой кислоты. Расщепление может приводить к образованию тупых или ступенчатых концов, и оно может быть одно цепочечным или двухцепочечным. Например, белок Cas9 дикого типа обычно создает продукт расщепления с тупыми концами. В качестве альтернативы, белок Cpf1 дикого типа (например, FnCpf1) может приводить к образованию продукта расщепления с 5'-выступом из 5 нуклеотидов, при этом расщепление происходит после 18-й пары оснований из последовательности РАМ в нецелевой цепи и после 23-го основания в целевой цепи. Белок Cas может обладать полной активностью расщепления для создания двухцепочечного разрыва в целевом геномном локусе (например, двухцепочечного разрыва с тупыми концами), или может представлять собой никазу, которая создает одноцепочечный разрыв в целевом геномном локусе.

[00219] Примеры белков Cas включают в себя Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 или Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 и Cu1966, и их модифицированные версии и их гомологи.

[00220] Иллюстративный белок Cas представляет собой белок Cas9 или белок, полученный из белка Cas9. Белки Cas9 происходят из системы CRISPR/Cas типа II и обычно имеют четыре ключевых мотива с консервативной архитектурой. Мотивы 1, 2 и 4 представляют собой мотивы, подобные RuvC, а мотив 3 представляет собой мотив HNH. Иллюстративные белки Cas9 происходят из Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum,Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospiraplatensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Acaryochloris marina, Neisseria meningitidis или Campylobacter jejuni. Дополнительные примеры представителей семейства Cas9 описаны в патентном документе WO 2014/131833, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Cas9 из S. pyogenes (SpCas9) (которому присвоен учетный номер SwissProt Q99ZW2) представляет собой иллюстративный белок Cas9. Иллюстративный белок SpCas9 и его кодирующая последовательность указаны в SEQ IS NO: 21 и SEQ ID NO: 22, соответственно. Cas9 из S. aureus (SaCas9) (которому присвоен учетный номер UniProt J7RUA5) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. Cas9 из Campylobacter jejuni (CjCas9) (которому присвоен учетный номер UniProt Q0P897) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. См., например, работу Kim et al. (2017) Nat. Comm. 8: 14500, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. SaCas9 имеет меньший размер, чем SpCas9, а CjCas9 имеет меньший размер, чем оба белка SaCas9 и SpCas9. Cas9 из Neisseria meningitidis (Nme2Cas9) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. См., например, работу Edraki et al. (2019) Mol. Cell 73 (4): 714 - 726, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Белки Cas9 из Streptococcus thermophilus (например, белок Cas9 из Streptococcus thermophilus LMD-9, кодируемый локусом CRISPR1 (StlCas9), или белок Cas9 из Streptococcus thermophilus, кодируемый локусом CRISPR3 (St3Cas9)) представляют собой другие иллюстративные белки Cas9. Белок Cas9 из Francisella novicida (FnCas9) или вариантный белок Cas9 RHA из Francisella novicida, который распознает альтернативный РАМ (замены E1369R/E1449H/R1556A) представляют собой другие иллюстративные белки Cas9. Обзор этих и других иллюстративных белков Cas9 представлен, например, в работе Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28 (7): 247 - 261, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00221] В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, белок Cas может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 21 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 21. В качестве другого конкретного примера, химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью и один или большее число доменов активации транскрипции, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 36 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 36.

[00222] Еще один иллюстративный белок Cas представляет собой белок Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1). Cpf1 представляет собой большой белок (около 1300 аминокислот), который содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, вместе с аналогом характерного богатого аргинином кластера из Cas9. Тем не менее в белке Cpf1 отсутствует нуклеазный домен HNH, который присутствует в белках Cas9, а RuvC-подобный домен является смежным в последовательности Cpf1, в отличие от Cas9, который содержит длинные вставки, включая домен HNH. См., например, работу Zetsche et al. (2015) Cell 163 (3): 759 - 771, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Иллюстративные белки Cpf1 происходят из Francisella tularensis 1, Francisella tularensis subsp. novicida, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens и Porphyromonas macacae. Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1; присвоен учетный номер UniProt A0Q7Q2) представляет собой иллюстративный белок Cpf1.

[00223] Белки Cas могут представлять собой белки дикого типа (т.е. белки, которые встречаются в природе), модифицированные белки Cas (т.е. вариантные белки Cas) или фрагменты белков Cas дикого типа, или модифицированные белки Cas. Белки Cas также могут представлять собой варианты или фрагменты, активные в отношении каталитической активности белков Cas дикого типа или модифицированных белков Cas. Варианты или фрагменты, активные в отношении каталитической активности, могут быть по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или более идентичны последовательности белка Cas дикого типа или последовательности модифицированного белка Cas, или его части, при этом активные варианты сохраняют способность разрезать в желаемом сайте расщепления и, следовательно, сохраняют активность, индуцирующую двухцепочечный разрыв. Анализы на предмет активности, индуцирующей двухцепочечный разрыв, известны и обычно измеряют общую активность и специфичность белка Cas на субстратах ДНК, содержащих сайт расщепления.

[00224] Одним из примеров модифицированного белка Cas является модифицированный белок SpCas9-HF1, который представляет собой высокоточный вариант Cas9 из Streptococcus pyogenes, несущий изменения (N497A/R661A/Q695A/Q926A), предназначенные для снижения неспецифических контактов с ДНК. См., например, работу Kleinstiver et al. (2016) Nature 529 (7587): 490 - 495, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другим примером модифицированного белка Cas является модифицированный вариант eSpCas9 (K848A/K1003A/R1060A), разработанный для снижения нецелевых эффектов. См., например, работу Slaymaker et al. (2016) Science 351 (6268): 84 - 88, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другие варианты SpCas9 включают в себя K855A и K810A/K1003A/R1060A. Обзор этих и других модифицированных белков Cas представлен, например, в работе Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28 (7): 247 - 261, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другим примером модифицированного белка Cas9 является xCas9, который представляет собой вариант SpCas9, который может распознавать более широкий диапазон последовательностей РАМ. См., например, работу Ни et al. (2018) Nature 556: 57 - 63, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00225] Белки Cas могут быть модифицированы с целью увеличения или уменьшения одного или большего числа из следующих параметров: аффинность связывания нуклеиновой кислоты, специфичность связывания нуклеиновой кислоты и ферментативная активность. Белки Cas также могут быть модифицированы с целью изменения любой другой активности или свойства белка, например, стабильности. Например, белок Cas может быть усечен для удаления доменов, которые не являются существенными для функции белка, или для оптимизации (например, повышения или понижения) активности или свойства белка Cas. В качестве другого примера, один или большее число нуклеазных доменов белка Cas могут быть модифицированы, удалены или инактивированы (например, для использования в биосенсорных клетках SAM/тау, содержащих белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью).

[00226] Белки Cas могут содержать по меньшей мере один нуклеазный домен, такой как ДНКазный домен. Например, белок Cpf1 дикого типа обычно содержит RuvC-подобный домен, который расщепляет обе цепи целевой ДНК, возможно, в димерной конфигурации. Белки Cas также могут содержать по меньшей мере два нуклеазных домена, таких как ДНКазные домены. Например, белок Cas9 дикого типа обычно содержит RuvC-подобный нуклеазный домен и HNH-подобный нуклеазный домен. Каждый из доменов RuvC и HNH может разрезать разные цепи двухцепочечной ДНК с образованием двухцепочечного разрыва в ДНК. См., например, работу Jinek et al. (2012) Science 337: 816 - 821, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00227] Один, или большее число, или все нуклеазные домены могут быть удалены или мутированы таким образом, что они больше не функциональны или имеют пониженную нуклеазную активность. Например, если один из нуклеазных доменов в белке Cas9 удален или мутирован, то полученный в результате белок Cas9 может называться никазой и может генерировать одноцепочечный разрыв в двухцепочечной целевой ДНК, но не двух цепочечный разрыв (т.е. он может расщеплять комплементарную цепь или некомплементарную цепь, но не обе). Если оба нуклеазных домена удалены или мутированы, то полученный в результате белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas с нулевой нуклеазной активностью или белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, или каталитически мертвый белок Cas (dCas)). Примером мутации, которая превращает Cas9 в никазу, является мутация D10A (аспартат на аланин в положении 10 белка Cas9) в домене RuvC белка Cas9 из S. pyogenes. Аналогичным образом, Н939А (гистидин на аланин в положении аминокислоты 839), Н840А (гистидин на аланин в положении аминокислоты 840) или N863A (аспарагин на аланин в положении аминокислоты N863) в домене HNH белка Cas9 из S. pyogenes может превращать Cas9 в никазу. Другие примеры мутаций, которые превращают Cas9 в никазу, включают в себя соответствующие мутации белка Cas9 из S. thermophilus. См., например, Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39 (21): 9275 - 9282 и патентный документ WO 2013/141680, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Такие мутации могут быть получены с использованием таких способов, как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез или полный генный синтез. Примеры других мутаций, создающих никазы, можно найти, например, в патентных документах WO 2013/176772 и WO 2013/142578, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Если в белке Cas удалены или мутированы все нуклеазные домены (например, в белке Cas9 удалены или мутированы оба нуклеазных домена), то полученный в результате белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas с нулевой нуклеазной активностью или с белок Cas инактивированной нуклеазной активностью). Одним из конкретных примеров является двойной мутант D10A/H840A белка Cas9 из S. pyogenes или соответствующий двойной мутант белка Cas9 из другого вида при оптимальном выравнивании с последовательностью Cas9 из S. pyogenes. Другим конкретным примером является двойной мутант D10A/N863A белка Cas9 из S. pyogenes или соответствующий двойной мутант белка Cas9 из другого вида при оптимальном выравнивании с последовательностью Cas9 из S. pyogenes.

[00228] Примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах xCas9 являются такими же, как описанные выше примеры для SpCas9. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cas9 из Staphylococcus aureus. Например, фермент Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9) может включать в себя замену в положении N580 (например, замену N580A) и замену в положении D10 (например, замену D10A) для образования белка Cas с инактивированной нуклеазной активностью. См., например, патентный документ WO 2016/106236, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах Nme2Cas9 (например, комбинация D16A и Н588А). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St1Cas9 (например, комбинация D9A, D598A, Н599А и N622A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St3Cas9 (например, комбинация D10A и N870A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах CjCas9 (например, комбинация D8A и Н559А). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах FnCas9 и RHA FnCas9 (например, N995A).

[00229] Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cpf1. Что касается белков Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1), Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) и Moraxella bovoculi 237 (MbCpf1 Cpf1), такие мутации могут включать в себя мутации в положениях 908, 993 или 1263 в AsCpf1, или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1, либо в положениях 832, 925, 947 или 1180 в LbCpf1, или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1. Такие мутации могут включать в себя, например, одну или большее число из мутаций D908A, Е993А и D1263A в AsCpf1, или соответствующие мутации в ортологах Cpf1, либо D832A, Е925А, D947A и D1180A в LbCpf1, или соответствующие мутации в ортологах Cpf1. См., например, патентный документ US 2016/0208243, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00230] Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичными полипептидами в качестве слитых белков. Например, белок Cas может быть слит с доменом расщепления, доменом эпигенетической модификации, доменом активации транскрипции или доменом репрессии транскрипции. См. патентный документ WO 2014/089290, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Например, белки Cas могут быть функционально связаны или слиты с доменом активации транскрипции для применения в биосенсорных клетках SAM/тау. Примеры доменов активации транскрипции включают в себя домен активации VP16 вируса простого герпеса, VP64 (который является тетрамерным производным от VP16), домен активации р65 NFκB, домены активации р53 1 и 2, домен активации CREB (белка, связывающего элемент отклика цАМФ), домен активации Е2А и домен активации NFAT (ядерного фактора активированных Т-клеток). Другие примеры включают в себя домены активации из Oct1, Oct-2A, SP1, АР-2, CTF1, Р300, СВР, PCAF, SRC1, PvALF, ERF-2, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, ARF-6, ARF-7, ARF-8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, TRAB1PC4 и HSF1. См., например, US 2016/0237456, EP 3045537 и 2011/146121, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В некоторых случаях может применяться система активации транскрипции, содержащая слитый белок dCas9-VP64, спаренный с MS2-p65-HSF1. Гидовые РНК в таких системах могут быть сконструированы с последовательностями аптамера, присоединенными к тетрапетле егРНК и шпильке 2, предназначенным для связывания димеризованных белков оболочки бактериофага MS2. См., например, работу Konermann et al. (2015) Nature 517 (7536): 583 - 588, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Примеры доменов репрессии транскрипции включают в себя индуцируемые домены раннего репрессора цАМФ (ICER), репрессорные домены Kruppel-ассоциированного бокса A (KRAB-А), богатые глицином репрессорные домены YY1, Sp1-подобные репрессоры, E(spl) репрессоры, IκВ репрессор и МеСР2. Другие примеры включают в себя домены репрессии транскрипции из А/В, KOX, ТФР-бета-индуцирумого раннего гена (TIEG), v-erbA, SID, SPD4X, MBD2, MBD3, DNMT1, DNMG3A, DNMT3B, Rb, ROM2, см., например, ЕР3045537 и WO 2011/146121, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Белки Cas также могут быть слиты с гетерологичным полипептидом, обеспечивающим повышенную или пониженную стабильность. Слитый домен или гетерологичный полипептид могут быть расположены на N-конце, С-конце или внутри белка Cas.

[00231] Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичными полипептидами в качестве слитых белков. В качестве одного из примеров, белок Cas может быть слит с одним или большим числом гетерологичных полипептидов, которые обеспечивают субклеточную локализацию. Такие гетерологичные полипептиды могут включать в себя, например, один или большее число из сигналов ядерной локализации (NLS), таких как монопартитный NLS SV40 и (или) бипартитный NLS импортина альфа для нацеливания на ядро, сигнал митохондриальной локализации для нацеливания на митохондрии, сигнал удержания в ЭР и т.п. См., например, работу Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 5101 - 5105, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Такие сигналы субклеточной локализации могут быть расположены на N-конце, С-конце или в любой области в пределах белка Cas. NLS может содержать отрезок основных аминокислот и может быть монопартитной последовательностью или бипартитной последовательностью. Необязательно, белок Cas может содержать два или большее число NLS, включая NLS (например, NLS импортина альфа или монопартитный NLS) на N-конце и NLS (например, NLS SV40 или бипартитный NLS) на С-конце. Белок Cas также может содержать два или большее число NLS на N-конце и (или) два или большее число NLS на С-конце.

[00232] Белки Cas также могут быть функционально связаны с проникающим в клетку доменом, или с доменом трансдукции белка. Например, проникающий в клетку домен может происходить из белка ТАТ ВИЧ-1, проникающего в клетку мотива TLM из вируса гепатита В человека, MPG, Рер-1, VP22, проникающего в клетку белка из вируса простого герпеса, или из полиаргининовой пептидной последовательности. См., например, WO 2014/089290 и WO 2013/176772, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Проникающий в клетку домен может быть расположен на N-конце, С-конце или в любой области в пределах белка Cas.

[00233] Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичным полипептидом для облегчения отслеживания или очистки, например, с флуоресцентным белком, меткой очистки или меткой эпитопа. Примеры флуоресцентных белков включают в себя зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), синие флуоресцентные белки (например, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, мономер DsRed, тандем HcRed, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, мономерный Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок. Примеры меток включают в себя глутатион-8-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (СВР), мальтозо-связывающий белок, тиоредоксин (TRX), поли(NANP), метку тандемной аффинной очистки (ТАР), myc, AcV5, AU1, AU5, Е, ECS, Е2, FLAG, гемагглютинин (НА), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, гистидин (His), белок-носитель карбоксила биотина (BCCP) и кальмодулин.

[00234] Белки Cas могут быть предоставлены в любом виде. Например, белок Cas может быть предоставлен в виде белка. Например, белок Cas может быть представлен в виде белка Cas в комплексе с гРНК. В качестве альтернативы, белок Cas может быть предоставлен в виде нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Cas, например, такой нуклеиновой кислоты, как РНК (например, информационная РНК (иРНК)) или ДНК. Необязательно, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть кодон-оптимизирована для эффективной трансляции в белок в конкретной клетке или организме. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть модифицирована с целью замещения кодонов, которые часто используются в клетке бактерии, клетке дрожжей, клетке человека, клетке организма, не являющегося человеком, клетке млекопитающего, клетке грызуна, клетке мыши, клетке крысы или любой другой представляющей интерес клетке-хозяине по сравнению с полинуклеотидной последовательностью, встречающейся в природе. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке человека. Когда нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, вводится в клетку, белок Cas может кратковременно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке.

[00235] Белки Cas, представленные в виде иРНК, могут быть модифицированы для улучшения стабильности и (или) иммуногенных свойств. Модификации могут быть внесены в один или большее число нуклеозидов внутри иРНК. Примеры химических модификаций нуклеиновых оснований иРНК включают в себя псевдоуридин, 1-метил-псевдоуридин и 5-метилцитидин. Например, можно использовать кэпированную и полиаденилированную иРНК Cas, содержащую N1-метилпсевдоуридин. Точно так же иРНК Cas могут быть модифицированы за счет истощения уридина с использованием синонимичных кодонов.

[00236] Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 22 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 21. В другом конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок Cas, содержащий белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью и один или большее число доменов активации транскрипции, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 38 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 38, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 36. В качестве альтернативы, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть функционально связаны с промотором в экспрессионной конструкции. Экспрессионные конструкции включают в себя любые конструкции нуклеиновых кислот, способные регулировать экспрессию гена или другой представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты (например, гена Cas) и которые могут переносить такую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-мишень. Промоторы, которые можно использовать в экспрессионной конструкции, включают в себя промоторы, активные, например, в одной или большем числе из эукариотических клеток, клеток человека, негуманизированных клеток, клеток млекопитающего, негуманизированных клеток млекопитающего, клеток грызунов, клеток мыши, клеток крысы, плюрипотентных клеток, эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, взрослых стволовых клеток, клеток-предшественниц с ограниченным развитием, индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС, англ. «iPS») клеток или эмбриона на одноклеточной стадии. Такие промоторы могут представлять собой, например, условные промоторы, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы или тканеспецифические промоторы.

3. Химерные адаптерные белки

[00237] Описанные в данном документе биосенсорные клетки SAM/тау могут содержать не только нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, VP64), но, необязательно, могут также содержать нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), кодирующие химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок (например, белок оболочки MS2 (МСР)), слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции (например, слитый с р65 и HSF1). Необязательно, указанные химерный белок Cas и (или) химерный адаптерный белок стабильно экспрессируются. Необязательно, указанные клетки содержат геномно интегрированную последовательность, кодирующую химерный белок Cas и (или) геномно интегрированную последовательность, кодирующую химерный адаптерный белок.

[00238] Такие химерные адаптерные белки включают в себя: (а) адаптер (т.е. адаптерный домен или адаптерный белок), который специфически связывается с адаптер-связывающим элементом в гидовой РНК; и (b) один или большее число гетерологичных доменов активации транскрипции. Например, такие слитые белки могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или большее число доменов активации транскрипции (например, два или большее число гетерологичных доменов активации транскрипции, или три или большее число гетерологичных доменов активации транскрипции). В одном из примеров такие химерные адаптерные белки могут включать в себя: (а) адаптер (т.е. адаптерный домен или адаптерный белок), который специфически связывается с адаптер-связывающим элементом в гидовой РНК; и (b) два или большее число доменов активации транскрипции. Например, химерный адаптерный белок может включать в себя: (а) адаптерный белок оболочки MS2, который специфически связывается с одним или большим числом аптаперов MS2 в гидовой РНК (например, с двумя аптамерами MS2 в разных областях в гидовой РНК); и (b) один или большее число (например, два или большее число) доменов активации транскрипции. Например, указанные два домена активации транскрипции могут представлять собой домены активации транскрипции р65 и HSF1 или их функциональные фрагменты или варианты. Тем не менее также представлены химерные адаптерные белки, в которых домены активации транскрипции содержат другие домены активации транскрипции или их функциональные фрагменты или варианты.

[00239] Указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут быть непосредственно слиты с адаптером. В качестве альтернативы, указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут быть связаны с адаптером посредством линкера или комбинации линкеров, или посредством одного или большего числа дополнительных доменов. Аналогичным образом, если присутствуют два или большее число доменов активации транскрипции, то они могут быть непосредственно слиты друг с другом или могут быть связаны друг с другом посредством линкера или комбинации линкеров, или посредством одного или большего числа дополнительных доменов. Линкеры, которые можно использовать в указанных слитых белках, могут включать в себя любую последовательность, которая не влияет на функцию указанных слитых белков. Иллюстративные линкеры представляют собой короткие (например, состоящие из 2-20 аминокислот) и обычно гибкие (например, содержащие аминокислоты с высокой степенью свободы, такие как глицин, аланин и серии) линкеры.

[00240] Указанные один или большее число доменов активации транскрипции и указанный адаптер могут располагаться в любом порядке внутри указанного химерного адаптерного белка. В качестве одного из вариантов, указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут быть С-концевыми по отношению к указанному адаптеру, а указанный адаптер может быть N-концевым по отношению к указанным одному или большему числу доменов активации транскрипции. Например, указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут находиться на С-конце указанного химерного адаптерного белка, а указанный адаптер может находиться на N-конце указанного химерного адаптерного белка. Тем не менее указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут быть С-концевыми по отношению к указанному адаптеру, не находясь на С-конце указанного химерного адаптерного белка (например, если сигнал ядерной локализации находится на С-конце указанного химерного адаптерного белка). Аналогично, указанный адаптер может быть N-концевым по отношению к указанным одному или большему числу доменов активации транскрипции, не находясь на N-конце указанного химерного адаптерного белка (например, если сигнал ядерной локализации находится на N-конце указанного химерного адаптерного белка). В качестве другого варианта, указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут быть N-концевыми по отношению к указанному адаптеру, а указанный адаптер может быть С-концевым по отношению к указанным одному или большему числу доменов активации транскрипции. Например, указанные один или большее число доменов активации транскрипции могут находиться на N-конце указанного химерного адаптерного белка, а указанный адаптер может находиться на С-конце указанного химерного адаптерного белка. В качестве еще одного варианта, если указанный химерный адаптерный белок содержит два или большее число доменов активации транскрипции, то указанные два или большее число доменов активации транскрипции могут фланкировать указанный адаптер.

[00241] Химерные адаптерные белки также могут быть функционально связаны или слиты с дополнительными гетерологичными полипептидами. Указанный слитый или связанный гетерологичный полипептид может быть расположен на N-конце, С-конце или в любой области внутри указанного химерного адаптерного белка. Например, химерный адаптерный белок может дополнительно содержать сигнал ядерной локализации. Конкретный пример такого белка включает в себя белок оболочки MS2 (адаптер), связанный (либо напрямую, либо посредством NLS) с доменом активации транскрипции р65, С-концевым по отношению к белку оболочки MS2 (МСР), и с доменом активации транскрипции HSF1, С-концевым по отношению к домену активации транскрипции р65. Такой белок может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок МСР; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. Например, химерный адаптерный белок может содержать, состоять по существу из, или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или на 100% идентична последовательности химерного адаптерного белка MCP-p65-HSF1, указанной в SEQ ID NO: 37. Аналогичным образом, нуклеиновая кислота, кодирующая химерный адаптерный белок, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности, которая по меньшей мере на 85%, на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или на 100% идентична последовательности, кодирующей химерный адаптерный белок MCP-p65-HSF1, указанной в SEQ ID NO: 39.

[00242] Адаптеры (т.е. адаптерные домены или адаптерные белки) представляют собой домены, связывающие нуклеиновые кислоты (например, ДНК-связывающие домены и (или) РНК-связывающие домены), которые специфически распознают и связываются с определенными последовательностями (например, связываются с определенными последовательностями ДНК и (или) РНК, такими как аптамеры, зависимым от последовательности способом). Аптамеры включают в себя нуклеиновые кислоты, которые, благодаря своей способности принимать определенную трехмерную конформацию, могут связываться с целевой молекулой с высокой аффинностью и специфичностью. Такие адаптеры могут связываться, например, с определенной последовательностью РНК и вторичной структурой. Данные последовательности (т.е. адаптер-связывающие элементы) могут быть сконструированы в гидовую РНК. Например, аптамер MS2 может быть сконструирован в гидовую РНК для специфического связывания белка оболочки MS2 (МСР). Например, указанный адаптер может содержать, состоять по существу из, или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или на 100% идентична последовательности МСР, указанной в SEQ ID NO: 40. Аналогичным образом, нуклеиновая кислота, кодирующая указанный адаптер, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности, которая по меньшей мере на 85%, на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или на 100% идентична последовательности, кодирующей МСР, указанной в SEQ ID NO: 41. Конкретные примеры адаптеров и целевых молекул включают в себя, например, комбинации РНК-связывающий белок - аптамер, которые существуют в пределах разнообразия белков оболочки бактериофага. См., например, US 2019-0284572 и WO 2019/183123, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00243] Описанные в данном документе химерные адаптерные белки содержат один или большее число доменов активации транскрипции. Такие домены активации транскрипции могут представлять собой встречающиеся в природе домены активации транскрипции, могут представлять собой функциональные фрагменты или функциональные варианты встречающихся в природе доменов активации транскрипции, или могут представлять собой сконструированные или синтетические домены активации транскрипции. Домены активации транскрипции, которые можно применять, включают в себя домены, описанные, например, в US 2019-0284572 и WO 2019/183123, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

4. Типы клеток

[00244] Описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау могут представлять собой клетки любого типа и могут быть in vitro, ex vivo или in vivo. Линия биосенсорных клеток Cas/тау или популяция клеток может быть моноклональной клеточной линией или популяцией клеток. Аналогичным образом, описанные в данном документе биосенсорные клетки SAM/тау могут представлять собой клетки любого типа и могут быть in vitro, ex vivo или in vivo. Линия биосенсорных клеток SAM/тау или популяция клеток может быть моноклональной клеточной линией или популяцией клеток. Клетка может происходить из любого источника. Например, клетка может быть эукариотической клеткой, животной клеткой, растительной клеткой или грибковой (например, дрожжевой) клеткой. Такие клетки могут представлять собой клетки рыб или клетки птиц, или такие клетки могут представлять собой клетки млекопитающих, такие как клетки человека, клетки млекопитающих, не относящихся к человеку, клетки грызунов, клетки мыши или клетки крысы. Млекопитающие включают в себя, например, людей, приматов, не относящихся к человеку, человекообразных обезьян, нечеловекообразных обезьян, кошек, собак, лошадей, быков, оленей, бизонов, овец, грызунов (например, мышей, крыс, хомяков, морских свинок), сельскохозяйственных животных (например, виды бычьих, такие как коровы и быки; виды овечьих, такие как овцы и козы; и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). Птицы включают в себя, например, кур, индюков, страусов, гусей и уток. Также включены домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин «животное, не являющееся человеком» исключает людей. В конкретном примере биосенсорные клетки Cas/тау представляют собой клетки человека (например, клетки HEK293T). Аналогичным образом, в конкретном примере биосенсорные клетки SAM/тау представляют собой клетки человека (например, клетки HEK293T).

[00245] Клетка может представлять собой, например, тотипотентную клетку или плюрипотентную клетку (например, эмбриональную стволовую (ЭС) клетку, такую как ЭС-клетка грызунов, ЭС-клетка мыши или ЭС-клетка крысы). Тотипотентные клетки включают в себя недифференцированные клетки, которые могут давать начало любому типу клеток, а плюрипотентные клетки включают в себя недифференцированные клетки, которые обладают способностью развиваться в больше чем один тип дифференцированных клеток. Такие плюрипотентные и (или) тотипотентные клетки могут представлять собой, например, ЭС-клетки или ЭС-подобные клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки. ЭС-клетки включают в себя тотипотентные или плюрипотентные клетки эмбрионального происхождения, которые способны вносить вклад в клеточную популяцию любой ткани развивающегося эмбриона при введении в эмбрион. ЭС-клетки могут происходить из внутренней клеточной массы бластоцисты и способны дифференцироваться в клетки любого из трех зародышевых листков позвоночных (энтодермы, эктодермы и мезодермы).

[00246] Клетка также может представлять собой первичную соматическую клетку или клетку, которая не является первичной соматической клеткой. Соматические клетки могут включать в себя любую клетку, которая не является гаметой, зародышевой клеткой, гаметоцитом или недифференцированной стволовой клеткой. Клетка может также представлять собой первичную клетку. Первичные клетки включают в себя клетки или культуры клеток, которые были выделены непосредственно из организма, органа или ткани. Первичные клетки включают в себя клетки, которые не являются ни трансформированными, ни бессмертными. Они включают в себя любую клетку, полученную из организма, органа или ткани, которая ранее не пересаживалась как культура клеток или ранее пересаживалась как культура клеток, но не может пересаживаться как культура клеток неопределенно долго. Такие клетки могут быть выделены с помощью обычных методик и включают в себя, например, соматические клетки, гематопоэтические клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки, кератиноциты, меланоциты, моноциты, мононуклеарные клетки, адипоциты, преадипоциты, нейроны, глиальные клетки, гепатоциты, скелетные миобласты и гладкомышечные клетки. Например, первичные клетки могут происходить из соединительных тканей, мышечных тканей, тканей нервной системы или эпителиальных тканей.

[00247] Также, такие клетки, как правило, не пролиферируют неопределенно долго, но из-за мутации или изменения избежали нормального клеточного старения и вместо этого могут продолжают делиться. Такие мутации или изменения могут происходить естественным образом или быть вызваны намеренно. Примеры иммортализованных клеток включают в себя клетки яичника китайского хомячка (СНО), эмбриональные клетки почки человека (например, клетки HEK293T) и клетки-фибробасты эмбриона мыши (например, клетки 3Т3). Многочисленные типы иммортализованных клеток хорошо известны. Иммортализованные или первичные клетки включают в себя клетки, которые обычно используются для культивирования или для экспрессии рекомбинантных генов или белков.

[00248] Клетка может также представлять собой дифференцированную клетку, такую как нейрональная клетка (например, нейрональная клетка человека).

В. Способы получения биосенсорных клеток Cas/тау и биосенсорных клеток SAM/тау

[00249] Описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау могут быть получены любыми известными способами. Первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, и белок Cas могут быть введены в клетку в любом виде (например, ДНК, РНК или белок) любыми известными способами. Аналогичным образом, описанные в данном документе биосенсорные клетки SAM/тау могут быть получены любыми известными способами. Первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, химерный белок Cas и химерный адаптерный белок могут быть введены в клетку в любом виде (например, ДНК, РНК или белок) любыми известными способами. «Введение» включает в себя презентацию клетке нуклеиновой кислоты или белка таким образом, что соответствующая последовательность получает доступ внутрь клетки. Представленные в данном документе способы не зависят от конкретного способа введения нуклеиновой кислоты или белка в клетку, только от того, что данная нуклеиновая кислота или данный белок получают доступ внутрь по меньшей мере одной клетки. Способы введения нуклеиновых кислот и белков в различные типы клеток известны и включают в себя, например, способы стабильной трансфекции, способы кратковременной трансфекции и опосредованные вирусами способы. Необязательно, можно использовать нацеливающие векторы.

[00250] Протоколы трансфекции, а также протоколы введения нуклеиновых кислот или белков в клетки могут быть различными. Неограничивающие способы трансфекции включают в себя химические способы трансфекции с использованием липосом; наночастищ фосфата кальция (Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456 - 67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590 - 4; и Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W.H. Freeman and Company, pp. 96 - 97); дендримеров; или катионных полимеров, такие как диэтиламиноэтилдекстран или полиэтиленимин. Нехимические способы включают в себя электропорацию, сонопорацию и оптическую трансфекцию. Трансфекция на основе частиц включает в себя применение генной пушки или трансфекцию с помощью магнита (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277 - 28). Для трансфекции также можно применять вирусные способы.

[00251] Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку также может быть опосредовано электропорацией, интрацитоплазматической инъекцией, вирусной инфекцией, аденовирусом, аденоассоциированным вирусом, лентивирусом, ретровирусом, трансфекцией, липид-опосредованной трансфекцией или нуклеофекцией. Нуклеофекция представляет собой усовершенствованную технологию электропорации, которая позволяет доставлять субстраты нуклеиновых кислот не только в цитоплазму, но также через ядерную мембрану и в ядро. В дополнение к этому, для применения нуклеофекции в описанных в данном документе способах обычно требуется гораздо меньше клеток, чем при обычной электропорации (например, всего около 2 миллионов по сравнению с 7 миллионами при обычной электропорации). В одном из примеров нуклеофекция выполняется с использованием системы LONZA^® NUCLEOFECTOR™.

[00252] Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку также можно осуществить с помощью микроинъекции. Микроинъекция иРНК предпочтительно осуществляется в цитоплазму (например, для доставки иРНК непосредственно в клеточную систему трансляции), тогда как микроинъекция белка или ДНК, кодирующей белок, предпочтительно осуществляется в ядро. В качестве альтернативы, микроинъекция может осуществляться с помощью инъекции как в ядро, так и в цитоплазму: сначала игла может быть введена в ядро, и может быть произведена инъекция первого количества, а при извлечении иглы из клетки может быть введено второе количество в цитоплазму. Способы проведения микроинъекций хорошо известны. См., например, работу Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 15022 - 15026; и Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 9354 - 9359.

[00253] Другие способы введения нуклеиновой кислоты или белков в клетку могут включать в себя, например, векторную доставку, опосредованную частицами доставку, опосредованную экзосомами доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку, опосредованную проникающим в клетку пептидом доставку или опосредованную имплантируемым устройством доставку. Способы введения нуклеиновых кислот или белков субъекту для модификации клеток in vivo описаны в другой части данного документа.

[00254] В одном примере первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, и белок Cas могут быть введены с помощью вирусной трансдукции, такой как лентивирусная трансдукция.

[00255] Скрининг клеток, которые содержат первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, и белок Cas, можно проводить любыми известными способами.

[00256] В качестве одного из примеров, можно применять репортерные гены для скрининга клеток, которые содержат белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, или второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером. Иллюстративные репортерные гены включают в себя гены, кодирующие люциферазу, β-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), DsRed, ZsGreen, MmGFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, Cerulean, T-Sapphire и щелочную фосфатазу. Например, если первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки (например, CFP и YFP), то клетки, содержащие данные репортеры, могут быть отобраны с помощью технологии проточной цитометрии для отбора дважды положительных клеток. Затем данные дважды положительные клетки могут быть объединены для получения поликлональной линии, или могут быть получены моноклональные линии из одиночных дважды положительных клеток.

[00257] В качестве одного из примеров, можно применять маркеры отбора для скрининга клеток, которые содержат белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, или второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером. Примеры маркеров отбора включают в себя неомицинфосфотрансферазу (neo^г), гигромицин-В-фосфотрансферазу (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазу (puro^г), бластицидин-S-дезаминазу (bsr^г), ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (gpt) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-k). Другой иллюстративный маркер отбора представляет собой белок устойчивости к блеомицину, кодируемый геном Sh ble (ген блеомицина из Streptoalloteichus hindustanus), который придает устойчивости к зеоцину (флеомицину D1).

[00258] Положительные в отношении агрегации тау-белка (Аг[+]) клетки, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, что означает, что агрегаты содержащего повторы домена тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах со временем, могут быть получены, например, путем засева агрегатами тау-белка. Например, наивные отрицательные в отношении агрегации тау-белка (Аг[-]) биосенсорные клетки Cas/тау, описанные в данном документе, могут быть обработаны рекомбинантным фибриллизованным тау-белком (например, рекомбинантным фибриллизованным доменом тау-белка, содержащим повторы) для засева агрегации содержащего повторы домена тау-белка, стабильно экспрессируемого данными клетками. Аналогичным образом, наивные отрицательные в отношении агрегации тау-белка (Аг[-]) биосенсорные клетки SAM/тау, описанные в данном документе, могут быть обработаны рекомбинантным фибриллизованным тау-белком (например, рекомбинантным фибриллизованным доменом тау-белка, содержащим повторы) для засева агрегации содержащего повторы домена тау-белка, стабильно экспрессируемого данными клетками. Фибриллизованный содержащий повторы домен тау-белка может быть таким же, как содержащий повторы домен тау-белка, стабильно экспрессируемый клетками, или отличаться от него. Необязательно, рекомбинантный фибриллизованный тау-белок может быть смешан с липофектаминовым реагентом. Затем засеянные клетки могут быть серийно разведены для получения клонов-производных от одиночных клеток и для идентификации клональных линий клеток, в которых агрегаты содержащих повторы доменов тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах с течением времени.

[00259] В качестве другого примера, положительные в отношении агрегации тау-белка (Аг[+]) клетки, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, что означает, что агрегаты содержащего повторы домена тау-белка стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах со временем, могут быть получены, например, путем засева клеток (например, отрицательных в отношении агрегации тау-белка) клеточным лизатом из положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Это «максимальный засев», который описывается в приведенных в данном документе примерах. Например, клетки можно засеять, используя среду, содержащую клеточный лизат (например, свежую среду, содержащую клеточный лизат). Термин «максимальный засев» может относиться к засеву, который сам по себе индуцирует агрегацию тау-белка в большинстве отрицательных в отношении агрегации тау-белка биосенсорных клеток. Термин «минимальный засев» может относиться к засеву, который сам по себе недостаточен для индукции агрегации тау-белка в отрицательных в отношении агрегации тау-белка биосенсорных клетках (или только минимально индуцирует агрегацию тау-белка), но сенсибилизирует такие клетки к индукции агрегации.

[00260] Количество или концентрация клеточного лизата в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация клеточного лизата в среде может составлять от около 0,1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл или от около 2,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл среды (например, свежей культуральной среды). Например, клеточный лизат в культуральной среде может находиться в концентрации от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл или может находиться в концентрации около 1,5 мкг/мл, около 2 мкг/мл, около 2,5 мкг/мл, около 3 мкг/мл, около 3,5 мкг/мл, около 4 мкг/мл, около 4,5 мкг/мл или около 5 мкг/мл. Необязательно, клеточный лизат может находиться в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00261] Клетки для продуцирования лизата могут быть собраны в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00262] Клеточный лизат можно, например, получать с помощью обработки ультразвуком указанных положительных в отношении агрегации тау-белка клеток (например, клеток, собранных в буфере с ингибиторами протеаз, как описано выше) в течение любого подходящего периода времени. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 1 минуты до около 6 минут, от около 1 минуты до около 5 минут, от около 1 минуты до около 4 минут, от около 1 минуты до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 2 минут до около 5 минут, от около 2 минут до около 4 минут, от около 2 минут до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 3 минут до около 5 минут или от около 3 минут до около 4 минут. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 2 минут до около 4 минут или в течение около 3 минут.

[00263] Необязательно, среда содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда содержит липофектамин. Необязательно, среда не содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда не содержит липофектамин. Количество или концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 0,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3 мкл/мл или от около 2 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл среды (например, свежей среды). Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, или она может составлять около 1,5 мкл/мл, около 2 мкл/мл, около 2,5 мкл/мл, около 3 мкл/мл, около 3,5 мкл/мл или около 4 мкл/мл.

[00264] Распространение тау-белка от клетки к клетке также может быть результатом агрегационной активности тау-белка, секретируемого клетками, содержащими агрегаты. Например, клетки Аг[+] или клетки, сенсибилизированные к превращению в клетки Аг[+] (например, сенсибилизированные к активности по засеву тау-белка или к активности по агрегации тау-белка), могут быть получены путем совместного культивирования биосенсорных клеток Аг[-] Cas/тау с клетками Аг[+]. Аналогичным образом, клетки Аг[+] или клетки, сенсибилизированные к превращению в клетки Аг[+] (например, сенсибилизированные к активности по засеву тау-белка или к активности по агрегации тау-белка), могут быть получены путем совместного культивирования биосенсорных клеток Аг[-] SAM/тау с клетками Аг[+].

[00265] Клетки Аг[+] или клетки, сенсибилизированные к превращению в клетки Аг[+] (например, сенсибилизированные к активности по засеву тау-белка или к активности по агрегации тау-белка), также могут быть получены путем применения кондиционированной среды, собранной от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Это «минимальный засев», который описывается в приведенных в данном документе примерах. Кондиционированная среда относится к отработанной среде, собранной от культивируемых клеток. Она содержит метаболиты, факторы роста и белки внеклеточного матрикса, секретируемые в среду культивируемыми клетками. Применение кондиционированной среды не предполагает совместного культивирования с клетками Аг[+] (т.е. наивные клетки Аг[-] не культивируются совместно с клетками Аг[+]). В качестве одного из примеров, кондиционированная среда может быть получена путем сбора среды, которая находилась на конфлюентных клетках Аг[+]. Среда могла находиться на конфлюентных клетках Аг[+] в течение около 12 часов, около 24 часов, около 2 суток, около 3 суток, около 4 суток, около 5 суток, около 6 суток, около 7 суток, около 8 суток, около 9 суток или около 10 суток. Например, среда могла находиться на конфлюентных клетках Аг[+] в течение от около 1 суток до около 7 суток, от около 2 суток до около 6 суток, от около 3 суток до около 5 суток или около 4 суток. Кондиционированная среда может затем наноситься на наивные (Аг[-]) биосенсорные клетки Cas/тау в комбинации со свежей средой. Аналогичным образом, кондиционированная среда может затем применяться к наивным (Аг[-]) биосенсорным клеткам SAM/тау в комбинации со свежей средой. Соотношение кондиционированной среды и свежей среды может составлять, например, около 10:1, около 9:1, около 8:1, около 7:1, около 6:1, около 5:1, около 4:1, около 3:1, около 2:1, около 1:1, около 1:2, около 1:3, около 1:4, около 1:5, около 1:6, около 1:7, около 1:8, около 1:9 или около 1:10. Например, соотношение кондиционированной среды и свежей среды может составлять от около 5:1 до около 1:1, от около 4:1 до около 2:1, или около 3:1. Например, он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 90% из кондиционированной среды и на около 10% из свежей среды, на около 85% из кондиционированной среды и на около 15% из свежей среды, на около 80% из кондиционированной среды и на около 20% из свежей среды, на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды, на около 70% из кондиционированной среды и на около 30% из свежей среды, на около 65% из кондиционированной среды и на около 35% из свежей среды, на около 60% из кондиционированной среды и на около 40% из свежей среды, на около 55% из кондиционированной среды и на около 45% из свежей среды, на около 50% из кондиционированной среды и на около 50% из свежей среды, на около 45% из кондиционированной среды и на около 55% из свежей среды, на около 40% из кондиционированной среды и на около 60% из свежей среды, на около 35% из кондиционированной среды и на около 65% из свежей среды, на около 30% из кондиционированной среды и на около 70% из свежей среды, на около 25% из кондиционированной среды и на около 75% из свежей среды, на около 20% из кондиционированной среды и на около 80% из свежей среды, на около 15% из кондиционированной среды и на около 85% из свежей среды или на около 10% из кондиционированной среды и на около 90% из свежей среды. В одном из примеров он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в среде, которая включает в себя по меньшей мере около 50% кондиционированной среды и не больше чем около 50% свежей среды. В конкретном примере он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды. Необязательно, кондиционированная среда применяется к наивным клеткам Аг[-] без липофектамина или без липосом (например, катионных липосом), или без фосфолипидов. Необязательно, указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00266] Кондиционированная среда без совместного культивирования ранее не применялась в данном контексте в качестве засеивающего агента. Тем не менее кондиционированная среда особенно полезна для крупномасштабных полногеномных скринингов, поскольку тау-фибриллы, полученные in vitro, являются ограниченным ресурсом. В дополнение к этому, кондиционированная среда является более подходящей с физиологической точки зрения, поскольку она продуцируется и секретируется клетками, а не in vitro. Применение кондиционированной среды, как описано в данном документе, обеспечивает повышение активности засева тау-белка (например, ~0,1%, что измерено на основании индукции FRET, как описано в другой части данного документа) для сенсибилизации клеток к агрегации тау-белка.

С. Культуры in vitro и кондиционированная среда

[00267] В данном документе также описаны культуры in vitro или композиции, содержащие описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау и среду для культивирования указанных клеток. В данном документе также описаны культуры in vitro или композиции, содержащие описанные в данном документе биосенсорные клетки SAM/тау и среду для культивирования указанных клеток. Данные клетки могут представлять собой клетки Аг[-] или клетки Аг[+]. Например, культура или композиция могут содержать клетки Аг[-]. В одном из примеров среда содержит кондиционированную среду от клеток Аг[+], как описано в другой части данного документа. Необязательно, клетки в культуре или композиции представляют собой клетки Аг[-] и не культивируются совместно с клетками Аг[+]. Среда может включать в себя смесь кондиционированной среды и свежей среды. В качестве одного из примеров, соотношение кондиционированной среды и свежей среды может составлять, например, около 10:1, около 9:1, около 8:1, около 7:1, около 6:1, около 5:1, около 4:1, около 3:1, около 2:1, около 1:1, около 1:2, около 1:3, около 1:4, около 1:5, около 1:6, около 1:7, около 1:8, около 1:9 или около 1:10. Например, соотношение кондиционированной среды и свежей среды может составлять от около 5:1 до около 1:1, от около 4:1 до около 2:1, или около 3:1. Например, он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 90% из кондиционированной среды и на около 10% из свежей среды, на около 85% из кондиционированной среды и на около 15% из свежей среды, на около 80% из кондиционированной среды и на около 20% из свежей среды, на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды, на около 70% из кондиционированной среды и на около 30% из свежей среды, на около 65% из кондиционированной среды и на около 35% из свежей среды, на около 60% из кондиционированной среды и на около 40% из свежей среды, на около 55% из кондиционированной среды и на около 45% из свежей среды, на около 50% из кондиционированной среды и на около 50% из свежей среды, на около 45% из кондиционированной среды и на около 55% из свежей среды, на около 40% из кондиционированной среды и на около 60% из свежей среды, на около 35% из кондиционированной среды и на около 65% из свежей среды, на около 30% из кондиционированной среды и на около 70% из свежей среды, на около 25% из кондиционированной среды и на около 75% из свежей среды, на около 20% из кондиционированной среды и на около 80% из свежей среды, на около 15% из кондиционированной среды и на около 85% из свежей среды или на около 10% из кондиционированной среды и на около 90% из свежей среды. В одном из примеров он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в среде, которая включает в себя по меньшей мере около 50% кондиционированной среды и не больше чем около 50% свежей среды. В конкретном примере он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды. Необязательно, среда содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды. Необязательно, среда не содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды. Необязательно, среда не содержит липофектамин.

D. Культуры in vitro и среда, содержащая лизат из положительных в отношении агрегации тау-белка клеток

[00268] В данном документе также описаны культуры in vitro или композиции, содержащие описанные в данном документе биосенсорные клетки Cas/тау и среду для культивирования указанных клеток. В данном документе также описаны культуры in vitro или композиции, содержащие описанные в данном документе биосенсорные клетки SAM/тау и среду для культивирования указанных клеток. В одном из примеров среда содержит клеточный лизат из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Данные клетки могут представлять собой клетки Аг[-] или клетки Аг[+]. Например, культура или композиция могут содержать клетки Аг[-]. Необязательно, клетки в культуре или композиции представляют собой клетки Аг[-] и не культивируются совместно с клетками Аг[+]. Среда может содержать смесь из свежей среды и клеточного лизата.

[00269] Количество или концентрация клеточного лизата в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация клеточного лизата в среде может составлять от около 0,1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл или от около 2,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл среды (например, свежей культуральной среды). Например, клеточный лизат в культуральной среде может находиться в концентрации от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл или может находиться в концентрации около 1,5 мкг/мл, около 2 мкг/мл, около 2,5 мкг/мл, около 3 мкг/мл, около 3,5 мкг/мл, около 4 мкг/мл, около 4,5 мкг/мл или около 5 мкг/мл. Необязательно, клеточный лизат может находиться в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00270] Клетки для продуцирования лизата могут быть собраны в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00271] Клеточный лизат можно, например, получать с помощью обработки ультразвуком указанных положительных в отношении агрегации тау-белка клеток (например, клеток, собранных в буфере с ингибиторами протеаз, как описано выше) в течение любого подходящего периода времени. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 1 минуты до около 6 минут, от около 1 минуты до около 5 минут, от около 1 минуты до около 4 минут, от около 1 минуты до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 2 минут до около 5 минут, от около 2 минут до около 4 минут, от около 2 минут до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 3 минут до около 5 минут или от около 3 минут до около 4 минут. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 2 минут до около 4 минут или в течение около 3 минут.

[00272] Необязательно, среда содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда содержит липофектамин. Необязательно, среда не содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда не содержит липофектамин. Количество или концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 0,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3 мкл/мл или от около 2 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл среды (например, свежей среды). Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, или она может составлять около 1,5 мкл/мл, около 2 мкл/мл, около 2,5 мкл/мл, около 3 мкл/мл, около 3,5 мкл/мл или около 4 мкл/мл.

III. Библиотеки гидовых РНК для нокаута генов

[00273] В способах скрининга CRISPRn, описанных в данном документе, применяются библиотеки CRISPR гидовых РНК (гРНК) для нокаута генов, такие как полногеномные библиотеки гРНК для нокаута генов. Нуклеазы Cas, такие как Cas9, могут быть запрограммированы на индукцию двухцепочечных разрывов в определенных геномных локусах с помощью гРНК, предназначенных для нацеливания на определенные целевые последовательности. Поскольку специфичность нацеливания белков Cas обеспечивается короткими гРНК, возможен объединенный функциональный скрининг в масштабе генома. Такие библиотеки имеют несколько преимуществ перед другими библиотеками, такими как библиотеки коротких шпилечных РНК (кшРНК, англ. «shRNA»), которые снижают экспрессию белка за счет нацеливания на иРНК. Напротив, библиотеки гРНК достигают нокаута за счет мутаций сдвига рамки считывания, введенных в геномные кодирующие области генов.

[00274] В способах скрининга CRISPRa, описанных в данном документе, применяются библиотеки CRISPR гидовых РНК (гРНК) для активации транскрипции, такие как полногеномные библиотеки гРНК для активации транскрипции. Системы SAM могут быть запрограммированы на активацию транскрипции генов в определенных геномных локусах с помощью гРНК, предназначенных для нацеливания на определенные целевые последовательности. Поскольку специфичность нацеливания белков Cas обеспечивается короткими гРНК, возможен объединенный функциональный скрининг в масштабе генома.

[00275] гРНК в библиотеке могут быть нацелены на любое число генов. Например, гРНК могут быть нацелены на около 50 или большее число генов, на около 100 или большее число генов, на около 200 или большее число генов, на около 300 или большее число генов, на около 400 или большее число генов, на около 500 или большее число генов, на около 1000 или большее число генов, на около 2000 или большее число генов, на около 3000 или большее число генов, на около 4000 или большее число генов, на около 5000 или большее число генов, на около 10000 или большее число генов, или на около 20000 или большее число генов. В некоторых библиотеках гРНК могут быть выбраны для нацеливания на гены в конкретном сигнальном пути. Некоторые библиотеки представляют собой полногеномные библиотеки.

[00276] Полногеномные библиотеки включают в себя одну или большее число гРНК (например, егРНК), нацеленных на каждый ген в геноме. Целевой геном может представлять собой геном любого типа. Например, геном может представлять собой эукариотический геном, геном млекопитающего, геном млекопитающего, отличного от человека, геном грызунов, геном мыши, геном крысы или геном человека. В одном из примеров целевой геном представляет собой геном человека.

[00277] гРНК могут быть нацелены на любое число последовательностей в каждом отдельном целевом гене. В некоторых библиотеках нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на от около 2 до около 10, от около 2 до около 9, от около 2 до около 8, от около 2 до около 7, от около 2 до около 6, от около 2 до около 5, от около 2 до около 4 или от около 2 до около 3 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере около 2, на по меньшей мере около 3, на по меньшей мере около 4, на по меньшей мере около 5 или на по меньшей мере около 6 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве другого конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на от около 3 до около 6 или на от около 4 до около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[00278] Например, библиотеки могут быть нацелены на гены со средним охватом около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10 гРНК на ген. В конкретном примере библиотека может быть нацелена на гены со средним охватом около 3-4 гРНК на ген или около 6 гРНК на ген.

[00279] гРНК могут быть нацелены на любую желаемую область в целевых генах. гРНК CRISPRn могут быть сконструированы для нацеливания на кодирующие области генов таким образом, что расщепление соответствующим белком Cas приведет к мутациям вставки/делеции (В/Д) со сдвигом рамки считывания, которые приводят к образованию аллеля с потерей функции. Более конкретно, мутации со сдвигом рамки считывания могут быть достигнуты с помощью нацеленных разрывов двухцепочечных ДНК и последующей мутагенной репарации через путь негомологичного соединения концов (НГСК), который приводит к образованию В/Д в месте разрыва. В/Д, вводимые в разрывы двухцепочечных ДНК, являются случайными мутациями, при этом некоторые В/Д приводят к мутациям со сдвигом рамки считывания, которые вызывают преждевременную терминацию соответствующего гена.

[00280] В некоторых библиотеках CRISPRn каждая гРНК нацелена на конститутивный экзон, если это возможно. В некоторых библиотеках CRISPRn каждая гРНК нацелена на 5'-конститутивный экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гРНК нацелена на первый экзон, второй экзон или третий экзон (с 5'-конца гена), если это возможно.

[00281] В качестве одного из примеров, гРНК в библиотеке CRISPRn могут быть нацелены на конститутивные экзоны. Конститутивные экзоны представляют собой экзоны, которые неизменно сохраняются после сплайсинга. Экзоны, экспрессируемые во всех тканях, можно рассматривать как конститутивные экзоны для нацеливания гРНК. гРНК в библиотеке могут быть нацелены на конститутивные экзоны вблизи 5'-конца каждого гена. Необязательно, первый и последний экзоны каждого гена могут быть исключены из потенциальных мишеней. Необязательно, любой экзон, содержащий сайт альтернативного сплайсинга, может быть исключен из потенциальных мишеней. Необязательно, два наиболее ранних экзона, отвечающих указанным выше критериям, выбираются в качестве потенциальных мишеней. Необязательно, экзоны 2 и 3 выбираются в качестве потенциальных мишеней (например, если конститутивные экзоны не идентифицированы). Кроме того, гРНК в библиотеке могут быть выбраны и сконструированы таким образом, чтобы минимизировать нецелевые эффекты.

[00282] В конкретном примере, полногеномная библиотека или библиотеки гРНК CRISPRn содержат егРНК, нацеленные на 5'-конститутивные экзоны > 18000 генов в геноме человека со средним охватом ~ 6 егРНК на ген, при этом каждый целевой сайт был выбран с целью минимизации нецелевой модификации.

[00283] гРНК CRISPRa могут быть сконструированы для нацеливания на последовательности, примыкающие к сайту начала транскрипции гена. Например, целевая последовательность может быть расположена в пределах 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, ПО, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1 пары оснований от сайта начала транскрипции. Например, каждая гРНК в библиотеке CRISPRa может быть нацелена на последовательность в пределах 200 п.о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции. Необязательно, целевая последовательность находится в пределах области из 200 пар оснований в направлении к 5' от сайта начала транскрипции и 1 пары оснований направлении к 3' от сайта начала транскрипции (от -200 до +1).

[00284] гРНК в полногеномной библиотеке могут находиться в любом виде. Например, библиотека гРНК может быть упакована в вирусный вектор, такой как ретровирусные векторы, лентивирусные векторы или аденовирусные векторы. В конкретном примере библиотека гРНК упакована в лентивирусные векторы. Векторы могут дополнительно включать в себя репортерные гены или маркеры отбора для облегчения отбора клеток, которые получают векторы. Примеры таких репортерных генов и маркеров отбора описаны в другой части данного документа. В качестве одного из примеров, маркер отбора может представлять собой маркер, который придает устойчивость к лекарственному средству, такой как неомицинфосфотрансфераза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, пуромицин-N-ацетилтрансфераза и бластицидин-S-дезаминаза. Другой иллюстративный маркер отбора представляет собой белок устойчивости к блеомицину, кодируемый геном Sh ble (ген блеомицина из Streptoalloteichus hindustanus), который придает устойчивости к зеоцину (флеомицину D1). Например, клетки можно отбирать с помощью лекарственного средства (например, пуромицина), таким образом, что только клетки, трансдуцированные конструкцией гидовой РНК, сохраняются для дальнейшего применения в проведении скрининга.

А. Гидовые РНК

[00285] «Гидовая РНК», или «гРНК», представляет собой молекулу РНК, которая связывается с белком Cas (например, с белком Cas9) и направляет белок Cas в определенную область внутри целевой ДНК. Гидовые РНК могут содержать два сегмента: «сегмент нацеливания на ДНК» и «сегмент связывания с белком». «Сегмент» включает в себя часть или область молекулы, такую как непрерывный участок нуклеотидов в РНК. Некоторые гРНК, например, гРНК для Cas9, могут содержать две отдельные молекулы РНК: «активирующую РНК» (например, тракрРНК) и «нацеливающую РНК» (например, CRISPR РНК или крРНК). Другие гРНК представляют собой одну молекулу РНК (полинуклеотид одной РНК), которую также можно назвать «одномолекулярной гРНК», «единой гидовой РНК» или «егРНК». См., например, патентные документы WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578 и WO 2014/131833, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Для Cas9, например, единая гидовая РНК может содержать крРНК, слитую с тракрРНК (например, с помощью линкера). Для Cpf1, например, необходима только крРНК для достижения связывания с целевой последовательностью. Термины «гидовая РНК» и «гРНК» включают в себя как двухмолекулярные (т.е. модульные) гРНК, так и одномолекулярные гРНК.

[00286] Иллюстративная двухмолекулярная гРНК содержит крРНК-подобную («CRISPR РНК» или «нацеливающую РНК», или «крРНК», или «крРНК-повтор») молекулу и соответствующую тракрРНК-подобную («трансактивирующую CRISPR РНК» или «активирующую РНК», или «тракрРНК») молекулу. крРНК содержит как сегмент (одноцепочечный) гРНК для нацеливания на ДНК, так и участок нуклеотидов, который формирует половину дуплекса дцРНК сегмента гРНК для связывания с белком. Пример хвоста крРНК, расположенного в направлении к 3' от сегмента нацеливания на ДНК, включает в себя, состоит по существу из, или состоит из GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 23). Любой из описанных в данном документе сегментов нацеливания на ДНК может быть присоединен к 5'-концу SEQ ID NO: 23 с образованием крРНК.

[00287] Соответствующая тракрРНК (активирующая РНК) содержит отрезок нуклеотидов, который формирует другую половину дуплекса дцРНК сегмента гРНК для связывания с белком. Участок нуклеотидов крРНК комплементарен участку нуклеотидов тракрРНК и гибридизуется с участком нуклеотидов тракрРНК с образованием дуплекса дцРНК сегмента гРНК для связывания с белком. Таким образом, можно сказать, что каждая крРНК имеет соответствующую тракрРНК. Иллюстративная последовательность тракрРНК содержит, состоит по существу из, или состоит из

AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 24). Другие иллюстративные последовательности тракрРНК содержат, состоят по существу из, или состоят из любого из

AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 28) или

GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 29).

[00288] В системах, в которых необходимы как крРНК, так и тракрРНК, крРНК и соответствующая тракрРНК гибридизуются с образованием гРНК. В системах, в которых необходима только крРНК, крРНК может представлять собой гРНК. крРНК дополнительно обеспечивает одноцепочечный сегмент нацеливания на ДНК, который гибридизуется с комплементарной цепью целевой ДНК. При использовании для модификации внутри клетки, точная последовательность данной молекулы крРНК или тракрРНК может быть разработана так им образом, чтобы быть специфичной для видов, в которых будут использоваться данные молекулы РНК. См., например, работы Mali et al. (2013) Science 339: 823 - 826; Jinek et al. (2012) Science 337: 816 - 821; Hwang et al. (2013) Mtf. Biotechnol. 31: 227 - 229; Jiang et al. (2013)Nat. Biotechnol. 31: 233 - 239; и Cong et al. (2013) Science 339: 819 - 823, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00289] Сегмент нацеливания на ДНК (крРНК) данной гРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности на комплементарной цепи целевой ДНК, как более подробно описано ниже. Сегмент гРНК для нацеливания на ДНК взаимодействует с целевой ДНК специфическим для последовательности образом посредством гибридизации (т.е. спаривания оснований). Как таковая, нуклеотидная последовательность сегмента нацеливания на ДНК может варьировать и определяет местоположение внутри целевой ДНК, в котором будут взаимодействовать гРНК и целевая ДНК. Сегмент данной гРНК для нацеливания на ДНК может быть модифицирован для гибридизации с любой желаемой последовательностью в целевой ДНК. Встречающиеся в природе крРНК различаются в зависимости от системы CRISPR/Cas и организма, но часто содержат сегмент нацеливания длиной от 21 нуклеотида до 72 нуклеотидов, фланкированный двумя прямыми повторами (ПП) длиной от 21 нуклеотида до 46 нуклеотидов (см., например, патентный документ WO 2014/131833, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В случае S. pyogenes, длина ПП составляет 36 нуклеотидов, а длина сегмента нацеливания составляет 30 нуклеотидов. Расположенный в 3'-направлении ПП комплементарен соответствующей тракрРНК и гибридизуется с соответствующей тракрРНК, которая в свою очередь связывается с белком Cas.

[00290] Сегмент нацеливания на ДНК может иметь, например, длину по меньшей мере около 12, 15, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40 нуклеотидов. Такие сегменты нацеливания на ДНК могут иметь, например, длину от около 12 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, от около 12 нуклеотидов до около 80 нуклеотидов, от около 12 нуклеотидов до около 50 нуклеотидов, от около 12 нуклеотидов до около 40 нуклеотидов, от около 12 нуклеотидов до около 30 нуклеотидов, от около 12 нуклеотидов до около 25 нуклеотидов или от около 12 нуклеотидов до около 20 нуклеотидов. Например, сегмент нацеливания на ДНК может состоять из от около 15 нуклеотидов до около 25 нуклеотидов (например, из от около 17 нуклеотидов до около 20 нуклеотидов, или из около 17 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 19 нуклеотидов или 20 нуклеотидов). См., например, патентный документ US 2016/0024523, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Для Cas9 из S. pyogenes типичный сегмент нацеливания на ДНК составляет от 16 нуклеотидов до 20 нуклеотидов в длину или от 17 нуклеотидов до 20 нуклеотидов в длину. Для Cas9 из S. aureus типичный сегмент нацеливания на ДНК составляет от 21 нуклеотида до 23 нуклеотидов в длину. Для Cpf1 типичный сегмент нацеливания на ДНК составляет по меньшей мере 16 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 18 нуклеотидов в длину.

[00291] ТракрРНК могут иметь любой вид (например, полноразмерные тракрРНК или активные частичные тракрРНК) и различную длину. Они могут включать в себя первичные транскрипты или процессированные формы. Например, тракрРНК (как часть единой гидовой РНК или как отдельная молекула, представляющая собой часть двухмолекулярной гРНК) могут содержать, состоять по существу из, или состоять из всей или части последовательности тракрРНК дикого типа (например, из около или больше чем из около 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или большего числа нуклеотидов из последовательности тракрРНК дикого типа). Примеры последовательностей тракрРНК дикого типа из S. pyogenes включают в себя 171-нуклеотидную, 89-нуклеотидную, 75-нуклеотидную и 65-нуклеотидную версии. См., например, Deltcheva etal. (2011) Nature 471: 602 - 607; WO 2014/093661, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Примеры тракрРНК в единых гидовых РНК (егРНК) включают в себя сегменты тракрРНК, обнаруживаемые в +48, +54, +67 и +85 версиях егРНК, где «+n» указывает, что в егРНК включены нуклеотиды из тракрРНК дикого типа вплоть до +n нуклеотида из тракрРНК дикого типа. См. патентный документ US 8697359, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00292] Процент комплементарности между сегментом гидовой РНК для нацеливания на ДНК и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100%). Процент комплементарности между сегментом нацеливания на ДНК и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять по меньшей мере 60% в отношении около 20 смежных нуклеотидов. Например, процент комплементарности между сегментом нацеливания на ДНК и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять 100% в отношении 14 смежных нуклеотидов на 5'-конце данной комплементарной цепи целевой ДНК и вплоть до 0% в отношении остальных нуклеотидов. В таком случае можно считать, что сегмент нацеливания на ДНК составляет 14 нуклеотидов в длину. В качестве другого примера, процент комплементарности между сегментом нацеливания на ДНК и комплементарной цепью целевой ДНК может составлять 100% в отношении семи смежных нуклеотидов на 5'-конце данной комплементарной цепи целевой ДНК и вплоть до 0% в отношении остальных нуклеотидов. В таком случае можно считать, что сегмент нацеливания на ДНК составляет 7 нуклеотидов в длину. В некоторых гидовых РНК по меньшей мере 17 нуклеотидов в сегменте нацеливания на ДНК комплементарны комплементарной цепи целевой ДНК. Например, сегмент нацеливания на ДНК может составлять 20 нуклеотидов в длину и может содержать 1, 2 или 3 несовпадения с комплементарной цепью целевой ДНК. В одном из примеров несовпадения не являются смежными с областью комплементарной цепи, соответствующей последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (РАМ) (т.е. с обратным комплементом последовательности РАМ) (например, несовпадения находятся на 5'-конце сегмента гидовой РНК для нацеливания на ДНК, или несоответствия находятся на расстоянии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 пар оснований от области на комплементарной цепи, соответствующей последовательности РАМ).

[00293] Белок-связывающий сегмент гРНК может содержать два участка нуклеотидов, которые комплементарны друг другу. Комплементарные нуклеотиды белок-связывающего сегмента гибридизуются с образованием дуплекса двухцепочечной РНК (дцРНК). Сегмент данной гРНК для связывания с белком взаимодействует с белком Cas, и гРНК направляет связанный белок Cas к определенной нуклеотидной последовательности в целевой ДНК с помощью сегмента нацеливания на ДНК.

[00294] Единые гидовые РНК могут содержать сегмент нацеливания на ДНК и последовательность остова (т.е. белок-связывающую последовательность гидовой РНК или Cas-связывающую последовательность гидовой РНК). Например, такие гидовые РНК могут иметь 5'-сегмент нацеливания на ДНК, соединенный с 3'-последовательностью остова. Иллюстративные последовательности остова содержат, состоят по существу или состоят из:

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (версия 1; SEQ ID NO: 17);

GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 2; SEQ ID NO: 18);

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 3; SEQ ID NO: 19); и

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 4; SEQ ID NO: 20). Другие иллюстративные последовательности остова содержат, состоят по существу или состоят из:

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (версия 5; SEQ ID NO: 30);

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (версия 6; SEQ ID NO: 31); или

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (версия 7; SEQ ID NO: 32).

Гидовые РНК, нацеленные на любую из описанных в данном документе целевых последовательностей для гидовых РНК, могут включать в себя, например, сегмент на 5'-конце гидовой РНК для нацеливания на ДНК, слитый с любой из иллюстративных последовательностей каркаса остова гидовой РНК на 3'-конце гидовой РНК. Это значит, что любой из описанных в данном документе сегментов нацеливания на ДНК может быть присоединен к 5'-концу любой из указанных выше последовательностей остова с образованием единой гидовой РНК (химерной гидовой РНК).

[00295] Гидовые РНК могут включать в себя модификации или последовательности, которые обеспечивают дополнительные желательные свойства (например, модифицированную или регулируемую стабильность; субклеточное нацеливание; отслеживание с помощью флуоресцентной метки; сайт связывания для белка или белкового комплекса и т.п.). Примеры таких модификаций включают в себя, например, 5'-кэп (например, кэп 7-метилгуанилата (m7G)); 3'-полиаденилированный хвост (т.е. 3'-поли(А) хвост); последовательность рибопереключателя (например, для обеспечения возможности регулируемой стабильности и (или) регулируемой доступности для белков и (или) белковых комплексов); последовательность контроля стабильности; последовательность, которая образует дуплекс дцРНК (т.е. шпильку); модификацию или последовательность, которые нацеливают РНК на субклеточную локализацию (например, ядро, митохондрии, хлоропласты и т.п.); модификацию или последовательность, которые обеспечивают отслеживание (например, прямая конъюгация с флуоресцентной молекулой, конъюгация с фрагментом, который облегчает флуоресцентное обнаружение, последовательность, которая обеспечивает возможность флуоресцентного обнаружения, и т.д.); модификацию или последовательность, которые обеспечивают сайт связывания для белков (например, белков, которые действуют на ДНК, включая активаторы транскрипции, репрессоры транскрипции, ДНК-метилтрансферазы, ДНК-деметилазы, гистонацетилтрансферазы, гистондеацетилазы и т.п.); и их комбинации. Другие примеры модификаций включают в себя сконструированные дуплексные шпилечные структуры, сконструированные выпуклые области, сконструированные 3'-шпильки дуплексной шпилечной структуры или любую их комбинацию. См., например, патентный документ US 2015/0376586, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Выпуклая область может представлять собой неспаренную областью нуклеотидов внутри дуплекса, состоящую из крРНК-подобной области и минимальной тракрРНК-подобной области. Выпуклая область может содержать на одной стороне дуплекса неспаренную область 5' - XXXY - 3', где X представляет собой любой пурин, a Y может представлять собой нуклеотид, который может образовывать неоднозначную пару с нуклеотидом из противоположной цепи, и на другой стороне дуплекса неспаренную нуклеотидную область.

[00296] В некоторых случаях может применяться система активации транскрипции, содержащая слитый белок dCas9-VP64, спаренный с MS2-p65-HSF1. Гидовые РНК в таких системах могут быть сконструированы с последовательностями аптамера, присоединенными к тетрапетле егРНК и шпильке 2, предназначенным для связывания димеризованных белков оболочки бактериофага MS2. См., например, работу Konermann et al. (2015) Nature 517 (7536): 583 - 588, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00297] Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут также вызывать врожденный иммунный ответ.Модификации могут способствовать повышению стабильности и снижению иммуногенности. Гидовые РНК могут содержать модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды, включая, например, одно или большее число из следующего: (1) изменение или замена одного или обоих несвязывающих атомов кислорода из фосфата и (или) одного или большего числа связывающих атомов кислорода из фосфата в связи фосфодиэфирного остова; (2) изменение или замена компонента рибозного сахара, такие как изменение или замена 2'-гидроксила в рибозном сахаре; (3) замена фосфатного фрагмента дефосфорилированными линкерами; (4) модификация или замена встречающегося в природе азотистого основания; (5) замена или модификация рибозо-фосфатного остова; (6) модификация 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида (например, удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента); и (7) модификация сахара. Другие возможные модификации гидовой РНК включают в себя модификации или замену урацилов или полиурациловых трактов. См., например, WO 2015/048577 и US 2016/0237455, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Похожие модификации могут быть внесены в нуклеиновые кислоты, кодирующие Cas, такие как иРНК Cas. Например, иРНК Cas могут быть модифицированы путем истощения уридина с использованием синонимичных кодонов.

[00298] В качестве одного из примеров, нуклеотиды на 5'- или 3'-конце гидовой РНК могут включать в себя фосфоротиоатные связи (например, данные основания могут иметь модифицированную фосфатную группу, которая является фосфоротиоатной группой). Например, гидовая РНК может включать в себя фосфоротиоатные связи между 2, 3 или 4 концевыми нуклеотидами на 5'- или 3'-конце гидовой РНК. В качестве другого примера, нуклеотиды на 5'- и (или) 3'-конце гидовой РНК могут иметь 2'-0-метильные модификации. Например, гидовая РНК может включать в себя 2'-0-метильные модификации на 2, 3 или 4 концевых нуклеотидах на 5'- и (или) 3'-конце гидовой РНК (например, на 5'-конце). См., например, WO 2017/173054 А1 и Finn et al. (2018) Cell Reports 22: 1-9, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другие возможные модификации более подробно описаны в других частях данного документа. В конкретном примере гидовая РНК включает в себя 2'-O-метильные аналоги и 3'-фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК. Такие химические модификации могут, например, придавать гидовым РНК повышенную стабильность и защиту от экзонуклеаз, позволяя им сохраняться в клетках дольше, чем немодифицированные гидовые РНК. Такие химические модификации также могут, например, защищать от врожденных внутриклеточных иммунных ответов, которые могут активно разрушать РНК или запускать иммунные каскады, ведущие к гибели клеток.

[00299] В некоторых гидовых РНК (например, единых гидовых РНК) по меньшей мере одна петля (например, две петли) гидовой РНК модифицированы с помощью вставки определенной последовательности РНК, которая связывается с одним или большим числом адаптеров (например, адаптерными белками или доменами). Такие адаптерные белки могут быть использованы для дальнейшего рекрутирования одного или большего числа гетерологичных функциональных доменов, таких как домены активации транскрипции (например, для применения в скрининге CRISPRa в биосенсорных клетках SAM/тау). Примеры слитых белков, содержащих такие адаптерные белки (т.е. химерные адаптерные белки), описаны в другой части данного документа. Например, петля связывания MS2 ggccAACAUGAGGAUCACCCAUGUCUGCAGggcc (SEQ ID NO: 33) может заменять нуклеотиды с +13 на +16 и нуклеотиды с +53 на +56 остова егРНК (каркаса), указанного в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (или в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31), или остова егРНК для системы CRISPR/Cas9 из S. pyogenes, описанной в WO 2016/049258 и Konermann et al. (2015) Nature 517 (7536): 583 - 588, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. См. также патентные документы US 2019-0284572 и WO 2019/183123, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Применяемая в данном документе нумерация гидовых РНК относится к нумерации нуклеотидов в последовательности остова гидовой РНК (т.е. последовательности, расположенной в направлении к 3' от сегмента гидовой РНК, нацеливающего на ДНК). Например, первый нуклеотид остова гидовой РНК пронумерован как +1, второй нуклеотид остова пронумерован как +2 и т.д. Остатки, соответствующие нуклеотидам от +13 до +16 в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (либо в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31), представляют собой последовательность петли в области, охватывающей нуклеотиды от +9 до +21 в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (либо в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31), область, называемую в данном документе тетрапетлей. Остатки, соответствующие нуклеотидам от +53 до +56 в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (либо в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31), представляют собой последовательность петли в области, охватывающей нуклеотиды от +48 до +61 в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (либо в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31), область, называемую в данном документе шпилькой 2. Другие шпилечные последовательности в последовательности с SEQ ID NO: 17 или с SEQ ID NO: 19 (либо в последовательности с SEQ ID NO: 30 или 31) включают в себя шпильку 1 (нуклеотиды от +33 до +41) и шпильку 3 (нуклеотиды от +63 до +75). Получаемая в результате структура представляет собой остов егРНК, в котором каждая из последовательностей тетрапетли и шпильки 2 заменена петлей связывания MS2. Тетрапетля и шпилька 2 выступают из белка Cas9 таким образом, что добавление петли связывания MS2 не должно влиять на какие-либо остатки Cas9. Кроме того, близость сайтов тетрапетли и шпильки 2 к ДНК, указывает на то, что локализация в данных местоположениях может приводить к высокой степени взаимодействия между ДНК и любым рекрутируемым белком, таким как активатор транскрипции. Таким образом, в некоторых егРНК нуклеотиды, соответствующие положениям с +13 по +16, и (или) нуклеотиды, соответствующие положениям с +53 по +56 остова гидовой РНК, указанные в SEQ ID NO: 17 или в SEQ ID NO: 19 (или в SEQ ID NO: 30 или 31), или соответствующие остатки при оптимальном выравнивании с любым из данных остовов/каркасов заменяются отдельными последовательностями РНК, способными связываться с одним или большим числом адаптерных белков или доменов. В качестве альтернативы или дополнения, адаптер-связывающие последовательности могут быть добавлены к 5'-концу или 3'-концу гидовой РНК. Иллюстративный остов гидовой РНК, содержащий петли связывания MS2 в областях тетрапетли и шпильки 2, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 34. Иллюстративная общая единая гидовая РНК, содержащая петли связывания MS2 в областях тетрапетли и шпильки 2, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 35.

[00300] Гидовые РНК могут быть предоставлены в любом виде. Например, гРНК может быть предоставлена в виде РНК, либо в виде двух молекул (отдельные крРНК и тракрРНК), либо в виде одной молекулы (егРНК), и, необязательно, в виде комплекса с белком Cas. гРНК также может быть предоставлена в виде ДНК, кодирующей гРНК. ДНК, кодирующая гРНК, может кодировать одну молекулу РНК (егРНК) или отдельные молекулы РНК (например, отдельные крРНК и тракрРНК). В последнем случае ДНК, кодирующая гРНК, может быть предоставлена как одна молекула ДНК или как отдельные молекулы ДНК, кодирующие крРНК и тракрРНК, соответственно.

[00301] Когда гРНК предоставляется в форме ДНК, гРНК может кратковременно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке. ДНК, кодирующие гРНК, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующие гРНК, могут быть функционально связаны с промотором в экспрессионной конструкции. Например, ДНК, кодирующая гРНК, может находиться в векторе, содержащем гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas. В качестве альтернативы, она может находиться в векторе или плазмиде, отдельной от вектора, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas. Промоторы, которые можно использовать в таких экспрессионных конструкциях, включают в себя промоторы, активные, например, в одной или большем числе из эукариотических клеток, клеток человека, негуманизированных клеток, клеток млекопитающего, негуманизированных клеток млекопитающего, клеток грызунов, клеток мыши, клеток крысы, плюрипотентных клеток, эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, взрослых стволовых клеток, клеток-предшественниц с ограниченным развитием, индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток или эмбриона на одноклеточной стадии. Такие промоторы могут представлять собой, например, условные промоторы, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы или тканеспецифические промоторы. Такие промоторы также могут представлять собой, например, двунаправленные промоторы. Конкретные примеры подходящих промоторов включают в себя: промотор РНК-полимеразы III, такой как промотор U6 человека, промотор U6 полимеразы III крысы или промотор U6 полимеразы III мыши.

[00302] В качестве альтернативы, гРНК могут быть получены различными другими способами. Например, гРНК могут быть получены путем транскрипции in vitro с использованием, например, РНК-полимеразы Т7 (см., например, патентные документы WO 2014/089290 и WO 2014/065596, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). Гидовые РНК также могут представлять собой синтетически произведенные молекулы, полученные с помощью химического синтеза. Например, гидовая РНК может быть химически синтезирована, чтобы включать в себя 2'-O-метильные аналоги и 3'-фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК.

[00303] Гидовые РНК (или нуклеиновые кислоты, кодирующие гидовые РНК) могут находиться в композициях, содержащих одну или большее число гидовых РНК (например, 1, 2, 3, 4 или большее число гидовых РНК) и носитель, повышающий стабильность гидовой РНК (например, носитель, пролонгирующий период при заданных условиях хранения (например, -20°С, 4°С или температура окружающей среды), в течение которого продукты разложения остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5% от веса исходной нуклеиновой кислоты или белка; или повышающий стабильность in vivo). Неограничивающие примеры таких носителей включают в себя микросферы полилактидной кислоты (PLA), микросферы поли-D,L-лактидной-когликолевой кислоты) (PLGA), липосомы, мицеллы, обратные мицеллы, липидные кохлеаты и липидные микротрубочки. Такие композиции могут дополнительно содержать белок Cas, такой как белок Cas9, или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas.

В. Целевые последовательности для гидовых РНК

[00304] Целевые ДНК для гидовых РНК включают в себя последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в ДНК, с которыми будет связываться направленный на ДНК сегмент гРНК, при условии, что существуют достаточные условия для связывания. Подходящие условия для связывания ДНК/РНК включают в себя физиологические условия, обычно присутствующие в клетке. Другие подходящие условия для связывания ДНК/РНК (например, условия в бесклеточной системе) известны в данной области техники (см., например, работу Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.). Цепь целевой ДНК, которая комплементарна гРНК и гибридизуется с гРНК, может быть названа «комплементарной цепью», а цепь целевой ДНК, которая комплементарна «комплементарной цепи» (и, следовательно, не комплементарна белку Cas или гРНК) может быть названа «некомплементарной цепью» или «матричной цепью».

[00305] Целевая ДНК включает в себя как последовательность на комплементарной цепи, с которой гибридизуется гидовая РНК, так и соответствующую последовательность на некомплементарной цепи (например, смежную с мотивом, примыкающим к протоспейсеру (РАМ)). Термин «целевая последовательность для гидовой РНК» при использовании в контексте данного документа относится конкретно к последовательности на некомплементарной цепи, соответствующей (т.е. являющейся обратным комплементом) последовательности, с которой гибридизуется гидовая РНК на комплементарной цепи. Это значит, что целевая последовательность для гидовой РНК относится к последовательности на некомплементарной цепи, смежной с РАМ (например, в направлении к 5' от РАМ в случае Cas9). Целевая последовательность для гидовой РНК эквивалентна нацеливающему на ДНК сегменту гидовой РНК, но с тиминами вместо урацилов. В качестве одного из примеров, целевая последовательность для гидовой РНК применительно к ферменту SpCas9 может относиться к последовательности, расположенной в направлении к 5' от 5'-NGG-3' РАМ на некомплементарной цепи. Гидовая РНК разработана таким образом, чтобы иметь комплементарность к комплементарной цепи целевой ДНК, где гибридизация между нацеливающим на ДНК сегментом гидовой РНК и комплементарной цепью целевой ДНК способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не обязательно требуется при условии, что комплементарность достаточна, чтобы вызвать гибридизацию и способствовать образованию комплекса CRISPR. Если гидовая РНК упоминается в данном документе как нацеленная на целевую последовательность для гидовой РНК, это означает, что данная гидовая РНК гибридизуется с последовательностью комплементарной цепи целевой ДНК, которая является обратным комплементом целевой последовательности для гидовой РНК на некомплементарной цепи.

[00306] Целевая последовательность ДНК или целевая последовательность для гидовой РНК может содержать любой полинуклеотид и может располагаться, например, в ядре или в цитоплазме клетки, или в органелле клетки, такой как митохондрия или хлоропласт.Целевая последовательность ДНК или целевая последовательность для гидовой РНК может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, эндогенную или экзогенную для клетки. Целевая последовательность для гидовой РНК может представлять собой последовательность, кодирующую продукт гена (например, белок), или некодирующую последовательность (например, регуляторную последовательность), или может включать в себя и то, и другое.

[00307] Для систем CRISPRa и SAM может быть предпочтительным, чтобы целевая последовательность была смежной с сайтом начала транскрипции гена. Например, целевая последовательность может быть расположена в пределах 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, ПО, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1 пары оснований от сайта начала транскрипции. Необязательно, целевая последовательность находится в пределах области из 200 пар оснований в направлении к 5' от сайта начала транскрипции и 1 пары оснований направлении к 3' от сайта начала транскрипции (от -200 до +1).

[00308] Сайт-специфическое связывание и расщепление целевой ДНК белком Cas может происходить в местоположениях, определяемых как (i) комплементарноетью спаривания оснований между гидовой РНК и комплементарной цепью целевой ДНК, так и (ii) коротким мотивом, называемым мотивом, примыкающим к протоспейсеру (РАМ), в некомплементарной цепи целевой ДНК. РАМ может фланкировать целевую последовательность для гидовой РНК. Необязательно, целевая последовательность для гидовой РНК может быть фланкирована последовательностью РАМ на 3'-конце (например, для Cas9). В качестве альтернативы, целевая последовательность для гидовой РНК может быть фланкирована последовательностью РАМ на 5'-конце (например, для Cpf1). Например, сайт расщепления для белков Cas может находиться на расстоянии от около 1 пары оснований до около 10 пар оснований или от около 2 пар оснований до около 5 пар оснований (например, 3 пары оснований) в направлении к 5' или в направлении к 3' от последовательности РАМ (например, в пределах целевой последовательности для гидовой РНК). В случае SpCas9, последовательность РАМ (т.е. на некомплементарной цепи) может представлять собой 5'-N₁GG-3', где N₁ представляет собой любой нуклеотид ДНК, и где РАМ находится непосредственно в направлении к 3' от целевой последовательности для гидовой РНК на некомплементарной цепи целевой ДНК. Таким образом, последовательность, соответствующий РАМ на комплементарной цепи (т.е. обратный комплемент) будет представлять собой 5'-CCN₂-3', где N₂ представляет собой любой нуклеотид ДНК и находится непосредственно в направлении к 5' от последовательности, с которой гибридизуется нацеливающий на ДНК сегмент гидовой РНК, на некомплементарной цепи целевой ДНК. В некоторых таких случаях N₁ и N₂ могут быть комплементарными, и пара оснований N₁-N₂ может представлять собой любую пару оснований (например, N₁=C и N₂=G; N_i=G и N₂=С; N₁=A и N₂=Т; или N₁=T и N₂=А). В случае Cas9 из S. aureus, последовательность РАМ может представлять собой NNGRRT или NNGRR, где N может представлять собой A, G, С или Т, a R может представлять собой G или А. В случае Cas9 из С. jejuni, последовательность РАМ может представлять собой, например, NNNNACAC или NNNNRYAC, где N может представлять собой A, G, С или Т, a R может представлять собой G или А. В некоторых случаях (например, для FnCpf1) последовательность РАМ может располагаться в направлении к 5' от 5'-конца и иметь последовательность 5'-TTN-3'.

[00309] Примером целевой последовательности для гидовой РНК является последовательность ДНК из 20 нуклеотидов, непосредственно предшествующая мотиву NGG, которая распознается белком SpCas9. Например, двумя примерами целевых последовательностей для гидовой РНК плюс РАМ являются GN₁₉NGG (последовательность с SEQ ID NO: 25) или N₂₀NGG (последовательность с SEQ ID NO: 26). См., например, патентный документ WO 2014/165825, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Гуанин на 5'-конце может способствовать транскрипции РНК-полимеразой в клетках. Другие примеры целевых последовательностей для гидовой РНК плюс РАМ могут включать в себя два гуаниновых нуклеотида на 5'-конце (например, GGN₂₀NGG; последовательность с SEQ ID NO: 27) для облегчения эффективной транскрипции полимеразой Т7 in vitro. См., например, патентный документ WO 2014/065596, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другие целевые последовательности для гидовой РНК плюс РАМ могут иметь длину от 4 нуклеотидов до 22 нуклеотидов последовательностей с SEQ ID NO: 25-27, включительно с 5' G или GG и 3' GG или NGG. Еще другие целевые последовательности для гидовой РНК плюс РАМ могут иметь длину от 14 нуклеотидов до 20 нуклеотидов последовательностей с SEQ ID NO: 25-27.

[00310] Образование комплекса CRISPR, гибридизованного с целевой ДНК, может приводить к расщеплению одной или обеих цепей целевой ДНК внутри или вблизи области, соответствующей целевой последовательности для гидовой РНК (т.е. целевой последовательности для гидовой РНК на некомплементарной цепи целевой ДНК и обратному комплементу на комплементарной цепи, с которой гибридизуется гидовая РНК). Например, сайт расщепления может находиться в пределах целевой последовательности для гидовой РНК (например, в определенном местоположении по отношению к последовательности РАМ). «Сайт расщепления» включает в себя положение в целевой ДНК, в котором белок Cas вызывает одноцепочечный разрыв или двухцепочечный разрыв. Сайт расщепления может находиться только на одной цепи (например, когда используется никаза) или на обеих цепях двух цепочечной ДНК. Сайты расщепления могут находиться в одном и том же положении на обеих цепях (образуя тупые концы; например, Cas9)) или могут находиться в разных сайтах на каждой цепи (создавая ступенчатые концы (например, выступы); например, Cpf1). Ступенчатые концы могут быть получены, например, с помощью использования двух белков Cas, каждый из которых вызывает одноцепочечный разрыв в сайте расщепления, различном для одной и для другой цепи, тем самым вызывая двухцепочечный разрыв. Например, первая никаза может создавать одноцепочечный разрыв в первой цепи двухцепочечной ДНК (дцДНК), а вторая никаза может создавать одноцепочечный разрыв во второй цепи дцДНК, и, таким образом, создаются последовательности с выступами. В некоторых случаях целевая последовательность для гидовой РНК или сайт расщепления для никазы в первой цепи отделены от целевой последовательности для гидовой РНК или от сайта расщепления для никазы во второй цепи по меньшей мере на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 или 1000 пар оснований.

IV. Способы скрининга в отношении генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка

[00311] Линии биосенсорных клеток Cas/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка. Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток Cas/тау, как описано в другом месте в данном документе, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку засева тау-белка или агрегации тау-белка в целевых клетках.

[00312] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток Cas/тау (например, популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепляет множество генов, что приводит к нокауту генной функции и возникновению генетически модифицированной популяции клеток. Затем указанная генетически модифицированная популяция клеток может быть приведена в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток. Засеянную популяцию клеток можно культивировать с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

[00313] Подобным образом, линии биосенсорных клеток SAM/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов засева или агрегации тау-белка. Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток SAM/тау, как описано в другом месте в данном документе, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку засева тау-белка или агрегации тау-белка в целевых клетках.

[00314] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток SAM/тау (например, популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с химерным белком Cas и химерным адаптерным белком, и данные комплексы активируют транскрипцию множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов и возникновению модифицированной популяции клеток. Затем указанная модифицированная популяция клеток может быть приведена в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток. Засеянную популяцию клеток можно культивировать с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

[00315] Биосенсорные клетки Cas/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки Cas/тау, описанные в другой части данного документа. Аналогичным образом, биосенсорные клетки SAM/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки SAM/тау, описанные в другой части данного документа. Первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка могут быть разными, похожими или одинаковыми. Содержащий повторы домен тау-белка может представлять собой любой из содержащих повторы доменов тау-белка, описанных в другой части данного документа. Например, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут представлять собой содержащие повторы домены тау-белка дикого типа, или могут содержать мутацию, способствующую агрегации (например, патогенную мутацию, способствующую агрегации), такую как мутация тау-белка P301S. Первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать домен тау-белка с четырьмя повторами. В качестве одного конкретного примера, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 11 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 11. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая содержащий повторы домен тау-белка, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 12 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 12, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 11.

[00316] Первый содержащий повторы домен тау-белка может быть связан с первым репортером, а второй содержащий повторы домен тау-белка может быть связан со вторым репортером любыми способами. Например, репортер может быть слит с содержащим повторы доменом тау-белка (например, как часть слитого белка). Репортерные белки могут представлять собой любую пару репортерных белков, которые производят обнаруживаемый сигнал, когда первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, агрегирован со вторым содержащим повторы доменом тау-белка, связанным со вторым репортером. В качестве одного из примеров, первый и второй репортеры могут представлять собой расщепленный белок люциферазы. В качестве другого примера, первый и второй репортерные белки могут представлять собой пару резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET-пару). FRET представляет собой физическое явление, при котором донорный флуорофор в возбужденном состоянии безызлучательно передает свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору, тем самым заставляя акцептор испускать свою характерную флуоресценцию. Примеры FRET-nap (донорный и акцепторный флуорофоры) хорошо известны. См., например, работу Bajar et al. (2016) Sensors (Basel) 16 (9): 1488, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В качестве конкретного примера FRET-пары, первый репортер может представлять собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер может представлять собой желтый флуоресцентный белок (YFP). В качестве конкретного примера, CFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 13 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 13. В качестве другого конкретного примера, YFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 15 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности cSEQIDNO: 15.

[00317] Для биосенсорных клеток Cas/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, белок Cas может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 21 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00318] Один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 22 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00319] Для биосенсорных клеток SAM/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, химерный белок Cas может содержать белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64. Например, химерный белок Cas может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В качестве одного конкретного примера, адаптерный белок может представлять собой белок оболочки MS2, и один или большее число доменов активации транскрипции в химерном адаптерном белке могут содержать домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1. Например, химерный адаптерный белок может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 38 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 38, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 36. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный адаптерный белок, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 39 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 39, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 37.

[00320] Один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток.

[00321] Как раскрыто в другом месте в данном документе, клетки могут представлять собой клетки любого типа. Например, клетки могут представлять собой эукариотические клетки, клетки млекопитающего или клетки человека (например, клетки HEK293T или нейрональные клетки).

[00322] Множество уникальных гидовых РНК можно ввести в популяцию клеток любыми известными способами. В некоторых способах гидовые РНК вводятся в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции, такой как ретровирусная, аденовирусная или лентивирусная трансдукция. В конкретном примере гидовые РНК могут вводятся с помощью лентивирусной трансдукции. Каждое из множества уникальных гидовых РНК может находиться в отдельном вирусном векторе. Популяция клеток может быть инфицирована с любым показателем множественности заражения. Например, показатель множественности заражения может составлять от около 0,1 до около 1,0, от около 0,1 до около 0,9, от около 0,1 до около 0,8, от около 0,1 до около 0,7, от около 0,1 до около 0,6, от около 0,1 до около 0,5, от около 0,1 до около 0,4 или от около 0,1 до около 0,3. В качестве альтернативы, показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 1,0, меньше чем около 0,9, меньше чем около 0,8, меньше чем около 0,7, меньше чем около 0,6, меньше чем около 0,5, меньше чем около 0,4, меньше чем около 0,3 или меньше чем около 0,2. В конкретном примере показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00323] Гидовые РНК могут быть введены в популяцию клеток вместе с маркером отбора или репортерным геном для отбора клеток, которые имеют гидовые РНК, и способ может дополнительно включать в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора или репортерный ген. Примеры маркеров отбора и репортерных генов приведены в другой части данного документа. В качестве одного из примеров, маркер отбора может представлять собой маркер, который придает устойчивость к лекарственному средству, такой как неомицинфосфотрансфераза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, пуромицин-N-ацетилтрансфераза и бластицидин-S-дезаминаза. Другой иллюстративный маркер отбора представляет собой белок устойчивости к блеомицину, кодируемый геном Sh ble (ген блеомицина из Streptoalloteichus hindustanus), который придает устойчивости к зеоцину (флеомицину D1). Например, клетки можно отбирать с помощью лекарственного средства (например, пуромицина), таким образом, что только клетки, трансдуцированные конструкцией гидовой РНК, сохраняются для дальнейшего применения в проведении скрининга. Например, лекарственное средство может представлять собой пуромицин или зеоцин (флеомицин D1).

[00324] В некоторых способах множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. Например, если гидовые РНК вводят с помощью вирусной трансдукции, то клетки могут быть инфицированы с низким показателем множественности заражения, чтобы гарантировать, что большинство клеток с высокой вероятностью получат только одну вирусную конструкцию. В качестве одного конкретного примера, множественность заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00325] Популяция клеток, в которую введено множество уникальных гидовых РНК, может включать в себя любое подходящее количество клеток. Например, популяция клеток может включать в себя больше чем около 50, больше чем около 100, больше чем около 200, больше чем около 300, больше чем около 400, больше чем около 500, больше чем около 600, больше чем около 700, больше чем около 800, больше чем около 900, или больше чем около 1000 клеток на уникальную гидовую РНК. В конкретном примере популяция клеток включает в себя больше чем около 300 клеток, или больше чем около 500 клеток на уникальную гидовую РНК.

[00326] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число генов. Например, множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на около 50 или большее число генов, на около 100 или большее число генов, на около 200 или большее число генов, на около 300 или большее число генов, на около 400 или большее число генов, на около 500 или большее число генов, на около 1000 или большее число генов, на около 2000 или большее число генов, на около 3000 или большее число генов, на около 4000 или большее число генов, на около 5000 или большее число генов, на около 10000 или большее число генов, или на около 20000 или большее число генов. В некоторых способах гидовые РНК могут быть выбраны для нацеливания на гены в конкретном сигнальном пути. В некоторых способах библиотека уникальных гидовых РНК представляет собой полногеномную библиотеку.

[00327] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число последовательностей в каждом отдельном целевом гене. В некоторых способах, нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на от около 2 до около 10, от около 2 до около 9, от около 2 до около 8, от около 2 до около 7, от около 2 до около 6, от около 2 до около 5, от около 2 до около 4 или от около 2 до около 3 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере около 2, на по меньшей мере около 3, на по меньшей мере около 4, на по меньшей мере около 5 или на по меньшей мере около 6 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве другого конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на от около 3 до около 6 или на от около 4 до около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[00328] Гидовые РНК могут быть нацелены на любую желаемую область в целевых генах. В некоторых способах CRISPRn, в которых применяются биосенсорные клетки Cas/тау, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, второй экзон или третий экзон (с 5'-конца гена), если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может быть нацелена на целевую последовательность гидовой РНК в пределах 200 п.о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции, если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может содержать один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. В одном из примеров каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Например, адаптер-связывающий элемент может содержать последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. В конкретном примере каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-PHK (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-PHK (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13-16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31.

[00329] Стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 10 суток, от около 3 суток до около 9 суток, от около 4 суток до около 8 суток, от около 5 суток до около 7 суток, или около 6 суток. Аналогичным образом, стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 10 суток, от около 3 суток до около 9 суток, от около 4 суток до около 8 суток, от около 5 суток до около 7 суток, или около 6 суток.

[00330] Для получения засеянной популяции клеток можно применять любой подходящий агент засева тау-белка. Подходящие агенты засева тау-белка описаны в другой части данного документа. Некоторые подходящие агенты засева содержат содержащий повторы домен тау-белка, который может быть, например, отличным от первого содержащего повторы домена тау-белка и (или) второго содержащего повторы домена тау-белка, или аналогичным им. В одном примере стадия засева включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии кондиционированной среды, собранной от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Например, кондиционированная среда может быть собрана от конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, после пребывания на конфлюентных клетках в течение от около 1 суток до около 7 суток, от около 2 суток до около 6 суток, от около 3 суток до около 5 суток или около 4 суток. Стадия засева может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей из кондиционированной среды и свежей среды в любой пропорции. Например, он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 90% из кондиционированной среды и на около 10% из свежей среды, на около 85% из кондиционированной среды и на около 15% из свежей среды, на около 80% из кондиционированной среды и на около 20% из свежей среды, на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды, на около 70% из кондиционированной среды и на около 30% из свежей среды, на около 65% из кондиционированной среды и на около 35% из свежей среды, на около 60% из кондиционированной среды и на около 40% из свежей среды, на около 55% из кондиционированной среды и на около 45% из свежей среды, на около 50% из кондиционированной среды и на около 50% из свежей среды, на около 45% из кондиционированной среды и на около 55% из свежей среды, на около 40% из кондиционированной среды и на около 60% из свежей среды, на около 35% из кондиционированной среды и на около 65% из свежей среды, на около 30% из кондиционированной среды и на около 70% из свежей среды, на около 25% из кондиционированной среды и на около 75% из свежей среды, на около 20% из кондиционированной среды и на около 80% из свежей среды, на около 15% из кондиционированной среды и на около 85% из свежей среды или на около 10% из кондиционированной среды и на около 90% из свежей среды. В одном из примеров он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в среде, которая включает в себя по меньшей мере около 50% кондиционированной среды и не больше чем около 50% свежей среды. В конкретном примере он может включать в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды. Необязательно, указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00331] Стадия культивирования указанной засеянной популяции клеток с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток, может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 1 суток до около 7 суток, от около 2 суток до около 6 суток, от около 3 суток до около 5 суток, или около 4 суток. Агрегация может быть определена любыми подходящими способами, в зависимости от используемых репортеров. Например, в способах, в которых первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток может быть идентифицирована с помощью проточной цитометрии.

[00332] Содержание гидовых РНК может быть определено любыми подходящими способами. В конкретном примере содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения. Секвенирование нового поколения относится к технологиям высокопроизводительного секвенирования ДНК, не основанным на методе Сэнгера. Например, определение содержания гидовой РНК может включать в себя измерение числа считываний гидовой РНК.

[00333] В некоторых способах гидовая РНК считается обогащенной, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в около 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК. Также могут применяться различные пороговые значения для показателя обогащения. Например, пороговое значение для показателя обогащения может быть установлено выше, чтобы обеспечить большую строгость (например, по меньшей мере в около 1,6 раза, по меньшей мере в около 1,7 раза, по меньшей мере в около 1,8 раза, по меньшей мере в около 1,9 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза или по меньшей мере в около 2,5 раза). В качестве альтернативы, пороговое значение для показателя обогащения может быть установлено ниже, чтобы обеспечить меньшую строгость (например, по меньшей мере в около 1,4 раза, по меньшей мере в около 1,3 раза или по меньшей мере в около 1,2 раза).

[00334] В одном из примеров стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени во время культивирования и (или) во второй момент времени во время культивирования. Например, первый момент времени может представлять собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а второй момент времени может представлять собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить по прошествии количества времени, которое достаточно для того, чтобы гидовые РНК образовали комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепил множество генов, приведя к нокауту генной функции (CRISPRn), или чтобы активировать транскрипцию множества генов (CRISPRa). Тем не менее наиболее оптимально, чтобы первый момент времени приходился на первый пассаж клеток, для определения репрезентации библиотеки гРНК вскоре после заражения (т.е. перед дальнейшим увеличением числа данных клеток и редактированием генома) и для определения того, развивается ли репрезентация каждой гРНК от первого момента времени до второго момента времени и до любых дополнительных моментов времени, вплоть до конечного момента времени. Это позволяет исключить гРНК/целевые молекулы, обогащенные вследствие преимуществ роста клеток в ходе скрининга, путем подтверждения того, что содержание гРНК не изменилось между первым и вторым моментами времени. В качестве конкретного примера, первый момент времени может наступить после около 1 суток, после около 2 суток, после около 3 суток или после около 4 суток культивирования и увеличения числа клеток, а второй момент времени может наступить после около 3 суток, после около 4 суток, после около 5 суток или после около 6 суток культивирования и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить после около 3 суток культивирования и увеличения числа клеток, а второй момент времени может наступить после около 6 суток культивирования и увеличения числа клеток. В некоторых способах ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше (или выше чем другое выбранное пороговое значение для показателя обогащения) в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК, как в первый момент времени, так и во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка, если содержание по меньшей мере двух уникальных гидовых РНК, нацеленных на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше (или выше чем другое выбранное пороговое значение для показателя обогащения) в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК, либо в первый момент времени, либо во второй момент времени.

[00335] В некоторых способах CRISPRn предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, в некоторых способах CRISPRa предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена усиливает агрегацию тау-белка. Первая стадия включает в себя идентификацию того, какие из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Вторая стадия включает в себя вычисление вероятности случайного присутствия идентифицированных гидовых РНК с использованием формулы nCn'*(x-n')C(m-n)/xCm, где х представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1), n представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, и n' представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Третья стадия включает в себя вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в популяции клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК. Относительное содержание представляет собой число считываний данной гидовой РНК, деленное на число считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК. Четвертая стадия включает в себя выбор гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. Возможные пороговые оценки обогащения обсуждаются выше. В качестве конкретного примера, пороговая оценка обогащения может быть установлена как «в около 1,5 раза».

[00336] «Разнообразие» при использовании во фразе «разнообразие уникальных гидовых РНК» означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Данный термин - это не «содержание», а скорее качественный показатель «присутствует» или «отсутствует». Разнообразие уникальных гидовых РНК означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Разнообразие уникальных гидовых РНК определяется с помощью секвенирования нового поколения (СНП) для идентификации всех уникальных гидовых РНК, присутствующих в популяции клеток. Это осуществляется с помощью двух праймеров, которые распознают константные области вирусного вектора для амплификации гРНК, которая находится между данными константными областями, и праймера, который распознает одну константную область для секвенирования. Каждая уникальная гидовая РНК, присутствующая в образце, будет генерировать число считываний с использованием праймера для секвенирования. Результаты СНП будут включать в себя последовательность, а также число считываний, соответствующих данной последовательности. Число считываний будет использоваться для расчета оценки обогащения для каждой гидовой РНК, и наличие каждой уникальной последовательности укажет на то, какие гидовые РНК присутствуют в данном образце. Например, если есть три уникальных гидовых РНК для гена до отбора, и все три сохраняются после отбора, то и n, и n' равно 3. Эти числа используются для расчета статистических значений, но не для фактического числа считываний. Тем не менее число считываний для каждой гидовой РНК (в одном примере, 100, 200, 50, которые соответствуют каждой из 3 уникальных гидовых РНК) будет использоваться для расчета оценки обогащения.

V. Способы скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, которые препятствуют агрегации тау-белка

[00337] Линии биосенсорных клеток Cas/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка (например, тех, которые препятствуют агрегации тау-белка или ожидается, что препятствуют агрегации тау-белка). Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток Cas/тау, как описано в другом месте в данном документе, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку агрегации тау-белка в целевых клетках.

[00338] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток Cas/тау (например, популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепляет множество генов, что приводит к нокауту генной функции и возникновению генетически модифицированной популяции клеток. Затем указанная генетически модифицированная популяция клеток может быть приведена в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток. Например, агент засева тау-белка может представлять собой агент «максимального засева», как описано в другой части данного документа, например, клеточные лизаты из положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Засеянную популяцию клеток можно культивировать с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток, и при этом агрегаты не образуются во второй субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения отрицательной в отношении агрегации популяции клеток. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после их засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК. Обогащение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка.

[00339] Подобным образом, линии биосенсорных клеток SAM/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка (например, тех, которые препятствуют агрегации тау-белка или ожидается, что препятствуют агрегации тау-белка). Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток SAM/тау, как описано в другом месте в данном документе, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку агрегации тау-белка в целевых клетках.

[00340] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток SAM/тау (например, популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с химерным белком Cas и химерным адаптерный белком, и данные комплексы активируют транскрипцию множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов и возникновению модифицированной популяции клеток. Затем указанная модифицированная популяция клеток может быть приведена в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток. Например, агент засева тау-белка может представлять собой агент «максимального засева», как описано в другой части данного документа, например, клеточные лизаты из положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Засеянную популяцию клеток можно культивировать с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток, и при этом агрегаты не образуются во второй субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения отрицательной в отношении агрегации популяции клеток. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после их засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК. Обогащение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, предотвращает агрегацию тау-белка. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток после засева, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка.

[00341] Биосенсорные клетки Cas/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки Cas/тау, описанные в другой части данного документа. Аналогичным образом, биосенсорные клетки SAM/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки SAM/тау, описанные в другой части данного документа. Первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка могут быть разными, похожими или одинаковыми. Содержащий повторы домен тау-белка может представлять собой любой из содержащих повторы доменов тау-белка, описанных в другой части данного документа. Например, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут представлять собой содержащие повторы домены тау-белка дикого типа, или могут содержать мутацию, способствующую агрегации (например, патогенную мутацию, способствующую агрегации), такую как мутация тау-белка P301S. Первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать домен тау-белка с четырьмя повторами. В качестве одного конкретного примера, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 11 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 11. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая содержащий повторы домен тау-белка, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 12 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 12, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 11.

[00342] Первый содержащий повторы домен тау-белка может быть связан с первым репортером, а второй содержащий повторы домен тау-белка может быть связан со вторым репортером любыми способами. Например, репортер может быть слит с содержащим повторы доменом тау-белка (например, как часть слитого белка). Репортерные белки могут представлять собой любую пару репортерных белков, которые производят обнаруживаемый сигнал, когда первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, агрегирован со вторым содержащим повторы доменом тау-белка, связанным со вторым репортером. В качестве одного из примеров, первый и второй репортеры могут представлять собой расщепленный белок люциферазы. В качестве другого примера, первый и второй репортерные белки могут представлять собой пару резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET-пару). FRET представляет собой физическое явление, при котором донорный флуорофор в возбужденном состоянии безызлучательно передает свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору, тем самым заставляя акцептор испускать свою характерную флуоресценцию. Примеры FRET-nap (донорный и акцепторный флуорофоры) хорошо известны. См., например, работу Bajar et al. (2016) Sensors (Basel) 16 (9): 1488, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В качестве конкретного примера FRET-пары, первый репортер может представлять собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер может представлять собой желтый флуоресцентный белок (YFP). В качестве конкретного примера, CFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 13 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 13. В качестве другого конкретного примера, YFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 15 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности c SEQ ID NO: 15.

[00343] Для биосенсорных клеток Cas/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, белок Cas может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 21 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00344] Один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 22 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00345] Для биосенсорных клеток SAM/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, химерный белок Cas может содержать белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64. Например, химерный белок Cas может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В качестве одного конкретного примера, адаптерный белок может представлять собой белок оболочки MS2, и один или большее число доменов активации транскрипции в химерном адаптерном белке могут содержать домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1. Например, химерный адаптерный белок может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 38 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 38, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 36. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный адаптерный белок, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 39 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 39, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 37.

[00346] Один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток.

[00347] Как раскрыто в другом месте в данном документе, клетки могут представлять собой клетки любого типа. Например, клетки могут представлять собой эукариотические клетки, клетки млекопитающего или клетки человека (например, клетки HEK293T или нейрональные клетки).

[00348] Множество уникальных гидовых РНК можно ввести в популяцию клеток любыми известными способами. В некоторых способах гидовые РНК вводятся в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции, такой как ретровирусная, аденовирусная или лентивирусная трансдукция. В конкретном примере гидовые РНК могут вводятся с помощью лентивирусной трансдукции. Каждое из множества уникальных гидовых РНК может находиться в отдельном вирусном векторе. Популяция клеток может быть инфицирована с любым показателем множественности заражения. Например, показатель множественности заражения может составлять от около 0,1 до около 1,0, от около 0,1 до около 0,9, от около 0,1 до около 0,8, от около 0,1 до около 0,7, от около 0,1 до около 0,6, от около 0,1 до около 0,5. от около 0,1 до около 0,4 или от около 0,1 до около 0,3. В качестве альтернативы, показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 1,0, меньше чем около 0,9, меньше чем около 0,8, меньше чем около 0,7, меньше чем около 0,6, меньше чем около 0,5, меньше чем около 0,4, меньше чем около 0,3 или меньше чем около 0,2. В конкретном примере показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00349] Гидовые РНК могут быть введены в популяцию клеток вместе с маркером отбора или репортерным геном для отбора клеток, которые имеют гидовые РНК, и способ может дополнительно включать в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора или репортерный ген. Примеры маркеров отбора и репортерных генов приведены в другой части данного документа. В качестве одного из примеров, маркер отбора может представлять собой маркер, который придает устойчивость к лекарственному средству, такой как неомицинфосфотрансфераза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, пуромицин-N-ацетилтрансфераза и бластицидин-S-дезаминаза. Другой иллюстративный маркер отбора представляет собой белок устойчивости к блеомицину, кодируемый геном Sh ble (ген блеомицина из Streptoalloteichus hindustanus), который придает устойчивости к зеоцину (флеомицину D1). Например, клетки можно отбирать с помощью лекарственного средства (например, пуромицина), таким образом, что только клетки, трансдуцированные конструкцией гидовой РНК, сохраняются для дальнейшего применения в проведении скрининга. Например, лекарственное средство может представлять собой пуромицин или зеоцин (флеомицин D1).

[00350] В некоторых способах множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. Например, если гидовые РНК вводят с помощью вирусной трансдукции, то клетки могут быть инфицированы с низким показателем множественности заражения, чтобы гарантировать, что большинство клеток с высокой вероятностью получат только одну вирусную конструкцию. В качестве одного конкретного примера, множественность заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00351] Популяция клеток, в которую введено множество уникальных гидовых РНК, может включать в себя любое подходящее количество клеток. Например, популяция клеток может включать в себя больше чем около 50, больше чем около 100, больше чем около 200, больше чем около 300, больше чем около 400, больше чем около 500, больше чем около 600, больше чем около 700, больше чем около 800, больше чем около 900, или больше чем около 1000 клеток на уникальную гидовую РНК. В конкретном примере популяция клеток включает в себя больше чем около 300 клеток, или больше чем около 500 клеток на уникальную гидовую РНК.

[00352] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число генов. Например, множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на около 50 или большее число генов, на около 100 или большее число генов, на около 200 или большее число генов, на около 300 или большее число генов, на около 400 или большее число генов, на около 500 или большее число генов, на около 1000 или большее число генов, на около 2000 или большее число генов, на около 3000 или большее число генов, на около 4000 или большее число генов, на около 5000 или большее число генов, на около 10000 или большее число генов, или на около 20000 или большее число генов. В некоторых способах гидовые РНК могут быть выбраны для нацеливания на гены в конкретном сигнальном пути. В некоторых способах библиотека уникальных гидовых РНК представляет собой полногеномную библиотеку.

[00353] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число последовательностей в каждом отдельном целевом гене. В некоторых способах, нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на от около 2 до около 10, от около 2 до около 9, от около 2 до около 8, от около 2 до около 7, от около 2 до около 6, от около 2 до около 5, от около 2 до около 4 или от около 2 до около 3 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере около 2, на по меньшей мере около 3, на по меньшей мере около 4, на по меньшей мере около 5 или на по меньшей мере около 6 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве другого конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на от около 3 до около 6 или на от около 4 до около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[00354] Гидовые РНК могут быть нацелены на любую желаемую область в целевых генах. В некоторых способах CRISPRn, в которых применяются биосенсорные клетки Cas/тау, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, второй экзон или третий экзон (с 5'-конца гена), если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может быть нацелена на целевую последовательность гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции, если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может содержать один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. В одном из примеров каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Например, адаптер-связывающий элемент может содержать последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. В конкретном примере каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-PHK (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-PHK (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13 - 16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53 - 56 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31.

[00355] Стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 15 суток, от около 3 суток до около 13 суток, от около 5 суток до около 12 суток, от около 7 суток до около 11 суток, или около 7 суток, или около 11 суток. В качестве другого примера, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 14 суток, от около 3 суток до около 12 суток, от около 5 суток до около 11 суток, от около 7 суток до около 10 суток, или около 7 суток, или около 10 суток. Аналогичным образом, стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 15 суток, от около 3 суток до около 13 суток, от около 5 суток до около 12 суток, от около 7 суток до около 11 суток, или около 7 суток, или около 11 суток. Аналогичным образом, стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 2 суток до около 14 суток, от около 3 суток до около 12 суток, от около 5 суток до около 11 суток, от около 7 суток до около 10 суток, или около 7 суток, или около 10 суток.

[00356] Для получения засеянной популяции клеток можно применять любой подходящий агент засева тау-белка. Подходящие агенты засева тау-белка описаны в другой части данного документа. Некоторые подходящие агенты засева содержат содержащий повторы домен тау-белка, который может быть, например, отличным от первого содержащего повторы домена тау-белка и (или) второго содержащего повторы домена тау-белка, или аналогичным им. В одном из примеров стадия засева включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии содержания клеточного лизата из культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии. Необязательно, указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии.

[00357] Количество или концентрация клеточного лизата в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация клеточного лизата в среде может составлять от около 0,1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,1 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 0,5 мкг/мл до около 1 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 1 мкг/мл до около 1,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 1,5 мкг/мл до около 2 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 3 мкг/мл, от около 2 мкг/мл до около 2,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 50 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 25 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4,5 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 4 мкг/мл, от около 2,5 мкг/мл до около 3,5 мкг/мл или от около 2,5 мкг/мл до около 3 мкг/мл среды (например, свежей культуральной среды).

Например, клеточный лизат в культуральной среде может находиться в концентрации от около 1 мкг/мл до около 5 мкг/мл или может находиться в концентрации около 1,5 мкг/мл, около 2 мкг/мл, около 2,5 мкг/мл, около 3 мкг/мл, около 3,5 мкг/мл, около 4 мкг/мл, около 4,5 мкг/мл или около 5 мкг/мл. Необязательно, клеточный лизат может находиться в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00358] Клетки для продуцирования лизата могут быть собраны в буфере, таком как фосфатно-солевой буфер. Необязательно, буфер может содержать ингибиторы протеаз. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Буфер может содержать любой из указанных ингибиторов или любую их комбинацию (например, буфер может содержать все указанные ингибиторы протеаз).

[00359] Клеточный лизат можно, например, получать с помощью обработки ультразвуком указанных положительных в отношении агрегации тау-белка клеток (например, клеток, собранных в буфере с ингибиторами протеаз, как описано выше) в течение любого подходящего периода времени. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 1 минуты до около 6 минут, от около 1 минуты до около 5 минут, от около 1 минуты до около 4 минут, от около 1 минуты до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 2 минут до около 5 минут, от около 2 минут до около 4 минут, от около 2 минут до около 3 минут, от около 2 минут до около 6 минут, от около 3 минут до около 5 минут или от около 3 минут до около 4 минут. Например, клетки можно обрабатывать ультразвуком в течение от около 2 минут до около 4 минут или в течение около 3 минут.

[00360] Необязательно, среда содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда содержит липофектамин. Необязательно, среда не содержит липофектамин или липосомы (например, катионные липосомы), или фосфолипиды, или другой агент трансфекции. Необязательно, среда не содержит липофектамин. Количество или концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде могут быть любыми подходящими количеством или концентрацией. Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 0,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 0,5 мкл/мл до около 1 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 1 мкл/мл до около 1,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 3 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл, от около 1,5 мкл/мл до около 2 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 10 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 4 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3,5 мкл/мл, от около 2 мкл/мл до около 3 мкл/мл или от около 2 мкл/мл до около 2,5 мкл/мл среды (например, свежей среды). Например, концентрация липофектамина или липосом (например, катионных липосом), или фосфолипидов, или другого агента трансфекции в среде может составлять от около 1,5 мкл/мл до около 4 мкл/мл, или она может составлять около 1,5 мкл/мл, около 2 мкл/мл, около 2,5 мкл/мл, около 3 мкл/мл, около 3,5 мкл/мл или около 4 мкл/мл.

[00361] Стадия культивирования указанной засеянной популяции клеток с целью обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток для получения положительной в отношении агрегации популяции клеток, может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться в течение от около 1 суток до около 7 суток, от около 2 суток до около 6 суток, от около 3 суток до около 5 суток, от около 1 суток до около 3 суток, или около 2 суток. Агрегация может быть определена любыми подходящими способами, в зависимости от используемых репортеров. Например, в способах, в которых первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток может быть идентифицирована с помощью проточной цитометрии.

[00362] Содержание гидовых РНК может быть определено любыми подходящими способами. В конкретном примере содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения. Секвенирование нового поколения относится к технологиям высокопроизводительного секвенирования ДНК, не основанным на методе Сэнгера. Например, определение содержания гидовой РНК может включать в себя измерение числа считываний гидовой РНК.

[00363] В некоторых способах гидовая РНК считается обогащенной в отрицательных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной засеянной популяцией клеток. В некоторых способах гидовая РНК считается истощенной в положительных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной засеянной популяцией клеток. Также могут применяться различные пороговые значения для показателя обогащения/истощения. Например, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено выше, чтобы обеспечить большую строгость (например, по меньшей мере в около 1,6 раза, по меньшей мере в около 1,7 раза, по меньшей мере в около 1,8 раза, по меньшей мере в около 1,9 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза или по меньшей мере в около 2,5 раза). В качестве альтернативы, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено ниже, чтобы обеспечить меньшую строгость (например, по меньшей мере в около 1,4 раза, по меньшей мере в около 1,3 раза или по меньшей мере в около 1,2 раза).

[00364] В качестве альтернативы, в некоторых способах гидовая РНК считается обогащенной в положительных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной засеянной популяцией клеток. В некоторых способах гидовая РНК считается истощенной в отрицательных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной засеянной популяцией клеток. Также могут применяться различные пороговые значения для показателя обогащения/истощения. Например, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено выше, чтобы обеспечить большую строгость (например, по меньшей мере в около 1,6 раза, по меньшей мере в около 1,7 раза, по меньшей мере в около 1,8 раза, по меньшей мере в около 1,9 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза или по меньшей мере в около 2,5 раза). В качестве альтернативы, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено ниже, чтобы обеспечить меньшую строгость (например, по меньшей мере в около 1,4 раза, по меньшей мере в около 1,3 раза или по меньшей мере в около 1,2 раза).

[00365] В одном из примеров стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. Аналогичным образом, стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. Например, первый момент времени может представлять собой первый пассаж при культивировании популяции клеток или середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить по прошествии количества времени, которое достаточно для того, чтобы гидовые РНК образовали комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепил множество генов, приведя к нокауту генной функции (CRISPRn), или чтобы активировать транскрипцию множества генов (CRISPRa). Тем не менее в некоторых случаях наиболее оптимально, чтобы первый момент времени приходился на первый пассаж клеток, для определения репрезентации библиотеки гРНК вскоре после заражения (т.е. перед дальнейшим увеличением числа данных клеток и редактированием генома) и для определения того, развивается ли репрезентация каждой гРНК от первого момента времени до второго момента времени и до любых дополнительных моментов времени, вплоть до конечного момента времени. Это позволяет исключить гРНК/целевые молекулы, обогащенные вследствие преимуществ роста клеток в ходе скрининга, путем подтверждения того, что содержание гРНК не изменилось между первым и вторым моментами времени. В качестве конкретного примера, первый момент времени может наступить после около 1 суток, после около 2 суток, после около 3 суток или после около 4 суток культивирования и увеличения числа клеток (например, около 3 суток после культивирования и увеличения числа клеток), а второй момент времени может наступить после около 5 суток, после около 6 суток, после около 7 суток, после около 8 суток, после около 9 суток, после около 10 суток или после около 11 суток культивирования и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить после около 3 суток культивирования и увеличения числа клеток, а второй момент времени может наступить после около 7 суток или после около 10 суток культивирования и увеличения числа клеток.

[00366] В некоторых способах ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени.

[00367] В качестве альтернативы, в одном из примеров стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. Аналогичным образом, стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. Например, первый момент времени может представлять собой первый пассаж при культивировании популяции клеток или середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить по прошествии количества времени, которое достаточно для того, чтобы гидовые РНК образовали комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепил множество генов, приведя к нокауту генной функции (CRISPRn), или чтобы активировать транскрипцию множества генов (CRISPRa). Тем не менее в некоторых случаях наиболее оптимально, чтобы первый момент времени приходился на первый пассаж клеток, для определения репрезентации библиотеки гРНК вскоре после заражения (т.е. перед дальнейшим увеличением числа данных клеток и редактированием генома) и для определения того, развивается ли репрезентация каждой гРНК от первого момента времени до второго момента времени и до любых дополнительных моментов времени, вплоть до конечного момента времени. Это позволяет исключить гРНК/целевые молекулы, обогащенные вследствие преимуществ роста клеток в ходе скрининга, путем подтверждения того, что содержание гРНК не изменилось между первым и вторым моментами времени. В качестве конкретного примера, первый момент времени может наступить после около 1 суток, после около 2 суток, после около 3 суток или после около 4 суток культивирования и увеличения числа клеток (например, около 3 суток после культивирования и увеличения числа клеток), а второй момент времени может наступить после около 5 суток, после около 6 суток, после около 7 суток, после около 8 суток, после около 9 суток, после около 10 суток или после около 11 суток культивирования и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить после около 3 суток культивирования и увеличения числа клеток, а второй момент времени может наступить после около 7 суток или после около 10 суток культивирования и увеличения числа клеток.

[00368] В некоторых способах ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и с популяцией засеянных клеток во второй момент времени.

[00369] В некоторых способах CRISPRn предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, в некоторых способах CRISPRa предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена предотвращает (или ожидается, что предотвращает) агрегацию тау-белка. Первая стадия включает в себя определение того, какие из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток. Вторая стадия включает в себя вычисление вероятности случайного присутствия идентифицированных гидовых РНК с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1), n представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, и n' представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Третья стадия включает в себя вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, или в популяции клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК, или в указанной засеянной популяции клеток. Относительное содержание представляет собой число считываний данной гидовой РНК, деленное на число считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК. Четвертая стадия включает в себя выбор гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. Возможные пороговые оценки обогащения обсуждаются выше. В качестве конкретного примера, пороговая оценка обогащения может быть установлена как «в около 1,5 раза».

[00370] В качестве альтернативы, в некоторых способах CRISPRn предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена способствует (или ожидается, что способствует) агрегации тау-белка или усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, в некоторых способах CRISPRa предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена способствует (или ожидается, что способствует) агрегации тау-белка или усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка. Первая стадия включает в себя идентификацию того, какие из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Вторая стадия включает в себя вычисление вероятности случайного присутствия идентифицированных гидовых РНК с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1), n представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, и n' представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Третья стадия включает в себя вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, или в популяции клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК, или в указанной засеянной популяции клеток. Относительное содержание представляет собой число считываний данной гидовой РНК, деленное на число считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК. Четвертая стадия включает в себя выбор гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. Возможные пороговые оценки обогащения обсуждаются выше. В качестве конкретного примера, пороговая оценка обогащения может быть установлена как «в около 1,5 раза».

[00371] «Разнообразие» при использовании во фразе «разнообразие уникальных гидовых РНК» означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Данный термин это не «содержание», а скорее качественный показатель «присутствует» или «отсутствует». Разнообразие уникальных гидовых РНК означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Разнообразие уникальных гидовых РНК определяется с помощью секвенирования нового поколения (СНП) для идентификации всех уникальных гидовых РНК, присутствующих в популяции клеток. Это осуществляется с помощью двух праймеров, которые распознают константные области вирусного вектора для амплификации гРНК, которая находится между данными константными областями, и праймера, который распознает одну константную область для секвенирования. Каждая уникальная гидовая РНК, присутствующая в образце, будет генерировать число считываний с использованием праймера для секвенирования. Результаты СНП будут включать в себя последовательность, а также число считываний, соответствующих данной последовательности. Число считываний будет использоваться для расчета оценки обогащения для каждой гидовой РНК, и наличие каждой уникальной последовательности укажет на то, какие гидовые РНК присутствуют в данном образце. Например, если есть три уникальных гидовых РНК для гена до отбора, и все три сохраняются после отбора, то и n, и n' равно 3. Эти числа используются для расчета статистических значений, но не для фактического числа считываний. Тем не менее число считываний для каждой гидовой РНК (в одном примере, 100, 200, 50, которые соответствуют каждой из 3 уникальных гидовых РНК) будет использоваться для расчета оценки обогащения.

VI. Способы скрининга в отношении генетических модификаторов дезагрегации тау-белка

[00372] Линии биосенсорных клеток Cas/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов дезагрегации тау-белка (например, тех, которые способствуют дезагрегации тау-белка). Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции положительных в отношении агрегации тау-белка биосенсорных клеток Cas/тау, как описано в другой части данного документа, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку дезагрегации тау-белка в целевых клетках.

[00373] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток Cas/тау (например, популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), при этом указанные клетки представляют собой положительные в отношении агрегации тау-белка клетки, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепляет множество генов, что приводит к нокауту генной функции и возникновению генетически модифицированной популяции клеток. В результате культивирования получают популяцию положительных в отношении агрегации клеток и популяцию отрицательных в отношении агрегации клеток, которые затем могут быть идентифицированы. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени. Обогащение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что нарушение гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка.

[00374] Аналогичным образом, линии биосенсорных клеток SAM/тау, описанные в данном документе, могут применяться в способах скрининга в отношении генетических модификаторов дезагрегации тау-белка (например, тех, которые способствуют дезагрегации тау-белка). Такие способы могут включать в себя обеспечение популяции положительных в отношении агрегации тау-белка биосенсорных клеток SAM/тау, как описано в другой части данного документа, введение библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, и оценку дезагрегации тау-белка в целевых клетках.

[00375] В качестве одного из примеров, способ может включать в себя обеспечение популяции биосенсорных клеток SAM/тау (например, популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером), при этом указанные клетки представляют собой положительные в отношении агрегации тау-белка клетки, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество уникальных гидовых РНК, которые нацелены на множество генов, и культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток. Множество уникальных гидовых РНК образует комплексы с химерным белком Cas и химерным адаптерным белком, и данные комплексы активируют транскрипцию множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов и возникновению модифицированной популяции клеток. В результате культивирования получают популяцию положительных в отношении агрегации клеток и популяцию отрицательных в отношении агрегации клеток, которые затем могут быть идентифицированы. Наконец, содержание каждой из множества уникальных гидовых РНК может быть определено в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени. Обогащение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором дезагрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором дезагрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует дезагрегации тау-белка. Обогащение гидовой РНК в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, истощение гидовой РНК в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток по сравнению с популяцией положительных в отношении агрегации тау-белка клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовой РНК в один или большее число моментов времени, указывает на то, что ген, на который нацелена данная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка, или является потенциальным генетическим модификатором агрегации тау-белка (например, кандидатом для дальнейшего тестирования с помощью вторичных скринингов), при этом ожидается, что активация транскрипции гена, на который нацелена данная гидовая РНК, способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка.

[00376] Биосенсорные клетки Cas/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки Cas/тау, описанные в другой части данного документа. Аналогичным образом, биосенсорные клетки SAM/тау, применяемые в указанном способе, могут представлять собой любые биосенсорные клетки SAM/тау, описанные в другой части данного документа. Первый содержащий повторы домен тау-белка и второй содержащий повторы домен тау-белка могут быть разными, похожими или одинаковыми. Содержащий повторы домен тау-белка может представлять собой любой из содержащих повторы доменов тау-белка, описанных в другой части данного документа. Например, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут представлять собой содержащие повторы домены тау-белка дикого типа, или могут содержать мутацию, способствующую агрегации (например, патогенную мутацию, способствующую агрегации), такую как мутация тау-белка P301S. Первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать домен тау-белка с четырьмя повторами. В качестве одного конкретного примера, первый содержащий повторы домен тау-белка и (или) второй содержащий повторы домен тау-белка могут содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 11 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 11. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая содержащий повторы домен тау-белка, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 12 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 12, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 11.

[00377] Первый содержащий повторы домен тау-белка может быть связан с первым репортером, а второй содержащий повторы домен тау-белка может быть связан со вторым репортером любыми способами. Например, репортер может быть слит с содержащим повторы доменом тау-белка (например, как часть слитого белка). Репортерные белки могут представлять собой любую пару репортерных белков, которые производят обнаруживаемый сигнал, когда первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, агрегирован со вторым содержащим повторы доменом тау-белка, связанным со вторым репортером. В качестве одного из примеров, первый и второй репортеры могут представлять собой расщепленный белок люциферазы. В качестве другого примера, первый и второй репортерные белки могут представлять собой пару резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET-пару). FRET представляет собой физическое явление, при котором донорный флуорофор в возбужденном состоянии безызлучательно передает свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору, тем самым заставляя акцептор испускать свою характерную флуоресценцию. Примеры FRET-nap (донорный и акцепторный флуорофоры) хорошо известны. См., например, работу Bajar et al. (2016) Sensors (Basel) 16 (9): 1488, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В качестве конкретного примера FRET-пары, первый репортер может представлять собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а второй репортер может представлять собой желтый флуоресцентный белок (YFP). В качестве конкретного примера, CFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ FD NO: 13 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 13. В качестве другого конкретного примера, YFP может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 15 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 15.

[00378] Для биосенсорных клеток Cas/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, белок Cas может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 21 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00379] Один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 22 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 21.

[00380] Для биосенсорных клеток SAM/тау белок Cas может представлять собой любой белок Cas, описанным в другом месте в данном документе. В качестве одного из примеров, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Например, белок Cas9 представлять собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes. В качестве одного конкретного примера, химерный белок Cas может содержать белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64. Например, химерный белок Cas может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64. В качестве одного конкретного примера, адаптерный белок может представлять собой белок оболочки MS2, и один или большее число доменов активации транскрипции в химерном адаптерном белке могут содержать домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1. Например, химерный адаптерный белок может содержать, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок Cas, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 38 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 38, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 36. В одном конкретном примере нуклеиновая кислота, кодирующая химерный адаптерный белок, может содержать, состоять по существу из, или состоять из последовательности с SEQ ID NO: 39 или из последовательности, которая по меньшей мере на около 90%, на около 91%, на около 92%, на около 93%, на около 94%, на около 95%, на около 96%, на около 97%, на около 98% или на около 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 39, необязательно при этом данная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности с SEQ ID NO: 37.

[00381] Один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут стабильно экспрессироваться в популяции клеток. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один, или большее число, или все из следующего: химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, - могут быть геномно интегрированы в популяцию клеток.

[00382] Как раскрыто в другом месте в данном документе, клетки могут представлять собой клетки любого типа. Например, клетки могут представлять собой эукариотические клетки, клетки млекопитающего или клетки человека (например, клетки HEK293T или нейрональные клетки).

[00383] Множество уникальных гидовых РНК можно ввести в популяцию клеток любыми известными способами. В некоторых способах гидовые РНК вводятся в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции, такой как ретровирусная, аденовирусная или лентивирусная трансдукция. В конкретном примере гидовые РНК могут вводятся с помощью лентивирусной трансдукции. Каждое из множества уникальных гидовых РНК может находиться в отдельном вирусном векторе. Популяция клеток может быть инфицирована с любым показателем множественности заражения. Например, показатель множественности заражения может составлять от около 0,1 до около 1,0, от около 0,1 до около 0,9, от около 0,1 до около 0,8, от около 0,1 до около 0,7, от около 0,1 до около 0,6, от около 0,1 до около 0,5. от около 0,1 до около 0,4 или от около 0,1 до около 0,3. В качестве альтернативы, показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 1,0, меньше чем около 0,9, меньше чем около 0,8, меньше чем около 0,7, меньше чем около 0,6, меньше чем около 0,5, меньше чем около 0,4, меньше чем около 0,3 или меньше чем около 0,2. В конкретном примере показатель множественности заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00384] Гидовые РНК могут быть введены в популяцию клеток вместе с маркером отбора или репортерным геном для отбора клеток, которые имеют гидовые РНК, и способ может дополнительно включать в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора или репортерный ген. Примеры маркеров отбора и репортерных генов приведены в другой части данного документа. В качестве одного из примеров, маркер отбора может представлять собой маркер, который придает устойчивость к лекарственному средству, такой как неомицинфосфотрансфераза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, пуромицин-N-ацетилтрансфераза и бластицидин-S-дезаминаза. Другой иллюстративный маркер отбора представляет собой белок устойчивости к блеомицину, кодируемый геном Sh ble (ген блеомицина из Streptoalloteichus hindustanus), который придает устойчивости к зеоцину (флеомицину D1). Например, клетки можно отбирать с помощью лекарственного средства (например, пуромицина), таким образом, что только клетки, трансдуцированные конструкцией гидовой РНК, сохраняются для дальнейшего применения в проведении скрининга. Например, лекарственное средство может представлять собой пуромицин или зеоцин (флеомицин D1).

[00385] В некоторых способах множество уникальных гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из уникальных гидовых РНК. Например, если гидовые РНК вводят с помощью вирусной трансдукции, то клетки могут быть инфицированы с низким показателем множественности заражения, чтобы гарантировать, что большинство клеток с высокой вероятностью получат только одну вирусную конструкцию. В качестве одного конкретного примера, множественность заражения может составлять меньше чем около 0,3.

[00386] Популяция клеток, в которую введено множество уникальных гидовых РНК, может включать в себя любое подходящее количество клеток. Например, популяция клеток может включать в себя больше чем около 50, больше чем около 100, больше чем около 200, больше чем около 300, больше чем около 400, больше чем около 500, больше чем около 600, больше чем около 700, больше чем около 800, больше чем около 900, или больше чем около 1000 клеток на уникальную гидовую РНК. В конкретном примере популяция клеток включает в себя больше чем около 300 клеток, или больше чем около 500 клеток на уникальную гидовую РНК.

[00387] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число генов. Например, множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на около 50 или большее число генов, на около 100 или большее число генов, на около 200 или большее число генов, на около 300 или большее число генов, на около 400 или большее число генов, на около 500 или большее число генов, на около 1000 или большее число генов, на около 2000 или большее число генов, на около 3000 или большее число генов, на около 4000 или большее число генов, на около 5000 или большее число генов, на около 10000 или большее число генов, или на около 20000 или большее число генов. В некоторых способах гидовые РНК могут быть выбраны для нацеливания на гены в конкретном сигнальном пути. В некоторых способах библиотека уникальных гидовых РНК представляет собой полногеномную библиотеку.

[00388] Множество уникальных гидовых РНК может быть нацелено на любое число последовательностей в каждом отдельном целевом гене. В некоторых способах, нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на от около 2 до около 10, от около 2 до около 9, от около 2 до около 8, от около 2 до около 7, от около 2 до около 6, от около 2 до около 5, от около 2 до около 4 или от около 2 до около 3 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. Например, нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере около 2, на по меньшей мере около 3, на по меньшей мере около 4, на по меньшей мере около 5 или на по меньшей мере около 6 уникальных целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов. В качестве другого конкретного примера, нацеливание происходит в среднем на от около 3 до около 6 или на от около 4 до около 6 целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

[00389] Гидовые РНК могут быть нацелены на любую желаемую область в целевых генах. В некоторых способах CRISPRn, в которых применяются биосенсорные клетки Cas/тау, каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон, если это возможно. В некоторых способах каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, второй экзон или третий экзон (с 5'-конца гена), если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может быть нацелена на целевую последовательность гидовой РНК в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции, если это возможно. В некоторых способах CRISPRa, в которых применяются биосенсорные клетки SAM/тау, каждая гидовая РНК может содержать один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок. В одном из примеров каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК. Например, адаптер-связывающий элемент может содержать последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33. В конкретном примере каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-PHK (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-PHK (тракрРНК), и первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13-16 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31, а вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из последовательности с SEQ ID NO: 17, 19, 30 или 31.

[00390] Стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться от около 2 суток до около 15 суток, от около 3 суток до около 14 суток, от около 5 суток до около 14 суток, от около 7 суток до около 14 суток, от около 9 суток до около 14 суток, от около 10 суток до около 14 суток, от около 11 суток до около 14 суток или от около 12 суток до около 14 суток. Аналогичным образом, стадия культивирования популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток может иметь любую подходящую продолжительность времени. Например, культивирование может длиться от около 2 суток до около 15 суток, от около 3 суток до около 14 суток, от около 5 суток до около 14 суток, от около 7 суток до около 14 суток, от около 9 суток до около 14 суток, от около 10 суток до около 14 суток, от около 11 суток до около 14 суток или от около 12 суток до около 14 суток.

[00391] Стадия идентификации положительной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток и отрицательной в отношении агрегации тау-белка популяции клеток может включать в себя синхронизацию прохождения клеточного цикла. Например, указанную синхронизацию можно применять для получения популяции клеток, преимущественно обогащенной клетками в фазе S или преимущественно обогащенной клетками в фазе G2. В качестве конкретного примера, синхронизация может быть достигнута с помощью двойного тимидинового блока.

[00392] Агрегация может быть определена любыми подходящими способами, в зависимости от используемых репортеров. Например, в способах, в которых первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), положительная в отношении агрегации тау-белка популяция клеток может быть идентифицирована с помощью проточной цитометрии.

[00393] Содержание гидовых РНК может быть определено любыми подходящими способами. В конкретном примере содержание определяется с помощью секвенирования нового поколения. Секвенирование нового поколения относится к технологиям высокопроизводительного секвенирования ДНК, не основанным на методе Сэнгера. Например, определение содержания гидовой РНК может включать в себя измерение числа считываний гидовой РНК.

[00394] В некоторых способах гидовая РНК считается обогащенной в отрицательных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени. В некоторых способах гидовая РНК считается истощенной в положительных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени. Также могут применяться различные пороговые значения для показателя обогащения/истощения. Например, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено выше, чтобы обеспечить большую строгость (например, по меньшей мере в около 1,6 раза, по меньшей мере в около 1,7 раза, по меньшей мере в около 1,8 раза, по меньшей мере в около 1,9 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза или по меньшей мере в около 2,5 раза). В качестве альтернативы, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено ниже, чтобы обеспечить меньшую строгость (например, по меньшей мере в около 1,4 раза, по меньшей мере в около 1,3 раза или по меньшей мере в около 1,2 раза).

[00395] В некоторых способах гидовая РНК считается обогащенной в положительных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени. В некоторых способах гидовая РНК считается истощенной в отрицательных в отношении агрегации клетках, если содержание данной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток в один или большее число моментов времени. Также могут применяться различные пороговые значения для показателя обогащения/истощения. Например, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено выше, чтобы обеспечить большую строгость (например, по меньшей мере в около 1,6 раза, по меньшей мере в около 1,7 раза, по меньшей мере в около 1,8 раза, по меньшей мере в около 1,9 раза, по меньшей мере в около 2 раз, по меньшей мере в около 2,5 раза или по меньшей мере в около 2,5 раза). В качестве альтернативы, пороговое значение для показателя обогащения/истощения может быть установлено ниже, чтобы обеспечить меньшую строгость (например, по меньшей мере в около 1,4 раза, по меньшей мере в около 1,3 раза или по меньшей мере в около 1,2 раза).

[00396] В одном из примеров стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК во второй момент времени. Аналогичным образом, стадия определения содержания может включать в себя определение содержания множества уникальных гидовых РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени, и (или) по сравнению с популяцией клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК во второй момент времени. Например, первый момент времени может представлять собой первый пассаж при культивировании популяции клеток или приходиться на середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток, а второй момент времени может представлять собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить по прошествии количества времени, которое достаточно для того, чтобы гидовые РНК образовали комплексы с белком Cas, и белок Cas расщепил множество генов, приведя к нокауту генной функции (CRISPRn), или чтобы активировать транскрипцию множества генов (CRISPRa). Тем не менее в некоторых случаях наиболее оптимально, чтобы первый момент времени приходился на первый пассаж клеток, для определения репрезентации библиотеки гРНК вскоре после заражения (т.е. перед дальнейшим увеличением числа данных клеток и редактированием генома) и для определения того, развивается ли репрезентация каждой гРНК от первого момента времени до второго момента времени и до любых дополнительных моментов времени, вплоть до конечного момента времени. Это позволяет исключить гРНК/целевые молекулы, обогащенные вследствие преимуществ роста клеток в ходе скрининга, путем подтверждения того, что содержание гРНК не изменилось между первым и вторым моментами времени. В качестве конкретного примера, первый момент времени может наступить после около 1 суток, после около 2 суток, после около 3 суток, после около 4 суток, после около 5 суток, после около 6 суток, после около 7 суток или после около 8 суток культивирования и увеличения числа клеток (например, около 7 суток после культивирования и увеличения числа клеток), а второй момент времени может наступить после около 5 суток, после около 6 суток, после около 7 суток, после около 8 суток, после около 9 суток, после около 10 суток, после около 11 суток или после около 12 суток (например, около 10 суток) культивирования и увеличения числа клеток. Например, первый момент времени может наступить после около 7 суток культивирования и увеличения числа клеток, а второй момент времени может наступить после около 10 суток культивирования и увеличения числа клеток. [00397] В некоторых способах ген может затем рассматриваться как генетический модификатор дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор дезагрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка, если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени.

[00398] В некоторых способах ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной отрицательной в отношении агрегации популяцией клеток и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток, с указанной культивируемой популяцией клеток в первый момент времени и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. В качестве альтернативы или дополнения, ген может затем рассматриваться как генетический модификатор агрегации тау-белка, при этом нарушение (CRISPRn) или активация транскрипции (CRISPRa) данного гена способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка (или ожидается, что способствует агрегации тау-белка или усиливает агрегацию тау-белка), если содержание гидовой РНК, нацеленной на данный ген, по отношению к общей популяции указанного множества уникальных гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза ниже в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток по сравнению с указанной положительной в отношении агрегации популяцией клеток и с указанной культивируемой популяцией клеток во второй момент времени. [00399] В некоторых способах CRISPRn предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора дезагрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка. Аналогичным образом, в некоторых способах CRISPRa предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора дезагрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена способствует (или ожидается, что способствует) дезагрегации тау-белка. Первая стадия включает в себя определение того, какие из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в популяции отрицательных в отношении агрегации тау-белка клеток. Вторая стадия включает в себя вычисление вероятности случайного присутствия идентифицированных гидовых РНК с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1), n представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, и n' представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Третья стадия включает в себя вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, или в популяции клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени или во второй момент времени. Относительное содержание представляет собой число считываний данной гидовой РНК, деленное на число считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК. Четвертая стадия включает в себя выбор гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. Возможные пороговые оценки обогащения обсуждаются выше. В качестве конкретного примера, пороговая оценка обогащения может быть установлена как «в около 1,5 раза».

[00400] В некоторых способах CRISPRn предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение данного гена способствует (или ожидается, что способствует) агрегации тау-белка или усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка. Аналогичным образом, в некоторых способах CRISPRa предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции данного гена способствует (или ожидается, что способствует) агрегации тау-белка или усиливает (или ожидается, что усиливает) агрегацию тау-белка. Первая стадия включает в себя идентификацию того, какие из множества уникальных гидовых РНК присутствуют в популяции положительных в отношении агрегации тау-белка клеток. Вторая стадия включает в себя вычисление вероятности случайного присутствия идентифицированных гидовых РНК с использованием формулы nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, m представляет собой разнообразие уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1), n представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, введенных в популяцию клеток, и n' представляет собой разнообразие нацеленных на данный ген уникальных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Третья стадия включает в себя вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (1). Оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание данной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, деленное на относительное содержание данной гидовой РНК в указанной отрицательной в отношении агрегации популяции клеток, или в популяции клеток, культивируемых после введения библиотеки гидовых РНК в первый момент времени или во второй момент времени. Относительное содержание представляет собой число считываний данной гидовой РНК, деленное на число считываний всей популяции множества уникальных гидовых РНК. Четвертая стадия включает в себя выбор гена, если соответствующие показатели гидовой РНК, нацеленной на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения. Возможные пороговые оценки обогащения обсуждаются выше. В качестве конкретного примера, пороговая оценка обогащения может быть установлена как «в около 1,5 раза».

[00401] «Разнообразие» при использовании во фразе «разнообразие уникальных гидовых РНК» означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Данный термин - это не «содержание», а скорее качественный показатель «присутствует» или «отсутствует». Разнообразие уникальных гидовых РНК означает число последовательностей уникальных гидовых РНК. Разнообразие уникальных гидовых РНК определяется с помощью секвенирования нового поколения (СНП) для идентификации всех уникальных гидовых РНК, присутствующих в популяции клеток. Это осуществляется с помощью двух праймеров, которые распознают константные области вирусного вектора для амплификации гРНК, которая находится между данными константными областями, и праймера, который распознает одну константную область для секвенирования. Каждая уникальная гидовая РНК, присутствующая в образце, будет генерировать число считываний с использованием праймера для секвенирования. Результаты СНП будут включать в себя последовательность, а также число считываний, соответствующих данной последовательности. Число считываний будет использоваться для расчета оценки обогащения для каждой гидовой РНК, и наличие каждой уникальной последовательности укажет на то, какие гидовые РНК присутствуют в данном образце. Например, если есть три уникальных гидовых РНК для гена до отбора, и все три сохраняются после отбора, то и n, и n' равно 3. Эти числа используются для расчета статистических значений, но не для фактического числа считываний. Тем не менее число считываний для каждой гидовой РНК (в одном примере, 100, 200, 50, которые соответствуют каждой из 3 уникальных гидовых РНК) будет использоваться для расчета оценки обогащения.

[00402] Все патентные документы, веб-сайты, другие публикации, учетные номера и т.п., указанные выше или ниже в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был специально и отдельно указан как включенный в данный документ посредством ссылки. Если разные версии последовательности связаны с учетным номером в разное время, то подразумевается та версия, которая связана с учетным номером на действительную дату подачи данной заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю дату из даты фактической подачи или даты подачи приоритетной заявки со ссылкой на учетный номер, если это применимо. Аналогичным образом, если разные версии публикации, веб-сайта и т.п. публикуются в разное время, то подразумевается та версия, которая была опубликована последней на действительную дату подачи данной заявки, если не указано иное. Любые признак, стадия, элемент, вариант осуществления или аспект данного изобретения можно применять в комбинации с любым другим, если специально не указано иное. Несмотря на то, что данное изобретение описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров для ясности и понимания, будет очевидно, что могут быть осуществлены определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы данного изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00403] Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот. Нуклеотидные последовательности следуют стандартному соглашению: они начинаются с 5'-конца последовательности и простираются вперед (то есть слева направо в каждой строке) до 3'-конца. Показана только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, но подразумевается, что комплементарная ей цепь включена посредством любой ссылки на отображаемую цепь. Когда представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, следует понимать, что также представлены ее варианты с вырожденными ко донами, которые кодируют ту же аминокислотную последовательность. Аминокислотные последовательности следуют стандартному соглашению: они начинаются с амино-конца последовательности и простираются вперед (то есть слева направо в каждой строке) до карбокси-конца.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Разработка полногеномной скрининговой платформы CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов агрегации тау-белка

[00405] Аномальная агрегация или фибриллизация белков является определяющим признаком многих заболеваний, в частности, ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), лобно-височная деменция (ЛВД), боковой амиотрофический склероз (БАС), хроническая травматическая энцефалопатия (ХТЭ), болезнь Крейтцфельда Якоба (БКЯ) и другие. Во многих из данных заболеваний фибриллизация определенных белков в нерастворимые агрегаты является не только характерным признаком заболевания, но также считается причинным фактором нейротоксичности. Кроме того, данные заболевания характеризуются распространением совокупной патологии через центральную нервную систему в соответствии со стереотипными паттернами - процессом, который коррелирует с прогрессированием заболевания. Таким образом, идентификация генов и генетических путей, которые модифицируют процессы аномальной агрегации белков или распространения агрегатов от клетки к клетке, имеет большое значение для лучшего понимания этиологии нейродегенеративных заболеваний, а также для разработки стратегий терапевтического вмешательства.

[00406] Чтобы идентифицировать гены и пути, которые модифицируют процессы аномальной агрегации тау-белка, была разработана платформа для проведения полногеномных скринингов с использованием библиотек егРНК нуклеаз CRISPR (CRISPRn) для идентификации генов, которые регулируют возможность клеток быть «засеянными» агрегатами тау-белка, связанными с заболеваниями (т.е. генов, нарушение которых делает клетки более восприимчивыми к образованию агрегатов тау-белка при воздействии источника фибриллизованного тау-белка). Идентификация таких генов может пролить свет на механизмы распространения агрегатов тау-белка от клетки к клетке и на генетические пути, которые регулируют восприимчивость нейронов к формированию агрегатов тау-белка в контексте нейродегенеративных заболеваний.

[00407] В данном скрининге использовалась линия клеток-биосенсоров тау-белка человека, состоящая из клеток HEK293T , стабильно экспрессирующих домен тау-белка с четырьмя повторами, tau_4RD, содержащий домен связывания микротрубочек (MBD) тау-белка с патогенной мутацией P301S, слитый либо с CFP, либо с YFP. Это значит, что указанные клеточные линии HEK293T содержат два трансгена, стабильно экспрессирующих варианты ассоциированного с заболеванием белка, слитые с флуоресцентным белком CFP или с флуоресцентным белком YFP - Tay^4RD-CFP/Tay^4RD-YFP (TCY), где содержащий повторы домен тау-белка (4RD) содержит патогенную мутацию P301S. См. фиг. 1. В данных биосенсорных линиях агрегация белков тау-CFP/Tay-YFP производит FRET-сигнал, который является результатом переноса энергии флуоресценции от донора CFP к акцептору YFP. См. фиг. 2. Клетки, положительные в отношении FRET, содержащие агрегаты тау-белка, могут быть отсортированы и выделены с помощью метода проточной цитометрии. В исходном состоянии нестимулированные клетки экспрессируют репортеры в стабильном растворимом виде с минимальным сигналом FRET. При стимуляции (например, липосомная трансфекция засеваемыми частицами) репортерные белки образуют агрегаты, производя сигнал FRET. Клетки, содержащие агрегаты, можно выделить с помощью метода FACS. Стабильно размножающиеся клеточные линии, содержащие агрегаты, Аг[+], могут быть выделены путем клонального серийного разведения клеточных линий Аг[-].

[00408] В данную линию клеток-биосенсоров тау-белка было внесено несколько модификаций, чтобы сделать ее пригодной для генетического скрининга. Во-первых, данные клетки-биосенсоры тау-белка были модифицированы путем введения Cas 9-экспремирующего трансгена (SpCas9) с помощью лентивирусного вектора. Клональные трансгенные клеточные линии, экспрессирующие Cas9, были отобраны с помощью бластицидина и выделены путем клонального серийного разведения для получения клонов, происходящих из одиночных клеток. В данных клонах проводили оценку уровня экспрессии Cas9 с помощью кПЦР-РВ (фиг. 3А) и активности расщепления ДНК с помощью цифровой ПНР (фиг. 3В). Относительные уровни экспрессии Cas9 также показаны в таблице 3.

[00410] В частности, эффективность мутации Cas9 оценивали с помощью цифровой ПЦР через 3 суток и через 7 суток после трансдукции лентивирусов, кодирующих гРНК против двух выбранных целевых генов. Эффективность разрезания ограничивалась уровнями Cas9 в клонах с более низкой экспрессией. Клон с достаточным уровнем экспрессии Cas9 был необходим для достижения максимальной активности. Несколько из клонов-производных с более низкой экспрессией Cas9 не смогли эффективно разрезать целевые последовательности, тогда как клоны с более высокой экспрессией (включая те, которые использовались для скрининга) были способны генерировать мутации в целевых последовательностях в генах PERK и SNCA с эффективностью около 80% после трех суток в культуре. Эффективное разрезание наблюдали уже через 3 суток после трансдукции гРНК с лишь незначительным улучшением через 7 суток. Клон 7В10-С3 был выбран как высокопроизводительный клон для применения в последующих скринингах библиотек.

[00411] Во-вторых, были разработаны реагенты и способ для сенсибилизации клеток к активности засева тау-белка. Распространение тау-белка от клетки к клетке может быть результатом агрегационной активности тау-белка, секретируемого клетками, содержащими агрегаты. Для изучения распространения агрегации тау-белка в клетках были получены субклоны клеточной линии тау-YFP, состоящей из клеток HEK293T, стабильно экспрессирующих содержащий повторы домен тау-белка - tau_4RD, содержащий домен связывания микротрубочек (MBD) тау-белка с патогенной мутацией P301S, слитый с YFP. См. фиг. 5. Клетки, в которых белок тау-YFP стабильно присутствует в агрегированном состоянии (Аг[+]), получали с помощью обработки данных Tay-YFP-клеток рекомбинантным фибриллизованным тау-белком, смешанным с липофектаминовым реагентом, для того, чтобы засеять агрегацию белка тау-YFP, стабильно экспрессируемого данными клетками. Затем указанные «засеянные» клетки серийно разводили для получения клонов, происходящих из отдельных клеток. Затем данные клоны размножали для идентификации клональных клеточных линий, в которых агрегаты тау-YFP стабильно сохраняются во всех клетках при росте и множественных пассажах с течением времени. Один из данных клонов тау-YFP Аг[+] клон 18 использовали для получения кондиционированной среды путем сбора среды, которая находилась на конфлюентных клетках тау-YFP Аг[+] в течение четырех суток. Затем кондиционированную среду (КМ) наносили на наивные клетки-биосенсоры тау-CFP/Tay-YFP в соотношении КМ: свежая среда, равном 3:1, чтобы можно было вызвать агрегацию тау-белка в небольшом проценте данных реципиентных клеток. Липофектамин не применялся. Липофектамин не применялся, чтобы данный анализ был максимально физиологичным, без провоцирования клеток-реципиентов на усиление/повышение агрегации тау-белка с помощью липофектамина. Согласно измерениям с использованием проточной цитометрии для оценки процентного содержания клеток, продуцирующих сигнал FRET в качестве меры агрегации, кондиционированная среда планомерно индуцировала FRET в около 0,1% клеток. См. фиг. 6. Подводя итоги, клетки Tay-YFP_Ar[+] не способны производить сигнал FRET, но они способны обеспечить источник факторов засева тау-белка.

Пример 2. Полногеномный скрининг CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов агрегации тау-белка

[00412] Чтобы выявить гены-модификаторы агрегации тау-белка в виде обогащенных егРНК в клетках FRET[+], экспрессирующие Cas9 тау-CFP/Tay-YFP биосенсорные клетки без агрегатов (Аг[-]) были трансдуцированы двумя полногеномными библиотеками CRISPR егРНК человека с использованием подхода лентивирусной доставки для введения нокаутирующих мутаций в каждый целевой ген. См. фиг. 4. Каждая библиотека CRISPR егРНК нацелена на конститутивные 5'-экзоны для функционального нокаута со средним охватом ~ 3 егРНК на ген (в общей сложности 6 гРНК на ген в двух объединенных библиотеках). Распределение числа считываний (т.е. репрезентация каждой гРНК в данной библиотеке) было нормальным и одинаковым для каждой библиотеки. егРНК были разработаны таким образом, чтобы избежать нецелевых эффектов, избегая егРНК с двумя или меньшим числом несовпадений с нецелевыми геномными последовательностями. Указанные библиотеки охватывают 19050 генов человека и 1864 микроРНК с 1000 контрольными ненацеленными егРНК. Указанные библиотеки трансдуцировали с показателем множественности заражения (МЗ, англ. «MOI») <0,3 при охвате >300 клеток на егРНК. Клетки-биосенсоры тау-белка выращивали в условиях отбора пуромицином для отбора клеток с интеграцией и экспрессией уникальной егРНК на клетку. Отбор пуромицином начинали через 24 часа после трансдукции при концентрации, составляющей 1 мкг/мл. В первичном скрининге использовали пять независимых повторностей скрининга.

[00413] Образцы полной трансдуцированной популяции клеток собирали после пассажа клеток на 3-е и на 6-е сутки после трансдукции. После пассажа на 6-е сутки клетки выращивали в кондиционированной среде для того, чтобы сенсибилизировать их к активности засева. На 10-е сутки применяли клеточную сортировку с активацией флуоресценции (FACS), чтобы конкретным образом выделить субпопуляцию клеток FRET[+]. См. фиг. 7. Данный скрининг состоял из пяти повторных экспериментов. Выделение ДНК и ПЦР-амплификация интегрированных конструкций егРНК позволили провести характеризацию репертуара егРНК в каждый момент времени с помощью секвенирования нового поколения (СИП).

[00414] Статистический анализ данных СНП позволил идентифицировать егРНК, обогащенные в субпопуляции FRET[+] на 10-е сутки, в пяти экспериментах, по сравнению с репертуаром егРНК в более ранние моменты времени - на 3-е и на 6-е сутки. Примеры относительного содержания и обогащения для анализа СНП проиллюстрированы на фиг. 8. Первая стратегия для выявления потенциальных модификаторов тау-белка заключалась в использовании секвенирования ДНК для получения числа считываний егРНК в каждом образце с использованием алгоритма DESeq для поиска егРНК, которые были более многочисленными на 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками или на 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками, но не на 6-е сутки по сравнению с 3-ми сутками (кратность изменения (КИ) ≥1,5 и отрицательный биномиальный тест при р<0,01). КИ ≥1,5 означает, что соотношение (среднее число считываний на 10-е сутки) / (среднее число считываний на 3-е сутки или на 6-е сутки) составляете 1,5. Р<0,01 означает, что вероятность отсутствия статистической разницы между числом считываний на 10-е сутки и числом считываний на 3-и сутки или на 6-е сутки составляет <0,01. Алгоритм DESeq представляет собой широко используемый алгоритм для «анализа дифференциальной экспрессии для данных подсчета последовательностей». См., например, работу Anders et al. (2010) Genome Biology 11: R106, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00415] В частности, в каждой библиотеке использовали два сравнения для определения значимых егРНК: 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками и 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками. Для каждого из указанных четырех сравнений использовался алгоритм DESeq, и порог отсечения, который считался значимым, составлял кратность изменения ≥1,5, а также отрицательный биномиальный тест при р<0,01. После того, как были определены значимые гидовые РНК в каждом из указанных сравнений для каждой библиотеки, ген считался значимым, если он удовлетворял одному из двух следующих критериев: (1) по меньшей мере две егРНК, соответствующие данному гену, считались значимыми в одном сравнении (либо 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками, либо 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками); и (2) по меньшей мере одна егРНК была значимой в обоих сравнениях (10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками и 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками). Используя данный алгоритм, мы идентифицировали как значимые пять генов из первой библиотеки и четыре гена из второй библиотеки. См. таблицу 4.

[00417] Тем не менее первая стратегия требует определенных уровней однородности числа считываний в каждой экспериментальной группе, и может быть слишком строгой. Многие факторы могут приводить к изменчивости числа считываний одной и той же егРНК среди образцов в каждой экспериментальной группе (образцы на 3-е, 6-е или 10-е сутки), такие как начальное число вирусов в скрининговой библиотеке, эффективность заражения или редактирования гена и относительная скорость роста после редактирования гена. Следовательно, также применяли вторую стратегию, основанную на положительной частоте появлений (число считываний >30) гидовых РНК на каждый ген в каждом образце на 10-е сутки (после отбора) вместо определения точного числа считываний. Формальное статистическое р-значение рассчитывали для числа положительно наблюдаемых гидовых РНК в образце после отбора (n') с учетом размера библиотеки (х), числа гидовых РНК на каждый ген (n) и общего числа положительно наблюдаемых гидовых РНК в образце после отбора (m) («число» относится к типу егРНК (т.е. к уникальным последовательностям гидовых РНК), а не к числу считываний) (p_n'=nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm). Вероятность случайного присутствия n' гидовых РНК равна: p_n'-=nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm. Вероятность случайного присутствия n' или большего числа гидовых РНК для гена g рассчитывалась следующим образом:

Общее увеличение числа считываний (обогащение) гена после отбора по сравнению с показателем до отбора использовалось в качестве дополнительного параметра для идентификации положительных генов: (Относительное содержание = [число считываний гена] / [число считываний всех генов] и обогащение после отбора = [относительное содержание после отбора] / [относительное содержание до отбора]).

[00418] Более конкретно, вторая стратегия представляет собой новый и более чувствительный метод анализа для положительного отбора CPJSPR. Целью положительного отбора CPJSPR является использование секвенирования ДНК для идентификации генов, для которых нарушение, вызванное егРНК, коррелирует с фенотипом. Чтобы снизить фоновый шум, в указанных экспериментах обычно используются несколько егРНК для одного и того же гена вместе с экспериментальными репликами. Тем не менее в настоящее время широко используемые методы статистического анализа, которые требуют определенной степени однородности/согласия среди егРНК для одного и того же гена, а также среди технических повторов, не работают достаточно хорошо. Это связано с тем, что данные методы не могут справиться с огромными вариациями среди егРНК и повторов для одного и того же гена по многим возможным причинам (например, различная эффективность заражения или редактирования генов, начальное число вирусов в скрининговой библиотеке и присутствие других егРНК с таким же фенотипом). В отличие от этого, мы разработали метод, устойчивый к большим вариациям. Он основан на положительных частотах появлений гидовых РНК на каждый отдельный ген в отдельном эксперименте, а не на точном числе считываний каждой егРНК. Формальные статистические р-значения рассчитывали для числа положительно наблюдаемых егРНК в экспериментальных повторностях с учетом размера библиотеки, числа егРНК на каждый ген и общего числа положительно наблюдаемых егРНК в каждом эксперименте. Относительное обогащение считываний последовательностей егРНК до и после отбора фенотипа также используется в качестве параметра. Наш метод работает лучше, чем широко используемые современные методы, включая DESeq, MAGECK и другие. В частности, данный метод включает в себя следующие шаги:

[00419] (1) Для каждого эксперимента определение любых присутствующих гидовых РНК в клетках с положительным фенотипом.

[00420] (2) На уровне гена вычисление вероятности случайного присутствия гидовых РНК в каждом эксперименте: nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие гидовых РНК до выбора фенотипа, m представляет собой разнообразие гидовых РНК после выбора фенотипа, n представляет собой разнообразие гидовых РНК для гена до выбора фенотипа, и n' представляет собой разнообразие гидовых РНК для гена после выбора фенотипа. Общая вероятность присутствия по нескольким экспериментам (получение одного р-значения по сравнению с р-значениями, полученными в нескольких экспериментах) рассчитывается с помощью комбинированного критерия вероятности Фишера (ссылка: Fisher, R.A.; Fisher, R. А (1948) "Questions and answers #14" The American Statistician). Это значит, что статистический критерий 0 сначала вычисляется с использованием р-значений из множества экспериментов: где p_kпредставляет собой р-значение, вычисленное для k-го эксперимента, а К представляет собой общее число экспериментов. Тогда комбинированное р-значение по К экспериментам равно вероятности наблюдения значения φ при распределении хи-квадрат со степенью свободы 2*К. В качестве альтернативы, общая вероятность присутствия по нескольким экспериментам рассчитывается путем умножения вычисленной выше вероятности, полученной в каждом эксперименте.

[00421] (3) Расчет среднего обогащения гидовых РНК на уровне гена: оценка обогащения = относительное содержание после отбора / относительное содержание до отбора. Относительное содержание = число считываний гидовых РНК для гена / число считываний всех гидовых РНК.

[00422] (4) Отбор генов значительно ниже вероятности случайного присутствия, а также выше определенной оценки обогащения.

[00423] Четырнадцать целевых генов, идентифицированных с помощью двух разных подходов (либо с помощью каждого из двух подходов, либо с помощью обоих подходов) как обогащенные в клетках FRET[+], были выбраны в качестве основных кандидатов для дальнейшей валидации после визуального осмотра на основе данных подсчета числа считываний. См. таблицу 5. Тридцать отдельных егРНК были исследованы во вторичных скринингах для валидации. Схема вторичных скринингов показана на фиг. 9, а соответствующие результаты показаны на фиг. 10. Нарушение либо целевого гена 2, либо целевого гена 8, с помощью множества протестированных егРНК повышало восприимчивость клетки к образованию агрегатов тау-белка в ответ на источник активности по засеву тау-белка (кондиционированная среда). Индукция сигнала FRET повышалась в 15-20 раз в клетках с нарушением любой из данных двух целевых молекул. Нарушение данных двух целевых генов усиливает образование агрегатов тау-белка в ответ на кондиционированную среду, но не на свежую среду. См. фиг. 11.

[00425] Затем были проведены дальнейшие эксперименты с целевыми генами 2 и 8, чтобы дополнительно подтвердить, что нацеливание на каждый из данных генов способствует агрегации тау-белка. См. фиг. 12. Тестировали две разные егРНК против целевого гена 2 и использовали одну егРНК против целевого гена 8. Ненацеленную егРНК использовали в качестве отрицательного контроля. В 0-е сутки провели четыре независимых лентивирусных трансдукции для каждой гидовой РНК. В 6-е сутки провели засев тау-белка с помощью кондиционированной среды с липофектамином или без него и отобрали образцы для кПЦР-РВ. Данные, полученные с помощью кПЦР-РВ, показаны на фиг. 13. Каждая из двух егРНК, нацеленных на целевой ген 2, снизила экспрессию иРНК целевого гена 2, а гРНК, нацеленная на целевой ген 8, снизила экспрессию целевого гена 8. В 10-е сутки провели FACS-анализ для оценки индукции сигнала FRET. Агрегация тау-белка повышалась каждой из двух егРНК, нацеленных на целевой ген 2, и гРНК, нацеленной на целевой ген 8. См. фиг. 15. В 13-е сутки отобрали образцы для вестерн-блоттинга. Результаты вестерн-блоттинга показаны на фиг. 14. Подобно экспериментам с кПЦР-РВ, оценивающим экспрессию иРНК, экспрессия белка 2 снижалась с помощью двух егРНК, нацеленных на целевой ген 2, а экспрессия белка 8 снижалась с помощью егРНК, нацеленной на целевой ген 8.

[00426] Дальнейшая валидация целевых генов 2 и 8 как модификаторов агрегации тау-белка выполнялась путем выделения отдельных клонов с нокдауном целевого гена 2 и отдельных клонов с нокдауном целевого гена 8 для валидации. Биосенсорные клетки тау-CFP/Tay-YFP, экспрессирующие Cas9, не содержащие агрегатов (Аг[-]) трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим егРНК 1 для целевого гена 2, егРНК 5 для целевого гена 8 или ненацеленную егРНК. Затем проводили серийное клональное разведение для отбора индивидуальных клонов. Уровни иРНК целевого гена 2 и иРНК целевого гена 8 оценивали с помощью кПЦР-РВ, а уровни белка 2 и белка 8 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Каждый из клонов с егРНК для целевого гена 2 снизил экспрессию иРНК целевого гена 2 (данные не показаны) и экспрессию белка 2 (фиг.16), а каждый из клонов с егРНК для целевого гена 8 снизил экспрессию иРНК целевого гена 8 (данные не показаны) и экспрессию белка 8 (фиг. 16).

[00427] Затем каждый из клонов засевали кондиционированной средой в течение 4 суток и проводили FRET-анализ для оценки агрегации тау-белка. Результаты, полученные с помощью нокдаун-клонов, подтверждают, что целевые гены 2 и 8 являются модификаторами агрегации тау-белка. См. фиг. 17.

[00428] Затем отдельные клоны были дополнительно охарактеризованы с помощью секвенирования нового поколения с целью определения того, какие модификации были внесены в локусы целевого гена 2 и целевого гена 8. Данные модификации кратко изложены в таблице 6, приведенной ниже. Почти все мутантные клоны содержат некоторый процент аллелей дикого типа. Процентное содержание клеток FRET[+] (обладающих активностью по агрегации тау-белка) коррелировало с процентным содержанием вставок/делеций, вызванных негомологичным соединением концов в сайтах расщепления (т.е. агрегация тау-белка обратно коррелировала с процентным содержанием аллелей дикого типа: чем ниже процентное содержание аллелей дикого типа, тем выше процентное содержание клеток Fret[+]). См. фиг. 16 и таблицу 6.

[00430] Фосфорилирование тау-белка также оценивали в каждом клоне с помощью вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что тау-белок гиперфосфорилирован по S262 и S356 в клоне 5.7 егРНК целевого гена 8. См. фиг. 18. Несмотря на то, что клоны, в которых тау-белок не был гиперфосфорилирован, все же, по-видимому, усиливали индукцию FRET в данном эксперименте, клон 5.7 был довольно нестабильным, а целевой ген 8 участвует во многих биологических процессах, поэтому нельзя сделать общих выводов. Дальнейшие эксперименты на первичных кортикальных нейронах мышей показали, что окрашивание на фосфо-тау (S356) повышается в соматодендритном компартменте в первичных кортикальных нейронах мышей, обработанных Cas9 и егРНК для целевого гена 2 с помощью лентивирусной доставки и поддерживаемых в течение 14 суток в культуре (данные не показаны).

[00431] Данная валидация подтвердила ценность подхода первичного скрининга для идентификации генов, которые могут регулировать восприимчивость клеток к засеву тау-белка при воздействии внешнего источника активности по засеву тау-белка. Таким образом, целевые молекулы, идентифицированные посредством указанного скрининга, могут быть значимыми целевыми молекулами, распространяющими патологию тау-белка от клетки к клетке в контексте нейродегенеративного заболевания, и будут изучены в дальнейшем.

Пример 3. Разработка полногеномной скрининговой платформы CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов агрегации тау-белка с использованием библиотеки CRISPR/Cas9 для активации транскрипции

[00432] Чтобы дополнительно идентифицировать гены и пути, которые модифицируют процессы аномальной агрегации тау-белка, была разработана платформа для проведения скринингов с использованием библиотек егРНК активации CRISPR (hSAM) для идентификации генов, которые регулируют возможность клеток быть «засеянными» агрегатами тау-белка, связанными с заболеваниями (т.е. генов, активация транскрипции которых делает клетки более восприимчивыми к образованию агрегатов тау-белка при воздействии источника фибриллизованного тау-белка). Идентификация таких генов может пролить свет на механизмы распространения агрегатов тау-белка от клетки к клетке и на генетические пути, которые регулируют восприимчивость нейронов к формированию агрегатов тау-белка в контексте нейродегенеративных заболеваний.

[00433] В данном скрининге использовалась линия клеток-биосенсоров тау-белка человека, состоящая из клеток HEK293T , стабильно экспрессирующих домен тау-белка с четырьмя повторами, tau 4RD, содержащий домен связывания микротрубочек (MBD) тау-белка с патогенной мутацией P301S, слитый либо с CFP, либо с YFP. Это значит, что указанные клеточные линии HEK293T содержат два трансгена, стабильно экспрессирующих варианты ассоциированного с заболеванием белка, слитые с флуоресцентным белком CFP или с флуоресцентным белком YFP - Tay^4RD-CFP/Tay^4RD-YFP (TCY), где содержащий повторы домен тау-белка (4RD) содержит патогенную мутацию P301S. См. фиг. 1. В данных биосенсорных линиях агрегация белков тау-CFP/Tay-YFP производит FRET-сигнал, который является результатом переноса энергии флуоресценции от донора CFP к акцептору YFP. См. фиг. 2. Клетки, положительные в отношении FRET, содержащие агрегаты тау-белка, могут быть отсортированы и выделены с помощью метода проточной цитометрии. В исходном состоянии нестимулированные клетки экспрессируют репортеры в стабильном растворимом виде с минимальным сигналом FRET. При стимуляции (например, липосомная трансфекция засеваемыми частицами) репортерные белки образуют агрегаты, производя сигнал FRET. Клетки, содержащие агрегаты, можно выделить с помощью метода FACS. Стабильно размножающиеся клеточные линии, содержащие агрегаты, Аг[+], могут быть выделены путем клонального серийного разведения клеточных линий Аг[-].

[00434] В данную линию клеток-биосенсоров тау-белка было внесено несколько модификаций, чтобы сделать ее пригодной для генетического скрининга. Во-первых, данную линию клеток-биосенсоров тау-белка дополнительно трансгенно модифицировали для экспрессии компонентов системы активации транскрипции CRISPR/Cas SAM: dCas9-VP64 и MS2-P65-HSF1. Лентивирусные конструкции dCas9-VP64 и MS2-P65-HSF1 представлены в SEQ ID NO: 42 и 43 соответственно. Был выбран клон в качестве высокопроизводительного клона для применения в последующих скринингах библиотек. Данный клон был подтвержден на предмет его эффективности в активации выбранных целевых генов.

[00435] Во-вторых, были разработаны реагенты и способ для сенсибилизации клеток к активности засева тау-белка, как в примере 1. В качестве альтернативы, если требуется дополнительная агрегация, можно использовать клеточный лизат из клона Аг[+], как в примере 5.

Пример 4. Полногеномный скрининг CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов агрегации тау-белка с использованием библиотеки CRISPR/Cas9 для активации транскрипции

[00436] Чтобы выявить дополнительные гены-модификаторы агрегации тау-белка в виде обогащенных егРНК в клетках FRET[+], экспрессирующие SAM тау-CFP/Tay-YFP биосенсорные клетки без агрегатов (Аг[-]) трансдуцировали полногеномной библиотекой егРНК CRISPR hSAM человека с использованием подхода лентивирусной доставки для активации транскрипции каждого целевого гена. егРНК в указанной библиотеке нацелены на сайты, расположенные в пределах 200 п. о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции со средним охватом ~ 3 егРНК на ген. егРНК были разработаны таким образом, чтобы избежать нецелевых эффектов, избегая егРНК с двумя или меньшим числом несовпадений с нецелевыми геномными последовательностями. Указанная библиотека охватывает 18946 генов человека. Указанную библиотеку вводили путем трансдукции с показателем множественности заражения (МЗ) <0,3 при охвате >300 клеток на егРНК. Клетки-биосенсоры тау-белка выращивали в условиях отбора зеоцином для отбора клеток с интеграцией и экспрессией уникальной егРНК на клетку. В первичном скрининге использовали пять независимых повторностей скрининга.

[00437] Образцы полной трансдуцированной популяции клеток собирали после пассажа клеток на 3-е и на 6-е сутки после трансдукции. После пассажа на 6-е сутки клетки выращивали в кондиционированной среде для того, чтобы сенсибилизировать их к активности засева. На 10-е сутки применяли клеточную сортировку с активацией флуоресценции (FACS), чтобы конкретным образом выделить субпопуляцию клеток FRET[+]. Выделение ДНК и ПЦР-амплификация интегрированных конструкций егРНК позволили провести характеризацию репертуара егРНК в каждый момент времени с помощью секвенирования нового поколения (СНП).

[00438] Поскольку анализ данных и статистический анализ отражают подход, использованный в примере 2, не все соответствующие подробности из примера 2 повторяются в данном примере. Статистический анализ данных СНП позволил идентифицировать егРНК, обогащенные в субпопуляции FRET[+] на 10-е сутки, во множестве экспериментов, по сравнению с репертуаром егРНК в более ранние моменты времени на 3-е и на 6-е сутки. Первая стратегия для выявления потенциальных модификаторов тау-белка заключалась в использовании секвенирования ДНК для получения числа считываний егРНК в каждом образце с использованием алгоритма DESeq для поиска егРНК, которые были более многочисленными на 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками или на 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками, но не на 6-е сутки по сравнению с 3-ми сутками (кратность изменения (КИ) ≥1,5 и отрицательный биномиальный тест при р<0,01). КИ ≥1,5 означает, что соотношение (среднее число считываний на 10-е сутки) / (среднее число считываний на 3-е сутки или на 6-е сутки) составляете 1,5. Р<0,01 означает, что вероятность отсутствия статистической разницы между числом считываний на 10-е сутки и числом считываний на 3-й сутки или на 6-е сутки составляет <0,01. Алгоритм DESeq представляет собой широко используемый алгоритм для «анализа дифференциальной экспрессии для данных подсчета последовательностей». См., например, работу Anders et al. (2010) Genome Biology 11: R106, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00439] В частности, в каждой библиотеке использовали два сравнения для определения значимых егРНК: 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками и 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками. Для каждого из указанных четырех сравнений использовался алгоритм DESeq, и порог отсечения, который считался значимым, составлял кратность изменения ≥1,5, а также отрицательный биномиальный тест при р<0,01. После того, как были определены значимые гидовые РНК в каждом из указанных сравнений для каждой библиотеки, ген считался значимым, если он удовлетворял одному из двух следующих критериев: (1) по меньшей мере две егРНК, соответствующие данному гену, считались значимыми в одном сравнении (либо 10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками, либо 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками); и (2) по меньшей мере одна егРНК была значимой в обоих сравнениях (10-е сутки по сравнению с 3-ми сутками и 10-е сутки по сравнению с 6-ми сутками).

[00440] Тем не менее первая стратегия требует определенных уровней однородности числа считываний в каждой экспериментальной группе, и может быть слишком строгой. Многие факторы могут приводить к изменчивости числа считываний одной и той же егРНК среди образцов в каждой экспериментальной группе (образцы на 3-е, 6-е или 10-е сутки), такие как начальное число вирусов в скрининговой библиотеке, эффективность заражения или редактирования гена и относительная скорость роста после редактирования гена. Следовательно, также применяли вторую стратегию, основанную на положительной частоте появлений (число считываний >30) гидовых РНК на каждый ген в каждом образце на 10-е сутки (после отбора) вместо определения точного числа считываний. Формальное статистическое р-значение рассчитывали для числа положительно наблюдаемых гидовых РНК в образце после отбора (n') с учетом размера библиотеки (х), числа гидовых РНК на каждый ген (n) и общего числа положительно наблюдаемых гидовых РНК в образце после отбора (m) («число» относится к типу егРНК (т.е. к уникальным последовательностям гидовых РНК), а не к числу считываний) (p_n'=nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm). Вероятность случайного присутствия n' гидовых РНК равна: p_n'=nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm. Вероятность случайного присутствия n' или большего числа гидовых РНК для гена g рассчитывалась следующим образом:

[00441] Более конкретно, вторая стратегия представляет собой новый и более чувствительный метод анализа для положительного отбора CRISPR. Целью положительного отбора CRISPR является использование секвенирования ДНК для идентификации генов, для которых активация транскрипции, вызванная егРНК, коррелирует с фенотипом. Чтобы снизить фоновый шум, в указанных экспериментах обычно используются несколько егРНК для одного и того же гена вместе с экспериментальными репликами. Тем не менее в настоящее время широко используемые методы статистического анализа, которые требуют определенной степени однородности/согласия среди егРНК для одного и того же гена, а также среди технических повторов, не работают достаточно хорошо. Это связано с тем, что данные методы не могут справиться с огромными вариациями среди егРНК и повторов для одного и того же гена по многим возможным причинам (например, различная эффективность заражения или редактирования генов, начальное число вирусов в скрининговой библиотеке и присутствие других егРНК с таким же фенотипом). В отличие от этого, мы разработали метод, устойчивый к большим вариациям. Он основан на положительных частотах появлений гидовых РНК на каждый отдельный ген в отдельном эксперименте, а не на точном числе считываний каждой егРНК. Формальные статистические р-значения рассчитывали для числа положительно наблюдаемых егРНК в экспериментальных повторностях с учетом размера библиотеки, числа егРНК на каждый ген и общего числа положительно наблюдаемых егРНК в каждом эксперименте. Относительное обогащение считываний последовательностей егРНК до и после отбора фенотипа также используется в качестве параметра. Наш метод работает лучше, чем широко используемые современные методы, включая DESeq, MAGECK и другие. В частности, данный метод включает в себя следующие шаги:

[00442] (1) Для каждого эксперимента - определение любых присутствующих гидовых РНК в клетках с положительным фенотипом.

[00443] (2) На уровне гена - вычисление вероятности случайного присутствия гидовых РНК в каждом эксперименте: nCn' * (x-n')C(m-n) / xCm, где х представляет собой разнообразие гидовых РНК до выбора фенотипа, m представляет собой разнообразие гидовых РНК после выбора фенотипа, n представляет собой разнообразие гидовых РНК для гена до выбора фенотипа, и n' представляет собой разнообразие гидовых РНК для гена после выбора фенотипа. Общая вероятность присутствия по нескольким экспериментам (получение одного р-значения по сравнению с р-значениями, полученными в нескольких экспериментах) рассчитывается с помощью комбинированного критерия вероятности Фишера (ссылка: Fisher, R.A.; Fisher, R.А (1948) "Questions and answers #14" The American Statistician). Это значит, что статистический критерий φ сначала вычисляется с использованием р-значений из множества экспериментов: где p_kпредставляет собой р-значение, вычисленное для k-го эксперимента, а К представляет собой общее число экспериментов. Тогда комбинированное р-значение по К экспериментам равно вероятности наблюдения значения φ при распределении хи-квадрат со степенью свободы 2*К. В качестве альтернативы, общая вероятность присутствия по нескольким экспериментам рассчитывается путем умножения вычисленной выше вероятности, полученной в каждом эксперименте.

[00444] (3) Расчет среднего обогащения гидовых РНК на уровне гена: оценка обогащения = относительное содержание после отбора / относительное содержание до отбора. Относительное содержание = число считываний гидовых РНК для гена / число считываний всех гидовых РНК.

[00445] (4) Отбор генов значительно ниже вероятности случайного присутствия, а также выше определенной оценки обогащения.

[00446] В общей сложности 34 целевых гена (на которые нацелены 42 разные егРНК) были идентифицированы с помощью двух разных подходов (либо с помощью каждого из двух подходов, либо с помощью обоих подходов) как обогащенные в клетках FRET[+].

Пример 5. Подготовка и валидации лизатов из клеток тау-YFP Аг[+] клона 18 для засева тау-белка

[00447] Дальнейшей нашей целью была идентификация целевых генов, которые при их нарушении снижают агрегацию тау-белка (либо путем блокирования поглощения факторов засева, либо путем ингибирования образования олигомеров или фибрилл, либо способствуя их разборке, либо с помощью какого-либо другого механизма). Чтобы разработать такой скрининг в отношении егРНК, которые предотвращают агрегацию тау-белка, нам нужен был мощный источник активности засева тау-белка, который мы могли бы легко получать в больших количествах. Как описано в данном примере, мы обнаружили, что лизат из цельных клеток тау-YFP Аг[+] клона 18 способен индуцировать агрегацию тау-белка и сигнал FRET, в то время как лизат клеток тау-YFP Аг[-] такой способности не имеет.Лизат из цельных клеток намного более эффективен в отношении активности засева тау-белка (без липофектамина), чем кондиционированные среды или рекомбинантные фибриллы тау-белка. Чтобы вызвать агрегацию (FRET) в большем проценте клеток (например, >50%), мы попытались использовать лизат из цельных клеток в сочетании с липофектамином. Нам также нужно было разработать метод сбора клеточного лизата в буфере, который сам по себе не токсичен для клеток. В описанных в данном документе экспериментах мы использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ), содержащий ингибиторы протеаз, для сбора клеток, и обработку ультразвуком для лизирования клеток. Наиболее подходящий лизат получался при обработке клеток ультразвуком в течение 3 минут.

[00448] Клетки подготавливали для обработки ультразвуком следующим образом: (1) брали 6 культуральных флаконов Т175 с клетками тау-YFP Аг[-] и 6 культуральных флаконов Т175 с клетками тау-YFP Аг[+] клона 18 (по ~ 50 миллионов клеток / Т175); (2) промывали клетки в культуральном флаконе с помощью 10 мл ФСБ, затем клетки соскабливали в 5 мл ФСБ; (3) собирали соскобленные клетки из 2 культуральных флаконов Т175 в одну пробирку на 15 мл, затем промывали данные 2 культуральных флакона Т175 с помощью ФСБ общим объемом 5 мл и добавляли полученный смыв с клетками в указанную пробирку на 15 мл с получением конечного объема, составляющего 15 мл (получали 3 пробирки с клетками тау-YFP Аг[-] и 3 пробирки с клетками тау-YFP Аг[+] клона 18); (4) центрифугировали данные пробирки при 1000 об/мин в течение 5 минут, аспирировали надосадочную жидкость, добавляли по 4 мл ФСБ / пробирку+40 мкл реактива HALT™ (смесь из шести ингибиторов протеаз широкого спектра действия AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин и пепстатин А, стабилизированные в высококачественном диметилсульфоксиде (ДМСО))+40 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) / пробирку (ингибиторы протеаз); и (5) переносили полученные клеточные суспензии в пробирки на 50 мл (держатель пробирок для ультразвуковой обработки может удерживать только пробирки на 50 мл) и замораживали при температуре -80°С до обработки ультразвуком.

[00449] Обработку ультразвуком для получения клеточных лизатов проводили следующим образом: (1) размораживали суспензии клеток в теплой водяной бане; (2) обрабатывали их ультразвуком в течение 1 минуты, 3 минут или 6 минут; (3) центрифугировали образцы, обработанные ультразвуком, при 1000 об/мин в течение 5 минут, делали аликвоты по 300 мкл и замораживали при температуре -80°С.

[00450] Биосенсорные клетки Tay-CFP/Tay-YFP/Cas9 клона 7В10С3 Аг[-] (С3) и FRET/FACS-контрольные клетки тау-CFP, тау-YFP, HEK-HZ, Tay-CFP/Tay-YFP/Cas9 клона 7 В10С3-В2 Аг[+] (В2) размораживали, помещали в 12-луночные планшеты и обрабатывали 10 мкг, 30 мкг или 100 мкг клеточного лизата, полученного выше. Результаты показаны на фиг. 19. Наблюдали дозозависимый ответ, и лучше всего работала 3-минутная обработка ультразвуком.

[00451] В последующем эксперименте высевали по 150000 клеток 7В10С3 Аг[-] на лунку в 24-луночных планшетах в двух повторностях. Мы использовали по 1 мл свежей среды на лунку. Мы добавляли 0 (контроль), 10, 25 или 50 мкг 3-минутного лизата из клеток тау-YFP Аг[+] клона 18 +/- липофектамин (10 мкл на 1 мл среды). При использовании липофектамина все клетки были Аг[+], но все клетки погибли через 24 часа в образцах с 25 и 50 мкг лизата, и через 48 часов - в образцах с 10 мкг лизата.

[00452] Затем мы попытались уменьшить количество используемого лизата. Высевали по 150000 клеток 7В10С3 Аг[-] на лунку в 24-луночных планшетах в двух повторностях. Мы использовали по 1 мл свежей среды на лунку. Мы добавляли 0 (контроль), 1, 5 или 10 мкг 3-минутного лизата из клеток тау-YFP Аг[+] клона 18+/- липофектамин (10 мкл на 1 мл среды). При использовании липофектамина все клетки были Аг[+], но через 24 часа клетки выглядели нездоровыми и погибли через 48 часов в образцах с 5 и 10 мкг лизата. В образцах с 1 мкг лизата все клетки были Аг[+], но через 24 часа выглядели несколько нездоровыми. Через 3 суток клетки все еще были живы и Аг[+].

[00453] Затем мы попытались уменьшить количество используемого лизата и протестировать различные концентрации липофектамина. Высевали по 150000 клеток 7В10С3 Аг[-] на лунку в 24-лун очных планшетах в двух повторностях. Мы использовали по 1 мл свежей среды на лунку. Мы добавляли 0 (контроль), 0,1, 0,5 или 1 мкг 3-минутного лизата из клеток тау-YFP Аг[+] клона 18+/- липофектамин (1, 5 или 10 мкл на 1 мл среды). При использовании 10 мкл липофектамина все клетки во всех образцах погибли через 24 часа. При использовании 5 мкл липофектамина и 0,5 мкг лизата клетки выглядели нормально через 48 часов, и большинство из них были Аг[+]. Аналогичным образом, при использовании 5 мкл липофектамина и 1 мкг лизата клетки выглядели нормально через 48 часов, и все были Аг[+]. Тем не менее 5 мкл липофектамина были токсичными в образцах 0 мкг и 0,1 мкг, так как через 48 часов клетки выглядели нездоровыми. При использовании 1 мкл липофектамина клетки выглядели нормально через 48 часов и были ~ 30% Аг[+] в образцах с 0,1 мкг лизата, ~ 40% Аг[+] в образцах 0,5 мкг лизата и ~ 50% Аг[+] в образцах с 1 мкг лизата. См. фиг. 20. Похожий эксперимент был проведен с тестированием 3 мкг, 5 мкг или 10 мкг клеточного лизата и 1 мкл, 2 мкл или 3 мкл липофектамина. Результаты показаны на фиг. 21. Еще один эксперимент был проведен с тестированием 0,5 мкг, 0,7 мкг или 1 мкг клеточного лизата и 3,5 мкл или 4 мкл липофектамина. Процент положительных в отношении агрегации клеток для каждого экспериментального условия был следующим: 0,5 мкг лизата / 3,5 мкл липофектамина: 73,5%; 0,7 мкг лизата / 3,5 мкл липофектамина: 71,7%; 1 мкг лизата /3,5 мкл липофектамина: 75,7%; 0,5 мкг лизата / 4 мкл липофектамина: 76,4%; 0,7 мкг лизата / 4 мкл липофектамина: 76,7%; и 1 мкг лизата / 4 мкл липофектамина: 78,0%. В дальнейших экспериментах выявлено, что 2 мкл и 2,5 мкл липофектамина не являются токсичными для клеток, но 3 мкл, 3,5 мкл, 4 мкл, 4,5 мкл и 5 мкл токсичны для клеток.

[00454] Затем мы увеличили масштаб до культуральных флаконов Т25, с посевом 2,8 миллиона клеток 7В10С3 + лизат + липофектамин. Сортировку FACS/FRET проводили после 2 суток культивирования. Были протестированы два условия: (1) 1,5 мкг лизата+2 мкл липофектамина на мл свежей среды; и (2) 2 мкг лизата + 2 мкл липофектамина на мл свежей среды. В первом эксперименте 965880 клеток были FRET[-] (т.е. Аг[-]) и 984760 клеток были FRET[+] (т.е. Аг[+]). Во втором эксперименте 547960 клеток были FRET[-] (т.е. Аг[-]) и 855900 клеток были FRET[+] (т.е. Аг[+]). Мы пришли к выводу, что для полногеномного скрининга мы будем использовать 2,5 мкл липофектамина на мл свежей среды и сравним две разные дозы лизатов из клеток тау-YFP Аг[+] клона 18 (1,5 мкг и 2 мкг), что потенциально может увеличить процентное содержание клеток Аг[+], сохраняя при этом их здоровье.

Пример 6. Полногеномный скрининг CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов, которые предотвращают агрегацию тау-белка

[00455] Цель скрининга в примере 2 состояла в том, чтобы идентифицировать гены-модификаторы, которые при их нарушении способствуют образованию агрегатов тау-белка при стимуляции слабым материалом засева тау-белка. Напротив, в скрининге, описываемом в данном примере, мы обрабатывали наши биосенсорные клетки сильным материалом засева тау-белка, который обычно вызывает агрегацию тау-белка и индукцию FRET в большинстве клеток. Данный материал для «максимального засева» состоит из обработанного ультразвуком лизата из цельных клеток тау-YFP Аг[+] клона 18, применяемого с липофектаминовым реагентом для трансфекции. Мы использовали данный подход для идентификации целевых генов, которые при их нарушении снижают агрегацию тау-белка (либо путем блокирования поглощения факторов засева, либо путем ингибирования образования олигомеров или фибрилл, либо способствуя их разборке, либо с помощью какого-либо другого механизма). См. фиг. 22.

[00456] Биосенсорные клетки тау-CFP/Tay-YFP, экспрессирующие Cas9 и не содержащие агрегатов (Аг[-]), трансдуцировали двумя полногеномными библиотеками CRISPR егРНК человека с использованием подхода лентивирусной доставки для введения нокаутирующих мутаций в каждый целевой ген. Каждая библиотека CRISPR егРНК нацелена на конститутивные 5'-экзоны для функционального нокаута со средним охватом ~ 3 егРНК на ген (в общей сложности 6 гРНК на ген в двух объединенных библиотеках). Распределение числа считываний (т.е. репрезентация каждой гРНК в данной библиотеке) было нормальным и одинаковым для каждой библиотеки. егРНК были разработаны таким образом, чтобы избежать нецелевых эффектов, избегая егРНК с двумя или меньшим числом несовпадений с нецелевыми геномными последовательностями. Указанные библиотеки охватывают 19050 генов человека и 1864 микроРНК с 1000 контрольными ненацеленными егРНК. Указанные библиотеки трансдуцировали с показателем множественности заражения (МЗ, англ. «MOI») <0,3 при охвате>300 клеток на егРНК. Клетки-биосенсоры тау-белка выращивали в условиях отбора пуромицином для отбора клеток с интеграцией и экспрессией уникальной егРНК на клетку. Отбор пуромицином начинали через 24 часа после трансдукции при концентрации, составляющей 1 мкг/мл. В первичном скрининге использовали пять независимых повторностей скрининга.

[00457] В каждом повторном эксперименте образцы биосенсорных клеток 7В10С3 собирали на 3-е и на 7-е сутки после трансдукции библиотек CRISPR, упакованных в лентивирусы. Во время пассажа в 7-е сутки к указанным клеткам добавляли материал «максимального засева», и через 48 часов (в 9-е сутки) выполняли FACS для разделения и сбора популяций FRET[-] и FRET[+]. Данный скрининг состоял из пяти повторных экспериментов. Выделение ДНК и ГЩР-амплификация интегрированных конструкций егРНК позволили провести характеризацию репертуара егРНК в каждый момент времени с помощью секвенирования нового поколения (СНП). Всего было 40 образцов: 5 повторных скринингов * 2 библиотеки * 4 образца для каждого условия (FRET[-] на 3-й сутки, на 7-е сутки, на 9-е сутки и FRET[+] на 9-е сутки). Для «максимального засева» применяли по 2,5 мкл липофектамина на мл свежей среды и тестировали различные количества клеточного лизата на мл свежей среды (2 мкг, 4 мкг и 5 мкг).

[00458] Анализ данных и статистический анализ отражают подход, использованный в примере 2, поэтому не все соответствующие подробности из примера 2 повторяются в данном примере. Мы сравнили (парный анализ) FRET(-) против FRET(+) против 7-х суток. Мы также выполнили парный анализ по сравнению с 3-й сутками (более строгий). На 9-е сутки образцы FRET[-] и FRET[+] анализировали относительно егРНК, обогащение или истощение которых может указывать на влияние на фенотип агрегации тау-белка. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[-] на 9-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 9-е сутки, на 3-е сутки и на 7-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[+] на 9-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 9-е сутки, на 3-е сутки и на 7-е сутки, указывают на целевые гены, которые при их нарушении могут снижать агрегацию тау-белка или защищать от нее. Эти попадания в егРНК представляют собой особый интерес как потенциальные мишени для терапевтического вмешательства. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[+] на 9-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 9-е сутки, на 3-е сутки и на 7-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[-] на 9-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 9-е сутки, на 3-е сутки и на 7-е сутки, указывают на целевые гены, которые при их нарушении могут способствовать агрегации тау-белка или усиливать агрегацию тау-белка. егРНК, которые истощены как в клетках FRET[+], так и в клетках FRET[-] на 9-е сутки по сравнению с более ранними моментами времени, вероятно, представляют собой важные гены, которые при их нарушении снижают жизнеспособность клеток с течением времени.

[00459] Мы идентифицировали 142 значимых гРНК, которые были обогащены или истощены в клетках FRET[-] (по сравнению с клетками FRET[+] и клетками на 7-е сутки). Из них 46 гРНК были истощены в клетках FRET[-], 77 гРНК были обогащены в клетках FRET[-], и 20 гРНК были обогащены в клетках FRET[-] по сравнению с 7-ми сутками (незначимо по сравнению с 3-ми сутками). См. фиг. 23 и фиг. 24.

[00460] Затем исследовали 405 отдельных егРНК во вторичных скринингах для валидации. Схема вторичных скринингов показана на фиг. 25. Провели четыре эксперимента. Количество клеточного лизата, использованного в каждом, составляло 5 мкг/мл свежей среды. Протестировали четыре различных количества липофектамина (на мл свежей среды): 1,5 мкл, 2 мкл, 2,5 мкл и 3,5 мкл. Данная валидация подтверждает ценность подхода первичного скрининга в идентификации генов, которые могут действовать как положительные и отрицательные модификаторы агрегации тау-белка.

Пример 7. Полногеномный скрининг CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов, которые препятствуют агрегации тау-белка, с использованием библиотеки CRISPR/Cas9 для активации транскрипции

[00461] Как и в примере 6, в скрининге, описываемом в данном примере, мы обрабатывали наши биосенсорные клетки сильным материалом засева тау-белка, который обычно вызывает агрегацию тау-белка и индукцию FRET в большинстве клеток. Данный материал для «максимального засева» состоит из обработанного ультразвуком лизата из цельных клеток тау-YFP Аг[+] клона 18, применяемого с липофектаминовым реагентом для трансфекции. Мы использовали данный подход для идентификации целевых генов, которые при активации их транскрипции снижают агрегацию тау-белка (либо путем блокирования поглощения факторов засева, либо путем ингибирования образования олигомеров или фибрилл, либо способствуя их разборке, либо с помощью какого-либо другого механизма). См. фиг. 26.

[00462] Биосенсорные клетки тау-CFP/Tay-YFP, экспрессирующие SAM и не содержащие агрегатов (Аг[-]), трансдуцировали полногеномной библиотекой егРНК CRISPR hSAM человека с использованием подхода лентивирусной доставки для активации транскрипции каждого из целевых генов. егРНК в указанной библиотеке нацелены на сайты, расположенные в пределах 200 п.о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции со средним охватом ~ 3 егРНК на ген. егРНК были разработаны таким образом, чтобы избежать нецелевых эффектов, избегая егРНК с двумя или меньшим числом несовпадений с нецелевыми геномными последовательностями. Указанная библиотека охватывает 18946 генов человека. Указанную библиотеку вводили путем трансдукции с показателем множественности заражения (МЗ) <0,3 при охвате >300 клеток на егРНК. Клетки-биосенсоры тау-белка выращивали в условиях отбора зеоцином для отбора клеток с интеграцией и экспрессией уникальной егРНК на клетку. В первичном скрининге использовали пять независимых повторностей скрининга.

[00463] На 10-е сутки (вторая половина дня) после трансдукции упакованных в лентивирус библиотек CRISPR к указанным клеткам добавляли материал «максимального засева», а на 13-е сутки (первая половина дня) выполняли FACS для разделения и сбора популяций FRET[-] и FRET[+]. См. фиг. 26. Данный скрининг состоял из пяти повторных экспериментов. Выделение ДНК и ПЦР-амплификация интегрированных конструкций егРНК позволили провести характеризацию репертуара егРНК в каждый момент времени с помощью секвенирования нового поколения (СНП). Для «максимального засева» применяли три количества липофектамина на мл свежей среды (по 2,5 мкл, 3,5 мкл и 4 мкл) и тестировали различные количества клеточного лизата на мл свежей среды (3 мкг, 4 мкг и 5 мкг).

[00464] На 13-е сутки образцы FRET[-] и FRET[+] анализировали относительно егРНК, обогащение или истощение которых может указывать на влияние на фенотип агрегации тау-белка. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[-] на 13-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 13-е сутки и на 10-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[+] на 13-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 13-е сутки и на 10-е сутки, указывают на целевые гены, которые при активации их транскрипции могут снижать агрегацию тау-белка или защищать от агрегации тау-белка. Эти попадания в егРНК представляют собой особый интерес как потенциальные мишени для терапевтического вмешательства. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[+] на 13-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 13-е сутки и на 10-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[-] на 13-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 13-е сутки и на 10-е сутки, указывают на целевые гены, которые при активации их транскрипции могут способствовать агрегации тау-белка или усиливать агрегацию тау-белка. Данные анализировали и проверяли во вторичных скринингах для валидации, как в примере 6. Статистический анализ отражает подход, использованный в примере 2. Мы сравнивали (парный анализ) FRET(-) против FRET(+) против 10-х суток.

Пример 8. Полногеномный скрининг CRISPR/Cas9 для идентификации генетических модификаторов дезагрегации тау-белка

[00465] В приведенных выше примерах мы провели две серии полногеномных скринингов, направленных на идентификацию положительных и отрицательных регуляторов агрегации тау-белка. В нашем первом скрининге мы идентифицировали гены-модификаторы, которые при их нарушении способствуют образованию агрегатов тау-белка при стимуляции слабым материалом засева тау-белка. Данный материал для «минимального засева» состоит из кондиционированной среды, собранной от положительных в отношении агрегации клеток тау-YFP, нанесенной непосредственно на клетки 7В10С3 для стимуляции образования -0,1% клеток FRET[+] через 3 суток in vitro. Напротив, во втором скрининге, мы обрабатывали наши биосенсорные клетки сильным или максимальным материалом засева тау-белка, который обычно вызывает агрегацию тау-белка и индукцию FRET в большинстве клеток. Данный материал для «максимального засева» состоит из обработанного ультразвуком лизата из цельных положительных в отношении агрегации клеток тау-YFP, применяемого с липофектаминовым реагентом для трансфекции.

[00466] В данном случае мы трансдуцировали положительные в отношении агрегации клетки 7В10С3-В2 или DC11-B6 упакованными в лентивирусы библиотеками CRISPR. 7 В10С3-В2 и DC11-В6 представляют собой клоны, которые содержат стабильно распространяющиеся агрегаты тау-белка. Данный скрининг проводили на клетках-биосенсорах тау-белка НЕК293, экспрессирующих Cas9 (клон 7В10С3) или dCas9-SAM (клон DC11), в которых агрегация тау-белка дает сигнал FRET, который может быть обнаружен и использован в качестве средства сортировки клеток с помощью FACS. Клоны 7В10С3 и DC11 дополнительно обрабатывали тау-фибриллами для получения субклонов, содержащих стабильно распространяющиеся агрегаты тау-белка. Два из таких положительных в отношении агрегации (агрегаты[+]) стабильных субклонов, названных 7В10С3-В2 и DC11-В6, были отобраны для размножения в культуре и использовались для скрининга.

[00467] После двух недель культивирования мы выделили и секвенировали с помощью секвенирования нового поколения (СНП) истощенные/обогащенные единые гидовые РНК (егРНК) в клетках FRET[-], исходя из гипотезы о том, что егРНК, которые вызывают потерю агрегации тау-белка посредством нарушения их специфических целевых молекул, будут обогащенными в популяции FRET[-]. Популяция клеток FRET[-] преимущественно состояла из клеток без агрегатов. Тем не менее мы наблюдали некоторые клетки FRET[-], в которых были видны вкрапления, состоящие из крошечных агрегатов, которых было недостаточно для излучения FRET и, следовательно, которые не распознаются методом FACS KaKFRET[+].

[00468] Чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов в популяции FRET[-] и минимизировать число положительных в отношении вкраплений клеток, наблюдаемых преимущественно в фазе G1 после митоза (см. фиг. 28), мы синхронизировали прохождение клетками клеточного цикла с помощью двойного тимидинового блока ингибитора синтеза ДНК (см. фиг. 29). Это новое применение данного метода синхронизации позволило нам получить популяцию клеток, преимущественно обогащенную клетками в S-фазе, и, таким образом, синхронизировать накопление агрегатов после митоза.

[00469] Для каждой библиотеки (две библиотеки CRISPRn и одна библиотека CRISPRa) выполняли по пять повторных скринингов. В каждом повторном эксперименте образцы биосенсорных клеток 7В10С3-В2 и DC11-B6 собирали на 7-е и на 10-е сутки после трансдукции упакованных в лентивирусы библиотек CRISPR. На 12-е сутки клетки выращивали в культуре в присутствии тимидина в течение 21 часа. После удаления первого тимидинового блока (13-е сутки) клетки промывали и выращивали в культуре со свежей средой в течение 8 часов, чтобы высвободить клетки из блока, и снова инкубировали их с тимидином для второго блока. В результате данной синхронизации клетки синхронно проходят через G2 и митотическую фазу и останавливаются в начале S-фазы. На 14-е сутки клетки высвобождали из второго тимидинового блока и выращивали в культуре со свежей средой в течение 3 часов, чтобы позволить им синхронно проходить фазу G2. Выполняли FACS для разделения и сбора популяций FRET[-] и FRET[+]. См. фиг. 27.

[00470] Собирали геномную ДНК из каждого образца и амплифицировали репертуар егРНК из каждого образца с помощью ПЦР. Всего было 60 образцов: 5 повторных скринингов * 3 библиотеки * 4 образца для каждого условия (FRET[-] на 7-е сутки, на 10-е сутки, на 14-е сутки и FRET[+] на 14-е сутки).

[00471] Анализ данных и статистический анализ отражают подход, использованный в примере 2, поэтому соответствующие подробности из примера 2 в данном примере не повторяются. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[-] на 14-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 14-е сутки, на 7-е сутки и на 10-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[+] на 14-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 14-е сутки, на 7-е сутки и на 10-е сутки, указывают на целевые гены, которые при их нарушении (или при активации их транскрипции, в случае скрининга CRISPRa) могут способствовать дезагрегации тау-белка. Эти попадания в егРНК представляют собой особый интерес как потенциальные мишени для терапевтического вмешательства. егРНК, которые обогащены в клетках FRET[+] на 14-е сутки по сравнению с клетками FRET[-] на 14-е сутки, на 7-е сутки и на 10-е сутки, и (или) истощены в клетках FRET[-] на 14-е сутки по сравнению с клетками FRET[+] на 14-е сутки, на 7-е сутки и на 10-е сутки, могут указывать на целевые гены, которые при их нарушении (или при активации их транскрипции, в случае скрининга CRISPRa) способствуют агрегации тау-белка или усиливают агрегацию тау-белка.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> СКРИНИНГОВАЯ ПЛАТФОРМА CRISPR/CAS ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОДИФИКАТОРОВ ЗАСЕВА ИЛИ АГРЕГАЦИИ ТАУ-БЕЛКА

<130> 057766-544635

<150> US 62/820,086

<151> 2019-03-18

<160> 43

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 1

Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys

1 5 10 15

Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 2

Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys

1 5 10 15

Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 3

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 3

Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys

1 5 10 15

Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

20 25 30

<210> 4

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 4

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

1 5 10 15

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

20 25 30

<210> 5

<211> 93

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 5

cagacagccc ccgtgcccat gccagacctg aagaatgtca agtccaagat cggctccact 60

gagaacctga agcaccagcc gggaggcggg aag 93

<210> 6

<211> 93

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 6

gtgcagataa ttaataagaa gctggatctt agcaacgtcc agtccaagtg tggctcaaag 60

gataatatca aacacgtccc gggaggcggc agt 93

<210> 7

<211> 93

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 7

gtgcaaatag tctacaaacc agttgacctg agcaaggtga cctccaagtg tggctcatta 60

ggcaacatcc atcataaacc aggaggtggc cag 93

<210> 8

<211> 96

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 8

gtggaagtaa aatctgagaa gcttgacttc aaggacagag tccagtcgaa gattgggtcc 60

ctggacaata tcacccacgt ccctggcgga ggaaat 96

<210> 9

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 9

Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser

1 5 10 15

Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys

20 25 30

Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys

35 40 45

Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val

50 55 60

Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys

65 70 75 80

Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu

85 90 95

Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile

100 105 110

Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys

115 120 125

Ile Glu Thr His Lys

130

<210> 10

<211> 399

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 10

ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60

actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120

gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtcccggga 180

ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240

ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300

aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360

gtccctggcg gaggaaataa aaagattgaa acccacaag 399

<210> 11

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 11

Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser

1 5 10 15

Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys

20 25 30

Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys

35 40 45

Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ser Gly Gly Gly Ser Val

50 55 60

Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys

65 70 75 80

Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu

85 90 95

Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile

100 105 110

Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys

115 120 125

Ile Glu Thr His Lys

130

<210> 12

<211> 399

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 12

ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60

actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120

gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtctcggga 180

ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240

ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300

aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360

gtccctggcg gaggaaataa aaagattgaa acccacaag 399

<210> 13

<211> 238

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 13

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 14

<211> 714

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 14

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctgggg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacatcag ccacaacgtc tatatcaccg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714

<210> 15

<211> 236

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 15

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu

225 230 235

<210> 16

<211> 708

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 16

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccacct tcggctacgg cctgcagtgc ttcgcccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagctacc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctg 708

<210> 17

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 17

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcu 77

<210> 18

<211> 82

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 18

guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gc 82

<210> 19

<211> 76

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 19

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

<210> 20

<211> 86

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 20

guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 86

<210> 21

<211> 1392

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1)..(1384)

<223> Cas9

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1385)..(1392)

<223> FLAG

<400> 21

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys

1370 1375 1380

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1385 1390

<210> 22

<211> 4176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1)..(4152)

<223> Cas9

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (4153)..(4176)

<223> FLAG

<400> 22

atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctac tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgacaagcga cctgccgcca caaagaaggc tggacaggct 4140

aagaagaaga aagattacaa agacgatgac gataag 4176

<210> 23

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 23

guuuuagagc uaugcu 16

<210> 24

<211> 67

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 24

agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60

gugcuuu 67

<210> 25

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (2)..(21)

<223> n = A, T, C или G

<400> 25

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 26

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1)..(21)

<223> n = A, T, C или G

<400> 26

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 27

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (3)..(23)

<223> n = A, T, C или G

<400> 27

ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngg 25

<210> 28

<211> 72

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 28

aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60

gucggugcuu uu 72

<210> 29

<211> 82

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 29

guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gc 82

<210> 30

<211> 83

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 30

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 83

<210> 31

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 31

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu 80

<210> 32

<211> 92

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 32

guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 92

<210> 33

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 33

ggccaacaug aggaucaccc augucugcag ggcc 34

<210> 34

<211> 137

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 34

guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc agggccuagc aaguuaaaau 60

aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac ccaugucugc agggccaagu 120

ggcaccgagu cggugcu 137

<210> 35

<211> 157

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1)..(20)

<223> n представляет собой a, c, g или u

<400> 35

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60

agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120

ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcu 157

<210> 36

<211> 1471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1)..(1384)

<223> dCas9

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1405)..(1409)

<223> NLS

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1410)..(1471)

<223> VP64

<400> 36

Met Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys

1 5 10 15

Lys Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

20 25 30

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

35 40 45

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

50 55 60

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

65 70 75 80

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

85 90 95

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

100 105 110

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

115 120 125

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

130 135 140

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

145 150 155 160

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

165 170 175

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

180 185 190

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

195 200 205

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

210 215 220

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

245 250 255

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

260 265 270

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

275 280 285

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

290 295 300

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

305 310 315 320

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

325 330 335

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

355 360 365

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

370 375 380

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

385 390 395 400

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

405 410 415

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

420 425 430

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

435 440 445

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

450 455 460

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

465 470 475 480

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

485 490 495

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

500 505 510

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

515 520 525

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

530 535 540

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

545 550 555 560

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

565 570 575

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

580 585 590

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

595 600 605

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

610 615 620

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

625 630 635 640

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

645 650 655

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

660 665 670

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

675 680 685

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

690 695 700

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

705 710 715 720

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

725 730 735

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

740 745 750

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

755 760 765

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

770 775 780

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

785 790 795 800

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

805 810 815

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

820 825 830

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

835 840 845

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

850 855 860

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg

865 870 875 880

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

885 890 895

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

900 905 910

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

915 920 925

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

930 935 940

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

945 950 955 960

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

965 970 975

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

980 985 990

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

995 1000 1005

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu

1010 1015 1020

Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile

1025 1030 1035

Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe

1040 1045 1050

Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu

1055 1060 1065

Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly

1070 1075 1080

Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr

1085 1090 1095

Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys

1100 1105 1110

Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro

1115 1120 1125

Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp

1130 1135 1140

Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser

1145 1150 1155

Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu

1160 1165 1170

Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser

1175 1180 1185

Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr

1190 1195 1200

Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser

1205 1210 1215

Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1220 1225 1230

Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1235 1240 1245

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly

1250 1255 1260

Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His

1265 1270 1275

Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser

1280 1285 1290

Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser

1295 1300 1305

Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu

1310 1315 1320

Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala

1325 1330 1335

Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr

1340 1345 1350

Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile

1355 1360 1365

Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly

1370 1375 1380

Asp Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1385 1390 1395

Gly Gly Ser Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Gly

1400 1405 1410

Ser Gly Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu

1415 1420 1425

Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

1430 1435 1440

Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala

1445 1450 1455

Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ile Asn Cys Thr

1460 1465 1470

<210> 37

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (1)..(130)

<223> MCP

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (151)..(155)

<223> NLS

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (161)..(341)

<223> P65

<220>

<221> ЗНАЧЕНИЕ_ОТСУТСТВУЕТ

<222> (350)..(473)

<223> HSF1

<400> 37

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu

20 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser

35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu

50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val

65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe

85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu

100 105 110

Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly

115 120 125

Ile Tyr Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Gly Ser

145 150 155 160

Pro Ser Gly Gln Ile Ser Asn Gln Ala Leu Ala Leu Ala Pro Ser Ser

165 170 175

Ala Pro Val Leu Ala Gln Thr Met Val Pro Ser Ser Ala Met Val Pro

180 185 190

Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro

195 200 205

Gln Ser Leu Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Thr Gln Ala Gly Glu Gly

210 215 220

Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Phe Asp Ala Asp Glu Asp

225 230 235 240

Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Gly Val Phe Thr Asp

245 250 255

Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly

260 265 270

Val Ser Met Ser His Ser Thr Ala Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro

275 280 285

Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg Pro Pro Asp Pro

290 295 300

Ala Pro Thr Pro Leu Gly Thr Ser Gly Leu Pro Asn Gly Leu Ser Gly

305 310 315 320

Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu

325 330 335

Ser Gln Ile Ser Ser Ser Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Phe Ser

340 345 350

Val Asp Thr Ser Ala Leu Leu Asp Leu Phe Ser Pro Ser Val Thr Val

355 360 365

Pro Asp Met Ser Leu Pro Asp Leu Asp Ser Ser Leu Ala Ser Ile Gln

370 375 380

Glu Leu Leu Ser Pro Gln Glu Pro Pro Arg Pro Pro Glu Ala Glu Asn

385 390 395 400

Ser Ser Pro Asp Ser Gly Lys Gln Leu Val His Tyr Thr Ala Gln Pro

405 410 415

Leu Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser Val Asp Thr Gly Ser Asn Asp Leu

420 425 430

Pro Val Leu Phe Glu Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Phe Ser Glu Gly Asp

435 440 445

Gly Phe Ala Glu Asp Pro Thr Ile Ser Leu Leu Thr Gly Ser Glu Pro

450 455 460

Pro Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val Ser

465 470

<210> 38

<211> 4413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1)..(4152)

<223> dCas9

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (4213)..(4227)

<223> NLS

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (4228)..(4413)

<223> VP64

<400> 38

atgaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa ggacaagaag 60

tacagcatcg gcctggccat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120

tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 180

aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240

aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300

atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360

ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 420

gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480

agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 540

cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600

ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660

ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat 720

ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780

agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840

cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900

cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 960

atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 1020

tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080

gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 1140

ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200

ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 1260

ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 1320

cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380

accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 1440

atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500

ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 1560

gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 1620

accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680

aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg 1740

aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800

gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860

gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920

ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 1980

gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2040

aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100

tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 2160

aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 2220

gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280

gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 2340

agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 2400

gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460

cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 2520

gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccacat cgtgcctcag 2580

agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caaggcccgg 2640

ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 2700

cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 2760

agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 2820

cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880

gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940

gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 3000

cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060

gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120

agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180

tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240

acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300

aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360

ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420

gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480

gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540

gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600

aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660

gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720

gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780

ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 3840

tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900

gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 3960

caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020

aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080

gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgtctcag 4140

ctgggaggcg acagcgctgg aggaggtgga agcggaggag gaggaagcgg aggaggaggt 4200

agcggaccta agaaaaagag gaaggtggcg gccgctggat ccggacgggc tgacgcattg 4260

gacgattttg atctggatat gctgggaagt gacgccctcg atgattttga ccttgacatg 4320

cttggttcgg atgcccttga tgactttgac ctcgacatgc tcggcagtga cgcccttgat 4380

gatttcgacc tggacatgct gattaactgt aca 4413

<210> 39

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1)..(390)

<223> MCP

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (451)..(465)

<223> NLS

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (481)..(1023)

<223> P65

<220>

<221> значение_отсутствует

<222> (1048)..(1419)

<223> HSF1

<400> 39

atggcttcaa actttactca gttcgtgctc gtggacaatg gtgggacagg ggatgtgaca 60

gtggctcctt ctaatttcgc taatggggtg gcagagtgga tcagctccaa ctcacggagc 120

caggcctaca aggtgacatg cagcgtcagg cagtctagtg cccagaagag aaagtatacc 180

atcaaggtgg aggtccccaa agtggctacc cagacagtgg gcggagtcga actgcctgtc 240

gccgcttgga ggtcctacct gaacatggag ctcactatcc caattttcgc taccaattct 300

gactgtgaac tcatcgtgaa ggcaatgcag gggctcctca aagacggtaa tcctatccct 360

tccgccatcg ccgctaactc aggtatctac agcgctggag gaggtggaag cggaggagga 420

ggaagcggag gaggaggtag cggacctaag aaaaagagga aggtggcggc cgctggatcc 480

ccttcagggc agatcagcaa ccaggccctg gctctggccc ctagctccgc tccagtgctg 540

gcccagacta tggtgccctc tagtgctatg gtgcctctgg cccagccacc tgctccagcc 600

cctgtgctga ccccaggacc accccagtca ctgagcgctc cagtgcccaa gtctacacag 660

gccggcgagg ggactctgag tgaagctctg ctgcacctgc agttcgacgc tgatgaggac 720

ctgggagctc tgctggggaa cagcaccgat cccggagtgt tcacagatct ggcctccgtg 780

gacaactctg agtttcagca gctgctgaat cagggcgtgt ccatgtctca tagtacagcc 840

gaaccaatgc tgatggagta ccccgaagcc attacccggc tggtgaccgg cagccagcgg 900

ccccccgacc ccgctccaac tcccctggga accagcggcc tgcctaatgg gctgtccgga 960

gatgaagact tctcaagcat cgctgatatg gactttagtg ccctgctgtc acagatttcc 1020

tctagtgggc agggaggagg tggaagcggc ttcagcgtgg acaccagtgc cctgctggac 1080

ctgttcagcc cctcggtgac cgtgcccgac atgagcctgc ctgaccttga cagcagcctg 1140

gccagtatcc aagagctcct gtctccccag gagcccccca ggcctcccga ggcagagaac 1200

agcagcccgg attcagggaa gcagctggtg cactacacag cgcagccgct gttcctgctg 1260

gaccccggct ccgtggacac cgggagcaac gacctgccgg tgctgtttga gctgggagag 1320

ggctcctact tctccgaagg ggacggcttc gccgaggacc ccaccatctc cctgctgaca 1380

ggctcggagc ctcccaaagc caaggacccc actgtctcc 1419

<210> 40

<211> 130

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 40

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu

20 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser

35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu

50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val

65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe

85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu

100 105 110

Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly

115 120 125

Ile Tyr

130

<210> 41

<211> 390

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 41

atggcttcaa actttactca gttcgtgctc gtggacaatg gtgggacagg ggatgtgaca 60

gtggctcctt ctaatttcgc taatggggtg gcagagtgga tcagctccaa ctcacggagc 120

caggcctaca aggtgacatg cagcgtcagg cagtctagtg cccagaagag aaagtatacc 180

atcaaggtgg aggtccccaa agtggctacc cagacagtgg gcggagtcga actgcctgtc 240

gccgcttgga ggtcctacct gaacatggag ctcactatcc caattttcgc taccaattct 300

gactgtgaac tcatcgtgaa ggcaatgcag gggctcctca aagacggtaa tcctatccct 360

tccgccatcg ccgctaactc aggtatctac 390

<210> 42

<211> 6673

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 42

gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg 60

tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg 120

tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg 180

ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg 240

gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca 300

cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt 360

cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 420

gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 480

agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata 540

gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg 600

gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 660

caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 720

cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 780

gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc 840

gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 900

ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 960

cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 1020

cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 1080

tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 1140

aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gacgtacggc caccatgaaa aggccggcgg 1200

ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga aaaaggacaa gaagtacagc atcggcctgg 1260

ccatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgcccagca 1320

agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac ctgatcggag 1380

ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga accgccagaa 1440

gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc agcaacgaga 1500

tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg 1560

ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg 1620

agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggccg 1680

acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc cacttcctga 1740

tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc 1800

agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg gacgccaagg 1860

ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc gcccagctgc 1920

ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggca acctgattgc cctgagcctg ggcctgaccc 1980

ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg agcaaggaca 2040

cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctgt 2100

ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg agagtgaaca 2160

ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac gagcaccacc 2220

aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag tacaaagaga 2280

ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga gccagccagg 2340

aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc gaggaactgc 2400

tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac aacggcagca 2460

tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag gaagattttt 2520

acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc cgcatcccct 2580

actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc agaaagagcg 2640

aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct tccgcccaga 2700

gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag gtgctgccca 2760

agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa gtgaaatacg 2820

tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag gccatcgtgg 2880

acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag gactacttca 2940

agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg ttcaacgcct 3000

ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc ctggacaatg 3060

aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt gaggacagag 3120

agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa gtgatgaagc 3180

agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg atcaacggca 3240

tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac ggcttcgcca 3300

acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag gacatccaga 3360

aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat ctggccggca 3420

gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag ctcgtgaaag 3480

tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag aaccagacca 3540

cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag ggcatcaaag 3600

agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg cagaacgaga 3660

agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag gaactggaca 3720

tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc acatcgtgcc tcagagcttt ctgaaggacg 3780

actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaaggc ccggggcaag agcgacaacg 3840

tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg ctgaacgcca 3900

agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc ggcctgagcg 3960

aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag atcacaaagc 4020

acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat gacaagctga 4080

tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc cggaaggatt 4140

tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac gcctacctga 4200

acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc gagttcgtgt 4260

acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag caggaaatcg 4320

gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc aagaccgaga 4380

ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac ggcgaaaccg 4440

gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg ctgagcatgc 4500

cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc aaagagtcta 4560

tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg gaccctaaga 4620

agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg gccaaagtgg 4680

aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc accatcatgg 4740

aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc tacaaagaag 4800

tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg gaaaacggcc 4860

ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg gccctgccct 4920

ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag ggctcccccg 4980

aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg gacgagatca 5040

tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat ctggacaaag 5100

tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc gagaatatca 5160

tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac tttgacacca 5220

ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct ggacgccacc ctgatccacc 5280

agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga ggcgacagcg 5340

ctggaggagg tggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggtagcgga cctaagaaaa 5400

agaggaaggt ggcggccgct ggatccggac gggctgacgc attggacgat tttgatctgg 5460

atatgctggg aagtgacgcc ctcgatgatt ttgaccttga catgcttggt tcggatgccc 5520

ttgatgactt tgacctcgac atgctcggca gtgacgccct tgatgatttc gacctggaca 5580

tgctgattaa ctgtacaggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg 5640

tcgaggagaa tcctggccca atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg 5700

aaagagcaac ggctacaatc aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg 5760

cagctctctc tagcgacggc cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg 5820

gaccttgtgc agaactcgtg gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga 5880

cttgtatcgt cgcgatcgga aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc 5940

gacaggtgct tctcgatctg catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac 6000

agccgacggc agttgggatt cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaag 6060

aattcgatat caagcttatc ggtaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 6120

ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 6180

tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 6240

tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 6300

tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 6360

ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 6420

gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 6480

catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 6540

tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 6600

ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 6660

ccgcctcccc gca 6673

<210> 43

<211> 4324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 43

gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg 60

tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg 120

tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg 180

ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg 240

gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca 300

cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt 360

cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 420

gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 480

agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata 540

gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg 600

gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 660

caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 720

cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 780

gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc 840

gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 900

ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 960

cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 1020

cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 1080

tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 1140

aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gacgtacggc caccatggct tcaaacttta 1200

ctcagttcgt gctcgtggac aatggtggga caggggatgt gacagtggct ccttctaatt 1260

tcgctaatgg ggtggcagag tggatcagct ccaactcacg gagccaggcc tacaaggtga 1320

catgcagcgt caggcagtct agtgcccaga agagaaagta taccatcaag gtggaggtcc 1380

ccaaagtggc tacccagaca gtgggcggag tcgaactgcc tgtcgccgct tggaggtcct 1440

acctgaacat ggagctcact atcccaattt tcgctaccaa ttctgactgt gaactcatcg 1500

tgaaggcaat gcaggggctc ctcaaagacg gtaatcctat cccttccgcc atcgccgcta 1560

actcaggtat ctacagcgct ggaggaggtg gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag 1620

gtagcggacc taagaaaaag aggaaggtgg cggccgctgg atccccttca gggcagatca 1680

gcaaccaggc cctggctctg gcccctagct ccgctccagt gctggcccag actatggtgc 1740

cctctagtgc tatggtgcct ctggcccagc cacctgctcc agcccctgtg ctgaccccag 1800

gaccacccca gtcactgagc gctccagtgc ccaagtctac acaggccggc gaggggactc 1860

tgagtgaagc tctgctgcac ctgcagttcg acgctgatga ggacctggga gctctgctgg 1920

ggaacagcac cgatcccgga gtgttcacag atctggcctc cgtggacaac tctgagtttc 1980

agcagctgct gaatcagggc gtgtccatgt ctcatagtac agccgaacca atgctgatgg 2040

agtaccccga agccattacc cggctggtga ccggcagcca gcggcccccc gaccccgctc 2100

caactcccct gggaaccagc ggcctgccta atgggctgtc cggagatgaa gacttctcaa 2160

gcatcgctga tatggacttt agtgccctgc tgtcacagat ttcctctagt gggcagggag 2220

gaggtggaag cggcttcagc gtggacacca gtgccctgct ggacctgttc agcccctcgg 2280

tgaccgtgcc cgacatgagc ctgcctgacc ttgacagcag cctggccagt atccaagagc 2340

tcctgtctcc ccaggagccc cccaggcctc ccgaggcaga gaacagcagc ccggattcag 2400

ggaagcagct ggtgcactac acagcgcagc cgctgttcct gctggacccc ggctccgtgg 2460

acaccgggag caacgacctg ccggtgctgt ttgagctggg agagggctcc tacttctccg 2520

aaggggacgg cttcgccgag gaccccacca tctccctgct gacaggctcg gagcctccca 2580

aagccaagga ccccactgtc tcctgtacag gcagtggaga gggcagagga agtctgctaa 2640

catgcggtga cgtcgaggag aatcctggcc caaccatgaa aaagcctgaa ctcaccgcta 2700

cctctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct 2760

ccgagggcga agaatctcgg gctttcagct tcgatgtggg agggcgtgga tatgtcctgc 2820

gggtgaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgcta tgtttatcgg cactttgcat 2880

ccgccgctct ccctattccc gaagtgcttg acattgggga gttcagcgag agcctgacct 2940

attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca ccttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc 3000

ccgctgttct ccagcccgtc gccgaggcca tggatgccat cgctgccgcc gatcttagcc 3060

agaccagcgg gttcggccca ttcggacctc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgcg 3120

atttcatctg cgctattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca 3180

ccgtcagtgc ctccgtcgcc caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc 3240

ccgaagtccg gcacctcgtg cacgccgatt tcggctccaa caatgtcctg accgacaatg 3300

gccgcataac agccgtcatt gactggagcg aggccatgtt cggggattcc caatacgagg 3360

tcgccaacat cttcttctgg aggccctggt tggcttgtat ggagcagcag acccgctact 3420

tcgagcggag gcatcccgag cttgcaggat ctcctcggct ccgggcttat atgctccgca 3480

ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg 3540

ctcagggtcg ctgcgacgca atcgtccggt ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa 3600

tcgcccgcag aagcgctgcc gtctggaccg atggctgtgt ggaagtgctc gccgatagtg 3660

gaaacagacg ccccagcact cgtcctaggg caaaggatct gcagtaatga gaattcgata 3720

tcaagcttat cggtaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 3780

ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 3840

ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 3900

tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 3960

acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 4020

ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 4080

caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 4140

ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 4200

tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 4260

ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 4320

cgca 4324

<---

Claims

1. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером,

где указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих, и

где первый репортер и второй репортер представляют собой флуоресцентные белки, и при этом первый репортер и второй репортер представляют собой пару с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET);

(b) введение в указанную популяцию клеток библиотеки, содержащей множество гидовых РНК, которые нацелены на множество генов;

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности редактирования генома и увеличения числа клеток, при этом указанное множество гидовых РНК образует комплексы с указанным белком Cas, а указанный белок Cas расщепляет указанное множество генов, что приводит к нокауту генной функции с образованием генетически модифицированной популяции клеток;

(d) приведение указанной генетически модифицированной популяции клеток в контакт с агентом засева тау-белка для получения засеянной популяции клеток,

где приведение в контакт включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в присутствии агента засева тау-белка, где агент засева тау-белка содержит кондиционированную среду, собранную от культивируемых клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в которых содержащий повторы домен тау-белка стабильно присутствует в агрегированном состоянии, где кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение от 1 суток до 7 суток;

(e) культивирование указанной засеянной популяции клеток для обеспечения возможности образования агрегатов тау-белка, при этом агрегаты первого содержащего повторы домена тау-белка и второго содержащего повторы домена тау-белка образуются в субпопуляции указанной засеянной популяции клеток с образованием положительной в отношении агрегации популяции клеток; и

(f) определение содержания каждой из указанного множества гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной генетически модифицированной популяцией клеток из стадии (с),

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9, необязательно, где указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes, необязательно, где указанный белок Cas содержит SEQ ID NO: 21, и необязательно, где указанный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток, или где нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белок Cas, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный экзон, необязательно, где

каждая гидовая РНК нацелена на конститутивный 5'-экзон, или

где каждая гидовая РНК нацелена на первый экзон, на второй экзон или на третий экзон.

5. Способ скрининга в отношении генетических модификаторов агрегации тау-белка, включающий в себя:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащих химерный белок Cas, который содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, химерный адаптерный белок, который содержит адаптерный белок, слитый с одним или большим числом доменов активации транскрипции, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером,

(c) культивирование указанной популяции клеток для обеспечения возможности активации транскрипции и увеличения числа клеток, при этом указанное множество гидовых РНК образует комплексы с указанным химерным белком Cas и указанным химерным адаптерным белком, и указанные комплексы активируют транскрипцию указанного множества генов, что приводит к повышенной экспрессии генов с образованием генетически модифицированной популяции клеток;

при этом обогащение гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, идентифицированной на стадии (е), по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с), указывает на то, что ген, на который нацелена указанная гидовая РНК, является генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом активация транскрипции гена, на который нацелена указанная гидовая РНК, усиливает агрегацию тау-белка.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9, необязательно,

где указанный белок Cas представляет собой белок Cas9 из Streptococcus pyogenes, и

где указанный химерный белок Cas содержит белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, слитый с доменом активации транскрипции VP64, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный белок Cas содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью; сигнал ядерной локализации; и домен активатора транскрипции VP64, необязательно, где указанный химерный белок Cas содержит SEQ ID NO: 36, и необязательно, где указанный химерный белок Cas кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 38, где

указанный адаптерный белок представляет собой белок оболочки MS2, и отличающийся тем, что указанные один или большее число доменов активации транскрипции в указанном химерном адаптерном белке содержат домен активации транскрипции р65 и домен активации транскрипции HSF1, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок содержит, в направлении от N-конца до С-конца: белок оболочки MS2; сигнал ядерной локализации; домен активации транскрипции р65; и домен активации транскрипции HSF1, и необязательно, где указанный химерный адаптерный белок содержит SEQ ID NO: 37, необязательно отличающийся тем, что указанный химерный адаптерный белок кодируется кодирующей последовательностью, содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 39.

7. Способ по любому из пп. 5 или 6, отличающийся тем, что указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, стабильно экспрессируются в популяции клеток, или

где нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные химерный белок Cas, химерный адаптерный белок, первый содержащий повторы домен тау-белка, связанный с первым репортером, и второй содержащий повторы домен тау-белка, связанный со вторым репортером, геномно интегрированы в популяцию клеток.

8. Способ по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что каждая гидовая РНК нацелена на целевую последовательность для гидовой РНК в пределах 200 п.о. в направлении к 5' от сайта начала транскрипции, и

где каждая гидовая РНК содержит один или большее число адаптер-связывающих элементов, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом каждая гидовая РНК содержит два адаптер-связывающих элемента, с которыми может специфически связываться указанный химерный адаптерный белок, необязательно при этом первый адаптер-связывающий элемент находится внутри первой петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, а второй адаптер-связывающий элемент находится внутри второй петли каждой из одной или большего числа гидовых РНК, необязательно при этом указанный адаптер-связывающий элемент содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и

необязательно при этом указанная каждая из одной или большего числа гидовых РНК представляет собой единую гидовую РНК, содержащую часть CRISPR-РНК (крРНК), слитую с частью трансактивирующей CRISPR-PHK (тракрРНК), и указанная первая петля представляет собой тетрапетлю, соответствующую остаткам 13-16 из SEQ ID NO: 17, а указанная вторая петля представляет собой шпильку 2, соответствующую остаткам 53-56 из SEQ ID NO: 17.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) имеет продолжительность от около 3 суток до около 9 суток, необязательно, где стадия (с) имеет продолжительность около 6 суток.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная кондиционированная среда была собрана после нахождения в культуре конфлюентных клеток, положительных в отношении агрегации тау-белка, в течение около 4 суток.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (d) включает в себя культивирование указанной генетически модифицированной популяции клеток в смеси, состоящей на около 75% из кондиционированной среды и на около 25% из свежей среды.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанную генетически модифицированную популяцию клеток не культивируют совместно с указанными клетками, положительными в отношении агрегации тау-белка.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (е) имеет продолжительность от около 2 суток до около 6 суток, необязательно, где стадия (е) имеет продолжительность около 4 суток.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание каждой из множества гидовых РНК определяется с помощью секвенирования нового поколения.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гидовая РНК считается обогащенной, если содержание указанной гидовой РНК по отношению к общей популяции указанного множества гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с).

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (f) включает в себя определение содержания каждой из указанного множества гидовых РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) в первый момент времени на стадии (с) и/или во второй момент времени на стадии (с), необязательно, где указанный первый момент времени на стадии (с) представляет собой первый пассаж при культивировании популяции клеток, а указанный второй момент времени представляет собой середину периода культивирования популяции клеток, чтобы обеспечить возможность редактирования генома и увеличения числа клеток или активации транскрипции и увеличения числа клеток, и необязательно, где указанный первый момент времени на стадии (с) наступает после около трех суток культивирования, а указанный второй момент времени на стадии (с) наступает после около шести суток культивирования.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что ген считается генетическим модификатором агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции указанного гена усиливает агрегацию тау-белка, если:

(1) содержание гидовой РНК, нацеленной на указанный ген, по отношению к общей популяции указанного множества гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) как в первый момент времени на стадии (с), так и во второй момент времени на стадии (с); и/или

(2) содержание по меньшей мере двух гидовых РНК, нацеленных на указанный ген, по отношению к общей популяции указанного множества гидовых РНК по меньшей мере в 1,5 раза выше в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток из стадии (е) по сравнению с указанной культивируемой популяцией клеток из стадии (с) либо в первый момент времени на стадии (с), либо во второй момент времени на стадии (с).

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии (f) предпринимаются следующие шаги для идентификации гена как генетического модификатора агрегации тау-белка, при этом нарушение или активация транскрипции указанного гена усиливает агрегацию тау-белка:

(1) идентификация того, какие из указанного множества гидовых РНК присутствуют в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е);

(2) вычисление вероятности случайного присутствия указанных гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1), с использованием формулы: nCn' *(x-n')C(m-n) / xCm,

где х представляет собой разнообразие гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b),

где m представляет собой разнообразие гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1),

где n представляет собой разнообразие гидовых РНК, введенных в популяцию клеток на стадии (b), которые нацелены на указанный ген, и

где n' представляет собой разнообразие гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f)(1), которые нацелены на указанный ген;

(3) вычисление средних оценок обогащения для гидовых РНК, идентифицированных на стадии (f) (1),

при этом указанная оценка обогащения для гидовой РНК представляет собой относительное содержание указанной гидовой РНК в указанной положительной в отношении агрегации популяции клеток, полученной на стадии (е), деленное на относительное содержание указанной гидовой РНК в указанной культивируемой популяции клеток из стадии (с), и

при этом указанное относительное содержание представляет собой количество считываний указанной гидовой РНК, деленное на количество считываний всей популяции указанного множества гидовых РНК; и

(4) выбор данного гена, если гидовая РНК, нацеленная на данный ген, значительно ниже вероятности случайного присутствия и выше пороговой оценки обогащения.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и/или указанный второй содержащий повторы домен тау-белка представляют собой содержащий повторы домен тау-белка человека, и/или

где указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и/или указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию, способствующую агрегации, необязательно,

где указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и/или указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат мутацию тау-белка P301S;и/или

где указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и/или указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат домен тау-белка с четырьмя повторами; и/или

где указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и/или указанный второй содержащий повторы домен тау-белка содержат SEQ ID NO: 11; и/или

где указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый содержащий повторы домен тау-белка и указанный второй содержащий повторы домен тау-белка являются одинаковыми, и каждый из них содержит домен тау-белка с четырьмя повторами, содержащий мутацию тау-белка P301S.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный первый репортер представляет собой голубой флуоресцентный белок (CFP), а указанный второй репортер представляет собой желтый флуоресцентный белок (YFP).

22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанные клетки представляют собой клетки человека, необязательно, где указанные клетки представляют собой клетки HEK293T.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество гидовых РНК вводят в концентрации, выбранной таким образом, чтобы большинство клеток получали только по одной из гидовых РНК.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество гидовых РНК нацелено на 100 или большее число генов, 1000 или большее число генов, или 10000 или большее число генов, или где указанная библиотека является полногеномной библиотекой.

25. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нацеливание происходит в среднем на множество целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов, необязательно, где

нацеливание происходит в среднем на по меньшей мере три целевых последовательности в каждом из целевого множества генов, необязательно,

где нацеливание происходит в среднем на от около трех до около шести целевых последовательностей в каждом из целевого множества генов.

26. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью вирусной трансдукции, необязательно, где

каждое из указанного множества гидовых РНК находится в отдельном вирусном векторе, необязательно,

где указанное множество гидовых РНК вводят в популяцию клеток с помощью лентивирусной трансдукции, и необязательно,

где указанная популяция клеток инфицирована с показателем множественности заражения, составляющим меньше чем около 0,3.

27. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное множество гидовых РНК вводят в указанную популяцию клеток вместе с маркером отбора, и стадия (b) дополнительно включает в себя отбор клеток, которые содержат маркер отбора, необязательно,

где указанный маркер отбора придает устойчивость к лекарственному средству, необязательно отличающийся тем, что указанный маркер отбора придает устойчивость к пуромицину или зеоцину, и необязательно,

где указанный маркер отбора выбран из неомицинфосфотрансферазы, гигромицин-В-фосфотрансферазы, пуромицин-N-ацетилтрансферазы и бластицидин-S-дезаминазы.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, в которую на стадии (b) вводят указанное множество гидовых РНК, включает в себя больше чем около 300 клеток на гидовую РНК.