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Es wurde ein Ansatz zur Einführung einer oder mehrerer gewünschter Insertionen und/oder Deletionen mit bekannten Größen in eine oder mehrere vorbestimmte Stellen in einer Nukleinsäure (z. B. in einem Zell- oder Organismusgenom) entwickelt. Dabei wurden Techniken entwickelt, um dies entweder der Reihe nach oder durch Inserieren eines diskreten DNA-Fragments definierter Größe in das Genom genau an einer vorbestimmten Stelle bzw. Ausführen einer diskreten Deletion mit einer definierten Größe an einer exakten Stelle durchzuführen. Die Technik beruht auf der Beobachtung, dass DNA-Einzelstrangbrüche vorzugsweise über den HDR-Weg repariert werden, was die Wahrscheinlichkeit von Indels (z. B. durch NHEJ produziert) in der vorliegenden Erfindung verringert und somit effizienter als Techniken des Stands der Technik ist.
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Ebenso wurden neue Techniken mit der Bezeichnung sEHDR (Sequential Endonuclease-mediated Homology Directed Recombination) und sCHDR (Sequential Cas-mediated Homology Directed Recombination) entwickelt.
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HINTERGRUND
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Es wurde gezeigt, dass bestimmte Bakterien- und Archaeenstämme hoch entwickelte adaptive Immunabwehrsysteme, CRISPR/Cas-Systeme, enthalten, die kontinuierlich umprogrammiert werden, um den Abbau komplementärer Sequenzen zu steuern, die in einwandernder Virus- oder Plasmid-DNA vorhanden sind. Kurze Segmente von Fremd-DNA, Spacer genannt, werden in das Genom zwischen CRISPR-Repeats eingebaut und dienen als 'Erinnerung' an vergangene Expositionen. CRISPR-Spacer werden dann zum Erkennen und Silencing exogener genetischer Elemente analog zu RNAi in eukaryontischen Organismen verwendet.
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Das CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-System, das das Cas(CRISPR associated)-Protein enthält, wurde in vitro von einer Reihe von Forschungsgruppen rekonstituiert, was die DNA-Spaltung fast aller DNA-Matrizen gestattet, ohne dass man nach dem richtigen Restriktionsenzym-Schneidwerkzeug suchen muss. Das CRISPR/Cas-System bietet auch eine Spaltung mit stumpfen Enden zur Erzeugung einer dsDNA oder, bei Verwendung mutierter Cas-Versionen, einer selektiven einzelstrangspezifischen Spaltung (siehe Cong et al., Wang et al. & Mali et al., unten zitiert).
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Durch In-vitro-Untersuchungen unter Verwendung des Streptococcus pyogenes-Typ-II-CRISPR/Cas-Systems konnte gezeigt werden, dass als einzige Komponenten für eine effiziente CRISPR/Cas-vermittelte Modifikation der Ziel-DNA bzw. des Zielgenoms eine Cas-Nuklease (z. B. eine Cas9-Nuklease), CRISPR-RNA (crRNA) und trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) benötigt werden. Der Wildtyp-Mechanismus der CRISPR/Cas-vermittelten DNA-Spaltung erfolgt über mehrere Schritte. Transkription des CRISPR-Array, enthaltend kleine Fragmente (20–30 Basenpaare) der angetroffenen (oder Ziel-)DNA, in Prä-crRNA, deren Reifung über die Hybridisierung mit tracrRNA via direkte Prä-crRNA-Repeats erfolgt. Die Hybridisation der Prä-crRNA und tracrRNA, als Guide-RNA (gRNA oder sgRNA) bekannt, vereinigt sich mit der Cas-Nuklease unter Bildung eines Ribonukleoprotein-Komplexes, der die Umwandlung von Prä-crRNA in reife crRNA vermittelt. Der reife crRNA:tracrRNA-Duplex leitet Cas9 zum DNA-Ziel, bestehend aus dem Protospacer und der erforderlichen PAM(Protospacer Adjacent Motif)-Sequenz (CRISPR/cas-Protospacer-adjacent Motif; PAM), und zwar über die Ausbildung eines Heteroduplex zwischen der Spacer-Region der crRNA und der Protospacer-DNA auf dem Wirtsgenom. Die Cas9-Nuklease vermittelt die Spaltung der Ziel-DNA stromaufwärts von PAM, so dass ein Doppelstrangbruch im Protospacer bzw. ein strangspezifischer Einschnitt (Nick) bei Verwendung mutierter Cas9-Nuklease, wobei ein DNA-strangspezifisches Spaltmotiv mutiert ist (beispielsweise enthält Cas9-Nickase eine D10A-Substitution), entsteht (Cong et al.).
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Es sei angemerkt, dass unterschiedliche Streptococcus-Stämme isoliert wurden, die PAM-Sequenzen verwenden, die sich von den von Streptococcus pyogenes-Cas9 verwendeten unterscheiden. Letztere benötigt eine NGG-PAM-Sequenz. Bei anderen prokaryontischen Spezies sind CRISPR/Cas-Systeme beschrieben (zum Beispiel die Csy4-Endoribonuklease in Pseudomonas aeroginosa (siehe Shah et al.), die eine unterschiedliche PAM-Sequenz (z. B. CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGG, NGGNG) erkennen. Es ist erwähnenswert, dass die Csy4 (auch als Cas6f bekannt) keine Sequenzhomologie zu Cas9 aufweist, die DNA-Spaltung jedoch über einen ähnlichen Mechanismus erfolgt, bei dem ein Cas-Protein-crRNA-Komplex konstruiert wird, der die Ziel-DNA-Erkennung erleichtert, was zu spezifischer DNA-Spaltung führt (Haurwitz et al.).
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Das in vitro rekonstituierte Typ-II-CRISPR/Cas-System wurde in einer Reihe unterschiedlicher Umgebungen adaptiert und angewandt. Hierzu zählen Erzeugen selektiver Genunterbrechung in einzelnen oder mehreren Genen in ES-Zellen und auch Unterbrechen einzelner oder mehrerer Gene mittels eines Ein-Schritt-Ansatzes unter Verwendung von Zygoten zur Erzeugung biallelischer Mutationen in Mäusen. Die Geschwindigkeit, Genauigkeit und die Effizienz, mit denen dieses System auf Genome Editing angewandt werden könnte, führt neben seiner Multiplex-Fähigkeit zu einer enormen Überlegenheit dieses Systems gegenüber seinen Vorgänger-Genome-Editing-Techniken, namentlich ZFNs (Zinc Finger Nucleases), TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) und konstruierten Homing-Meganukleasen (Gaj et al. & Perez-Pinera et al.). Diese wurden zwar erfolgreich in verschiedenen eukaryontischen Wirten eingesetzt, weisen aber alle wichtige Einschränkungen auf; insbesondere Off-Target-Mutagenese, die zu Toxizität in Verbindung mit Nuklease führt, und auch Entwicklungszeit und -kosten solcher konstruierter Proteine. Das CRISPR/Cas-System ist dagegen ein überlegenes Genome-Editing-System, mit dem sich Mutationen relativ einfach einführen lassen, indem man einfach eine einzelne Guided-RNA konstruiert, die zu der Protospacer-Sequenz auf der Ziel-DNA komplementär ist.
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Der durch eine Endonuklease wie Cas9 induzierte dsDNA-Bruch wird anschließend über einen NHEJ(Non-homologous End Joining)-Mechanismus repariert, wobei die anschließende DNA-Reparatur an der Bruchstelle mit unterschiedlichen und unvorhersehbaren Inserierten oder Deletionen (Indels) variierender Größe zusammengefügt wird. Dies ist sehr unerwünscht, wenn ein präzises Nukleinsäure- oder Genome Editing erforderlich ist. Allerdings kann eine vorbestimmte präzise Mutation mittels HDR (Homology Directed Repair) erzeugt werden, z. B. unter Einschluss eines Donor-Oligos oder Donor-DNA-Fragments. Es konnte gezeigt werden, dass durch diesen Ansatz mit Cas9-Nuklease präzise vorbestimmte Mutationen erzeugt werden, aber die Effizienz, mit der dies in beiden Allelen vorkommt, ist niedrig, wobei eine Mutation in einem der Stränge des dsDNA-Ziels beobachtet wird (Wang et al.).
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Das CRISPR/Cas-System weist somit in seiner gegenwärtigen Form gewisse Einschränkungen auf. Während die Möglichkeit besteht, eine gewünschte Sequenz in einem Strang von dsDNA zu modifizieren, wird die Sequenz im anderen Strang häufig durch unerwünschtes NHEJ mutiert.
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KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
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In einer ersten Auslegung der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt: –
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Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender dsDNA und
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden im ersten Strang;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wodurch ein modifizierter erster Strang erhalten wird; wodurch DNA erhalten wird, wobei der erste Strang durch die Rekombination modifiziert wurde, der zweite Strang aber nicht modifiziert wurde; und
- (c) gegebenenfalls Replizieren des modifizierten ersten Strangs unter Erhalt einer Nachkommen-dsDNA, wobei jeder Strang davon eine Kopie der inserierten Nukleotidsequenz umfasst; und Isolieren der Nachkommen-dsDNA umfasst.
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In einer zweiten Auslegung der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt: –
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Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden in einem einzelnen Nukleinsäurestrang;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wobei die Insertionssequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die inserierte Nukleotidsequenz umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs.
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In einer dritten Auslegung der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt: –
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Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung erster und zweiter Brüche in einem Nukleinsäurestrang, wodurch geschnittene 5'- und 3'-Enden und eine zwischen den Enden liegende Nukleotidsequenz entstehen;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Deletion der Nukleotidsequenz; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die Deletion umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs.
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In einer vierten Auslegung der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt: –
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Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender dsDNA und
- (a) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines geschnittenen Endes im ersten Strang 3' von einem PAM-Motiv;
- (b) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines Schnitts im zweiten Strang an einer Position, die einer Position 3' vom geschnittenen Ende des Strangs aus Teil (a) entspricht, wobei der Schnitt 3' vom PAM-Motiv liegt;
- (c) Bereitstellen einer ersten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (a) liegenden Sequenz hybridisiert
- (d) Bereitstellen einer zweiten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (b) liegenden Sequenz hybridisiert, umfasst,
wobei die Nukleinsäurestränge aus Teil (a) und Teil (b) unter Erhalt einer Deletion von Nukleinsäure zwischen den Schnitten repariert werden.
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In Aspekten der Auslegungen der Erfindung wird ein Verfahren einer sequentiellen Endonuklease vermittelnden Homologie-gerichteten Rekombination (Sequential Endonuclease-mediated Homology Directed Recombination, sEHDR) bereitgestellt, das ein erstmaliges Durchführen des Verfahrens einer vorhergehenden Auslegung und das Durchführen des Verfahrens einer vorhergehenden Auslegung zum zweiten Mal umfasst. Auf diese Weise ermöglicht die Erfindung das zwei- oder mehrmalige Durchführen aufeinander folgender Nukleinsäuremodifikationen, z. B. Genommodifikationen, die präzise Sequenzdeletionen, -insertionen oder Kombinationen davon umfassen können. So kann dieser Aspekt der Erfindung beispielsweise für ein ”Walk Along” an Nukleinsäuren (z. B. Chromosomen in Zellen) verwendet werden, um relativ große und präzise Nukleotidsequenzdeletionen oder -insertionen herzustellen. In einer Ausführungsform werden eine oder mehrere Cas-Endonukleasen (z. B. eine Cas9 und/oder Cys4) bei einem Verfahren zur sequentiellen Cas-vermittelten homologie-gesteuerten Rekombination (Sequential Cas-mediated Homology Directed Recombination, sCHDR) verwendet.
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In einem weiteren Aspekt lässt sich die Erfindung gemäß den nachfolgenden nummerierten Sätzen beschreiben:
- 1. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender dsDNA und
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden im ersten Strang;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wodurch ein modifizierter erster Strang erhalten wird; wodurch DNA erhalten wird, wobei der erste Strang durch die Rekombination modifiziert wurde, der zweite Strang aber nicht modifiziert wurde; und
- (c) gegebenenfalls Replizieren des modifizierten ersten Strangs unter Erhalt einer Nachkommen-dsDNA, wobei jeder Strang davon eine Kopie der inserierten Nukleotidsequenz umfasst; und Isolieren der Nachkommen-dsDNA umfasst.
- 2. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden in einem einzelnen Nukleinsäurestrang;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wobei die Insertionssequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die inserierte Nukleotidsequenz umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs.
- 3. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei die Insertionssequenz eine orthologe oder homologe Sequenz des Strangs ersetzt.
- 4. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei die Insertionsnukleotidsequenz eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden aufweist.
- 5. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei die Insertionssequenz eine stellenspezifische Rekombinationsstelle umfasst.
- 6. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung erster und zweiter Brüche in einem Nukleinsäurestrang, wodurch geschnittene 5'- und 3'-Enden und eine zwischen den Enden liegende Nukleotidsequenz entstehen;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Deletion der Nukleotidsequenz; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die Deletion umfassenden Tochternukleinsäurestrangs.
- 7. Verfahren nach Satz 6, wobei die deletierte Sequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
- 8. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (c) erfolgt, indem eine den modifizierten ersten Strang umfassende Zelle isoliert oder ein nichtmenschliches Wirbeltier, bei dem das Verfahren durchgeführt wurde, oder eine Nachkommenschaft davon erhalten wird.
- 9. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei es sich bei dem Nukleinsäurestrang oder dem ersten Strang um einen DNA-Strang handelt.
- 10. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei das Produkt des Verfahrens einen Nukleinsäurestrang umfasst, der ein PAM-Motiv 3' von der Insertion oder Deletion umfasst.
- 11. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind.
- 12. Verfahren nach Satz 11, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer eine vom ersten und zweiten Homologiearm flankierte Insertionsnukleotidsequenz umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Insertionsnukleotidsequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden inseriert ist.
- 13. Verfahren nach Satz 12, wobei die Insertion die in einem der Sätze 3 bis 5 genannte Bedeutung hat und keine weitere Sequenz zwischen den Homologiearmen liegt.
- 14. Verfahren nach einem der Sätze 11 bis 13, wobei die Homologiearme jeweils eine Länge von wenigstens 20 zusammenhängenden Nukleotiden aufweisen.
- 15. Verfahren nach einem der Sätze 11 bis 14, wobei der erste und/oder zweite Homologiearm ein PAM-Motiv umfasst.
- 16. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei in Schritt (a) durch Cas-Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet wird; gegebenenfalls mittels Erkennung eines GG- or NGG-PAM-Motivs.
- 17. Verfahren nach Satz 16, wobei zum Schneiden in Schritt (a) eine Nickase verwendet wird.
- 18. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei das Verfahren in einer Zelle, z. B. einer eukaryontischen Zelle, durchgeführt wird.
- 19. Verfahren nach Satz 18, wobei das Verfahren in einer Säugerzelle durchgeführt wird.
- 20. Verfahren nach Satz 18, wobei es sich bei der Zelle um eine Nager- (z. B. Maus-), ES-Zelle oder Zygote handelt.
- 21. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei das Verfahren bei einem nichtmenschlichen Säuger, z. B. einer Maus oder Ratte oder einem Kaninchen, durchgeführt wird.
- 22. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei jede Spaltstelle von PAM-Motiv (z. B. einer NGG- oder NGGNG-Sequenz, wobei N für eine beliebige Base und G für ein Guanin steht) flankiert ist.
- 23. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei das 3'-Ende 3' von einem PAM-Motiv flankiert ist.
- 24. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (a) durch Spaltung in einem einzigen Strang von dsDNA durchgeführt wird.
- 25. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (a) durchgeführt wird, indem in einer Zelle der Nukleinsäurestrang, eine Cas-Endonuklease, eine crRNA und eine tracrRNA (z. B. bereitgestellt von einer oder mehreren gRNAs) mit dem Ziel, dass die Endonuklease die Spaltung durchführt, und gegebenenfalls eine Insertionssequenz zur homologen Rekombination mit dem Nukleinsäurestrang kombiniert werden.
- 26. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination mit einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei der zweite Homologiearm eine PAM-Sequenz umfasst, so dass durch homologe Rekombination zwischen dem zweiten Homologiearm und der sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz eine ein PAM-Motiv umfassende Sequenz im Produkt des Verfahrens entsteht.
- 27. Verfahren einer sequentiellen durch Endonuklease vermittelten homologie-”ten Rekombination (Sequential Endonuclease-mediated Homology Directed Recombination, sEHDR), umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem vorhergehenden Satz (z. B. wenn gemäß Satz 1 eine Nickase zum Schneiden eines dsDNA-Einzelstrangs verwendet wird; oder wenn in Abhängigkeit von Satz 2 oder 5 eine Nuklease zum Schneiden beider Stränge von dsDNA verwendet wird) ein erstes Mal und ein zweites Mal, wobei in Schritt (a) jeweils durch Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet wird; wobei das Produkt des ersten Mals zur durch Endonuklease vermittelten Spaltung beim zweiten Mal verwendet wird, wobei entweder (i) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten Mal bzw. bei den zweiten Malen deletiert werden; (ii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal deletiert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal eingefügt wird; (iii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal eingefügt und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal deletiert wird; oder (iv) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten bzw. zweiten Mal eingefügt werden; gegebenenfalls wobei die Nukleinsäurestrangmodifikation beim zweiten Mal innerhalb von 20 oder weniger Nukleotiden von der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal liegt.
- 28. Verfahren nach Satz 27, wobei das erste Mal gemäß Anspruch 6 durchgeführt wird, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, wobei Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; und/oder das zweite Mal gemäß Satz 6 durchgeführt wird, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, so dass Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; gegebenenfalls wobei der zweite Arm ein PAM-Motiv umfasst, so dass das Produkt des zweiten Mals ein PAM-Motiv zur Verwendung bei einem nachfolgenden durch Cas-Endonuklease vermittelten Verfahren gemäß einem der Sätze 1 bis 26 umfasst.
- 29. Verfahren nach Satz 27, wobei das erste Mal gemäß Satz 1 oder 2 durchgeführt wird, wobei die hereinkommende Nukleinsäure die Insertionssequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, wobei die Insertionssequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination inseriert ist; und/oder das zweite Mal gemäß Satz 1 oder 2 durchgeführt wird, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei die Insertionssequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination inseriert ist; gegebenenfalls wobei der zweite Arm ein PAM-Motiv umfasst, so dass das Produkt des zweiten Mals ein PAM-Motiv zur Verwendung bei einem nachfolgenden durch Cas-Endonuklease vermittelten Verfahren gemäß einem der Sätze 1 bis 26 umfasst.
- 30. Verfahren nach Satz 27, wobei entweder das erste Mal oder das zweite Mal wie in Satz 28 angegeben durchgeführt und das jeweils andere Mal wie in Satz 29 angegeben durchgeführt wird, wobei wenigstens eine Sequenzdeletion und wenigstens eine Sequenzinsertion erfolgt.
- 31. Verfahren nach einem vorhergehenden Satz, wobei Schritt (a) unter Verwendung von durch Cas-Endonuklease vermittelter Spaltung und einer eine crRNA und eine tracrRNA umfassenden gRNA durchgeführt wird.
- 32. Verfahren nach Satz 25 oder 31, wobei die crRNA die Struktur 5'-X-Y-3' aufweist, wobei X für eine RNA-Nukleotidsequenz (gegebenenfalls mit einer Länge von wenigstens 5 Nukleotiden) und Y für eine ein Nukleotidmotiv, das mit einem von der tracrRNA umfassten Motiv hybridisiert, umfassende crRNA-Sequenz steht, wobei X zur Hybridisierung mit einer sich 5' von der gewünschten Stelle des geschnittenen 5'-Endes erstreckenden Nukleotidsequenz fähig ist.
- 33. Verfahren nach Satz 25, 31 oder 32, wobei Y für 5'-N1UUUUAN2N3GCUA-3' (SEQ ID NO: 3) steht, wobei N1-3 jeweils für ein A, U, C oder G stehen und/oder die tracrRNA die Sequenz (in 5'-nach-3'-Orientierung) UAGCMIUUAAAAM2 (SEQ ID NO: 4) umfasst, wobei M1 für eine Spacer-Nukleotidsequenz und M2 für ein Nukleotid steht.
- 34. Herstellungsverfahren für eine Zelle oder einen transgenen nichtmenschlichen Organismus, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Durchführen des Verfahrens nach einem vorhergehenden Anspruch für
- (i) ein Knock-out einer Zielnukleotidsequenz im Genom einer ersten Zelle und/oder
- (ii) ein Knock-in einer Insertionsnukleotidsequenz in das Genom einer ersten Zelle, gegebenenfalls wobei die Insertionssequenz eine Zielsequenz ganz oder teilweise am endogenen Ort der Zielsequenz im Genom ersetzt; wobei sich die Zelle oder eine Nachkommenschaft davon zu einem nichtmenschlichen Organismus bzw. einer Zelle entwickeln kann; und
- (b) Entwickeln der Zelle oder Nachkommenschaft zu einem nichtmenschlichen Organismus oder einer nichtmenschlichen Zelle.
- 35. Verfahren nach Satz 34, wobei der Organismus bzw. die Zelle homozygot für die Modifikation (i) und/oder (ii) ist.
- 36. Verfahren nach Satz 34 oder 35, wobei es sich bei der Zelle um eine ES-Zelle, iPS-Zelle, totipotente Zelle oder pluripotente Zelle handelt.
- 37. Verfahren nach einem der Sätze 34 bis 36, wobei es sich bei der Zelle um eine Nagerzelle (z. B. eine Maus- oder Rattenzelle) handelt.
- 38. Verfahren nach einem der Sätze 34 bis 37, wobei es sich bei der Zielsequenz um eine endogene Sequenz handelt, die ein regulatorisches Element ganz oder teilweise umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
- 39. Verfahren nach einem der Sätze 34 bis 38, wobei die Insertionssequenz eine synthetische Sequenz ist; oder eine Sequenz umfasst, die ein Protein aus einer anderen Spezies als der Spezies, von der die erste Zelle stammt, ganz oder teilweise codiert; oder ein regulatorisches Element aus der ersten Spezies umfasst.
- 40. Verfahren nach Satz 39, wobei die Insertionssequenz ein menschliches Protein oder eine menschliche Proteinuntereinheit oder -domäne ganz oder teilweise codiert.
- 41. Zelle oder nichtmenschlicher Organismus, deren bzw. dessen Genom eine eine von endogenen Nukleotidsequenzen flankierte nicht endogene Nukleotidsequenz umfassende Modifikation umfasst, wobei die Zelle bzw. der Organismus mit dem Verfahren nach einem der Sätze 24 bis 40 erhältlich ist und wobei die nicht endogene Sequenz 3' von einem Cas-PAM-Motiv flankiert ist; wobei die Zelle nicht von einem Menschen umfasst wird; und einer, mehrere oder alle der Punkte (a) bis (d) zutrifft bzw. zutreffen
- (a) das Genom ist homozygot für die Modifikation; oder umfasst die Modifikation an einem Allel und ist am anderen Allel unmodifiziert von Cas-vermittelter homologer Rekombination;
- (b) die nicht endogene Sequenz umfasst ein regulatorisches Element ganz oder teilweise oder codiert ein Protein ganz oder teilweise;
- (c) die nicht endogene Sequenz ist wenigstens 20 Nukleotide lang;
- (d) die nicht endogene Sequenz ersetzt eine orthologe oder homologe Sequenz im Genom.
- 42. Zelle oder Organismus nach Satz 41, wobei es sich bei der nicht endogenen Sequenz um eine menschliche Sequenz handelt.
- 43. Zelle oder Organismus nach Satz 41 oder 42, wobei das PAM-Motiv eine aus CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT und GAA ausgewählte Sequenz umfasst.
- 44. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 43, wobei sich ein PAM-Motiv nicht mehr als 10 Nukleotide (z. B. 3 Nukleotide) 3' von der nicht endogenen Sequenz befindet.
- 45. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 44, wobei das PAM-Motiv von einer Streptococcus-Cas9 erkannt wird.
- 46. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 45, wobei es sich um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier handelt, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der schweren Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der schweren Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
- 47. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 46, wobei es sich um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier handelt, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der kappa-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
- 48. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 47, wobei es sich um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier handelt, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der lambda-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
- 49. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 46 bis 48, wobei die nicht endogene Sequenz ein menschliches Fc-Rezeptorprotein oder eine Untereinheit oder Domäne davon (z. B. ein menschliches FcRn- oder FcY-Rezeptorprotein, -Untereinheit oder -Domäne) codiert.
- 50. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 48, wobei die nicht endogene Sequenz ein oder mehrere menschliche Antikörper-Gensegmente, eine variable Antikörperregion oder eine konstante Antikörperregion umfasst.
- 51. Zelle oder Organismus nach einem der Sätze 41 bis 50, wobei es sich bei der Insertionssequenz um eine menschliche Sequenz handelt, die eine orthologe nichtmenschliche Sequenz ersetzt oder ergänzt.
- 52. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, hergestellt durch Immunisierung eines Wirbeltiers (z. B. Maus oder Ratte) gemäß einem der Sätze 41 bis 51 mit einem Antigen.
- 53. Isolierungsverfahren für einen Antikörper, der ein vorbestimmtes Antigen bindet, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Bereitstellen eines Wirbeltiers (gegebenenfalls einer Maus oder Ratte) gemäß einem der Sätze 41 bis 51;
- (b) Immunisieren des Wirbeltiers mit dem Antigen;
- (c) Entfernen von B-Lymphozyten aus dem Wirbeltier und Auswählen eines oder mehrerer B-Lymphozyten, die Antikörper exprimieren, die an das Antigen binden;
- (d) gegebenenfalls Immortalisieren der ausgewählten B-Lymphozyten oder Nachkommenschaft davon, gegebenenfalls indem Hybridomen davon produziert werden; und
- (e) Isolieren eines von den B-Lymphozyten exprimierten Antikörpers (z. B. eines IgG-Typ-Antikörpers).
- 54. Verfahren nach Satz 53, mit dem Schritt eines Isolierens von den Antikörper, der das Antigen bindet, codierender Nukleinsäure aus den B-Lymphozyten; gegebenenfalls Austauschen der Nukleotidsequenz der konstanten Region der schweren Kette des Antikörpers gegen eine eine menschliche oder humanisierte konstante Schwerkettenregion codierende Nukleotidsequenz und gegebenenfalls Affinitätsreifen der variablen Region des Antikörpers; und gegebenenfalls Inserieren der Nukleinsäure in einen Expressionsvektor und gegebenenfalls einen Wirt.
- 55. Verfahren nach Satz 53 oder 54, ferner umfassend Herstellen einer Mutante oder eines Derivats des mit dem Verfahren nach Anspruch 53 oder 54 produzierten Antikörpers.
- 56. Verwendung eines isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemäß Satz 52 oder eines mutierten oder derivatisierten Antikörpers davon, der das Antigen bindet, bei der Fertigung einer Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel.
- 57. Verwendung eines isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemäß Satz 52 oder eines mutierten oder derivatisierten Antikörpers davon, der das Antigen bindet, zur Verwendung in der Medizin.
- 58. Nukleotidsequenz, codierend einen Antikörper nach Satz 52, gegebenenfalls wobei die Nukleotidsequenz Teil eines Vektors ist.
- 59. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den oder die Antikörper nach Satz 52 und ein Verdünnungs-, Hilfs- oder Trägermittel.
- 60. ES-Zelle, eukaryontische Zelle, Säugerzelle, nichtmenschliches Tier oder nichtmenschliche Blastozyste, umfassend eine exprimierbare genomisch integrierte Nukleotidsequenz, die eine Cas-Endonuklease codiert.
- 61. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Satz 60, wobei die Endonuklease-Sequenz konstitutiv exprimierbar ist.
- 62. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Satz 60, wobei die Endonuklease-Sequenz induzierbar exprimierbar ist.
- 63. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Satz 60, 61 oder 62, wobei die Endonuklease-Sequenz gewebespezifisch oder stadiumspezifisch im Tier oder in einer Nachkommenschaft davon oder in einem nichtmenschlichen Tier, bei dem es sich um einen Abkömmling der Zelle oder Blastozyste handelt, exprimierbar ist.
- 64. Zelle oder Tier nach Satz 63, wobei es sich bei der Zelle um eine nichtmenschliche Embryozelle oder bei dem Tier um einen nichtmenschlichen Embryo handelt, wobei die Endonuklease-Sequenz in der Zelle oder dem Embryo exprimierbar ist oder exprimiert wird.
- 65. Zelle oder Tier nach Satz 64, wobei die Endonuklease in operativer Verknüpfung mit einem aus der aus einem embryospezifischen Promotor (z. B. einem Nanog-Promotor, einem Pou5fl-Promotor oder einem SoxB-Promotor) bestehenden Gruppe ausgewählten Promotor steht.
- 66. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einem der Sätze 60 bis 65, wobei sich die Cas-Endonuklease an einem Rosa-26-Locus befindet.
- 67. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einem der Sätze 60 bis 65, wobei die Cas-Endonuklease mit einem Rosa-26-Promotor operativ verknüpft ist.
- 68. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einem der Sätze 60 bis 63, wobei die Cas-Endonuklease-Sequenz 5' und 3' von Transposonelementen (z. B. invertierten terminalen piggyBac-Elementen) oder stellenspezifischen Rekombinationsstellen (z. B. loxP und/oder einer lox-Mutante, z. B. lox2272 oder lox511; oder frt) flankiert ist.
- 69. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Satz 68, umfassend eine oder mehrere Restriktionsendonuklease-Stellen zwischen der Cas-Endonuklease-Sequenz und einem Transposonelement.
- 70. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einem der Sätze 60 bis 69, umfassend eine oder mehrere gRNAs.
- 71. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Satz 68, 69 oder 70, wobei die gRNA(s) 5' und 3' von Transposonelementen (z. B. invertierten terminalen piggyBac-Elementen) oder stellenspezifischen Rekombinationsstellen (z. B. loxP und/oder einer lox-Mutante, z. B. lox2272 oder lox511; oder frt) flankiert sind.
- 72. Verwendung der Zelle, des Tiers oder der Blastozyste nach einem der Sätze 60 bis 71 bei einem Verfahren gemäß einem der Sätze 1 bis 51 oder 73.
- 73. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender dsDNA und
- (a) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines geschnittenen Endes im ersten Strang 3' von einem PAM-Motiv;
- (b) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines Schnitts im zweiten Strang an einer Position, die einer Position 3' vom geschnittenen Ende des Strangs aus Teil (a) entspricht, wobei der Schnitt 3' vom PAM-Motiv liegt;
- (c) Bereitstellen einer ersten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (a) liegenden Sequenz hybridisiert
- (d) Bereitstellen einer zweiten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (b) liegenden Sequenz hybridisiert, umfasst, wobei die Nukleinsäurestränge aus Teil (a) und Teil (b) unter Erhalt einer Deletion von Nukleinsäure zwischen den Schnitten repariert werden.
- 74. Verfahren nach Satz 6, wobei die deletierte Sequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
- 75. Verfahren nach Satz 73 oder 74, wobei durch Cas-Endonuklease vermittelte Spaltung in Schritt (a) verwendet wird oder in Schritt (b) mittels Erkennung eines GG- or NGG-PAM-Motivs erfolgt.
- 76. Verfahren nach Satz 75, wobei zum Schneiden in Schritt (a) und/oder in Schritt (b) eine Nickase verwendet wird.
- 77. Verfahren nach Satz 73 oder 74, wobei zum Schneiden in Schritt (a) und/oder in Schritt (b) eine Nuklease verwendet wird.
- 78. Verfahren nach einem der Sätze 74 bis 77, wobei das Verfahren in einer Zelle, z. B. einer eukaryontischen Zelle, durchgeführt wird.
- 79. Verfahren nach Satz 78, wobei das Verfahren in einer Säugerzelle durchgeführt wird.
- 80. Verfahren nach Satz 78, wobei es sich bei der Zelle um eine Nager- (z. B. Maus-)ES-Zelle oder Zygote handelt.
- 81. Verfahren nach einem der Sätze 74 bis 80, wobei das Verfahren bei einem nichtmenschlichen Säuger, z. B. einer Maus oder Ratte oder einem Kaninchen, durchgeführt wird.
- 82. Verfahren nach einem der Sätze 74 bis 81, wobei jede Spaltstelle von PAM-Motiv (z. B. einer NGG- oder NGGNG-Sequenz, wobei N für eine beliebige Base und G für ein Guanin steht) flankiert ist.
- 83. Verwendung einer ersten und zweiten gRNA, um auf einen gewünschten Teil der Nukleinsäure zu zielen, wobei der zu deletierende Bereich definiert wird, bei einem Verfahren gemäß einem der Sätze 74 bis 82.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1A. Präzise DNA-Insertion an einem vorgegebenen Ort (KI): Gegen einen vorgegebenen Ort konstruierte gRNA kann mittels Cas9-D10A-Nickase 5' von der PAM-Sequenz (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten) DNA-Nick induzieren. Als Alternative kann gRNA zusammen mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen 5' von der PAM-Sequenz verwendet werden. Die Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie um den Bereich der Bruchstelle, enthaltend jegliche Form von DNA-Veränderungen, einschließlich Addition endogener oder exogener DNA, kann an der Bruchstellenverbindung, wo die DNA durch HDR repariert wird, präzise eingefügt werden.
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1B. Präzise DNA-Insertion an einem vorgegebenen Ort (KI): Diese Figur zeigt eine ausführlichere Beschreibung des in 1A beschriebenen Mechanismus. Gegen einen vorgegebenen Ort konstruierte sgRNA kann mittels Cas9-D10A-Nickase 5' von der PAM-Sequenz (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten) DNA-Nick induzieren. Als Alternative kann sgRNA zusammen mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen 5' von der PAM-Sequenz verwendet werden. Die Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologiearmen (HA) um den Bereich der Bruchstelle, enthaltend jegliche Form von DNA-Veränderungen, einschließlich Addition endogener oder exogener DNA, kann an der Bruchstellenverbindung, wo die DNA durch HDR repariert wird, präzise eingefügt werden.
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2A. Präzise DNA-Deletion (KO): Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende gRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können gRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 1 und 3' von PAM-2-Sequenz leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR. DNA-Reparatur über HDR reduziert die Gefahr von Indel-Bildung an den Bruchstellenverbindungen und vermeidet DNA-Reparatur über NHEJ, und damit wird der von der PAM-Sequenz flankierte Bereich herausdeletiert und DNA-Reparatur auf eine vorbestimmte und vorgegebene Weise durchgeführt.
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2B. Präzise DNA-Deletion (KO): Diese Figur zeigt eine ausführlichere Beschreibung des in 2A beschriebenen Mechanismus. Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende sgRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Anmerkung. Die PAMs können im Gegensatz zum in der Figur dargestellten Beispiel, wo beide PAMs auf dem gleichen DNA-Strang liegen, in gegenüberliegenden DNA-Strängen lokalisiert sein. Als Alternative können sgRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 1 und 3' von PAM-2-Sequenz leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR. DNA-Reparatur über HDR reduziert die Gefahr von Indel-Bildung an den Bruchstellenverbindungen und vermeidet DNA-Reparatur über NHEJ, und damit wird der von der PAM-Sequenz flankierte Bereich herausdeletiert und DNA-Reparatur auf eine vorbestimmte und vorgegebene Weise durchgeführt.
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3A: Präzise DNA-Deletion und -Insertion (KO → KI): Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende gRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können gRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 1 und 3' zu PAM 2 mit Einschluss zusätzlicher endogener oder exogener DNA leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR mit der gleichzeitigen Deletion des von DSB oder Nick flankierten Bereichs und der Insertion von interessierender DNA.
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3B: Präzise DNA-Deletion und -Insertion (KO → KI): Diese Figur zeigt eine ausführlichere Beschreibung des in 3A beschriebenen Mechanismus. Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende gRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können sgRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 1 und 3' zu PAM 2 mit Einschluss zusätzlicher endogener oder exogener DNA (DNA-Insertion) leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR mit der gleichzeitigen Deletion des von DSB oder Nick flankierten Bereichs und der Insertion von interessierender DNA. Anmerkung. Wiederum können die PAMs im Gegensatz zum in der Figur dargestellten Beispiel, wo beide PAMs auf dem gleichen DNA-Strang liegen, in gegenüberliegenden DNA-Strängen lokalisiert sein.
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4A: Recycling von PAM für Sequential Genome Editing (Deletionen): Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende gRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können gRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 2 und 3' von PAM 3 leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR, und damit wird der Bereich zwischen PAM 2 und PAM 3 herausdeletiert. Bei dieser Deletion bleibt PAM 3 erhalten, die somit als eine Stelle zum Durchführen einer weiteren Runde von CRISPR/Cas-vermitteltem Genome Editing fungiert. Eine weitere PAM-Stelle (z. B. PAM 1) kann in Verbindung mit PAM-3-Sequenz zum Durchführen einer weiteren Runde Deletion wie oben beschrieben verwendet werden. Mit diesem PAM-Recycling-Ansatz lassen sich viele Runden von Deletionen in einer Art schrittweiser Deletion ausführen, wobei nach jeder Runde ein PAM-3-Recycling erfolgt. Dieser Ansatz kann auch für die schrittweise Addition endogener oder exogener DNA verwendet werden.
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4B: Recycling von PAM für Sequential Genome Editing (Deletionen): Diese Figur zeigt eine ausführlichere Beschreibung des in 4A beschriebenen Mechanismus. Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende sgRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten, zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können sgRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition eines Donor-Oligos oder eines Donor-DNA-Fragments (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zum Bereich 5' von PAM 1 (transparenter PAM-Kasten) und 3' von PAM 2 (schwarzer PAM-Kasten) leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR, und damit wird der Bereich zwischen PAM 1 und PAM 2 herausdeletiert. PAM-Sequenz kann zusammen mit einmaliger gRNA in der eindringenden DNA enthalten sein und in die Editing-Stelle zurückgelenkt werden. Hierbei kann beispielsweise ein Recycling von PAM-1-Sequenz erfolgen, die somit als eine Stelle zum Durchführen einer weiteren Runde von CRISPR/Cas-vermitteltem Genome Editing fungiert. Eine weitere PAM-Stelle (z. B. PAM 3, grauer PAM-Kasten) kann in Verbindung mit der PAM-1-Sequenz nach Recycling zum Durchführen einer weiteren Runde Editing (d. h. Insertion) wie oben beschrieben verwendet werden. Mit diesem PAM-Recycling-Ansatz lassen sich viele Runden von Genome Editing schrittweise ausführen, wobei nach jeder Runde ein PAM-1-Recycling erfolgt. Dieser Ansatz kann auch für die schrittweise Addition endogener oder exogener DNA verwendet werden.
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5A: CRISPR/Cas-vermittelte Lox-Insertion zur Erleichterung von RMCE: Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende gRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können gRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition von zwei Donor-Oligos oder Donor-DNA-Fragmenten (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zu Bereichen 5' und 3' von jeder PAM-Sequenz, wobei die Donor-DNA Rekombinase-Erkennungssequenz (Recombinase Recognition Sequence, RRS) wie loxP und lox5171 enthält, leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR unter Einschluss dieser RRS. Die eingeführte RRS kann als ein Landeplatz zur Insertion beliebiger interessierender DNA mit hoher Effizienz und unter präziser Verwendung von durch Rekombinase vermitteltem Kassettenaustausch (Recombinase Mediated Cassette Exchange, RMCE) verwendet werden. Die beibehaltene PAM-2-Stelle kann für eine weitere Runde von CRISPR/Cas-vermitteltem Genome Editing zum Deletieren oder Inserieren interessierender DNA einem Recycling unterzogen werden. Zu beachten ist, dass die inserierte interessierende DNA Selektionsmarker wie PGK-Puro flankiert von PiggyBac-LTR enthalten könnte, um die erste Selektion zu gestatten, wobei nach erfolgreicher Integration in interessierende DNA der Selektionsmarker durch Exprimieren von hyperPbase-Transposase bequem entfernt werden kann.
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5B: CRISPR/Cas-vermittelte Lox-Insertion zur Erleichterung von RMCE: Diese Figur zeigt eine ausführlichere Beschreibung des in 5A beschriebenen Mechanismus. Auf einen flankierenden interessierenden Bereich zielende sgRNAs können mittels Cas9-D10A-Nickase an vorgegebenen Orten, die die gewünschten PAM-Sequenzen enthalten (dargestellt als gefüllter schwarzer Kasten), zwei DNA-Nicks induzieren. Als Alternative können sgRNAs mit Cas9-Wildtyp-Nuklease zur Induktion von zwei den interessierenden Bereich flankierenden DSB verwendet werden. Addition von zwei Donor-Oligos oder Donor-DNA-Fragmenten (einzel- oder doppelsträngig) mit Homologie zu Bereichen jeweils 5' und 3' von den PAM-Sequenzen, wobei die Donor-DNA Rekombinase-Erkennungssequenz (Recombinase Recognition Sequence, RRS) wie loxP und lox5171 enthält, leitet DNA-Reparatur auf präzise Weise über HDR unter Einschluss dieser RRS. Anmerkung. Das Zielen auf die lox-Stellen kann der Reihe nach oder als Pool in einem Ein-Schritt-Verfahren erfolgen. Die eingeführte RRS kann als ein Landeplatz zur Insertion beliebiger interessierender DNA mit hoher Effizienz und unter präziser Verwendung von durch Rekombinase vermitteltem Kassettenaustausch (RMCE) verwendet werden. Wie in 4 ausführlich dargestellt, kann die PAM-Sequenz für eine weitere Runde von CRISPR/Cas-vermitteltem Genome Editing zum Deletieren oder Insertion interessierender DNA einem Recycling unterzogen werden. Wahlweise könnte die inserierte interessierende DNA Selektionsmarker wie PGK-Puro flankiert von PiggyBac-LTR enthalten, um die erste Selektion zu gestatten, wobei nach erfolgreicher Integration in interessierende DNA der Selektionsmarker durch Exprimieren von hyperPbase-Transposase bequem entfernt werden kann.
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6A und 6B: Genom-Modifikation zur Erzeugung transposonausschneidbarer Cas9 und gRNA
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6C: Einzelkopie-Cas9-Expression: Ein Landeplatz kann zu Anfang in einen beliebigen Locus der Wahl als Ziel in Maus-ES-Zellen oder eine andere eukaryontische Zelllinie gelenkt werden. Der Landeplatz enthält typischerweise PiggyBac-5'- und -3'-LTR, Selektionsmarker wie neo, zum Beispiel floxed, und einen genlosen Promotor wie PGK in der dargestellten allgemeinen Konfiguration. Das Zielen erfolgt mittels homologer Rekombination, wobei Klone auf G418 selektioniert werden. Der nächste Schritt beinhaltet RMCE zur Insertion von über eine T2A-Sequenz mit Puro-delta-tk verknüpfter Cas9 mit der Wahlmöglichkeit der Insertion einer einzelnen oder mehrerer Guide-RNA unter Verwendung der einmaligen Restriktionsstellen (RS). Die Orientierung der lox-Stellen werden so positioniert, dass nur dann, wenn die eindringende DNA mit der Cas9 im Landeplatz inseriert ist, der PGK-Promotor auf dem Landeplatz die Transkription und somit die Expression des Puromycin und über das T2A-Transkribieren und Expression-Cas9-Produktion aktivieren kann. Mit diesem Ansatz lässt sich eine einfache stabile Expression von Cas9 erzielen. Nach 4–6 Tagen Selektion auf Puromycin kann die gesamte Cas9- und -Guide-RNA-floxed-Kassette unter Verwendung von PiggyBac-Transposase (Pbase) ausgeschnitten werden, wobei einzelne Klone auf Genome Editing als Ergebnis der eingeführten Guide-RNA analysiert werden können. Als Wahlmöglichkeit kann eine Cas9 exprimierende stabile Zellbanklinie erzeugt werden, aus der mehrere konstruierte Zelllinien erzeugt werden können. Hierzu wird auf der RMCE-Stufe nur Cas9-T2A-Puro-delta-tk und keine gRNA eingefügt. Hierdurch wird eine allgemeine Einzelkopie-Cas9 exprimierende Zelllinie erhalten, wobei ihr Genom durch Transfizieren einzelner oder mehrerer gRNA editiert werden kann.
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7: Schema, das die gRNA-Position in Bezug auf Gen X, die Struktur des Targeting-Vektors und das zur Genotypisierung der erhaltenen Zielklone verwendete Oligopaar darstellt.
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8: Ein Gelbild, das die Genotypisierungsergebnisse nach durch Cas9-Nuklease vermitteltem DNA-Doppelstrangbruch und dem anschließenden DNA-Targeting zeigt. Die Genotypisierung zeigt PCR-Produkt (880 bp), das für den 5'-Ziel-Homologiearm unter Verwendung von Oligopaar HAP341/HAP334 spezifisch ist. Die Gele auf der linken Seite zeigen Genotypisierungsdaten von 96 ES-Zellklonen, die mit gRNA, menschlicher Cas9-Nuklease und entweder einem zirkulären Targeting-Vektor (Tafel 1) oder einem linearen Targeting-Vektor (Tafel 2) transfiziert wurden. Die Gele auf der rechten Seite zeigen 96 ES-Zellklone, die mit gRNA und entweder einem zirkulären Targeting-Vektor (Tafel 3) oder einem linearen Targeting-Vektor (Tafel 4), aber mit keiner menschlichen Cas9-Nuklease transfiziert wurden. Für jede Transfektion ist der Prozentsatz der korrekt anvisierten Klone dargestellt.
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9: Schema, das die Position der gRNAs auf einem Gen zeigt, um eine definierte Deletion des Bereichs zwischen den beiden gRNA zu gestatten. Das Oligopaar Primer 1 und 2 wurde zum Nachweisen von ES-Klonen mit der spezifischen 55-bp-Deletion verwendet.
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10: Ein 3%-Agarose-Gel mit aus 96 mit gRNA 1 und 2 transfizierten ES-Klonen amplifizierten PCR-Produkten. Primer 1 und 2 wurden zum Amplifizieren um die beiden gRNA herum verwendet, wobei alle Klone, die die definierte Deletion enthalten, als kleineres PCR-Produkt erkennbar sind, die durch ein Sternchen hervorgehoben sind.
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11: PCR-Genotypisierung durch Amplifizieren der 5'- (oberes Gel) und 3'-(unteres Gel)Ziel-Homologiearme im auf Chromosom 6 lokalisierten Rosa26-Gen. Korrekt anvisierte Klone, die PCR-Produkt für sowohl 5'- als auch 3'-Verbindungsstelle ergeben, sind mit einem Sternchen markiert.
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12: Genotypisierung für die korrekte Insertion der Cas9-DNA-Kassette durch PCR-Amplifizieren des 5'-(oberes Gel) und 3'-(unteres Gel)Arms der inserierten DNA-Kassette.
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13: PCR-Genotypisierung durch Amplifizieren des Bereichs um die Guide-RNA und Beurteilen des PCR-Produkts hinsichtlich des Vorliegens von Indels. Größere Indels sind direkt aus dem Gel erkennbar, da sie PCR-Produkt ergeben, das kürzer als die erwartete WT-DNA ist, was auf signifikante Deletion schließen lässt. Für die Positivkontrolle wurde genomische DNA aus Maus AB2.1 verwendet, um die Größe des entsprechenden WT-PCR-Produkts zu bestimmen. Bei der Negativkontrolle handelte es sich um eine Keine-DNA-Wasser-Kontrolle
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14: PCR-Amplifikation des die Guide-RNA flankierenden Bereichs unter Verwendung von aus Jungtieren nach Zygoten-Cas9/Guide-mRNA-Injektion extrahierter DNA zur Analyse von Indel-Bildung. Spur 14 zeigt eine Brutto-Deletion in dieser Maus, wobei die mit einem Sternchen markierten Spuren anzeigen, dass diese Mäuse kleinere Indels enthalten.
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Tabelle 3: Zusammenfassung der Sequenzierdaten von den 8 analysierten Mäusen, wobei die Einzelheiten der nachgewiesenen Indels dargestellt sind. Die Zahl bezieht sich auf die Häufigkeit des jeweiligen in den analysierten Klonen identifizierten Indels, wobei die Beschreibung der Indels in Klammern dargestellt ist.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der Erfindung liegt die Notwendigkeit verbesserter Nukleinsäuremodifikationstechniken zugrunde. Ein Beispiel für eine Technik zur Nukleinsäuremodifikation ist die Anwendung des CRISPR/Cas-Systems. Es hat sich gezeigt, dass dieses System das bislang fortgeschrittenste verfügbare Genome-Editing-System ist, was unter anderem an seiner breiten Anwendung, der relativen Geschwindigkeit, mit der Genome editiert werden können, um Mutationen zu erzeugen, und seiner Benutzerfreundlichkeit liegt. Es bestand jedoch der Glaube daran, dass sich diese Technologie für noch breitere Anwendungen als aus dem Stand der Technik ersichtlich weiterentwickeln lässt.
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Es wurde erkannt, dass ein wichtiger Aspekt, um dies zu erreichen, darin bestünde, einen Weg zu finden, um die Genauigkeit von Nukleinsäuremodifikationen über die von den im Stand der Technik bekannten CRISPR/Cas-Verfahren vorgesehene Genauigkeit hinaus zu verbessern.
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Darüber hinaus wurde festgestellt, dass bisher nur über bescheidene Nukleinsäuremodifikationen berichtet worden war. Es wäre wünschenswert, relativ große vorgegebene und präzise DNA-Deletionen oder -Insertionen unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems zu realisieren.
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Es wurde ein Ansatz zur Einführung einer oder mehrerer gewünschter Insertionen und/oder Deletionen mit bekannten Größen in eine oder mehrere vorbestimmte Stellen in einer Nukleinsäure (z. B. in einem Zell- oder Organismusgenom) entwickelt. Dabei wurden Techniken entwickelt, um dies entweder der Reihe nach oder durch Insertion eines diskreten DNA-Fragments definierter Größe in das Genom genau an einer vorbestimmten Stelle bzw. Ausführen einer diskreten Deletion mit einer definierten Größe an einer exakten Stelle durchzuführen. Die Technik beruht auf der Beobachtung, dass DNA-Einzelstrangbrüche vorzugsweise über den HDR-Weg repariert werden, was die Wahrscheinlichkeit von Indels (z. B. durch NHEJ produziert) in der vorliegenden Erfindung verringert und somit effizienter als Techniken des Stands der Technik ist.
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Hierzu stellt die Erfindung bereit: –
Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender Doppelstrang-DNA (dsDNA) und
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden im ersten Strang; und
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wodurch ein modifizierter erster Strang erhalten wird; wodurch DNA erhalten wird, wobei der erste Strang durch die Rekombination modifiziert wurde, der zweite Strang aber nicht modifiziert wurde, umfasst.
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Gegebenenfalls umfasst das Verfahren ferner Replizieren des modifizierten ersten Strangs unter Erhalt einer Nachkommen-dsDNA, wobei jeder Strang davon eine Kopie der Insertionsnukleotidsequenz umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Verfahren (c) Isolieren der Tochter-dsDNA, z. B. indem eine die Tochter-dsDNA enthaltende Zelle gewonnen wird. Replikation kann zum Beispiel in einer Zelle realisiert werden. Beispielsweise werden Schritt (a) und (b) in einer Zelle durchgeführt, und die Zelle wird repliziert, wobei die Zellmaschinerie den modifizierten ersten Strang repliziert, z. B. um eine dsDNA-Tochter zu erzeugen, bei der jeder Strang die Modifikation umfasst.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung der aus Schritt (b) erhaltene modifizierte DNA-Strang isoliert.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung das Verfahren in vitro durchgeführt. Zum Beispiel wird das Verfahren in einer Zelle oder Zellpopulation in vitro durchgeführt.
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Als Alternative wird gegebenenfalls in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung das Verfahren durchgeführt, um das Genom eines Virus zu modifizieren.
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Als Alternative wird gegebenenfalls in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung das Verfahren in vivo in einem Organismus durchgeführt. In einem Beispiel handelt es sich bei dem Organismus um einen nichtmenschlichen Organismus. In einem Beispiel handelt es sich dabei um eine Pflanze oder ein Tier oder ein Insekt oder ein Bakterium oder eine Hefe. Zum Beispiel wird das Verfahren an einem Wirbeltier (z. B. einem menschlichen Patienten oder einem nichtmenschlichen Wirbeltier (z. B. einem Vogel, z. B. einem Huhn) oder nichtmenschlichen Säuger wie etwa einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen) praktiziert.
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Gegebenenfalls handelt es sich in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung bei dem Verfahren um ein kosmetisches Behandlungsverfahren für einen Menschen oder um ein nicht therapeutisches, nicht chirurgisches, nicht diagnostisches Verfahren, praktiziert z. B. an einem Menschen oder einem nichtmenschlichen Wirbeltier oder Säuger (z. B. einer Maus oder einer Ratte).
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Durch die Erfindung wird ebenso bereitgestellt:
ein Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung geschnittener 5'- und 3'-Enden in einem einzelnen Nukleinsäurestrang;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Insertion einer Nukleotidsequenz zwischen den Enden, wobei die Insertionssequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die inserierte Nukleotidsequenz umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs, z. B. durch Gewinnen einer den Nachkommennukleinsäurestrang enthaltenden Zelle.
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In einem Beispiel ist der Nachkommenstrang ein Produkt der Replikation des von Schritt (b) produzierten Strangs. Der Nachkommenstrang wird beispielsweise durch Nukleinsäurereplikation in einer Zelle produziert. Beispielsweise werden Schritt (a) und (b) in einer Zelle durchgeführt, und die Zelle wird repliziert, wobei die Zellmaschinerie den in Schritt (b) produzierten modifizierten Strang repliziert, z. B. um eine dsDNA-Nachkommenschaft zu erzeugen, bei der jeder Strang die Modifikation umfasst.
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In einem Beispiel handelt es sich bei dem Nukleinsäureeinzelstrang um einen DNA- oder RNA-Strang.
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In einem Beispiel handelt es sich bei dem regulatorischen Element um einen Promotor oder Enhancer.
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Gegebenenfalls handelt es sich in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung bei der inserierten Nukleotidsequenz um eine Pflanzen-, Tier-, Wirbeltier- oder Säugersequenz, z. B. eine menschliche Sequenz. Die Sequenz codiert beispielsweise ein vollständiges Protein, Polypeptid, Peptid, eine vollständige Domäne oder mehrere (z. B. ein, zwei oder mehr) von diesen. In einem Beispiel verleiht die eingefügte Sequenz einer die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte modifizierte Nukleinsäure umfassenden Zelle eine Resistenzeigenschaft (z. B. Herbizid-, virale oder bakterielle Resistenz). In einem Beispiel codiert die eingefügte Sequenz ein Interleukin, einen Rezeptor (z. B. einen Zelloberflächenrezeptor), Wachstumsfaktor, ein Hormon, einen Antikörper (oder eine variable Domäne oder Bindungsstelle davon), einen Antagonisten, Agonisten; z. B. eine menschliche Version von diesen. In einem Beispiel ist die eingefügte Sequenz ein Exon.
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Gegebenenfalls ersetzt in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung die eingefügte Nukleotidsequenz eine orthologe oder homologe Sequenz des Strangs (z. B. handelt es sich bei der Insertion um eine menschliche Sequenz, die eine pflanzliche, menschliche oder Maus-Sequenz ersetzt). Beispielsweise wird das Verfahren in einer Maus oder Mauszelle (wie etwa einer ES-Zelle) durchgeführt, wobei die Insertion eine orthologe oder homologe Maus-Sequenz (z. B. ein bei einer Krankheit impliziertes biologisches Maus-Zielprotein) ersetzt. Zum Beispiel wird das Verfahren (z. B. in vitro) in einer menschlichen Zelle durchgeführt, wobei die Insertion eine orthologe oder homologe menschliche Sequenz ersetzt (z. B. wird ein bei einer Krankheit impliziertes biologisches menschliches Zielprotein, z. B. eine mutierte Form einer Sequenz durch eine andere (z. B. Wildtyp-)menschliche Sequenz ersetzt, was bei der Korrektur eines Gendefekts in der Zelle von Nutzen sein kann. In dieser Ausführungsform kann es sich bei der Zelle um eine menschliche ES- oder iPS- oder totipotente oder pluripotente Stammzelle handeln, die anschließend in einen menschlichen Patienten bei einem Gentherapieverfahren zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer medizinischen Krankheit oder eines medizinischen Leidens bei dem Patienten eingeführt werden kann).
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Gegebenenfalls weist in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung die inserierte Nukleotidsequenz eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden, z. B. wenigstens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder 900 Nukleotiden, oder wenigstens 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 oder 100 kb auf.
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Gegebenenfalls umfasst in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung die Insertionssequenz eine stellenspezifische Rekombinationsstelle, z. B. eine lox-, frt- oder rox-Stelle. Beispielsweise kann es sich bei der Stelle um eine loxP-, lox511- oder lox2272-Stelle handeln.
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Durch die Erfindung wird ebenso bereitgestellt: ein Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden von Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung erster und zweiter Brüche in einem Nukleinsäurestrang, wodurch geschnittene 5'- und 3'-Enden und eine zwischen den Enden liegende Nukleotidsequenz entstehen;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Deletion der Nukleotidsequenz; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die Deletion umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs.
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In einem Beispiel ist der Nachkommenstrang ein Produkt der Replikation des von Schritt (b) produzierten Strangs. Der Nachkommenstrang wird beispielsweise durch Nukleinsäurereplikation in einer Zelle produziert. Beispielsweise werden Schritt (a) und (b) in einer Zelle durchgeführt, und die Zelle wird repliziert, wobei die Zellmaschinerie den in Schritt (b) produzierten modifizierten Strang repliziert, z. B. um eine dsDNA-Nachkommenschaft zu erzeugen, bei der jeder Strang die Modifikation umfasst.
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In einem Beispiel handelt es sich bei dem Nukleinsäureeinzelstrang um einen DNA- oder RNA-Strang.
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In einem Beispiel umfasst die deletierte Sequenz ein regulatorisches Element oder codiert ein Protein ganz oder teilweise. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem deletierten regulatorischen Element um einen Promotor oder Enhancer.
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Gegebenenfalls handelt es sich in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung bei der deletierten Nukleotidsequenz um eine Pflanzen-, Tier-, Wirbeltier- oder Sängersequenz, z. B. eine menschliche Sequenz. Die Sequenz codiert beispielsweise ein vollständiges Protein, Polypeptid, Peptid, eine vollständige Domäne oder mehrere (z. B. ein, zwei oder mehr) von diesen. In einem Beispiel codiert die deletierte Sequenz ein Interleukin, einen Rezeptor (z. B. einen Zelloberflächenrezeptor), Wachstumsfaktor, ein Hormon, einen Antikörper (oder eine variable Domäne oder Bindungsstelle davon), einen Antagonisten, Agonisten; z. B. eine nichtmenschliche Version von diesen. In einem Beispiel ist die deletierte Sequenz ein Exon.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung die deletierte Nukleotidsequenz durch eine orthologe oder homologe Sequenz einer anderen Spezies oder eines anderen Stamms ersetzt (z. B. ersetzt eine menschliche Sequenz eine orthologe oder homologe Sequenz einer Pflanze, eines Menschen oder einer Maus). Beispielsweise wird das Verfahren in einer Maus oder Mauszelle durchgeführt, wobei die Insertion eine orthologe oder homologe Maus-Sequenz (z. B. ein bei einer Krankheit impliziertes biologisches Maus-Zielprotein) ersetzt. Zum Beispiel wird das Verfahren (z. B. in vitro) in einer menschlichen Zelle durchgeführt, wobei die Insertion eine orthologe oder homologe menschliche Sequenz ersetzt (z. B. wird ein bei einer Krankheit impliziertes biologisches menschliches Zielprotein, z. B. eine mutierte Form einer Sequenz durch eine andere (z. B. Wildtyp-)menschliche Sequenz ersetzt, was bei der Korrektur eines Gendefekts in der Zelle von Nutzen sein kann. In dieser Ausführungsform kann es sich bei der Zelle um eine menschliche ES- oder iPS- oder totipotente oder pluripotente Stammzelle handeln, die anschließend in einen menschlichen Patienten bei einem Gentherapieverfahren zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer medizinischen Krankheit oder eines medizinischen Leidens bei dem Patienten eingeführt werden kann).
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Gegebenenfalls weist in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung die deletierte Nukleotidsequenz eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden, z. B. wenigstens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder 900 Nukleotiden, oder wenigstens 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 oder 100 kb auf.
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Gegebenenfalls erfolgt in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (c), indem eine den modifizierten ersten Strang umfassende Zelle isoliert oder ein nichtmenschliches Wirbeltier, bei dem das Verfahren durchgeführt wurde, oder eine Nachkommenschaft davon erhalten wird.
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Gegebenenfalls umfasst in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung das Produkt des Verfahrens einen Nukleinsäurestrang, der ein PAM-Motiv 3' von der Insertion oder Deletion umfasst. In einem Beispiel liegt das PAM-Motiv innerhalb von 10, 9, 8, 7 6, 5, 4 oder 3 Nukleotiden von der Insertion oder Deletion. Dies ist sinnvoll, um aufeinander folgende Insertionen und/oder Deletionen gemäß dem Verfahren zu ermöglichen, wie es weiter unten erläutert wird.
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Gegebenenfalls umfasst in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung das Produkt des Verfahrens einen Nukleinsäurestrang, der ein PAM-Motiv 5' von der Insertion oder Deletion umfasst. In einem Beispiel liegt das PAM-Motiv innerhalb von 10, 9, 8, 7 6, 5, 4 oder 3 Nukleotiden von der Insertion oder Deletion. Dies ist sinnvoll, um aufeinander folgende Insertionen und/oder Deletionen gemäß dem Verfahren zu ermöglichen, wie es weiter unten erläutert wird.
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Gegebenenfalls erfolgt in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (b), indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind. Der Fachmann ist mit der Konstruktion von Vektoren und DNA-Molekülen zur Verwendung bei homologer Rekombination vertraut, einschließlich Überlegungen wie etwa Größe und Sequenz der Homologiearme und dem Einschluss von Selektionsmarkern zwischen den Armen. Beispielsweise umfasst die hereinkommende Nukleinsäure erste und zweite Homologiearme und die Insertionssequenz und eine optionale Selektionsmarkersequenz (z. B. neo-Nukleotidsequenz). Die Arme können zum Beispiel eine Länge von wenigstens 20, 30, 40, 50, 100 oder 150 Nukleotiden aufweisen. Wo Deletion erforderlich ist, wird die Insertion weggelassen (wenngleich eine optionale Selektionsmarkersequenz zwischen den Armen enthalten sein kann oder nicht).
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Somit erfolgt in einer Ausführungsform der Erfindung Schritt (b), indem homologe Rekombination zwischen einer eine vom ersten und zweiten Homologiearm flankierte Insertionsnukleotidsequenz umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Insertionsnukleotidsequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden inseriert ist.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung befindet sich die Insertion zwischen den Homologiearmen, wobei keine weitere Sequenz zwischen den Armen vorhanden ist.
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In einem Beispiel weist jeder Homologiearm eine Länge von wenigstens 20, 30, 40, 50, 100 oder 150 Nukleotiden auf.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (a) unter Verwendung einer Endonuklease, z. B. einer Nickase, durchgeführt. Nickasen schneiden nur in einem Einzelstrang von dsDNA. Bei der Endonuklease handelt es sich zum Beispiel um eine Endonuklease eines CRISPR/Cas-Systems, z. B. eine Cas9- oder Cys4-Endonuklease (z. B. eine Cas9- oder Cys4-Nickase). In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine in Tabelle 1 unten aufgeführte PAM, zum Beispiel ist die Endonuklease eine Cas-Endonuklease, die eine aus CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT und GAA ausgewählte PAM erkennt. In einem Beispiel handelt es sich bei der Cas-Endonuklease um eine S pyogenes-Endonuklease, z. B. eine S pyogenes-Cas9-Endonuklease. In einem Beispiel wird eine S. pyogenes-PAM-Sequenz oder Streptococcus thermophilus-LMD-9-PAM-Sequenz verwendet.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-1-Cas-Endonuklease. In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-2-Cas-Endonuklease. In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-3-Cas-Endonuklease. In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-4-Cas-Endonuklease. In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-7-Cas-Endonuklease. In einem Beispiel handelt es sich bei der Endonuklease um eine Group-10-Cas-Endonuklease.
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In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-1-PAM. In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-2-PAM. In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-3-PAM. In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-4-PAM. In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-7-PAM. In einem Beispiel erkennt die Endonuklease eine CRISPR/Cas-Group-10-PAM.
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In einem Beispiel wird in Schritt (a) durch Cas-Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet; gegebenenfalls mittels Erkennung eines GG- or NGG-PAM-Motivs.
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In einem Beispiel umfasst der erste und/oder zweite Homologiearm ein PAM-Motiv. Dies ist sinnvoll, um aufeinander folgende Insertionen und/oder Deletionen gemäß dem Verfahren zu ermöglichen, wie es weiter unten erläutert wird.
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Als Nickase ist beispielsweise S pyogenes-Cas9-D10A-Nickase geeignet (siehe Cong et al. und den nachfolgenden Beispielteil).
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Gegebenenfalls werden in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (a) und (b) des Verfahrens in einer Zelle, z. B. einer Bakterien-, Hefe-, eukaryontischen Zelle, Pflanzen-, Tier-, Säuger-, Wirbeltier-, nichtmenschlichen Tier-, Nager-, Ratten-, Maus-, Kaninchen-, Fisch-, Vogel- oder Hühnerzelle durchgeführt. Beispielsweise ist die Zelle eine E coli-Zelle oder CHO- oder HEK293- oder Picchia- oder Saccharomyces-Zelle. In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle um eine menschliche Zelle in vitro. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um eine embryonale Stammzelle (ES-Zelle, z. B. eine menschliche oder nichtmenschliche ES-Zelle wie eine Maus-ES-Zelle) oder eine induzierte pluripotente Stammzelle (iPS-Zelle; z. B. eine menschliche, Nager-, Ratten- oder Maus-iPS-Zelle) oder eine pluripotente oder totipotente Zeile. Gegebenenfalls handelt es sich bei der Zeile nicht um eine embryonale Zeile, z. B. wobei die Zeile keine humane embryonale Zeile ist. Gegebenenfalls handelt es sich bei der Zeile nicht um eine pluripotente oder totipotente Zeile. In einem Beispiel wird das Verfahren zur Herstellung einer menschlichen Stammzelle für die Therapie am Menschen verwendet (z. B. einer aus einer Zeile eines Patienten erzeugten iPS-Zelle zur Wiedereinführung in den Patienten, nachdem das erfindungsgemäße Verfahren an der Zeile durchgeführt wurde), wobei die Stammzelle eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren inserierte Nukleotidsequenz oder Gensequenz umfasst. Die Merkmale der Beispiele in diesem Absatz können kombiniert werden.
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In einem Beispiel wird das Verfahren in einer Säugerzelle durchgeführt. Beispielsweise ist die Zelle eine menschliche Zelle in vitro oder eine nichtmenschliche Säugerzelle. Zum Beispiel eine nichtmenschliche (z. B. Nager-, Ratte- oder Maus-)Zygote. Zum Beispiel eine einzellige nichtmenschliche Zygote.
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In einem Beispiel wird das Verfahren in einer Pflanze oder einem nichtmenschlichen Säuger, z. B. einem Nager, einer Maus oder Ratte oder einem Kaninchen, oder einem Gewebe oder Organ davon durchgeführt (z. B. in vitro).
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In einem Beispiel ist die 3'- oder jede Spaltstelle 3' von PAM-Motiv (z. B. einem hier offenbarten Motiv, wie etwa NGG- oder NGGNG-Sequenz, wobei N für eine beliebige Base und G für ein Guanin steht) flankiert. Zum Beispiel sind eine oder mehrere oder alle Spaltstellen 3' von der Sequenz 5'-TGGTG-3' flankiert. Im Gegensatz zu dsDNA ist die PAM für ssDNA-Bindung und Spaltung nicht absolut notwendig: Ein einzelsträngiges Oligodesoxynukleotid mit einem Protospacer mit oder ohne eine PAM-Sequenz wird fast ebenso gut wie dsDNA gebunden und kann erfindungsgemäß verwendet werden, wobei ein DNA-Einzelstrang modifiziert wird. Zudem schneidet in Gegenwart von Mg2+-Ionen Cas9 an die crRNA gebundene ssDNA unter Verwendung ihrer aktiven HNH-Stelle unabhängig von PAM.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (a) durch Spaltung in einem Einzelstrang von dsDNA oder in ssDNA durchgeführt.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (a) durchgeführt, indem in einer Zelle der Nukleinsäurestrang, eine Cas-Endonuklease, eine crRNA und eine tracrRNA (z. B. bereitgestellt von einer oder mehreren gRNAs) mit dem Ziel, dass die Endonuklease die Spaltung durchführt, und gegebenenfalls eine Insertionssequenz für homologe Rekombination mit dem Nukleinsäurestrang kombiniert werden. Statt einer Insertionssequenz kann man eine Homologiearme, aber keine Insertionssequenz enthaltende hereinkommende Sequenz verwenden, um Deletion wie oben beschrieben zu bewirken. In einem Beispiel wird die Cas-Endonuklease von einer Nukleotidsequenz codiert, die in die Zeile eingeführt wurde. In einem Beispiel wird die gRNA von einer DNA-Sequenz codiert, die in die Zeile eingeführt wurde.
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In einem Beispiel wird das Verfahren in Gegenwart von Mg2+ durchgeführt. Gegebenenfalls erfolgt in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (b), indem homologe Rekombination mit einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei der zweite Homologiearm eine PAM-Sequenz umfasst, so dass durch homologe Rekombination zwischen dem zweiten Homologiearm und der sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz eine ein PAM-Motiv umfassende Sequenz im Produkt des Verfahrens entsteht. Die PAM kann zum Beispiel eine beliebige hier offenbarte PAM-Sequenz sein. Somit produziert das Verfahren einen eine PAM umfassenden modifizierten Nukleinsäurestrang, der für eine anschließende Nukleinsäuremodifikation gemäß einer Auslegung, einem Aspekt, einem Beispiel oder einer Ausführungsform der Erfindung verwendet werden kann, wobei eine Cas-Endonuklease zum Schneiden der Nukleinsäure eingesetzt wird. Dies eignet sich beispielsweise zum Durchführen von sEHDR (Sequential Endonuclease-Mediated Homology Directed Recombination [sequentielle endonuklease-vermittelte homologie-gesteuerte Rekombination]) gemäß der Erfindung, insbesondere sCHDR, wie unten beschrieben.
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sEHDR (Sequential Endonuclease-Mediated Homology Directed Recombination)
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Durch die Erfindung wird ferner bereitgestellt:
ein Verfahren einer sEHDR (Sequential Endonuclease-Mediated Homology Directed Recombination), umfassend Durchführen des Verfahrens nach einer bzw. einem vorhergehenden Auslegung, Aspekt, Beispiel oder Ausführungsform der Erfindung ein erstes Mal und ein zweites Mal, wobei in Schritt (a) jeweils durch Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet wird; wobei das Produkt des ersten Mals zur durch Endonuklease vermittelten Spaltung beim zweiten Mal verwendet wird, wobei entweder (i) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten Mal bzw. bei den zweiten Malen deletiert werden; (ii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal deletiert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal inseriert wird; (iii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal inseriert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal deletiert wird; oder (iv) erste bzw. zweite Nukleotidsequenzen beim ersten bzw. zweiten Mal inseriert werden; gegebenenfalls wobei die Nukleinsäurestrangmodifikation beim zweiten Mal innerhalb von 20, 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 oder weniger Nukleotiden von der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal oder unmittelbar neben der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal liegt.
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Beispielsweise werden die ersten und zweiten Nukleotidsequenzen so inseriert, dass sie nach der Insertion beim zweiten Mal zusammenhängend sind. Als Alternative sind die ersten und zweiten Deletionen dergestalt, dass eine zusammenhängende Sequenz nach Durchführen der ersten und der zweiten Deletion deletiert wurde.
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In einer Ausführungsform von sEHDR wird erfindungsgemäß eine Cas-Endonuklease verwendet. Somit wird bereitgestellt:
ein Verfahren einer sCHDR (Sequential Cas-Mediated Homology Directed Recombination [sequentielle Cas-vermittelte homologie-gesteuerte Rekombination]), umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem vorhergehenden Anspruch ein erstes Mal und ein zweites Mal, wobei in Schritt (a) jeweils durch Cas-Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet wird; wobei Schritt (b) des ersten Mals unter Erfolgen homologer Rekombination mit einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei der zweite Homologiearm eine PAM-Sequenz umfasst, so dass durch homologe Rekombination zwischen dem zweiten Homologiearm und der sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz eine ein PAM-Motiv umfassende Sequenz im Produkt des Verfahrens entsteht; wobei das PAM-Motiv des Produkts des ersten Mals zur durch Cas-Endonuklease vermittelten Spaltung beim zweiten Mal verwendet wird, wobei entweder (i) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten Mal bzw. bei den zweiten Malen deletiert werden; (ii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal deletiert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal eingefügt wird; (iii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal inseriert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal deletiert wird; oder (iv) erste bzw. zweite Nukleotidsequenzen beim ersten bzw. zweiten Mal eingefügt werden; gegebenenfalls wobei die Nukleinsäurestrangmodifikation beim zweiten Mal innerhalb von 20, 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 oder weniger Nukleotiden von der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal oder unmittelbar neben der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal liegt.
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Beispielsweise werden die ersten und zweiten Nukleotidsequenzen so inseriert, dass sie nach der Insertion beim zweiten Mal zusammenhängend sind. Als Alternative sind die ersten und zweiten Deletionen dergestalt, dass eine zusammenhängende Sequenz nach Durchführen der ersten und der zweiten Deletion deletiert wurde.
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In einer Ausführungsform (Erste Ausführungsform) wird das erste Mal gemäß der dritten Auslegung der Erfindung durchgeführt, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, wobei Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; und/oder das zweite Mal gemäß der dritten Auslegung der Erfindung durchgeführt, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, so dass Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; gegebenenfalls wobei der zweite Arm ein PAM-Motiv umfasst, so dass das Produkt des zweiten Mals ein PAM-Motiv zur Verwendung bei einem nachfolgenden durch Cas-Endonuklease vermittelten Verfahren gemäß einer Auslegung, einem Aspekt, einem Beispiel oder einer Ausführungsform der Erfindung umfasst.
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In einer Ausführungsform (Zweite Ausführungsform) wird das erste Mal gemäß der ersten oder zweiten Auslegung der Erfindung durchgeführt, wobei die hereinkommende Nukleinsäure die Insertionssequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, wobei die Insertionssequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination inseriert ist; und/oder das zweite Mal gemäß der ersten oder zweiten Auslegung der Erfindung durchgeführt, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei die Insertionssequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination eingefügt ist; gegebenenfalls wobei der zweite Arm ein PAM-Motiv umfasst, so dass das Produkt des zweiten Mals ein PAM-Motiv zur Verwendung bei einem nachfolgenden durch Cas-Endonuklease vermittelten Verfahren gemäß einer Auslegung, einem Aspekt, einem Beispiel oder einer Ausführungsform der Erfindung umfasst.
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In einem Beispiel wird entweder das erste oder das zweite Mal wie in der ersten Ausführungsform angegeben durchgeführt und das jeweils andere Mal wie in der zweiten Ausführungsform angegeben durchgeführt, wobei wenigstens eine Sequenzdeletion und wenigstens eine Sequenzinsertion erfolgt.
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Gegebenenfalls wird in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung Schritt (a) mittels durch Cas-Endonuklease vermittelter Spaltung unter Verwendung einer Cas-Endonuklease, einer oder mehrerer crRNAs und einer tracrRNA durchgeführt. Beispielsweise wird das Verfahren in einer Zelle durchgeführt und die crRNA und tracrRNA in die Zelle als RNA-Moleküle eingeführt. Beispielsweise wird das Verfahren in einer Zygote (z. B. einer nichtmenschlichen Zygote, z. B. einer Nager-, Ratten- oder Mauszygote) durchgeführt und die crRNA und tracrRNA in die Zygote injiziert. In einer weiteren Ausführungsform sind die crRNA und tracrRNA von DNA in einer Zelle oder einem Organismus codiert und werden in der Zelle (z. B. einer ES-Zelle, z. B. einer nichtmenschlichen ES-Zelle, z. B. einer Nager-, Ratten- oder Maus-ES-Zelle) oder dem Organismus unter Erhalt der crRNA und tracrRNA transkribiert. Bei dem Organismus handelt es sich zum Beispiel um ein nichtmenschliches Tier oder eine Pflanze oder ein Bakterium oder eine Hefe oder ein Insekt. In einer Ausführungsform ist die tracrRNA auf diese Weise von DNA codiert, aber eine oder mehrere crRNAs werden als RNA-Nukleinsäure in die Zelle oder den Organismus eingeführt, um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen.
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Zusätzlich oder als Alternative zu diesen Beispielen kann die Endonuklease in Form eines Proteins oder ein die Endonuklease codierender Vektor in die Zelle oder den Organismus eingeführt werden, um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen. In einem weiteren Beispiel wird die Endonuklease von DNA codiert, die in die Zelle oder den Organismus genomisch integriert und in der Zelle bzw. dem Organismus transkribiert und translatiert wird.
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In einem Beispiel wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer ES-Zelle (z. B. einer nichtmenschlichen ES-Zelle, z. B. einer Nager-, Ratten- oder Maus-ES-Zelle) durchgeführt, die zuvor so konstruiert wurde, dass sie eine exprimierbare genomisch integrierte Cas-Endonuklease-Sequenz umfasst (oder es ist ein diese tragender Vektor in der Zelle enthalten). Es wäre möglich, eine tracrRNA einzuführen (oder zu codieren). Durch Einführen einer crRNA mit einer Oligo-Leitsequenz zum Zielen auf die gewünschte Zone des Zellgenoms kann man dann Modifikationen im Zellgenom gemäß der Erfindung durchführen. In einem Beispiel wird eine wie hier beschriebene gRNA in die ES-Zelle eingeführt. Die genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Sequenz kann zum Beispiel konstitutiv exprimiert werden oder induzierbar exprimierbar sein. Als Alternative oder zusätzlich kann die Sequenz in einem unter Verwendung der ES-Zelle entwickelten Nachkommenorganismus (z. B. einem Nager) gewebespezifisch exprimierbar sein.
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Die ursprüngliche eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Sequenz umfassende ES-Zelle lässt sich über Standardtechniken verwenden, um ein nichtmenschliches Nachkommentier zu erzeugen, das die exprimierbare Cas-Endonuklease-Sequenz enthält. Somit wird durch die Erfindung bereitgestellt:
ein nichtmenschliches Tier (z. B. ein Wirbeltier, Säuger, Fisch oder Vogel), eine Tierzelle, ein Insekt, eine Insektenzelle, eine Pflanze oder Pflanzenzelle, umfassend eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Nukleotidsequenz und gegebenenfalls eine tracrRNA und/oder eine eine tracrRNA codierende Nukleotidsequenz. Bei der Cas-Endonuklease handelt es sich zum Beispiel um Cas9 oder Cys4. In einem Beispiel umfasst das Tier-, Insekten- oder Pflanzengenom eine von stellenspezifischen Rekombinationsstellen und/oder Transposonelementen (z. B. piggyBac-Transposon-Repeat-Elementen) flankierte chromosomale DNA-Sequenz, wobei die Sequenz die Endonuklease und gegebenenfalls eine oder mehrere gRNAs codiert. Wie in den Beispielen unten beschrieben, kann zur Insertion einer solchen Sequenz RMCE (Recombinase-Mediated Cassette Exchange [durch Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch]) verwendet werden. Die Transposonelemente können verwendet werden, um die Sequenz aus dem Genom nach Verwenden der Endonuklease zur Durchführung von Rekombination auszuschneiden. RMCE und/oder transposon-vermitteltes Ausschneiden kann in einer Zelle (z. B. einer ES-Zelle) erfolgen, die später zum Ableiten eines Nachkommentiers oder einer Nachkommenpflanze mit der gewünschten genomischen Modifikation verwendet wird.
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Ebenso wird durch die Erfindung eine aus einem solchen Tier gewonnene oder gewinnbare ES-Zelle bereitgestellt, wobei die ES-Zelle eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Nukleotidsequenz umfasst. In einem Beispiel handelt es sich bei der ES-Zelle um eine Nager-, z. B. eine Maus- oder Ratten-ES-Zelle oder um eine ES-Zelle von Kaninchen, Hund, Schwein, Katze, Rind, nichtmenschlichen Primaten, Fisch, Amphibie oder Vogel.
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Ebenso wird durch die Erfindung ein Verfahren für Isolieren einer ES-Zelle bereitgestellt, wobei das Verfahren Gewinnen einer ES-Zelle aus einem Tier (z. B. einem nichtmenschlichen Tier, z. B. einem Nager, z. B. einer Ratte oder einer Maus) umfasst, wobei das Tier eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Nukleotidsequenz umfasst, wie hier beschrieben.
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In allen diesen Aspekten kann es sich bei der Zelle statt einer ES-Zelle um eine iPS-Zelle oder eine totipotente oder pluripotente Zelle handeln. So kann eine iPS- oder Stammzelle aus einem (z. B. einer somatischen Zelle eines) Menschen gewonnen werden, in vitro so konstruiert werden, dass sie eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Nukleotidsequenz und gegebenenfalls eine oder mehrere eine tracrRNA oder gRNA codierende DNA-Sequenzen umfasst. Die Erfindung betrifft somit auch ein solches Verfahren und eine menschliche iPS- oder Stammzelle, die eine genomisch integrierte exprimierbare Cas-Endonuklease-Nukleotidsequenz und gegebenenfalls eine oder mehrere eine tracrRNA oder gRNA codierende DNA-Sequenzen umfasst. Diese Zelle kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Durchführung von Genommodifikation verwendet werden (z. B. um einen genetischen Defekt zu korrigieren, indem z. B. defekte Sequenz durch eine gewünschte Sequenz ersetzt wird, gegebenenfalls mit anschließendem transposon-vermitteltem Ausschneiden der Endonuklease codierenden Sequenz). Nach gegebenenfalls erfolgtem Ausschneiden der Cas-Endonuklease-Sequenz kann die iPS-Zelle oder Stammzelle in den menschlichen Spender (oder einen anderen Menschen, z. B. einen genetischen Verwandten davon) eingeführt werden, um Gentherapie oder Prophylaxe durchzuführen. Alternativ wird eine totipotente oder pluripotente menschliche Zelle verwendet und dann anschließend zu menschlichem Gewebe oder einem Organ oder Teil davon weiterentwickelt. Dies eignet sich zum Bereitstellen von Material für Therapie oder Prophylaxe am Menschen oder zum Herstellen von Materialien für Testverfahren (z. B. für Einpflanzung in nichtmenschliche Tiermodelle) oder zur Verwendung bei In-vitro-Tests (z. B. von Arzneistoffen).
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In einem Beispiel wird bei dem Verfahren eine einzelne Guided-RNA (gRNA oder sgRNA), die eine crRNA und eine tracrRNA umfasst, verwendet. Die crRNA umfasst eine Oligonukleotidsequenz (”X” in der unten erwähnten Struktur 5'-X-Y-3'), die zum Zielen auf einen gewünschten Teil der Nukleinsäure bzw. des Genoms, die bzw. das modifiziert werden soll, gewählt wird. Dem Fachmann ist es leicht möglich, geeignete Oligosequenz(en) auszuwählen. In einem Beispiel weist die Sequenz eine Länge von 3 bis 100 Nukleotiden, z. B. von 3 bis 50, 40, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden, z. B. von oder 5, 10, 15 oder 20 bis 100 Nukleotiden, z. B. von 5, 10, 15 oder 20 bis 50 Nukleotiden auf.
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Bei der gRNA handelt es sich zum Beispiel um eine einzelne Nukleinsäure, die sowohl die crRNA als auch die tracrRNA umfasst. Eine gRNA umfasst beispielsweise die Sequenz 5'-[oligo]-[UUUUAGAGCUA (S N1UUUUAN2N3GCUA)]-[LINKER]-[UAGCAAGUUAAAA (SEQ ID NO: 2)]-3', wobei der LINKER mehrere (z. B. 4 oder mehr, z. B. 4, 5 oder 6) Nukleotide umfasst (z. B. 5'-GAAA-3').
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Beispielsweise weist die crRNA die Struktur 5'-X-Y-3' auf, wobei X für eine RNA-Nukleotidsequenz (gegebenenfalls mit einer Länge von wenigstens 5 Nukleotiden) und Y für eine ein Nukleotidmotiv, das mit einem von der tracrRNA umfassten Motiv hybridisiert, umfassende crRNA-Sequenz steht, wobei X zur Hybridisierung mit einer Nukleotidsequenz 5' von der gewünschten Stelle des geschnittenen 5'-Endes, die sich z. B. 5' von der gewünschten Stelle des 5'-Schnitts erstreckt, fähig ist.
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In einem Beispiel steht Y für 5'-N1UUUUAN2N3GCUA-3' (SEQ ID NO: 3), N1-3 jeweils für ein A, U, C oder G stehen und/oder die tracrRNA die Sequenz (in 5'-nach-3'-Orientierung) UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO: 4) umfasst, wobei M1 für Spacer-Nukleotidsequenz und M2 für ein Nukleotid steht; z. B. N1-G, N2 = G und N3 = A. Die Spacer-Sequenz weist z. B. eine Länge von 5, 4, 3, 2 oder 1 RNA Nukleotiden auf (z. B. AAG in 5'-nach-3'-Orientierung). M2 steht zum Beispiel für ein A, U, C oder G (z. B. steht M2 für ein G). In einer Ausführungsform wird eine chimäre gRNA verwendet, die eine Sequenz 5'-X-Y-Z-3' umfasst, wobei X und Y die oben angegebene Bedeutung haben und Z für eine tracrRNA steht, die die Sequenz (in 5'-nach-3'-Orientierung) UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO: 4) umfasst, wobei M1 für Spacer-Nukleotidsequenz und M2 für ein Nukleotid steht. In einem Beispiel umfasst Z die Sequenz 5'-UAGCAAGUUAAAA-3' (SEQ ID NO: 2), z. B. steht Z für 5'-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO: 5). In einem Beispiel weist die gRNA die Sequenz auf:
![Figure DE202014010413U1_0002](https://patentimages.storage.googleapis.com/21/ec/75/1c095cca95d575/DE202014010413U1_0002.png)
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Wird eine Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Insertion einer exogenen Sequenz in die zu modifizierende Nukleinsäure gewünscht, so kann die exogene Sequenz auf linearer oder zirkulärer Nukleinsäure (z. B. DNA) bereitgestellt werden. Typischerweise ist die exogene Sequenz von Homologiearmen flankiert, die homologe Rekombination mit Sequenzen 5' bzw. 3' von der Stelle, wo die exogene Sequenz eingefügt werden soll, eingehen können. Der Fachmann ist mit dem Wählen von Homologiearmen für homologe Rekombination vertraut.
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Die Erfindung kann bei einem Herstellungsverfahren für einen transgenen Organismus, z. B. einen beliebigen hier genannten Organismus, verwendet werden. Bei dem Organismus kann es sich zum Beispiel um einen nichtmenschlichen Organismus handeln, der als Testmodell verwendet wird, um einen pharmazeutischen Arzneistoff zu testen oder ein exogenes Protein oder einen Teil davon (z. B. ein menschliches Proteinziel, das durch Knock-in in einem nichtmenschlichen Tier-Testorganismus vorliegt) zu exprimieren. In einem weiteren Beispiel wurde die Erfindung für ein Knock-out einer endogenen Sequenz (z. B. eines Zielproteins) in einem Organismus, wie etwa einem nichtmenschlichen Organismus, verwendet. Dies kann beim Beurteilen des Effekts (Phänotyps) des Knock-out und somit Beurteilen möglicher Arzneistoffziele oder von mit Krankheit in Verbindung gebrachten Proteinen von Nutzen sein. In einem Beispiel handelt es sich bei dem Organismus um ein nichtmenschliches Tier (z. B. ein Wirbeltier, einen Säuger, Vogel, Fisch, Nager, eine Maus, Ratte oder ein Kaninchen), bei dem ein menschliches Zielprotein durch Knock-in unter Verwendung der Erfindung eingeführt wurde. Gegebenenfalls wurde die Erfindung für ein Knock-out eines orthologen oder homologen endogenen Ziels des Organismus verwendet (z. B. wurde eine endogene Zielsequenz an der endogenen Position durch eine orthologe ocer homologe menschliche Zielsequenz ersetzt). Auf diese Weise kann ein Testmodell zum Testen pharmazeutischer Arzneistoffe, die über das menschliche Ziel wirken, hergestellt werden.
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In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Organismus um ein nichtmenschliches Wirbeltier, das variable menschliche Antikörperregionen exprimiert, dessen Genom einen Austausch eines endogenen Ziels gegen eine orthologe oder homologe menschliche Sequenz umfasst. In einem Beispiel wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Antibody-Generating Vertebrate oder Assay Vertebrate (Antikörper erzeugenden Wirbeltiers oder Testwirbeltiers) verwendet, wie aus der
WO2013061078 bekannt, deren Offenbarungsgehalt, und insbesondere ihr solche Vertebrates, ihre Zusammensetzung, Herstellung und Verwendung betreffender Offenbarungsgehalt, hiermit ausdrücklich und vollumfänglich durch Bezugnahme aufgenommen ist, um Stütze für die vorliegenden Ansprüche zu begründen.
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In einem Beispiel wird ein exogenes regulatorisches Element durch Knock-in unter Verwendung des Verfahrens eingeführt. Beispielsweise wird es durch Knock-in eingeführt, um ein endogenes regulatorisches Element zu ersetzen.
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In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle oder eines transgenen nichtmenschlichen Organismus (z. B. eines beliebigen hier genannten nichtmenschlichen Organismus) bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Durchführen des Verfahrens nach einem in allen Auslegungen, Aspekten, Beispielen oder Ausführungsformen der Erfindung für (i) ein Knock-out einer Zielnukleotidsequenz im Genom einer ersten Zelle und/oder (ii) ein Knock-in einer Insertionsnukleotidsequenz in das Genom einer ersten Zelle, gegebenenfalls wobei die Insertionssequenz eine Zielsequenz ganz oder teilweise am endogenen Ort der Zielsequenz im Genom ersetzt; wobei sich die Zelle oder eine Nachkommenschaft davon zu einem nichtmenschlichen Organismus bzw. einer nichtmenschlichen Zelle entwickeln kann; und
- (b) Entwickeln der Zelle oder Nachkommenschaft zu einem nichtmenschlichen Organismus oder einer nichtmenschlichen Zelle.
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In einem Beispiel ist der Organismus bzw. die Zelle homozygot für die Modifikation (i) und/oder (ii).
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle um eine ES-Zelle (wie etwa eine Maus-ES-Zelle), iPS-Zelle, totipotente Zelle oder pluripotente Zelle. In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle oder eine menschliche Zelle in vitro. In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle um eine Pflanzen-, Hefe-, Insekten- oder Bakerienzelle.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle bzw. dem Organismus um eine Nagerzelle (z. B. eine Maus- oder Rattenzelle) oder eine Kaninchen-, Vogel-, Fisch-, Hühner-, nichtmenschliche Primaten-, Affen-, Schweine-, Hunde-, Kamel-, Hai-, Schaf-, Rinder- oder Katzenzelle.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zielsequenz um eine endogene Sequenz, die ein regulatorisches Element ganz oder teilweise umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
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In einem Beispiel ist die Insertionssequenz eine synthetische Sequenz; oder umfasst eine Sequenz, die ein Protein aus einer anderen Spezies als der Spezies, von der die erste Zelle stammt, ganz oder teilweise codiert; oder umfasst ein regulatorisches Element aus der ersten Spezies. Dies ist sinnvoll, um Gene mit neuen regulatorischen Elementen zu kombinieren.
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In einem Beispiel codiert die Insertionssequenz ein menschliches Protein oder eine menschliche Proteinuntereinheit oder -domäne ganz oder teilweise. Beispielsweise codiert die Insertionssequenz ein Zellmembranprotein, sezerniertes Protein, intrazelluläres Protein, Cytokin, Rezeptorprotein (z. B. Fc-Rezeptorprotein, wie FcRn- oder ein FcY-Rezeptorprotein), Protein des menschlichen Immunsystems oder eine Domäne davon (z. B. ein Ig-Protein oder eine Ig-Domäne, wie ein bzw. eine Antikörperprotein oder TCR-Protein bzw. -domäne, oder ein MHC-Protein), ein Hormon oder einen Wachstumsfaktor.
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Durch die Erfindung wird ebenso bereitgestellt:
eine Zelle (z. B. eine isolierte oder aufgereinigte Zelle, z. B. eine Zelle in vitro, oder eine beliebige hier offenbarte Zelle) oder ein nichtmenschlicher Organismus (z. B. ein beliebiger hier offenbarter Organismus, wie zum Beispiel eine Maus), dessen Genom eine eine von endogenen Nukleotidsequenzen flankierte nicht endogene Nukleotidsequenz umfassende Modifikation umfasst, wobei die Zelle bzw. der Organismus mit dem Verfahren nach einer Auslegung, einem Aspekt, einem Beispiel oder einer Ausführungsform der Erfindung erhältlich ist und wobei die nicht endogene Sequenz 3' und/oder 5' von einem Cas-PAM-Motiv flankiert ist (z. B. innerhalb von 20, 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 oder weniger Nukleotiden davon oder unmittelbar daneben liegend); wobei die Zelle nicht von einem Menschen umfasst wird; und einer, mehrere oder alle der Punkte (a) bis (d) zutrifft bzw. zutreffen (z. B. (a); (b); (c); (d); (a) und (b); (a) und (c); (a) und (d); (b) und (c); (b) und (d); (c) und (d); (a), (b) und (c); (a), (b) und (d); (a), (c) und (d); (b), (c) und (d) oder (a), (b), (c) und (d)).
- (a) das Genom ist homozygot für die Modifikation; oder umfasst die Modifikation an einem Allel und ist am anderen Allel unmodifiziert von Cas-vermittelter homologer Rekombination;
- (b) die nicht endogene Sequenz umfasst ein regulatorisches Element ganz oder teilweise oder codiert ein Protein ganz oder teilweise;
- (c) die nicht endogene Sequenz weist eine Länge von wenigstens 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder 900 Nukleotiden oder von wenigstens 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 oder 100 kb auf.
- (d) die nicht endogene Sequenz ersetzt eine orthologe oder homologe Sequenz im Genom.
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Die Zelle kann eine menschliche Zelle sein oder in menschlichem Gewebe enthalten sein, aber nicht Teil eines Menschen sein. Zum Beispiel handelt es sich bei der Zelle um eine menschliche Zelle in vitro.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der nicht endogenen Sequenz um eine menschliche Sequenz.
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In einem Beispiel handelt es sich bei dem PAM-Motiv um eine beliebige hier offenbarte PAM, oder es umfasst eine aus CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT und GAA ausgewählte Sequenz. Beispielsweise handelt es sich bei dem Motiv um ein Cas9-PAM-Motiv. Bei der PAM handelt es sich zum Beispiel um NGG. In einem weiteren Beispiel handelt es sich bei der PAM um GG.
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In einem Beispiel liegt ein PAM-Motiv nicht mehr als 10 Nukleotide (z. B. 3 Nukleotide) 3' und/oder 5' von der nicht endogenen Sequenz.
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In einem Beispiel wird das PAM-Motiv von einer Streptococcus-Cas9 erkannt.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle bzw. dem Organismus um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der schweren Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der schweren Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert. Zum Beispiel handelt es sich bei dem Organismus um ein Antibody-Generating Vertebrate oder Assay Vertebrate, offenbart in der
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle bzw. dem Organismus um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der kappa-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Zelle bzw. dem Organismus um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der lambda-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
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In einem Beispiel codiert die nicht endogene Sequenz ein menschliches Fc-Rezeptorprotein oder eine Untereinheit oder Domäne davon (z. B. ein menschliches FcRn- oder FcY-Rezeptorprotein, -Untereinheit oder -Domäne).
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In einem Beispiel umfasst die nicht endogene Sequenz ein oder mehrere menschliche Antikörper-Gensegmente, eine variable Antikörperregion oder eine konstante Antikörperregion.
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In einem Beispiel handelt es sich bei der Insertionssequenz um eine menschliche Sequenz, die eine orthologe nichtmenschliche Sequenz ersetzt oder ergänzt.
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Durch die Erfindung wird ebenso bereitgestellt:
ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, hergestellt durch Immunisierung eines erfindungsgemäßen (oder mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten) Wirbeltiers (z. B. Maus oder Ratte) mit einem Antigen.
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Durch die Erfindung wird ebenso bereitgestellt:
ein Isolierungsverfahren für einen Antikörper, der ein vorbestimmtes Antigen bindet, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen (oder mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten) Wirbeltiers (gegebenenfalls einer Maus oder Ratte);
- (b) Immunisieren des Wirbeltiers mit dem Antigen;
- (c) Entfernen von B-Lymphozyten aus dem Wirbeltier und Auswählen eines oder mehrerer B-Lymphozyten, die Antikörper exprimieren, die an das Antigen binden;
- (d) gegebenenfalls Immortalisieren der ausgewählten B-Lymphozyten oder Nachkommenschaft davon, gegebenenfalls indem Hybridomen davon produziert werden; und
- (e) Isolieren eines von den B-Lymphozyten exprimierten Antikörpers (z. B. eines IgG-Typ-Antikörpers).
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In einem Beispiel umfasst das Verfahren den Schritt eines Isolierens von den Antikörper, der das Antigen bindet, codierender Nukleinsäure aus den B-Lymphozyten; gegebenenfalls Austauschen der Nukleotidsequenz der konstanten Region der schweren Kette des Antikörpers gegen eine eine menschliche oder humanisierte konstante Schwerkettenregion codierende Nukleotidsequenz und gegebenenfalls Affinitätsreifen der variablen Region des Antikörpers; und gegebenenfalls Inserieren der Nukleinsäure in einen Expressionsvektor und gegebenenfalls einen Wirt.
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In einem Beispiel umfasst das Verfahren Herstellen einer Mutante oder eines Derivats des mit dem Verfahren erzeugten Antikörpers.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird die Verwendung eines hier beschriebenen isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers oder eines mutierten oder Derivatantikörpers davon, der das Antigen bindet, bei der Fertigung einer Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird die Verwendung eines hier beschriebenen isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers oder eines mutierten oder Derivatantikörpers davon, der das Antigen bindet, zur Verwendung in der Medizin.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird ein Behandlungsverfahren für einen dieses benötigenden Patienten (z. B. einen menschlichen Patienten), das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines hier beschriebenen isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers oder eines mutierten oder Derivatantikörpers davon, welcher ein Antigen bindet, umfasst.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird eine Nukleotidsequenz, die einen hier beschriebenen Antikörper codiert, gegebenenfalls wobei die Nukleotidsequenz Teil eines Vektors ist. Ebenso wird durch die Erfindung eine die Nukleotidsequenz umfassende Wirtszelle bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den oder die hier beschriebenen Antikörper und ein Verdünnungs-, Hilfs- oder Trägermittel umfasst.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird eine ES-Zelle, ein nichtmenschliches Tier oder eine nichtmenschliche Blastozyste, umfassend eine exprimierbare genomisch integrierte Nukleotidsequenz, die eine Cas-Endonuklease (z. B. eine Cas9 oder Cys4) codiert, und gegebenenfalls eine exprimierbare genomisch integrierte Nukleotidsequenz, die eine tracrRNA oder eine gRNA codiert. Bei der ES-Zelle handelt es sich beispielsweise um einen beliebigen hier beschriebenen ES-Zelltyp.
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In einem Beispiel für die Zelle, das Tier oder die Blastozyste ist die Endonuklease-Sequenz konstitutiv exprimierbar.
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In einem Beispiel für die Zelle, das Tier oder die Blastozyste ist die Endonuklease-Sequenz induzierbar exprimierbar.
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In einem Beispiel für die Zelle, das Tier oder die Blastozyste ist die Endonuklease-Sequenz gewebespezifisch im Tier oder in einer Nachkommenschaft davon oder in einem nichtmenschlichen Tier, bei dem es sich um einen Abkömmling der Zelle oder Blastozyste handelt, exprimierbar.
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In einem Beispiel umfasst die Zelle, das Tier oder die Blastozyste eine oder mehrere gRNAs oder eine exprimierbare Nukleotidsequenz, die eine gRNA codiert, oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen, die jeweils eine unterschiedliche gRNA codieren.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird die Verwendung der Zelle, des Tiers oder der Blastozyste bei einem Verfahren gemäß einer Auslegung, einem Aspekt, einer Ausführungsform oder einem Beispiel der Erfindung.
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In einem Aspekt wird ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugter Antikörper bereitgestellt, gegebenenfalls zur Verwendung in der Medizin, z. B. zur Behandlung und/oder Vorbeugung (wie etwa in einem Behandlungs- und/oder Vorbeugungsverfahren) eines medizinischen Leidens oder einer Krankheit bei einem Patienten, z. B. einem Menschen.
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In einem Aspekt wird eine Nukleotidsequenz, die den erfindungsgemäßen Antikörper codiert, bereitgestellt, gegebenenfalls wobei die Nukleotidsequenz Teil eines Vektors ist. Geeignete Vektoren sind für den Fachmann leicht erkennbar, z. B. ein herkömmlicher Antikörper-Expressionsvektor, der die Nukleotidsequenz zusammen in operativer Verknüpfung mit einem oder mehreren Expressionskontrollelementen umfasst.
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In einem Aspekt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die den erfindungsgemäßen Antikörper und ein Verdünnungs-, Hilfs- oder Trägermittel umfasst, gegebenenfalls wobei die Zusammensetzung in einem intravenösen (IV-)Behälter (z. B. und IV-Beutel) oder einem mit einer IV-Spritze verbundenen Behälter enthalten ist.
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In einem Aspekt wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers bei der Fertigung eines Arzneimittels für die Behandlung und/oder Prophylaxe einer Krankheit oder eines Leidens bei einem Patienten, z. B. einem Menschen, bereitgestellt.
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In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung humanisierte Antikörper und Antikörperketten, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, sowohl in chimärer als auch vollständig humanisierter Form, sowie Verwendung der Antikörper in der Medizin. Ebenso betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen solchen Antikörper und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder anderen Hilfsstoff umfasst.
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Antikörperketten, die menschliche Sequenzen enthalten, wie etwa chimäre menschliche-nichtmenschliche Antikörperketten, werden hier aufgrund des Vorliegens der bzw. des menschlichen proteincodierenden Bereiche bzw. Bereichs als humanisiert betrachtet. Vollständig humane Antikörper können ausgehend von eine erfindungsgemäße chimäre Antikörperkette codierender DNA mit Standardtechniken erzeugt werden.
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Verfahren zur Erzeugung sowohl monoklonaler als auch polyklonaler Antikörper sind im Stand der Technik allgemein bekannt, wobei die vorliegende Erfindung sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper von chimären oder vollständig humanisierten Antikörpern betrifft, die in Reaktion auf Antigen-Challenge in nichtmenschlichen Wirbeltieren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden.
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In noch einem weiteren Aspekt können in der vorliegenden Erfindung erzeugte chimäre Antikörper oder Antikörperketten manipuliert werden, geeigneterweise auf der DNA-Ebene, um Moleküle mit antikörperähnlichen Eigenschaften oder antikörperähnlicher Struktur zu erzeugen, wie etwa eine menschliche variable Region aus einer schweren oder leichten Kette mit fehlender konstanter Region, zum Beispiel einen Domäne-Antikörper; oder eine menschliche variable Region mit einer beliebigen konstanten Region aus entweder schwerer oder leichter Kette aus der gleichen oder unterschiedlichen Spezies; oder eine menschliche variable Region mit einer nicht natürlich vorkommenden konstanten Region; oder eine menschliche variable Region zusammen mit einem beliebigen anderen Fusionspartner. Die Erfindung betrifft alle solche chimären Antikörperderivate, die von gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierten chimären Antikörpern abgeleitet sind.
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In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verwendung von Tieren der vorliegenden Erfindung bei der Analyse der voraussichtlichen Wirkungen von Arzneistoffen und Impfstoffen im Zusammenhang eines quasi-menschlichen Antikörperrepertoires.
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Ebenso betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung oder Validierung eines Arznei- oder Impfstoffs, wobei das Verfahren Zuführen des Impfstoffs oder Arzneistoffs an einem erfindungsgemäßen Säuger und Überwachen einer oder mehrerer aus: der Immunantwort, dem Sicherheitsprofil; der Auswirkung auf Krankheit umfasst.
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Ebenso betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend einen Antikörper oder ein Antikörperderivat wie hier beschrieben sowie entweder Anweisungen zur Verwendung eines solchen Antikörpers oder ein geeignetes Laborreagens, wie etwa einen Puffer, Antikörpernachweisreagens.
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Es versteht sich, dass hier beschriebene besondere Ausführungsformen zur Veranschaulichung gezeigt sind und nicht als Einschränkungen der Erfindung. Das Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt werden, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Der Fachmann wird zahlreiche Äquivalente der hier beschriebenen speziellen Vorschriften erkennen oder dazu in der Lage sein, diese unter Anwendung von nicht mehr als Routineversuchen zu ermitteln. Solche Äquivalente werden als in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallend angesehen und sind durch die Ansprüche abgedeckt. Alle in der Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind indikativ für das Ausmaß an Fachwissen des Fachmanns auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden durch Verweis in gleichem Ausmaß Bestandteil der Anmeldung, als wie wenn für die einzelnen Veröffentlichungen oder Patentanmeldungen jeweils speziell und individuell angegeben wurde, dass diese durch Verweis Bestandteil der Anmeldung werden. Die Verwendung des Wortes ”ein” oder ”eine” in Verbindung mit dem Begriff ”umfassend” in den Ansprüchen und/oder der Beschreibung kann ”ein(e) [als Zahl]” bedeuten, ist aber auch mit der Bedeutung ”ein(e) oder mehrere”, ”mindestens ein(e)” und ”ein(e) oder mehr als ein(e)” vereinbar. Wird in den Ansprüchen der Begriff 'oder” verwendet, so soll er ”und/oder” bedeuten, wenn nicht ausdrücklich angegeben wird, dass er sich nur auf Alternativen bezieht oder die Alternativen sich gegenseitig ausschließen, wenngleich die Offenbarung eine Definition stützt, die sich nur auf Alternativen und ”und/oder” bezieht. Der Begriff ”etwa” wird in der gesamten Anmeldung verwendet, um zu zeigen, dass ein Wert die Fehlervariation, die der Vorrichtung, dem zur Bestimmung des Wertes angewandten Verfahren oder der Variation, die es zwischen den Studiensubjekten gibt, eigen ist, einschließt.
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So, wie in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, sind die Worte ”umfassend” (und alle Formen von umfassend wie ”umfassen” und ”umfasst”), ”habend” (und alle Formen von habend wie ”haben” und ”hat”), ”einschließend” (und alle Formen von einschließend wie ”einschließt” und ”einschließen”) oder ”enthaltend” (und alle Formen von enthaltend wie ”enthält” und ”enthalten”) einschließend bzw. offen und schließen zusätzliche, nicht aufgeführte Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus.
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Der Begriff ”oder Kombinationen davon”, wie hier verwendet, bezieht sich auf alle Permutationen und Kombinationen der dem Begriff vorhergehenden aufgelisteten Punkte. Zum Beispiel soll ”A, B, C oder Kombinationen davon wenigstens eine von: A, B, C, AB, AC, BC oder ABC und, falls Reihenfolge in einem bestimmten Zusammenhang wichtig ist, auch BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC oder CAB umfassen. Um mit diesem Beispiel fortzufahren, ausdrücklich umfasst sind Kombinationen, die Wiederholungen eines oder mehrerer Punkte oder Begriffe enthalten, wie etwa BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB und so weiter. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass es keine Begrenzung der Anzahl an Punkten oder Begriffen in jeder beliebigen Kombination gibt, außer wenn dies aus dem Zusammenhang anders ersichtlich ist.
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Alle Teile der vorliegenden Offenbarung können in Kombination mit einem beliebigen anderen Teil der Offenbarung gelesen werden, wenn aus dem Zusammenhang nicht offensichtlich etwas anderes hervorgeht.
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Alle der hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung ohne übermäßigen experimentellen Aufwand gemacht und durchgeführt werden. Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben; es wird dem Fachmann jedoch klar sein, dass Variationen auf die Zusammensetzungen und/oder Verfahren und bei den Schritten oder in der Reihenfolge der Schritte des hier beschriebenen Verfahrens angewendet werden können, ohne vom Konzept, Geist und Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Alle solchen ähnlichen Austäusche und Modifikationen, die dem Fachmann offensichtlich sind, werden als zum wie in den angefügten Ansprüchen definierten Geist, Schutzumfang und Konzept der Erfindung gehörig angesehen.
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Literaturstellen
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- 1. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA et al: Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013, 339(6121): 819–823.
- 2. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013, 153(4): 910–918.
- 3. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM: RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013, 339(6121): 823–826.
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Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen eingehender beschrieben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Präzise DNA-Modifikationen
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(a) Verwendung von Nickase für HDR
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Es wurde berichtet, dass sich die Cas9-Nuklease durch die Substitution eines Aspartats zu Alanin (D10A) in der RuvCl-Domäne von SpCas9 in eine Nickase umwandeln lässt (Cong et al.). Erwähnenswert ist, dass DNA-Einzelstrangbrüche vorzugsweise über den HDR-Weg repariert werden. Die Cas9-D10A-Nickase kann, wenn sie in einem Komplex mit reifer crRNA:tracrRNA vorliegt, DNA-Nicking an einem präzisen Ort spezifisch induzieren. Vor diesem Hintergrund wird vorgeschlagen, die Anwendung des CRISPR/Cas-Systems auszudehnen, indem ein Nick in einem gegebenen Ort in einem Genom mit Cas9-D10A-Nickase erzeugt und dann unter Ausnutzung des HDR-Wegs ein einzelsträngiges DNA-Fragment (endogen oder exogen), das die Nicked-DNA-Verbindung flankierende DNA-Homologie (typischerweise sind bei Recombineering 50 bp genug für effiziente Rekombination) zum Einbringen und Inserieren einer gegebenen DNA in einem präzisen Ort enthält, inseriert wird; beim vorliegenden Beispiel wird Homologie ähnlicher Größe verwendet (1A). Guide-RNA (gRNA) wird individuell pro Protospacer-Zielsequenz konstruiert oder in einen einzelnen CRISPR-Array, der für 2 oder mehr Spacer-Sequenzen codiert, eingebaut, was Multiplex-Genome-Editing von einem einzelnen CRSPR-Array gestattet.
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(b) Beispiel einer präzisen DNA-Deletion
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Um präzise Deletion unter Verwendung von Cas9 in Assoziation mit gRNA und ohne Targeting-Vektor oder Donor-DNA zu demonstrieren, wurden zwei gRNA innerhalb eines Gens in einem Abstand von 55 bp konstruiert. Die beiden gRNA befanden sich auf gegenüberliegenden DNA-Strängen, wie in 9 gezeigt.
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Maus-ES-Zellen wurden mit menschlicher Cas9-Nuklease und den beiden gRNAs transfiziert. Das Transfektionsverfahren wurde wie oben im Einzelnen beschrieben durchgeführt, doch wurden die erhaltenen Klone nicht selektioniert. Die transfizierten ES-Klone wurden unter Verwendung eines die beiden gRNA überspannenden Oligo-Paars (Primer 1 & 2) zum Nachweisen einer spezifischen 55-bp-Deletion genotypisiert (10).
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Die meisten Klone zeigten nicht die spezifische 55-bp-Deletion, allerdings wurden eindeutig Klone identifiziert, die die definierte Deletion enthielten. Es stellte sich heraus, dass von den 384 analysierten Klonen ungefähr 4% der Klone die spezifische 55-bp-Deletion enthielten. Anmerkung: Nicht alle Genotypisierungsdaten sind gezeigt. Die Klone mit der spezifischen 55-bp-Deletion wurden weiter analysiert, und zwar durch Sequenzieren der PCR-Produkte als endgültige Bestätigung (Daten nicht gezeigt). Weiterhin wurde beobachtet, dass dort, wo die spezifische Deletion zu sehen war, beide Allele die spezifische Deletion enthielten. Diese Daten bestätigten, dass bei Verwendung von zwei gRNAs eine präzise und spezifische Deletion gemacht werden kann, ohne dass ein Targeting-Vektor benötigt wird. Allerdings darf man annehmen, dass sich die Effizienz der definierten Deletion mit der Zwei-gRNA-Kombination zusammen mit einem Targeting-Vektor oder einem Donor-DNA-Fragment mit den vorgesehenen Deletionsbereich flankierenden Homologiearmen stark verbessern lässt.
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(c) Alternative Methodologie für Deletion von DNA
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In einem separaten Aufbau können zwei gRNA oder ein einzelner CRISPR-Array, der Mehrfach-Spacer-Sequenz codiert, konstruiert werden, die ein interessierendes Gen oder einen interessierenden Bereich flankieren, wobei mit der Assoziation von Cas9-D10A-Nickase zwei getrennte Einzelstrangbrüche induziert werden können. Damit kann in Assoziation mit einem einzelsträngigen DNA-Fragment mit DNA Homologie zur 5'-Bruchstellenverbindung des ersten DNA-Nick und DNA Homologie zur 3'-Bruchstellenverbindung des zweiten Nick der Bereich zwischen den beiden Einzelstrang-DNA-Nicks präzise deletiert werden (2A).
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(d) Alternative Methodologie für Austausch von DNA
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In einem weiteren Aufbau können zwei separate gRNA oder ein einzelner Multiplex-CRISPR-Array konstruiert werden, die ein interessierendes Gen oder einen interessierenden Bereich flankieren, wobei mit der Assoziation von Cas9-D10A-Nickase zwei getrennte Einzelstrangbrüche induziert werden können. In diesem Fall kann das eindringende einzelsträngige DNA-Fragment (oder Doppelstrang-DNA) DNA-Sequenz aus entweder endogener oder exogener Quelle mit Sequenz für ein bekanntes Gen, regulatorisches Element, Promotor usw. enthalten. Dieses einzelsträngige DNA-Fragment (oder Doppelstrang-DNA) kann zusammengebracht werden, um den von DNA-Nick flankierten interessierenden DNA-Bereich zu ersetzen, indem es mit DNA-Homologie aus dem 5'-Bereich des ersten Nick und dem 3'-Bereich aus dem zweiten Nick ausgerüstet wird (3A). Aufgrund der hohen Effizienz des CRISPR/Cas-Systems, DNA zu spalten, ist bei der obigen vorgeschlagenen Strategie keine Einführung eines Selektionsmarkers notwendig, womit exaktes nahtloses Genome-Editing auf präzise und definierte Weise geschaffen wird. Als Option kann ein von PiggyBac-LTRs flankierter Selektionsmarker enthalten sein, um die direkte Selektion korrekt modifizierter Klone zu gestatten. Sobald die korrekten Klone identifiziert worden sind, kann der Selektionsmarker durch die Expression hyperaktiver piggyBac-Transposase bequem entfernt werden (Yusa K., Zhou L., Li M. A., Bradley A., Craig N. L.: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108(4): 1531–1536). Weiterhin können die obigen Ansätze auf ES-Zellen, Sängerzellen, Hefezellen, Bakterienzellen, Pflanzenzellen angewandt werden ebenso wie direkt in Zygoten erfolgen, um den Vorgang homozygoter Genommanipulation in Rekordzeit voranzutreiben. Es wäre auch möglich, dieses System in Multiplex-Form zu bringen, um mehrere gleichzeitige DNA-Insertionen (KI), -deletionen (KO) und die sequentielle Deletion und Insertion (KO → KI) zu erzeugen.
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(e) Beispiel für DNA-Deletion und -Insertion an einem vorgegebenen Ort (KO → KI)
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Um zu zeigen, dass ein gewünschter DNA-Bereich unter Verwendung von Cas9 manipuliert werden kann, wurde eine einzelne Guide-RNA (gRNA) an einem gewünschten Bereich ausgewählt (Exon 1 von Gen X) 7. Auch wurde ein Targeting-Vektor konstruiert, der ungefähr 300 bp Homologiearme (5'- und 3'-HA), die die gRNA flankieren, enthielt. Die Homologiearme hybridisieren genau im definierten Bereich, womit ein 50-bp-Bereich, der zur Deletion vorgesehen ist, deletiert wird. Der Targeting-Vektor gestattet auch die Insertion einer beliebigen interessierenden DNA-Sequenz. Dieses Proof-of-Concept-Experiment erfolgte unter Beteiligung einer ungefähr 1,6 kb großen PGK-Puromycin-Kassette. Die Guide-RNA (0,5 μg) wurde zusammen mit dem Targeting-Vektor (1 μg) und Cas9-Nuklease-Vektor (1 μg) in ES-Zellen transfiziert, wobei nach Selektion auf Puromycin unter Verwendung der oben beschriebenen Vorschrift 96 Klone gewählt wurden. Anmerkung. Als Test für Targeting-Effizienz wurde ein Vergleich linearer gegen zirkulärer Targeting-Vektor durchgeführt. Ebenso wurde als Negativkontrolle das gleiche Experiment ohne Verwendung von Cas9-Vektor durchgeführt, um Targeting-Effizienz über homologe Rekombination mit und ohne Cas9-Expression zu vergleichen.
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Alle ausgewählten Klone waren puromycin-resistent, und die aus jeder der vier Transfektionen gewählten 96 Klone wurden unter Verwendung des Oligo-Paars HAP341/HAP334 genotypisiert. Korrekt als Ziel gefundene Klone ergaben ein 880 bp großes PCR-Produkt. Die erhaltenen Genotypisierungsdaten sind in 8 dargestellt.
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Anhand der Genotypisierungsdaten aus diesem Experiment ist ersichtlich, dass ein Cas9-vermittelter DNA-Doppelstrangbruch die homologe Rekombinationseffizienz des Targeting-Vektors stark verbessert, da 62% bzw. 49% der Klone mittels zirkulärem bzw. linearem Targeting-Vektor korrekt als Ziel gefunden wurden, gegenüber nur einem einzelnen mittels zirkulärem Targeting-Vektor als Ziel gefundenen Klon, wenn keine Cas9 verwendet wurde. Auch ist anhand dieser Daten ersichtlich, dass der zirkuläre Targeting-Vektor eine geringfügig bessere Targeting-Effizienz ergab als die bei Verwendung von linearem Vektor, doch lässt sich anhand dieses Einzelexperiments keine allgemeine Schlussfolgerung ziehen, außer dass man sagen kann, dass sowohl zirkulärer als auch linearer Targeting-Vektor in Assoziation mit Cas9 und einer spezifischen Guide-RNA zu stark verbesserter Targeting-Effizienz führten. Ebenso zeigte dieses Experiment, dass der Einsatz von Cas9 zur Erzeugung eines definierten DNA-Bruchs verwendet werden kann, um einen definierten DNA-Bereich zu deletieren und anschließend ein beliebiges interessierendes DNA-Fragment einzufügen.
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Beispiel 2: Recvcling von PAM für sequentielle Insertionen oder Deletionen
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In gewissen Situationen kann es sinnvoll sein, ein Genom durch Chromosomen-Walking zu editieren. Unter Verwendung eines der drei oben skizzierten Beispiele könnte es möglich sein, sequentielles Genome-Editing schrittweise durchzuführen, wobei die in einer vorherigen Runde von CRISPR/Cas-vermitteltem Genome-Editing verwendete PAM-Sequenz wiederverwendet werden kann, um mehrere Runden Genome-Editing wie Deletionen, Insertionen oder die gleichzeitige Deletion und Insertion durchzuführen. Ein Beispiel für sequentielle Deletion, wobei ein Recycling der PAM-Sequenz vom vorherigen Genome-Editing-Schritt erfolgt, ist in 4A dargestellt. Mit dem PAM-Recycling-Ansatz ist es möglich, sequentielle Insertionen ebenso wie sequentielle gleichzeitige Deletion und Insertion durchzuführen.
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Das Recycling der PAM-Sequenz erfolgt durch ihre Wiedereinführung über homologe Rekombination und als Teil des Homologiearms. Die PAM-Sequenz kann sich gegebenenfalls in Begleitung einer einmaligen Guide-RNA-Sequenz befinden, wobei eine neue Stelle innerhalb des Wirtsgenoms für eine weitere Runde Genome-Editing geschaffen wird.
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Beispiel 3: Schnelle Insertion von Lox-Stellen mittels CRISPR/Cas-System
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Die Targeting-Effizienz bei Verwendung herkömmlicher homologer Rekombinationsverfahren in ES-Zellen ist niedrig. In einem unterschiedlichen Aufbau kann das CRISPR/Cas-System zur schnellen und effizienten Einführung von lox-Stellen oder anderer Rekombinase-Erkennungssequenz wie Frt an einem definierten Ort verwendet werden, um als Landeplatz für Genome-Editing mittels RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange [durch Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch]) zu fungieren (Qiao J., Oumard A., Wegloehner W., Bode J.: Novel tag-and-exchange (RMCE) strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties., J. Mol. Biol., 2009, 390(4): 579–594; und Oumard A., Qiao J., Jostock T., Li J., Bode J.: Recommended Method for Chromosome Exploitation: RMCE-based Cassette-exchange Systems in Animal Cell Biotechnology., Cytotechnology, 2006, 50(1–3): 93–108). Sobald die lox-Stellen in das Genom eingeführt sind, kann Inversion, Deletion oder Kassettenaustausch zum Deletieren und Einführen von DNA-Fragment variierender Größe an dieser Stelle über Expression von Cre-Rekombinase effizient ausgeführt werden. Ein Beispiel für CRISPR/Cas-vermittelte lox-Insertion mit anschließendem RMCE ist in 5A dargestellt. Der RMCE-Schritt kann zur Inversion des von einer lox-Stelle flankierten Bereichs oder zur Deletion dieses Bereichs ebenso wie zur gleichzeitigen Deletion und Insertion interessierender DNA in diesem Bereich verwendet werden. Weiterhin kann der RMCE-Schritt für das Durchführen mehrerer sequentieller RMCE-Runden (sRMCE) angepasst sein.
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Beispiel 4A:
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Es wird auf 6A verwiesen. Ein piggyBac-Transposon, das ein von einem PGK-Promotor getriebenes von loxP/lox-Mutante flankiertes neoR-Gen trägt, wird durch standardmäßige homologe Rekombination zielgerichtet in ein ES-Zellgenom eingebracht. Die Zielklone können mit G418 selektioniert werden. Damit wird ein Landeplatz für den folgenden RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange) bereitgestellt. Ein solcher ES-Klon als Ausgangszelle für alle weiteren Modifikationen verwendet werden. Eine Kassette mit dem von loxP/lox-Mutante flankierten promotorlosen PuroΔTK-T2A-Cas9-Gen und dem von einem U6-Polymerase-III-Promotor getriebenen Guide-RNA(gRNA)-Gen wird durch transiente cre-Expression in den Landeplatz inseriert. Bei den gRNA-Genen kann es sich um eines oder mehrere handeln, die auf das gleiche Gen oder unterschiedliche Gene zielen. Die Insertionsklone können mit Puromycin selektioniert und mit Junction-PCRs bestätigt werden. Während der Selektion führt die Expression von Cas9 und gRNAs aus der inserierten Kassette zu effizienterem Gen-Targeting bzw. zu effizienterer Genmodifikation als durch transiente Expression der Cas9 und gRNA erzielt werden kann. Nach 4–6 Tagen Selektion wird die gesamte modifizierte Kassette durch die transiente Expression von piggyBac transposase (PBase) ausgeschnitten. Die endgültigen ES-Zellklone würden keine Cas9- oder gRNA-Sequenz enthalten. Die Klone mit homozygoten modifizierten Genen würden durch PCR und Sequenz bestätigt.
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Das Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Cas9- und gRNA-Expression in einer gewissen Zeit zu kontrollieren, so dass sie ausreicht, um effiziente Targeting-Raten zu erzeugen.
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Example 4B: Einzelkopie-Cas9-Expression
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Wie in Beispiel 6 ausführlich beschrieben, wurde, um die einzelne und stabile Expression von Cas9 von innerhalb des Chromosoms einer Zelle zu demonstrieren, ein Landeplatz-Vektor zielgerichtet in das Rosa26-Allel auf Chromosom 6 eingebracht. DNA-Homologiearme wurden verwendet, um den Landeplatz-Vektor zielgerichtet zwischen Exons 2 und 3 von Rosa26 einzubringen. Der Landeplatz-Vektor wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise zielgerichtet in ES-Zellen eingebracht. Die transfizierten ES-Klone wurden auf G418 selektioniert und auf korrektes Targeting (11) genotypisiert, indem die 5'- und 3'-Homologiearm-Verbindungsstellen PCR-amplifiziert wurden.
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Targeting des Landeplatzes ergab viele ES-Zielklone. Eine Auswahl der Zielklone wurde zur Insertion einer DNA-Kassette, die Cas9-Nuklease verknüpft mit Puro-delta-tk über eine T2A-Sequenz enthielt, in den Ziel-Landeplatz über RMCE verwendet, was die Expression von Cre-Rekombinase beinhaltete. Die entsprechenden loxP- und lo2272-Stellen sowohl innerhalb des Landeplatzes als auch des hereinkommenden Vektors gewährleisteten eine korrekte Insertionsorientierung. Da der Landeplatz einen genlosen PGK-Promotor enthielt, aktivierte eine korrekte Insertion der hereinkommenden Cas9 enthaltenden Vektor-DNA die Expression von Puromycin, womit Klone positiv auf Puromycin selektioniert wurden. Nicht spezifisches Targeting dieser DNA-Kassette ergibt keine puromycin-resistenten Klone aufgrund des Fehlens eines die Transkription des promotorlosen Puromycin-Gens in der eingefügten DNA-Kassette treibenden Promotors. Der ursprüngliche in den Landeplatz inserierte Cas9-Vektor enthielt keine Guide-RNA-Sequenz. Die puromycin-resistenten ES-Klone wurden durch PCR auf die korrekte Insertion von Cas9 genotypisiert (12).
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Wie aufgrund der positiven Selektion erwartet, wurden die meisten auf Insertion des Cas9-Vektors genotypisierten Klone bezogen auf die PCR-Genotypisierungsergebnisse über RMCE korrekt als Ziel gefunden. Zwei der korrekten Klone (KHK1.6 Z2-24-27 und KHK1.10Z2-25-4, als positive Z-Klone bezeichnet), die nun die Einzelkopie-Cas9 integriert in das Rosa26-Gen als Einzelkopie enthalten, wurden verwendet, um zu testen, ob die Cas9-Expression zum Induzieren von Cas9-vermitteltem Genome-Editing ausreichend war. In die beiden positiven Z-Klone wurde Guide-RNA gegen ein als Gen Y bezeichnetes Gen unter Verwendung einer oben beschriebenen Vorgehensweise transfiziert. Nach Transfektion und Expansion der erhaltenen ES-Klone wurden aus jeder Transfektion 36 Einzelklone isoliert und zunächst mit PCR unter Verwendung von die Guide-RNA flankierendem Oligo analysiert (13).
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Die meisten Klone ergaben ein PCR-Produkt mit einer zur Positivkontrolle-PCR, bei der DNA aus Maus-AB2.1-ES-Zellen verwendet wurde, gleichwertigen Größe. Allerdings ist klar zu sehen, dass einige Klone ein PCR-Produkt ergaben, das deutlich kleiner als das der Positivkontrolle ist, was darauf schließen lässt, dass diese Klone eine signifikante Deletion über Indel enthalten. Um dies zu verifizieren und zu prüfen, ob der Rest der PCR-Produkte trotz ähnlicher Größe zur Positivkontrolle keine Indels enthielt, wurden alle PCR-Produkte mittels Qiagen-Gelextraktionskit aufgereinigt und durch Sequenzieren analysiert. Die Sequenzierdaten bestätigten eine signifikante Deletion bei denjenigen PCR-Produkten, die kürzere Produkte als die Positivkontrolle ergaben. Dabei wurde auch hervorgehoben, dass einige der anderen Klone mit ähnlicher PCR-Produktgröße zur Positivkontrolle Indels enthielten, was verschiedene Kombinationen von Insertion und Deletion beinhaltete (Sequenzierdaten nicht gezeigt). Von den analysierten Klonen enthielten 18% ein Indel. Diese Daten zeigten eindeutig, dass eine Einzelkopie-Expression von Cas9 zur Durchführung von Genome-Editing verwendet werden kann, wobei diese Klone nun als Cas9-Wirtszellen zum Durchführen einer Vielzahl von Genome-Editing verwendet werden können. Diese ES-Klone werden nun zur Erzeugung transgener Mauslinien verwendet, wobei ein Ein-Schritt-Genome-Editing durchgeführt werden kann, indem lediglich Guide-mRNA direkt in Zygoten injiziert wird, ohne dass Transkription von Cas9-mRNA erforderlich ist, so dass die Vorschrift für Ein-Schritt-Genome-Editing vereinfacht wird.
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Beispiel 5(A): Methodik
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A: Rekonstruktion des CRISPR/Cas-Vektor-Systems (Nuklease)
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Das CRISPR/Cas-Genome-Editing-System wurde in vitro rekonstruiert und beispielhaft in embryonalen Stammzellen der Maus unter Verwendung des Vektors pX330, der humanisiertes S. pyogenes (hSpCsn1) enthielt (
Cong et al.), veranschaulicht. Das CRISPR/Cas-System lässt sich wie bei Cong et al beschrieben unter Verwendung synthetischer DNA-Stränge und DNA-Konstruktion rekonstruieren. Im vorliegenden Beispiel würde die gesamte DNA-Konstruktion aus einem 6006 bp großen Fragment bestehen, das 45 bp Homologie zum pBlueScript KS+-Vektor 5' zur EcoRV-Schnittstelle, menschlichen U6-Promotor, zwei Bbsl-Restrikitionsstellen für Klonieren in der Spacer-Sequenz, die an eine chimäre Guided-RNA-Sequenz fusioniert, Huhn-beta-Actin-Promotor mit 3 FLAG, Kernlokalisierungssignal (NLS) gefolgt von hSpCsn1-Sequenz und einem weiteren NLS, bGH-polyA, ITR(Inverted Terminal Repeat)-Sequenz und schließlich weitere 45 bp Homologie zum pBlueScript KS+-Vektor 3' zur EcoRV-Schnittstelle enthält. Dieser 6006 bp lange DNA-Abschnitt wird in Form von 7 einzelnen DNA-Fragmenten synthetisiert, wobei jedes Fragment eine 45 bp große Überlappung mit dem benachbarten DNA-Fragment aufweist, um die DNA-Konstruktion zu gestatten. Die DNA-Sequenz dieser Fragmente ist nachfolgend in der Reihenfolge der Konstruktion dargestellt. Fragment 1A (1340 bp)
![Figure DE202014010413U1_0003](https://patentimages.storage.googleapis.com/e1/3c/f1/9e2aff1c9c55ff/DE202014010413U1_0003.png)
Fragment 2 (852 bp)
Fragment 3 (920 bp)
Fragment 4 (920 bp)
Fragment 5 (920 bp)
Fragment 6 (789 bp)
Fragment 7 (535 bp)
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Zur Rekonstruktion des CRISPR/Cas-Systems, beschrieben in Cong et al, werden die obigen DNA-Fragmente zusätzlich zu EcoRV-linearisiertem pBlueScript KS+-Vektor unter Verwendung des Gibson Assembly Kit (NEB Cat No. E5510S) zusammengesetzt. In einem alternativen Ansatz kann das 6006 bp große Fragment durch Assembly-PCR konstruiert werden, indem die einzelnen DNA-Fragmente im Molverhältnis zusammen gemischt werden und das DNA-Gemisch als PCR-Matrize verwendet wird. Das konstruierte PCR-Produkt kann dann direkt in pBlueScript-Vektor oder ein Standardklonierungsvektorsystem wie etwa ein TOPO-TA-Klonierung-Kit (Invitrogen) kloniert werden.
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B: Rekonstruktion des CRISPR/Cas-Vektor-Systems (D10A-Nickase)
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Die D10A-Nickase-Version des CRISPR/Cas-Systems kann zweckmäßig durch Zusammensetzen der obigen Fragmente rekonstruiert werden, wobei Fragment 2 durch Fragment 2A, das die D10A-Substitution enthält, ersetzt wird (siehe nachfolgende Sequenz). Fragment 2A (852 bp)
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Das zu Alanin substituierte Aspartat ist in Fettdruck hervorgehoben und unterstrichen.
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C: Ziel-(Spacer-)Sequenz-Klonierung
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Die Ziel-Spacer-Sequenz kann in das obige CRISPR/Cas-Vektor-System über die stromaufwärts von der chimären Guided-RNA-Sequenz lokalisierten Bbsl-Restriktionsstellen kloniert werden. Die Spacer-Sequenz kann in Form von Oligo-Paaren bestellt und einem Annealing zusammen mit Überhängen wie nachfolgend dargestellt unterzogen werden, um eine direkte Klonierung in mit Bbsl linearisierten CRISPR/Cas-Vektor unter Verwendung molekularbiologischer Standardvorschriften zu gestatten.
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Sequenz eines beispielhaften Oligopaars mit Spacer-Sequenz:
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Die unterstrichene 4-bp-Überhangsequenz muss in den Spacer-Oligos enthalten sein, um Klonierung in die Bbsl-Restriktionsstelle im CRISPR/Cas-Vektor zu erleichtern. Unter Verwendung dieses Ansatzes lässt sich jede Spacer-Sequenz bequem in den CRISPR/Cas-Vektor klonieren.
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D: Rekonstruktion des CRISPR/Cas-Systems für Ein-Schritt-Erzeugung transgener Tiere
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Um ein CRISPR/Cas-System für Ein-Schritt-Erzeugung eines transgenen Tiers zu rekonstituieren, wie bei Wang et al. (
Wang H., Yang H., Shivalila C. S., Dawlaty M. M., Cheng A. W., Zhang F., Jaenisch R.: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering., Cell, 2013, 153(4): 910–918) beschrieben, wo direkte Embryoinjektion verwendet wird, muss das oben ausführlich dargestellte CRISPR/Cas-Vektor-System zum Einbauen eines T7-Polymerase-Promotors zur Cas9-Codiersequenz modifiziert werden. Darüber hinaus muss die gRNA entfernt und durch Annealing von Oligos getrennt synthetisiert oder synthetisch hergestellt werden (siehe unten für eine Beispiel-T7-Spacer-Sequenz, fusioniert an chimäre Guided-RNA-Sequenz – T7-gRNA). Anzumerken ist, dass die Spacer-Sequenz idealerweise in einem einmaligen Bereich eines gegebenen Chromosoms konstruiert wird, um einen Off-Target-Effekt zu minimieren, wobei auch die jeweilige genomische Protospacer-Sequenz eine PAM-Sequenz am 3'-Ende aufweisen muss. T7-gRNA-Beispielsequenz
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Die unterstrichenen 20 bp von N's stellen die Spacer-Sequenz für eine gegebene Ziel-DNA dar.
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Zur Rekonstruktion des Ein-Schritt-CRISPR/Cas-Systems können die oben im Einzelnen aufgeführten DNA-Fragmente (Fragmente 2, 3, 4, 5, 6 & 7) zusammengesetzt werden, wobei Fragment 1A (mit 45 bp Homologie zum pBlueScript KS+-Vektor 5' zur EcoRV-Restriktionssstelle, menschlichem U6-Promotor, Bbsl-Restriktionsstellen, chimärer Guided-RNA-Sequenz und Huhn-b-Actin-Promotor) durch Fragment 1 ersetzt wird, das lediglich 45 bp Homologie zum pBlueScript KS+-Vektor und die DNA-Sequenz für T7-Polymerase-Promotor mit 45 bp Homologie zu Fragment 2 enthält. Hierdurch entsteht die Nuklease-Version des CRISPR/Cas-Systems für Ein-Schritt-Erzeugung transgener Tiere. Zur Erzeugung der Nickase-Version kann Fragment 2 durch Fragment 2A ersetzt werden, wie oben ausführlich dargestellt, wobei danach Fragmente 1, 2A, 3, 4, 5, 6 und 7 entweder mit Gibson-Assembly oder Assembly-PCR zusammengesetzt werden können. Fragment 1 (111 bp)
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E: Herstellung von Oligo/DNA-Fragmenten für HDR-vermittelte Reparatur
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DNA-Oligos im Bereich von 15 bp und hoch bis oberhalb > 125 bp werden durch Sigma Custom Oligo Synthesis Service synthetisiert. Die Oligos können eine beliebige Sequenz enthalten, wie etwa eine definierte Mutation, eingeführte Restriktionsstellen oder eine interessierende Sequenz, einschließlich Rekombinationserkennungssequenz wie loxP oder Derivate davon, Frt und Derivate davon oder PiggyBac-LTR oder beliebige andere Transposonelemente oder regulatorische Elemente, einschließlich Enhancer, Promotorsequenz, Reportergen, Selektionsmarker und Tags. In der Oligo-Konstruktion wird DNA-Homologie zum Bereich, wo Cas9 DNA-Doppelstrangbruch oder DNA-Nick vermittelt, eingebaut. Die Größe der Homologie liegt im Bereich von einigen wenigen Basenpaaren (2–5 bp) bis hoch zu und oberhalb von 80 bp. Größere DNA-Fragmente (> 100 bp bis zu mehreren Kilobasen) werden entweder synthetisch (GeneArt) oder mit PCR hergestellt. Das DNA-Fragment wird entweder mit oder ohne flankierte NLS oder nur mit einer einzelnen NLS und entweder mit einem oder ohne einen Promotor (z. B. T7-Polymerase-Promotor) synthetisiert. Die DNA kann als einzelsträngiges DNA-Fragment unter Verwendung entweder des Verfahrens des Einfangs biotinylierter Ziel-DNA-Sequenz (Invitrogen: Dynabeads M-270 Streptavidin) oder einer anderen Standard- und etablierten Methodik zur Präparation von Einzelstrang-DNA hergestellt werden. Die Einzelstrang-DNA kann für die Mikroinjektion mittels IVT wie oben beschrieben hergestellt und die mRNA zusammen mit Cas9-mRNA und gRNA injiziert werden. Das DNA-Fragment kann auch als doppelsträngiges DNA-Fragment coinjiziert werden. Das DNA-Fragment wird von DNA-Homologie zu der Stelle, wo Cas9 DNA-Doppelstrangbruch oder DNA-Nick vermittelt, flankiert. Die DNA-Homologie kann im Bereich von einigen wenigen Basenpaaren (2–5 bp) bis zu oder oberhalb von mehreren Kilobasen liegen. Das DNA-Fragment kann zum Einführen beliebiger endogener oder exogener DNA verwendet werden.
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HDR-vermittelte Reparatur kann auch in ES-Zellen nach CRISPR/Cas-vermittelter DNA-Spaltung erfolgen. Das oben genannte Donor-Oligo- oder -DNA-Fragment kann in ES-Zellen zusammen mit dem CRISPR/Cas-Expressionsvektor cotransfiziert werden.
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F: Herstellung von Cas9-mRNA und gRNA
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Den T7-Polymerase-Promotor mit dem Codierbereich für humanisierte Cas9 enthaltender Vektor wird unter Verwendung von Oligos Cas9-F und Cas9-R PCR-amplifiziert. Das T7-Cas9-PCR-Produkt kann gel-extrahiert und die DNA unter Verwendung von Qiagen-Gelextraktionskit aufgereinigt werden. Die aufgereinigte T7-Cas9-DNA wird für In-vitro-Transkription (IVT) unter Verwendung von mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Life Technologies Cat No. AM1345) verwendet. Der Vektor mit der T7-gRNA kann unter Verwendung von Oligos gRNA-F und gRNA-R PCR-amplifiziert werden, wobei die PCR-Produkte wiederum per Gel aufgereinigt werden. IVT der T7-gRNA wird mit MEGAshortscript T7 Kit (Life Technologies Cat No. AM1354) durchgeführt und die gRNA mit MEGAclear Kit (Life Technologies Cat No. AM1908) aufgereinigt und in RNase-freiem Wasser eluiert.
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Beispiel 5B: Ein-Schritt-Erzeugung transgener Tiere
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A: Verfahren zur Transfektion von ES-Zellen
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Maus-embryonale Stammzellen AB2.1 und Derivate dieser Linie werden zum Transfizieren der säugercodon-optimierten Cas9 und sgRNA von einem einzelnen Expressionsvektor oder, falls gewünscht, von getrennten Vektoren verwendet. AB2.1-ES-Zellen werden auf einer PSNL76/7/4-MEF-Feeder-Schicht in M-15: Knockout DMEM (Gibco, kein Pyruvat, hohe Glucose, 15% FBS, 1xGPS, 1xBME) mit Standard-ES-Zellkulturtechniken kultiviert. Die Transfektion von CRISPR/Cas-Expressionsvektor gegebenenfalls zusammen mit einem zusätzlichen Donor-Oligo- oder -DNA-Fragment erfolgt durch Elektroporation nach dem Amaxa 4D-Nucleofector® Protocol (Lonza). Ein PGK-Puro exprimierendes Plasmid wird ebenso gegebenenfalls cotransfiziert, um die Transfektionseffizienz zu fördern.
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In einem Verfahren werden ES-Zellen nach Transfektion zurück auf Feeder-Platten ausplattiert, wobei Puromycin (2 μg/ml) 72 Stunden nach Transfektion 7 Tage lang zugegeben wird, wonach Kolonien gewählt und mit PCR genotypisiert werden. Positive Kolonien werden auf Feeder-Schicht weiter kultiviert und expandiert, wobei, wenn nötig, Selektionsmarker unter Verwendung eines PiggyBac-Transposon-Systems ausgeschnitten werden. Dies erfolgt mittels Elektroporation von ES-Zellen mit einem HyPbase enthaltenden Plasmid nach dem Amaxa 4D-Nucleofector® Protocol (Lonza). Die ES-Zelle wird zurück auf Feeder-Platten ausplattiert. ES-Zellen werden 2–3 Tage nach Transfektion passagiert und nach weiteren 2–3 Tagen mit unterschiedlichen Zelldichten (1:10, 1:20, 1:100 und 1:300) ausplattiert, wobei FIAU-Selektion (2 μg/ml) 24 Stunden nach Umplattieren zugesetzt wird. Nach 7–10 Tagen auf Selektionsmedium werden Kolonien gewählt und mittels PCR-Genotypisierung analysiert. Positive Klone werden auf Feeder-Schicht weiter kultiviert und expandiert und zur Mikroinjektion von Zygoten (Blastozysten) geschickt.
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Bei einem alternativen Verfahren werden ES-Zellen 8 Stunden vor Transfektion mit einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen unter Verwendung von antibiotikafreiem M-15 Knockout DMEM (Gibco, kein Pyruvat, hohe Glucose, 15% FBS, 1xL-Glutamin, 1xBME) auf 6w-Feeder-Platten ausgesät. Transiente Transfektion erfolgt mittels Lipofectamine® LTX Reagent mit PLUSTM Reagent (InvitrogenTM) nach Standardvorschrift. Nach einer Inkubationszeit werden Transfektionsreagentien auf Feeder-Platten (kultiviert in antibiotikafreiem Medium) übertragen, wobei das Medium (M-15) auf diesen Platten nach Transfektion wenigstens 24 Stunden lang nicht gewechselt wird. 48 Stunden nach Transfektion werden die ES-Zellen in eine einzelne Zellsuspension trypsinisiert, wobei eine Zellzählung durchgeführt wird und die Zellen mit unterschiedlichen Zelldichten im Bereich von 100–5000 Zellen pro 10 cm-Feeder-Platte ausplattiert werden. 24 Stunden nach Umplattieren werden die Zellen 4 Tage Puro-Selektion mit 2 μg/ml (Puromycin-Dihydrochlorid von Streptomyces alboniger, Pulver, P8833 Sigma) ausgesetzt, wonach die Zellen wieder in M-15 kultiviert werden. 10–13 Tage nach Transfektion werden Kolonien gewählt.
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Verfahren 5C: Mikroiniektion von Mauszygoten – Verfahren 1
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Materialien und Reagentien:
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- • M2 (Sigma M7167)
- • Embryo Max KSOM (Speciality media MR-020P-F)
- • Hyaluronidase (Sigma H4272)
- • Mineral Oil (Sigma, M-8410)
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Mögliche Donor-Stämme:
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- • S3F/S3F; KF3/KF3
- • S3F/S3F; K4/K4
- • S7F/S7F
- • K5F/K5F
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Präparation von Zygoten und Mikroinjektion:
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Die Vorschrift ist wie beschrieben in: A. Nagy Et al. Manipulating the Mouse Embryo 3 Ausgabe. Kapitel 7, Protocols 7-1, 7-6, 7-10, 7-11. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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Kurzdarstellung:
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- 1. Zygoten werden superovulierten weiblichen E0.5dpc-(day post-coitum)-Mäusen entnommen.
- 2. Die Zygoten werden zur Dispersion von Cumuluszellen in Hyaluronidase inkubiert.
- 3. Zygoten werden gesammelt und auf mehrere Tropfen M2-Medium überführt, um die Hyaluronidase-Lösung und Zelltrümmer abzuspülen. Zygoten werden in KSOM-Medium platziert und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert, bis sie benötigt werden.
- 4. Zygotenqualität wird beurteilt, wobei Zygoten mit normaler Morphologie zur Injektion ausgewählt, in KSOM-Medium platziert und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert werden, bis sie benötigt werden.
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Mikroinjektionsaufbau:
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Die Injektionsvorgänge erfolgen an einem inversen Mikroskop Nikon Eclipse Ti mit Eppendorf-Mikromanipulatoren und einem Eppendorf-Femtojet-Injektionssystem. Ein Objekttäger wird vorbereitet, indem ein großer Tropfen von ~200 Mikroliter M2 in die Mitte gegeben wird.
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Mikroiniektion:
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Eine angemessene Anzahl Zygoten auf den Objektträger platzieren. Die Zygoten untersuchen und nur solche mit normaler Morphologie (2 ausgeprägte Vorkerne sind sichtbar) auswählen. Unter Halten einer Zygote mit einem männlichen Vorkern am nächsten zur Injektionspipette diese vorsichtig durch die Zona pellucida in den Vorkern drücken, Injektionsdruck anlegen, der Vorkern sollte sichtbar anschwellen, die Injektionspipette schnell entfernen. Die injizierte Zygote kann abgesetzt werden, während der Rest injiziert wird.
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Am Ende der Injektionsrunde sollten alle lebensfähigen injizierten Zygoten in vorbereitete Schalen, die Tropfen von KSOM enthalten, platziert und inkubiert werden, bis sie für die chirurgische Implantation bereit sind. Sie werden 2–3 Stunden vor der chirurgischen Implantation in scheinschwangere Weibchen inkubiert. 21 Tage später werden Jungtiere geboren.
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Verfahren 5C: Mikroiniektion von Mauszygoten – Verfahren 2
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Materialien und Reagentien
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- – PMSG
- – hCG
- – M2 (Sigma M7167)
- – Embryo Max KSOM (Specialty media MR-020P-F)
- – Mineralöl (Sigma, M-8410)
- – Hyluronidase (Sigma H 4272)
- – 35 mm-Falcon-Petrischalen (Fisher 08-757-100A)
- – Scharfe Scheren
- – Spitze Uhrmacherpinzetten
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Präparation von Oozyten:
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- 1. Tag 0: Den Weibchen mittels IP-Injektion PMSG (5 I. U.) geben.
- 2. Tag 2: 48 Stunden später den Weibchen mittels IP-Injektion hCG (5 I. U.) geben. Weibchen mit Zuchtmännchen paaren.
- 3. Tag 3: Plugs prüfen, weibliche Mäuse mit Plug durch CO2-Erstickung oder Genickbruch an Tag 0.5 dpc um 8.00 Uhr töten.
- 4. Den Unterleib sezieren, Ovarium und Fettpölsterchen lokalisieren, den Eileiter unter Zurücklassen des Ovariums und Fetts herausschneiden, das Uterushorn auf ~1 cm stutzen, in eine 35 mm-Petrischale mit M2 bei Raumtemperatur legen.
- 5. Jeweils ein Ovarium in eine Schale mit Hyaluronidase-Lösung in M2 (~0,3 mg/ml) bei Raumtemperatur legen. Durch ein Stereomikroskop bei einer Vergrößerung von 20 × oder 40 × betrachten.
- 6. Eine Pinzette verwenden, um den Eileiter zu greifen und auf dem Schalenboden zu halten. Unter Verwendung einer zweiten Pinzette oder einer 26 g-Nadel den Eileiter nahe der Stelle, an der die Zygoten lokalisiert sind (der Ampulla), zerreißen, wobei die Ansammlung von Cumuluszellen freigesetzt wird.
- 7. Die Zygoten sollten nur einige Minuten in der Hyaluronidase belassen werden, danach könnten die Zygoten geschädigt werden. Falls notwendig, Zygoten einige Male auf- und abpipettieren, um die Freisetzung der Zygoten von den Cumuluszellen zu unterstützen.
- 8. Eine Mundpipette verwenden, um die Zygoten aufzunehmen und sie in eine frische Schale mit M2 zu überführen, danach Überführen durch mehrere Tropfen M2, um die Hyaluronidase, Cumuluszellen und Zelltrümmer abzuspülen. Die Zygoten durchsortieren, dabei alle offensichtlich schlechten (fragmentierte, fehlgebildete, nicht befruchtete) entfernen und die guten (zwei Polkörperchen sollten sichtbar sein sowie alle mit Polkörperchen) in äquilibrierte Tropfen von KSOM+ AA bei 37°c und 5% CO2 platzieren, weiter inkubieren, bis sie benötigt werden. Etwa 50 Eier pro Tropfen platzieren.
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Vorkern-Mikroinjektion
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- 1. Mikroinjektionsaufbau: Die Injektionsvorgänge erfolgen an einem inversen Mikroskop Nikon Eclipse Ti mit Eppendorf-Mikromanipulatoren. Eine 60 mm-Petrischale vorbereiten, um injizierte Zygoten darin zu platzieren. Vier – sechs 40 μl-Tropfen KSOM+AA pipettieren, mit Öl bedecken und zum Äquilibrieren in einen Inkubator mit 5% CO2 stellen. Einen Objektträger mit Vertiefung vorbereiten durch Aufbringen eines großen (~200 μl) Tropfens M2-Medium auf die Mitte der Vertiefung, einen kleinen Tropfen Medium auf die linke Seite des Objektträgers geben, für die Haltepipette.
- 2. Mikroinjektion: Sicherstellen, dass der unter Druck stehende Injektor eingeschaltet und verwendungsbereit ist. Eine angemessene Anzahl Zygoten auf den Objektträger platzieren, dabei nicht mehr Zygoten zugeben als innerhalb von 20–30 min injiziert werden können. Die Haltepipette in den Tropfen M2 auf der linken Seite des Objektträgers platzieren; sie wird unter Verwendung von Kapillarkraft gefüllt, sobald sie bis etwa zur Schulter gefüllt ist, am Manipulator anbringen. Die Zygoten sorgfältig untersuchen, dabei sicherstellen, dass zwei Vorkerne sichtbar sind und die Morphologie gut ist, alle, die anomal aussehen, verwerfen. Um zu testen, ob die Injektionsnadel offen ist, die Spitze in die Nähe einer Zygote in der gleichen Bildebene bringen, ohne sie zu berühren. Mit dem unter Druck stehenden System Druck anlegen, falls sich die Zygote bewegt, ist die Nadel offen, falls nicht, ist die Nadel zu. In diesem Fall unter Verwendung der ”clear'-Funktion Druck anlegen, falls die Spitze immer noch nicht offen ist, die Spitze von Hand brechen. Vorsichtig die Spitze an der Haltepipette ”klopfen” und den obigen Test wiederholen, dabei sicherstellen, dass die Spitze nicht zu groß wird, falls dies passiert, die Nadel ersetzen und nochmal anfangen. Die Spitze der Haltepipette neben eine Zygote platzieren und sie durch Anlegen von Unterdruck auf das Ende der Pipette saugen. Das Mikroskop fokussieren, um die Vorkerne zu lokalisieren, die Zygote sollte so positioniert sein, dass Injektion in die Zygote ermöglicht wird, ohne dass die Vorkerne getroffen werden, vorzugsweise mit einer Lücke zwischen der Zona pellucida und dem Oolemma. Die Spitze der Injektionsnadel in die gleiche Bildebene wie die Zona pellucida bringen. Die Injektionspipette auf die gleiche y-Achsenposition wie die Zona pellucida bringen, die Höhe der Nadel einstellen, so dass die Spitze vollständig scharf erscheint, ohne den Fokus zu verändern. Damit wird das genaue Zielen der Nadel auf die Zygote sichergestellt. Die Injektionspipette durch die Zona pellucida drücken, durch das Zytoplasma zur Rückseite der Zygote hin. Die Nadel erzeugt eine ”Blase” durch das Oolemma, die zum Platzen gebracht werden muss, dabei sieht man, dass sie zurückspringt, an diesem Punkt die Nadel schnell entfernen, dabei sieht man, dass sich das Zytoplasma bewegt, was anzeigt, dass RNA aus der Nadel fließt. Zytoplasmatische Granula, die nach Entfernen der Injektionspipette aus den Oozyten fließen, sind ein eindeutiges Zeichen dafür, dass die Zygote bald lysieren wird. In diesem Fall, oder falls Bestandteile von Zellkern/Zytoplasma an der Injektionspipette haften, sollten die Oozyten nach der Injektion verworfen werden. Falls die Zygote intakt und erfolgreich injiziert zu sein scheint, diese in eine gute Gruppe einsortieren. Eine neue Zygote für die Injektion wählen. Es kann die gleiche Injektionspipette verwendet werden, solange sie weiter erfolgreich injiziert. Zu einer neuen Injektionspipette wechseln, falls (a) keine Verformung des Zytoplasmas zu sehen ist, (b) eine Zygote nach der anderen lysiert; (c) die Spitze der Pipette sichtbar ”dreckig” wird oder Zellkerninhalt an der Pipette haftet. Sobald alle Zygoten injiziert wurden, diese entfernen und in das äquilibrierte KSOM +AA legen und sie bei 37°C über Nacht in den Inkubator stellen. Nur die Zygoten, die die Injektion überlebt haben, überführen und zum 2-Zellen-Stadium kultivieren. Alle lysierten Zygoten und solche, die sich nicht entwickelt haben, zurücklassen.
- 3. Die Gesamtzahl an injizierten Zygoten bestimmen und die pro Empfänger übertragenen Anzahlen aufzeichnen.
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Ergebnisse
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Um die Effizienz der Ein-Schritt-Erzeugung transgener Mäuse zu demonstrieren, wurde unser T7-Cas9-Nuklease-Vektor verwendet, um mRNA über die oben ausführlich dargestellte In-vitro-Transkription zu erzeugen. Ebenso wurde mRNA von der Guide-RNA mit der oben beschriebenen In-vitro-Transkription produziert. Vor dem Injizieren des mRNA-Gemischs in das Zytoplasma wurden Oozyten aus weiblichen Mäusen nach der oben im Einzelnen aufgeführten Vorschrift präpariert. Ein mRNA-Gemisch mit 100 ng/μl Cas9-Nuklease-mRNA und 50 ng/μl Guide-mRNA wurde durch Mikroinjektion in das Zytoplasma injiziert, wie oben ausführlich dargestellt. Die Mikroinjektion erfolgt im Ein-Zellen-Stadium. Zygoten, die die Injektion überlebten, wurden bis zum 2-Zellen-Stadium kultiviert und danach in Empfänger-Mäuse übertragen.
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Insgesamt wurden 107 Zygoten injiziert, von denen 49 überlebten und in das 2-Zellen-Stadium übergingen. Diese wurden dann in zwei weibliche Empfänger-Mäuse übertragen. Hierdurch wurden 19 Jungtiere aus 2 Würfen erhalten. Wurf 1 lieferte 3 Männchen und 6 Weibchen. Wurf 2 lieferte 4 Männchen und 6 Weibchen. Die Jungtiere wurden 3 Wochen nach der Geburt am Ohr geschnitten, und DNA wurde extrahiert. PCR wurde unter Verwendung von die gRNA flankierenden Oligos durchgeführt, um mögliche Indels nachzuweisen (14).
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Durch PCR-Amplifizieren um die Guide-RNA und Auftrennen der PCR-Produkte auf einem Agarosegel wurde wenigstens eine Maus hervorgehoben, die ein großes Indel in Form einer Deletion enthielt, wohingegen andere Mäuse nach Beurteilung der Schärfe des PCR-Produkts auf dem Gel kleinere Indels zu haben schienen. Für eine erste grobe Analyse wurden alle PCR-Produkte zum Sequenzieren geschickt, wobei die mit einem Sternchen markierten (insgesamt 7 Mäuse, 14) Mischsequenzen um die gRNA ergaben, womit weiter bestätigt wurde, dass sie Indels enthalten. Um dies zu bestätigen, wurden die PCR-Produkte aus diesen 7 Mäusen zusammen mit dem PCR-Produkt aus einer anderen Maus, das keine Mischsequenz ergab (PCR-Produkt aus Spur 19, 14), einzeln in einen allgemeinen Klonierungsvektor kloniert. Von jeder einzelnen Klonierung wurden 28 Klone gewählt und durch Sequenzieren analysiert. Durch Sequenzieren wurde bestätigt, dass alle 7 Mäuse Indels enthielten und dass die Mäuse, die keine Mischsequenz enthielten, keine Indels enthielten. Die Sequenzierdaten sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
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Durch die Sequenzierdaten wurde bestätigt, dass alle analysierten Mäuse Indels enthielten. Ebenso lassen sie vermuten, dass bei Verwendung unserer oben im Einzelnen aufgeführten Zygoteninjektionsvorschrift und unseres Verfahrens zur Herstellung von mRNA für Cas9 und Guide-RNA Cas9 in einem frühen Stadium effizient arbeitet, und zwar bis zu dem Punkt, an dem sich Zellen jenseits des 2-Zellen-Stadiums zu teilen beginnen, wenn man nach der Tatsache urteilt, dass bei allen analysierten Mäusen nicht mehr als 3 Arten von Indels identifiziert wurden. Von den 7 Mäusen mit Indels wiesen 3 keine nachweisbare WT-Sequenz auf. Die weibliche Maus (KMKY6.1j), die nach der ersten Sequenzanalyse keine Mischsequenz zeigte, enthielt tatsächlich keine Indels, womit unsere erste Sequenzanalyse der PCR-Produkte validiert wird.
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Die männliche Maus (KMKY5.1 c), die keine WT-Sequenz zeigte, wurde als Paarungspartner für die beiden weiblichen Mäuse (KMKY5.1 e & KMKY6.1 e), die ebenfalls keine WT-Sequenz zeigten, verwendet. Die aus den beiden Paarungen resultierenden Jungtiere ergaben insgesamt 14 Jungtiere aus dem ersten Wurf. Nach analoger Sequenzanalyse, wobei aus dem Bereich um die Guide-RNA amplifizierte PCR-Produkte kloniert wurden, wurden einzelne und mehrere Klone dann auf das Vorliegen von Indels analysiert. Für jede Maus wurden 24 Klone durch Sequenzieren analysiert. Die Sequenzierdaten von allen 14 Jungtieren bestätigten lediglich zwei Indel-Sequenzen, die die beiden Allele widerspiegeln, die sich aus der männlichen und der weiblichen Elternmaus ergeben. Diese Daten zeigen zweifelsfrei, dass unsere Ein-Schritt-Genome-Editing-Vorschrift in einem frühen Stadium und nicht jensets des 2-Zellen-Stadiums sehr effizient arbeitet, womit komplexe Mosaik-Indel-Bildung vermieden wird. Mit unserer etablierten Vorschrift könnnen definierte Deletionen direkt in Zygoten oder kann eine definierte Deletion mit anschließender Insertion durchgeführt werden, um den Vorgang der Erzeugung transgener Mäuse zur Homozygotie in Rekordzeit voranzutreiben.
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Beispiel 6:
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Einzelkopie-Cas9-Expression in ES-Zellen
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Es wird auf 6B verwiesen.
- 1. Ein aus einem PiggyBac-Transposonelement bestehender Landeplatz mit den folgenden Merkmalen wird zielgerichtet in Maus-ES-Zellen (z. B. 129-abgeleitete ES-Zellen, wie z. B. AB2.1-ES-Zellen; Baylor College of Medicine, Texas, USA) eingebracht und auf G418 selektioniert. Das PiggyBac-Transposonelement enthält ein von loxP und lox2272 flankiertes Neomycinresistenz-Gen. Es weist auch einen genlosen PGK-Promotor auf. In diesem Beispiel wird der Landeplatz zielgerichtet in den introgenen Bereich des auf Chromosom 6 lokalisierten Gens Rosa26 eingeführt, er könnte jedoch anderswo zielgerichtet eingeführt werden. Durch das zielgerichtete Einbringen dieses Landeplatzes im Rosa26-Gen wird eine universelle ES-Zelllinie für präzises Inserieren eines beliebigen gewünschten DNA-Fragments, einschließlich DNA-Fragmenten mit Cas9, mutierter Cas9 oder einem anderen interessierenden Gen, über RMCE mit hoher Effizienz bereitgestellt. Das Targeting von Rosa26 ist vorteilhaft, da das zielgerichtet eingebrachte Konstrukt als Einzelkopie inseriert wird (anders als Zufallsintegration an irgendeiner anderen Stelle) und es unwahrscheinlich ist, dass es einen unerwünschten phänotypischen Effekt produziert.
Anmerkung. Dieser Landeplatz kann in ein beliebiges Gen in einem beliebigen Chromosom oder in der Tat in einer beliebigen eukaryontischen oder Säuger-Zelllinie, z. B. einer menschlichen, Insekten-, Pflanzen-, Hefe-, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Nager-, Schweine-, Hunde-, Katzen-, Fisch-, Hühner- oder Vogel-Zelllinie inseriert werden, wobei anschließend der entsprechende Cas9 exprimierende transgene Organismus erzeugt wird.
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Rosa 26-Locus
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Ubiquitäre Expression von Transgen in einer maus-embryonalen Stammzelle lässt sich durch Gen-Targeting zum ROSA26-Locus (auch bekannt unter: gene trap ROSA 26 or Gt(ROSA)26) durch homologe Rekombination erzielen (Lit. (a) und (b) unten). Die genomischen Koordinaten für das Maus-C57BL/6J-Rosa26-Gen auf der Grundlage von Ensemble Release 73 – September 2013 sind: Chromosom 6: 113,067,428–113,077,333; Rückwärtsstrang.
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Der Rosa26-Locus kann auch als Empfängerort zum Knock-in eines Transgens verwendet werden. In unserem Beispiel wurde der Rosa26-Locus zum Knock-in des Landeplatz-Vektors durch Targeting über homologe Rekombination in den zwischen Exons 2 und 3 lokalisierten Intronbereich von Mausstamm 129 abgeleiteter embryonaler Stammzellen unter Verwendung von ca. 3,1 kb großen Homologiearmen verwendet. Die Homologiearme wurden durch Recombineering aus einem aus Mausstamm 129 erzeugten BAC Clone gewonnen. Die Sequenz der für das Targeting verwendeten Rosa26-Homologiearme ist nachfolgend angegeben. Sequenz des Rosa26-5'-Homologiearms
Sequenz des Rosa26-3'-Homologiearms
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Literaturstellen:
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- a) Pablo Perez-Pinera, David G. Ousterout, Matthew T. Brown und Charles A. Gersbach (2012) Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Research, 2012, Bd. 40, Nr. 8 3741–3752
- b) Peter Hohenstein, Joan Slight, Derya Deniz Ozdemir, Sally F Burn, Rachel Berry und Nicholas D Hastie (2008) High-efficiency Rosa26 knock-in vector construction for Cre-regulated overexpression and RNAi. PathoGenetics 2008, 1:3
- 2. Ein zu RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange) befähigter Vektor mit einem promotorlosen puromycin-delta-tk mit In-frame-Fusion von T2A am C-Terminus gefolgt von entweder Cas9- oder mutierter Cas9-Nukleotidsequenz und einer Reihe einmaliger Restriktionsstellen flankiert von loxP und lox2272 gestattet direktes Targeting dieses Vektors in den Landeplatz durch Cre-vermittelten RMCE. Bekanntermaßen gestattet T2A ribosomales Skipping während der Translation. Die Insertion der Codiersequenz von T2A zwischen zwei Genen führt zu zwei Produkten (ein Gen, ein Transkript, aber zwei exprimierte Proteine, in diesem Fall die Cas9 und Selektionsmarker). ES-Klone mit dem korrekt inserierten DNA-Fragment können direkt auf Puromycin selektioniert werden. Dieser Ansatz stellt vorteilhafterweise auch die Einzelkopie-Expression von Cas9 im Gegensatz zu einer Zufallsintegration oder einem transienten Expressionsansatz sicher. Die Insertion des zu RMCE befähigten Vektors in den den Landeplatz enthaltenden gewünschten Locus kann direkt selektioniert werden, da der PGK-Promotor im Landeplatz die Transkription des promotorlosen Puro-Delta-Tk und Cas9 treibt. Da sich das Puro-delta-Tk in der gleichen Transkriptionseinheit wie Cas9 befindet, gewährleisten auf Puromycin selektionierte ES-Klone die Expression von Cas9.
- 3. Die obige Strategie gestattet drei getrennte Ansätze zur Expression der für das Unterbrechen (Mutation durch Indel-Bildung, Deletion oder Deletion mit anschließender Insertion) des interessierenden Gens vorgesehenen sgRNA.
- a. Die obige ES-Zelllinie mit Cas9 kann zur Erzeugung transgener Mäuse mit entweder konstitutiv exprimierter Cas9 verwendet oder für induzierbare Cas9-Expression oder in der Tat gewebespezifische Cas9-Expression, zum Beispiel Expression von Cas9 in einem Embryostadium unter Verwendung von Nanog-, Pou5f1- oder SoxB-promotor-spezifischer Cas9-Expression, modifiziert werden. Eine solche Cas9 exprimierende abgeleitete Mauslinie kann für Genome-Editing in rationalisierter Weise verwendet werden, wobei in vitro transkribierte sgRNA leicht in von solchen transgenen Mäusen erhaltene Embryos injiziert werden kann. Dadurch wird die Effizienz der Erzeugung von Mauslinien mit dem gewünschten homozygoten Genotyp verbessert und somit die Anzahl an benötigten Tieren drastisch reduziert.
- b. sgRNA kann direkt in die Cas9 exprimierenden ES-Zellen transfiziert werden, womit die Notwendigkeit einer Klonierung einzelner oder mehrfacher sgRNA in den zu RMCE befähigten Vektor umgangen wird. Dieser Ansatz gestattet die gleichzeitige sehr schnelle Insertion mehrerer sgRNA in die ES-Zellen.
- c. Mehrere sgRNA können direkt in die Mehrfachklonierungsstelle des zu RMCE befähigten Vektors kloniert werden (d. h. unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher Restriktionsendonuklease-Stellen), um Einzelkopie-Expression der Guide-RNA zu gestatten. Dieser Ansatz kann beim Begrenzen von Off-target-Effekten, die besonders relevant für solche Gene mit hoher Sequenzhomologie innerhalb des Genoms sind, sinnvoll sein.
- 4. ES-Zellen, die Cas9 und sgRNA exprimieren, können direkt auf puromycinhaltigem Medium selektioniert werden. 4–6 Tage Selektion auf Puromycin gestatten die Mutation oder Unterbrechung des gewünschten Orts, wobei der Vorteil einer Manipulation von ES-Zellen darin liegt, dass einzelne Klone durch PCR mit anschließendem Sequenzieren auf die gewünschte Mutation analysiert werden können. Nur korrekt mutierte ES-Zellklone können weiter prozessiert werden, wobei ein durch Insertion des Landeplatzes und die anschließende Insertion des RMCE-Vektors eingeführtes DNA-Element vollständig entfernt werden kann, wonach die ES-Zelle keine andere Veränderung aufweist als die beabsichtigte durch die Wirkung von Cas9 und der sgRNA induzierte Mutation. Dies kann durch transiente Expression von PBase-Transposon mit anschließender Selektion auf FIAU erfolgen. Durch Entfernen der konstitutiv exprimierten Cas9 bei lediglich der minimalen zum Induzieren einer Mutation in Gegenwart von sgRNA erforderlichen Zeitdauer wird die Möglichkeit durch Cas9 induzierter unerwünschter Mutationen reduziert oder eliminiert.
- 5. ES-Klone mit der gewünschten Mutation können in eine Blastozyste injiziert werden, um transgene Mäuse zu erzeugen.
Tabelle 1: PAM-Konservierung in Repeat- und Leader-Sequenzen für verschiedene CRISPR-Typen
(reproduziert aus Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system F. J. M. Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, C. Almendros Microbiology (2009), 155, 733–740) ![Figure DE202014010413U1_0025](https://patentimages.storage.googleapis.com/50/70/88/d7e543be976ee2/DE202014010413U1_0025.png)
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SEQ ID NOs für die Sequenzen in Tabelle 1 sind in der nachfolgenden Tabelle dargelegt.
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Tabelle 2: CRISPR-Assoziierte Endonukleasen
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[Die Gen-ID-Nummern beziehen sich auf Gene in der NCBI Gene Database von September 2013; alle Sequenzinformationen in Verbindung mit den nachfolgenden Gen-IDs sind hiermit durch Bezugnahme für eine mögliche Verwendung in der vorliegenden Erfindung aufgenommen]
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1. Plav_0099
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- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Parvibaculum lavamentivorans DS-1]
- Andere Namen: Plav_0099
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009719.1 (105795..108908, Komplement)
- ID: 5454634
- SEQ ID NO: 62
-
2. FTN_0757
-
- Membranprotein [Francisella novicida U112]
- Andere Namen: FTN_0757
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008601.1 (810052..814941)
- ID: 4548251
- SEQ ID NO: 63
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3. Cj1523c
-
CRISPR-assoziiertes Protein [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168 = ATCC 700819]
-
- Andere Namen: Cj1523c
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_002163.1 (1456880..1459834, Komplement)
- ID: 905809
- SEQ ID NO: 64
-
4. mcrA
-
- Restriktionsendonuklease [Bifidobacterium longum DJO10A]
- Andere Namen: BLD_1902
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_010816.1 (2257993..2261556)
- ID: 6362834
- SEQ ID NO: 65
-
5. MGA_0519
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum str. R(low)]
- Andere Namen: MGA_0519
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_004829.2 (919248..923060)
- ID: 1089911
- SEQ ID NO: 66
-
6. Emin_0243
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Elusimicrobium minutum Pei191]
- Andere Namen: Emin_0243
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_010644.1 (261119..264706)
- ID: 6263045
- SEQ ID NO: 67
-
7. FTW_1427
-
- CRISPR-assoziiertes großes Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis WY96-3418]
- Andere Namen: FTW_1427
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009257.1 (1332426..1335803, Komplement)
- ID: 4958852
- SEQ ID NO: 68
-
8. SMA_1444
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus macedonicus ACA-DC 198]
- Andere Namen: SMA_1444
- Kommentar: NC_016749.1 (1418337..1421729, Komplement)
- ID: 11601419
- SEQ ID NO: 69
-
9. SSUST3_1318
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus suis ST3]
- Andere Namen: SSUST3_1318
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015433.1 (1323872..1327240, Komplement)
- ID: 10491484
- SEQ ID NO: 70
-
10. cas5
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus gallolyticus UCN34]
- Andere Namen: GALLO_1439
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013798.1 (1511433..1514825, Komplement)
- ID: 8776949
- SEQ ID NO: 71
-
11. GALLO_1446
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus gallolyticus UCN34]
- Andere Namen: GALLO_1446
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013798.1 (1518984..1523110, Komplement)
- ID: 8776185
- SEQ ID NO: 72
-
12. csn1
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Bifidobacterium dentium Bd1]
- Andere Namen: BDP_1254
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013714.1 (1400576..1403992, Komplement)
- ID: 8692053
- SEQ ID NO: 73
-
13. NMO_0348
-
- putatives CRISPR-assoziiertes Protein [Neisseria meningitidis alpha14]
- Andere Namen: NMO_0348
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013016.1 (369547..372795, Komplement)
- ID: 8221228
- SEQ ID NO: 74
-
14. csn1
-
- CRISPR-Assoziiertes Protein Csn1 [Streptococcus equi subsp. zooepidemicus MGCS10565]
- Andere Namen: Sez_1330
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_011134.1 (1369339..1373385, Komplement)
- ID: 6762114
- SEQ ID NO: 75
-
15. csn1
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1]
- Andere Namen: SGO_1381
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009785.1 (1426750..1430160, Komplement)
- ID: 5599802
- SEQ ID NO: 76
-
16. M28_Spy0748
-
- zytoplasmatisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS6180]
- Andere Namen: M28_Spy0748
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007296.1 (771231..775337)
- ID: 3573516
- SEQ ID NO: 77
-
17. SGGBAA2069_c14690
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC BAA-2069]
- Andere Namen: SGGBAA2069_c14690
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015215.1 (1520905..1525017, Komplement)
- ID: 10295470
- SEQ ID NO: 78
-
18. SAR116_2544
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322]
- Andere Namen: SAR116_2544
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_014010.1 (2748992..2752099)
- ID: 8962895
- SEQ ID NO: 79
-
19. TDE0327
-
- CRISPR-assoziierte Cas5e [Treponema denticola ATCC 35405]
- Andere Namen: TDE0327
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_002967.9 (361021..365208)
- ID: 2741543
- SEQ ID NO: 80
-
20. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus pasteurianus ATCC 43144]
- Andere Namen: SGPB_1342
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015600.1 (1400035..1403427, Komplement)
- ID: 10753339
- SEQ ID NO: 81
-
21. cas9
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Corynebacterium ulcerans BR-AD22]
- Andere Namen: CULC22_00031
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015683.1 (30419..33112, Komplement)
- ID: 10842578
- SEQ ID NO: 82
-
22. MGAS2096_Spy0843
-
- putatives zytoplasmatisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS2096]
- Andere Namen: MGAS2096_Spy0843
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008023.1 (813084..817190)
- ID: 4066021
- SEQ ID NO: 83
-
23. MGAS9429_Spy0885
-
- zytoplasmatisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS9429]
- Andere Namen: MGAS9429_Spy0885
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008021.1 (852508..856614)
- ID: 4061575
- SEQ ID NO: 84
-
24. AZL_009000
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Azospirillum sp. B510]
- Andere Namen: AZL_009000
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013854.1 (1019522..1023028, Komplement)
- ID: 8789261
- SEQ ID NO: 85
-
25. EUBREC_1713
-
- enthält RuvC-ähnliche Nuklease- und HNH-Nuklease-Domänen [Eubacterium rectale ATCC 33656]
- Andere Namen: EUBREC_1713
- Andere Bezeichnungen: CRISPR-System-verwandtes Protein
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_012781.1 (1591112..1594456)
- ID: 7963668
- SEQ ID NO: 86
-
26. Alide2_0194
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Alicycliphilus denitrificans K601]
- Andere Namen: Alide2_0194
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015422.1 (218107..221196)
- ID: 10481210
- SEQ ID NO: 87
-
27. Alide_0205
-
- crispr-assoziiertes Protein, csn1-Familie [Alicycliphilus denitrificans BC]
- Andere Namen: Alide_0205
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_014910.1 (228371..231460)
- ID: 10102228
- SEQ ID NO: 88
-
28. STER_1477
-
- CRISPR-System-ähnliches Protein [Streptococcus thermophilus LMD-9]
- Andere Namen: STER_1477
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008532.1 (1379975..1384141, Komplement)
- ID: 4437923
- SEQ ID NO: 89
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29. STER_0709
-
- CRISPR-System-ähnliches Protein [Streptococcus thermophilus LMD-9]
- Andere Namen: STER_0709
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008532.1 (643235..646600)
- ID: 4437391
- SEQ ID NO: 90
-
30. cas9
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- CRISPR-assoziiertes Protein [Corynebacterium diphtheriae 241]
- Andere Namen: CD241_2102
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016782.1 (2245769..2248399)
- ID: 11674395
- SEQ ID NO: 91
-
31. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae 241]
- Andere Namen: CD241_0034
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016782.1 (35063..38317)
- ID: 11672999
- SEQ ID NO: 92
-
32. Corgl_1738
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Coriobacterium glomerans PW2]
- Andere Namen: Corgl_1738
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015389.1 (2036091..2040245)
- ID: 10439994
- SEQ ID NO: 93
-
33. Fluta_3147
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Fluviicola taffensis DSM 16823]
- Andere Namen: Fluta_3147
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015321.1 (3610221..3614597, Komplement)
- ID: 10398516
- SEQ ID NO: 94
-
34. Acav_0267
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Acidovorax avenae subsp. avenae ATCC 19860]
- Andere Namen: Acav_0267
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015138.1 (295839..298976)
- ID: 10305168
- SEQ ID NO: 95
-
35. NAL212_2952
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Nitrosomonas sp. AL212]
- Andere Namen: NAL212_2952
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015222.1 (2941806..2944940, Komplement)
- ID: 10299493
- SEQ ID NO: 96
-
36. SpiBuddy_2181
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Sphaerochaeta globosa str. Buddy]
- Andere Namen: SpiBuddy_2181
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015152.1 (2367952..2371491, Komplement)
- ID: 10292274
- SEQ ID NO: 97
-
37. Tmz1t_2411
-
- HNH-Endonuklease [Thauera sp. MZ1T]
- Andere Namen: Tmz1t_2411
- Genomischer Zusammenhang: Plasmid pTha01
- Kommentar: NC_011667.1 (75253..76200, Komplement)
- ID: 7094333
- SEQ ID NO: 98
-
38. Gdia_0342
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5]
- Andere Namen: Gdia_0342
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_011365.1 (382737..385748)
- ID: 6973736
- SEQ ID NO: 99
-
39. JJD26997_1875
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Cas5e [Campylobacter jejuni subsp. doylei 269.97]
- Andere Namen: JJD26997_1875
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009707.1 (1656109..1659063, Komplement)
- ID: 5389688
- SEQ ID NO: 100
-
40. Asuc_0376
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Actinobacillus
- succinogenes 130Z]
- Andere Namen: Asuc_0376
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009655.1 (431928..435116)
- ID: 5348478
- SEQ ID NO: 101
-
41. Veis_1230
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Verminephrobacter eiseniae EF01-2]
- Andere Namen: Veis_1230
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008786.1 (1365979..1369185)
- ID: 4695198
- SEQ ID NO: 102
-
42. MGAS10270_Spy0886
-
- putatives zytoplasmatisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS10270]
- Andere Namen: MGAS10270_Spy0886
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008022.1 (844446..848552)
- ID: 4063984
- SEQ ID NO: 103
-
43. gbs0911
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus agalactiae NEM316]
- Andere Namen: gbs0911
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_004368.1 (945801..949946)
- ID: 1029893
- SEQ ID NO: 104
-
44. NMA0631
-
- hypothetisches Protein [Neisseria meningitidis Z2491]
- Andere Namen: NMA0631
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_003116.1 (610868..614116, Komplement)
- ID: 906626
- SEQ ID NO: 105
-
45. Ccan_14650
-
- hypothetisches Protein [Capnocytophaga canimorsus Cc5]
- Andere Namen: Ccan 14650
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015846.1 (1579873..1584165, Komplement)
- ID: 10980451
- SEQ ID NO: 106
-
46. Ipp0160
-
- hypothetisches Protein [Legionella pneumophila str. Paris]
- Andere Namen: Ipp0160
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_006368.1 (183831..187949)
- ID: 3118625
- SEQ ID NO: 107
-
47. Cbei_2080
-
- hypothetisches Protein [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052]
- Andere Namen: Cbei_2080
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009617.1 (2422056..2423096)
- ID: 5296367
- SEQ ID NO: 108
-
48. MMOB0330
-
- hypothetisches Protein [Mycoplasma mobile 163K]
- Andere Namen: MMOB0330
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_006908.1 (45652..49362, Komplement)
- ID: 2807677
- SEQ ID NO: 109
-
49. MGF_5203
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum str. F]
- Andere Namen: MGF_5203
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017503.1 (888602..892411)
- ID: 12397088
- SEQ ID NO: 110
-
50. MGAH_0519
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum str. R(high)]
- Andere Namen: MGAH_0519
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017502.1 (918476..922288)
- ID: 12395725
- SEQ ID NO: 111
-
51. Smon_1063
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptobacillus moniliformis DSM 12112]
- Andere Namen: Smon_1063
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013515.1 (1159048..1162827, Komplement)
- ID: 8600791
- SEQ ID NO: 112
-
52. Spy49_0823
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes NZ131]
- Andere Namen: Spy49_0823
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_011375.1 (821210..825316)
- ID: 6985827
- SEQ ID NO: 113
-
53. C8J_1425
-
- hypothetisches Protein [Campylobacter jejuni subsp. jejuni 81116]
- Andere Namen: C8J_1425
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009839.1 (1442672..1445626, Komplement)
- ID: 5618449
- SEQ ID NO: 114
-
54. FTF0584
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis FSC198]
- Andere Namen: FTF0584
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008245.1 (601115..604486)
- ID: 4200457
- SEQ ID NO: 115
-
55. FTT_0584
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4]
- Andere Namen: FTT_0584
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_006570.2 (601162..604533)
- ID: 3191177
- SEQ ID NO: 116
-
56. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis RE378]
- Andere Namen: GGS_1116
- Kommentar: NC_018712.1 (1169559..1173674, Komplement)
- ID: 13799322
- SEQ ID NO: 117
-
57. SMUGS5_06270
-
- CRISPR-assoziiertes Protein csn1 [Streptococcus mutans GS-5]
- Andere Namen: SMUGS5_06270
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018089.1 (1320641..1324678, Komplement)
- ID: 13299050
- SEQ ID NO: 118
-
58. Y1U_C1412
-
- Csn1 [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002]
- Andere Namen: Y1U_C1412
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017927.1 (1376653..1380819, Komplement)
- ID: 12977193
- SEQ ID NO: 119
-
59. Y1U_C0633
-
- CRISPR-System-ähnliches Protein [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002]
- Andere Namen: Y1U_C0633
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017927.1 (624274..627639)
- ID: 12975630
- SEQ ID NO: 120
-
60. SALIVA_0715
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease, Csn1-Familie [Streptococcus salivarius JIM8777]
- Andere Namen: SALIVA_0715
- Kommentar: NC_017595.1 (708034..711417)
- ID: 12910728
- SEQ ID NO: 121
-
61. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein csn1 [Streptococcus mutans LJ23]
- Andere Namen: SMULJ23_0701
- Kommentar: NC_017768.1 (751695..755732)
- ID: 12898085
- SEQ ID NO: 122
-
62. RIA_1455
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, SAG0894 [Riemerella anatipestifer RA-GD]
- Andere Namen: RIA_1455
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017569.1 (1443996..1448198)
- ID: 12613647
- SEQ ID NO: 123
-
63. STND_0658
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease, Csn1-Familie [Streptococcus thermophilus ND03]
- Andere Namen: STND_0658
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017563.1 (633621..636986)
- ID: 12590813
- SEQ ID NO: 124
-
64. RA0C_1034
-
- putative BCR [Riemerella anatipestifer ATCC 11845 = DSM 15868]
- Andere Namen: RA0C_1034
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017045.1 (1023494..1026931, Komplement)
- ID: 11996006
- SEQ ID NO: 125
-
65. Sinf_1255
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, SAG0894-Familie [Streptococcus infantarius subsp. infantarius CJ18]
- Andere Namen: Sinf_1255
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016826.1 (1276484..1280611, Komplement)
- ID: 11877786
- SEQ ID NO: 126
-
66. Nitsa_1472
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, csn1-Familie [Nitratifractor salsuginis DSM 16511]
- Andere Namen: Nitsa 1472
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_014935.1 (1477331..1480729)
- ID: 10148263
- SEQ ID NO: 127
-
67. NLA_17660
-
- hypothetisches Protein [Neisseria lactamica 020-06]
- Andere Namen: NLA_17660
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_014752.1 (1890078..1893326)
- ID: 10006697
- SEQ ID NO: 128
-
68. SmuNN2025_0694
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus mutans NN2025]
- Andere Namen: SmuNN2025_0694
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_013928.1 (737258..741295)
- ID: 8834629
- SEQ ID NO: 129
-
69. SDEG_1231
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis GGS_124]
- Andere Namen: SDEG_1231
- Chromosom: 1
- Kommentar: Chromosome 1NC_012891.1 (1176755..1180870, Komplement)
- ID: 8111553
- SEQ ID NO: 130
-
70. NMCC_0397
-
- hypothetisches Protein [Neisseria meningitidis 053442]
- Andere Namen: NMCC_0397
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_010120.1 (402733..405981, Komplement)
- ID: 5796426
- SEQ ID NO: 131
-
71. SAK_1017
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus agalactiae A909]
- Andere Namen: SAK_1
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007432.1 (980303..984415)
- ID: 3686185
- SEQ ID NO: 132
-
72. M5005_Spy_0769
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS5005]
- Andere Namen: M5005_Spy_0769
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007297.1 (773340..777446)
- ID: 3572134
- SEQ ID NO: 133
-
73. MS53_0582
-
- hypothetisches Protein [Mycoplasma synoviae 53]
- Andere Namen: MS53_0582
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007294.1 (684155..688099)
- ID: 3564051
- SEQ ID NO: 134
-
74. DIP0036
-
- hypothetisches Protein [Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129]
- Andere Namen: DIP0036
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_002935.2 (34478..37732)
- ID: 2650188
- SEQ ID NO: 135
-
75. WS1613
-
- hypothetisches Protein [Wolinella succinogenes DSM 1740]
- Andere Namen: WS1613
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_005090.1 (1525628..1529857)
- ID: 2553552
- SEQ ID NO: 136
-
76. PM1127
-
- hypothetisches Protein [Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70]
- Andere Namen: PM1127
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_002663.1 (1324015..1327185, Komplement)
- ID: 1244474
- SEQ ID NO: 137
-
77. SPs1176
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes SSI-1]
- Andere Namen: SPs1176
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_004606.1 (1149610..1153716, Komplement)
- ID: 1065374
- SEQ ID NO: 138
-
78. SMU_1405c
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus mutans UA159]
- Andere Namen: SMU_1405c, SMU.1405c
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_004350.2 (1330942..1334979, Komplement)
- ID: 1028661
- SEQ ID NO: 139
-
79. lin2744
-
- hypothetisches Protein [Listeria innocua Clip11262]
- Andere Namen: lin2744
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_003212.1 (2770707..2774711, Komplement)
- ID: 1131597
- SEQ ID NO: 140
-
80. csn1B
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC 43143]
- Andere Namen: SGGB_1441
- Kommentar: NC_017576.1 (1489111..1493226, Komplement)
- ID: 12630646
- SEQ ID NO: 141
-
81. csn1A
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC 43143]
- Andere Namen: SGGB_1431
- Kommentar: NC_017576.1 (1480439..1483831, Komplement)
- ID: 12630636
- SEQ ID NO: 142
-
82. cas9
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Corynebacterium ulcerans 809]
- Andere Namen: CULC809_00033
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017317.1 (30370..33063, Komplement)
- ID: 12286148
- SEQ ID NO: 143
-
83. GDI_2123
-
- hypothetisches Protein [Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5]
- Andere Namen: GDI_2123
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_010125.1 (2177083..2180235)
- ID: 5792482
- SEQ ID NO: 144
-
84. Nham_4054
-
- hypothetisches Protein [Nitrobacter hamburgensis X14]
- Andere Namen: Nham_4054
- Genomischer Zusammenhang: Plasmid 1
- Kommentar: NC_007959.1 (13284..16784, Komplement)
- ID: 4025380
- SEQ ID NO: 145
-
85. str0657
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus thermophilus CNRZ1066]
- Andere Namen: str0657
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_006449.1 (619189..622575)
- ID: 3165636
- SEQ ID NO: 146
-
86. stu0657
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus thermophilus LMG 18311]
- Andere Namen: stu0657
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_006448.1 (624007..627375)
- ID: 3165000
- SEQ ID NO: 147
-
87. SpuM3_0677
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS315]
- Andere Namen: SpyM3_0677
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_004070.1 (743040..747146)
- ID: 1008991
- SEQ ID NO: 148
-
88. HFMG06CAA_5227
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum CA06_2006.052-5-2P]
- Andere Namen: HFMG06CAA_5227
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018412.1 (895338..899147)
- ID: 13464859
- SEQ ID NO: 149
-
89. HFMG01WIA_5025
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum WI01_2001.043-13-2P]
- Andere Namen: HFMG01WIA_5025
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018410.1 (857648..861457)
- ID: 13463863
- SEQ ID NO: 150
-
90. HFMG01NYA_5169
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum NY01_2001.047-5-1P]
- Andere Namen: HFMG01NYA_5169
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018409.1 (883511..887185)
- ID: 13462600
- SEQ ID NO: 151
-
91. HFMG96NC SEQ ID NO: 127
-
- A_5295
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum NC96_1596-4-2P]
- Andere Namen: HFMG96NCA_5295
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018408.1 (904664..908473)
- ID: 13462279
- SEQ ID NO: 152
-
92. HFMG95NCA_5107
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma gallisepticum NC95_13295-2-2P]
- Andere Namen: HFMG95NCA_5107
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018407.1 (871783..875592)
- ID: 13461469
- SEQ ID NO: 153
-
93. MGAS10750_Spy0921
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes MGAS10750]
- Andere Namen: MGAS10750_Spy0921
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_008024.1 (875719..879834)
- ID: 4066656
- SEQ ID NO: 154
-
94. XAC3262
-
- hypothetisches Protein [Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306]
- Andere Namen: XAC3262
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_003919.1 (3842310..3842765)
- ID: 1157333
- SEQ ID NO: 155
-
95. SSUST1_1305
-
- CRISPR-System-ähnliches Protein [Streptococcus suis ST1]
- Andere Namen: SSUST1_1305
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017950.1 (1293105..1297250, Komplement)
- ID: 13017849
- SEQ ID NO: 156
-
96. SSUD9_1467
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus suis D9]
- Andere Namen: SSUD9_1467
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017620.1 (1456318..1459686, Komplement)
- ID: 12718289
- SEQ ID NO: 157
-
97. BBta_3952
-
- hypothetisches Protein [Bradyrhizobium sp. BTAi1]
- Andere Namen: BBta_3952
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_009485.1 (4149455..4152649, Komplement)
- ID: 5151538
- SEQ ID NO: 158
-
98. CIY_03670
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Butyrivibrio fibrisolvens 16/4]
- Andere Namen: CIY_03670
- Kommentar: NC_021031.1 (309663..311960, Komplement)
- ID: 15213189
- SEQ ID NO: 159
-
99. A11Q_912
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Bdellovibrio exovorus JSS]
- Andere Namen: A11Q_912
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_020813.1 (904781..907864, Komplement)
- ID: 14861475
- SEQ ID NO: 160
-
100. MCYNO850
-
- CRISPR-assoziiertes Protein der Csn1-Familie [Mycoplasma cynos C142]
- Andere Namen: MCYN_0850
- Kommentar: NC_019949.1 (951497..955216, Komplement)
- ID: 14356531
- SEQ ID NO: 161
-
101. SaSA20_0769
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Streptococcus agalactiae SA20-06]
- Andere Namen: SaSA20_0769
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_019048.1 (803597..807709)
- ID: 13908026
- SEQ ID NO: 162
-
102. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus pyogenes A20]
- Andere Namen: A20_0810
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018936.1 (772038..776144)
- ID: 13864445
- SEQ ID NO: 163
-
103. P700755_000291
-
- CRISPR-assoziiertes Protein Cas9/Csn1, Subtyp II [Psychroflexus torquis ATCC 700755]
- Andere Namen: P700755_000291
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018721.1 (312899..317428)
- ID: 13804571
- SEQ ID NO: 164
-
104. A911_07335
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Campylobacter jejuni subsp. jejuni PT14]
- Andere Namen: A911_07335
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018709.2 (1450217..1453180, Komplement)
- ID: 13791138
- SEQ ID NO: 165
-
105. ASU2_02495
-
- Protein der Familie CRISPR-assoziierte Endonuklease Csn1 [Actinobacillus suis H91-0380]
- Andere Namen: ASU2_02495
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018690.1 (552318..555482)
- ID: 13751600
- SEQ ID NO: 166
-
106. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes SLCC2540]
- Andere Namen: LMOSLCC2540_2635
- Kommentar: NC_018586.1 (2700744..2704748, Komplement)
- ID: 13647248
- SEQ ID NO: 167
-
107. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes SLCC5850]
- Andere Namen: LMOSLCC5850_2605
- Kommentar: NC_018592.1 (2646023..2650027, Komplement)
- ID: 13626042
- SEQ ID NO: 168
-
108. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes Serotyp 7 str. SLCC2482]
- Andere Namen: LMOSLCC2482_2606
- Kommentar: NC_018591.1 (2665393..2669397, Komplement)
- ID: 13605045
- SEQ ID NO: 169
-
109. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes SLCC2755]
- Andere Namen: LMOSLCC2755_2607
- Kommentar: NC_018587.1 (2694850..2698854, Komplement)
- ID: 13599053
- SEQ ID NO: 170
-
110. BN148_1523c
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168-BN148]
- Andere Namen: BN148_1523c
- Kommentar: NC_018521.1 (1456880..1459834, Komplement)
- ID: 13530688
- SEQ ID NO: 171
-
111. Belba_3201
-
- CRISPR-assoziiertes Protein Cas9/Csn1, Subtyp II/NMEMI [Belliella baltica DSM 15883]
- Andere Namen: Belba_3201
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018010.1 (3445311..3449369, Komplement)
- ID: 13056967
- SEQ ID NO: 172
-
112. FN3523_1121
-
- Membranprotein [Francisella cf. novicida 3523]
- Andere Namen: FN3523_1121
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017449.1 (1129528..1134468, Komplement)
- ID: 12924881
- SEQ ID NO: 173
-
113. cas9
-
- CRISPR-assoziiertes Protein Cas9/Csn1, Subtyp II/NMEMI [Prevotella intermedia 17]
- Andere Namen: PIN17_A0201
- Chromosom: II
- Kommentar: Chromosom IINC_017861.1 (240722..244864)
- ID: 12849954
- SEQ ID NO: 174
-
114. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein, Csn1-Familie [Streptococcus thermophilus JIM 8232]
- Andere Namen: STH8232_0853
- Kommentar: NC_017581.1 (706443..709808)
- ID: 12637306
- SEQ ID NO: 175
-
115. LMOG_01918
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes J0161]
- Andere Namen: LMOG_01918
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017545.1 (2735374..2739378, Komplement)
- ID: 12557915
- SEQ ID NO: 176
-
116. LMRG_02138
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Listeria monocytogenes 10403S]
- Andere Namen: LMRG 02138
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017544.1 (2641981..2645985, Komplement)
- ID: 12554876
- SEQ ID NO: 177
-
117. CJSA_1443
-
- putatives CRISPR-assoziiertes Proteinn [Campylobacter jejuni subsp. jejuni IA3902]
- Andere Namen: CJSA_1443
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017279.1 (1454273..1457227, Komplement)
- ID: 12250720
- SEQ ID NO: 178
-
118. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein Csn1 [Streptococcus pyogenes MGAS1882]
- Andere Namen: MGAS1882_0792
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017053.1 (775696..779799)
- ID: 12014080
- SEQ ID NO: 179
-
119. csn1
-
- CRISPR-assoziiertes Protein Csn1 [Streptococcus pyogenes MGAS15252]
- Andere Namen: MGAS15252_0796
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017040.1 (778271..782374)
- ID: 11991096
- SEQ ID NO: 180
-
120. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae HC02]
- Andere Namen: CDHC02_0036
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016802.1 (37125..40379)
- ID: 11739116
- SEQ ID NO: 181
-
121. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae C7 (beta)]
- Andere Namen: CDC7B_0035
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016801.1 (36309..39563)
- ID: 11737358
- SEQ ID NO: 182
-
122. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae BH8]
- Andere Namen: CDBH8_0038
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016800.1 (37261..40515)
- ID: 11735325
- SEQ ID NO: 183
-
123. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae 31A]
- Andere Namen: CD31A_0036
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016799.1 (34597..37851)
- ID: 11731168
- SEQ ID NO: 184
-
124. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae VA01]
- Andere Namen: CDVA01_0033
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016790.1 (34795..38049)
- ID: 11717708
- SEQ ID NO: 185
-
125. cas3
-
- CRISPR-assoziierte Endonuklease [Corynebacterium diphtheriae HC01]
- Andere Namen: CDHC01_0034
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016786.1 (35060..38314)
- ID: 11708318
- SEQ ID NO: 186
-
126. cas9
-
- CRISPR-assoziiertes Protein [Corynebacterium diphtheriae HC01]
- Andere Namen: CDHC01_2103
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016786.1 (2246368..2248998)
- ID: 11708126
- SEQ ID NO: 187
-
127. PARA_18570
-
- hypothetisches Protein [Haemophilus parainfluenzae T3T1]
- Andere Namen: PARA_18570
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_015964.1 (1913335..1916493)
- ID: 11115627
- SEQ ID NO: 188
-
128. HDN1F_34120
-
- hypothetisches Protein [gamma proteobacterium HdN1]
- Andere Namen: HDN1F_34120
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_014366.1 (4143336..4146413, Komplement)
- ID: 9702142
- SEQ ID NO: 189
-
129. SPy_1046
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes M1 GAS]
- Andere Namen: SPy_1046
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_002737.1 (854757..858863)
- ID: 901176
- SEQ ID NO: 190
-
130. GBS222_0765
-
- Hypothetisches Protein [Streptococcus agalactiae]
- Andere Namen: GBS222_0765
- Kommentar: NC_021195.1 (810875..814987)
- ID: 15484689
- SEQ ID NO: 191
-
131. NE061598_03330
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis NE061598]
- Andere Namen: NE061598_03330
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017453.1 (601219..604590)
- ID: 12437259
- SEQ ID NO: 192
-
132. NMV_1993
-
- hypothetisches Protein [Neisseria meningitidis 8013]
- Andere Namen: NMV_1993
- Kommentar: NC_017501.1 (1917073..1920321)
- ID: 12393700
- SEQ ID NO: 193
-
133. csn1
-
- hypothetisches Protein [Campylobacter jejuni subsp. jejuni M1]
- Andere Namen: CJM1_1467
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017280.1 (1433667..1436252, Komplement)
- ID: 12249021
- SEQ ID NO: 194
-
134. FTU_0629
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis TIGB03]
- Andere Namen: FTU_0629
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016933.1 (677092..680463)
- ID: 11890131
- SEQ ID NO: 195
-
135. NMAA_0315
-
- hypothetisches Protein [Neisseria meningitidis WUE 2594]
- Andere Namen: NMAA_0315
- Kommentar: NC_017512.1 (377010..380258, Komplement)
- ID: 12407849
- SEQ ID NO: 196
-
136. WS1445
-
- hypothetisches Protein [Wolinella succinogenes DSM 1740]
- Andere Namen: WS1445
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_005090.1 (1388202..1391381, Komplement)
- ID: 2554690
- SEQ ID NO: 197
-
137. THITE_2123823
-
- hypothetisches Protein [Thielavia terrestris NRRL 8126]
- Andere Namen: THITE_2123823
- Chromosom: 6
- Kommentar: Chromosom 6NC_016462.1 (1725696..1725928)
- ID: 11523019
- SEQ ID NO: 198
-
138. XAC29_16635
-
- hypothetisches Proteinn [Xanthomonas axonopodis Xac29-1]
- Andere Namen: XAC29_16635
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_020800.1 (3849847..3850302)
- ID: 14853997
- SEQ ID NO: 199
-
139. M1GAS476_0830
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus pyogenes M1 476]
- Andere Namen: M1GAS476_0830
- Chromosom: 1
- Kommentar: NC_020540.1 (792119..796225)
- ID: 14819166
- SEQ ID NO: 200
-
140. Piso0_000203
-
- Piso0_000203 [Millerozyma farinosa CBS 7064]
- Andere Namen: GNLVRS01_PISO0A04202g
- Andere Bezeichnungen: hypothetisches Protein
- Chromosom: A
- Kommentar: NC_020226.1 (343553..343774, Komplement)
- ID: 14528449
- SEQ ID NO: 201
-
141. G148_0828
-
- hypothetisches Protein [Riemerella anatipestifer RA-CH-2]
- Andere Namen: G148_0828
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_020125.1 (865673..869875)
- ID: 14447195
- SEQ ID NO: 202
-
142. csn1
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis AC-2713]
- Andere Namen: SDSE_1207
- Kommentar: NC_019042.1 (1134173..1138288, Komplement)
- ID: 13901498
- SEQ ID NO: 203
-
143. A964_0899
-
- hypothetisches Protein [Streptococcus agalactiae GD201008-001]
- Andere Namen: A964_0899
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_018646.1 (935164..939276)
- ID: 13681619
- SEQ ID NO: 204
-
144. FNFX1_0762
-
- hypothetisches Protein [Francisella cf. novicida Fx1]
- Andere Namen: FNFX1_0762
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_017450.1 (781484..786373)
- ID: 12435564
- SEQ ID NO: 205
-
145. FTV_0545
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. tularensis TI0902]
- Andere Namen: FTV_0545
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_016937.1 (601185..604556)
- ID: 11880693
- SEQ ID NO: 206
-
146. FTL_1327
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS]
- Andere Namen: FTL_1327
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007880.1 (1262508..1263689, Komplement)
- ID: 3952607
- SEQ ID NO: 207
-
147. FTL_1326
-
- hypothetisches Protein [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS]
- Andere Namen: FTL_1326
- Genomischer Zusammenhang: Chromosom
- Kommentar: NC_007880.1 (1261927..1262403, Komplement)
- ID: 3952606
- SEQ ID NO: 208
-
Zusätzliche Aussagen der Erfindung sind wie folgt:
- 1. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Verwenden durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung erster und zweiter Brüche in einem Nukleinsäurestrang, wodurch geschnittene 5'- und 3'-Enden und eine zwischen den Enden liegende Nukleotidsequenz entstehen;
- (b) Verwenden homologer Rekombination zur Deletion der Nukleotidsequenz; und
- (c) gegebenenfalls Gewinnen des in Schritt (b) modifizierten Nukleinsäurestrangs oder eines die Deletion umfassenden Nachkommennukleinsäurestrangs.
- 2. Verfahren nach Aussage 1, wobei die deletierte Sequenz ein regulatorisches Element umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
- 3. Verfahren nach Aussage 2, wobei die deletierte Sequenz eine Proteinuntereinheit oder -domäne umfasst.
- 4. Verfahren nach einer der Aussagen 1 bis 3, wobei die Deletion aus Schritt (b) eine Länge von wenigstens 20 Nukleotiden aufweist.
- 5. Verfahren nach Aussage 1, ferner umfassend einen Schritt eines Inserierens einer Nukleotidsequenz zwischen den geschnittenen Enden in (a).
- 6. Verfahren nach Aussage 5, wobei die Insertionsnukleotidsequenz ein PAM-Motiv umfasst.
- 7. Verfahren nach Aussage 5 oder Aussage 6, wobei die Insertionssequenz eine Länge von wenigstens 10 Nukleotiden aufweist.
- 8. Verfahren nach einer der Aussagen 5 bis 7, wobei zur Insertion der Nukleotidsequenz Rekombinase-Erkennungssequenzen verwendet werden, z. B. loxP und/oder eine lox-Mutante, z. B. lox2272 oder lox511; oder frt.
- 9. Verfahren nach einer der Aussagen 5 bis 7, wobei homologe Rekombination verwendet wird, um die Insertionsnukleotidsequenz zu inserieren.
- 10. Verfahren nach einer der Aussagen 5 bis 9, wobei das Verfahren in einer Zelle durchgeführt wird und die Insertionssequenz eine orthologe oder homologe Sequenz in der Zelle ersetzt.
- 11. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (c) erfolgt, indem eine den modifizierten ersten Strang umfassende Zelle isoliert oder ein nichtmenschliches Wirbeltier, bei dem das Verfahren durchgeführt wurde, oder eine Nachkommenschaft davon erhalten wird.
- 12. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei es sich bei dem Nukleinsäurestrang oder dem ersten Strang um einen DNA-Strang handelt.
- 13. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei das Produkt des Verfahrens einen Nukleinsäurestrang umfasst, der ein PAM-Motiv 3' von der Insertion oder Deletion umfasst.
- 14. Verfahren nach Aussage 13, wobei das PAM-Motiv nicht mehr als 10 Nukleotide 3' von der Deletion liegt.
- 15. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind.
- 16. Verfahren nach Aussage 15, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer eine vom ersten und zweiten Homologiearm flankierte Insertionsnukleotidsequenz umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Insertionsnukleotidsequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden inseriert ist.
- 17. Verfahren nach Aussage 15 oder Aussage 16, wobei die Homologiearme jeweils eine Länge von wenigstens 20 zusammenhängenden Nukleotiden aufweisen.
- 18. Verfahren nach einer der Aussagen 15 bis 17, wobei der erste und/oder zweite Homologiearm eine Rekombinase-Erkennungssequenz, wie etwa ein PAM-Motiv, umfasst.
- 19. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei in Schritt (a) durch Cas-Endonuklease vermittelte Spaltung verwendet und mittels Erkennung eines GG- or NGG-PAM-Motivs durchgeführt wird.
- 20. Verfahren nach Aussage 19, wobei zum Schneiden in Schritt (a) eine Nickase verwendet wird und, gegebenenfalls, wobei es sich bei der Nickase um eine Cas-Nickase handelt.
- 21. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei das Verfahren in einer Zelle, z. B. einer eukaryontischen Zelle, durchgeführt wird.
- 22. Verfahren nach Aussage 21, wobei das Verfahren in einer Säugerzelle, z. B. Nager- oder Mauszelle, z. B. einer Nager-(z. B. Maus-)ES-Zelle oder Zygote, durchgeführt wird.
- 23. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei das Verfahren bei einem nichtmenschlichen Säuger, z. B. einer Maus oder Ratte oder einem Kaninchen, durchgeführt wird.
- 24. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei jede Spaltstelle von PAM-Motiv (z. B. einer NGG- oder NGGNG-Sequenz, wobei N für eine beliebige Base und G für ein Guanin steht) flankiert ist.
- 25. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei das 3'-Ende 3' von einem PAM-Motiv flankiert ist.
- 26. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (a) durch Spaltung in einem einzigen Strang von dsDNA durchgeführt wird.
- 27. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (a) durchgeführt wird, indem in einer Zelle der Nukleinsäurestrang, eine Cas-Endonuklease, eine crRNA und eine tracrRNA (z. B. bereitgestellt von einer oder mehreren gRNAs) mit dem Ziel, dass die Endonuklease die Spaltung durchführt, und gegebenenfalls eine Insertionssequenz zur homologen Rekombination mit dem Nukleinsäurestrang kombiniert werden.
- 28. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination mit einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei der zweite Homologiearm eine PAM-Sequenz umfasst, so dass durch homologe Rekombination zwischen dem zweiten Homologiearm und der sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz eine ein PAM-Motiv umfassende Sequenz im Produkt des Verfahrens entsteht.
- 29. Verfahren einer sequentiellen durch Endonuklease vermittelten homologie-gesteuerten Rekombination (Sequential Endonuclease-mediated Homology Directed Recombination, sEHDR), umfassend Durchführen des Verfahrens nach einer vorhergehenden Aussage ein erstes Mal und ein zweites Mal, wobei das Produkt des ersten Mals zur durch Endonuklease vermittelten Spaltung beim zweiten Mal verwendet wird, wobei entweder (i) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten Mal bzw. bei den zweiten Malen deletiert werden; (ii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal deletiert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal inseriert wird; (iii) eine erste Nukleotidsequenz beim ersten Mal inseriert und eine zweite Nukleotidsequenz beim zweiten Mal deletiert wird; oder (iv) erste und zweite Nukleotidsequenzen beim ersten bzw. zweiten Mal inseriert werden; gegebenenfalls wobei die Nukleinsäurestrangmodifikation beim zweiten Mal innerhalb von 20 oder weniger Nukleotiden von der Nukleinsäurestrangmodifikation beim ersten Mal liegt.
- 30. Verfahren nach Aussage 29, wobei das erste Mal gemäß Aussage 1 durchgeführt wird, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, wobei Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; und/oder das zweite Mal gemäß Aussage 1 durchgeführt wird, wobei Schritt (b) erfolgt, indem homologe Rekombination zwischen einer erste und zweite Homologiearme umfassenden hereinkommenden Nukleinsäure durchgeführt wird, wobei die Homologiearme weitgehend homolog zu einer sich 5' vom 5'-Ende erstreckenden Sequenz bzw. einer sich 3' vom 3'-Ende erstreckenden Sequenz sind, wobei die hereinkommende Nukleinsäure keine Sequenz zwischen dem ersten und dem zweiten Homologiearm umfasst, so dass Sequenz zwischen den 5'- und 3'-Enden durch homologe Rekombination deletiert ist; gegebenenfalls wobei der zweite Arm ein PAM-Motiv umfasst, so dass das Produkt des zweiten Mals ein PAM-Motiv zur Verwendung bei einem nachfolgenden durch Cas-Endonuklease vermittelten Verfahren gemäß einer der Aussagen 1 bis 28 umfasst.
- 31. Verfahren nach einer vorhergehenden Aussage, wobei Schritt (a) unter Verwendung von durch Cas-Endonuklease vermittelter Spaltung und einer eine crRNA und eine tracrRNA umfassenden gRNA durchgeführt wird.
- 32. Verfahren nach Aussage 27 oder 31, wobei die crRNA die Struktur 5'-X-Y-3' aufweist, wobei X für eine RNA-Nukleotidsequenz (gegebenenfalls mit einer Länge von wenigstens 5 Nukleotiden) und Y für eine ein Nukleotidmotiv, das mit einem von der tracrRNA umfassten Motiv hybridisiert, umfassende RNA-Sequenz steht, wobei X zur Hybridisierung mit einer sich 5' von der gewünschten Stelle des geschnittenen 5'-Endes erstreckenden Nukleotidsequenz fähig ist.
- 33. Verfahren nach Aussage 27, 31 oder 32, wobei Y für 5'-N1UUUUAN2N3GCUA-3' steht, wobei N1-3 jeweils für ein A, U, C oder G stehen und/oder die tracrRNA die Sequenz (in 5'-nach-3'-Orientierung) UAGCM1UUAAAAM2 umfasst, wobei M1 für Spacer-Nukleotidsequenz und M2 für ein Nukleotid steht.
- 34. Verfahren einer Nukleinsäurerekombination, wobei das Verfahren Bereitstellen von erste und zweite Stränge umfassender dsDNA und
- (a) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines geschnittenen Endes im ersten Strang 3' von einem PAM-Motiv;
- (b) Verwenden von durch Cas-Endonuklease vermittelter Nukleinsäurespaltung zur Erzeugung eines Schnitts im zweiten Strang an einer Position, die einer Position 3' vom geschnittenen Ende des Strangs aus Teil (a) entspricht, wobei der Schnitt 3' vom PAM-Motiv liegt;
- (c) Bereitstellen einer ersten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (a) liegenden Sequenz hybridisiert
- (d) Bereitstellen einer zweiten gRNA, die mit einer 5' zum PAM-Motiv im Strang aus Teil (b) liegenden Sequenz hybridisiert, umfasst,
wobei die Nukleinsäurestränge aus Teil (a) und Teil (b) unter Erhalt einer Deletion von Nukleinsäure zwischen den Schnitten repariert werden.
- 35. Herstellungsverfahren für eine Zelle oder einen transgenen nichtmenschlichen Organismus, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Durchführen des Verfahrens nach einer vorhergehenden Aussage für (i) ein Knock-out einer Zielnukleotidsequenz im Genom einer ersten Zelle und/oder (ii) ein Knock-in einer Insertionsnukleotidsequenz in das Genom einer ersten Zelle, gegebenenfalls wobei die Insertionssequenz eine Zielsequenz ganz oder teilweise am endogenen Ort der Zielsequenz im Genom ersetzt; wobei sich die Zelle oder eine Nachkommenschaft davon zu einem nichtmenschlichen Organismus bzw. einer nichtmenschlichen Zelle entwickeln kann; und
- (b) Entwickeln der Zelle oder Nachkommenschaft zu einem nichtmenschlichen Organismus oder einer nichtmenschlichen Zelle.
- 36. Verfahren nach Aussage 35, wobei der Organismus bzw. die Zelle homozygot für die Modifikation (i) und/oder (ii) ist.
- 37. Verfahren nach Aussage 35 oder 36, wobei es sich bei der Zelle um eine ES-Zelle, iPS-Zelle, totipotente Zelle oder pluripotente Zelle, gegebenenfalls eine Nagerzelle (z. B. eine Maus- oder Rattenzelle), handelt.
- 38. Verfahren nach einer der Aussagen 35 bis 37, wobei es sich bei der Zielsequenz um eine endogene Sequenz handelt, die ein regulatorisches Element ganz oder teilweise umfasst oder ein Protein ganz oder teilweise codiert.
- 39. Verfahren nach einer der Aussagen 35 bis 38, wobei die Insertionssequenz eine synthetische Sequenz ist; oder eine Sequenz umfasst, die ein Protein aus einer anderen Spezies als der Spezies, von der die erste Zelle stammt, ganz oder teilweise codiert; oder ein regulatorisches Element aus der ersten Spezies umfasst.
- 40. Verfahren nach Aussage 39, wobei die Insertionssequenz ein menschliches Protein oder eine menschliche Proteinuntereinheit oder -domäne ganz oder teilweise codiert.
- 41. Zelle oder nichtmenschlicher Organismus, deren bzw. dessen Genom eine eine von endogenen Nukleotidsequenzen flankierte nicht endogene Nukleotidsequenz umfassende Modifikation umfasst, wobei die Zelle bzw. der Organismus mit dem Verfahren nach einer der Aussagen 26 bis 40 erhältlich ist und wobei die nicht endogene Sequenz 3' von einem Cas-PAM-Motiv flankiert ist; wobei die Zelle nicht von einem Menschen umfasst wird; und einer, mehrere oder alle der Punkte (a) bis (d) zutrifft bzw. zutreffen
- (a) das Genom ist homozygot für die Modifikation; oder umfasst die Modifikation an einem Allel und ist am anderen Allel unmodifiziert von Cas-vermittelter homologer Rekombination;
- (b) die nicht endogene Sequenz umfasst ein regulatorisches Element ganz oder teilweise oder codiert ein Protein ganz oder teilweise;
- (c) die nicht endogene Sequenz ist wenigstens 20 Nukleotide lang;
- (d) die nicht endogene Sequenz ersetzt eine orthologe oder homologe Sequenz im Genom.
- 42. Zelle oder Organismus nach Aussage 41, wobei es sich bei der nicht endogenen Sequenz um eine menschliche Sequenz handelt.
- 43. Zelle oder Organismus nach Aussage 41 oder 42, wobei das PAM-Motiv eine aus CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT und GAA ausgewählte Sequenz umfasst.
- 44. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 43, wobei sich ein PAM-Motiv nicht mehr als 10 Nukleotide (z. B. 3 Nukleotide) 3' von der nicht endogenen Sequenz befindet.
- 45. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 44, wobei das PAM-Motiv von einer Streptococcus-Cas9 erkannt wird.
- 46. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 45, wobei es sich um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier handelt, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der schweren Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der schweren Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
- 47. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 46, wobei es sich um eine nichtmenschliche Wirbeltierzelle bzw. ein nichtmenschliches Wirbeltier handelt, die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der kappa-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert oder die bzw. das eine oder mehrere variable Domänen der lambda-leichten Kette menschlicher Antikörper (und gegebenenfalls keine variablen Domänen der kappa-leichten Kette einer nichtmenschlichen Wirbeltierspezies) exprimiert.
- 48. Zelle oder Organismus nach einer Aussage 46 oder Aussage 47, wobei die nicht endogene Sequenz ein menschliches Fc-Rezeptorprotein oder eine Untereinheit oder Domäne davon (z. B. ein menschliches FcRn- oder FcY-Rezeptorprotein, -Untereinheit oder -Domäne) codiert.
- 49. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 48, wobei die nicht endogene Sequenz ein oder mehrere menschliche Antikörper-Gensegmente, eine variable Antikörperregion oder eine konstante Antikörperregion umfasst.
- 50. Zelle oder Organismus nach einer der Aussagen 41 bis 49, wobei es sich bei der Insertionssequenz um eine menschliche Sequenz handelt, die eine orthologe nichtmenschliche Sequenz ersetzt oder ergänzt.
- 51. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, hergestellt durch Immunisierung eines Wirbeltiers (z. B. Maus oder Ratte) gemäß einer der Aussagen 41 bis 50 mit einem Antigen.
- 52. Isolierungsverfahren für einen Antikörper, der ein vorbestimmtes Antigen bindet, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) Bereitstellen eines Wirbeltiers (gegebenenfalls einer Maus oder Ratte) gemäß einer der Aussagen 41 bis 51;
- (b) Immunisieren des Wirbeltiers mit dem Antigen;
- (c) Entfernen von B-Lymphozyten aus dem Wirbeltier und Auswählen eines oder mehrerer B-Lymphozyten, die Antikörper exprimieren, die an das Antigen binden;
- (d) gegebenenfalls Immortalisieren der ausgewählten B-Lymphozyten oder Nachkommenschaft davon, gegebenenfalls indem Hybridomen davon produziert werden; und
- (e) Isolieren eines von den B-Lymphozyten exprimierten Antikörpers (z. B. und IgG-Typ-Antikörpers).
- 53. Verfahren nach Aussage 52, mit dem Schritt eines Isolierens von den Antikörper, der das Antigen bindet, codierender Nukleinsäure aus den B-Lymphozyten; gegebenenfalls Austauschen der Nukleotidsequenz der konstanten Region der schweren Kette des Antikörpers gegen eine eine menschliche oder humanisierte konstante Schwerkettenregion codierende Nukleotidsequenz und gegebenenfalls Affinitätsreifen der variablen Region des Antikörpers; und gegebenenfalls Insertion der Nukleinsäure in einen Expressionsvektor und gegebenenfalls einen Wirt.
- 54. Verfahren nach Aussage 52 oder 53, ferner umfassend Herstellen einer Mutante oder eines Derivats des mit dem Verfahren nach Aussage 52 oder 53 produzierten Antikörpers.
- 55. Verwendung eines isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemäß Aussage 51 oder eines mutierten oder derivatisierten Antikörpers davon, der das Antigen bindet, bei der Fertigung einer Zusammensetzung zur Verwendung als Arzneimittel.
- 56. Verwendung eines isolierten, monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemäß Aussage 51 oder eines mutierten oder derivatisierten Antikörpers davon, der das Antigen bindet, zur Verwendung in der Medizin.
- 57. Nukleotidsequenz, codierend einen Antikörper nach Aussage 51, gegebenenfalls wobei die Nukleotidsequenz Teil eines Vektors ist.
- 58. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den oder die Antikörper nach Aussage 51 und ein Verdünnungs-, Hilfs- oder Trägermittel.
- 59. ES-Zelle, eukaryontische Zelle, Säugerzelle, nichtmenschliches Tier oder nichtmenschliche Blastozyste, umfassend eine exprimierbare genomisch integrierte Nukleotidsequenz, die eine Cas-Endonuklease codiert.
- 60. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Aussage 59, wobei die Endonuklease-Sequenz konstitutiv exprimierbar ist.
- 61. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Aussage 59, wobei die Endonuklease-Sequenz induzierbar exprimierbar ist.
- 62. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Aussage 59, 60 oder 61, wobei die Endonuklease-Sequenz gewebespezifisch oder stadiumspezifisch im Tier oder in einer Nachkommenschaft davon oder in einem nichtmenschlichen Tier, bei dem es sich um einen Abkömmling der Zelle oder Blastozyste handelt, exprimierbar ist.
- 63. Zelle oder Tier nach Aussage 62, wobei es sich bei der Zelle um eine nichtmenschliche Embryozelle oder bei dem Tier um einen nichtmenschlichen Embryo handelt, wobei die Endonuklease-Sequenz in der Zelle oder dem Embryo exprimierbar ist oder exprimiert wird.
- 64. Zelle von Tier nach Aussage 63, wobei die Endonuklease in operativer Verknüpfung mit einem aus der aus einem embryospezifischen Promotor (z. B. einem Nanog-Promotor, einem Pou5fl-Promotor oder einem SoxB-Promotor) bestehenden Gruppe ausgewählten Promotor steht.
- 65. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einer der Aussagen 61 bis 64, wobei sich die Cas-Endonuklease an einem Rosa-26-Locus befindet und gegebenenfalls mit einem Rosa-26-Promotor operativ verknüpft ist.
- 66. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einer der Aussagen 59 bis 62, wobei die Cas-Endonuklease-Sequenz 5' und 3' von Transposonelementen (z. B. invertierten terminalen piggyBac-Elementen) oder stellenspezifischen Rekombinationsstellen (z. B. loxP und/oder einer lox-Mutante, z. B. lox2272 oder lox511; oder frt) flankiert ist.
- 67. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Aussage 66, umfassend eine oder mehrere Restriktionsendonuklease-Stellen zwischen der Cas-Endonuklease-Sequenz und einem Transposonelement.
- 68. Zelle, Tier oder Blastozyste nach einer der Aussagen 59 bis 67, umfassend eine oder mehrere gRNAs.
- 69. Zelle, Tier oder Blastozyste nach Aussage 66, 67 oder 68, wobei die gRNA(s) 5' und 3' von Transposonelementen (z. B. invertierten terminalen piggyBac-Elementen) oder stellenspezifischen Rekombinationsstellen (z. B. loxP und/oder einer lox-Mutante, z. B. lox2272 oder lox511; oder frt) flankiert sind.
- 70. Verwendung der Zelle, des Tiers oder der Blastozyste nach einer der Aussagen 59 bis 69 bei einem Verfahren gemäß einer der Aussagen 1 bis 50.
SEQUENZPROTOKOLL ![Figure DE202014010413U1_0028](https://patentimages.storage.googleapis.com/8b/44/9b/359fc1c4eae0b5/DE202014010413U1_0028.png)
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![Figure DE202014010413U1_0071](https://patentimages.storage.googleapis.com/52/54/93/09bf970f52b0a3/DE202014010413U1_0071.png)
![Figure DE202014010413U1_0072](https://patentimages.storage.googleapis.com/49/ef/74/ff62f7eeb54ce6/DE202014010413U1_0072.png)
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![Figure DE202014010413U1_0074](https://patentimages.storage.googleapis.com/b1/d7/cf/07e8934bdfc43c/DE202014010413U1_0074.png)
![Figure DE202014010413U1_0075](https://patentimages.storage.googleapis.com/9a/b0/2d/a185bbc4edfc81/DE202014010413U1_0075.png)
![Figure DE202014010413U1_0076](https://patentimages.storage.googleapis.com/23/3c/39/136bb43c0a7c01/DE202014010413U1_0076.png)
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2013061078 [0103, 0118]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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