TW202319540A - 檢測標的部位中的檢測對象核酸序列之存在或不存在之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種改變真核細胞基因體之標的部位的方法,該方法包含下述步驟:
(1)將導入核酸導入至前述細胞的步驟,該導入核酸包含:
(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸、
(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA、及
(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸;以及
(2)選擇表現前述選擇標記之細胞的步驟;其中,
被供給至前述步驟(1)之(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C),與(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸之莫耳數(A)、及(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)之任一者相比,皆較少。
Description
本發明係關於改變真核細胞之基因體的標的部位之方法。詳細而言,係關於藉由在試管內(in vitro)或活體外(ex vivo)之基因體編集來改變真核細胞基因體之標的部位的方法。
在基因體編集(參照專利文獻1)方面,藉由部位特異性核酸酶在基因體中的特定部位導入DNA雙股斷裂(Double-strand break:DSB),經由同源重組(Homologous recombination:HR)所致之DSB修復機構的介導,在核酸酶所造成之切斷處敲入(knock-in)作為目標之基因。
在經由HR介導之基因敲入中,於進行如單鹼基多型(Single nucleotide polymorphism:SNP)之導入或短標籤序列之插入等約數個至數十個鹼基改變的情況,可採用使單股寡DNA(Single-strand oligodeoxynucleotides:
ssODN)納入由核酸酶所致之切斷處的方法。
另一方面,在經由HR所介導之敲入中,於進行改變超過數個至數十個鹼基的情況,使用搭載有待插入基因的靶向載體(亦稱為「供體(donor)載體」)。靶向載體具有將包含待插入基因之靶向盒(targeting cassette)藉由用以引起HR的2個同源臂挾持的結構。藉由將組入有RNA誘導型核酸酶(例如,Cas9核酸酶或Cas9切口酶(nickase)或該等之變異體等)之表現載體及組入有嚮導RNA(guide RNA、gRNA)之表現載體與靶向載體一起轉染(transfection)至細胞,可達成經由DSB及HR所致之基因敲入。
就對經由HR介導之敲入效率造成影響的因子而言,有「脫靶效應(off-target effect)」及「隨機整合(random integration)」。脫靶效應意指核酸酶將DSB導入至基因體之標的部位以外的部位。若發生脫靶效應時,因DSB藉由非同源末端結合(Non-homologous end-joining:NHEJ)被修復時發生之錯誤,有引起不是預期之基因破壞之情形。又,隨機整合意指靶向載體盒不依靠DSB及HR,而隨機組入至基因體。隨機整合亦有引起不是預期之基因破壞之情形。
關於脫靶效應,專利文獻2中揭示使用短縮嚮導RNA(tru-gRNA),而使基因體編集之特異性增大的方法。gRNA為包含:藉由鹼基對形成而結合於標的部位之DNA序列的互補性區域、及RNA誘導型核酸酶結合區
域者,不過該方法係使用具有經短縮之標的互補性區域(未達20nt)的tru-gRNA作為gRNA。
又,先前,就確認外來核酸序列經由HR插入至基因體的手法而言,採用以該基因體作為模板,使用設計於同源臂之外側(上游或下游)之引子、及設計於外來核酸序列內之引子,進行PCR的方法。該方法係採取檢測出為目的之鹼基長之增幅產物,來確認外來核酸序列已插入至基因體的手法。藉由PCR來檢測增幅產物,由於欠缺定量性,該方法無法評估外來核酸序列經由HR對基因體的插入效率(敲入效率)。又,即使發生隨機整合,該方法亦無法檢測出。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2016-500262號公報
[專利文獻2]日本特表2016-512691號公報
本發明之主要目的為提供一種使用RNA誘導型核酸酶之模板核酸、及gRNA之模板核酸或gRNA,而以高特異性及效率來改變細胞之基因體之標的部位的技術。其他觀點方面,本發明之課題為有效率地選擇在基因體之標的部位有發生期望之改變的細胞。
為了解決上述課題,本發明提供下述[1]至[8]。
[1]一種改變真核細胞之基因體之標的部位的方法(在本說明書中,有稱為「本發明之方法」之情形),其包含下述步驟:
(1)將導入核酸導入至前述細胞的步驟,該導入核酸包含:
(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸、
(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA、及
(c)包含編碼選擇標記(selection marker)之核酸序列的模板核酸;以及
(2)選擇表現前述選擇標記之細胞的步驟;
其中,被供給至前述步驟(1)之(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C),與(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸之莫耳數(A)、及(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)之任一者相比,皆較少。
[2]如[1]之方法,其中,於前述步驟(1)中之導入核酸內包含(d)包含外來核酸序列的靶向模板核酸;被供給至步驟(1)中之(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C),與(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸之莫耳數(A)、(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序
列的模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)、及(d)包含外來核酸序列的靶向模板核酸之莫耳數(D)之任一者相比,皆較少。
[3]如[1]或[2]之方法,其中,相對於被供給至前述步驟(1)的導入核酸之莫耳數的合計,(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(n)所得的積數之比率(C×n/(導入核酸之莫耳數的合計))為0.01至0.8。
[4]如[1]之方法,其中,在被供給至前述步驟(1)的導入核酸只為(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸、(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA、以及(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸的情況,相對於(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸之莫耳數(A)、(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)、及(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C)的合計,(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(3)所得的積數之比率(C×3/(A+B+C))為0.01至0.8。
[5]如[2]之方法,其中,在被供給至前述步驟(1)的導入核酸只為(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸、(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA、(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸、以及(d)包含外來核酸序列的模板核酸的情況,相對於
(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸之莫耳數(A)、(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)、(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C)、及(d)包含外來核酸序列的模板核酸之莫耳數(D)的合計,(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(4)所得的積數之比率(C×4/(A+B+C+D))為0.01至0.8。
[6]如[1]至[5]中任一項之方法,其中,導入核酸皆為質體載體。
[7]如[1]至[6]中任一項之方法,其中,前述選擇標記為抗藥性基因。
[8]如[1]至[7]中任一項之方法,其中,前述RNA誘導型核酸酶為Cas9核酸酶或Cas9切口酶。
[9]如[1]至[7]中任一項之方法,其中,前述RNA誘導型核酸酶為Cpf1核酸酶。
[9a]一種評估方法,係在被供給至[1]至[9]之方法的細胞中,評估前述外來核酸序列對基因體之插入效率的方法,其包含:
(A)以細胞之基因體作為模板,使用設計於同源臂外側的探針、及設計於靶向盒內之探針,進行數位PCR之步驟。
[10]一種用以在染色體上之預定座位內檢測對象核酸序列之存在或不存在的方法,該方法包含下述步驟:
(2)藉由數位PCR法檢測第一核酸探針及第二核酸探針有無對源自前述染色體的基因體DNA斷片雜交的步驟,其中,該第一核酸探針會雜交於前述檢測對象核酸序列之全部或一部分,該第二核酸探針會雜交於前述預定座位內之前述檢測對象核酸序列以外的核酸序列;
(3)在前述第一核酸探針及前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片雜交而檢測出雙重陽性的情況,測知前述檢測對象核酸序列存在於前述預定座位;在未檢測出雙重陽性的情況,測知前述檢測對象核酸序列不存在於前述預定座位的步驟。
[11]如[10]之方法,其中,在前述預定座位中,前述第一核酸探針可雜交之第一區域與前述第二核酸探針可雜交之第二區域以預定之鹼基長度隔開。
[12]如[11]之方法,其中,在前述步驟(2)之前段,包含(1)從受檢細胞調製基因體DNA斷片之步驟。
[13]如[12]之方法,其中,前述檢測對象核酸序列為企圖經由基因重組而插入至前述受檢細胞之染色體上之目標座位的外來核酸序列;
前述第一核酸探針會雜交於該外來核酸序列之全部或一部分上;
前述第二核酸探針會雜交於前述目標座位之核酸序列,並且該核酸序列沒有位在供基因重組之2個同源臂之間。
[13a]如[13]之方法,其中,基於未得到前述雙重陽性,且檢測出前述第一核酸探針與前述基因體DNA斷片之雜交,而測知前述外來核酸序列存在於前述目標座位以外之座位。
[13b]如[13]之方法,其中,基於未得到前述雙重陽性,且檢測出前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片之雜交,而測知前述外來核酸序列不存在於前述染色體上。
[13c]如[13]至[13b]中任一項之方法,其中,在前述步驟(1)中,從前述受檢細胞之細胞集團調製基因體DNA斷片,
在前述步驟(2)中,將前述第一核酸探針及前述第二核酸探針對前述基因體DNA斷片之雜交定量化,
在前述步驟(3)中,從前述第一核酸探針及前述第二核酸探針之雜交量(DP)、只有前述第一核酸探針之雜交量(SP1)、及/或只有前述第二核酸探針之雜交量(SP2),算出前述細胞集團中之以下任一種以上的比率:外來核酸序列對目標座位之插入率(%)=DP×100/(DP+SP2);外來核酸序列對染色體之隨機整合率(%)=SP1×100/(DP+SP2)。
[13d]如[13c]之方法,其進一步包含下述步驟:
(4)使用探針對,並藉由數位PCR法將該探針對與前述基因體DNA斷片的雜交定量化,其中該探針對以彼此隔開之鹼基長度相當於前述第一區域與前述第二區域之間的鹼基長度雜交於前述染色體,
從前述探針對之兩條探針的雜交量(dp)、及前述探針
對只有任一者之雜交量(sp),算出前述基因體DNA斷片之下述比率的步驟:
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(式中,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值);
(5)將前述插入率(%)以前述斷裂率(%)進行校正之步驟。
[13e]如[13a]至[13d]中任一項之方法,其中,前述目標座位中,前述第一核酸探針可雜交之第一區域,與前述第二核酸探針可雜交之第二區域,隔開至少1kb長度。
[14]如[12]之方法,其中,前述檢測對象核酸序列為企圖經由基因重組而從前述受檢細胞之染色體上之目標座位被刪除的內在核酸序列;
前述第一核酸探針會雜交於前述內在核酸序列之全部或一部分上;
前述第二核酸探針會雜交於前述目標座位之核酸序列,並且該核酸序列沒有位在供基因重組之2個同源臂之間。
[14a]如[14]之方法,其中,基於未得到前述雙重陽性,且檢測出前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片雜交,而測知前述內在核酸序列不存在於前述目標座位中。
[14b]如[14]之方法,其中,在前述第一核酸探針及前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片雜交,而檢測出
雙重陽性之情況,測知前述內在核酸序列存在於前述目標座位中。
[14c]如[14a]或[14b]之方法,其中,在前述步驟(1)中,從前述受檢細胞之細胞集團調製基因體DNA斷片;
在前述步驟(2)中,將前述第一核酸探針及前述第二核酸探針對前述基因體DNA斷片之雜交定量化;
在前述步驟(3)中,從前述第一核酸探針及前述第二核酸探針之雜交量(DP)、及只有前述第二核酸探針之雜交量(SP2),算出前述細胞集團之下述比率:
內在核酸序列之刪除率(%)=100-DP×100/(DP+SP2)。
[14d]如[14c]之方法,其進一步包含下述步驟:
(4)使用探針對,並藉由數位PCR法定量該探針對與前述基因體DNA斷片之雜交,其中該探針對以彼此隔開之鹼基長度相當於前述第一區域與前述第二區域之間的鹼基長度雜交於前述染色體,
從前述探針對之兩條探針的雜交量(dp)、及前述探針對中只有任一者之雜交量(sp),算出前述基因體DNA斷片之下述比率的步驟:
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(式中,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值);
(5)將前述刪除率(%)以前述斷裂率(%)進行校正之步驟。
[14e]如[14a]至[14d]中任一項之方法,其中,在前述
目標座位中,前述第一核酸探針可雜交之第一區域與前述第二核酸探針雜交之第二區域,隔開至少1kb長度。
[15]如[10]至[12]中任一項之方法,其中,基於未得到前述雙重陽性,且檢測出前述第一核酸探針與前述基因體DNA斷片之雜交,而測知前述檢測對象核酸序列存在於前述預定座位以外的座位。
[16]如[10]至[12]中任一項之方法,其中,基於未得到前述雙重陽性,且檢測出前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片之雜交,而測知前述檢測對象核酸序列不存在於前述染色體上。
根據本發明,可提供一種使用RNA誘導型核酸酶之模板核酸、及gRNA之模板核酸或gRNA,以高特異性及效率改變細胞之基因體的標的部位的技術。又,提供一種有效率地選擇在基因體之標的部位有發生期望之改變的細胞的技術。
第1圖為用以說明本發明之檢測染色體上之預定座位中檢測對象核酸序列存在或不存在之方法的圖。
第2圖為用以說明本發明之評估敲入效率之方法的圖。
第3圖為用以說明本發明之評估剔除(knock-out)效率
之方法的圖。
第4圖為用以說明本發明之評估經由同源重組(HR)所介導之敲入效率之方法的圖。
第5圖為顯示APC基因之外顯子3之鹼基序列及gRNA之識別序列的圖(實施例1)。
第6圖為顯示野生型APC基因之增幅產物、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的APC基因之增幅產物二者的鹼基序列之圖(實施例1)。
第7圖為顯示野生型APC基因之增幅產物、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的APC基因之增幅產物二者的限制酵素消化斷片之電泳圖譜之圖(實施例1)。
第8圖為顯示敲入效率(=100×Y/(X+Y))相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例1),其中該敲入效率係基於野生型APC基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的APC基因之增幅產物的量(Y)而算出。該圖中,橫軸表示Factor值,縱軸表示敲入效率(%)。
第9圖為顯示經回收之基因體DNA的質量相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例1)。橫軸表示Factor值,縱軸表示基因體DNA質量(μg)。
第10圖為顯示敲入效率(=100×Y/(X+Y))相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例2),其中該敲入效率係基於野生型TNNI1基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的TNNI1基因之增幅產物的量(Y)而算出。該圖中,橫軸表示Factor值,縱軸表示敲入效率
(%)。
第11圖為顯示經回收之基因體DNA的質量相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例2)。橫軸表示Factor值,縱軸表示基因體DNA質量(ng)。
第12圖為顯示敲入效率(=100×Y/(X+Y))相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例3),其中該敲入效率係基於野生型TNNI1基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的TNNI1基因之增幅產物的量(Y)而算出。該圖中,橫軸表示Factor值,縱軸表示敲入效率(%)。
第13圖為顯示經回收之基因體DNA的質量相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例3)。橫軸表示Factor值,縱軸表示基因體DNA質量(ng)。
第14圖為顯示IPTKB基因之外顯子8的鹼基序列及gRNA之識別序列的圖(實施例4)。
第15圖為顯示敲入效率(=100×Y/(X+Y))相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例4),其中該敲入效率係基於野生型IPTKB基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸(外來核酸序列)之插入的IPTKB基因之增幅產物的量(Y)而算出。該圖中,橫軸表示Factor值,縱軸表示敲入效率(%)。
第16圖為顯示經回收之基因體DNA的質量相對於Factor值作圖之結果的圖(實施例4)。橫軸表示Factor值,縱軸表示基因體DNA質量(ng)。
以下,針對用於實施本發明之較佳態樣,在參照圖式下加以說明。此外,下述所說明之實施態樣,係表示本發明之代表性實施態樣之一例,並非藉此將本發明之範圍狹隘地解釋。
1.基因體標的部位之改變方法
就本發明之改變基因體標的部位的方法而言,可列舉本身周知之基因重組方法(例如,藉由非同源性末端結合(NHEJ)之改變方法(剔除方法及敲入方法)、藉由同源重組(HR)之改變方法(敲入方法)、藉由同源重組修復(HDR)之改變方法(敲入方法)及藉由微同源性末端結合(MMEJ)之改變方法(敲入方法))。就本發明之剔除方法而言,可列舉如:藉由在修復由RNA誘導型核酸酶所致之DSB時而發生之插入及/或缺損(InDel)變異來改變基因之方法。另一方面,就本發明之敲入方法而言,可列舉如:在由RNA誘導型核酸酶所致之DNA雙股切斷(DSB)的部位,插入適當的外來核酸序列,藉此來改變基因之方法。
本發明之一實施態樣,為改變真核細胞基因體之標的部位的方法,其特徵為包含下述步驟:
(1)將導入核酸導入至前述細胞的步驟(以下亦稱為「轉染步驟(1)」),該導入核酸包含:
(a)包含編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列的模板核酸(以下亦稱為「核酸酶模板核酸」)、
(b)包含編碼嚮導RNA之核酸序列的模板核酸(以下亦稱為「gRNA模板核酸」)或嚮導RNA、以及
(c)包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸(以下亦稱為「選擇模板核酸」);以及
(2)選擇表現前述選擇標記之細胞的步驟(以下亦稱為「選擇步驟(2)」)。
在本發明之一實施態樣中,經由使用有核酸酶模板核酸及gRNA模板核酸或gRNA的NHEJ介導,可將標的部位之基因剔除。在經由使用有核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸或gRNA的NHEJ所介導的剔除中,較佳為使細胞內表現充分量的RNA誘導型核酸酶及gRNA。
藉由細胞內表現充分量的RNA誘導型核酸酶及gRNA,在剔除上以充分之頻率發生DSB,而能以高效率地剔除標的部位之基因。
在本發明之剔除方法中,於轉染步驟(1)中,供給比核酸酶模板核酸、及gRNA模板核酸或gRNA之任一者少之莫耳數的選擇模板核酸,於選擇步驟(2)中,藉由只選擇表現選擇標記的細胞,可以高效率地得到已將期望之基因體標的部位剔除的細胞。
就選擇步驟(2)中所選擇之細胞而言,可列舉即使於轉染步驟(1)中供給少量之選擇載體的情況,仍能表現充分量之選擇標記的細胞。亦即,於選擇步驟(2)中所選擇之細胞,可為選擇模板核酸之捕獲效率高的細胞、或
所捕獲之選擇模板核酸為表現效率高的細胞。由此,在此等細胞中,核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸或gRNA之捕獲效率及表現效率之任一者皆高,其結果可以高頻率生成DSB,並且藉由NHEJ將標的部位之基因以高正確率地剔除。
本發明之剔除方法,於轉染步驟(1)中,供給比核酸酶模板核酸及gRNA模板核酸或gRNA之任一者少之莫耳數的選擇模板核酸,於選擇步驟(2)中,藉由只選擇表現選擇標記之細胞,可得到高剔除效率。
本發明之其他實施態樣,係在真核細胞基因體的標的部位插入外來核酸序列之方法,其特徵為在前述轉染步驟(1)中,於導入核酸中包含含有(d)外來核酸序列之靶向模板核酸(以下,亦簡稱為「靶向模板核酸」)。
在經由使用核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸或gRNA、及靶向模板核酸之HR所介導的敲入中,首先,較佳為使細胞內表現充分量之RNA誘導型核酸酶及gRNA,並且,較佳為在細胞內導入適當量之靶向模板核酸。
在細胞內沒有表現充分量之RNA誘導型核酸酶及gRNA的情況,欠缺經由HR介導之敲入所必要的因子,而有不憑藉DSB及HR之隨機整合之頻率增加的可能性。
即使在細胞內表現充分量之RNA誘導型核酸酶及gRNA的情況,若與RNA誘導型核酸酶及gRNA之表現量相比,靶向模板核酸之導入量過少時,則相對於HR
所致之DSB修復,經由NHEJ所致之DSB修復將變得較為優勢,導致非目標之基因破壞變得顯著。另一方面,若靶向與RNA誘導型核酸酶及gRNA之表現量相比,模板核酸之導入量變得過剩時,則有不依賴DSB及HR之隨機整合的頻率增加之可能性。因此,在以不會將隨機整合以高頻率地引起的程度之量為限制下,靶向模板核酸之適當導入量較佳為充分量。
在本發明之敲入方法中,於轉染步驟(1)中,供給比核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸或gRNA、及靶向模板核酸之任一者少之莫耳數的選擇模板核酸,於選擇步驟(2)中,藉由只選擇表現選擇標記之細胞,將能以高效率地得到經敲入之細胞(參照實施例)。
在本發明之一態樣中,選擇模板核酸之莫耳數(C),較佳為與核酸酶模板核酸之莫耳數(A)及嚮導RNA模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)的任一者相比,皆較少。在本發明中,相對於導入核酸之莫耳數之合計(A+B+C),將供給至轉染步驟(1)之選擇模板核酸之莫耳數(C)調整至特定比率,藉此能以更高效率地得到標的部位經改變的細胞。在一實施態樣中,選擇模板核酸之莫耳數(C)相對於導入核酸之莫耳數之合計的比率(C/(A+B+C),為1/400至1/10,以1/200至1/5為較佳,以1/150左右為更佳。
就更佳之實施態樣而言,可將選擇模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目所得之積數,除以導入核酸之莫耳數之合計而得的值(以下亦稱為「Factor
值」)調整為特定比率。
Factor值被定義為:相對於核酸酶模板核酸之莫耳數(A)、嚮導RNA模板核酸序列或嚮導RNA之莫耳數(B)、及選擇模板核酸之莫耳數(C)之合計(A+B+C),選擇模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(n)所得之積數的比率(C×n/(A+B+C))。
Factor值=C×n/(A+B+C)
就Factor值而言,可為0.01至0.8,較佳為0.02至0.4,更佳為0.02至0.2,特佳為0.02至0.04。
在選擇步驟(2)中所選擇之細胞,係考量即使為在轉染步驟(1)中供給少量之選擇模板核酸的情況,仍可表現充分量之選擇標記的細胞。亦即,在選擇步驟(2)中所選擇之細胞,係考量其為選擇模板核酸之捕獲效率高的細胞、或為所捕獲之選擇模板核酸的表現效率高之細胞的可能性。因此,在此等細胞中,核酸酶模板核酸及gRNA模板核酸或gRNA之捕獲效率及表現效率均高,可使經由HR介導之敲入所必須之因子以充分量表現,研判相對於RNA誘導型核酸酶及gRNA之表現量,以一定量導入之靶向模板核酸不容易成為過剩量。其結果,在此等細胞中,若相對於RNA誘導型核酸酶及gRNA之表現量,以不會有成為過少之虞之範圍內的量導入靶向模板核酸時,將可同時抑制基因破壞及隨機整合,而得到高敲入(knock-in)效率。
在本發明中,供給至轉染步驟(1)之導入核
酸,較佳為分別以作為各種模板核酸或嚮導RNA導入至細胞。例如,就使用載體作為導入核酸而導入前述(a)至(d)之模板核酸的情況,較佳為編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列、編碼嚮導RNA之核酸序列、外來核酸序列、及編碼選擇標記之核酸序列之任一者皆不被包含於相同之載體,而被包含於分別之載體。
本發明之方法,亦可適用於敲入及剔除之任一種基因改變,而以適用於敲入(敲入方法)為較佳。
在本發明之一態樣中,選擇模板核酸之莫耳數(C),較佳為與核酸酶模板核酸之莫耳數(A)、嚮導RNA模板核酸或嚮導RNA之莫耳數(B)、及靶向模板核酸之莫耳數(D)之任一者相比,皆較少。在本發明中,藉由將供給至轉染步驟(1)之選擇模板核酸之莫耳數(C),相對於導入核酸之莫耳數之合計(A+B+C+D)的比率調整為特定比率,能以更高效率得到標的部位改變之細胞。在一實施態樣中,選擇模板核酸之莫耳數(C)相對於導入核酸之莫耳數之合計的比率(C/(A+B+C+D))為1/400至1/10,較佳為1/200至1/5,更佳為約1/150。
就更佳之實施態樣而言,可將選擇模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目之值,除以導入核酸之莫耳數之合計所得的值(以下亦稱為「Factor值」(「因數值」)),調成特定之比率。
Factor值被定義為:相對於核酸酶模板核酸之莫耳數(A)、嚮導RNA模板核酸序列或嚮導RNA之莫耳數(B)、
選擇模板核酸之莫耳數(C)、及靶向模板核酸之莫耳數(D)的合計(A+B+C+D),選擇模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(n)所得之積數的比率(C×n/(A+B+C+D))。
Factor值=C×n/(A+B+C+D)
就Factor值而言,可為0.01至0.8,較佳為0.02至0.4,更佳為0.02至0.2,特佳為0.02至0.04。
關於本發明中之「導入核酸之種類」,可被認為係相同種類之導入核酸,意指其核酸序列完全一致者。因此,模板核酸與gRNA為不同種類之導入核酸。
又,在模板核酸中,核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸、選擇模板核酸及靶向模板核酸,由於為包含彼此不同之核酸序列者,所以為不同種類之導入核酸。但是,在核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸、選擇模板核酸及靶向模板核酸之任何2種以上結合成為一模板核酸的情況,將該結合模板核酸計算為1種。
再者,即使為核酸酶模板核酸,例如包含編碼Cas9核酸酶之核酸序列的模板核酸、及包含編碼Cas9切口酶之核酸序列的模板核酸,由於為包含彼此不同之核酸序列者,所以為不同種類之導入核酸。又,包含編碼Cas9核酸酶之某結構域(domain)之核酸序列的模板核酸、及包含編碼Cas9核酸酶之其他結構域之核酸序列的模板核酸,由於為包含彼此不同之核酸序列者,所以為不同種類之導入核酸。
關於此點,gRNA模板核酸、選擇模板核酸及靶向模
板核酸亦相同,在模板核酸之核酸序列中所含的gRNA、選擇標記或外來核酸序列之核酸序列,彼此不同的模板核酸皆為不同種類的導入核酸。又,如模板核酸為例如質體載體之情況,在模板核酸具有核酸酶、gRNA、選擇標記、或外來核酸序列之核酸序列以外之核酸序列(例如啟動子序列等)的情況,此等在核酸序列上彼此不同之模板核酸亦皆為不同種類的之導入核酸。
本發明,就一觀點而言,係關於藉由將「導入核酸之種類」設定為2以上(但是,其中至少1者為包含選擇模板核酸之導入核酸),且轉染時使所使用的選擇模板核酸之莫耳數少於其他導入核酸所含之模板核酸,而可有效率地得到基因體之標的部位經改變之期望細胞的方法。轉染時所使用之「導入核酸之種類」為2以上即可,就「轉染時使用2種導入核酸之情況」而言,可列舉使用包含(i)選擇模板核酸及(ii)其他核酸之導入核酸的情況,具體而言,可列舉使用包含(i)選擇模板核酸及(ii)靶向模板核酸之導入核酸的情況、或使用包含(i)選擇模板核酸及(ii)核酸酶模板核酸及gRNA模板核酸之導入核酸的情況。
轉染時所使用之選擇標記模板核酸之莫耳數(C),比轉染時所使用之任一模板核酸或嚮導RNA之莫耳數皆較少。在本發明中,藉由將供給至轉染步驟(1)之選擇模板核酸之莫耳數(C)相對於導入核酸之莫耳數的合計(T)的比率調至特定之比率,而能以更高效率得到標的部位經改變之細胞。在一實施態樣中,就選擇模板核酸之莫耳數(C)
相對於導入核酸之莫耳數之合計的比率(C/T)之較佳範圍而言,可列舉與前述之C/(A+B+C+D)相同的範圍。
就更佳之實施態樣而言,可將選擇模板核酸之莫耳數(C)乘以導入核酸之種類之數目(n’)的積值,除以導入核酸之莫耳數之合計(T)所得的值(以下亦稱為「Factor值」)調至特定之比率,就該值之較佳範圍而言,可列舉與前述之C×n/(A+B+C+D)相同的範圍。
本發明中之「導入核酸之種類」,以3以上為較佳。
例如,在以Cas9核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸、嘌呤黴素(puromycin)選擇模板核酸及靶向模板核酸作為導入核酸之情況,此等彼此不結合且成為個別之模板核酸的情況,導入核酸之種類的數目為4。若Cas9核酸酶模板核酸與gRNA模板核酸結合成一個模板核酸的情況,導入核酸之種類的數目變成3。
如前述,供給至轉染步驟(1)之導入核酸,較佳為分別作為個別之模板核酸或嚮導RNA之形式導入細胞。例如,在使用質體載體作為導入核酸,而導入前述(a)至(d)之模板核酸的情況,編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列、編碼嚮導RNA之核酸序列、外來核酸序列、及編碼選擇標記之核酸序列,分別包含於4種質體載體。此時,Factor值可藉由前述之式(C×4)/(A+B+C+D)算出。
[細胞]
細胞只要為真核細胞即可,無特別限定,例如可為酵母、真菌、原生生物、植物細胞、昆蟲細胞、兩棲類細胞、爬蟲類細胞、鳥類細胞、非人類哺乳類細胞、人類細胞。就非人類哺乳類動物而言,可例示小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、犬、貓、豬、牛、馬、綿羊及猴。細胞可為培養細胞(試管內(in vitro)及活體外(ex vivo))。
在本說明書中,「試管內」意指在試管或培養器等中對上述細胞等進行例如轉染等操作。又,在本說明書中,「活體」意指從活體取出臟器及細胞等,對該取出之細胞等進行例如轉染等操作。
細胞可為多能性幹細胞(pluripotent stem cell)。
「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」意指胚胎幹細胞(ES細胞)以及潛在有與ES細胞同樣之分化多能性,亦即可分化成活體之各種組織(內胚層、中胚層、外胚層全部)之能力的細胞。就與ES細胞具有同樣之分化多能性的細胞而言,可列舉「誘導多能性幹細胞」(在本說明書中,有稱為「iPS細胞」之情形)。
「誘導多能性幹細胞」意指將特定之因子(細胞核重編程因子(Nuclear reprogramming factor))導入至哺乳動物體細胞或未分化幹細胞後,進行重編程(reprogramming)藉此而得的細胞。目前,有各式各樣的「誘導多能性幹細胞」,除了可使用依照山中氏等,藉由將Oct3/4、Sox2、K1f4、c-Myc之4因子導入至小鼠纖維母細胞而建構出的iPS細
胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)之外,亦可使用:將相同之4因子導入至人類纖維母細胞而建構出之源自人類細胞的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131:861-872.);將前述4因子導入後,以Nanog之表現作為指標進行篩選而建構出的Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.);以不含有c-Myc之方法而製作出的iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106);以無病毒法導入6因子而建構出之iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May;8(5):409-12、Okita K et al.Stem Cells.31(3):458-66.)。又,亦可使用依照Thomson氏等所製作的導入OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28之4因子而建構出的誘導多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.);依照Daley氏等所製作之誘導多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146),依照櫻田氏所製作之誘導多能性幹細胞(特開2008-307007號)等。
此外,亦可使用公開之全部論文(例如,Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574;Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650;Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797),或專利(例如,日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、
US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中所記載之該技術領域周知之誘導多能性幹細胞之任一種。
就人工多能性細胞株而言,可利用NIH、理研、京都大學等建構出的各種iPS細胞株。例如,若為人類iPS細胞株,可列舉:理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。
[RNA誘導型核酸酶]
就本發明中所使用之RNA誘導型核酸酶而言,可列舉如RNA誘導型內切核酸酶。
RNA誘導型內切核酸酶,係包含至少1個核酸酶結構域及與gRNA相互作用的至少1個結構域。RNA誘導型內切核酸酶係藉由gRNA而被誘導至基因體之標的部位。
RNA誘導型內切核酸酶可源自成簇規律性間隔短回文重覆序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats;CRISPR)/CRISPR-關連(Cas)系統。CRISPR/Cas系統可分為I型、II型、或III型系統。適當之CRISPR/Cas蛋白質的非限定性實例中,可包含Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、
CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3,Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及Cu1966。
在一態樣中,RNA誘導型內切核酸酶係源自II型CRISPR/Cas系統。在特定之態樣中,RNA誘導型內切核酸酶係源自Cas9蛋白質。Cas9蛋白質可源自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、黃色葡萄球菌、葡萄球菌屬、達松維爾類諾卡菌(Nocardiopsis dassonvillei)、普納鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiraris)、產綠色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)、玫瑰鏈孢子囊菌(Streptosporangium roseum)、酸性脂環酸桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、西蘭芽孢桿菌(Bacillus serenityredsense)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、新兇手法朗西斯菌(Francisella novicida)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微西拉菌(Microsilla marina)、類鼻疽細菌(Burkholderia bacteria)、萘硼極單胞菌(Polaromonas naphthaleneborans)、極單胞菌種(Polaromonas species)、瓦氏鰐球藻
(Crocosphaera watsonii)、藍桿藻屬(Cyanothece)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(Synechococcus)、阿拉伯醋酸喜鹽菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor becscii)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、腦膜炎奈特氏菌(Neisseria meningitides)、脫硫金礦菌(Candidatus desulforudis)、肉毒梭菌、艱難梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilusm)、熱丙酸鹽暗色厭氧香腸狀菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、靜脈異著色菌(Allochromatium vinosum)、海桿菌屬(Marinobacter genus)、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococccus watsoni)、植鹽假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、成簇細枝菌(Ktedonobacter racemifer)、調查甲烷鹽菌(Methanohalbium evestigatum)、多變魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫節旋藻(Nodularia spumigena)、念珠藻屬(Nostoc genus)、極大節螺藻(Arthrospira Maxima)、鈍頂節螺藻(Arthrospira Platensis)、節螺藻屬(Arthrospira)、鞘絲藻屬、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬(Lingvia)、運動石孢菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖熱腔菌(Thermosipho
africanus)、或海洋食醋藻(Acaryochloris marina)。
CRISPR/Cas蛋白質可為野生型CRISPR/Cas蛋白質、修飾型CRISPR/Cas蛋白質、或野生型或修飾型CRISPR/Cas蛋白質之斷片。為了增大核酸結合親和性及/或特異性、變更酵素活性、或變更蛋白質之其他特性,CRISPR/Cas蛋白質可被修飾。
RNA誘導型核酸酶可為Cas核酸酶或Cas切口酶。其中,Cas核酸酶或Cas切口酶均係CRISPR/Cas系統中必須之蛋白質成分,意指在與被稱為CRISPR RNA(crRNA)及轉活化crRNA(tracrRNA)之2個RNA形成複合體的情況,具有活性的內切核酸酶或切口酶。切口酶意指僅在一股DNA鏈上置入切口(nick)之DNA切斷酵素。一般而言,Cas9蛋白質包含至少2個核酸酶(亦即DNase)結構域。例如,Cas9蛋白質可包含類RuvC核酸酶結構域及類HNH核酸酶結構域。為了在DNA中進行雙股之切斷,RuvC及HNH結構域以各切斷單股之形式而合作(Jinek et al.,Science,337:816-821)。在一態樣中,源自Cas9之蛋白質,可被修飾成僅包含1個功能性核酸酶結構域(類RuvC或類HNH核酸酶結構域之任一種)。例如,源自Cas9之蛋白質,核酸酶結構域中之1個,可以刪除或變異之方式被修飾成不再具有功能(亦即核酸酶活性不存在)。在核酸酶結構域之1個為不活性之態樣中,源自Cas9之蛋白質雖可於雙股核酸導入切口,但無法切斷雙股DNA。例如,將類RuvC結構域中之天冬胺酸變換成丙胺
酸(D10A),可將源自Cas9之蛋白質變換為切口酶。相同地,將HNH結構域中之組胺酸變換成丙胺酸(H840A或H839A),可將源自Cas9之蛋白質變換為切口酶。各核酸酶結構域,可使用例如部位特異性突變誘發法、PCR仲介性突變誘發法、及全基因合成、以及在該技術領域中所周知之其他方法等公知方法進行修飾。
在RNA誘導型核酸酶中,尤其可使用源自鏈球菌屬菌(Streptococcus sp.)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus sp.)、新兇手法朗西斯菌(Francisella novicida)、或空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)之Cas核酸酶或Cas切口酶。其中,就來源而言,於鏈球菌屬菌中,以化膿性鏈球菌(S.pyogenes)為較佳,於葡萄球菌屬菌中,以黃色葡萄球菌(S.aureus)為較佳。源自化膿性鏈球菌及黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶或Cas9切口酶可識別NGG或NAG三核苷酸。
又,在特定態樣中,RNA誘導型內切核酸酶,就V型系統而言,可為被鑑定為相對最接近之Cpf1(源自普雷沃氏菌屬(Prevotella)及佛朗西斯(Francisella)之CRISPR)。Cpf1蛋白質可源自胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)及毛螺桿菌(Lachnospiraceae bacterium)、新兇手法朗西斯菌(Francisella novicida)。
再者,亦可使用鋅指核酸酶(ZFN,Zinc-finger nucleases)、或類轉錄活化因子效應核酸酶(TALEN,transcription activator-like effector nucleases)等
部位特異性核酸酶,來代替RNA誘導型核酸酶。
在此實施態樣之改變真核細胞基因體的標的部位之方法係包含在轉染步驟(1)中將導入核酸導入至細胞,其中該導入核酸包含:包含編碼切斷基因體中某部位之部位特異性核酸酶(例如稱為TALEN1)之核酸序列的模板核酸(核酸酶核酸)、及包含編碼切斷其他部位之部位特異性核酸酶(例如稱為TALEN2)之核酸序列的模板核酸(核酸酶核酸)、包含編碼選擇標記之核酸序列的模板核酸(選擇模板核酸)。此時,選擇模板核酸之莫耳數,只要少於核酸酶模板核酸之莫耳數(將TALEN1及TALEN2分別作為模板核酸之情況,為其合計莫耳數)即可。再者,在轉染步驟(1)中,於使用靶向模板核酸之情況,選擇模板核酸之莫耳數亦少於靶向模板核酸之莫耳數。
總之,本實施態樣之改變真核細胞基因體的標的部位之方法,亦為少於選擇模板核酸之莫耳數比選擇模板核酸以外之導入核酸之莫耳數之任一者,本實施態樣中之Factor值,亦即相對於導入核酸之莫耳數的合計,選擇模板核酸之莫耳數乘以導入核酸之種類之數目(n)之積數的比率,與前述相同地定義。
[gRNA]
gRNA只要是對基因體之標的部位具有特異性,與RNA誘導型核酸酶可形成複合體,於基因體之標的部位可具有RNA誘導型核酸酶的RNA即可。gRNA係由2個
RNA,亦即由CRISPR RNA(crRNA)及轉活化crRNA(tracrRNA)構成,crRNA係包含與基因體之標的部位互補的部分。gRNA可為包含crRNA及tracrRNA之嵌合RNA,亦可為藉由將crRNA及tracrRNA之必須部分融合而製成之單股RNA(sgRNA)。
在真核細胞中進行轉染之情況,gRNA可為包含crRNA及tracrRNA之嵌合RNA,而以藉由將crRNA及tracrRNA之必須部分融合而製成之單股RNA(sgRNA)為較佳。
gRNA包含3個區域:具有與染色體序列中之標的部位互補的5’末端之第一區域、形成莖環(stem loop)構造之第二內部區域、及本質上為單股之第三3’區域。以使gRNA可將RNA誘導型核酸酶誘導至特定標的部位之方式,第一區域在每個gRNA各自相異。gRNA之第二及第三區域,在全部gRNA中可以相同。
以能與基因體之標的部位形成鹼基對之方式,第一區域係與標的部位之序列為互補性。第一區域可包含約10個核苷酸至約25個以上之核苷酸。例如,第一區域與基因體之標的部位間的鹼基對形成區域,可為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、或25個以上核苷酸長。在例示之態樣中,第一區域為19、20、或21個核苷酸長。
gRNA包含形成二次結構之第二區域。該二次結構可包含莖(或髮夾)及環。環及莖之長度為可變。第
二區域可為約16至約60個核苷酸長之範圍。在例示之態樣中,環為約4個核苷酸長,莖包含約12個鹼基對。
就莖(或髮夾)及環之長度而言,以約20至約80個核苷酸長為較佳,以約30至約50個核苷酸為更佳。
gRNA於3’末端包含本質上維持單股之第三區域。第三區域與目標細胞內的染色體序列無互補性,與gRNA之其餘部分無互補性。第三區域之長度為可變。一般而言,第三區域為約4個以上核苷酸長。例如,第三區域之長度係在約5至約60個核苷酸長的範圍。
第二及第三區域之合併長度,可為約30至約120個核苷酸長之範圍。合併第二及第三區域之長度,較佳為約70至約100個核苷酸長之範圍。
[選擇標記(selection marker)]
選擇標記為可將表現該標記之細胞從不表現該標記之細胞區別的多肽,例如,可為螢光蛋白質、催化呈色反應及/或發光反應之酵素、抗藥性因子等。就螢光蛋白質而言,可使用例如:綠色螢光蛋白質(GFP)、藍色螢光蛋白質(CFP)、黃色螢光蛋白質(YFP)及紅色螢光蛋白質(dsRed)等。催化呈色反應及/或發光反應之酵素而言,可使用例如:螢光素酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)及β-半乳糖苷酶(lacZ)等。就抗藥性因子而言,例如周知對嘌呤黴素或新黴素、潮黴素、G418、殺稻瘟菌素等抗生素之抗性因子。
就選擇標記而言,從操作之容易性及選擇性等的觀點
而言,以抗藥性因子為較佳,以抗嘌呤黴素因子為特佳。另一方面,從基因插入效率之評估之容易性及正確性等觀點而言,以螢光蛋白質及催化呈色反應及/或發光反應之酵素為較佳,以螢光蛋白質為更佳。
[導入核酸]
本發明中之導入核酸,意指導入細胞之核酸,包含嚮導RNA及模板核酸。
[模板核酸]
本發明中之模板核酸,意指生產其他分子時作用為模板之核酸,例如,可列舉DNA(例如,寡DNA)、RNA(例如,寡RNA)及包含此等中之至少一者之核酸、載體等。本發明中之模板核酸,更具體而言,意指核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸、選擇模板核酸及靶向模板核酸。
在此等模板核酸中,可使用不同類型者。例如,就核酸酶模板核酸、選擇模板核酸及gRNA模板核酸而言,使用基因表現載體,就靶向模板核酸而言,亦可使用包含寡DNA之核酸。
本發明中之載體包含,例如:質體載體、噬菌粒、黏接質體(cosmid)、人工/迷你染色體、跳躍基因、及病毒載體(例如,慢病毒載體、腺伴隨病毒載體等)。載體以質體載體為較佳,較佳之質體載體之類型的非限定實例中,包含pUC、pBR322、pET、pBluescript、及彼等之
變異體。載體可進一步包含表現調節序列(例如,增強子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、轉錄終結序列等)、選擇標記(例如,前述之抗藥性因子等)序列、複製起點等。此外,在本說明書中,將組入有編碼「在啟動子控制下,在所導入之細胞內欲表現的蛋白質、RNA及因子等」之核酸序列的載體特稱為「基因表現載體」。
啟動子方面,可包含例如巨細胞病毒最初期啟動子(CMV)、猿猴病毒(SV40)啟動子、腺病毒主要後期啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV,Rous sarcoma virus)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、伸長因子(ED1)-α啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、彼等之斷片、或前述之任何組合。啟動子序列可為野生型,或為了更有效率地表現而加以修飾。
就本發明中之模板核酸而言,以使用質體載體為較佳。
[核酸酶模板核酸及選擇模板核酸]
核酸酶模板核酸及選擇模板核酸,可為在泛用之基因表現載體中組入有編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列或編碼選擇標記之核酸序列者即可。編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列及編碼選擇標記之核酸序列,可在泛用之啟動子控制下被組入。
編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列及編碼
選擇標記之核酸序列,可為在目標之真核細胞中,有效率地轉譯成蛋白質之經最佳化的密碼子。例如,密碼子可為為了於人類、小鼠、大鼠、倉鼠、牛、豬、貓、犬、魚、兩棲類、植物、酵母、昆蟲等中之表現而被最佳化。密碼子之最佳化,可依照本技術領域具有通常知識者所周知之方法實施。
[gRNA模板核酸或gRNA]
gRNA能以RNA之形式(gRNA)、或gRNA模板核酸(例如,編碼gRNA之DNA)之形式導入至細胞。在本發明中,較佳為以gRNA模板核酸之形式導入,更佳為以將編碼gRNA之核酸序列組入至泛用之基因表現載體而成的gRNA模板核酸(gRNA載體)之形式導入。在使用gRNA載體之情況,編碼gRNA之核酸序列,可在泛用之啟動子的控制下被組入。
編碼RNA誘導型核酸酶之核酸序列及編碼gRNA之核酸序列,可於不同啟動子之控制下組入至相同的模板核酸;雖然可使核酸酶模板核酸與gRNA模板核酸形成1個模板核酸,然而從提高敲入及/或剔除效率之觀點而言,以個別之模板核酸為較佳。
[靶向模板核酸]
就靶向模板核酸而言,為寡DNA及泛用之載體等,可使用包含外來核酸序列者,以包含外來核酸序列之質體
載體為較佳。外來核酸序列,可為細胞中不是天然存在之序列或細胞基因體中存在於與天然位置相異的位置之序列。例如,藉由將外來核酸序列插入基因體中,細胞可成為藉由插入之外來核酸序列所含之序列而表現被編碼的蛋白質。又,插入之外來核酸序列所含之序列為編碼終止密碼子的情況,於天然之狀態,可成為抑制表現之蛋白質的生成。於外來啟動子之控制下,外來核酸序列可包含被組入的蛋白質編碼序列。或者,以內在性啟動子控制外來核酸序列表現的方式,外來核酸序列能被組入至染色體序列。
又,外來核酸序列雖可與標的部位或其附近位置之染色體的天然序列實質上相同,然而可為包含至少1個核苷酸變化之序列。核苷酸變化可為例如,1個或更多個核苷酸的插入、刪除、置換或附加、或彼等之組合。藉此,細胞可從標的部位之染色體序列,生成經改變之基因產物。
靶向載體具有:以用以引起HR之2個同源臂挾持靶向盒的構造,其中該靶向盒包含插入之外來核酸序列。同源臂分別具有與染色體之標的部位的上游或下游位置之序列實質上相同的序列。其中,「實質上相同之序列」意指具有至少約75%序列相似度(sequence identity)之序列。因此,同源臂可與標的部位之上游或下游的序列具有75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列
相似度。序列相似度,較佳為至少85%或90%,更佳為至少95%或97%,特佳為至少99%。
「序列相似度」之術語,意指將2個基因序列以使其鹼基對之一致成為最大的方式排列時,2個序列間一致之鹼基對的比率(%)。
序列相似度可依照所屬技術領域具有通常知識者所周知之任何方法決定。例如,可依照Higgins氏之多重序列比對程式,亦即Clustal(Gene 73,1,237-244,1988)來決定。Clustal程式可利用例如歐州生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute(EBI))之網路上的網站。
同源臂可具有20個核苷酸至5000個核苷酸長之範圍。同源臂可含有50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、或5000個核苷酸。同源臂,較佳可為50至1500個核苷酸長,更佳可為500至1500個核苷酸長,特佳可為700至1000個核苷酸長之範圍。
靶向盒可包含編碼選擇標記(例如,上述之抗藥性基因等)之核酸序列。
靶向載體可為質體載體。
[轉染步驟(1)]
在本說明書中,轉染意指以將導入核酸導入至細胞內
為目的,而使其與細胞接觸的操作。又,在本說明書中,導入核酸對細胞內之導入,意指藉由轉染而與細胞接觸的導入核酸被攝入細胞內。
核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸或gRNA、靶向模板核酸及選擇模板核酸等導入核酸,係同時或連續地被轉染。轉染可依照先前周知之手法進行,例如可適當使用顯微注射、電穿孔術、DEAE-葡萄聚糖處理、脂質體轉染、奈米粒子媒介性轉染等。藉由此等手法,可將導入核酸導入細胞內。例如,若使用電穿孔術,藉由在包含導入核酸所適用之細胞的緩衝液施加適當的電壓,使導入核酸通過細胞膜,導入細胞內。就其他例子而言,若使用脂質體轉染,藉由將脂質分子及導入核酸之複合體應用於細胞,使該複合體通過細胞膜,而將導入核酸導入細胞內。如前述,本發明中之轉染的手法無特別限定,可為與例如Nature Protocols(K.Yusa et al,vol.8,No.10,2013,2061-2078)、Nature Protocols(T.Sakuma et al,vol.11,No.1,2016,118-133)、Nature Protocols(B.Wefers et al,vol.8,No.12,2013,2355-2379)等所記載之手法相同的手法。
將導入有導入核酸之細胞培養適當期間。藉由經適當期間培養,可得到表現有例如核酸酶、gRNA、選擇標記等改變基因體標的部位所必要之因子的細胞。又,在敲入方法之情況,可得到插入有外來核酸序列之細胞。就培養期間而言,無特別限定,可為24至72小時左右,較佳為24至48小時左右。就培養條件而言,可設為約37℃、存在
5%CO2。培養基可依據細胞之種類而適當地選擇。
[選擇步驟(2)]
本步驟為選擇表現選擇標記之細胞。
細胞之選擇可藉由下述方式進行:例如在使用抗藥性因子作為選擇標記之情況,可進行將轉染步驟(1)後之細胞於藥劑存在下培養,而僅有獲得抗藥性之細胞可作為生存細胞被得到。又,細胞之選擇,例如,在使用螢光蛋白質作為選擇標記之情況,針對轉染步驟(1)後之細胞,可藉由使用螢光顯微鏡、螢光強度計或流式細胞儀等來識別顯示螢光之細胞,並分離取出而進行。
在藥劑存在下培養之情況,就培養基中之藥劑濃度而言,藥劑濃度依據藥劑之種類而適當地選擇,可調成能使獲得抗藥性之細胞生存,未獲得抗藥性之細胞死滅的濃度。更具體而言,例如,在導入嘌呤黴素抗性因子之情況,可將嘌呤黴素濃度調至0.02至4μg/mL,而以約1μg/mL為較佳。在導入有潮黴素抗性因子之情況,可將潮黴素(hygromycin)濃度調至50至1000μg/ml,而以400μg/mL左右為較佳。就培養條件而言,可調成約37℃、存在5%CO2。培養基可依據所使用之細胞而適當地選擇。
又,在靶向模板核酸之靶向盒包含編碼選擇標記(例如,上述抗藥性基因等)之核酸序列的情況,可合併進行選擇以該選擇標記之表現作為指標之細胞。此情況下,選擇模板核酸表現之選擇標記及靶向模板核酸表現
之選擇標記,可設為彼此不同者,例如就抗藥性因子而言,可利用嘌呤黴素抗性因子及新黴素抗性因子的組合。藉由將2種選擇標記組合使用,關於基因體之標的部位,與在異等位基因之敲入相比,可提高在同等位基因之敲入比率。
藉由於前述濃度之藥劑存在下,培養供給至轉染步驟(1)之細胞,可選擇獲得抗藥性之細胞。就藥劑存在下之培養期間而言,可依據藥劑之種類而適當地選擇。例如,在嘌呤黴素之情況,可為2日以上,較佳為3至14日左右。在潮黴素之情況,可為5日以上,較佳為7至14日左右。在為新黴素之情況,可為7日以上,較佳為10至20日左右。
就藉由選擇標記來選擇細胞的步驟而言,無特別限定,例如,可使用與在StemCells(C.Ren et al,vol.24,2006,1338-1347)、Biochem.Biophysic.Res.Com.(A.Kubosaki et al,vol.426,2012,141-147)、Cancer Res.(I.Yamato et al,vol.72,No.18,2012,4829-4839)等中記載之手法相同的手法。
2.於染色體上之預定座位,檢測對象核酸序列存或不存在的檢測方法
於本發明之染色體上之預定座位,檢測對象核酸序列存在或不存在的檢測方法(在本說明書中,稱為「本發明之檢測方法」),必須包含下述步驟(2)、(3),及可任意地包含步驟(1)。
(1)從受檢細胞調製基因體DNA斷片之步驟。
(2)藉由數位PCR法檢測可與前述檢測對象核酸序列之全部或一部分雜交的第一核酸探針、及可與前述預定座位內之前述檢測對象核酸序列以外之核酸序列雜交的第二核酸探針,有無對前述源自染色體之基因體DNA斷片雜交的步驟。
(3)在前述第一核酸探針及前述第二核酸探針對前述基因體DNA斷片雜交,而檢測出雙重陽性之情況,測知前述檢測對象核酸序列存在於前述預定座位;在未檢測出雙重陽性之情況,測知前述檢測對象核酸序列不存在於前述預定座位的步驟。
其中,稱為「座位」之術語,與「染色體上之位點(Locus)」同義。「座位」不僅為包含轉錄調節區域之基因區域,亦可為非基因區域。
「檢測對象核酸序列」可為天然或人工之任意核酸序列。天然之核酸序列為可包含全部轉錄區域/非轉錄區域之核酸序列、以及全部蛋白質之編碼區域/非編碼區域之核酸序列者。又,檢測對象核酸序列之鹼基長度亦可為任意。
若依照本發明之檢測方法,亦可知悉提供進行基因體標的部位改變之細胞樣本中有產生期望改變之細胞的比率。一般而言,為了從前述細胞樣本得到有產生期望改變的細胞,進行:(i)將前述細胞樣本提供於極限稀釋法等而單株化後,(ii)確認已單株化之細胞中之基因體序列。在前述細胞樣本中有產生期望改變之細胞的比率為
低之情況,在前述(ii)之確認中得到有產生期望改變(經單株化)之細胞的可能性變低。為了能有效率地得到(經單株化)期望之細胞,在進行需要長時間之前述(i)之前,較佳為知道細胞樣本內,在單株化後是否能以高比率得到有產生期望改變之細胞的程度,包含有產生期望改變的細胞。藉由將本發明之檢出方法適用於前述細胞樣本,可知道在前述細胞樣本中有產生期望改變之細胞的比率,故實施前述(i)及(ii)之各步驟後,所謂「結果無法得到期望細胞」的可能性減低。
此外,就前述細胞樣本而言,例如,可列舉經適用本發明方法的真核細胞。
又,前述(ii)所記載之確認,可藉由對上述細胞樣本適用本發明之檢測方法而進行。
[基因體DNA斷片調製步驟(1)]
在本步驟中,從受檢細胞調製基因體DNA斷片。源自受檢細胞之基因體DNA斷片的調製,可依照先前周知之手法(例如參照Methods Enzymol.,2013,529:161-169及Nucleic Acids Res.,1988,16(12):5698)進行,例如,可基於矽膠膜法,使用包含旋轉管柱(spin column)及緩衝液所構成的市售套組而進行。
藉由從細胞之萃取操作,將基因體DNA斷片化,形成通常1kbp至600kbp,典型為50至100kbp左右之基因體DNA斷片。
本步驟,在將經預先調製之基因體DNA斷片使用於下述步驟之情況,非為必要步驟。
[數位PCR步驟(2)]
在本步驟中,藉由數位PCR法檢測:可與檢測對象核酸序列之全部或一部分雜交的第一核酸探針、及可與預定座位內之檢測對象核酸序列以外之核酸序列雜交的第二核酸探針,有無對基因體DNA斷片雜交。
數位PCR法為用於核酸之檢測及定量的手法,在本技術領域中,為周知且泛用之手法。數位PCR法中,首先,使用奈米流體晶片,將樣本(包含標靶核酸之核酸的極限稀釋溶液)分割導入至複數個微小反應區域內。在微小反應區域之一部分導入標靶核酸,在其他之微小反應區域可包含標靶核酸以外之核酸或完全不含核酸。繼而,於各微小反應區域內同時並行地進行PCR反應,其中該PCR反應使用可增幅標靶核酸的引子對。增幅中,使用與標靶核酸特異性地雜交之色素標識探針,來檢測出信號(陽性)。若標靶核酸不存在於微小反應區域內,則該微小反應區域中不會被檢測出信號(陰性)。反應後,基於微小反應區域之信號陽性/陰性比,亦可計算樣本中之標靶核酸的絕對分子數。在可能包含二個以上之標靶核酸之微小反應區域中,可適用由卜瓦松模型(Poisson model)所得到之校正係數。
參照第1圖,針對供給至數位PCR法之第
一核酸探針及第二核酸探針進行說明。
第1圖(A)顯示存在於基因體DNA斷片上之座位L1的檢測對象核酸序列T1。
第一核酸探針P1(以下,簡稱為「探針P1」)具有與檢測對象核酸序列T1之全部或一部分互補的鹼基序列,與檢測對象核酸序列T1特異性地雜交。
第二核酸探針P2(以下,簡稱為「探針P2」)具有與座位L1內之檢測對象核酸序列T1以外之核酸序列互補的鹼基序列,與該核酸序列特異性地雜交。
由於探針P1為與檢測對象核酸序列T1內之鹼基序列雜交者,另一方面,探針P2為與檢測對象核酸序列T1外之鹼基序列雜交者,故在座位L1中,探針P1可雜交之第一區域及探針P2所雜交之第二區域以預定鹼基長度(距離d)隔開。
距離d,於此處並未被特別限定,一般為0.1kb至100kb左右,較佳為0.1至10kb左右,更佳為0.1kb至5kb左右,又更佳為0.1kb至2kb左右。
探針P1、P2方面,可使用經化學修飾及色素標識而成之市售探針(例如TaqMan(註冊商標)探針),其中該化學修飾及色素標識係用以使此等探針對互補鏈(數位PCR法中之標靶核酸)所進行之雜交可光學性地檢測出。為了進行PCR反應,設計可分別增幅探針P1、P2之標靶核酸的引子對。
[檢測步驟(3)]
在本步驟中,在探針P1及探針P2皆對基因體DNA斷片雜交,而檢測出雙重陽性之情況,測知檢測對象核酸序列T1存在於座位L1;在未檢測出雙重陽性之情況,測知檢測對象核酸序列T1不存在於座位L1。
參照第1圖加以說明。
首先,如第1圖(A)所示,在基因體DNA斷片上之座位L1存在檢測對象核酸序列T1之情況,於數位PCR法中,檢測出探針P1及探針P2之信號均為陽性的「雙重陽性」。
另一方面,在數位PCR法中,雖然有探針P1之信號成為陽性的微小反應區域,探針P2之信號成為陽性的微小反應區域,但不是成為雙重陽性之微小反應區域的情況,如第1圖(B)所示,可知檢測對象核酸序列T1存在於座位L2,該座位L2為任一基因體DNA斷片上之座位且不具有探針P2所雜交之第二區域。在野生型染色體中檢測對象核酸序列T1為存在於座位L1之內在核酸序列的情況,但沒有探針P1及探針P2成為雙重陽性之微小反應區域,可知在受檢細胞中,該內在核酸序列從原本之座位L1轉移至座位L2、或者從染色體上刪除。
又,在數位PCR法中,在只有探針P2之信號成為陽性,而探針P1之信號成為陰性的情況,如第1圖(C)所示,可知檢測對象核酸序列T1不存在於具有探針P2所雜交之第二區域的座位L1,且亦不存在於任何基因體DNA斷片上。在野生型染色體中檢測對象核酸序列T1為存在於座位
L1之內在核酸序列的情況,從上述可知在受檢細胞中,該內在核酸序列從染色體上刪除。
其中,基因體DNA斷片調製步驟(1)時,若在座位L1中探針P1可雜交之第一區域及探針P2可雜交之第二區域之間有發生染色體之未預期斷裂(以下,亦簡稱為「斷裂」),則成為「單一陽性1」及「單一陽性2」的偽陰性。針對排除如此斷裂之影響的方法,於後段詳細地說明。
3.敲入效率之評估方法
本發明之檢測染色體上之預定座位中檢測對象核酸序列存在或不存在之方法,可應用於敲入效率之評估方法。
本發明之敲入效率的評估方法包含下述步驟。
(1)從受檢細胞或其集團調製基因體DNA斷片之步驟。
(2)藉由數位PCR法檢測第一核酸探針及第二核酸探針有無對源自前述染色體之基因體DNA斷片雜交的步驟,其中
第一核酸探針可與企圖經由基因重組介導而插入至前述受檢細胞之染色體上之目標座位的外來核酸序列之全部或一部分雜交,
第二核酸探針可與前述目標座位內之前述外來核酸序列以外的核酸序列且不是位於供基因重組之2個同源臂之間的核酸序列雜交。
(3)在檢測出前述第一核酸探針及前述第二核酸探針對前
述基因體DNA斷片雜交而為雙重陽性之情況,測知前述外來核酸序列存在於前述目標座位,
在未檢測出雙重陽性之情況,測知前述外來核酸序列不存在於前述目標座位的步驟。
此處,「外來核酸序列」,可為任意核酸序列,其鹼基長度亦為任意者。
又,在此處雖說明檢測企圖經由使用同源臂之同源重組介導而被插入至染色體上的目標座位之外來核酸序列的實施態樣,然而外來核酸序列亦可為不依賴同源重組而被插入至染色體上之目標座位者。不依賴同源重組而將外來核酸序列插入至染色體上之目標座位的手法,周知有例如稱為HITI(homology-independent targeted integration)之方法(Nature,2016,540(7631):144-149)及稱為ObLiGaRe(Obligate Ligation-Gated Recombination)之方法(Genome Res.2013,23(3):539-46)等。在此等情況,前述第二探針係被設計成與前述目標座位內之核酸序列,並且為前述外來核酸序列以外之核酸序列雜交。
[基因體DNA斷片調製步驟(1)]
在本步驟中,從受檢細胞調製基因體DNA斷片,其中該受檢細胞係被供給至經由同源重組介導而將外來核酸序列插入至染色體上之目標座位之操作的細胞。步驟之詳情如上述說明。
針對受檢細胞評估外來核酸序列對目標座
位之插入率(敲入效率)的情況,從該受檢細胞之細胞集團調製基因體DNA斷片。
[數位PCR步驟(2)]
本步驟為藉由數位PCR法檢測第一核酸探針及第二核酸探針有無對基因體DNA斷片雜交,其中該第一核酸探針雜交於外來核酸序列之全部或一部分,該第二核酸探針雜交於目標座位內之外來核酸序列以外的核酸序列,並且不是位於供同源重組之2個同源臂間的核酸序列。
其中,「2個同源臂之間」,亦包含2個同源臂本身。亦即,第二探針為不與2個同源臂本身進行任何雜交者。
參照第2圖,針對被供給至數位PCR法之第一核酸探針及第二核酸探針加以說明。
第2圖(A)顯示存在於基因體DNA斷片上之座位L1的外來核酸序列T2。
第一核酸探針P1(以下,簡稱為「探針P1」),具有與外來核酸序列T2之全部或一部分互補的鹼基序列,並且與外來核酸序列T2特異性地雜交。
第二核酸探針P2(以下,簡稱為「探針P2」),具有與座位L1內之外來核酸序列T2以外的核酸序列,並且不是位於供同源重組之2個同源臂HA1、HA2間之核酸序列互補的鹼基序列,並且可與該核酸序列特異性地雜交。
其中,「同源臂HA1與同源臂HA2之間」,亦包含同源臂HA1、HA2本身。亦即,探針P2為不與同源臂HA1、HA2
本身雜交者。
由於探針P1與外來核酸序列T2內之鹼基序列雜交,另一方面,探針P2與外來核酸序列T2外之鹼基序列雜交,所以在座位L1中探針P1可雜交之第一區域及探針P2可雜交之第二區域成為以預定的鹼基長度(距離d)隔開。
距離d為0.1kb至100kb左右,較佳為0.5至10kb左右,更佳為1kb至5kb左右,又更佳為1kb至2kb左右。再者,同源臂之長度,可依據外來核酸序列T2之長度而適當地調節,一般而言,為0.02kb至8kb左右,較佳為0.04kb至3kb左右,更佳為0.5kb至1.5kb左右。
此外,在圖中雖然將探針P2雜交之第二區域示於同源臂HA1之上游,但該區域也可位於同源臂HA2之下游。
針對受檢細胞集團評估外來核酸序列T2對座位L1之插入率(%)的情況,於本步驟中,將探針P1及探針P2與基因體DNA斷片之雜交進行定量化。定量化係在數位PCR法中,可藉由計算出反應後之微小反應區域的信號陽性/陰性而進行。
[檢測步驟(3)]
在本步驟中,在探針P1及探針P2對基因體DNA斷片雜交,而成為雙重陽性之情況,測知外來核酸序列T2存在於座位L1,根據只檢測出探針P1及探針P2之任一者與基因體DNA斷片雜交,測知外來核酸序列T2不存在於座位
L1。
參照第2圖加以說明。
首先,如第2圖(A)所示,在基因體DNA斷片上之座位L1存在外來核酸序列T2的情況,於數位PCR法中,檢測出探針P1及探針P2之信號皆成為陽性的「雙重陽性」。此係表示外來核酸序列T2經由同源重組介導正確地被插入至作為目標之座位L1。
另一方面,於數位PCR法中,在雖有探針P1之信號成為陽性之微小反應區域、探針P2之信號成為陽性之微小反應區域,但不是成為雙重陽性之微小反應區域的情況,如第2圖(B)所示,可知外來核酸序列T2存在於座位L2,該座位L2為任一個基因體DNA斷片上之座位,且不具有探針P2所雜交之第二區域。由此,顯示外來核酸序列T2藉由隨機整合被插入至不是目標之座位L2。
又,在數位PCR法中,只有探針P2之信號成為陽性,探針P1之信號成為陰性之情況,如第2圖(C)所示,可知外來核酸序列T2不存在於具有探針P2所雜交之第二區域的座位L1,而且不存在於任一個基因體DNA斷片上。由此,顯示外來核酸序列T2並未被至插入染色體上。
針對受檢細胞集團評估外來核酸序列T2對座位L1之插入率(%)的情況,基於數位PCR步驟(2)中之探針P1及探針P2對基因體DNA斷片雜交的定量結果,計算出插入率(%)。
具體而言,從探針P1及探針P2之雜交量(雙重陽性:
DP)及只有探針P2之雜交量(單一陽性2:SP2),藉由下述式算出插入率(%)。
外來核酸序列對目標座位之插入率(%)=DP×100/(DP+SP2)
又,若藉由下述式,亦可計算出外來核酸序列T2對染色體之隨機整合率(%)。
外來核酸序列對染色體之隨機整合率(%)=SP1×100/(DP+SP2)
此處,於基因體DNA斷片調製步驟(1)時,若在座位L1內探針P1可雜交之第一區域及探針P2雜交之第二區域之間有產生染色體之斷裂時,則成為「單一陽性1」及「單一陽性2」之偽陰性。若斷裂產生,則有影響插入率(%)之計算值之情形。
為了排除斷裂之影響,本發明之敲入效率的評估方法,可進一步包含下述步驟。
(4)使用所隔開之鹼基長度為相當於前述染色體上前述第一區域與前述第二區域之間的鹼基長度之探針對(例如,探針P3及P4),藉由數位PCR法定量前述基因組DNA斷片與該探針對的雜交,
從前述探針對(探針P3及P4)之兩條探針的雜交量(dp)、及前述探針只對其中一者的雜交量(sp),計算出前述基因體DNA斷片中之下述比率的步驟。
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(式中,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值)
(5)將前述插入率(%)以前述斷裂率(%)校正之步驟。
[斷裂率算出步驟(4)]
以下記載斷裂率之算出方法之例。在本步驟中,提供用以估計座位L1中探針P1可雜交之第一區域與探針P2可雜交之第二區域之間之斷裂發生率(%)的探針對。探針對(例如,探針P3及探針P4)係所隔開之鹼基長度(亦即距離d),相當於座位L1中之探針P1可雜交之第一區域與探針P2可雜交之第二區域之間的鹼基長度,該探針對雜交於染色體之任一區域。檢測出不是探針對之兩條探針皆雜交,而只有任一條探針雜交的基因體DNA斷片,顯示各探針的雜交區域之間(距離d)發生染色體之斷裂,其檢出頻率(%)可視為座位L1中之探針P1可雜交之第一區域與探針P2可雜交之第二區域之間(距離d)的斷裂發生率(%)。
因此,基因體DNA斷片調製步驟(1)所調製之基因體DNA斷片與探針對之雜交藉由數位PCR法進行定量,藉此可從下述式計算出座位L1中之斷裂的發生率(%)。
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(其中,「dp」表示探針對之兩條探針的雜交量,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值;再者,由於理論上兩探針之雜交量一致,可於計算中使用任一條探針之雜交量,代替平均值)
本步驟可依照基因體DNA斷片調製步驟(1)之準則進行。或者,在藉由相同之萃取條件進行基因體DNA斷片調製步驟(1)之情況,由於斷裂率(%)可視為相同
程度,以某萃取條件進行斷裂率(%)之計算後,以相同條件進行基因體DNA斷片調製步驟(1)時,本步驟可省略。又,斷裂未發生、或斷裂發生率為不會對插入率(%)等算出值造成影響程度的非常低情況,本步驟可省略。
[校正步驟(5)]
在本步驟中,將插入率(%)以斷裂率(%)校正。
具體而言,為了補償由於斷裂所造成之表面上數值的降低,於插入率(%)之值加上斷裂率(%),求取實際之插入率(%)。
4.剔除效率之評估方法
本發明之檢測染色體上之預定座位中檢測對象核酸序列之存在或不存在的方法,亦可應用於剔除效率之評估方法。
本發明之剔除效率的評估方法包含下述步驟。
(1)從受檢細胞或其集團調製基因體DNA斷片之步驟。
(2)藉由數位PCR法檢測第一核酸探針及第二核酸探針有無對源自前述染色體之基因體DNA斷片雜交的步驟,其中
第一探針係雜交於企圖經由基因重組介導而刪除前述受檢細胞之染色體上之目標座位的內在核酸序列之全部或一部分,
第二探針係雜交於為前述目標座位內之前述內在核
酸序列以外的核酸序列,並且不是位於供基因重組之2個同源臂之間的核酸序列。
(3)在沒有得到前述雙重陽性,且檢測出前述第二核酸探針對前述基因體DNA斷片之雜交的情況,測知前述內在核酸序列不存在於前述目標座位,
在檢測出前述第一核酸探針及前述第二核酸探針對前述基因體DNA斷片雜交而為雙重陽性的情況,測知前述內在核酸序列存在於前述目標座位的步驟。
其中,「內在核酸序列」可為任意核酸序列,可包含全部轉錄區域/非轉錄區域之核酸序列、及全部編碼蛋白質之區域/非編碼區域的核酸序列者。又,內在核酸序列之鹼基長度亦為任意者。
[基因體DNA斷片調製步驟(1)]
在本步驟中,企圖經由基因重組介導而從染色體上之目標座位刪除內在核酸序列,從受檢細胞調製基因體DNA斷片。步驟之詳情如上述說明者。
針對受檢細胞評估內在核酸序列之刪除率(剔除效率)的情況,從該受檢細胞之細胞集團調製基因體DNA斷片。
[數位PCR步驟(2)]
本步驟為藉由數位PCR法,檢測第一核酸探針及第二核酸探針有無對基因體DNA斷片之雜交,其中該第一核
酸探針係雜交於內在核酸序列之全部或一部分,該第二核酸探針係雜交於目標座位內之內在核酸序列以外的核酸序列,且不是位於供基因重組之2個同源臂之間的核酸序列雜交。
其中,「2個同源臂之間」亦包含2個同源臂本身。亦即,第二探針為不與2個同源臂本身進行雜交者。
參照第3圖,針對被供給至數位PCR法的第一核酸探針及第二核酸探針加以說明。
第3圖(A)顯示存在於基因體DNA斷片上之座位L1的內在核酸序列T3。
第一核酸探針P1(以下,簡稱為「探針P1」),具有與內在核酸序列T3之全部或一部分互補的鹼基序列,其可與內在核酸序列T3特異性地雜交。
第二核酸探針P2(以下,簡稱為「探針P2」),具有與座位L1內之內在核酸序列T3以外的核酸序列,且不是位於供同源重組之2個同源臂HA1、HA2之間的核酸序列互補的鹼基序列,其可與該核酸序列特異性地雜交。
此處,「同源臂HA1與同源臂HA2之間」,亦包含同源臂HA1、HA2本身。亦即,探針P2亦為不與同源臂HA1、HA2本身雜交者。
由於探針P1雜交於內在核酸序列T3內之鹼基序列,另一方面,探針P2雜交於內在核酸序列T3以外之鹼基序列雜交,在座位L1中,探針P1可雜交之第一區域及探針P2可雜交之第二區域以預定的鹼基長度(距離d)
隔開。
距離d為0.1kb至100kb左右,較佳為0.5至10kb左右,更佳為1kb至5kb左右,又更佳為約1kb至2kb左右。再者,同源臂之長度可依據內在核酸序列T3之長度而適當地調節,一般而言為0.02kb至8kb左右,較佳為0.04kb至3kb左右,更佳為0.5kb至1.5kb左右。
此外,圖中,雖將探針P2所雜交之第二區域示於同源臂HA1之上游,然而該區域亦可位於同源臂HA2之下游。
針對受檢細胞集團評估從內在核酸序列T3之染色體之刪除率(%)的情況,於本步驟中,將探針P1及探針P2與基因體DNA斷片之雜交定量化。定量化可在數位PCR法中,藉由算出反應後之微小反應區域的信號陽性/陰性而進行。
[檢測步驟(3)]
在本步驟中,基於檢測出探針P2只對基因體DNA斷片之雜交,測知內在核酸序列T3不存在於座位L1中,在探針P1及探針P2皆對基因體DNA斷片雜交而成為雙重陽性之情況,測知內在核酸序列T3存在於座位L1中。
參照第3圖加以說明。
首先,如第3圖(A)所示,在內在核酸序列T3存在於基因體DNA斷片上之座位L1的情況,於數位PCR法中,檢測出探針P1及探針P2之信號皆為陽性的「雙重陽性」。由此,顯示內在核酸序列T3未從染色體刪除,殘存於作為
目標之座位L1上。
另一方面,在數位PCR法中,只有探針P2之信號成為陽性,而探針P1之信號成為陰性的情況,如第3圖(B)所示,可知內在核酸序列T3從具有探針P2雜交之第二區域的座位L1刪除,且不存在於任何基因體DNA斷片上。由此,表示內在核酸序列T3從染色體完全被刪除。
針對受檢細胞集團評估內在核酸序列T3從座位L1之刪除率(%)的情況,基於數位PCR步驟(2)中之探針P1及探針P2對基因體DNA斷片之雜交的定量結果,算出刪除率(%)。
具體而言,從探針P1及探針P2之雜交量(雙重陽性:DP)、及只有探針P2之雜交量(單一陽性2:SP2),藉由下述式算出刪除率(%)。
內在核酸序列之刪除率(%)=100-DP×100/(DP+SP2)
此處,基因體DNA斷片調製步驟(1)時,若在座位L1內,探針P1可雜交之第一區域及探針P2雜交的第二區域之間發生染色體之斷裂時,則成為「單一陽性1」及「單一陽性2」的偽陽性。若此種斷裂發生,則有影響刪除率(%)之算出值之情形。
為了排除斷裂之影響,本發明之剔除效率的評估方法可進一步包含下述步驟。
(4)使用所隔開之鹼基長度相當於前述染色體上,前述第一區域與前述第二區域之間的鹼基長度之探針對(例如,探針P3及探針P4),並藉由數位PCR法定量該探針對
與前述基因體DNA斷片的雜交,
從前述探針對(探針P3及探針P4)之兩條探針的雜交量(dp)、及前述探針對中只有任一條之雜交量(sp),算出前述基因體DNA斷片中之下述比率的步驟:
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(式中,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值)。
又,用以校正剔除效率之斷裂率,亦可使用探針對(探針P1及探針P2)之雜交量,如下述式算出。
斷裂率(%)=100×SP1/(DP+SP2)
(5)將前述刪除率(%)以前述斷裂率(%)校正之步驟。
[斷裂率算出步驟(4)]
以下記載斷裂率之算出方法之例子。在本步驟中,提供用以估計座位L1中之探針P1可雜交之第一區域及探針P2可雜交之第二區域之間之斷裂發生率(%)的探針對(例如,探針P3及探針P4)。探針對係所隔開之鹼基長度(亦即距離d)相當於座位L1中之探針P1可雜交之第一區域與探針P2可雜交之第二區域之間的鹼基長度,該探針對可與染色體之任一區域雜交。檢測出不是探針對之兩條探針皆雜交而只有任一條探針雜交的基因體DNA斷片,表示在各探針的雜交區域之間(距離d)發生染色體之斷裂,該檢出頻率(%)可視為座位L1中之探針P1可雜交之第一區域及探針P2雜交之第二區域之間(距離d)的斷裂發生率(%)。
因此,將探針對與以基因體DNA斷片調製步驟(1)所調製之基因體DNA斷片的雜交,藉由數位PCR法定量,可從下述式計算出座位L1中之斷裂的發生率(%)。
斷裂率(%)=<sp>×100/(dp+<sp>)
(其中,「dp」表示探針對之兩條探針的雜交量,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值;再者,由於兩探針之雜交量理論上一致,可於計算中使用任一條探針之雜交量,代替平均值)
本步驟可依照基因體DNA斷片調製步驟(1)之準則進行。或者,在藉由相同之萃取條件進行基因體DNA斷片調製步驟(1)之情況,由於斷裂率(%)可視為相同程度,以某萃取條件進行斷裂率(%)之計算後,以相同條件進行基因體DNA斷片調製步驟(1)時,本步驟可省略。又,在未發生斷裂,或斷裂發生率為不會對插入率(%)等算出值造成影響之非常低程度的情況,本步驟可省略。
[校正步驟(5)]
本步驟中,將刪除率(%)以斷裂率(%)校正。
具體而言,為了補償藉經由斷裂所造成之表面數值的上升,從刪除率(%)之值減去斷裂率(%),求取實際之刪除率(%)。
A.剔除效率之評估方法
將供應於基因體之標的部位改變的細胞之基因體作
為模板,藉由定量性PCR、或數位PCR,可測定依存DSB而發生之序列變異的比率。此時,以發生DSB之基因體上之序列所設計出的探針,雖可檢測出野生型之序列,然而藉由DSB後所引起之NHEJ所致之修復而伴隨發生之鹼基插入或刪除的變異序列則無法被檢測出。因此,可將相較於野生型細胞之基因體所減少之信號量定量為變異之比率,並可將此變異之比率作為剔除效率。簡言之,亦可根據使用T7核酸內切酶I或Cel-I酶之切斷比率來確認。就更具體之步驟而言,以供應於基因體之標的部位改變的細胞之基因體為基礎,將發生DSB之區域以成為全長100至700bp左右之方式進行PCR增幅,並且與以野生型基因體為基礎並以相同之方式增幅之斷片混合後,於約95℃加熱約1分鐘,然後,進行自然冷卻而調製變異型及野生型之增幅產物的雜雙股。以可切斷雜雙股之T7核酸內切酶I或Cel-I酶處理後,藉由電泳評估受到切斷之比率,而可設為KO效率。變異導入效率之計算方法係以下述計算式進行。若將源自未切斷之區帶之峰的面積設為a,源自切斷之區帶之峰設為b及c,藉由下述式:
Fcut=(b+c)/(a+b+c)indel(%)=100x(1-sqrt((1-Fcut))),求取變異導入效率。可用其作為KO效率。
B.經由HR所介導之敲入效率的評估方法
本發明之經由HR所介導之敲入效率的評估方法,其特徵為包含下述步驟。
(A)以供應於HR之細胞的基因體作為模板,使用在與染色體之同源臂實質上相同之序列之外側所設計出的探針、及在靶向盒內所設計出的探針,進行數位PCR的步驟。
數位PCR為在多個微小反應區域內導入包含核酸之樣本,進行PCR,藉由檢測各反應區域內中有無增幅產物之生成,將樣本中所含之核酸進行定量性測定之手法。在數位PCR中,以使各反應區域內成為只導入一分子核酸、或完全未導入的狀態為目的,將樣本稀釋。因此,只要檢測PCR反應後各反應區域內有無增幅產物生成,即可決定在最初樣本導入時在各反應區域內是否存在核酸。將最初樣本導入之各反應區域內是否存在核酸,以1(有核酸)或0(無核酸)之數值進行數位化,藉由解析於多個反應區域所取得之數值,可決定樣本中之核酸的絕對量。數位PCR之基本方法論,記載於例如Sykes et al.,Biotechniques 13(3):444-449,1992中。
本發明之方法為可評估經由HR所介導之敲入效率者,其特徵為包含前述步驟(A)。以下,參照第4圖具體地說明。
經由HR所介導之敲入,典型而言,係使用包含靶向盒(TC)之靶向載體來進行,該靶向盒(TC)包含2個同源臂(HA1及HA2)及外來核酸序列。在此情況,對於藉由HR而插入有靶向盒之等位基因(參照圖中「HR等位基因」),可設計雜交於HA1之外側(圖中為上游)的探針2、及雜交於TC內之探針1。此外,探針2只要被設計在同源
臂之外側即可,亦可被設計在HA2之下游。
藉由HR而未插入有靶向盒之等位基因(圖中「未整合的等位基因」),只有被設計於HA1之外側(圖中為上游)的探針2可進行雜交。又,藉由隨機整合而發生不是預期之靶向盒的插入之等位基因(圖中「隨機整合的等位基因」),只有被設計於TC內之探針1可進行雜交。
因此,在數位PCR中,只要檢測各檢測區域中之探針1及探針2有無雜交,則可測定「HR等位基因」、「未整合的等位基因」及「隨機整合的等位基因」之各等位基因的存在量。具體而言,在探針1及探針2為雙重陽性之檢測情況,表示「HR基因」之存在,在只有探針2為單一陽性之檢測情況,表示「未整合的等位基因」之存在,在只有探針1為單一陽性之檢測情況,表示「隨機整的等位基因」之存在。
於是,依照「HR等位基因」之存在量與「未整合的等位基因」之存在量的比,可評估標的部位中之「外來核酸序列之插入率」。又,依照「HR等位基因」之存在量與「隨機整合的等位基因」之存在量的比,可評估外來核酸序列之「對標的部位之插入率」。
探針1及探針2對基因體之雜交的定量性檢測,可基於先前周知之數位PCR來進行。例如作為探針1及探針2者,經螢光標識之TaqMan探針與TaqMan引子之組合,可從市場之受託服務(Thermo Fisher Scientific)取得。又,作為即時PCR用之套組者,可取得QuantStudio
3D Degital PCT Master Mix;作為解析裝置者,可分別取得液滴型數位PCR裝置、QuantStudio 3D及QuantStudio 3D AnalysisSuite software(均為Thermo Fisher Scientific製)。
若依照本發明之基因體標的部位的改變方法,可提供使用RNA誘導型核酸酶之模板核酸、gRNA之模板核酸或gRNA,以高特異性及高效率地改變細胞之基因體的標的部位用之技術。在其他觀點方面,本發明之課題,為可有效率地選擇在基因體之標的部位有發生期望改變的細胞。若能以高效率地得到作為目的之基因體經改變的細胞,且可提高例如使用該目標細胞篩選藥物、衍生出源自該目標細胞之分化細胞等的時間及經濟效率。更具體而言,例如可舉出,在以供藥物篩選為目的而進行細胞的基因體標的部位之改變的情況,在先前之方法中,藉由隨機整合之細胞的存在比率變高,無法以適當之細胞實施藥物篩選,有無法取得可信頼之篩選結果的問題。因此,以其他途徑來改變基因體之標的部位的操作成為必要,而使得時間及經濟效率降低。若依照本發明之基因體標的部位之改變方法,由於能以高效率地得到作為目的之細胞,故可避免如前述之問題,可助於取得可信頼之數據、及提高時間及經濟效率。
[實施例]
[實施例1:藉由選擇質體之共轉染之敲入效率的提高]
以細胞之基因體的腺瘤性息肉病
(Adenomatous polyposis coli,APC)基因作為標的部位,進行人工核酸序列(外來核酸序列)之插入。作為核酸酶模板核酸、gRNA模板核酸、靶向模板核酸及選擇模板核酸者,分別使用表現化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)之Cas9的質體載體(核酸酶載體,Cas9)、表現gRNA之質體載體(gRNA載體,APCAS56)、包含人工核酸序列之質體載體(靶向載體,APCshort#2)、及表現嘌呤黴素抗性基因之質體載體(選擇載體,pEBmultipuro)。將此等質體載體之混合物,以500,000cells/10μl之條件,藉由電穿孔法轉染至大腸癌細胞株HCT-116。在轉染中,使用Neon(Invitrogen公司)之HCT-116用試藥及電穿孔術參數。APCshort#2具有使APC基因之外顯子3(序列編號1)一部分刪除的核酸序列。將APC基因之外顯子3的鹼基序列、及gRNA之識別序列(序列編號2)示於第5圖。
轉染係以使嘌呤黴素抗性基因之質體對全質體之合計量的比率(莫耳比),如「表1」所示地進行變化。
轉染24小時後,於1μg/ml之嘌呤黴素存在下進行10日之細胞培養,選擇嘌呤黴素抗性基因表現細胞。從選擇之細胞萃取基因體DNA,實施以下之PCR解析。
為了避開殘存之靶向模板核酸的影響來得到基因體之資料,在較靶向模板核酸之同源序列更上游處設計正向引子(序列編號3:CTTGCACAGAGACTCCCCATAATCACC)、及在較模板質體之缺損區域之更下游處設計反向引子(序列編號4:ACTTTCTCTGCTTCCATTTACAAACCCTCTTC)。使用此引子對,將從樣本1至5之轉染群回收的基因體DNA作為
模板進行PCR。野生型APC基因之增幅產物為1256bp(序列編號5),接受人工核酸序列插入之APC基因的增幅產物為1191bp(序列編號6)。將各增幅產物之鹼基序列示於第6圖。
為了更明確地檢測因人工核酸序列之插入所致之增幅產物長度的減少,經由限制酵素(MfeI)進行消化後,進行微晶片電泳。從野生型APC基因之增幅產物檢測出206bp之消化斷片,從接受人工核酸序列插入的APC基因之增幅產物檢測出147bp之消化斷片。
將電泳結果示於第7圖。可觀察到:伴隨著選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋度增加,野生型APC基因之增幅產物減少,而接受人工核酸序列插入之APC基因的增幅產物增加。亦即,顯而易見伴隨選擇載體之稀釋度的增加,人工核酸序列之插入效率增加。
藉由帶(band)濃度之定量,將野生型APC基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸序列插入的APC基因之增幅產物的量(Y)定量化,將計算出之敲入效率(=100×Y/(X+Y))的結果示於第8圖。圖中橫軸表示樣本1至5之轉染群中之選擇載體(pEBmultipuro)的稀釋率,縱軸表示基因插入效率(%)。又,將此時回收之總基因體DNA量示於第9圖。圖中橫軸表示樣本1至5之轉染群中之選擇載體(pEBmultipuro)的稀釋率,縱軸表示可回收的基因體DNA量。在樣本1至4中,尤其是樣本1至2中,從敲入效率及基因體DNA量而言,可謂施行更有效率之基
因體標的部位的改變。
[實施例2:經由選擇質體之共轉染所致之敲入效率的提高(人工核酸序列之變更)]
除了將細胞之基因體的TNNI1基因作為標的部位以外,以與實施例1相同地施作,進行人工核酸序列(外來核酸序列)之插入。
在包含人工核酸序列之靶向模板核酸(靶向寡核酸(targeting oligo)),使用具有於TNNI1基因之外顯子7插入20bp核酸序列之核酸序列的TNNIOligo,在表現gRNA之質體載體(gRNA載體)使用TNNI207。將TNNI1基因之外顯子7之鹼基序列中gRNA的識別序列標示為序列編號7。
改變嘌呤黴素抗性基因表現質體對全導入核酸之合計量的比率(莫耳比)並進行轉染,並且於嘌呤黴素存在下進行細胞培養,選擇表現嘌呤黴素抗性基因之細胞。從經選擇之細胞萃取基因體DNA,並且實施下述PCR解析。
在較靶向模板核酸之同源序列之更上游處設計正向引子(序列編號8:GAACGTGGAGGCCATGTCT),以及在較模板質體之缺損區域之更下游處設計反向引子(序列編號9:TAAGTACAACCCGCCTGCC)。使用此引子對,以回收之基因體DNA作為模板進行PCR。野生型TNNI1基因之增幅產物為166bp,接受人工核酸序列之插
入的TNNI1基因之增幅產物為186bp。
藉由帶濃度之定量,將野生型TNNI1基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸序列插入的TNNI1基因之增幅產物的量(Y)定量化,將計算出之敲入效率(=100×Y/(X+Y))的結果示於第10圖。圖中橫軸表示選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示敲入效率(%)。又,將此時回收之總基因體DNA量示於第11圖。圖中橫軸表示選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示可回收之基因體DNA量。Factor值越低,可得到越高之敲入效率。Factor值為0.056至0.21之範圍,從敲入效率及基因體DNA量之觀點而言,達成更有效率的基因體標的部位之改變。
[實施例3:經由選擇質體之共轉染所致之敲入效率之提高(細胞、人工核酸序列之變更)]
除了將細胞變更為子宮頸癌細胞株HeLa以外,以與實施例2相同地施作,進行人工核酸序列(外來核酸序列)之插入。亦即,從實施例1,將細胞變更為子宮頸癌細胞株HeLa,將基因體之標的部位變更為TNNI1基因。
改變嘌呤黴素抗性基因表現質體對全導入核酸之合計量的比率(莫耳比)並進行轉染,並且於嘌呤黴素存在下進行細胞培養,然後選擇表現嘌呤黴素抗性基因之細胞。從經選擇之細胞萃取基因體DNA,並實施下述PCR解析。
藉由帶濃度之定量,將野生型TNNI1基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸序列之插入的TNNI1基因之增幅產物的量(Y)定量化,將計算出之敲入效率(=100×Y/(X+Y))的結果示於第12圖。圖中橫軸表示選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示敲入效率(%)。又,將此時回收之總基因體DNA量示於第13圖。圖中橫軸表示選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示可回收之基因體DNA量。Factor值越低,可得到越高敲入效率。Factor值為0.074至0.28之範圍,從敲入效率及基因體DNA量的觀點而言,達成更有效率的基因體標的部位之改變。
關於HeLa及HCT-116以外之各種細胞,亦以相同地施作進行人工核酸序列(外來核酸序列)之插入實驗,驗證選擇載體對全部導入核酸之合計量的比率(莫耳比)對於敲入效率所造成之效果。其結果,可認為例如在iPS細胞(201B7株)中,Factor值為0.1748時,敲入效率為100%。
[實施例4:藉由選擇質體之共轉染所致之敲入效率之提高(RNA誘導型核酸酶、細胞、人工核酸序列之變更))]
除了使用表現胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)之Cpf1的質體載體作為核酸酶載體,將細胞變更為子宮頸癌細胞株HeLa,將基因體之標的部位變更為IPTKB基因以外,以與實施例1相同地施作,進行人工核酸序列(外來核
酸序列)之插入。
在包含人工核酸序列之靶向模板核酸(靶向寡核酸),使用具有IPTKB基因之外顯子8經刪除12bp之核酸序列的IPTKB12delID140;在表現gRNA之質體載體(gRNA載體)使用pENTER_SSA_Cpf1。將IPTKB基因之外顯子8的鹼基序列,及gRNA之識別序列(序列編號10)示於第14圖。
改變嘌呤黴素抗性基因表現質體對全部導入核酸之合計量的比率(莫耳比)並進行轉染,並於嘌呤黴素存在下進行細胞培養,選擇表現嘌呤黴素抗性基因之細胞。從經選擇之細胞萃取基因體DNA,實施下述PCR解析。
在較靶向模板核酸之同源序列更上游處設計正向引子(序列編號11:ATTGAGCCCCGAGAGGTAGCCATCCT),以及在較模板質體之缺損區域更下游處設計反向引子(序列編號12:GGGCTTCAGCTCACCCTTCAC)。使用該引子對,以回收之基因體DNA作為模板,進行PCR。野生型IPTKB基因之增幅產物為206bp,接受人工核酸序列之插入的IPTKB基因之增幅產物成為186bp。
藉由帶濃度之定量,將野生型IPTKB基因之增幅產物的量(X)、及接受人工核酸序列之插入的IPTKB基因之增幅產物的量(Y)定量化,將計算出之敲入效率(=100×Y/(X+Y))的結果示於第15圖。圖中橫軸表示選擇載
體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示敲入效率(%)。又,將此時回收之總基因體DNA量示於第16圖。圖中橫軸表示選擇載體(pEBmultipuro)之稀釋率,縱軸表示可回收之基因體DNA量。Factor值越低,可得到越高敲入效率。Factor值在0.011至0.043之範圍時,從敲入效率及基因體DNA量之觀點而言,達成更有效率的基因體標的部位之改變。
[試驗例1:藉由數位PCR之敲入效率的評估]
在將設計於同源臂外之TaqMan探針1及設計於插入之基因上的探針2以不同螢光標識且同時使用的情況,若成為兩螢光陰性之孔充分多,則基因體DNA分子係於數位PCR之孔上被極限稀釋,而成為在各孔為0至1分子。於此狀態下為兩螢光陽性之孔,判斷於基因體DNA調製時在被分斷化成平均DNA長度以內具有二結合部位,相對於全部基因體約3,000,000,000bp之長度,該平均DNA長度為充分短,由於藉由在該基因體中非特異性地插入DNA而成為雙重陽性的正確率顯著地低,故將雙重陽性孔視作特異性敲入來計數。將相對於雙重陽性孔數之全部探針2陽性孔數之比率(%)作為插入%。
[實施例5:斷裂率及敲入效率之評估]
依照實施例1記載之方法,以細胞之基因體的腺瘤性結腸息肉病(Adenomatous polyposis coli)(APC)基因作為標
的部位,進行人工核酸序列(TK基因)之插入。然後,進行使用母細胞之斷裂率的計算、及使用敲入細胞之敲入效率的評估。
首先,使用市售之套組(QIAamp DNA Mini Kit,QIAGEN),從母細胞調製基因體DNA斷片。
設計以1kb隔開且雜交於內因性基因(SOD1基因)上之探針組(探針A、探針B)。
使用探針組,以基因體DNA斷片作為模板,進行數位PCR法,將探針對與基因體DNA斷片之雜交定量。將定量值示於「表2」。計算出於1kb之區域內之斷裂率為8.8%。
斷裂率(%)=(<sp>)×100/(dp+<sp>)=(107+92)/2×100/(1036+(107+92)/2)=8.8
(其中,「dp」表示探針對之兩條探針的雜交量,<sp>表示探針對之各探針之雜交量的平均值)
探針A:TCGCCCAATAAAC(序列編號:13)
探針A之數位PCR正向引子:
AGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAA(序列編號:14)
探針A之數位PCR反向引子:
GCTAGCAGGATAACAGATGAGTTAAGG(序列編號:15)
探針B:CTGATGCTTTTTCATTATTAGG(序列編號:16)
探針B之數位PCR正向引子:
TGGCATCAGCCCTAATCCA(序列編號:17)
探針B之數位PCR反向引子:
CATTGCCCAAGTCTCCAACA(序列編號:18)
設計具有與TK基因之一部分鹼基序列互補之鹼基序列的探針P1、及具有與同源臂間之區域外側的鹼基序列互補之鹼基序列的探針P2。探針P1可雜交之第一區域及探針P2雜交之第二區域之間距離設定為1kb。
以與從母細胞萃取之相同條件,從敲入細胞萃取染色體,調製基因體DNA斷片。
使用探針組,以基因體DNA斷片作為模板,進行數位PCR法,將探針對與基因體DNA斷片之雜交定量化。將定量值示於「表3」。
外來核酸序列對目標座位之插入率
(%)=DP×100/(DP+SP2)=1059×100/(1059+194)=84.5
外來核酸序列對染色體之隨機整合率
(%)=SP1×100/(DP+SP1)=194×100/(1059+194)=15.5
探針P1:ATCGGCTCGGGTACG(序列編號:19)
探針P1之數位PCR正向引子:
CCAGCACCCGCCAGTAAGT(序列編號:20)
探針P1之數位PCR反向引子:
TTCGCGCGACGATATCG(序列編號:21)
探針P2:GCCACCATGAATGCTTACAATG(序列編號:22)
探針P2之數位PCR正向引子:
CACTGTCAAGATAAATCA(序列編號:23)
探針P2之數位PCR反向引子:
TGACTGGAGCAAAGACGGTTT(序列編號:24)
若考量先前算出之斷裂率(8.8%)時,則經考
量斷裂後之插入率係評估為93.3%(84.5+8.8),與理論值100%實質上一致。
若依照此手法,改變敲入操作之條件,可正確地評估毎個條件之敲入效率。因此,本手法在根據本發明之基因體標的部位的改變方法中,可被利用於決定最佳之Factor值。
[序列表自由文本]
序列編號1:APC基因之外顯子3的鹼基序列
序列編號2:APC基因之鹼基序列中之gRNA的識別序列
序列編號3:APC基因用正向引子之鹼基序列
序列編號4:APC基因用反向引子之鹼基序列
序列編號5:野生型APC基因之增幅產物的鹼基序列
序列編號6:接受人工核酸之插入的APC基因之增幅產物的鹼基序列
序列編號7:TNNI1基因之鹼基序列中之gRNA的識別序列
序列編號8:TNNI1基因用正向引子之鹼基序列
序列編號9:TNNI1基因用正向引子之鹼基序列
序列編號10:IPTKB基因之gRNA的識別序列
序列編號11:IPTKB基因正向引子之鹼基序列
序列編號12:IPTKB基因反向引子之鹼基序列
序列編號13:探針A之鹼基序列
序列編號14:探針A之數位PCR正向引子的鹼基序列
序列編號15:探針A之數位PCR反向引子的鹼基序列
序列編號16:探針B之鹼基序列
序列編號17:探針B之數位PCR正向引子的鹼基序列
序列編號18:探針B之數位PCR反向引子的鹼基序列
序列編號19:探針P1之鹼基序列
序列編號20:探針P1之數位PCR正向引子的鹼基序列
序列編號21:探針P1之數位PCR反向引子的鹼基序列
序列編號22:探針P2之鹼基序列
序列編號23:探針P2之數位PCR正向引子的鹼基序列
序列編號24:探針P2之數位PCR反向引子的鹼基序列
d:距離
P1:第一核酸探針
P2:第二核酸探針
T1:檢測對象核酸序列
L1、L2:座位
Claims (5)
- 一種用以檢測在染色體上之預定座位(locus)內檢測對象核酸序列之存在或不存在的方法,該方法包含如下步驟:(2)藉由數位PCR(digital PCR)法檢測有無第一核酸探針及第二核酸探針2對源自前述染色體的基因體DNA斷片雜交的步驟,其中該第一核酸探針會雜交於前述檢測對象核酸序列之全部或一部分,該第二核酸探針會雜交於前述預定座位內之前述檢測對象核酸序列以外的核酸序列;(3)在前述第一核酸探針及前述第二核酸探針與前述基因體DNA斷片雜交,而檢測出雙重陽性的情況,測知前述檢測對象核酸序列存在於前述預定座位;在未檢測出雙重陽性的情況,測知前述檢測對象核酸序列不存在於前述預定座位的步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,在前述預定座位中,前述第一核酸探針可雜交之第一區域與前述第二核酸探針可雜交之第二區域以一定之鹼基長度隔開。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中,在前述步驟(2)之前段,包含(1)從受檢細胞調製基因體DNA斷片的步驟。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中,前述檢測對象核酸序列為企圖經由基因重組而被插入在前述受檢細胞之染色體上的目標座位的外來核酸序列;前述第一核酸探針會雜交於前述外來核酸序列之全部或一部分;前述第二核酸探針會雜交於前述目標座位內之核酸序列,並且該核酸序列沒有位在供基因重組之2個同源臂(homology arm)之間。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中前述檢測對象核酸序列為企圖經由基因重組而從前述受檢細胞之染色體上之目標座位被刪除的內在核酸序列;前述第一核酸探針會雜交於前述內在核酸序列之全部或一部分;前述第二核酸探針會雜交於前述目標座位內之核酸序列,並且該核酸序列沒有位在供基因重組之2個同源臂之間。
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