JP2018522249A - Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価 - Google Patents

Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価 Download PDF

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Abstract

本明細書では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を評価、選択、最適化、および設計する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１５２，４７３号明細書の優先権を主張する。
本発明は、Ｃａｓ９分子／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子複合体の評価、選択、および設計に関する。
Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の直接送達は、細胞内のＣａｓ９タンパク質の迅速な代謝回転のおかげで、オフターゲット活性を最小化しながら効率的な遺伝子編集を可能にする。遺伝子編集は、生体外転写されたまたは化学的に合成されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成する、精製Ｃａｓ９タンパク質のカチオン性脂質送達によって、様々な哺乳類細胞において達成され得る。ＲＮＰ送達によって媒介される遺伝子編集の効率は、遺伝子座によって変動し、ｇＲＮＡの長さ、ならびに送達されるＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡの量および比率に左右される。ＲＮＰ複合体の二成分性質を考慮すると、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡとの間の完全かつ生産的な複合体形成を得るための正確な条件が必要である。タンパク質およびＲＮＡの量は、例えば、ブラッドフォード色素結合アッセイなどの色素結合アッセイ、またはＲｉｂｏＱｕａｎｔ ＲＮＡアッセイによって定量化できるものの、これらの技術は、遺伝子編集活性に必要な生産的ＲＮＰ複合体の定量化を提供しない。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の構造的および生物物理学的特性決定により、大きな接触面積および高い親和性が明らかにされた。熱溶融曲線は、タンパク質−リガンド複合体の安定性および結合を特徴付けるのに有用な特性である。示差走査熱量計（ＤＳＦ）は、例えばＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅなどの小分子染料の蛍光の変化を用いて、タンパク質の熱変性をモニターし、その熱融解温度（）を判定する、生物物理学的技術である。タンパク質へのリガンドの結合は、タンパク質を異なる程度に安定化して、そのＴｍを変化させる傾向がある。異なるリガンド濃度でタンパク質のＴｍを測定することで、そのリガンドに対するタンパク質の親和性の測定ができるようになる。幅広い熱融解シグネチャを用いて、信号対雑音比の高い高ハイスループットで、ＲＮＰ複合体の品質が迅速にアッセイされ得る。
したがって、それを用いて、例えば、ＲＮＰ媒介遺伝子編集の必要条件である生産的複合体形成を定量化するなど、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の質を評価し得る、ＤＳＦなどのアッセイを開発する必要性が依然として存在する。
本明細書では、（ａ）Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を各サンプルが含んでなる、複数のサンプルを作製するステップと；（ｂ）複数のサンプルのそれぞれにおけるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；（ｃ）（ｉ）複数のサンプルにおけるＴｍ値と、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値との、または所定の閾値Ｔｍ値との比較、または（ｉｉ）複数のサンプルのＴｍ値の相対的な順序付けの１つまたは複数に基づいて、複数のサンプルから少なくとも１つのサンプルを選択するステップとを含む、対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法が提供される。特定の実施形態では、複数のサンプルの各サンプル中のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップは、複数のサンプル中の各サンプルを示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラｇＲＮＡであってもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡであってもよい。特定の実施形態では、サンプルは、添加剤、小分子、安定化試薬、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、グリセロール濃度、またはその他の緩衝液成分を含んでなる構成要素を含んでなってもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子のＴｍ値より少なくとも８℃高いＴｍを有するＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなる、サンプルが選択されてもよい。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って選択されるｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子のＴｍ値よりも少なくとも８℃高いＴｍを有する、単離されたＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との複合体が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って選択されたｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子のＴｍ値よりも少なくとも８℃高いＴｍを有する、単離されたＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との複合体を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との非天然複合体のＴｍと、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子のＴｍとの差は、ＤＳＦによって評価されてもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラまたはモジュラーｇＲＮＡであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をそれぞれが含んでなる、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を作製するステップと；（ｂ）複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の各Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の１つまたは複数が安定していると判定するステップとを含む、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法が提供される。
本明細書の方法の特定の実施形態では、複数のｇＲＮＡ分子は、候補ｇＲＮＡ分子のライブラリーであってもよい。特定の実施形態では、候補ｇＲＮＡ分子のライブラリーは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列のライブラリーを含んでなってもよい。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列のライブラリーは、異なる長さであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を判定する方法が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）ＤＳＦを通じてＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より少なくとも８℃高ければ、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するのに最適なｇＲＮＡを同定する方法が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値を測定するステップと；（ｄ）（ｉ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高く（ｉｉ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値とのまたはＴｍ参照値との間のδ値を判定するステップと；（ｄ）δ値が少なくとも８℃であり、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、ｇＲＮＡ分子のＣａｓ９分子への結合を最適化して、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するする方法が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、（ａ）参照分子の熱安定性値を検出するステップと；（ｂ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値を測定するステップと；（ｄ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含む、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法が提供される。
本明細書の方法の特定の実施形態では、熱安定性値は変性温度値であってもよく、熱安定性参照値は変性温度参照値であってもよい。本明細書の方法の特定の実施形態では、熱安定性値はＴｍ値であってもよく、熱安定性参照値はＴｍ参照値であってもよい。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、または少なくとも２０℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していてもよい。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より少なくとも８℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定している。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、または約２０℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していてもよい。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より約８℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定している。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より約１℃〜５℃、約６℃〜１０℃、約１１℃〜１５℃、または約１６℃〜２０℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していてもよい。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より約６℃〜１０℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定している。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｔｍ値は、熱シフトアッセイを用いて検出されてもよい。特定の実施形態では、熱シフトアッセイは、ＤＳＦ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）から選択されてもよい。
本明細書の方法の特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、キメラｇＲＮＡ分子を含んでなってもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、モジュラーｇＲＮＡ分子を含んでなってもよい。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、本明細書で開示されるＣａｓ９分子のいずれかであってもよい。例えば、Ｃａｓ９分子は、表１から選択されるＣａｓ９分子であってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、キメラＣａｓ９分子、または合成または遺伝子操作Ｃａｓ９分子であってもよい。例えば、Ｃａｓ９分子は、１つの消去部分またはいくつかの消去部分を有するＣａｓ９分子であってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子を含んでなってもよい。
本明細書の方法の特定の実施形態では、参照分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の非存在下の参照Ｃａｓ９分子；（ｂ）第２のｇＲＮＡ分子（すなわち、評価される複合体中のもの以外のｇＲＮＡ）と複合体形成する、標準Ｃａｓ９分子（例えば、評価される複合体中のＣａｓ９分子と同じＣａｓ９分子）；および（ｃ）参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体から選択されてもよく、その中で参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる比率のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの異なる条件下で形成され、または異なる緩衝液中で形成された。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、評価される複合体のＣａｓ９分子と同一であってもよい。特定の実施形態では、標準Ｃａｓ９分子は、評価される複合体のＣａｓ９分子と異なってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、評価される複合体のＣａｓ９分子とは一次配列が異なってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子は、評価される複合体のｇＲＮＡ分子と同一であってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子は、評価される複合体のｇＲＮＡ分子と異なってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子は、評価される複合体のｇＲＮＡ分子と配列が異なってもよく、または修飾のために異なってもよい。
本明細書の方法の特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、予め選択されたＴｍの数値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、本明細書に記載される参照分子のいずれかのＴｍと相関する値を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性を検出するステップと；Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値を測定するステップと；Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、活性は、インデルを誘導する能力；標的ＤＮＡを修飾する能力；予め選択された修復方法の傾向；ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力；およびｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力の１つまたは複数を含んでなってもよい。特定の実施形態では、活性値は結合値であってもよく、活性は、（ａ）サンプル中でｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；（ｂ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の結合値を測定するステップと；（ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の結合値が、参照分子の結合値よりまたは結合参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含んでなる、ｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子に結合する能力であってもよい。特定の実施形態では、結合値は、動態アッセイを用いて測定されてもよい。特定の実施形態では、動態アッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、またはゲルバンドシフトアッセイから選択されてもよい。特定の実施形態では、予め選択された修復方法の傾向は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪであってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性は、試験管内システム；生体外システム；生体内システム；細胞アッセイ；または動物モデルを用いて試験されてもよい。
特定の実施形態では、参照分子は、本明細書で提供される参照分子のいずれかから選択される。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる比率のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子で形成され、またはＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる緩衝液中で形成される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製される、合成Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなる、組成物が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製される、１つまたは複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をコードする核酸を含んでなるベクター系が提供される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のいずれかを標的細胞に送達するステップを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を標的細胞に送達する方法が提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、ＲＮＰカチオン性脂質トランスフェクション、ウイルスベクター、またはＲＮＡトランスフェクションによって細胞に送達されてもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法、組成物、または配合物中のｇＲＮＡ分子は、単分子またはキメラｇＲＮＡであってもよい。その他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、モジュラーｇＲＮＡであってもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法、組成物、または配合物中のＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子であってもよく、またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来するＣａｓ９分子、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子であってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は標識されてもよく、これらの実施形態のうちのあるものでは、標識は蛍光染料であってもよい。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的ｇＲＮＡの描写である。
部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号３９および４０）； Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４１）； Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４２）； Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４３）； Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）； ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４５および４６）； Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号３９、４５、４７、および４６）。 単分子ｇＲＮＡ分子の追加的な例示的構造を描写する。二重鎖構造（配列番号４２）としてのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の例示的構造を示す。 単分子ｇＲＮＡ分子の追加的な例示的構造を描写する。二重鎖構造（配列番号３８）としてのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に部分的に由来する、単分子ｇＲＮＡ分子の例示的構造を示す。 Ｃａｓ９配列のアライメントを描写する（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３）。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；およびＬｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。全ての４つの配列中で保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、存在しないことを示す。 上記図２Ａの説明と同じ。 上記図２Ａの説明と同じ。 上記図２Ａの説明と同じ。 上記図２Ａの説明と同じ。 上記図２Ａの説明と同じ。 上記図２Ａの説明と同じ。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３で開示された、Ｃａｓ９分子に由来するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜９５、１２０〜１２３）。 上記図３Ａの説明と同じ。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３で開示されたＣａｓ９分子に由来するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列外れ値が除外された、アライメントを示す（配列番号５２〜１２３）。 上記図４Ａの説明と同じ。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３で開示されたＣａｓ９分子に由来するＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。 上記図５Ａの説明と同じ。 上記図５Ａの説明と同じ。図５Ｃの最後の行は、保存残基を特定する。 Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３で開示されたＣａｓ９分子に由来するＨＮＨ様ドメインの配列外れ値が除外された、アライメントを示す（配列番号１２４〜１４１、１４８、１４９、１５１〜１５３、１６２、１６３、１６６〜１７４、１７７〜１８７、１９４〜１９８）。 上記図６Ａの説明と同じ。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。 例示的ｇＲＮＡ配列（配列番号４２）を用いて、ｇＲＮＡドメイン命名法を例示する。 Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のドメイン構成の概略図を提供する。図８Ａは、Ｃａｓ９の２つのローブ（認識（ＲＥＣ）およびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ）に関する、アミノ酸位置を含めたＣａｓ９ドメインの構成を示す。 上記図８Ａの説明と同じ。図８Ｂは、８３個のＣａｓ９オルソログにわたる、各ドメインのパーセント相同性を示す。 ＤＳＦによって判定された、ｇＲＮＡの非存在下でのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の熱安定性を描写する。 ＤＳＦによって判定された、ｇＲＮＡの非存在下でのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の熱安定性を描写する。 ＤＳＦによって判定された、（１）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、（２）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡの存在下におけるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、および（３）Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの存在下におけるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の熱安定性を描写する。 ＤＳＦによって判定された、（１）Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９および（２）ＣＤ３を標的とするｇＲＮＡと合わせたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の熱安定性を描写する。 Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ ＣＤ３を標的とするｇＲＮＡのＪｕｒｋａｔＴ細胞への送達後における、ＣＤ３陰性集団の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＣＤ３ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を示す例示的ＦＡＣＳ分析を描写する。
定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で用いられ得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
「ａｌｔ−ＨＤＲ」、「代替相同指向修復」、または「代替ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、相同核酸（例えば、内因性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外因性核酸、例えば、鋳型核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。ａｌｔ−ＨＤＲは、プロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、標準ＨＤＲ媒介物であるＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２によって阻害され得るという点で、標準ＨＤＲと異なる。また、ａｌｔ−ＨＤＲは、破損の修復のために一本鎖またはニックの入った相同核酸を使用する。
「標準ＨＤＲ」または標準相同指向修復は、本明細書の用法では、相同核酸（例えば、内因性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外因性核酸、例えば、鋳型核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、二本鎖切断で顕著な切除があって少なくとも１つのＤＮＡの一本鎖部分が形成する場合に、典型的に機能する。正常細胞では、ＨＤＲ典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、およびライゲーションなどの一連の工程を伴う。プロセスはＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的に二本鎖である。
特に断りのない限り、「ＨＤＲ」という用語は、本明細書の用法では標準ＨＤＲおよびａｌｔ−ＨＤＲの双方を包含する。
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）をはじめとする、ライゲーション媒介修復および／または非鋳型媒介修復を指す。
本明細書で使用される「取得する」または「得る」という用語は、物理的実態または値を「直接取得する」、「間接的に取得する」、または値の場合には、「計算によって取得する」の１つまたは複数または全てによって物理的実態または例えば数値などの値の所有を得ることを指す。
「直接取得する」は、プロセスを実施して（例えば、合成法または分析法を実施して）、物理的実体または値を取得することを意味する。「物理的実体を直接取得することは、例えば、出発原料などの物理的実体に物理的変化を含むプロセスを実施することを含む。例示的な変化としては、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること、実体を剪断または断片化すること、実体を分離または精製すること、２つ以上の別個の実体を合わせて混合物にすること、共有結合または非共有結合の破壊または成形をはじめとする化学反応を実施することが挙げられる。値を直接取得することは、例えば、サンプル、分析物、または試薬などの実体の物理的変化を含む分析プロセス（本明細書では「物理的分析」と称されることもある）を実施するステップなどの、サンプルまたは別の実体の物理的変化をはじめとするプロセスを実施する、例えば、例えば、分析物、またはその断片もしくはその他の誘導体などの実体を別の実体から分離または精製すること、分析物、またはその断片もしくはその他の誘導体を、例えば、緩衝液、溶媒、または反応物質などの別の実体と組み合わせること、例えば、分析物の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を切断しまたは形成することによって、分析物またはその断片もしくはその他の誘導体の構造を変化させること；例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を切断しまたは形成することによって、試薬またはその断片もしくはその他の誘導体の構造を変化させることの１つまたは複数を含む方法などの分析法を実施することを含む。
「間接的に取得する」とは、別の当事者または出典（例えば、物理的実体または値を直接取得した第三者研究所）から、物理的実体または値を受け取ることを指す。例えば、第１の当事者は、第２の当事者が直接取得した、または計算によって取得した値を第２の当事者から取得（間接的に取得）し得る。
「計算によって取得する」とは、例えば、コンピュータなどの機械上で実施されるように、計算または演算によって値を取得することを指す。
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない。
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップが装入され得て、非相同配列は比較目的で無視され得る）。最適アライメントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２重み行列による、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同一の位置数の関数である。
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。特定の実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
「参照分子」は、本明細書の用法では、修飾または候補分子がそれに対して比較される分子を指す。例えば、参照Ｃａｓ９分子は、修飾または候補Ｃａｓ９分子がそれに対して比較されるＣａｓ９分子を指す。同様に、標準ｇＲＮＡは、修飾または候補ｇＲＮＡ分子がそれに対して比較されるｇＲＮＡ分子を指す。さらに、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体がそれに対して比較される、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を指す。修飾または候補分子は、配列（例えば、修飾または候補分子は、参照分子とＸ％の配列同一性または相同性を有してもよい）、熱安定性、または活性（例えば、修飾または候補分子は、参照分子のＸ％の活性を有してもよい）に基づいて、参照分子と比較されてもよい。例えば、ｗ参照分子がＣａｓ９分子である場合、修飾または候補分子は、参照Ｃａｓ９分子の１０％以下のヌクレアーゼ活性を有することで特徴付けられてもよい。標準Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する天然のＣａｓ９分子などの天然の未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較される修飾または候補Ｃａｓ９分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、修飾または候補Ｃａｓ９分子に達するように変異が加えられた、天然または既知の配列を有する親分子である。
「参照値」は、本明細書の用法では予め選択された数値である参照値を指す。予め選択された数値は、単一の値または範囲であり得る。特定の実施形態では、参照値は、参照分子の値と相関する値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、参照値は、熱安定性参照値であってもよい。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、熱安定性の予め選択された数値である。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、参照分子の熱安定性値と相関する値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、熱安定性と相関するパラメータを含んでなってもよい。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値または融解温度（Ｔｍ）参照値であってもよい。特定の実施形態では、変性温度参照値は、変性の予め選択された値である。特定の実施形態では、変性温度参照値は、参照分子の変性温度値と相関する値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、変性温度参照値は、変性と相関するパラメータを含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、Ｔｍの予め選択された数値であってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、所定の閾値Ｔｍであってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、参照分子のＴｍ値と相関する値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ参照値は、Ｔｍと相関するパラメータを含んでなってもよい。特定の実施形態では、参照値は、活性参照値であってもよい。特定の実施形態では、活性参照値は、参照分子の活性値と相関する値を含んでなってもよい。特定の実施形態では、活性参照値は、活性と相関するパラメータを含んでなってもよい。特定の実施形態では、活性参照値は、切断参照値または結合参照値であってもよい。特定の実施形態では、切断参照値は、核酸切断の予め選択された数値であってもよい。特定の実施形態では、結合参照値は、２つ以上の分子の結合の予め選択された数値であってもよい。特定の実施形態では、参照値は、δ参照値であってもよい。特定の実施形態では、δ値参照値は、δ値の予め選択された数値であってもよい。
「δ値」は、本明細書の用法では、２つの値の間の差またはシフトを表す値である。例えば、特定の実施形態では、δ値は、評価されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値と、参照分子の熱安定性値との、または熱安定性参照値との間の差を表す値であってもよい。特定の実施形態では、δ値は、評価されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値と、参照分子の活性値との、または活性参照値との間の差を表す値であってもよい。
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は家禽である。特定の実施形態では、対象はヒトであり、これらの実施形態のうちのあるものでは、ヒトは、乳児、小児、若年成人、または成人である。
「Ｘ」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
「約」は、本明細書の用法では、記述される値または値の範囲の１０％以内を意味する。
「Ｃａｓ９分子」または「Ｃａｓ９ポリペプチド」は、本明細書の用法では、ｇＲＮＡ分子と相互作用し得て、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインを（および特定の実施形態ではＰＡＭ配列を）含んでなる部位に局在化する、分子またはポリペプチドをそれぞれ指す。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドとしては、天然のＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドと、遺伝子操作、改変、または修飾Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドとの双方が挙げられ、後者は、例えば、最も類似した天然のＣａｓ９分子などの参照配列と、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる。
概要
本発明者らは、ＤＳＦによって判定されたＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性が、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の様々な特性と相関することを発見した。したがって、安定性の判定を用いて、例えば、標的を切断する能力；例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの特定の経路によって分解されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体によって媒介される切断事象の傾向；標的を調節する能力；または予め選択された送達方法の適合性などの様々な特性について、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を評価することができる。安定性の決定はまた、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、複合体を調製する方法（例えば、構成要素の比率または化学量論）、または例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の有効性または堅固さに対する、および一般にＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体への組み入れのための追加的な構成要素の添加を評価するためにも用いられ得る。
開示される実験結果に基づいて、本明細書では、Ｃａｓ９／分子ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性を測定するステップを含む方法が、提供される。タンパク質の熱安定性は、例えばｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの、好ましい条件下で増加させ得る。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを判定するのに有用である。方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するのに最適なｇＲＮＡを同定する方法、対象に投与するためのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体スクリーニングする方法、および対象に投与するためのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を選択する方法をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｃａｓ９／分子ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性を測定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が測定されてもよい。さらに、特定の実施形態では、参照分子の熱安定性値もまた測定されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、本明細書に記載される参照分子の熱安定性値よりまたは熱安定性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子であってもよい。特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、変性温度値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値である。特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、Ｔｍ値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、Ｔｍ参照値であってもよい。特定の実施形態では、熱安定性値は、熱シフトアッセイを用いて測定されてもよい。本明細書で開示されるように、ＤＳＦは、タンパク質の熱安定性を測定するのに用いられてもよい技術である。特定の実施形態では、熱安定性を測定するために用いられる熱シフトアッセイは、ＤＳＦ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）であってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値よりまたは熱安定性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値よりまたは熱安定性参照値より少なくとも８℃高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子の非存在下の参照Ｃａｓ９分子であってもよい。特定の実施形態では、熱安定性値を測定するステップを含む方法は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値を測定することを含むステップをさらに含んでなってもよい。
開示される実験結果に基づいて、本明細書では、Ｃａｓ９／分子ｇＲＮＡ分子複合体の活性を測定するステップを含む方法もまた提供され、それは複合体の安定性を判定するのに有用であり得る。方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するのに最適なｇＲＮＡを同定する方法、対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、および対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を選択する方法をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｃａｓ９／分子ｇＲＮＡ分子複合体の活性を測定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が検出されてもよい。さらに、特定の実施形態では、参照分子の活性値が、検出されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、検出される活性は、結合活性であってもよい。特定の実施形態では、結合活性としては、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力；ｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力またはｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、分子の結合値が測定されてもよい。特定の実施形態では、評価される分子の結合値が、参照分子の結合値より、または結合参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、活性は、切断活性である。切断活性のいくつかの例としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が標的を切断する能力、例えばＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの特定の経路によって分解されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体によって媒介される、切断事象の傾向Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が標的を調節する能力のいずれか１つまたは複数が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の切断値が測定されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の切断値が、参照分子の切断値よりまたは切断参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
本明細書で開示される方法、であっ複数のサンプルで実施されてもよい。例えば、特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を各サンプルが含んでなる、複数のサンプルを作製するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値および／または活性値は、複数のサンプルのそれぞれで検出されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなる少なくとも１つのサンプルは、複数のサンプルから選択されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなるサンプルが、（ｉ）複数のサンプルのＴｍと参照複合体のＴｍとの、または所定の閾値Ｔｍとの比較、または（ｉｉ）複数のサンプルのＴｍ値の相対的な順序付けの１つまたは複数に基づいて選択されてもよい。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をそれぞれが含んでなる、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を作製するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値は、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のそれぞれについて検出されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値よりまたは熱安定性参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値は、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のそれぞれについて検出されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高れば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は安定していると判定されてもよい。
本明細書では、本明細書で開示される方法のいずれかを用いて作製される、非天然Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体もまた、提供される。
本明細書では、本明細書に記載の方法を用いて作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のいずれかを含んでなってもよい組成物が、提供される。例えば、本明細書の組成物は、本明細書で提供される方法に従って選択される、参照分子のＴｍよりまたはＴｍ参照値より、少なくとも８℃高いＴｍを有する、単離されたＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子の複合体を含んでなってもよい。
本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製される、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をコードする核酸を含んでなるベクター系もまた、提供される。
本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を送達するステップを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を標的細胞に送達する方法が提供される。
開示される実験結果に基づいて、本明細書では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその構成要素を評価、選択、最適化、または設計する方法が提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその調製物中のＣａｓ９分子の安定性値（すなわち、安定性と相関する値（例えば、熱安定性値または活性値））を取得するまたは判定するステップを含んでなる。特定の実施形態では、安定性値は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその調製物におけるＣａｓ９分子の熱安定性値または活性値であってもよい。特定の実施形態では、熱安定性値は、Ｔｍ価値または変性温度値であってもよく、特定の実施形態では、熱安定性値は、取得されまたはＤＳＦを用いて判定される。特定の実施形態では、安定性値は、ｇＲＮＡ分子と複合体形成するＣａｓ９分子について取得される。その他の実施形態では、安定性値は、ｇＲＮＡ分子の存在下のＣａｓ９分子について取得される。特定の実施形態では、安定性値は、例えば、Ｔｍ参照値などの熱安定性参照値（すなわち、熱安定性と相関するパラメータ）または例えば、標的ＤＮＡを切断する能力のような切断活性などの活性参照値（すなわち、活性と相関するパラメータ）と比較される。例えば、安定性値がＴｍ値である場合、Ｔｍ値がＴｍ参照値と同一であるか、より高いか、またはそれ未満であるかどうかを判定するために、Ｔｍ値がＴｍ参照値と比較されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法を用いて、例えば、最大安定性を有する、または所望の標的範囲内の安定性を有する対合形成などの、最適なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ対合形成が選択または設計される。特定の実施形態では、方法を用いて、例えば、最大安定性で特定のＣａｓ９分子と複合体形成するｇＲＮＡ分子を同定するなど、特定のＣａｓ９分子との対合形成ための１つまたは複数のｇＲＮＡが選択または設計される。その他の実施形態では、方法を用いて、例えば、最大安定性で特定のｇＲＮＡと複合体形成するＣａｓ９分子を同定するなど、特定のｇＲＮＡとのまたはｇＲＮＡのセットとの対合形成のためのＣａｓ９分子が選択される。なおも別の実施形態では、方法を用いて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体における対合形成のためのＣａｓ９分子とｇＲＮＡまたはｇＲＮＡのセットとの双方が選択される。
本明細書の特定の実施形態では、複合体中のＣａｓ９分子の安定性と相関する所望の値を示す、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ複合体またはそれらの構成要素、ならびにこれらの複合体またはそれらの構成要素を含んでなる組成物および医薬製剤が提供される。特定の実施形態では、この値は、Ｔｍまたは変性温度であってもよく、特定の実施形態では、値は、取得されまたはＤＳＦを用いて判定される。これらの実施形態のうちのあるものでは、複合体は、本明細書で提供される方法を用いて作製される。
本明細書の特定の実施形態では、熱安定性値を比較するステップを含んでなる方法が提供される。特定の実施形態では、方法は、熱安定性値を熱安定性参照値と比較するステップを含んでなる。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、例えば、Ｔｍ値などの熱安定性の予め選択された数値などの、予め選択された数値を含んでなる（その中で値は、単一の値または範囲であり得る）。特定の実施形態では、熱安定性参照値は、ａ）ｇＲＮＡ分子の非存在下の、例えば、評価される複合体中のＣａｓ９分子と同じＣａｓ９分子（または異なるＣａｓ９分子）などの参照Ｃａｓ９分子；ｂ）第２のｇＲＮＡ分子（すなわち、評価される複合体中のもの以外のｇＲＮＡ）と複合体形成する、標準Ｃａｓ９分子（例えば、評価される複合体中のＣａｓ９分子と同じＣａｓ９分子）；またはｃ）参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性と相関する値であってもよく、その中で参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる比率のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの異なる条件下で形成され、または異なる緩衝液中で形成された。
本明細書の特定の実施形態では、標準Ｃａｓ９分子が提供される。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、評価される複合体のＣａｓ９分子と同一であってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、例えば、評価される複合体のＣａｓ９分子と一次配列が異なるなど、異なってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子は、評価される複合体のｇＲＮＡ分子と同一であってもよい。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のｇＲＮＡ分子は、例えば、配列が異なるまたは修飾のために異なるなど、ｇＲＮＡ分子と異なってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、δ値（例えばδ値は２つの値の間の差またはシフトである）が取得され、例えば、判定されてもよい。特定の実施形態では、δ値は、評価されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性と、参照値との差と相関する値を含んでもよい。特定の実施形態では、δ値は、例えば、評価されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の変性温度またはＴｍと；例えば、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の値などの参照値の変性温度またはＴｍなどの安定性との安定性の差と相関する値を含んでもよい。
本明細書の特定の実施形態では、方法は、δ値をδ参照値（例えば、δ値の参照値）と比較するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、これは、δ値がδ参照値以下；δ参照値以上；またはδ参照値の所定の範囲内であるかどうかを評価するステップを含んでもよい。
本明細書の特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を選択するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の値（例えば、熱安定性値（例えば、Ｔｍ値をはじめとするが、これに限定されるものではない）、活性値、またはδ値と、参照値との比較に基づいて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を選択するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、参照値は、これに限定されるものではないが、所定の閾値、上限値、目標値を含んでもよい。特定の実施形態では、値は、δ値であってもよい。特定の実施形態では、参照値は、δ参照値であってもよい。
特定の実施形態では、方法は、δ値がδ参照値以下；δ参照値以上；δ参照値の所定の範囲内であるかどうかを評価するステップを含んでもよい。
特定の実施形態では、方法はまた、選択されＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）の活性または特性評価または測定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、活性は、例えば、切断する能力などの切断活性であってもよい。特定の実施形態において、活性は、成功裏に送達される能力であってもよい。特定の実施形態では、活性は、例えば、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力などの結合活性であってもよい。
特定の実施形態では、評価するステップは、試験管内システム、生体外システム、または生体内システムなどのシステム内において、細胞アッセイなどのアッセイで、または細胞または動物モデルなどのモデルで、選択されたＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）の活性を評価または測定するステップを含んでもよい。
特定の実施形態では、評価するステップは、選択されＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）の活性を評価または測定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、活性は、インデルを誘導する能力；標的ＤＮＡを修飾する能力；Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体によって触媒される切断事象を媒介するための例えば、本明細書に記載される経路など、例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの予め選択された修復方法の傾向などの切断活性であってもよい。特定の実施形態では、活性は、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力などの結合活性であってもよい。
特定の実施形態では、方法は、活性についてＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を選択するステップを含んでもよい。例えば、活性は、インデルを誘導する能力；標的ＤＮＡを修飾する能力；Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体によって触媒される切断事象を媒介するための例えば、本明細書に記載される経路など、例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの予め選択された修復方法の傾向などの切断活性であってもよい。特定の実施形態では、活性は、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力などの結合活性であってもよい。
特定の実施形態では、方法は、活性についてＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を設計または最適化するステップを含んでもよい。例えば、活性は、インデルを誘導する能力；標的ＤＮＡを修飾する能力；Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体によって触媒される切断事象を媒介するための例えば、本明細書に記載される経路など、例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの予め選択された修復方法の傾向などの切断活性であってもよい。特定の実施形態では、活性は、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力などの結合活性であってもよい。
特定の実施形態では、方法は、少なくともＸ個のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子の安定性を判定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、Ｘは、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、または１，０００に等しくてもよい。特定の実施形態では、安定性を判定するステップは、Ｃａｓ９分子の安定性値を測定するステップを含んでもよい。特定の実施形態では、安定性値は、熱安定性値であってもよい。特定の実施形態では、熱安定性値は、Ｔｍ値であってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ値は、ＤＳＦによって判定されてもよい。
特定の実施形態では、安定性を判定するステップは、例えば、Ｔｍ値を判定するなど、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子が変性する温度を判定するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ値は、ＤＳＦによって判定されてもよい。
特定の実施形態では、方法は、例えば、第１のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体および第２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体について、Ｔｍ値を判定するなど、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子が変性する温度をＤＳＦによって判定するステップを含んでなってもよい。
特定の実施形態では、少なくともＸ個のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の第１のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と、第２のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは、異なる配列のＣａｓ９分子を有する；配列が異なる、または修飾、キャッピングまたはテーリングによって異なるｇＲＮＡ分子を有する；例えば、異なる化学量論などの異なる条件下で形成されたことで異なる。
特定の実施形態では、例えば、送達が、ＲＮＰカチオン性脂質トランスフェクション、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、またはＲＮＡトランスフェクションによる送達を含んでなる場合など、安定性の判定に応答して、最適化されたまたは予め選択された送達特性について、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその（ｔｈｅｒｅ ｏｆ）構成要素）が選択されてもよい。
特定の実施形態では、安定性の判定に応答して、品質管理基準との最適化されたまたは予め選択された関係について、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその（ｔｈｅｒｅ ｏｆ）構成要素）が選択される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）は、安定性の判定に応答して、品質管理または放出基準を満たすように選択されてもよい。
特定の実施形態では、例えば、Ｔｍ値または変性温度値、またはδ値などの熱安定性値が、参照値またはδ参照値との予め選択された関係性を有する場合に、本明細書の方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）を選択するステップを含んでなってもよい。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその構成要素）は、安定性の判定に応答して、例えば、切断特性などの最適化されたまたは予め選択された特性について選択される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値と、例えば、ｇＲＮＡ分子の非存在下のＣａｓ９分子などの参照分子の熱安定性値との間のδ値の評価に応答して、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその（ｔｈｅｒｅ ｏｆ）構成要素）が選択される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値と、例えば、ｇＲＮＡ分子の非存在下のＣａｓ９分子などの参照分子の活性値との間のδ値の評価に応答して、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（またはその（ｔｈｅｒｅ ｏｆ）構成要素）が選択される。
特定の実施形態では、本明細書の方法は、例えば、Ｃａｓ９分子と複合体形成して、Ｃａｓ９分子／候補ｇＲＮＡ分子複合体の安定性の判定に応答する、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列のライブラリーなどの候補ｇＲＮＡ分子のライブラリー（または単一候補ｇＲＮＡ分子）を評価するステップと、例えば、候補ｔｒａｃｒｇＲＮＡ分子または配列などの候補ｇＲＮＡ分子または配列を選択するステップとを含んでなってもよい。
特定の実施形態では、ライブラリーは、例えば、異なる長さ、異なる配列などの異なる構造の、または例えば、追加的なリン酸基または代替５’キャップ構造を有するなどの異なる修飾を有する、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列は、キメラｇＲＮＡ上に配置されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書の方法は、構成要素を含んでなる調製物において、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子の安定性を評価するステップを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子調製物への組み入れのために構成要素を評価するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、構成要素は、添加剤、小分子、安定化試薬、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、グリセロール濃度、またはその他の緩衝液成分を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、本明細書の方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子の安定性を評価するステップを含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体への組み入れのために候補Ｃａｓ９分子を評価するステップを含んでなってもよい。特定の実施形態では、候補Ｃａｓ９分子は、例えば、１つの消去部分またはいくつかの消去部分を有するＣａｓ９分子などのキメラＣａｓ９分子、または合成または遺伝子操作Ｃａｓ９分子を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、安定性を判定するステップは、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって、例えば、Ｃａｓ９分子のＴｍなど、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子が変性する温度を判定するステップを含んでなってもよい。
本明細書では、反応混合物が提供される。反応混合物は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体；および例えば、シグナル放出がＣａｓ９分子の変性に相関する、色素などのシグナル放出化合物を含んでなってもよい。
本明細書では、その中にＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体；および例えば、シグナル放出がＣａｓ９分子の変性に相関する、色素などのシグナル放出化合物が配置される、示差走査型蛍光光度計が提供される。
本明細書では、本明細書に記載の方法によって評価、選択、最適化、または設計される、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が提供される。
本明細書では、本明細書に記載の方法によって選択または設計される、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなる組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、医薬組成物であってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、薬学的に許容できる担体中に調合されてもよい。
本明細書で考察されるように、本明細書で開示される方法を用いて、製剤または送達のために最適化された複合体が評価、選択または設計されてもよい。例えば、本明細書に記載の方法は、ＲＮＰカチオン性脂質トランスフェクション、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、またはＲＮＡトランスフェクションなどであるが、これに限定されるものではない、任意の送達方法を用いて、キメラｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９分子（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）との複合体形成を改善するために、複数の様式で用いられ得る。
本明細書で考察される方法は、品質管理のために、または放出基準がタンパク質構成要素およびＲＮＡ校正用をの両方について満たされているかどうかを判定するために、用いられ得る。例えば、例えば、Ｃａｓ９タンパク質をＲＮＡと共にインキュベートした際に熱シフトがないなど、熱シフトの基準が満たされなければ、不十分な品質のＣａｓ９分子またはａｇＲＮＡ分子が示唆される。一実施形態では、この方法は、例えば、不純物の検出および除去によって、このような問題に対処するための目安または工程管理として使用される。
本明細書に記載の方法は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体において使用するための候補Ｃａｓ９分子または候補ｇＲＮＡ分子ライブラリーを評価するために用いられ得る。一実施形態では、方法は、最適化結合のための構成要素を同定する。これにより、最適化された標的切断またはその他の特性のための候補のスクリーニングを可能にし得る。本明細書に記載の方法はまた、ｇＲＮＡの長さおよび組成の修飾を評価するためにも用いられ得る。例えば、変異Ｃａｓ９タンパク質を精製した後、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）または配列のライブラリーを、例えば、少なくとも１：１のＲＮＡ：タンパク質比の予め選択された比で、タンパク質と共にインキュベートし得る。ｇＲＮＡ分子の非存在下のＣａｓ９タンパク質と比較した際に観察される熱シフトの出現は、例えば、試験管内、生体外、または生体内で、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連活性を媒介できるｇＲＮＡ分子などの有効なｇＲＮＡ分子の指標となる。
本明細書に記載の方法を用いて、異なるリンカー配列と融合したコグネイトガイド配列と組み合わされて、ＤＳＦを用いて結合についてアッセイされた、異なる長さのｔｒａｃｒ領域を有する、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）または配列のライブラリーがスクリーニングされ得る。良好に結合した複合体は、生体外での切断活性についてスクリーニングされ得た。本明細書に記載の方法は、本明細書で考察される、切断に対する効果、送達適合性、またはその他の特徴について、ＲＮＡの化学修飾、追加的なリン酸基、または代案の５’キャップ構造を評価できるようにする。
本明細書に記載の方法を用いて、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との互作用安定化するための、添加剤、小分子安定化試薬、緩衝液、例えば塩モル濃度などの塩、グリセロール濃度、およびその他の緩衝液成分などの構成要素のライブラリーがスクリーニングされ得る。
本明細書に記載の方法を用いて、例えば、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との相互作用を安定化するためのキメラまたは遺伝子操作Ｃａｓ９分子などのキメラ、遺伝子操作、または合成Ｃａｓ９分子のライブラリーがスクリーニングされ得る。不十分な熱シフトは、ＲＮＡ結合が最適以下であるか、または中断されたことの徴候である。部分的な熱熱シフトは、ＲＮＡが生産的に結合していることを暗示する。ＤＳＦＴｍを有しないキメラまたは遺伝子操作Ｃａｓ９分子では、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）または配列ライブラリーは、ＤＳＦによる測定で結合回復についてスクリーニングされ得る。
不活性と認識されたＣａｓ９分子は、例えば、ランダム化核酸ライブラリーなどの核酸分子ライブラリーに対する熱安定性アッセイにおいて用いられ得る。これにより、ｔｒａｃｒＲＮＡの役割を果たし得る新規分子のスクリーニングが可能になる。この新たに発見された核酸分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）を用いて、侵入性生物およびウイルスに由来する、ゲノムＤＮＡ、生体内ＲＮＡ、および／または遺伝物質を標的化する、新たなｇＲＮＡが開発され得る。
本明細書に記載の方法は、Ｃａｓ９分子の任意の変異型およびキメラ型に適用され得る。本明細書に記載の方法は、例えば本明細書に記載の他のＣａｓ分子などのその他のＣａｓ分子にも適用され得ることも理解される。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
ｇＲＮＡ分子は、本明細書での用法では、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特定の標的化または自動誘導を促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、本明細書で「キメラ」ｇＲＮＡと称されることもある単分子（単一ＲＮＡ分子を有する）、またはモジュラー（２つ以上、典型的に２つの別々のＲＮＡ分子を含んでなる）であり得る。本明細書で提供されるｇＲＮＡ分子は、標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでなる、それからなる、またはそれから本質的になる、標的化ドメインを含んでなる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、尾部ドメインおよび／または５’伸長ドメインをはじめとする１つまたは複数の追加的なドメインをさらに含んでなる。これらのドメインのそれぞれは、以下で詳細に考察される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子中のドメインの１つまたは複数は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する、天然の配列と同一でありまたは配列相同性を共有する、アミノ酸配列を含んでなる。
いくつかの例示的ｇＲＮＡ構造が、図１Ａ〜１Ｉに提供される。ｇＲＮＡの三次元形態、または活性型の鎖内または鎖間相互作用に関して、相補性の高い領域は、図１Ａ〜１Ｉ中、および本明細書で提供されるその他の描写中で、二本鎖として示されることもある。図７は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域に１つのヘアピンループを含有する配列番号４２のｇＲＮＡ配列を用いて、ｇＲＮＡドメイン命名法を例証する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、この領域に２つ以上（例えば、２つ、３つ以上）のヘアピンループを含有してもよい（例えば、図１Ｈ〜１Ｉを参照されたい）。
特定の実施形態では、単分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に、
標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでなる、それからなる、またはそれから本質的になる標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
（第１の相補的ドメインと相補的な）第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
任意選択的に、尾部ドメイン
を含んでなる。
特定の実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’方向に、
標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでなる、それからなる、またはそれから本質的になる標的化ドメイン；および
第１の相補的ドメイン
を含んでなる第１の鎖、および
好ましくは、５’から３’方向に、
任意選択的に、５’伸長ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
任意選択的に、尾部ドメイン
を含んでなる第２の鎖
を含んでなる。
標的化ドメイン
標的化ドメイン（時に、ガイド配列または相補性領域と称されることもある）は、標的核酸と相補的なまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になる。標的化ドメインの全部または一部が、それに対して相補的なまたはある程度相補的な核酸配列は、本明細書で標的ドメインと称される。標的化ドメインを選択する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｕ ２０１４；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ２０１４を参照されたい）。
標的ドメインを含んでなる標的核酸の鎖は、標的化ドメイン配列と相補的であることから、本明細書で相補鎖と称される。標的化ドメインはｇＲＮＡ分子の一部であるため、それは塩基のチミン（Ｔ）でなくウラシル（Ｕ）を含み；反対に、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡ分子は、ウラシルでなくチミンを含む。標的化ドメイン／標的ドメイン対において、標的化ドメイン中のウラシル塩基は、標的ドメイン中のアデニン塩基と対合する。特定の実施形態では、標的化ドメインと標的ドメインとの間の相補性の程度は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択の二次ドメインを含んでなる。これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインは二次ドメインの３’側に位置し、これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインは標的化ドメインの３’末端またはその付近にある。これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端の約８〜約１３ヌクレオチドからなりまたはそれから本質的になる。特定の実施形態では、コアドメインのみが、標的ドメインの対応する部分と相補的または部分的に相補的であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインは、標的ドメインの対応する部分と完全に相補的である。その他の実施形態では、二次ドメインもまた、標的ドメインの一部と相補的または部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン中のコアドメイン標的と相補的または部分的に相補的である一方で、二次ドメインは、標的ドメイン中の二次ドメイン標的と相補的または部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインおよび二次ドメインは、標的ドメインのそれぞれ対応する部分について、同程度の相補性を有する。その他の実施形態では、コアドメインとその標的の間の相補性程度、および二次ドメインとその標的の間の相補性程度は、異なってもよい。これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインが二次ドメインより高度なその標的との相補性を有してもよい一方で、その他の実施形態では、二次ドメインがコアドメインより高度な相補性を有してもよい。
特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内コアドメインは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、または２０〜１００ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインまたはコアドメインは３〜１５、３〜２０、５〜２０、１０〜２０、１５〜２０、５〜５０、１０〜５０、または２０〜５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内コアドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内コアドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１０＋／−４、１０＋／−５、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、または１６＋−２、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
標的化ドメインがコアドメインを含む特定の実施形態では、コアドメインは、３〜２０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、コアドメインは、５〜１５または８〜１３ヌクレオチド長である。標的化ドメインが二次ドメインを含む特定の実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。標的化ドメインが８〜１３ヌクレオチド長のコアドメインを含んでなる特定の実施形態では、それぞれ、標的化ドメインは、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６ヌクレオチド長であり、二次ドメインは、１３〜１８、１２〜１７、１１〜１６、１０〜１５、９〜１４、８〜１３、７〜１２、６〜１１、５〜１０、４〜９、または３〜８ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと完全に相補的である。同様に、標的化ドメインが、コアドメインおよび／または二次ドメインを含んでなる特定の実施形態では、コアドメインおよび二次ドメインの片方または双方が、標的ドメインの対応する部分と完全に相補的である。その他の実施形態では、標的化ドメインは標的ドメインと部分的に相補的であり、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含んでなる実施形態のいくつかでは、コアドメインおよび二次ドメインの片方または双方が、標的ドメインの対応する部分と部分的に相補的である。これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメイン、または標的化ドメイン内のコアドメインまたは標的化ドメインの核酸配列は、標的ドメインとまたは標的ドメインの対応する部分と、少なくとも８０、８５、９０、または９５％相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内コアドメインまたは二次ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的でない１つまたは複数のヌクレオチドを含み、これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内コアドメインまたは二次ドメインは、標的ドメインと相補的でない１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメインの対応する部分と相補的でない１、２、３、４、または５ヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的でない１つまたは複数のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの１つまたは複数は、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインは、その５’末端、３’末端、またはその５’および３’末端の双方の５ヌクレオチド以内に、標的ドメインと相補的でない１、２、３、４、または５ヌクレオチドを含む。標的ドメインが標的ドメインと相補的でない２つ以上のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、２つ以上の前記非相補的ヌクレオチドは互いに隣接し、これらの実施形態のあるものでは、２つ以上の連続的非相補的ヌクレオチドは、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。その他の実施形態では、２つ以上の連続的非相補的ヌクレオチドは、どちらも標的化ドメインの５’または３’末端から５ヌクレオチドを超えて位置する。
特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインは、いかなる修飾も含まない。その他の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメイン、またはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは下記の修飾をはじめとするが、これに限定されるものではない修飾を有する。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、２’メチル化など、例えば、２−アセチル化などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）を含んでなってもよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾され得る。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、標的化ドメインおよび／または標的化ドメインを含むｇＲＮＡを分解されにくくして、例えば、より低い免疫原性など、より生体適合性にする。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアドメインまたは二次ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインおよび／またはコアドメインまたは二次ドメインは、それらの各５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含み、および／または３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアドメインまたは二次ドメインは、２つ以上の連続ヌクレオチドに修飾を含んでなる。
標的化ドメインがコアドメインおよび二次ドメインを含む特定の実施形態では、コアドメインおよび二次ドメインは同数の修飾を含有する。これらの実施形態のうちのあるものでは、どちらのドメインも修飾を含まない。その他の実施形態では、コアドメインは、二次ドメインより多くの修飾を含み、もしくは逆もまた然りである。
特定の実施形態では、コアドメインまたは二次ドメインをはじめとする標的化ドメイン内の１つまたは複数のヌクレオチド修飾は、下記のシステムを用いて候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率に、干渉しないように選択される。ｇＲＮＡは、下記のシステムを用いて評価され得る、選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する、候補標的化ドメインを有する。候補標的化ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、全ての修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
図１Ａ〜１Ｉは、ｇＲＮＡ分子内の標的化ドメイン配置の例を提供する。
第１および第２の相補的ドメイン
第１および第２の相補性（あるいは、それぞれｃｒＲＮＡ由来ヘアピン配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来ヘアピン配列と称されることもある）ドメインは、完全にまたは部分的に互いに相補的である。特定の実施形態では、相補性程度は、少なくともいくつかの生理的条件において、２つのドメインが二本鎖領域を形成するのに十分である。モジュラーｇＲＮＡ分子中では、相補的ドメインのハイブリダイゼーションによって、２つの分子が結合される（例えば、図１Ａを参照されたい）。特定の実施形態では、第１と第２の相補的ドメインとの間の相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の特性と共に、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。第１および第２の相補的ドメインの例は、図１Ａ〜１Ｇに記載される。
特定の実施形態では（例えば、図１Ａ〜１Ｂを参照されたい）、第１および／または第２の相補的ドメインは、対応する相補的ドメインとの相補性を欠く１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインは、対応する相補的ドメインを補完しない、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドを含む。例えば、第２の相補的ドメインは、第１の相補的ドメイン中の対応するヌクレオチドと対合しない、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態では、対応する相補的ドメインを補完しない、第１または第２の相補的ドメイン上のヌクレオチドは、第１および第２の相補的ドメイン間に形成される二本鎖からループアウトする。これらの実施形態のうちのあるものでは、不対ループアウトは第２の相補的ドメイン上に位置し、これらの実施形態のうちのあるものでは、不対領域は、第２の相補的ドメインの５’末端から１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドで始まる。
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインは、５〜３０、５〜２５、７〜２５、５〜２４、５〜２３、７〜２２、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、７〜１５、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは第１の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補的ドメインは、５〜２７、７〜２７、７〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、７〜２０、５〜２０、７〜１８、７〜１７、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、第２の相補的ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、それぞれ独立して６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２、２１＋／−２、２２＋／−２、２３＋／−２、または２４＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補的ドメインは第１の相補的ドメインより長く、例えば、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長い。
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインは、それぞれ独立して、５’から３’方向に向けて、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインの３つのサブドメインを含んでなる。特定の実施形態では、第１の相補的ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、それぞれ、第２の相補的ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインと完全にまたは部分的に相補的である。
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインの５’サブドメインは、４〜９ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、５’ドメインは４、５、６、７、８、または９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの５’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、５’ドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補的ドメインの中心サブドメインは、１、２、または３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの中心サブドメインは、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補的ドメインの３’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、３’サブドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの３’サブドメインは、例えば、４、５、６、７、８、または９など、４〜９ヌクレオチド長である。
第１および／または第２の相補的ドメインは、天然または参照の第１および／または第２の相補的ドメインと相同性を共有し得て、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のうちのあるものでは、第１および／または第２の相補的ドメインは、天然または参照の第１および／または第２の相補的ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド以下が異なる。これらの実施形態のうちのあるものでは、第１および／または第２の相補的ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来する第１および／または第２の相補的ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ）有してもよい。
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインは、いかなる修飾も含まない。その他の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、下記の修飾をはじめとするが、これに限定されるものではない修飾を有する。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、２’メチル化など、例えば、２−アセチル化などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）を含んでなってもよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾され得る。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、第１および／または第２の相補的ドメインおよび／または第１および／または第２の相補性を含んでなるｇＲＮＡを分解されにくくして、または例えば、より低い免疫原性など、より生体適合性にする。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインは、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のうちのあるものでは、第１および／または第２の相補的ドメインは、それぞれ独立して、それらの各５’末端、３’末端、またはそれらの５’および３’末端の双方の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。その他の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメインは、それぞれ独立して、それらの各５’末端、３’末端、またはそれらの５’および３’末端の双方の５ヌクレオチド内に修飾を含有しない。特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインの片方または双方は、２つ以上連続ヌクレオチドに修飾を含んでなる。
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補的ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、下記のシステムにおいて候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率に、干渉しないように選択される。ｇＲＮＡは、下記のシステムを用いて評価され得る、選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する、候補第１または第２のドメインを有する。候補相補的ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインによって形成される二重鎖領域は、あらゆるループアウトまたは不対ヌクレオチドを除いて、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２塩基対長である。
特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化に際し、１１個の対合ヌクレオチドを含んでなる（例えば、配列番号４８のｇＲＮＡを参照されたい）。特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化に際し、１５個の対合ヌクレオチドを含んでなる（例えば、配列番号５０のｇＲＮＡを参照されたい）。特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化に際し、１６個の対合ヌクレオチドを含んでなる（例えば、配列番号５１のｇＲＮＡを参照されたい）。特定の実施形態では、第１および第２の相補的ドメインは、二重鎖化に際し、２１個の対合ヌクレオチドを含んでなる（例えば、配列番号２９のｇＲＮＡを参照されたい）。
特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、第１および第２の相補的ドメインの間で交換されて、ポリＵ配列が除去される。例えば、配列番号４８のｇＲＮＡのヌクレオチド２３および４８またはヌクレオチド２６および４５が交換されて、それぞれ配列番号４９または３１のｇＲＮＡが作製されてもよい。同様に、配列番号２９のｇＲＮＡのヌクレオチド２３および３９が、ヌクレオチド５０および６８で交換されて、配列番号３０のｇＲＮＡが作製されてもよい。
連結ドメイン
連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインの間に配置されて、それらを連結して単分子またはキメラｇＲＮＡにするのに役立つ。図１Ｂ〜１Ｅは、連結ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、連結ドメインの一部はｃｒＲＮＡ由来領域に由来して、別の部分はｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域に由来する。
特定の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを共有結合的に連結する。これらの実施形態のうちのあるものでは、連結ドメインは、共有結合からなり、またはそれを含んでなる。その他の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補的ドメインを非共有結合的に連結する。特定の実施形態では、連結ドメインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１０以下のヌクレオチド長である。その他の実施形態では、連結ドメインは、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５以上など、１０を超えるヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、２０＋／−１０、３０＋／−５、３０＋／−１０、４０＋／−５、４０＋／−１０、５０＋／−５、５０＋／−１０、６０＋／−５、６０＋／−１０、７０＋／−５、７０＋／−１０、８０＋／−５、８０＋／−１０、９０＋／−５、９０＋／−１０、１００＋／−５、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、連結ドメインは、例えば、第２の相補的ドメインに対して５’側であるｔｒａｃｒＲＮＡの配列などの天然配列と相同性を共有し、またはそれに由来する。特定の実施形態では、連結ドメインは、例えば、図１Ｂ〜１Ｅの連結ドメインなどの本明細書で開示される連結ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の相同性を有し、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド以下が異なる。
特定の実施形態では、連結ドメインは、いかなる修飾も含まない。その他の実施形態では、連結ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、下記の修飾をはじめとするが、これに限定されるものではない修飾を有する。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、２’メチル化など、例えば、２−アセチル化などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）を含んでなってもよい。特定の実施形態では、連結ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾され得る。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、連結ドメインおよび／または連結ドメインを含んでなるｇＲＮＡを分解されにくくして、または例えば、より低い免疫原性など、より生体適合性にする。特定の実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のうちのあるものでは連結ドメインは、その５’および／または３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。特定の実施形態では、連結ドメインは、２つ以上の連続ヌクレオチドに修飾を含んでなる。
特定の実施形態では、連結ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、下記のシステムを用いて候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率に、干渉しないように選択される。ｇＲＮＡは、下記のシステムにおいて評価され得る、選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する、候補連結ドメインを有する。候補連結ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補的ドメインの３’末端、および／または第２の相補的ドメインの５−末端に隣接する、またはそれから１、２、または３ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含んでなる。これらの実施形態のうちのあるものでは、連結領域の二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、２０＋／−１０、または３０＋／−５塩基対長である。特定の実施形態では、連結ドメインの二重鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対長である。特定の実施形態では、連結ドメインの二本鎖領域を形成する配列は、完全に相補的である。その他の実施形態では、二本鎖領域を形成する配列の片方または双方は、他方の二本鎖配列と相補的でない、１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド）を含有する。
５’伸長ドメイン
特定の実施形態では、本明細書で開示されるようなモジュラーｇＲＮＡは、５’伸長ドメイン、すなわち、第２の相補的ドメインの５’側の１つまたは複数の追加的なヌクレオチドを含んでなる（例えば、図１Ａを参照されたい）。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０以上、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のうちのあるものでは、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
特定の実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、以下で提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含んでなる。一例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、または以下に記載されるその他の修飾で、修飾され得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、または以下に記載されるその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位における修飾）を含んでなり得る。
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含んでなり得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含んでなる。
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含んでなる。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたクレオチドは、修飾されていない。
５’伸長ドメイン中の修飾は、以下に記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５’伸長ドメインと、例えば、図１Ａ〜１Ｇで本明細書に記載される５’伸長ドメインなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
隣接ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、隣接ドメインの例を提供する。
特定の実施形態では、隣接ドメインは、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長など、５〜２０ヌクレオチド長以上である。これらの実施形態のうちのあるものでは、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、隣接ドメインは、天然隣接ドメインと相同性を共有し、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のうちのあるものでは、隣接ドメインは、例えば、図１Ａ〜１Ｇに記載されるものをはじめとする、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）隣接ドメインなどの本明細書で開示される隣接ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド以下が異なる。
特定の実施形態では、隣接ドメインはいかなる修飾も含まない。その他の実施形態では、隣接ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾をはじめとするが、これに限定されるものではない修飾を有する。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、２’メチル化など、例えば、２−アセチル化などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）を含んでなってもよい。特定の実施形態では、隣接ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾され得る。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、隣接ドメインおよび／または隣接ドメインを含んでなるｇＲＮＡを分解されにくくして、または例えば、より低い免疫原性など、より生体適合性にする。特定の実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のうちのあるものでは隣接ドメインは、その５’および／または３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインは、２つ以上の連続ヌクレオチドに修飾を含んでなる。
特定の実施形態では、隣接ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、下記のシステムにおいて候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率に、干渉しないように選択される。ｇＲＮＡは、下記のシステムにおいて評価され得る、選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する、候補隣接ドメインを有する。候補隣接ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
尾部ドメイン
広範囲の尾部ドメインが、本明細書で開示されるｇＲＮＡ分子で使用するのに適する。図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｇは、このような尾部ドメインの例を提供する。
特定の実施形態では、尾部ドメインは存在しない。その他の実施形態では、尾部ドメインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長など、１〜１００ヌクレオチド長以上である。特定の実施形態では、尾部ドメインは、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜５０、１０〜１００、２０〜１００、１０〜９０、２０〜９０、１０〜８０、２０〜８０、１０〜７０、２０〜７０、１０〜６０、２０〜６０、１０〜５０、２０〜５０、１０〜４０、２０〜４０、１０〜３０、２０〜３０、２０〜２５、１０〜２０、または１０〜１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、尾部ドメインは、５＋／−５、１０＋／−５、２０＋／−１０、２０＋／−５、２５＋／−１０、３０＋／−１０、３０＋／−５、４０＋／−１０、４０＋／−５、５０＋／−１０、５０＋／−５、６０＋／−１０、６０＋／−５、７０＋／−１０、７０＋／−５、８０＋／−１０、８０＋／−５、９０＋／−１０、９０＋／−５、１００＋／−１０、または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、尾部ドメインは、天然尾部ドメインまたは天然尾部ドメイン５’末端と相同性を共有し得て、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のうちのあるものでは、隣接ドメインは、例えば、図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｇに記載されるものをはじめとする、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）隣接ドメインなどの本明細書で開示される天然尾部ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有し、または１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド以下が異なる。
特定の実施形態では、尾部ドメインは、互いに相補的で、少なくともいくつかの生理的条件下では、二重鎖領域を形成する配列を含む。これらの実施形態のうちのあるものでは、尾部ドメインは、尾部二重鎖領域を形成し得る尾部二本鎖ドメインを含んでなる。特定の実施形態では、尾部二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対長である。特定の実施形態では、尾部ドメインは、二本鎖を形成しない尾部二本鎖ドメインの３’側の一本鎖ドメインを含んでなる。これらの実施形態のうちのあるものでは、一本鎖ドメインは、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または４〜６ヌクレオチド長など、３〜１０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、尾部ドメインはいかなる修飾も含まない。その他の実施形態では、尾部ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾をはじめとするが、これに限定されるものではない修飾を有する。特定の実施形態では、尾部ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、２’メチル化など、例えば、２−アセチル化などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）を含んでなってもよい。特定の実施形態では、尾部ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾され得る。特定の実施形態では、尾部ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、尾部ドメインおよび／または尾部ドメインを含んでなるｇＲＮＡを分解されにくくして、または例えば、より低い免疫原性など、より生体適合性にする。特定の実施形態では、尾部ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のうちのあるものでは尾部ドメインは、その５’および／または３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４つの修飾を含む。特定の実施形態では、尾部ドメインは、２つ以上の連続ヌクレオチドに修飾を含んでなる。
特定の実施形態では、尾部ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドの修飾は、下記のように候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率に、干渉しないように選択される。ｇＲＮＡは、下記のシステムを用いて評価され得る、選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する、候補尾部ドメインを有する。候補尾部ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
特定の実施形態では、尾部ドメインは、生体外または生体内転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡの生体外転写に使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型の３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。Ｕ６プロモーターが生体内転写に使用される場合、これらのヌクレオチドはＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。Ｈ１プロモーターが転写に使用される場合、これらのヌクレオチドはＵＵＵＵ配列であってもよい。代替のｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、例えば、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナル次第で、様々な数のウラシル塩基であり得て、またはそれらは代替の塩基を含んでもよい。
特定の実施形態では、隣接および尾部ドメインは、一緒になって、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載される配列を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になる。
例示的単分子／キメラｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書で開示されるような単分子またはキメラｇＲＮＡは、５’［標的化ドメイン］−［第１の相補的ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補的ドメイン］−［隣接ドメイン］−［尾部ドメイン］−３’の構造を有し、その中で、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含んでなり、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補的ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
第２の相補的ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第２の相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補的ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
尾部ドメインは存在せず、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０または９５％の相同性を有する。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるような単分子ｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’に向けて以下を含んでなる：
例えば、１０〜５０ヌクレオチドを含んでなる、標的化ドメイン；
例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含んでなる、第１の相補的ドメイン；
連結ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
尾部ドメイン
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）からの配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する。
特定の実施形態では、隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインと対応するヌクレオチドと相補的である、第２の相補的ドメイン最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的または部分的に相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）からなり、それから本質的になり、またはそれを含んでなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインは、標的化ドメイン全長にわたり、標的ドメイン全長にわたり、またはその双方にわたり、標的ドメインと相補的である。
特定の実施形態では、本明細書で開示される単分子またはキメラｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および必要に応じて、尾部ドメインを含んでなる）は、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を含んでなり、その中で、標的化ドメインは２０Ｎ（残基１〜２０）として列挙されるが、長さが１６〜２６ヌクレオチドの範囲であってもよく、最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルに相当するが、存在しなくてもよく、または少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ分子である。
特定の実施形態では、本明細書で開示される単分子またはキメラｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および必要に応じて、尾部ドメインを含んでなる）は、配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含んでなり、その中で標的化ドメインは２０Ｎ（残基１〜２０）として列挙されるが、長さが１６〜２６ヌクレオチドの範囲であってもよく、最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルに相当するが、存在しなくてもよく、または少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ分子である。
例示的なキメラｇＲＮＡの配列および構造が、１Ｈ〜１Ｉにもまた示される。
例示的なモジュラーｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書で開示されるモジュラーｇＲＮＡは、
好ましくは、５’から３’方向に、
例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含んでなる、標的化ドメイン；
第１の相補的ドメイン
を含んでなる第１の鎖；および
好ましくは、５’から３’方向に、
任意選択的に、５’伸長ドメイン；
第２の相補的ドメイン；
隣接ドメイン；および
尾部ドメイン
を含んでなる第２の鎖
を含んでなり、その中で、
（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；
（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；
（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
特定の実施形態では、隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなる。
特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的な、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）からなる、それから本質的になる、またはそれを含んでなる。これらの実施形態のうちのあるものでは、標的化ドメインは、標的化ドメイン全長にわたり、標的ドメイン全長にわたり、またはその双方にわたり、標的ドメインと相補的である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。これらの実施形態の特定の実施形態では、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または（ｃ）第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のうちのあるものでは、（ａ）隣接および尾部ドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含んでなり；（ｂ）第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがあり；および／または第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
ｇＲＮＡをデザインする方法
本明細書に記載されるｇＲＮＡにおける使用のための標的化ドメインを選択し、設計し、検証する方法をはじめとする、ｇＲＮＡを設計する方法が本明細書に記載される。ｇＲＮＡへの組み込みのための例示的標的化ドメインもまた本明細書で提供される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、相補的塩基対形成を通じて標的ドメインにハイブリダイズすることが、本明細書において検討される。
標的配列の選択および妥当性検証ならびにオフターゲット分析のための方法は、以前に記載されている（例えば、Ｍａｌｉ ２０１３；Ｈｓｕ ２０１３；Ｆｕ ２０１４；Ｈｅｉｇｗｅｒ ２０１４；Ｂａｅ ２０１４；Ｘｉａｏ ２０１４を参照されたい）。例えば、ソフトウェアツールが利用されて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性の最小化など、使用者の標的配列に対応する潜在的標的化ドメインの選択が最適化され得る。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。可能な標的化ドメイン選択肢について、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用して、ツールは、最高いくつかの数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のミスマッチ塩基対を含有する、（例えば、ＮＡＧまたはＮＧＧＰＡＭのどちらかに先行する）ゲノム全体にわたる全てのオフターゲット配列を同定し得る。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測され得る。次に、それぞれの可能な標的化ドメインが、その予測されたオフターゲット切断の合計に従って各付けされ；最高位の標的化ドメインは、最大のオンターゲット切断と最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものに相当する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに含め得る。候補標的化ドメインおよびこれらの標的化ドメインを含んでなるｇＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法、および／または本明細書に記載される方法を使用して、機能的に評価され得る。
非限定的例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡで使用するための標的化ドメインが、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを用いて同定された。ｇＲＮＡ設計は、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づくカスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアを用いて行われた（Ｂａｅ ２０１４）。このソフトウェアは、ゲノム全体のオフターゲット傾向を計算した後に、ガイドを格付けする。典型的に、長さが１７〜２４の範囲のガイドについて、完全一致から７つのミスマッチまでのマッチが検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算で判定されたら、各ガイドについて集計スコアが計算され、ウェブインタフェースを用いて表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接する潜在的標的部位を同定することに加えて、ソフトウェアはまた、選択された標的部位と１、２、３つまたは３つを超えて異なる、ＰＡＭ隣接配列を同定する。各遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａＴｍａｓｋｅｒを用いて、反復要素についてスクリーニングされた。ＲｅｐｅａＴｍａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度について、入力ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
同定に続いて、標的化ドメインは、それらの直交性および５’Ｇの存在に基づいて階層に格付けされた（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ではＮＧＧＰＡＭ、またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ではＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５）ＰＡＭなどの関連ＰＡＭを含有するヒトゲノムにおける、近似一致の同定に基づいて）。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「優れた直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体標的化ドメインを指してもよい。優れた直交性を有する標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。
標的化ドメインは、単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対合「ニッカーゼ」ストラテジーの両方について同定された。標的化ドメインを選択するための基準、そしていずれの標的化ドメインが二重ｇＲＮＡ対合「ニッカーゼ」ストラテジーに使用され得るかの判定は、２つの考察事項に基づく：
（１）標的ドメイン対は、ＰＡＭが外側を向いてＤ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼで切断すると５’オーバーハングを生じるように、ＤＮＡ上に配向されるべきである；および
（２）二重ニッカーゼ対で切断することは、合理的な頻度で介在配列全体を欠失させるという仮説。しかし、二重ニッカーゼ対を使用した切断はまた、ｇＲＮＡの１つのみの部位に、インデル変異をもたらし得る。候補対メンバーは、１つの標的化ドメインの標的部位でインデル突然変異を引き起こすのと対比して、配列全体をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
Ｃａｓ９分子
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）からのＣａｓ９分子を含む。
Ｃａｓ９ドメイン
結晶構造は、ガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合体）を用いて、２つの異なる天然の細菌Ｃａｓ９分子（Ｊｉｎｅｋ ２０１４）、およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ ２０１４）について、判定されている。
天然のＣａｓ９分子は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含んでなり、そのそれぞれが、本明細書に記載されるドメインをさらに含んでなる。図８Ａ〜８Ｂは、一次構造中の重要Ｃａｓ９ドメイン構成の概略図を提供する。本開示全体を通じて使用される、各ドメインによって包含されるアミノ酸の命名法およびアミノ酸残基の番号付けは、以前記載されたとおりである（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４）。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９を参照する。
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含んでなる。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を共有せず、Ｃａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは長いαらせんおよびアルギニン富化領域であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸６０〜９３を含んでなる。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなどのリピート：アンチリピート二本鎖の認識にとって重要であり、したがって標的配列を認識することによって、Ｃａｓ９活性にとって重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に２つのＲＥＣ１モチーフを含んでなる。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直線一次構造中ではＲＥＣ２ドメインによって隔離されているが、三次構造中では、組み立てられてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメイン、またはその部分は、リピート：アンチリピート二本鎖の認識における役割もまた果たしてもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸１８０〜３０７を含んでなる。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ−相互作用（ＰＩ）ドメインを含んでなる。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーとの構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８において、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（当該技術分野で一般に、それぞれＲｕｖＣＩドメインまたはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ）から組み立てられる。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造中でその他のドメインによって直線的に隔てられる。しかし、三次構造中では、３つのＲｕｖＣモチーフは組み立てられてＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造類似性を共有して、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ−ＩＩＩモチーフ間にあり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸７７５〜９０８を含んでなる。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号２）のアミノ酸１０９９〜１３６８を含んでなる。
ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、これらの実施形態のうちのあるものでは、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの１つまたは複数を含んでなり得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、下に記載されるＲｕｖＣ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメイン、および／または、例えば、下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインを含んでなる。
ＲｕｖＣ様ドメイン
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１つ、２つ、３つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長など約１０〜２０アミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなる。
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２０）
のアミノ酸配列を含んでなるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または存在しなかった（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１と程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断可能である。その他の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断不能である。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９、（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含んでなるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または存在しなかった（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２１の配列と、１と程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ、
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２２）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または存在しなかった（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２２の配列と、１と程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＶ、
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号２３）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子は、図２Ａ〜２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｙとして示される））。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２３の配列と、１と程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、本明細書の図３Ａ〜３Ｂで開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａ〜３Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つ、３つまたは全てが存在する。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、本明細書の図４Ａ〜４Ｂで開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の数の残基が異なる。一実施形態では、図４Ａ〜４Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つまたは全てが存在する。
追加的なＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る。好ましくは、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、式Ｖ、
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＶまたはＨであり；
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶであり）；
Ｘ３はＭまたはＴである。
特定の実施形態では、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩ、
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１６）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２はＩ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに示される追加的なＲｕｖＣ様ドメインを含んでなり得る（Ｂとして示される））。
追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩＩ、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１７）
のアミノ酸配列を含んでなり得て、
式中、
Ｘ１はＨまたはＬであり；
Ｘ２はＲまたはＶであり；
Ｘ３はＥまたはＶである。
特定の実施形態では、追加的なＲｕｖＣ様ドメインは、アミノ酸配列Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１８）を含んでなる。
特定の実施形態では、相加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１５〜１８の配列と、１と程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン側方の配列は、式ＶＩＩＩ、
Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号１９）
のアミノ酸配列を有し、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され；
Ｘ２’は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され；
Ｘ４’は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるようなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
ＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、または２５アミノ酸長であるが、４０、３５、または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２５）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１はＤ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１つであるが２、３、４、または５つ以下の残基が、配列番号２５の配列と異なる。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは切断可能である。その他の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは切断不能である。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｘ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２６）
のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２６の配列と、１、２、３、４、または５個の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩ、
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２７）
のアミノ酸配列を含んでなるＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２７の配列と、１、２、３、４、または５個の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩ、
Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２８）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含んでなり、
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；
Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｓ、およびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメインを含んでなり得る）。
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２８の配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩＩ、
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２４）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；
Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２４の配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインとは、例えば、図５Ａ〜５Ｃなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。特定の実施形態では、図５Ａ〜５Ｃにおいて同定された高度に保存された残基の１つまたは双方が存在する。
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインとは、例えば、図６Ａ〜６Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１程度であるが、２、３、４、または５以下の残基が異なる。一実施形態では、図６Ａ〜６Ｂで同定された高度に保存された残基の１つ、２つ、３つまたは全てが存在する。
Ｃａｓ９活性
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に、野生型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、遺伝子操作されて、ヌクレアーゼ切断（またはその他の特性）が改変され得て、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供される。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書で、ｅａＣａｓ９（酵素的に活性なＣａｓ９）分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の酵素活性の１つまたは複数を含んでなる：
（１）ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
（２）一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
（３）エンドヌクレアーゼ活性；
（４）エキソヌクレアーゼ活性；および
（５）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方のＤＮＡ鎖を切断して二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性と、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性とを含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性なまたは切断可能なＨＮＨドメインと、不活性なまたは切断不能なＲｕｖＣドメインとを含んでなる。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性なまたは切断不能なＨＮＨドメインと、活性なまたは切断可能なＲｕｖＣドメインとを含んでなる。
いくつかのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドはｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子と連携してコア標的ドメインに局在化するが、標的核酸を切断できず、または効率的な速度で切断できない。切断活性を有さない、または実質的に有さないＣａｓ９分子は、本明細書で、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドと称される。例えば、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性を欠き、または本明細書に記載されるアッセイによる測定で、例えば、参照Ｃａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９ポリペプチドの切断活性の２０％、１０％、５％、１％、または０．１％未満である、実質的により低い切断活性を有し得る。
標的化およびＰＡＭ
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９はｇＲＮＡ分子と相互作用して、ｇＲＮＡ分子と協調し、標的ドメインを含んでなるそして特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含んでなる、部位に局在化し得る。
特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して切断する、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識して、その配列から、例えば、３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｍａｌｉ ２０１３を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧ（配列番号１９９）および／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）（配列番号２００）を認識して、例えば、これらの配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０１）を認識して、例えば、この配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０２）を認識して、例えば、その配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０３）を認識して、例えば、その配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０４）を認識して、例えば、その配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｇ、またはＣ）（配列番号２０５）を認識して、例えば、その配列の３〜５塩基対などの１〜１０塩基対上流で、標的核酸配列の切断を誘導する。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、（Ｊｉｎｅｋ ２０１２）に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。前述の実施形態のそれぞれ（すなわち、配列番号１９９〜２０５）で、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかなどの任意のヌクレオチド残基であり得る。
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、以前に記載されている（例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３を参照されたい）。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１、ＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。
特定の実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され（例えば、配列番号１、２、４〜６、または１２）、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ２０１３に記載される、生物種からのＣａｓ９分子などの天然起源Ｃａｓ９分子配列と比較すると、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
同一である、
アミノ酸配列を含んでなる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在化する能力。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列のいずれかを含んでなり、図中、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２の配列と、少なくとも１個であるが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１’の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜５を含んでなり、十分な追加的なＣａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。特定の実施形態では、領域１〜５は、それぞれ独立して、例えば、図２Ａ〜２Ｇからの配列（配列番号１、２、４、５、１４）などの、本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（配列番号２）のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０（番号付けは図２のモチーフ配列に従う；図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の５２％の残基は保存的である）と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０アミノ酸であるが、９０、８０、７０、６０、５０、４０、または３０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸１〜１８０と同一である、
領域１と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸１２０〜１８０（図２の４つのＣａｓ９配列中の５５％の残基は保存的である）と、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５アミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０、または１０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸１２０〜１８０と同一である、
領域１’と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸３６０〜４８０（図２の４つのＣａｓ９配列中の５２％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５アミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０、または１０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸３６０〜４８０と同一である、
領域２と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸６６０〜７２０（図２の４つのＣａｓ９配列中の５６％の残基は保存的である）と、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５アミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０、または１０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸６６０〜７２０と同一である、
領域３と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸８１７〜９００（図２の４つのＣａｓ９配列中の５５％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５アミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０、または１０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸８１７〜９００と同一である、
領域４と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸９００〜９６０（図２の４つのＣａｓ９配列中の６０％の残基は保存的である）と、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５アミノ酸であるが、３５、３０、２５、２０、または１０以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、４、１、および５）のアミノ酸９００〜９６０と同一である、
領域５と称されるアミノ酸配列を含んでなる。
遺伝子操作または改変Ｃａｓ９
本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在化する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとする、いくつかの特性のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの特性の全部または一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドはｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して、核酸中の部位に局在化する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他の活性は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
Ｃａｓ９分子としては、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドが挙げられる（遺伝子操作は、この文脈の用法では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを単に意味し、プロセスまたは起源の制限は暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、改変されたヌクレアーゼ活性（天然のまたはその他の参照Ｃａｓ９分子と比較して）または改変されたヘリカーゼ活性などの改変された酵素特性を含んでなり得る。本明細書中で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、（二本鎖ヌクレアーゼ活性とは対照的に）ニッカーゼ活性を有し得る。特定の実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のＣａｓ９活性に顕著な影響を及ぼさずに、例えば、その大きさを減少させるアミノ酸配列の欠失などのその大きさを変化させる改変を有し得る。特定の実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含んでなり得て、例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内因性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然のＣａｓ９分子と配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９活性に顕著な改変を有しない。
所望の特性を有するＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然の親Ｃａｓ９分子または親Ｃａｓ９ポリペプチドなどの改変などによっていくつかの様式で作製されて、所望の特性を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、天然または改変Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子と比較して、１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異は、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失を含んでなる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの参照Ｃａｓ９分子と比較して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含んでなり得る。
特定の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。その他の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
非切断および修飾切断Ｃａｓ９分子
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然起源Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然起源Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子）と比較して、二本鎖核酸（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）を調節する能力が、例えば、低下または増大され；例えば、天然起源Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調節する能力が、例えば、低下または増大され；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、排除され得る。
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含んでなる：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連した切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連した切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連した切断活性。
特定の実施形態ではｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（例えば、配列番号２４〜２８などの本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる。代表的な不活性のまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン中にアスパラギン酸の変異を有し得て、例えば、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号２の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力がある、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、配列番号１５〜２３などの本明細書に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン）とを含んでなる。代表的な不活性のまたは切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数の変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の８５６位のヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメイン中のヒスチジンが、例えば、アラニンで置換され得る；例えば、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の８７０位のアスパラギン、および／または図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の８７９位のアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメイン中の１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型と異なり、標的核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の有意により低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。
特定の実施形態では、例示的Ｃａｓ９活性は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の１つまたは複数を含んでなる。変異は、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣドメイン；ＨＮＨドメイン；ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン外の領域などの１つまたは複数のＲｕｖＣドメインに存在し得る。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインに存在する。一実施形態では、変異は、ＨＮＨドメイン内に存在する。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方に存在する。
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の配列に関して、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに加えられてもよい例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、および／またはＤ９８６Ａが挙げられる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子と比較して、ＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインに１つまたは複数の差異を含んでなるｅｉＣａｓ９分子であってもよく、その中では、ｅｉＣａｓ９分子は、核酸を切断せず、または例えば、本明細書に記載される切断アッセイにおいて、ｅｉＣａｓ９分子は、対応する野生型Ｃａｓ９分子などの参照Ｃａｓ９分子よりも、５０％、２５％、１０％、または１％低い効率で切断するなど、参照Ｃａｓ９分子よりも有意に低い効率で切断する。
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼすか否かは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含んでなり、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子）と比較して、二本鎖切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）を調節する能力が、例えば、低下または増大され；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調節する能力が、例えば、低下または増大され；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、排除され得る。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つまたは複数を含むｅａＣａｓ９分子である：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
特定の実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、核酸分子（二本鎖のまたは一本鎖核酸分子のいずれも）を切断せず、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０％、１０％、５％、１％または０．１％未満の有意により低い効率で核酸分子を切断する、ｅｉＣａｓ９分子である。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）またはＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子のような、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。特定の実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子は、ＲｕｖＣドメインに関連した実質的な切断活性、および／またはＨＮＨドメインに関連した切断活性を欠く。
特定の実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、その中で、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応して、固定残基の１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列と異なる配列；および図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応して、「＊」残基の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下が、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９分子などの天然のＣａｓ９分子の対応する配列と異なる配列を含んでなる。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、または２００アミノ酸残基）に、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の配列と異なる１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する、図２Ａ〜２Ｇで開示されるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号４）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、または２００アミノ酸残基）に、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の配列と異なる１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する、図２Ａ〜２Ｇで開示されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号１）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、または２００アミノ酸残基）に、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の配列と異なる１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する、図２Ａ〜２Ｇで開示されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号２）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである。
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列（配列番号１４）中の「＊」によって表示される１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、または２００アミノ酸残基）に、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）の配列と異なる１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する、図２Ａ〜２Ｇで開示されるＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号５）を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドである。
特定の実施形態では、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどの改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、異なる生物種の２つ以上の天然のＣａｓ９分子などの２つ以上の（ｔｗｏ ｏｆ ｍｏｒｅ）異なるＣａｓ９分子などの融合体であり得る。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含んでなるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
ＰＡＭ認識が改変されているか全くないＣａｓ９
天然のＣａｓ９分子は、例えば、上でＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について記載される、ＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と関連しないＰＡＭ特異性を有し、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善されるように、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加させ、および／またはＣａｓ９特異性を高レベルの同一性に向上させ（例えば、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列との間の９８％、９９％、または１００％一致）、例えば、オフターゲット部位が低減され、および／または特異性が増加される。特定の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。一実施形態では、Ｃａｓ９特異性は、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列との間の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を必要とする。異なるＰＡＭ配列を認識する、および／またはオフターゲット活性の低下を有するＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作製され得る。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用され得る代表的な方法およびシステムは、記載されている（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ２０１１を参照されたい）。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、本明細書に記載される方法によって評価され得る。
サイズ最適化Ｃａｓ９
本明細書に記載の遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書では、１つまたは複数の欠失と場合により１つまたは複数のリンカーとを含んでなる、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され、その中では、欠失の側面に位置するアミノ酸残基の間にリンカーが配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーを有するＣａｓ９分子を作製する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより、当業者には明らかであろう。
例えば、欠失を有する、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９分子などのＣａｓ９分子は、例えば、対応する天然Ｃａｓ９分子よりもアミノ酸数が減少するなど、より小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズによって、送達方法の融通性が増し、それによってゲノム編集の有用性が増す。Ｃａｓ９分子は、１つまたは複数の欠失を含んでなり得て、それは、本明細書に記載される得られたＣａｓ９分子の活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない。本明細書に記載される欠失を含んでなるＣａｓ９分子に保持される活性としては、
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；
および例えば、標的核酸またはａｇＲＮＡなどの核酸分子の認識活性
の１つまたは複数が挙げられる。
本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性は、本明細書または当技術分野で記載される活性アッセイを使用して評価され得る。
欠失に適する領域を同定する
欠失のためのＣａｓ９分子の適切な領域は、多様な方法によって同定され得る。例えば、表１に記載されるもののいずれかなどの様々な細菌種に由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子をＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造上にモデル化して（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４）、タンパク質の三次元立体構造に関して、選択されたＣａｓ９オルソログ全体にわたる保存レベルを調べ得る。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの界面などの、Ｃａｓ９活性に関与する領域から離れて空間的に位置する、保存性が低いまたは非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低減させない欠失候補である、領域またはドメインに相当する。
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書で提供される。例示的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、以前記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ ２０１３；Ｗａｎｇ ２０１３；Ｍａｌｉ ２０１３；Ｊｉｎｅｋ ２０１２を参照されたい）。
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、例えば、以下の全てなどの、以下の１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換される。
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
それに加えて、または代案としては、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３に記載される。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号７に記載される。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号６に記載される。
以下に提供されるのは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＣａｓ９分子をコードする代表的なコドン最適化核酸配列である。
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
様々な型のＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドを使用して、本明細書で開示された発明を実施し得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。例示的Ｃａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、以前記載されている（例えば、Ｈａｆｔ ２００５およびＭａｋａｒｏｖａ ２０１１を参照されたい）。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表２にもまた示される。
候補分子の機能分析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、および候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で周知の技術によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。本明細書に記載される各技術は、単独で、または１つまたは複数の技術と組み合わせて用いられて、候補分子が評価されてもよい。本明細書で開示される技術は、限定されるものではないが、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を判定する方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するのに最適なｇＲＮＡを同定する方法、対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法、および対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を選択する方法をはじめとする様々な方法のために用いられてもよい。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性を測定するための技術
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）およびその他の技術によって検出され得る。タンパク質の熱安定性は、例えばｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの、好ましい条件下で増加させ得る。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを判定するのに有用である。
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ＤＳＦは、タンパク質の熱安定性を測定するために用いられる技術である。アッセイは、いくつかの方法で適用され得る。代表的プロトコルとしては、ＲＮＰ形成のための所望の溶液条件を判定するためのプロトコル（アッセイ１、下記参照）、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の所望の化学量論比を試験するためのプロトコル（アッセイ２、下記参照）、例えば、野生型または変異Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子のための有効なｇＲＮＡ分子をスクリーニングするためのプロトコル（アッセイ３、下記参照）、および標的ＤＮＡの存在下におけるＲＮＰ形成を調べるためのプロトコル（アッセイ４）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
アッセイ１
ＲＮＰ複合体を形成するための所望の溶液を判定するために、１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）と共にＣａｓ９の２μＭ水溶液を作製し、３８４ウェルプレートに分注する。次に、様々なｐＨおよび塩を有する溶液中に希釈された、等モル量のｇＲＮＡを添加する。室温で１０分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行した。
アッセイ２
第２のアッセイは、様々な濃度のｇＲＮＡ分子と、上記アッセイ１からの緩衝液中の２μＭのＣａｓ９とを混合し、３８４ウェルプレート内において室温で１０分間インキュベートするステップを含む。１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）を含む等容積の最適緩衝液を添加して、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封する。あらゆる気泡を除去するための２０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行した。
アッセイ３
第３のアッセイでは、目的のＣａｓ９分子（例えば、Ｃａｓ９変異タンパク質などのＣａｓ９タンパク質）を精製する。変異ｇＲＮＡ分子のライブラリーを合成して、２０μＭの濃度に再懸濁する。Ｃａｓ９分子を、５×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）の存在下で、所定の緩衝液中でそれぞれ１μＡの最終濃度でｇＲＮＡ分子と共にインキュベートする。室温で１０分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行した。
アッセイ４
第４のアッセイでは、以下のサンプルに対してＤＳＦ実験を実施する：Ｃａｓ９タンパク質単独、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質と標的ＤＮＡ。構成要素を混合する順序は、反応液、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅである。反応溶液は、ＭｇＣｌ２の非存在在下または存在下で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する。あらゆる気泡を除去するための２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを用いて、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１度の増分で勾配を実行した。
本明細書に記載される実施例１および２は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の安定性を評価および判定するためのＤＳＦを用いた例示的な結果を開示する。本明細書に示されるように、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のより高いＴｍ値は、ｇＲＮＡ分子の非存在下でのＣａｓ９分子のＴｍ値と比較して、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとの間のより密接な複合体の指標となる。したがって、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のＴｍに関する情報は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が安定かどうかを判定するために有用である。
ＤＳＦに加えて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその調製物におけるＣａｓ９分子の安定性を決定するために用いられてもよい、当技術分野で公知のいくつかの追加的な技術が存在する。これらとしては、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、熱安定性を測定するＤＳＦの代替方法が挙げられる。
ＤＳＣ
ＤＳＣは、異なる緩衝液中の材料、ならびにａｐｏと対比した複合体の熱安定性を測定する非常に正確な技術である。ＤＳＣの利点は、サンプル間における、遷移のエンタルピーの差もまた提供し得ることである。しかし、ＤＳＣは、ＤＳＦよりも顕著に多量の（＞５０倍）試験材料を必要とする。ＤＳＣは、一度に１つのサンプルしか試験できないため、処理能力がより低い。
ＩＴＣ
ＩＴＣは、２つの分子の相互作用の熱安定性および動態速度の双方を測定し得る。その他の技術と対比したＩＴＣの利点は、それがより正確な測定値および動的情報を提供することである。しかし、それはより低い処理量とより多くの量の材料を必要とする。
本明細書で開示される熱安定性技術を用いて、結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増加し得る、分子（例えば、Ｃａｓ９分子）の熱安定性を測定してもよい。さらに、分子の熱安定性は、構成要素の存在などの好ましい条件下で増加してもよい。特定の実施形態では、構成要素は、添加剤、小分子、安定化試薬、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、グリセロール濃度、またはその他の緩衝液成分を含んでなってもよい。
特定の実施形態では、分子の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値より、または熱安定性参照値より高ければ、分子（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、分子の変性温度値である。例えば、特定の実施形態では、分子の変性温度値が参照分子の変性温度値より、または変性温度参照値より高ければ、分子（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）は選択されもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、分子のＴｍ値である。例えば、特定の実施形態では、分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、分子（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子の非存在下のＣａｓ９分子であってもよい。
特定の実施形態では、分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、少なくとも２０℃、少なくとも２１℃、少なくとも２２℃、少なくとも２３℃、少なくとも２４℃、少なくとも２５℃、少なくとも２６℃、少なくとも２７℃、少なくとも２８℃、少なくとも２９℃、少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４３℃、少なくとも４４℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、または少なくとも５０℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。例えば、分子のＴｍ値が、参照分子よりまたはＴｍ参照値より少なくとも８℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
特定の実施形態では、分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。例えば、分子のＴｍ値が、参照分子よりまたはＴｍ参照値より約８℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
特定の実施形態では、分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃〜約５℃、約６℃〜約１０℃、約１１℃〜約１５℃、約１６℃〜約２０℃、約２１℃〜約２５℃、約２６℃〜約３０℃、約３１℃〜約３５℃、約３６℃〜約４０℃、約４１℃〜約４５℃、約４６℃〜約５０℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。例えば、分子のＴｍ値が、参照分子よりまたはＴｍ参照値より約６℃〜約１０℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、分子のＴｍ値が、参照分子よりまたはＴｍ参照値より約８℃〜約９℃高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書の方法は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップと、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値とのまたはＴｍ参照値との間のδ値を判定するステップと、δ値が少なくとも８℃であり、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含んでもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子であってもよい。
特定の実施形態では、評価される分子のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値との、またはＴｍ参照値との間のδ値が、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、少なくとも２０℃、少なくとも２１℃、少なくとも２２℃、少なくとも２３℃、少なくとも２４℃、少なくとも２５℃、少なくとも２６℃、少なくとも２７℃、少なくとも２８℃、少なくとも２９℃、少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４３℃、少なくとも４４℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、または少なくとも５０℃であり、評価される分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ価値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、特定の実施形態では、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、評価される分子はＣＡ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体であってもよく、参照分子はｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子であってもよい。
特定の実施形態では、評価される分子のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値との、またはＴｍ参照値との間のδ値が、評価される分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ価値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃高ければ、特定の実施形態では、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。例えば、δ値が約８℃であり、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子であってもよい。
特定の実施形態では、評価される分子のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値との、またはＴｍ参照値との間のδ値が、評価される分子のＴｍ値が、参照分子のＴｍ価値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃〜約５℃、約６℃〜約１０℃、約１１℃〜約１５℃、約１６℃〜約２０℃、約２１℃〜約２５℃、約２６℃〜約３０℃、約３１℃〜約３５℃、約３６℃〜約４０℃、約４１℃〜約４５℃、約４６℃〜約５０℃高ければ、特定の実施形態では、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。例えば、δ値が約６℃〜約１０℃であり、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が参照分子のＴｍ価値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。特定の実施形態では、参照分子は、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子であってもよい。
特定の実施形態では、本明細書で使用される方法を用いて、Ｃａｓ９分子と複合体形成する異なる長さを有する複数のｇＲＮＡが評価されて、どのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が安定なＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成するかが判定されてもよい。これらの方法はまた、異なる化学量論のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を評価して、どのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が安定なＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成するかを判定するために使用されてもよい。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子と、複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることで、各サンプルがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含んでなる、複数のサンプルが作製されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のＴｍ値は、複数のサンプルのそれぞれで検出されてもよい。特定の実施形態では、（ｉ）複数のサンプルにおけるＴｍ値と、参照Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のＴｍ値との、または所定の閾値Ｔｍ値との比較、または（ｉｉ）複数のサンプルのＴｍ値の相対的な順序付けの１つまたは複数に基づいて、少なくとも１つのサンプルが複数のサンプルから選択されてもよい。特定の実施形態では、Ｔｍ値は、ＤＳＦによって検出されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、ｇＲＮＡ分子を含まないＣａｓ９分子のＴｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に、少なくとも１つのサンプルが選択されてもよい。
Ｃａｓ９およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の活性を測定するための技術
熱安定性技術に加えて、本明細書中の方法と共に用いられてもよい、当該技術分野で公知の様々なその他の技術がある。例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその分子の特定の活性を測定して、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその分子が安定しているかどうかが選択または決定され得る。これらの技術は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその分子が安定しているかどうかを判定するために、単独で、または本明細書に記載される熱安定性技術と併せて用いられてもよい。本明細書で開示される技術は、評価される分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のＣａｓ９分子、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子、またはＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその調製物）の活性を検出するために用いられてもよい。特定の実施形態では、評価される分子の活性値が測定されてもよい。特定の実施形態では、評価される分子の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
評価される分子の検出されてもよい様々な活性としては、分子の結合活性および切断活性が挙げられる。評価される分子の結合活性および切断活性は、本明細書に記載される技術を用いて検出されてもよい。
分子の結合活性のいくつかの例としては、ｇＲＮＡ分子がＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力、ｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力、またはｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、分子の結合活性が検出される場合、結合値が測定されてもよい。特定の実施形態では、評価される分子の結合値が、参照分子の結合値よりまたは結合参照値より高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
切断活性のいくつかの例としては、インデルを誘導する能力、標的ＤＮＡを修飾する能力、および予め選択された修復方法の傾向が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、切断活性が検出される場合、切断値が測定されてもよい。特定の実施形態では、評価される分子の切断値が、参照分子の切断値よりまたは切断参照値より高ければ、評価される分子は選択されてもよく、または安定していると判定されてもよい。
Ｃａｓ９およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の結合活性（動態）を測定するための技術
評価される分子の結合活性（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のＣａｓ９分子、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体中のｇＲＮＡ分子、またはＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体またはその調製物）は、様々な技術を用いて検出され得る。２つの分子間の結合の動態は、構成要素の存在などの特定の条件下でより好ましくあってもよい。特定の実施形態では、構成要素は、添加剤、小分子、安定化試薬、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、グリセロール濃度、またはその他の緩衝液成分、または特定構成要素の添加を含んでなってもよい。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の結合活性の検出を含む方法としては、限定されるものではないが、ｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力の検出、およびＣａｓ９分子およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡに結合する能力の検出が挙げられる。これらの方法は、評価される分子の結合に関する生物物理学的情報を提供する、動態アッセイなどの技術を用いて実施されてもよい。用いられてもよい動態アッセイのいくつかの例は、限定されるものではないが、下述される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）、およびゲルバンドシフトアッセイである。
ＳＰＲ
ＳＰＲは、ＢｉａＣｏｒｅまたはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲシステムのどちらかの使用を必要とする。この技術では、１つの分子がチップの表面に、共有結合的に、またはアフィニティ法を通じてのどちらかで付着される。第２の分子がフローセルに注入され、緩衝液を介して押し出される。反射光の角度の変化は、プラズモン共鳴の量の変化を引き起こす。これから、動態結合および解離を測定することができる。
ＢＬＩ
ＢＬＩは、ｆｏｒｔｅＢｉｏ製のＯｃｔｅｔと称される装置を必要とする。ＢＬＩは、ＳＰＲと同様に、２つの分子間の相互作用の動態速度を判定できる。
ゲルバンドシフト解析
ゲルバンドシフト解析（例えば、電気泳動移動度シフト解析）は、２つの相互作用分子のＫＤを判定する別の方法である。この測定は、その他の利用可能な技術よりも洗練されていないが、比較的安価な試薬を用いて実施され得るという利点がある。
結合アッセイ：Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価するための例示的方法は、以前記載されている（Ｊｉｎｅｋ ２０１２）。ＳＰＲ、ＢＬＩおよびゲルバンドシフト解析などの本明細書に記載される技術を用いて、例えば、ｇＲＮＡ分子がＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＣａｓ９分子に結合する能力、またはＣａｓ９分子およびＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡに結合する能力が測定されてもよい。
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μＬで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の切断活性を測定するための技術
本明細書に記載の方法は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の切断活性を検出するステップを含んでもよい。これは、例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的核酸を切断する能力などの、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡを修飾する能力を検出するステップを含んでもよい。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の切断活性を検出するために用いられてもよい技術のいくつかの例が、本明細書に記載される。
切断アッセイ：Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の安定性を判定するために試験され得る追加的な活性としては、例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的核酸を切断する能力などの、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡを修飾する能力が挙げられる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のエンドヌクレアーゼ活性は、本明細書中に開示されるように測定されてもよい。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、以前記載されている（Ｊｉｎｅｋ ２０１２）。
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物が、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す一方で、ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成し、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μＬでプレインキュベートされる。１μＬの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μＬのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
これらのアッセイの片方または双方を用いて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の安定性を判定し、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９分子の適合性を評価し得る。
ゲノム編集アプローチ
本明細書に記載の方法を用いて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を評価し得る。これらのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、本明細書で考察される１つまたは複数のアプローチまたは経路を用いて、遺伝子を標的化し得る。特定の実施形態では、標的遺伝子の変異は、外因的に提供される鋳型核酸を用いて、ＨＤＲによって修正される。その他の実施形態では、標的遺伝子の変異は、外因的に提供される鋳型核酸を用いることなく、ＨＤＲによって修正される。特定の実施形態では、標的遺伝子の片方または双方の対立遺伝子が、ＮＨＥＪを用いてノックアウトされる。特定の実施形態では、標的遺伝子の発現がノックダウンされる。本明細書に記載の方法を用いて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、本明細書で考察されるアプローチまたは経路の１つまたは複数に望ましいかどうかが評価され得る。
ＨＤＲ修復および鋳型核酸
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導ＨＤＲを用いて、標的配列内の標的位置が改変され得る（例えば、ゲノム中の変異の修復または編集などの修正）。
特定の実施形態では、標的位置を改変させるためのＨＤＲベースの方法は、外因的に提供される鋳型核酸（本明細書では、ドナーコンストラクトまたはドナー鋳型とも称される）を利用する。理論による拘束は望まないが、外因的に提供されるドナー鋳型または鋳型核酸を用いて、ＨＤＲによって標的位置の改変が起こると考えられている。プラスミドドナー鋳型は、相同組換えのための鋳型として利用され得ることが検討される。一本鎖ドナー鋳型が、標的配列およびドナー鋳型間で、代案のＨＤＲ（例えば、一本鎖アニーリング）方法による標的位置改変のための鋳型として、使用され得ることがさらに検討される。ドナー鋳型がもたらす標的位置の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含んでなり得る。
その他の実施形態では、標的位置を改変するためのＨＤＲベースの方法は、外因的に提供される鋳型核酸を利用しない。理論による拘束は望まないが、標的位置の改変は、内因性ゲノムドナー配列を有するＨＤＲによって起こると考えられる。特定の実施形態では、内因性ゲノムドナー配列は、標的位置と同じ染色体上に位置する。その他の実施形態では、内因性ゲノムドナー配列は、標的配列と異なる染色体上に位置する。内因性ゲノムドナー配列による標的位置の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含んでなり得る。
鋳型核酸を用いて、または内因性ゲノムドナー配列を用いて、ＨＤＲによって修正され得る変異としては、点変異が挙げられる。特定の実施形態では、点変異は、１つの二本鎖切断または２つの一本鎖切断のどちらかを用いて修正され得る。特定の実施形態では、点変異は、（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）切断が標的位置の両側で起こる２つの二本鎖切断、（４）二本鎖切断および２つの一本鎖切断が標的位置の両側で起こる１つの二本鎖切断および２つの一本鎖切断、（５）１対の一本鎖切断が標的位置の両側で起こる４つの一本鎖切断、または（６）１つの一本鎖切断によって修正され得る。
一本鎖鋳型核酸が用いられる特定の実施形態では、標的位置は、代替ＨＤＲによって改変され得る。
ドナー鋳型がもたらす標的位置の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、ニック、二本鎖切断、または例えば、標的核酸の各鎖の上にある、２つの一本鎖切断を含んでなり得る。標的核酸に切断を導入した後、切断端で切除が起こり、一本鎖オーバーハングＤＮＡ領域が生じる。
標準ＨＤＲでは、標的核酸に直接的に組み込まれるか、または標的核酸の配列を修正するための鋳型として使用される、標的核酸に対する相同配列を含んでなる、二本鎖ドナー鋳型が導入される。切断点での切除後、修復は、例えば、二重Ｈｏｌｌｉｄａｙ接合モデル（または二本鎖切断修復、ＤＳＢＲ、経路）または合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）経路などの異なる経路によって進行し得る。二重Ｈｏｌｌｉｄａｙ接合モデルでは、標的核酸の２つの一本鎖オーバーハングによって、ドナー鋳型内の相同配列への鎖侵入が起こり、２つのＨｏｌｌｉｄａｙ接合部を有する中間体の形成がもたらされる。接合部は、侵入鎖の末端から新たなＤＮＡが合成される際に移動して、切除の結果生じるギャップを充填する。新たに合成されたＤＮＡの末端は、切除された末端にライゲートされて接合部が分解され、例えば、対応する標的位置へのドナー鋳型の正しい配列の組み込みなどの標的核酸の修正がもたらされる。ドナー鋳型との乗換えが、接合部の分解の際に起こってもよい。ＳＤＳＡ経路では、ただ１つの一本鎖オーバーハングのみがドナー鋳型に侵入し、侵入鎖の末端から新たなＤＮＡが合成され、切除の結果生じるギャップを充填する。次に、新たに合成されたＤＮＡは残りの一本鎖オーバーハングにアニーリングされ、新しいＤＮＡが合成されてギャップを充填し、鎖がライゲートされて修正ＤＮＡ二重鎖が生成される。
代替ＨＤＲでは、例えば鋳型核酸などの一本鎖ドナー鋳型が導入される。所望のＡ１ＡＴ標的位置を変更するための、標的核酸におけるニック、一本鎖切断または二本鎖切断は、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９分子によって媒介され、切断点で切除が起こり、一本鎖オーバーハングを曝露する。標的核酸の標的位置を修正または変更するための鋳型核酸の配列の組み込みは、典型的には、上記のようにＳＤＳＡ経路によって起こる。
鋳型核酸に関する追加的な詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７９０５号明細書の「鋳型核酸」と題されたセクションＩＶに提供される。
遺伝子標的化のためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪを使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトを実施することができ、そして対象遺伝子中の配列を除去す（例えば、欠失させ）る。
理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て；それらは最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐを超える範囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされている。
ＮＨＥＪは変異誘発プロセスであることから、特定の最終配列の作製が必要でない限り、それを用いて小さな配列モチーフ（例えば、５０ヌクレオチド長以下のモチーフ）を欠失させ得る。二本鎖切断が、標的配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、望まれないヌクレオチドに及ぶことが多く、その結果それを除去する。より大型のＤＮＡ断片の欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。このようにして、数百キロベース程度に大きいＤＮＡセグメントが削除され得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位にインデル変異をなおも生じてもよい。
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルが生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の開始コドン直後の配列を含む。
標的化ノックダウン
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９、死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９としてもまた知られている）分子の生成をもたらす。ｅｉＣａｓ９分子はｇＲＮＡと複合体形成し、そのｇＲＮＡの標的化ドメインによって規定されるＤＮＡ配列に局在するが、標的ＤＮＡは切断しない。ｅｉＣａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。ｅｉＣａｓ９分子それ自体は、コード配列の初期領域に動員された場合に転写を阻止し得るが、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、またはＥＲＤ）をｅｉＣａｓ９に融合させ、それを例えば、開始コドンの３’側の１０００ｂｐ配列内、または遺伝子開始コドンの５’側のプロモーター領域５００ｂｐ内にある、標的ノックダウン位置に動員することで達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感受性部位（ＤＨＳ）は、Ｃａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内因性転写因子のための部位を保有するする可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、おそらくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされてもよい。特に遺伝子抑制については、内因性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。特定の実施形態では、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を使用して、１つまたは複数の内因性転写因子の結合を阻止してもよい。その他の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子はクロマチンに融合されて、タンパク質を改変し得る。クロマチン状態を改変することは、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。１つまたは複数のクロマチン修飾タンパク質に融合した１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を使用して、クロマチン状態が改変されてもよい。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、公知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、および／または標的ＤＮＡの発現を抑制できることが疑われる未知または既知の機能の配列を標的化し得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、望まれない対立遺伝子または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のＤＮＡ配列を切断して変異を引き起こし得るのに対し、Ｃａｓリプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Ｃａｓリプレッサーのオフターゲット効果が、Ｃａｓヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、Ｃａｓリプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもはや存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復元する可能性が高い。
一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、もう一つのＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が曝露される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填して、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を変更または修正するために鋳型核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
その他ＤＮＡ修復経路
ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢＲタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢＲを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢＲタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢＲプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する。
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は「損傷を受け」ているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、およびおよび／または（ａｎｄ ａｎｄ／ｏｒ）損傷を受けた５’末端をリン酸部分に回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
時に、ＳＳＢＲは、複製共役型である。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的な要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を含有する。切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像はＬｉ ２００８に記載され、概要は本明細書で提供される。
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
ｈＭＬＨ１は、ｈＭｕｔＬαとヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する）。これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を調節する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的な要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ Ｐｏｌｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ ２００８に記載され、概要は本明細書に記載される。
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への修正ヌクレオチド挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、第３段階の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１つのヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８ヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的な要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する追加的な詳細はＭａｒｔｅｉｊｎ ２０１４にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行する。このプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ Ｐｏｌδ、ＤＮＡ ＰｏｌεまたはＤＮＡ Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップを行うために、自己複製細胞が、ＤＮＡ ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを使用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ Ｐｏｌδ、ＤＮＡ Ｐｏｌκ、およびＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を使用する傾向がある。
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。追加的な要素は、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡをはじめとする、ＮＥＲ修復経路を促進してもよい。
鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１）などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ ＰｏｌβおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
標的細胞
例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、多種多様な細胞内の標的核酸を改変（例えば、変異を導入）し得る。この改変は、試験管内、生体外、または生体内で実施されてもよい。特定の実施形態では、この改変は、遺伝子発現の調節をもたらす。
本明細書に記載されるＣａｓ９およびｇＲＮＡ分子は、標的細胞に送達され得る。例示的標的細胞としては、血液細胞、神経細胞、免疫細胞、筋肉細胞、腎臓細胞、乳腺細胞、消化管細胞、血管細胞、肺細胞、骨細胞、膵臓細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、ホルモン分泌する細胞、肝細胞、上皮細胞、および線維芽細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、標的細胞は正常細胞である。その他の実施形態では、標的細胞は罹患細胞である。これらの実施形態のうちのあるものでは、標的細胞はがん細胞である。
適切な細胞としては、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経細胞幹細胞、または間葉系幹細胞などの幹細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり、または例えば、対象から生成され、変異を修正するように修飾されて、例えば、肝細胞、マクロファージ、単核貪食細胞、肺胞マクロファージ、骨髄性前駆細胞、肺上皮細胞、または造血幹細胞などの臨床的に関連する細胞に分化されたｉＰＳ細胞などの、ｉＰＳ細胞に由来する細胞である。特定の実施形態では、ＡＡＶが使用されて標的細胞が形質導入される。
本明細書に記載の方法によって産生された細胞は、即剤に使用されてもよい。代案としては、細胞は、（例えば、液体窒素中で）冷凍され、後で使用するために保管されてもよい。細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化培地中で、またはこのような凍結温度で細胞を保存する技術分野で一般に使用されるその他のこのような溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍する技術分野で一般に知られている様式で解凍される。
送達、調合、および投与経路
例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）、ドナー鋳型核酸、または３つ全てなどのＣａｓシステム構成要素は、様々な形態で送達、調合、または投与され得て、例えば、表３および４を参照されたい。表３は、構成要素がどのように調合、送達、または投与されるかの例を提供する。表４は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の様々な送達方法を要約する。
Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および／またはドナー鋳型のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ、ドナー鋳型、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、２つまたは全て）は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に投与され得て、または細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびにドナー鋳型は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いる）、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。同様に、ドナー鋳型は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いる）、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。ドナー鋳型は同様に、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
特定の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んでなってもよい。特定の実施形態では、ベクターは、標的化される領域（例えば、標的配列）に対して高い相同性を有する、ドナー鋳型を含んでなってもよい。これらの実施形態のうちのあるものでは、ドナー鋳型は、標的配列の全部または一部を含んでなる。例示的ドナー鋳型は、例えば遺伝子修正鋳型などの修復鋳型、または例えば点変異（例えば、単一ヌクレオチド（ｎｔ）置換）鋳型）などの遺伝子変異鋳型である。
特定の実施形態では、ベクターは、例えばＣａｓ９分子配列に融合された、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局化在、またはミトコンドリア局在化）をコードする配列を含んでなってもよい。特定の実施形態では、ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、および／またはスプライスアクセプターまたはドナーなどの１つまたは複数の調節／制御要素を含んでなってもよい。ベクターがプロモーターを含んでなる実施形態のうちのあるものでは、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。その他の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。
特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス作製のため）である。これらの実施形態のうちのあるものでは、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。その他の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えＡＡＶによって送達される。特定の実施形態では、ドナーテンプレート核酸は、組換えＡＡＶによって送達される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型を認識できる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いる）によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（オルモシル）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ ２０１２を参照されたい）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。
遺伝子移入のための例示的脂質は、下で表１に示される。遺伝子移入のための例示的ポリマーは、下で表５に示される。
特定の実施形態では、非ベクター送達ビヒクルは、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖類（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞更新を増加させるための標的化修飾を有する。特定の実施形態では、ビヒクルは、融合誘導性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。特定の実施形態では、ビヒクルは、酸誘導性立体構造変化（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するための）を受ける。特定の実施形態では、例えば、細胞内区画内の放出のために、刺激切断可能なポリマーが使用される。特定の実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。
特定の実施形態では、Ｃａｓシステム構成要素以外の（すなわち、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡまたはドナー鋳型以外の）１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。これらの実施形態のうちのあるものでは、これらの他の核酸分子は、Ｃａｓシステム構成要素の１つまたは複数と同時に送達される。その他の実施形態では、これらの他の核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。特定の実施形態では、これらの他の核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは異なる手段によって送達される。その他の核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。
Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡのＲＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子をコードするｇＲＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される標的細胞などの細胞に送達され得る。例えば、ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするＲＮＡ分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ ２０１２を参照されたい）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするＲＮＡ分子は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子に、コンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバー、またはキュベット内において、ドナー鋳型核酸分子の存在下または非存在下で、細胞をｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするＲＮＡ分子と混合するステップと、１回または複数回の規定の長さおよび振幅の電気インパルスを適用するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、混合物をカートリッジ、チャンバー、またはキュベットに供給する装置（例えば、ポンプ）に接続された容器内において、ドナー鋳型核酸分子の存在下または非存在下で、細胞がｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするＲＮＡ分子と混合され、１回または複数回の規定の長さおよび振幅の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達されるシステムを用いて、電気穿孔を通じた送達が実施される。ｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子をコードするＲＮＡ分子は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子に、コンジュゲートされ得る。
Ｃａｓ９分子の送達
Ｃａｓ９分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ ２０１２を参照されたい）、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。Ｃａｓ９タンパク質は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子に、コンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をｇＲＮＡ分子と組み合わせて、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に投与するまたは細胞に送達するための、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成してもよい。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰ複合体の細胞への直接送達は、核酸から発現させる必要性（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクション）を排除する。それはまた、核酸送達（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクション）に由来するＤＮＡ断片望まれない組み込みも排除する。したがってそれは、迅速な作用、高速な代謝回転、高いオンターゲット修飾率、低いオフターゲット効果、および細胞に対するより低い毒性を提供する、代案の送達アプローチである。それはまた、トランスフェクトするのが困難なＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（例えば、トランスフェクトするのが困難な初代および多能性幹細胞）を細胞に送達するためにも使用され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰ複合体が投与前に形成（すなわち、予備成形）されてもよい。特定の実施形態では、複数の（例えば、２つ以上の）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰ複合体が、同時にまたは順次送達（例えば、投与）されてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰ複合体は、電気穿孔によって細胞に送達されてもよい。
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバー、またはキュベット内において、ｇＲＮＡ分子および／またはドナー鋳型核酸の存在下または非存在下で、細胞をＣａｓ９分子と混合するステップと、１回または複数回の規定の長さおよび振幅の電気インパルスを適用するステップとを含んでなる。特定の実施形態では、混合物をカートリッジ、チャンバー、またはキュベットに供給する装置（例えば、ポンプ）に接続された容器内において、ｇＲＮＡおよび／またはドナー鋳型核酸存在下または非存在下で、細胞がＣａｓ９分子と混合され、１回または複数回の規定の長さおよび振幅の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達されるシステムを用いて、電気穿孔を通じた送達が実施される。
Ｃａｓシステム構成要素の投与経路
全身性の投与法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、一例として、静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成成分は、構成要素を血液細胞および骨髄細胞に標的化するように、改変または調合されてもよい。
局所投与法としては、一例として、骨髄内、クモ膜下腔内、および脳室内経路が挙げられる。特定の実施形態では、全身投与（例えば、静脈内投与）された場合と比較して、局所的に投与された場合に、有意により少量の構成要素（全身性アプローチと比較して）が効果を発揮してもよい。局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的に毒性の副作用の発生を低下させまたは排除し得る。
加えて、構成要素は、長時間にわたって放出されるように調合されてもよい。
Ｃａｓシステム構成要素の生体外送達
特定の実施形態では、表３に記載されるＣａｓシステム構成要素が細胞に導入され、それは、次に、例えば、対象から除去された細胞などの対象に導入されて、生体外で操作され、対象に再導入される。構成要素を導入する方法としては、例えば、表４に記載される送達方法のいずれかが挙げられる。
Ｘ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含んでなるヌクレオシドと定義される。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外の双方で細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外の双方で、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
ウラシル
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
シトシン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
アデニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
グアニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
例示的修飾ｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾核酸は、修飾ｇＲＮＡであり得る。本明細書中に記載されるｇＲＮＡのいずれでも、本明細書に記載されるように修飾され得るものと理解される。
実験（結果は示さず）を通じて、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｇＲＮＡ構成要素は、ｇＲＮＡがその５’末端またはその付近で修飾された場合に、Ｔ細胞の遺伝子を編集する上で、より効率的であることが見出された（例えば、ｇＲＮＡの５’末端が真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類似体の包含によって修飾された場合。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載されるこれらおよび他の改変ｇＲＮＡは、特定の循環細胞型（例えば、Ｔ細胞）に由来する先天性免疫応答の低下を引き起こし、この低下した応答が、観察された改善の原因であってもよいと考えられる。本発明は、ｇＲＮＡに対する循環細胞（例えば、Ｔ細胞）の先天性免疫応答を最小化することが、ｇＲＮＡを使用して循環細胞（生体外または生体内を問わない）を編集する場合に有利であり得て、また例えば、ｇＲＮＡが生体内遺伝子編集目的のために全身的にまたは局所的に投与される場合など、ｇＲＮＡを使用して非循環細胞を編集する場合にも有益であり得る、という認識を包含する。本発明はまた、５’キャップドｇＲＮＡで観察された改善が、同じタイプの構造的または機能的結果を達成するために、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張され得るという認識も包含する（例えば、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含めることで、または生体内転写されたｇＲＮＡが、仔ウシ腸アルカリホスファターゼなどのホスファターゼでの処理によって、５’三リン酸基が除去されることで修飾される場合など）。理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、１つまたは複数の修飾（例えば、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチド）を含有してもよく、それはヌクレアーゼに安定性を導入する（例えば、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドおよび／または３’ポリＡ配列を含めることで）。
したがって、特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、本明細書に記載されるような１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、ｇＲＮＡを使用する。これらの実施形態のあるものでは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドの包含は、特定の循環細胞型（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および／またはＢ細胞）において、その他の未修飾ｇＲＮＡと比較して、ｇＲＮＡに低下した先天性免疫応答を誘発させる。
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法で使用するためのｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５または１〜２ヌクレオチド内）で修飾される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））の包含によって修飾される。キャップまたはキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写中に組み込まれ得る。特定の実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）での処理によって修飾されて、５’三リン酸基が除去される。
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法で使用するためのｇＲＮＡは、その３’末端またはその付近（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５または１〜２ヌクレオチド内）で修飾される。
一実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つまたは複数（例えば、２５〜２００個）のアデニン（Ａ）残基の添加によって修飾される。ポリＡ配列は、ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルスゲノム）に含有され得て、またはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いて、化学合成中にまたは生体外転写に続いてｇＲＮＡに付加され得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法で使用するためのｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近の修飾と、その３’末端またはその付近の修飾との双方を含んでなる。
特定の実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップ類似体と、３’ポリＡ配列との双方を含有する。一実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）での処理によって修飾されて５’三リン酸基が除去され、３’ポリＡ配列を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡｓは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらす：
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの例えば、８位の修飾によって、修飾アデノシンおよびグアノシンで、または本明細書に記載される修飾アデノシンまたはグアノシンのいずれかによって、置換され得る。
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（−ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’糖修飾、または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、グアノシン（Ｇ）をはじめとする２’フルオロ修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中で、２’ＯＨ基は、例えば、同一リボース糖の４’炭素へのＣ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋によって結合され得て、例示的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏアミノ（その中で、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２）ｎアミノ（その中で、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、その中でリボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（その中でリボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）を含み得る。
一般に、ｇＲＮＡ分子は、酸素を有する５員環の糖類であるリボースを含む。代表的な修飾ｇＲＮＡとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖類似体改変の大部分は２’位に局在するが、４’位をはじめとするその他の部位も修飾を受け入れやすい。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含んでなる。
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、天然の１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えばｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどの適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論による拘束は望まないが、この下方制御は、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することで生じると考えられる。例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡなどの本明細書で開示されるＲＮＡ種は、例えばその３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型における（ｉｓ）発現の下方制御を促進するように選択され得る。
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
実施例１：Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体の生物物理学的特性決定および直接送達
Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の直接送達は、細胞内のＣａｓ９タンパク質の迅速な代謝回転のおかげで、オフターゲット活性を最小化しながら効率的な遺伝子編集を可能にする。ＲＮＰ送達によって媒介される遺伝子編集の効率は遺伝子座によって異なり、ｇＲＮＡの長さおよび送達されるＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡの量および比率に依存する。
Ｃａｓ９のｇＲＮＡとの複合体の構造的および生物物理学的特性決定は、大きな接触面積および高い親和性を明らかにした。熱溶融曲線は、複合体の結合および安定性を検出するのに有用な特性である。ａｐｏ−Ｃａｓ９分子（すなわち、ｇＲＮＡ分子の非存在下のＣａｓ９分子）からｇＲＮＡと複合体形性したＣａｓ９分子への融解温度の大幅な上昇を用いて、Ｃａｓ９のｇＲＮＡに対する親和性を特徴付けた。異なる長さの複数のｇＲＮＡをＣａｓ９と異なる化学量論で複合体形成させ、熱シフト（例えば、融解温度のシフト）を用いて相互作用を測定した。次に、これらの生物物理学的に特徴付けられた複合体を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、生成されたインデルの効率を測定した。ｇＲＮＡの長さおよび塩基組成のわずかな差異は、ＲＮＰ複合体の結合および形成に影響を及ぼすことが示された。結合親和性をゲノム編集の効率と相関させることにより、例えば、カチオン性脂質介在直接送達のためのＲＮＰの最適組成の設計が可能になる。
ＤＳＦによるＣａｓ９分子およびＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の評価
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子を組換え的に発現させて、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー、ＳＰセファロース、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００を用いて精製した。
ＤＳＦを用いて、ｇＲＮＡ分子の非存在下での精製されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の安定性を調べた。反応混合物は、１０μＬ容量中に５μＭのＣａｓ９分子および５×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）を含有した。勾配は、２０℃で１分間、次に２０℃から９５℃まで、１０秒毎に１℃の増分で実行した。蛍光シグナルの導関数を温度に対してプロットし、アンフォールディング転移の温度中点（Ｔｍ）を判定した。図９Ａおよび９Ｂに示されるように、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子（Ｔｍ＝３６℃）は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子（Ｔｍ＝４０℃）よりも不安定であった。
ＤＳＦを用いて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体もまた調べた。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９単独、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と１μＭのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ、およびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と１μＭのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡをＨ１５０（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で試験した。これらの実験で使用されたｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列は、次のとおりであった：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ：
；および
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ：
図１０に示されるように、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の熱変性は４２℃であり、同時のｇＲＮＡ分子の存在下において、５０℃への熱シフトが観察された。しかし、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を外来ｇＲＮＡ分子と共にインキュベートした場合には、シフトは観察されなかった。これらの結果は、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体形成が、熱シフトと相関してもよいことを示唆する。
ＪｕｒｋａｔＴ細胞へのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の送達
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡは、１：２５の比率であった。ｇＲＮＡ構築物を、ＰＣＲプロトコルを用いて作製した。ｇＲＮＡを生体外転写し、キャッピングし（例えば、５’アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ）、テール付加した（例えば、３’ポリＡテール）。図１１Ａに示すように、ｇＲＮＡ結合はＴｍを３２℃から４６℃にシフトさせた。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞に送達された。図１１Ｂは、約２０％の細胞がＣＤ３マーカーを喪失した（ｌｏｓｓ）ことを示している。
実施例２：生体外転写または化学合成からのｇＲＮＡ分子の比較
ＤＳＦを用いて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の成功裏の形成をアッセイし、３つの方法または供給業者から得られたｇＲＮＡ分子の品質および完全性を比較した。
表６の配列に対応する配列を有するｇＲＮＡ分子を、１５〜５０μｇの規模で得た。
４μＭの精製Ｃａｓ９タンパク質を、Ｈ１５０緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、室温において等モル量のｇＲＮＡと複合体形成させた。次に、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体（ＲＮＰ）を含有するこの反応物の一部を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を使用して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。ガイド起源に関わりなく、１００ｎＭのＲＮＰを全例で使用した。いずれの場合にも、ＲＮＰの残りをＨ１５０緩衝液中で１μＭに希釈し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを５０００×ストックから５×の最終濃度まで加え、本明細書に記載されるアッセイ１にしたがってＤＳＦアッセイを実施した。インデル定量化は、本明細書に記載のプロトコルに従って実施した。
実験結果は、表６に要約される。δＴｍを４２℃で融解するＣａｓ９タンパク質と比較した。結果は、８〜９℃のδＴｍによって証明される完全なＲＮＰ複合体形成を示唆したサンプルが、全て、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において良好なＮＨＥＪ活性を示したことを示した。
会社２からの化学的に合成されたｇＲＮＡは、極小のδＴｍとより低いＮＨＥＪ活性（１１％インデル）とを有して、不十分であることが判明した。
ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キットによる生体外転写ｇＲＮＡおよび会社１から購入されたｇＲＮＡは、７〜８℃のＴｍおよび２２〜２７℃の範囲のＮＨＥＪ活性によって実証されたように、十分な品質と完全性を有していた。
実施例３：ｇＲＮＡのクローニングおよび最初のスクリーニング
本実施例は、キメラｇＲＮＡを評価する方法を開示する。同一アプローチはまた、モジュラーｇＲＮＡを評価するのに用いられてもよい。
ｇＲＮＡをベクターにクローニングする
各ｇＲＮＡについて、重複するオリゴヌクレオチドの対が設計されて得られる。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラｇＲＮＡの上流Ｕ６プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のＤＮＡを生成するために準備される。特定の実施形態では、Ｕ６プロモーターは代替のプロモーターで置換されて、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、ａＴ７プロモーター）を駆動してもよい。
ｇＲＮＡを線状ｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ）にクローニングする
各ｇＲＮＡについて、１つのオリゴヌクレオチドが設計されて得られる。Ｕ６プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインをはじめとする、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む）は、別々にＰＣＲ増幅されて、ｄｓＤＮＡ分子として精製される。ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、Ｕ６およびｇＲＮＡスキャフォールドを縫い合わせる。得られたｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ産物）をトランスフェクションのために精製する。任意のｇＲＮＡスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するＣａｓ９と適合性のｇＲＮＡが生成されてもよい。特定の実施形態では、Ｕ６プロモーターは代替のプロモーターで置換されて、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）を駆動してもよい。
初期ｇＲＮＡスクリーニング
試験される各ｇＲＮＡは、プラスミド発現Ｃａｓ９および小量のＧＦＰ発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、２９３Ｔ、Ｋ５６２またはＵ２ＯＳなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。スクリーニングに使用される細胞は、最終的な治療用細胞標的（例えば、赤血球系細胞）に関連してもよい。可能な治療標的細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内因性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
形質移入は、（リポフェクタミンまたはＦｕＧＥＮＥなどの）脂質移入を使用して、または（Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションなどの）電気穿孔によって実施されてもよい。形質移入に続いて、ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーのどちらかによって判定され、一貫した高レベルの形質移入が確認され得る。予備形質移入は、異なるｇＲＮＡおよび異なる標的化アプローチ（例えば、１７量体、２０量体、ヌクレアーゼ、二重ニッカーゼなど）を含んでなり、いずれのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ組み合わせが最大活性を与えるかが判定され得る。
各ｇＲＮＡによる切断の効率は、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイによって標的遺伝子座でＮＨＥＪ誘導性インデル形成を測定することで評価されてもよい。このアッセイでは、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００〜７００ｂｐであり、意図される切断部位は、アンプリコン中に非対称的に配置される。ＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ検証に続いて、９５℃に加熱して、次に、緩慢に冷却することで、ＤＮＡは変性され再ハイブリダイズされる。ハイブリダイズＰＣＲ産物は、次に、非完全にマッチするＤＮＡを認識して切断する、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（またはその他のミスマッチ感受性酵素）で消化される。インデルが元の鋳型ＤＮＡ中に存在する場合、アンプリコンの変性および再アニーリングは、異なるインデルを保有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらし、完全に一致しない二本鎖ＤＮＡがもたらされる。消化産物は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法によって視覚化されてもよい。切断されたＤＮＡの割合（切断および比切断密度で除した分解産物密度）を使用して、次の方程式を使用して、パーセントＮＨＥＪが推定されてもよい：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断割合）１／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％ＮＨＥＪに至るまで感受性である。
特定の実施形態では、例えば、ＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなどのミスマッチ感受性酵素の配列決定と使用をはじめとするその他の方法が、切断効率を評価するために用いられてもよい。サンガー配列決定では、精製ＰＣＲアンプリコンがプラスミド骨格にクローン化され、形質転換されて、単一プライマーでミニプレップされて配列決定される。Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ比率を判定した後に、サンガー配列決定を使用して、インデルの正確な性質が判定されてもよい。次世代配列決定では、アンプリコンは３００〜５００ｂｐであってもよく、意図される切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低いＮＨＥＪ比率の検出を可能にする。
実施例４：ＮＨＥＪによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、所望の変異体（標的遺伝子のノックアウトまたは標的配列モチーフの除去のどちらか）を生成する遺伝子標的化効率が、配列決定によって判定されてもよい。サンガー配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、５００〜７００ｂｐ長であってもよい。次世代配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、３００〜５００ｂｐ長であってもよい。遺伝子機能のノックアウトが目的である場合、配列決定を使用して、遺伝子機能を破壊することが予期されるフレームシフトまたは大規模な欠失または挿入をもたらすＮＨＥＪ誘導インデルを、対立遺伝子の何パーセントが受けたかが評価されてもよい。特定の配列モチーフの除去が目的であれば、配列決定を用いて、この配列に広がる対立遺伝子の何パーセントが、ＮＨＥＪ誘導欠失を受けたかが評価されてもよい。
実施例５：ＨＤＲによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、遺伝子標的効率は、いくつかの方法によって決定され得る。
遺伝子標的化頻度の判定は、外因的に提供されたドナー鋳型または内因性ゲノムドナー配列による相同指向修復（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）を受け、その結果所望の修正が組み込まれた立遺伝子の百分率を測定することを伴う。所望のＨＤＲ事象が、制限酵素部位を生成または破壊する場合、遺伝子標的化の頻度は、ＲＦＬＰアッセイによって判定されてもよい。制限部位が生成せずあるいは破壊されない場合、遺伝子標的化頻度は、配列決定を用いて決定されてもよい。ＲＦＬＰアッセイを用いる場合でも、配列決定をなおも用いて、所望のＨＤＲ事象を確認し、その他の変異が存在しないことを確認してもよい。外因的に提供されたドナー鋳型を用いる場合、プライマーの少なくとも１つは、相同性アームに含まれる領域外の内因性遺伝子配列中に配置され、細胞になおも存在するドナー鋳型の増幅を妨げる。したがって、ドナー鋳型中に存在する相同性アームの長さは、ＰＣＲアンプリコンの長さに影響を及ぼしてもよい。ＰＣＲアンプリコンは、ドナー領域全体（相同性アームの外側に配置された双方のプライマー）に広がり得て、またはそれらは、ドナー領域の一部、およびドナーと内因性ＤＮＡの間の単一接合部（１つの内部プライマーおよび１つの外部プライマー）のみに広がり得る。アンプリコンがドナー領域全体よりも小さい場合、２つの異なるＰＣＲを用いて、５’および３’接合の双方を増幅および配列決定する必要がある。
ＰＣＲアンプリコンが短い（６００ｂｐ未満）場合、次世代配列決定を使用することが可能である。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低い遺伝子標的化率の検出を可能にする。
ＰＣＲアンプリコンが次世代配列決定には長すぎる場合、サンガー配列決定が実施され得る。サンガー配列決定では、精製されたＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローン化し（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを使用してＴＯＰＯクローン化し）、形質転換し、ミニプレップして配列決定する。
上述の同一または同様のアッセイを用いて、内因性ゲノムドナー配列によるＨＤＲを受け、その結果所望の修正が組み込まれた対立遺伝子の百分率を測定し得た。
参照による援用
全本明細書で言及されるての文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
同等物
当業者は、単に通例の実験法を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
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Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６（５）：９３５−９４９（２０１４）
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９０）：６２−６７（２０１４）
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５３（４）：９１０−９１８（２０１３）
Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．“ＣａｓＯＴ： ａ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｔｏｏｌ．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｅｐｕｂ Ｊａｎ．２１，２０１４）

Claims (57)

  1. （ａ）Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を各サンプルが含んでなる、複数のサンプルを作製するステップと；
    （ｂ）前記複数のサンプルのそれぞれにおけるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；
    （ｃ）（ｉ）前記複数のサンプルにおけるＴｍ値と、参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値との、または所定の閾値Ｔｍ値との比較、または（ｉｉ）前記複数のサンプルのＴｍ値の相対的な順序付けの１つまたは複数に基づいて、前記複数のサンプルから少なくとも１つのサンプルを選択するステップと
    を含んでなる、対象に投与するためのＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法。
  2. 前記複数のサンプル中の各サンプルの前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値を検出するステップが、前記複数のサンプル中の各サンプルを示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｇＲＮＡがキメラｇＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ｇＲＮＡがモジュラーｇＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  5. 請求項１〜２の１つの方法に従って選択された、前記ｇＲＮＡ分子の非存在下での前記Ｃａｓ９分子のＴｍ値より少なくとも８℃高い融解温度（Ｔｍ）を有する、単離されたＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との複合体。
  6. 請求項１〜２の１つの方法に従って選択された、前記ｇＲＮＡ分子の非存在下での前記Ｃａｓ９分子のＴｍより少なくとも８℃高い融解温度（Ｔｍ）を有する、単離されたＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子との複合体を含んでなる組成物。
  7. 前記Ｃａｓ９分子と前記ｇＲＮＡ分子の非天然複合体の融解温度（Ｔｍ）と、前記ｇＲＮＡ分子の非存在下での前記Ｃａｓ９分子の融解温度（Ｔｍ）との差が、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価される、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ｇＲＮＡがキメラまたはモジュラーｇＲＮＡである、請求項６に記載の組成物。
  9. （ａ）Ｃａｓ９分子と複数のｇＲＮＡ分子の１つとを組み合わせることによって作製されるＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をそれぞれが含んでなる、複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を作製するステップと；
    （ｂ）前記複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の各Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；
    （ｃ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、前記複数のＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の１つまたは複数が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法。
  10. （ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    （ｂ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；
    （ｃ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を促進する条件を判定する方法。
  11. （ａ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって検出するステップと；
    （ｂ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップとを含んでなる、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をスクリーニングする方法。
  12. （ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    （ｂ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；
    （ｃ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より少なくとも８℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するのに最適なｇＲＮＡを同定する方法。
  13. （ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    （ｂ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）値を検出するステップと；
    （ｃ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値を測定するステップと；
    （ｄ）（ｉ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高く（ｉｉ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の安定性を判定する方法。
  14. （ａ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    （ｂ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の融解温度（Ｔｍ）を検出するステップと；
    （ｃ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値と、参照分子のＴｍ値とのまたはＴｍ参照値との間のδ値を判定するステップと；
    （ｄ）δ値が少なくとも８℃であり、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するｇＲＮＡ分子のＣａｓ９分子への結合を最適化する方法。
  15. （ａ）参照分子の熱安定性値を検出するステップと；
    （ｂ）サンプル中でＣａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを組み合わせて、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    （ｃ）Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値を測定するステップと；（ｄ）前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の熱安定性値が、参照分子の熱安定性値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を検出する方法。
  16. 前記熱安定性値が変性温度値であり、前記熱安定性参照値が変性温度参照値である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記熱安定性値が、融解温度（Ｔｍ）価値であり、前記熱安定性参照値がＴｍ参照値である、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも１１℃、少なくとも１２℃、少なくとも１３℃、少なくとも１４℃、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、少なくとも１７℃、少なくとも１８℃、少なくとも１９℃、または少なくとも２０℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定している、請求項９〜１１、１３、および１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍが、参照分子のＴｍよりまたはＴｍ参照値より少なくとも８℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定している、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、または約２０℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定している、請求項９〜１１、１３、および１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍ値が、参照分子のＴｍ値よりまたはＴｍ参照値より約１℃〜５℃、約６℃〜１０℃、約１１℃〜１５℃、または約１６℃〜２０℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定している、請求項９〜１１、１３、および１７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体のＴｍが、参照分子のＴｍよりまたはＴｍ参照値より約６℃〜１０℃高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定している、請求項２１に記載の方法。
  23. Ｔｍ値が、熱シフトアッセイを用いて検出される、請求項９〜１０、１２〜１４、および１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記熱シフトアッセイが、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ｇＲＮＡ分子が、キメラｇＲＮＡ分子を含んでなる、請求項９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ｇＲＮＡ分子が、モジュラーｇＲＮＡ分子を含んでなる、請求項９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記Ｃａｓ９分子が、表１から選択されるＣａｓ９分子である、請求項１〜４および９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記Ｃａｓ９分子が、例えば、１つの消去部分またはいくつかの消去部分を有するＣａｓ９分子などの、キメラＣａｓ９分子、または合成または遺伝子操作Ｃａｓ９分子である、請求項１〜４および９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記Ｃａｓ９分子が、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子を含んでなる、請求項１〜４および９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記参照分子が、
    （ａ）前記ｇＲＮＡ分子の非存在下の参照Ｃａｓ９分子；
    （ｂ）第２のｇＲＮＡ分子（すなわち、評価される前記複合体中のもの以外のｇＲＮＡ）と複合体形成する、標準Ｃａｓ９分子（例えば、評価される前記複合体中のＣａｓ９分子と同じＣａｓ９分子）；および
    （ｃ）参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体
    から選択され、ここで前記参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子が、例えば、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる比率のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの異なる条件下で形成され、または異なる緩衝液中で形成される、請求項９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記参照Ｃａｓ９分子が、前記評価される複合体の前記Ｃａｓ９分子と同一である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記参照Ｃａｓ９分子が、前記評価される複合体の前記Ｃａｓ９分子と異なる、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記参照Ｃａｓ９分子が、前記評価される複合体の前記Ｃａｓ９分子と一次配列が異なる、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の前記ｇＲＮＡ分子が、前記評価される複合体の前記ｇＲＮＡ分子と同一である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の前記ｇＲＮＡ分子が、前記評価される複合体の前記ｇＲＮＡ分子と異なる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の前記ｇＲＮＡ分子が、前記評価される複合体の前記ｇＲＮＡ分子と配列が異なるか、または修飾のために異なる、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記Ｔｍ参照値が、Ｔｍの予め選択された数値を含んでなる、請求項９〜１４および１７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記Ｔｍ参照値が、請求項２２〜２７の前記参照分子のいずれかの前記Ｔｍと相関する値を含んでなる、請求項９〜１４および１７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性を検出するステップと；
    前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値を測定するステップと；
    前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性値が、参照分子の活性値よりまたは活性参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    をさらに含んでなる、請求項１〜４、９〜１２、および１４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記活性が、
    インデルを誘導する能力；
    標的ＤＮＡを修飾する能力；
    予め選択された修復方法の傾向；
    前記ｇＲＮＡ分子が前記ＤＮＡ標的にハイブリダイズしたまま留まる能力；および
    前記ｇＲＮＡ分子が前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の前記Ｃａｓ９分子に結合する能力
    の１つまたは複数を含んでなる、請求項１３および３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記活性値が結合値であり、前記活性が、
    サンプル中で前記ｇＲＮＡ分子と前記Ｃａｓ９分子とを組み合わせて、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を形成するステップと；
    前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の結合値を測定するステップと；
    前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の結合値が、参照分子の前記結合値よりまたは前記結合参照値より高ければ、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が安定していると判定するステップと
    を含んでなる、前記ｇＲＮＡ分子が前記Ｃａｓ９分子に結合する能力である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記結合値が、動態アッセイを用いて測定される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記動態アッセイが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、またはゲルバンドシフトアッセイから選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記予め選択された修復方法の傾向が、ＨＤＲまたはＮＨＥＪである、請求項４０に記載の方法。
  45. 前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体の活性が、
    試験管内システム；
    生体外システム；
    生体内システム；
    細胞アッセイ；または
    動物モデル
    を用いて試験される、請求項１３および３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記参照分子が、請求項３０〜３３の参照分子のいずれか１つから選択される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記参照Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる比率のＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子で形成され、または前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体とは異なる緩衝液中で形成される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記サンプルが、添加剤、小分子、安定化試薬、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、グリセロール濃度、またはその他の緩衝液成分を含んでなる、構成要素を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
  49. 請求項１〜４および９〜４８のいずれか一項に記載の方法を用いて作製される、合成Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体。
  50. 請求項１〜３および９〜４８のいずれか一項に記載の方法を用いて作製される、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を含んでなる、組成物。
  51. 請求項１〜４および９〜４８のいずれか一項に記載の方法を用いて作製される、安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体をコードする核酸を含んでなる、ベクター系。
  52. 請求項９〜４８のいずれか一項に記載の前記安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を標的細胞に送達するステップを含んでなる、前記Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を標的細胞に送達する方法。
  53. 前記安定なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、ＲＮＰカチオン性脂質トランスフェクション、ウイルスベクター、またはＲＮＡトランスフェクションによって前記細胞に送達される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、候補ｇＲＮＡ分子のライブラリーである、請求項１および９のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記候補ｇＲＮＡ分子のライブラリーが、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列のライブラリーを含んでなる、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子または配列のライブラリーが、異なる長さである、請求項５６に記載の方法。
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