KR20240100492A

KR20240100492A - 알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20240100492A
Application number: KR1020247015769A
Authority: KR
Inventors: 로라 셉-로렌지노; 재커리 더블유. 디멕
Original assignee: 인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2024-07-01

Abstract

숙주 세포에서 알파-1 항트립신[alpha 1 antitrypsin, AAT]을 발현시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 또한 알파-1 항트립신 결핍증[alpha 1 antitrypsin deficiency, AATD]을 앓고 있는 대상을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2021년 10월 15일에 출원된 미국 가출원 제63/256,365호의 이익을 주장한다.

알파-1 항트립신[alpha-1 antitrypsin, AAT 또는 A1AT] 또는 혈청 트립신 억제제는 SERPINA1 유전자에 의해 암호화된 세린 단백질분해효소 억제제(또한 세핀으로 명명됨)의 일종이다. AAT는 주로 간실질세포[hepatocyte]에 의해 합성되고 분비되며, 폐에서 호중구 엘라스테이스의 활성을 억제하는 기능을 한다. 기능성 AAT가 충분한 양이 없으면, 호중구 엘라스테이스는 조절되지 않고, 폐에서 폐포를 손상시킨다. 따라서, AAT의 수준을 감소시키거나 적절하게 기능성 AAT의 수준을 감소시키는 SERPINA1에서의 돌연변이는 폐 병리를 유발한다. 또한, 잘못 형성된 AAT 생성을 유발하는 SERPINA1에서의 돌연변이는 간실질세포에서의 AAT의 축적으로 인해 간 병리를 유발할 수 있다. 따라서, SERPINA1 돌연변이에 의해 야기된 불충분하고 부적절하게 형성된 AAT는 폐 및 간 병리를 유발할 수 있다.

SERPINA1 유전자에 대한 100개가 넘는 대립유전자 변이체가 기재된 바 있다. 변이체는 일반적으로 AAT의 혈청 수준에 대한 이들의 영향에 따라 분류된다. 예를 들어, M 대립유전자는 정상 혈청 AAT 수준과 관련된 정상 변이체인 반면, Z 및 S 대립유전자는 감소된 AAT 수준과 관련된 돌연변이 변이체이다. Z 및 S 대립유전자의 존재는 비정상 AAT를 생성하는 SERPINA1 유전자에서의 돌연변이를 특징으로 하는 유전적 장애인 α1-항트립신 결핍[α1-antitrypsin deficiency, AATD 또는 A1AD]과 관련 있다.

여러 형태 및 정도의 AATD가 있다. 'Z-변이체'가 가장 흔하며, 간과 폐 모두에서 중증의 임상 질환을 야기한다. Z-변이체는 아미노산 342번 위치에서 글루탐산에서 라이신으로의 미스센스 돌연변이(E342K)를 초래하는 제5 엑손의 5' 말단에서의 단일 뉴클레오타이드 변화를 특징으로 한다. Z 대립유전자에서 동종접합성(ZZ) 및 이종접합성(MZ 또는 SZ)을 모두 갖는 환자에게 증상이 일어난다. 한 개 또는 두 개의 Z 대립유전자가 존재하면, SERPINA1 mRNA가 불안정해지고 간실질세포에서 AAT 단백질 중합 및 응집을 초래한다. 적어도 하나의 Z 대립유전자를 갖는 환자는 간에서의 응집된 AAT 단백질의 축적으로 인해 간암의 발병률이 증가한다. 간 병리 이외에도, 적어도 하나의 Z 대립유전자를 특징으로 하는 AATD는 또한 폐포에서 AAT의 감소 및 그에 따른 호중구 엘라스테이스의 억제 감소로 인한 폐 질환을 특징으로 한다. 중증 ZZ-형태(즉, Z-변이체의 동종접합성 발현)의 유병률은 북유럽 인구에서 1:2,000이고, 미국에서 1:4,500이다. 다른 일반적인 돌연변이는 S-변이체이며, 이는 분비 전에 세포 내에서 분해되는 단백질을 초래한다. Z-변이체에 비해 S-변이체는 혈청 AAT를 더 경미하게 감소시키고 폐 질환 위험을 낮춘다.

간과 폐 모두에서 AATD의 부정적인 영향을 개선하는 방법 및 조성물에 대한 필요성이 존재한다.

본 개시는 알부민 세이프 하버 부위와 같은 인간 게놈 유전자좌에서 이종 AAT를 발현하여, 이종 AAT가 분비할 수 있게 하고 폐에서 AATD의 부정적인 영향을 완화하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 또한 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 녹아웃시키거나 감소시켜, AATD를 앓고 있는 환자에서 간 증상과 연관된 AAT의 돌연변이 형태의 생성을 제거하거나 감소시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 따라서, 특정 구현예에서, 세이프 하버 부위에서 이종 AAT를 삽입하여, 세포 또는 유기체에서 AAT 기능을 복원하고 내인성 SERPINA1 대립유전자의 발현을 차단(예를 들어, 이를 가이드 RNA 또는 siRNA로 표적함으로써)하는 조성물 및 방법이 존재한다.

특정 양태에서, 양방향 핵산 작제물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 작제물은 a) 제1 알파-1 항트립신[alpha-1 antitrypsin, AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하는 제1 절편으로서, 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한 제1 절편; 및 b) 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편으로서, 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도 및 SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한 제2 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 절편 및 제2 절편의 코딩 서열은 CpG가 고갈된다. 일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물 뉴클레오타이드 서열은 CpG가 고갈된다. 특정 구현예에서, 작제물은 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 절편은 제1 절편의 3'이다. 특정 구현예에서, 작제물은 상동성 팔[homology arm]을 포함하지 않는다.

본원에서 사용된 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 호중구 엘라스테이스를 억제하는 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 700 또는 702의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 절편은 링커에 의해 양방향 핵산 작제물의 제2 절편에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 길이가 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1,000, 1,500, 2,000개의 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 링커는 CpG가 고갈된다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 절편 및 제2 절편 각각은 폴리아데닐화 꼬리 서열, 폴리아데닐화 신호 서열, 또는 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 스플라이스 수여 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 작제물은 제1 절편의 상류에 제1 스플라이스 수여 부위 및 제2 절편의 하류에 제2 (역) 스플라이스 수여 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 스플라이스 수여 부위는 인간 스플라이스 수여 부위이다. 특정 구현예에서, 스플라이스 수여 부위는 마우스과 스플라이스 수여 부위 (murine splice acceptor site)이다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 이중 가닥, 선택적으로 이중 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 작제물은 단일 가닥, 선택적으로 단일 가닥 DNA이다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 코돈 최적화된다. 특정 구현예에서, 작제물은 다음 말단 구조, 즉, 헤어핀, 루프, 역위 말단 반복부[inverted terminal repeat, ITR], 또는 환상면체[toroid] 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 말단 구조는 CpG가 고갈된다. 일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물 뉴클레오타이드 서열은 CpG가 고갈지만, ITR은 CPG가 고갈되지 않는다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 한 개, 두 개 또는 세 개의 역위 말단 반복부[ITR]를 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 두 개 이하의 ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 SERPINA1 표적 siRNA, dsRNA 또는 이를 표적하는 가이드 RNA의 능력을 차단하거나 감소시키는 코돈 사용 빈도를 갖는다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1403-1436, 1403-1425, 1410-1436, 1418-1424, 1423-1435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역) 내의 비야생형 코돈의 사용을 포함한다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1,403-1,436, 1,403-1,425, 1,410-1,436, 1,418-1,424, 1,423-1,435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역) 내의 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, or 적어도 세 개의 불일치(예를 들어, 1-10개의 불일치, 1-9개의 불일치, 1-8개의 불일치, 1-7개의 불일치, 1-6개의 불일치, 1-5개의 불일치, 1-4개의 불일치, 1-3개의 불일치, 1-2개의 불일치, 한 개의 불일치, 2-10개의 불일치, 2-9개의 불일치, 2-8개의 불일치, 2-7개의 불일치, 2-6개의 불일치, 2-5개의 불일치, 2-4개의 불일치, 1-3개의 불일치, 두 개의 불일치, 3-10개의 불일치, 3-9개의 불일치, 3-8개의 불일치, 3-7개의 불일치, 3-6개의 불일치, 3-5개의 불일치, 3-4개의 불일치, 세 개의 불일치, 4-10개의 불일치, 4-9개의 불일치, 4-8개의 불일치, 4-7개의 불일치, 4-6개의 불일치, 4-5개의 불일치, 네 개의 불일치, 5-10개의 불일치, 5-9개의 불일치, 5-8개의 불일치, 5-7개의 불일치, 5-6개의 불일치, 다섯 개의 불일치, 6-10개의 불일치, 6-9개의 불일치, 6-8개의 불일치, 6-7개의 불일치, 여섯 개의 불일치, 7-10개의 불일치, 7-9개의 불일치, 7-8개의 불일치, 일곱 개의 불일치, 8-10개의 불일치, 8-9개의 불일치, 또는 여덟 개의 불일치)를 포함한다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 957-977번, 1,403-1,425번, 또는 1,410-1,436번 뉴클레오타이드를 표적하는 RNAi 작용제에 의해 표적되지 않는다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 1,129, 1,130, 또는 1,131의 표적 서열을 갖는 SERPINA1 표적 가이드 RNA에 의해 표적되지 않는다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1,403-1,436, 1,403-1,425, 1,410-1,436, 1,418-1,424, 1,423-1,435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역) 내의 비야생형 코돈의 사용을 포함한다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 771, 772, 781, 782에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 771, 772, 781, 및 782에서 선택되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 핵산 서열은 서열 번호 770, 780, 및 1,564에서 선택된다.

특정 양태에서, SERPINA1 핵산 서열을 세포 또는 세포 집단에 도입하는 방법으로서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 세포 또는 세포 집단에 i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물, ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 알부민 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 투여하여 SERPINA1 핵산을 세포 또는 세포 집단에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 a) 적어도 95% 서열 번호 2-33인 서열; b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접한 (contiguous) 뉴클레오타이드; 및 c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 간세포(예를 들어, 간실질세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 투여 전 수준과 비교하여 기능성 AAT를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가한 수준으로 발현한다.

특정 양태에서, 간세포 또는 세포 집단에서의 알파-1 항트립신[AAT] 분비를 증가시키는 방법으로서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 간세포 또는 간세포 집단에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 세포 또는 세포 집단에 i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물, ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 알부민 가이드 RNA(gRNA)를 투여하여 간세포 또는 세포 집단에서의 AAT 분비를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 a) 적어도 95% 서열 번호 2-33인 서열; b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; 및 c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에서 선택되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 간세포는 간실질세포이다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 투여 전 수준과 비교하여 기능성 AAT를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가한 수준으로 발현한다.

특정 양태에서, 알파-1 항트립신[AAT]을 대상(예를 들어, AAT의 발현을 필요로 하는 대상)에서 발현하는 방법으로서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 대상에 i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 알부민 가이드 RNA(gRNA)를 투여하여 AAT를 대상에서 발현하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 a) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 서열; b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; 및 c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에서 선택되는 서열을 포함한다.

특정 양태에서, 알파-1 항트립신 결핍[alpha-1 antitrypsin deficiency, AATD]을 대상(예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상)에서 치료하는 방법으로서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 대상에 i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 알부민 가이드 RNA(gRNA)를 투여하여 대상에서 AATD를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 a) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 서열; b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; 및 c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에서 선택되는 서열을 포함한다.

본원에서 제공된 방법의 특정 구현예에서, 대상의 기능성 AAT 수준은 적어도 약 500 μg/㎖까지 증가한다. 일부 구현예에서, 대상의 기능성 AAT 수준은 투여 전의 대상의 기능성 AAT 수준과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가한다. 일부 구현예에서, AAT의 수준은 혈청 또는 혈장에서 측정된다. 특정 구현예에서, 혈청 내 AAT 수준은 적어도 500 μg/ml, 적어도 500 μg/ml, 적어도 571 μg/ml 적어도 750 μg/ml, 적어도 1,000 μg/ml, 500-4,000 μg/ml, 500-3,500 μg/ml, 750-3,500 μg/ml, 1,000-3,500 μg/ml, 1,000-3,000 μg/ml, 또는 1,000-2,700 μg/ml이다. 일부 구현예에서, 수준은 양방향 핵산 작제물의 투여하고 적어도 8주, 적어도 9주, 적어도 10주, 적어도 11주 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 특정 구현예에서, 대상에서 기능성 AAT의 수준은 투여 후 적어도 1년 동안 유지된다.

본원에서 제공된 방법의 특정 구현예에서, 대상은 간 또는 폐 기능이 손상되었다. 일부 구현예에서, 투여는 대상에서 폐기종의 진행을 지연시킨다.

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 양방향 핵산 작제물의 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 siRNA, dsRNA 또는 가이드 RNA이다. 특정 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 서열 번호 703의 957-977번, 1,403-1,425번, 또는 1,410-1,436번 뉴클레오타이드를 표적하는 RNAi 작용제, 및 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 내인성 SERPINA1 유전자 표적 가이드 RNA에서 선택된다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[double-stranded break, DSB]을 유도하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 서열 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치에서 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 내인성 SERPINA1 유전자를 변형시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, DSB는 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 유도되거나, 내인성 SERPINA1 유전자는 세포 또는 세포 집단과 접촉하거나 대상에게 양방향 핵산 작제물을 투여한 후에 변형된다.

본원에서 제공된 방법의 일부 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 2번, 3번, 4번, 또는 5번 엑손에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고, 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 둘 다를 표적하지 않는다. 일부 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, SERPINA1 가이드 RNA는 서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 가이드 서열; 서열 번호 1,129-1,131과 적어도 95% 동일한 가이드 서열; 또는 서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 서열의 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

본원에서 제공된 방법의 특정 구현예에서, 투여 단계는 생체 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 투여된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제 또는 알부민 gRNA는 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 전달 또는 투여된다.

본원에서 제공된 특정 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제 또는 SERPINA1 gRNA는 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 전달 또는 투여된다. 일부 구현예에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스[adeno associate vira, AAV] 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터에서 선택된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드로 이루어진 군에서 선택된다.

본원에서 제공된 방법의 특정 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 클래스 2 Cas 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas9 핵산분해효소는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 클리베이스(cleavase)이다.

특정 양태에서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스[AAV] 벡터이다. 특정 구현예에서, AAV는 단일 가닥 게놈[single-stranded genome, ssAAV] 또는 자가 상보적 게놈[self-complementary genome, scAAV]을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 상동성 팔을 포함하지 않는다.일부 구현예에서, 벡터는 CpG가 고갈된다.

특정 양태에서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자가 본원에 제공된다.

특정 양태에서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포(예를 들어, 간실질세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 비분할 세포 유형이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 양방향 작제물에 의해 암호화된 AAT 폴리펩타이드를 발현한다.

특정 양태에서, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 포함하는(예를 들어, 하나 이상의 대상의 세포, 예컨대 이들의 간세포의 게놈을 포함하는) 대상에서 내인성 알파-1 항트립신[AAT]의 발현을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에게 RNA-가이드 DNA 결합제; 및 양방향 핵산 작제물의 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 siRNA, dsRNA 또는 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 서열 번호 703의 957-977번, 1,403-1,425번, 또는 1,410-1,436번 뉴클레오타이드를 표적하는 RNAi 작용제, 및 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 내인성 SERPINA1 유전자 표적 가이드 RNA에서 선택된다.

일부 구현예에서, 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 서열 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 내인성 SERPINA1 유전자를 변형하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 2번, 3번, 4번, 또는 5번 엑손에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 둘 다를 표적하지 않는다. 일부 구현예에서, SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 내인성 SERPINA1 유전자 내의 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, SERPINA1 가이드 RNA는 서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 가이드 서열; 서열 번호 1,129-1,131과 적어도 95% 동일한 가이드 서열; 또는 서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 서열의 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 양방향 핵산 작제물의 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 단계를 더 포함한다.

본원에서 제공된 방법의 일부 구현예에서, 대상은 상승된 간 효소를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상은 하나 이상의 간 효소의 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 또는 적어도 5배의 정상 상한치[upper limit of normal, ULN]를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 간 효소는 알라닌 아미노전이효소[alanine aminotransferase, ALT] 및 아스파테이트 아미노전이효소[aspartate aminotransferase, AST]에서 선택된다. 특정 구현예에서, 방법으로 인해 간 효소가 임상적으로 의미있게 감소한다. 일부 구현예에서, 치료로 인해 상승된 간 효소가 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 또는 5배 ULN 이내로 감소한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 간 섬유증을 치료 또는 예방한다.

특정 구현예에서, 가이드 RNA는 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물을 인간 세이프 하버 부위, 예컨대 알부민 세이프 하버 부위의 인트론 1에 표적 삽입하는 데 사용된다. 또한, 인간 세이프 하버 부위, 예컨대 알부민 세이프 하버 부위의 인트론 1에 표적 삽입하는 데 사용하기 위한, AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 공여자 작제물(예를 들어, 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물)이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물은 임의의 하나 이상의 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템, 아연 핑거 핵산분해효소[zinc finger nuclease, ZFN] 시스템, 전사 활성화 인자 유사 효과기 핵산분해효소[transcription activator-like effector nuclease, TALEN] 시스템)과 함께 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, SERPINA1 핵산 서열을 세포 또는 세포 집단에 도입하는 방법으로서, 다음을 투여하여 SERPINA1 핵산을 세포 또는 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 본 개시에 제공된다. i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA). a) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; 및 d) 서열 번호 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표의 15개의 연속 뉴클레오타이드 +/- 5 뉴클레오타이드에 상보적인 서열.

일부 구현예에서, AAT의 발현이 필요한 대상에서 AAT를 발현하는 방법으로서, 다음을 투여하여 이를 필요로 하는 대상에서 AAT를 발현하는 단계를 포함하는 방법이 본 개시에 제공된다. i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA). a) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; 및 d) 서열 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표의 15개의 연속 뉴클레오타이드 +/- 5 뉴클레오타이드에 상보적인 서열.

일부 구현예에서, AAT 단백질이 필요한 대상에서 알파-1 항트립신 결핍[AATD]을 치료하는 방법으로서, 다음을 투여하여 이를 필요로 하는 대상에서 AATD를 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본 개시에 제공된다. i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA). a) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; 및 d) 서열 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표의 15개의 연속 뉴클레오타이드 +/- 5 뉴클레오타이드에 상보적인 서열.

일부 구현예에서, 간세포 또는 세포 집단에서 AAT 분비를 증가시키는 방법으로서, 다음을 투여하여 간세포 또는 세포 집단에서 AAT 분비를 증가시키는 단계를 포함하는 방법이 본 개시에 제공된다. i) 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물; ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및 iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA). a) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; 및 d) 서열 2-33에 대해 열거된 게놈 좌표의 15개의 연속 뉴클레오타이드 +/- 5 뉴클레오타이드에 상보적인 서열.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는 순차적으로, 임의의 순서로 또는 임의의 조합으로 전달 또는 투여된다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물, RNA-가이드 DNA 결합제, 알부민 gRNA, 및 SERPINA1 gRNA는 개별적으로, 또는 임의의 조합으로 동시에 전달 또는 투여된다.

일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제, 또는 알부민 gRNA와 병용한 RNA-가이드 DNA 결합제는 양방향 핵산 작제물을 투여하기 전에 전달 또는 투여된다.

일부 구현예에서, 알부민 gRNA 또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 전달 또는 투여하기 전에 양방향 핵산 작제물이 전달 또는 투여된다.

특허 또는 출원 파일은 유색으로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 유색 도면(들)을 포함한 본 특허 또는 특허 출원 공보의 카피는 요청 및 필요한 수수료 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 인간 SERPINA1을 표적하는 LNP 제형화된 가이드 RNA G000409, G000414 또는 G000415의 투여 후 마우스의 간에서 hSERPINA1 PIZ 변이체 이식 유전자의 인델 형성을 통한 편집 퍼센트를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 인간 SERPINA1을 표적하는 LNP 제형화한 가이드 RNA G000409, G000414 또는 G000415의 투여 후 마우스의 간에서 hSERPINA1 PIZ 변이체 이식 유전자 내의 μg/ml 단위의 hA1AT 혈청 수준(A) 및 처리된 대조군(TSS%) 대비 (B)를 나타낸다.
도 3은 AAV 벡터에서 다양한 코돈 사용 빈도와 함께 인간 A1AT를 암호화하는 다양한 양방향 작제물을 투여한 후 일차 마우스 간실질세포[primary mouse hepatocytes, PMH]에서 A1AT 단백질 발현(ng/ml)을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 AAV 벡터에서 hSERPINA1 또는 nanoluc를 암호화하는 양방향 작제물의 투여 후 야생형(NGS) 마우스 또는 PIZ 형질전환 마우스에서 (A) 혈청 hA1AT 및 (B) 혈청 ALT 활성 수준을 나타낸다.
도 5는 AAV 벡터에서 다양한 코돈 사용 빈도와 함께 인간 A1AT를 암호화하는 다양한 양방향 작제물을 투여한 후 일차 마우스 간실질세포[PMH]에서 A1AT 단백질 발현을 나타낸다.
도 6a-6c는 AAV 벡터에서 다양한 코돈 사용 빈도와 함께 인간 A1AT를 각각 암호화하는 다양한 양방향 작제물 (A) 작제물 7, (B) 작제물 8 및 (C) 작제물 9를 투여한 후 용량 반응 연구의 결과를 나타낸다.
도 7은 G009860 및 작제물 1로 처리하거나 비히클로 처리하고 14일 차에 시노몰구스 알부민 유전자좌에서 편집 퍼센트(인델 형성)를 나타낸다.
도 8은 시노몰구스 특이적 SERPINA1 가이드인 G014418로 처리하거나 비히클로 처리하고 14일 후인 연구 259일 차에 cSERPINA1에서 편집 퍼센트(인델 형성)를 나타낸다.
도 9a 및 9b 혈청 (A) hA1AT 및 (B) cA1AT는 표시된 시점에서 평가되었다. 양방향 작제물 1은 1일 차에 투여되었다. 시노몰구스 특이적 SERPINA1 가이드 G014418은 244일 차(화살표로 표시됨)에 투여되었다.
도 10은 G009860 및 작제물 7 또는 작제물 8로 처리하거나 비히클로 처리하고 14일 차에 시노몰구스 알부민 유전자좌에서 편집 퍼센트(인델 형성)를 나타낸다.
도 11은 표시된 시점에서 1일 차에 G009860 및 작제물 7 또는 작제물 8로 처리하거나 비히클로 처리하고 시노몰구스 원숭이에서 순환하는 hA1AT 수준을 나타낸다. 음영 영역은 순환 중 hA1AT의 정상 수준(약 1,000-2,700 μg/ml 또는 20-53 μM)을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 발현 작제물 Alb-A1AT 및 천연-A1AT에서의 A1AT의 발현(도 12a) 및 호중구 엘라스테이스의 억제 퍼센트(도 12b)를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 28일 차(투여 전) 및 32일 차(투여 후)에 ELISA로 측정되는 hA1AT 단백질 수준(도 13a) 및 siRNA2 또는 siRNA3을 투여한 후의 A1AT의 녹다운 퍼센트(도 13b)를 나타낸다.
도 14는 투여하고 1주 차 및 2주 차의 혈청 hA1AT 수준을 나타낸다. 별표(*)는 그룹당 네 마리의 동물을 나타낸다.

본 발명의 특정 구현예에 대한 언급이 다음에 상세히 이루어질 것이며, 이의 예는 첨부된 도면으로 예시된다. 본 교시는 다양한 구현예와 함께 기재되지만, 본 발명을 그러한 구현예로 제한하려는 의도는 아니다. 반대로, 본 교시는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 다양한 대안, 수정 및 등가물을 포함한다.

본 교시를 상세하게 기재하기 전에, 본 개시는 변경될 수 있는 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서 및 첨부된 구현예에서 사용된 대로, 단수 형태는 문맥상 달리 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 '접합체'에 대한 언급은 복수의 접합체를 포함하고, '세포'에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '포함하다' 및 이의 문법적 변형은 비제한적인 것을 의미하여, 목록에 있는 항목이 열거된 항목을 대체할 수 있거나 이에 부가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않는다.

수치 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 측정된 값 및 측정 가능한 값은 유효 자릿수 및 측정과 연관된 오차를 고려하여 대략적인 것으로 이해된다. 또한, '포함하다[comprise]', '포함하다[comprises]', '포함하는[comprising]', '함유하다[contain]', '함유하다[contains]', '함유하는[containing]', '포함하다[include]', '포함하다[includes]' 및 '포함하는[including]'의 사용은 제한하려는 의도가 아니다. 전술한 일반적인 기재 및 상세한 기재는 모두 예시적이고 기재적인 것일 뿐이며, 교시 내용을 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.

명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소를 '포함하는'을 인용하는 명세서의 구현예는 또한 인용하는 구성요소로 '이루어지는[consisting of]' 또는 '본질적으로 이루어지는[consisting essentially of]'으로 상정되고, 다양한 구성요소로 '이루어지는'을 인용하는 명세서의 구현예는 또한 인용되는 구성요소를 '포함하는' 또는 이로 '본질적으로 이루어지는' 것으로 상정되며, 다양한 구성요소로 '본질적으로 이루어지는'을 인용하는 명세서의 구현예는 또한 인용되는 구성요소로 '이루어지는' 또는 이를 '포함하는' 것으로 상정된다(이러한 상호교환성은 구현예에서의 이러한 용어의 사용에는 적용되지 않음).

용어 '또는'은 문맥에서 달리 명백하게 명시하지 않는 한, 포괄적인 의미, 즉 '및/또는'과 동일하게 사용된다.

용어 '약'은 목록 앞에 사용될 때 목록의 각 구성원을 변형시킨다. 용어 '약' 또는 '대략'은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차를 의미하며, 이는 부분적으로 숫자가 어떻게 측정 또는 결정되는지에 따라 달라진다.

숫자 또는 일련의 숫자 앞의 용어 '적어도'는, 용어 '적어도'에 인접한 숫자, 및 문맥으로부터 명백하고 논리적으로 포함될 수 있는 모든 다음의 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자에서 뉴클레오타이드의 숫자는 정수여야 한다. 예를 들어, '20개의 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 17개의 뉴클레오타이드'는 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드가 표시된 속성을 갖는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 있는 경우, '적어도'는 일련의 숫자 또는 범위의 각 숫자를 변형시킬 수 있는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, '이하' 또는 '미만'은 어구에 인접한 값 및 논리적으로 더 작은 값 또는 문맥으로부터 논리적으로 0까지의 정수로 이해된다. 예를 들어, '두 개 이하의 뉴클레오타이드 염기쌍'의 듀플렉스 영역은 두 개, 한 개 또는 0개의 뉴클레오타이드 염기쌍을 갖는다. 일련의 수 또는 범위 앞에 '이하' 또는 '미만'이 있는 경우, 일련의 또는 범위에서의 각각의 숫자가 변형된 것으로 이해된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 범위는 양쪽 상한 및 하한을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 값의 최대량이 100%(예를 들어, 100% 억제)로 표시된 경우 그 값은 검출 방법에 의해 제한되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 100% 억제는 검정의 검출 수준 미만의 수준까지 억제하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 부문의 제목은 구조적 목적만으로만 사용되고, 어떤 방식으로든 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 참조로 포함된 임의의 자료가 본 명세서에 정의된 임의의 용어 또는 본 명세서의 임의의 다른 명시적 내용과 상충되는 경우, 본원이 우선한다.

Ⅰ. 정의

달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 다음의 용어 및 어구는 다음의 의미를 갖는 것으로 의도된다.

'폴리뉴클레오타이드' 및 '핵산'은 종래의 RNA, DNA, 혼합 RNA-DNA, 및 이들의 유사체인 중합체를 포함하여 골격을 따라 함께 연결되는 질소 헤테로사이클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 핵산 '골격'은 당-포스포다이에스터 연결, 펩타이드-핵산 결합('펩타이드 핵산' 또는 PNA; PCT WO 95/32305), 포스포로싸이오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 라이보스, 디옥시라이보스 또는 임의의 치환, 예를 들어, 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환이 있는 유사한 화합물일 수 있다. 질소 염기는 종래의 염기(A, G, C, T, U), 이의 유사체(예를 들어, 변형된 유리딘, 예컨대, 5-메톡시유리딘, 슈도유리딘 또는 N1-메틸슈도유리딘 또는 기타), 이노신, 퓨린 또는 피리미딘의 유도체[예를 들어, N⁴-메틸 디옥시구아노신, 디아자- 또는 아자-퓨린, 디아자- 또는 아자-피리미딘, 5번 또는 6번 위치에 치환기가 있는 피리미딘 염기(예를 들어, 5-메틸사이토신), 2번, 6번 또는 8번 위치에 치환기가 있는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O⁶-메틸구아닌, 4-싸이오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-다이메틸하이드라진-피리미딘, 및 O⁴-알킬-피리미딘, 미국 특허 제5,378,825호 및 PCT WO 93/13121]일 수 있다. 일반적인 논의를 위해, 문헌[The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11^th ed., 1992]을 참조한다. 핵산은 골격이 중합체의 위치(들)에 대한 질소 염기를 포함하지 않는 하나 이상의 '비염기성' 잔기를 포함할 수 있다(미국 특허 제5,585,481호). 핵산은 종래의 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나, 또는 종래의 성분 및 치환(예를 들어, 2' 메톡시 치환기를 갖는 종래의 뉴클레오사이드, 또는 종래의 뉴클레오사이드와 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체를 둘 다 함유하는 중합체)을 둘 다 포함할 수 있다. 핵산은 당 형태를 모방하는 RNA에 고정된 이환식 퓨라노스 단위를 갖는 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드 단량체를 함유하는 유사체인 '잠금된 핵산[locked nucleic acid, LNA]'을 포함하며, 이는 상보적 RNA 및 DNA 서열에 대한 혼성화 친화도를 향상시킨다(문헌[Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41]). RNA와 DNA는 상이한 당 모이어티를 가지고, RNA에서 유라실 또는 이의 유사체 및 DNA에서 타이민 또는 이의 유사체의 존재에 따라 상이할 수 있다.

'가이드 RNA', 'gRNA' 및 간단히 '가이드'는 가이드 서열, 예를 들어 crRNA(CRISPR RNA로도 알려짐) 또는 crRNA와 trRNA[tracrRNA crRNA(CRISPR RNA로도 알려짐)로도 알려짐]의 조합을 포함하는 가이드, 또는 crRNA와 trRNA(tracrRNA로도 알려짐)의 조합을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA[single guide RNA, sgRNA]) 또는, 예를 들어, 두 개의 별도의 RNA 분자(이중 가이드 RNA[dual guide RNA, dgRNA])로 연관될 수 있다. '가이드 RNA' 또는 'gRNA'는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생 서열이거나, 자연 발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열일 수 있다. 가이드 RNA, 예컨대 sgRNA 또는 dgRNA는 본원에 기재된 변형된 RNA를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, '가이드 서열'은 표적 서열에 상보적이고 RNA-가이드 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형(예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열로 유도하는 기능을 하는 가이드 RNA 내의 서열을 지칭한다. '가이드 서열'은 '표적 서열', 또는 '스페이서 서열'로도 지칭될 수 있다. 가이드 서열은, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(즉, Spy Cas9) 및 연관된 Cas9 동족체/동원체의 경우에 길이가 20개의 염기쌍일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열, 예를 들어 길이가 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24- 또는 25- 개의 뉴클레오타이드는 또한 가이드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열 번호 2-33에서 선택되는 알부민 가이드 서열 또는 서열 번호 1,000-1,131에서 선택되는 SERPINA1 가이드 서열 내 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은, 예를 들어 유전자 내에 또는 염색체 상에 있고, 가이드 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열 번호 2-33에서 선택되는 알부민 가이드 서열 또는 서열 번호 1,000-1,131에서 선택되는 SERPINA1 가이드 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드에 대해 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 한 개의 불일치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있되, 표적 서열의 총 길이는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1-4개의 불일치를 함유할 수 있되, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있되, 가이드 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

RNA-가이드 DNA 결합제에 대한 표적 서열은, RNA-가이드 DNA 결합제에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이므로, 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 주어진 서열과 해당 서열의 역 상보적 서열) 둘 다를 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 '표적 서열에 상보적'이라고 하는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 센스 또는 안티센스 가닥(예를 들어, 역 상보적 가닥)에 결합하도록 유도할 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서 일부 구현예에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 상보적 서열에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 U를 T로 치환하는 것을 제외하고는 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오타이드와 동일하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 'RNA-가이드 DNA-결합제'는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드나 폴리펩타이드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 하위 단위를 의미하되, DNA 결합 활성은 서열 특이적이고 RNA의 서열에 따라 다르다. 용어 RNA-가이드 DNA 결합제는 또한 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 예시적 RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 클리베이스/틈내기효소[nickase]를 포함한다. 예시적 RNA-가이드 DNA-결합제는, 예를 들어, FokI 클리베이스 도메인과의 융합을 통해 예를 들어, DNA 절단을 허용하도록 변형된 경우, RNA-가이드 DNA-결합제의 비활성화된 형태('dCas DNA-결합제')를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 'Cas 핵산분해효소'는 Cas 클리베이스 및 Cas 틈내기효소를 포함한다. Cas 클리베이스 및 Cas 틈내기효소는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1, 또는 Cmr2 하위 단위, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 하위 단위, 및 클래스 2 Cas 핵산분해효소를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '클래스 2 Cas 핵산분해효소'는 RNA-가이드 DNA 결합 활성을 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드다. 클래스 2 Cas 핵산분해효소는 해당 작용제가 DNA 절단을 허용하도록 변형된 경우, RNA-가이드 DNA 클리베이스 또는 틈내기효소 활성을 더 갖는 클래스 2 Cas 클리베이스/틈내기효소(예를 들어, H840A, D10A 또는 N863A 변이체) 및 클리베이스/틈내기효소 활성이 비활성화되는 클래스 2 dCas DNA-결합제를 포함한다. 클래스 2 Cas 핵산분해효소는 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9(예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9(예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0)(예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1)(예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질(문헌[Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)])은 또한 RuvC-유사 핵산분해효소 도메인을 함유한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 참조로 포함된다. 예를 들어, Zetsche의 표 S1 및 S3을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)]을 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, RNA-가이드 DNA-결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소, Cas9 핵산분해효소 또는 S. 피오게네스 Cas9 핵산분해효소)의 전달은 폴리펩타이드 또는 mRNA의 전달을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, '리보핵산단백질[ribonucleoprotein, RNP]' 또는 'RNP 복합체'는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대 Cas 핵산분해효소, 예를 들어, Cas 클리베이스, Cas 틈내기효소 또는 dCas DNA 결합제(예를 들어, Cas9)와 함께 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대 Cas9를 표적 서열로 유도하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하며, 작용제는 표적 서열에 결합하고, 작용제가 클리베이스 또는 틈내기효소인 경우의 결합은 절단 또는 틈내기[nicking]이 뒤따를 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 제2 서열에 대한 제1 서열의 정렬이 제2 서열의 전체 위치의 X% 이상이 제1 서열과 일치함을 나타내는 경우, 제1 서열은 제2 서열과 '적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함한다'는 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 서열 AAG와 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는데, 이는 정렬이 제2 서열의 세 개 위치 모두에 일치한다는 점에서 100% 동일성을 제공하기 때문이다. RNA와 DNA 사이의 상이함(일반적으로 유리딘을 티미딘으로 교환 또는 그 반대) 및 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 변형된 유리딘의 존재는 연관 뉴클레오타이드(예컨대, 티미딘, 유리딘, 또는 변형된 유리딘)가 동일한 상보적 뉴클레오타이드(예를 들어, 모든 티미딘, 유리딘 또는 변형된 유리딘에 대한 아데노신; 또 다른 예는 사이토신 및 5-메틸사이토신으로, 둘 다 상보적 뉴클레오타이드로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 가짐)를 갖는 한, 폴리뉴클레오타이드 간의 동일성 또는 상보성의 상이함에 기여하지 않는다. 따라서, 예를 들어, X가 임의의 변형된 유리딘, 예컨대 슈도유리딘, N1-메틸 슈도유리딘 또는 5-메톡시유리딘인 서열 5'-AXG는 AUG와 100% 동일한 것으로 간주되는데, 이는 둘 다 동일한 서열(5'-CAU)에 대해 완벽하게 상보적이기 때문이다. 예시적 정렬 알고리즘은 당업계에 널리 공지된 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 어떤 알고리즘 및 파라미터 설정의 선택이 서열의 주어진 쌍이 정렬되기에 적절한지 이해할 것이며, 서열이 일반적으로 길이가 유사하고, 아미노산에 대해 > 50% 또는 뉴클레오타이드에 대해 > 75% 동일성이 예상되는 경우, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI가 제공하는 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 기본 설정을 사용하는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적절하다.

본원에 사용된 바와 같이, 제1 서열 염기의 염기 중 X%가 제2 서열과 쌍을 이루는 경우 제1 서열은 제2 서열과 'X% 상보적'인 것으로 간주된다. 예를 들어, 제1 서열 5'AAGA3'은 제2 서열 3'TTCT5'와 100% 상보적이고, 제2 서열은 제1 서열과 100% 상보적이다. 일부 구현예에서, 제1 서열 5'AAGA3'은 제2 서열 3'TTCTGTGA5'과 100% 상보적인 반면, 제2 서열은 제1 서열과 50% 상보적이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 'CpG 고갈' 등은 CpG 다이뉴클레오타이드의 존재를 감소시키거나 바람직하게는 제거하기 위한 뉴클레오타이드 서열의 변형으로 이해된다. 코딩 서열에서의 CpG 고갈은, 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 대체 코돈 사용 빈도에 의하여 용이하게 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, A1AT 단백질 중 CpG가 고갈된 코딩 서열은 세 개 이하의 CpG 다이뉴클레오타이드(즉, 3, 2, 1, 또는 0개의 CpG 다이뉴클레오타이드)를 함유하고, 바람직하게는 A1AT 단백질에 대한 코딩 서열은 CpG 다이뉴클레오타이드를 함유하지 않는다. 발현 작제물의 다른 부분이 최소 수의 CpG 다이뉴클레오타이드를 갖도록 선택되거나 설계될 수 있다는 것으로 이해된다(예를 들어, 문헌[Wright JF, Mol Ther. 2020] 참조).

본원에 사용된 바와 같이, '비야생형 코돈의 사용'은 암호화된 아미노산 서열을 변경하지 않고 코딩 서열을 변형시키는 것이 대체 코돈 사용 빈도에 의해 용이하게 달성될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 비야생형 코돈의 사용은 정의된 영역 내의 비야생형 코돈을 갖는 야생형 코돈의 적어도 10%, 20%, 30%, 또는 40%에 대한 대체 코돈 사용 빈도를 포함한다. 본원에 정의된 일부 영역은 부분적으로 영역 내에 있는 코돈을 포함할 수 있으므로, 부분 코돈 서열은 야생형 서열과 비교된다. 부분 코돈이 정의된 영역 내의 야생형 서열에서의 변화를 포함하는 경우, 코돈은 비야생형 코돈을 사용하는 것으로 간주된다. 부분 코돈이 정의된 영역 내의 야생형 서열에서의 변화를 포함하지 않는 경우, 코돈은 야생형 코돈 사용 빈도를 갖는 것으로 간주된다.

본원에 사용된 바와 같이, 'mRNA'는 본원에서 전적으로 또는 우세하게 RNA 또는 변형된 RNA이고 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 개방형 판독틀을 포함하는(즉, 라이보솜 및 아미노-아실화되는 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있는) 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 데 사용된다. mRNA는 라이보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어 2'-메톡시 라이보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 본질적으로 라이보스 잔기, 2'-메톡시 라이보스 잔기, 또는 이들의 조합으로 이루어진다.

본원에 기재된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 예시적 가이드 서열은 표 1, 표 2 및 본 출원 전반에 걸쳐 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, '인델(indel)'은 표적 핵산의 이중 가닥 절단[double-stranded break, DSB]의 부위에 삽입 또는 결실되는 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, '이종 알파-1 항트립신'은 삽입 부위에 대해 이종인 SERPINA1 유전자의 유전자 생성물인 '이종 AAT' 또는 '이종 A1AT' 또는 'AAT/A1AT 이식 유전자'와 상호 교환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, SERPINA1 유전자는 외인성이다. 인간 야생형 AAT 단백질 서열은 NCBI NP_000286에서 입수 가능하고, 유전자 서열은 NCBI NM_000295에서 입수 가능하다. 인간 야생형 AAT cDNA는 서열화되었고(예를 들어, 문헌[Long et al., "Complete sequence of the cDNA for human alpha 1-antitrypsin and the gene for the S variant," Biochemistry 1984] 참조), 신호 펩타이드 및 성숙한 AAT 펩타이드를 함유하는 전구체 분자를 암호화한다. 세포내 표적, 탄수화물 부착, 촉매 기능, 단백질분해효소 억제 활성 등을 담당하는 펩타이드의 도메인은 특성화되었다(예를 들어, 문헌[Kalsheker, "Alpha 1-antitrypsin: structure, function and molecular biology of the gene," Biosci Rep. 1989; Matamala et al., "Identification of Novel Short C-Terminal Transcripts of Human SERPINA1 Gene," PLoS One 2017; 및 Niemann et al., "Isolation and serine protease inhibitory activity of the 44-residue, C-terminal fragment of alpha 1-antitrypsin from human placenta," Matrix 1992] 참조). 본원에 사용된 바와 같이, 이종 AAT는 전구체 AAT, 성숙 AAT, 및 이들의 변이체 및 단편, 예를 들어, 기능성 단편, 예를 들어, 단백질분해효소 억제 활성(예를 들어, 상업적으로 이용가능한 단백질분해효소 억제 검정 또는 인간 호중구 엘라스테이스[human neutrophil elastase, HNE] 억제 검정에 의해 검정되는 대로, 야생형 AAT와 비교하여, 예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 또는 100%)을 보유하는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 단편은 자연 발생, 예를 들어, 짧은 C-말단 단편이다. 일부 구현예에서, 기능성 단편은 유전적으로 조작되며, 예를 들어, 과활성 기능성 단편이다. AAT 단백질 서열의 예는 본원에 기재되어 있다(예를 들어, 서열 번호 700 또는 서열 번호 702). 본원에 사용된 바와 같이, 이종 AAT는 또한 AAT의 변이체, 예를 들어, 야생형 AAT와 비교하여 증가된 단백질분해효소 억제제 활성을 갖는 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이종 AAT는 또한 서열 번호 700과 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일하고, 예를 들어, HNE 억제에 의한 검정 시 야생형 AAT와 비교하여, 예를 들어 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 기능성 활성을 갖는 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이종 AAT는 또한 예를 들어, HNE 억제에 의한 검정 시 야생형 AAT와 비교하여 기능성 활성, 예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 활성을 갖는 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이종 AAT는 AAT, 예를 들어 AATD를 치료하는 데 유용한 기능성 AAT를 지칭하며, 이는 AATD를 치료하는 데 유용한 야생형 AAT 또는 이의 변이체일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, '이종 유전자'는 숙주 세포 게놈(예를 들어, 알부민 인트론 1 부위를 포함하는 세이프 하버 유전자좌와 같은 게놈 유전자좌에서의) 내 부위에 외인성 공급원으로서 도입되는 유전자를 지칭한다. 이러한 이종 유전자에서 발현되는 폴리펩타이드는 '이종 폴리펩타이드'로 지칭된다. 이종 유전자는 자연 발생하거나 조작될 수 있고, 야생형 또는 변이체일 수 있다. 이종 유전자는 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 이외의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이종 유전자는 야생형 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이)로서 숙주 게놈에서 자연 발생하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 목적 유전자(야생형 또는 변이체로서)를 함유하지만, 동일한 유전자 또는 이의 변이체가 예를 들어, 고도로 발현되는 유전자좌에서의 발현을 위한 외인성 공급원으로서 도입될 수 있다. 이종 유전자는 또한, 숙주 게놈에서 자연 발생하지 않거나 숙주 게놈에서 자연 발생하지 않는 이종 폴리펩타이드를 발현하는, 유전자일 수 있다. '이종 유전자', '외인성 유전자' 및 '이식 유전자'는 상호 교환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 이종 유전자 또는 이식 유전자는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 예를 들어 핵산 서열은 수령 세포에 대해 내인성이 아니다. 특정 구현예에서, 이종 유전자는 수령 세포에서 자연 발생하지 않는 AAT 핵산 서열을 포함할 수 있다. AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 엘라스테이스를 억제하는 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 이종 AAT는 삽입 부위 및 수령 세포에 관하여 이종일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, '돌연변이 SERPINA1' 또는 '돌연변이 SERPINA1 대립유전자'는 야생형 서열과 비교하여 SERPINA1 의 뉴클레오타이드 서열에 변화를 갖는 SERPINA1 서열을 지칭한다(NCBI 유전자 ID: 5265; NCBI NM_000295; 및 Ensembl: Ensembl:ENSG00000197249). 일부 구현예에서, 돌연변이 SERPINA1 대립유전자는 비기능성 또는 비분비되는 AAT 단백질을 암호화한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 'AATD' 또는 'A1AD'는 알파-1 항트립신 결핍을 지칭한다. AATD는 SERPINA1의 다양한 상이한 유전자 돌연변이에 의해 유발되는 질환 및 장애를 포함한다. AATD는 기능성 AAT가 감소된 수준으로 발현되거나(예를 들어, 대조군 샘플과 비교하여, 예를 들어, 혼탁측정법[nephelometry] 또는 면역혼탁법[immunoturbidimetry]에 의해 측정된, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 AAT 유전자 또는 단백질 발현, 예를 들어, 혈청에서 AAT가 약 100 mg/dL, 90 mg/dL, 80 mg/dL, 70 mg/dL, 60 mg/dL, 50 mg/dL, 40 mg/dL, 30 mg/dL, 20 mg/dL, 10 mg/dL, 또는 5 mg/dL 미만임), 기능성 AAT가 발현되지 않거나, 돌연변이 또는 비기능성 AAT가 발현된(예를 들어, 응집체를 형성하거나, 분비될 수 없거나, 단백질분해효소 활성이 감소된) 질환을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Greulich and Vogelmeier, Ther Adv Respir Dis 2016; Stoller and Aboussouan, Lancet, 2005]을 참조한다. 일부 구현예에서, AATD는 AAT가 세포내, 예를 들어 간실질세포에서 응집되거나 축적되고, 예를 들어 이것이 폐로 전달되어 단백질분해효소 억제제로서 기능할 수 있는 순환계로 분비되지 않는 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, AATD는, 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편의 PASD 염색에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, AATD는, 예를 들어 폐에서 호중구 엘라스테이스의 억제 감소에 의해 검출될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, '표적 서열'은 gRNA의 가이드 서열에 대해 상보성을 갖는 표적 유전자 내의 핵산의 서열을 지칭한다. 표적 서열 및 가이드 서열의 상호작용은 RNA-가이드 DNA 결합제가 표적 서열 내에서 결합 및 잠재적으로 틈내기 또는 절단(작용제의 활성에 따라)되도록 유도한다.

본원에서 사용된 바와 같이, '핵산 치료제'는 세포 내의 표적 핵산 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 길이의 뉴클레오타이드를 포함하는 치료제로 이해되며, 이러한 혼성화는, 예를 들어, 번역을 억제하거나 표적 핵산의 서열 특이적 분해를 촉진하거나 단백질을 암호화하는 DNA를 변화시킴으로써, 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 수준을 감소시켜, mRNA 또는 단백질 발현을 감소시킨다. 예시적 핵산 치료제는, 다이서 기질 [Dicer Substrate, ds]RNAi 작용제, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 작용제를 포함하는 RNAi 작용제; 또는 CISPR, TALEN, 또는 아연 핑거 핵산분해효소[zinc finger nuclease, ZFN]를 포함하는 RNA-가이드 DNA 결합제를 포함한다.

본원에서 상호 교환 가능하게 사용되는 용어 'iRNA', 'RNAi 작용제', 'iRNA 작용제', 'RNA 간섭제', 'siRNA', 'siRNA 작용제'는 본원에서 정의된 대로 RNA를 함유하고, 예를 들어, RNA-유도된 침묵 복합체[RNA-induced silencing complex, RISC] 경로를 통해 RNA 전사물의 표적 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭[RNA interference, RNAi]으로 공지된 공정을 통해 mRNA의 서열 특이적 분해를 유도한다. 일반적으로, 'iRNA'는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변형은 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. dsRNA 분자에 사용된 바와 같이, 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 'iRNA'에 포함된다. RNAi 작용제는 RISC 경로에 진입하기 전에 다이서에 의해 처리될 수 있거나 처리되지 않을 수 있다. 즉, RNAi 작용제는 표적 유전자의 발현을 감소시킴으로써 작용하여 표적 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 감소시키는 핵산 치료제이다. SERPINA1을 표적하는 예시적 iRNA 작용제는 예를 들어, WO2018098117, WO2015003113, 및 WO2015195628A2에 제공되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 사용된 'SERPINA1의 발현을 감소시키는 핵산 치료제' 등은 SERPINA1 RNA 및 SERPINA1에 의해 암호화된 A1AT 단백질, 또는 SERPINA1 RNA 및 SERPINA1에 의해 암호화된 단백질 둘 다의 수준을 감소시키는 핵산 치료제로서 이해된다. 일부 구현예에서, SERPINA1의 발현을 감소시키는 핵산 치료제는, SERPINA1을 암호화하는 mRNA의 분해를 촉진하거나 SERPINA1을 암호화하는 mRNA의 번역을 억제하는 치료제이다. 이러한 작용제는 핵산 치료제, 예를 들어, RNAi 간섭제 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 작용제는 전형적으로 내인성 야생형 및 돌연변이 SERPINA1 둘 다의 발현을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 내인성 SERPINA1의 발현은 억제될 수 있는 반면, 이종 SERPINA1의 발현은 이종 코딩 서열의 설계로 인해 억제되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, '정상' 또는 '건강한' 개체는 AATD-연관 대립유전자를 갖지 않는 개체를 포함한다. 예를 들어, AATD-연관 대립유전자는 ZZ, MZ 또는 SZ이다.

본원에서 사용된 '치료'는 대상에서 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하며, 질환의 억제, 이의 발생 저지, 질환의 하나 이상의 증상 완화, 질환의 치유, 또는 질환의 하나 이상의 증상의 예방을 포함한다. AATD는 폐 질환 또는 간 질환; 천명 또는 숨가쁨; 폐 감염의 위험 증가; 만성 폐쇄성 폐 질환[chronic obstructive pulmonary disease, COPD]; 기관지염, 천식, 호흡곤란; 간경변; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 또는 가래; 재발성 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰자위의 황변; 배 또는 다리의 부기와 연관될 수 있다. 예를 들어, AATD의 치료는 AATD의 증상, 예를 들어 간 또는 폐 증상을 완화시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 측정 시,예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL 넘게 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어, 치료 전후의 대조군과 비교하여, 기준선 혈청 AAT의 개선을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료는, 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, AATD와 연관된 간 질환의 조직학적 등급에 있어서, 예를 들어, 1, 2, 3 이상의 점수까지의 개선을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어, 치료 전후의 대조군과 비교하여 이삭 섬유증 점수의 개선을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료는 유전자형 혈청 수준, AAT 폐 기능, 폐활량 검사, 폐의 흉부 X-선, 폐의 CT 스캔, 간 기능의 혈액 검사, 또는 간의 초음파에서의 개선을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, '녹다운'은 특정한 유전자 생성물(예를 들어, 단백질, mRNA, 또는 둘 다)의 발현이 감소하는 것을 의미한다. 단백질의 녹다운은 예를 들어, 조직 또는 세포 집단(예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서)에 의해 분비되는 단백질을 검출하거나, 목적 조직 또는 세포 집단에서의 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정될 수 있다. mRNA의 녹다운을 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 목적 조직 또는 세포 집단에서 단리되는 mRNA의 서열 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, '녹다운'은 특정 유전자 생성물의 발현의 일부 손실, 예를 들어 전사되는 mRNA의 양의 감소 또는 (조직에서 발견되는 것과 같은 생체 내 집단을 포함하는) 세포 집단에 의해 발현되거나 분비되는 단백질의 양의 감소를 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 하나 이상의 세포에서(예를 들어, 조직에서 발견되는 것과 같은 생체 내 집단을 포함하는 세포 집단에서) 내인성 AAT를 '녹다운'시킨다. 연관 세포는 AAT를 생산할 수 있는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 (예를 들어, 이형접합 MZ 개체에서) 내인성 돌연변이 SERPINA1 대립유전자, 또는 내인성 야생형 SERPINA1 대립유전자를 녹다운한다.

본원에서 사용된 '녹아웃'은 세포에서 특정 단백질의 발현의 손실을 의미한다. 녹아웃은 조직 또는 세포 집단(예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서)에서 단백질 분비의 양을 검출하거나, 단백질 조직 또는 세포 집단에서 총 세포량을 검출함으로써 측정될 수 있다. 연관 세포는 AAT를 생성할 수 있는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 하나 이상의 세포(예를 들어, 조직에서 발견되는 것과 같은 생체 내 집단을 포함하는 세포 집단)에서 내인성 AAT를 '녹아웃'시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 (예를 들어, 이형접합 MZ 개체에서) 내인성 돌연변이 SERPINA1 대립유전자, 또는 내인성 야생형 SERPINA1 대립유전자를 녹아웃한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 세포에서 내인성 AAT 단백질의 발현의 완전한 손실이다.

본원에서 사용된 바와 같이 '폴리펩타이드'는 야생형 또는 변이체 단백질(예를 들어, 돌연변이, 단편, 융합체 또는 이의 조합)을 지칭한다. 변이체 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드의 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 기능성 활성을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 야생형 폴리펩타이드의 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩타이드는 과활성 변이체일 수 있다. 특정 경우에서, 변이체는 야생형 폴리펩타이드의 약 80% 내지 약 120%, 140%, 160%, 180%, 200% 기능성 활성을 보유한다.

본원에서 사용된 바와 같이, (본원에서 '양방향 작제물'과 상호 교환 가능하게 지칭되는) '양방향 핵산 작제물'은 적어도 두 개의 핵산 절편를 포함하되, 한 개의 절편(제1 절편)은 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 코딩 서열(코딩 서열은 본원에서 '이식 유전자' 또는 제1 이식 유전자로 지칭될 수 있음)을 포함하는 반면, 다른 절편(제2 절편)은 해당 서열의 상보적 서열이 목적 폴리펩타이드 또는 제2 이식 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. 즉, 적어도 두 개의 절편은 동일하거나 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 두 개의 절편이 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 경우, 제1 절편의 코딩 서열은 제2 절편의 서열의 상보적 서열과 동일할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 제2 절편의 서열은 제1 절편의 코딩 서열의 역 상보적 서열이다. 양방향 구조는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본원에 개시된 양방향 작제물은 임의의 목적 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 작제물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, '역 상보적 서열'은 참조 서열의 상보적 서열인 서열을 지칭하되, 상보적 서열은 역 배향으로 기재된다. 예를 들어, 가상 서열 5' CTGGACCGA 3'(서열 번호 500)의 경우, '완벽히' 상보적 서열은 3' GACCTGGCT 5'(서열 번호 501)이고, '완벽히' 역 상보적 서열은 5' TCGGTCCAG 3'(서열 번호 502)로 기재된다. 역 상보적 서열은 '완벽'할 필요는 없으며, 참조 서열과 동일한 폴리펩타이드 또는 유사한 폴리펩타이드를 여전히 암호화할 수 있다. 코돈 사용 빈도 중복성[redundancy]으로 인해, 역 상보적 서열은 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 참조 서열에서 분기할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, '역 상보적 서열'은 또한 참조 서열의 역 상보적 서열에, 예를 들어, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은, 제1 폴리펩타이드(제1 이식 유전자)를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 제1 절편, 및 해당 서열의 상보적 서열이 제2 폴리펩타이드(제2 이식 유전자)를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 예를 들어 50, 100, 200, 500, 1,000개 이상의 아미노산 잔기에 걸친 아미노산 서열을 포함한다.

'세이프 하버' 유전자좌는 유전자가 숙주 세포, 예를 들어 간실질세포상에서 현저하게 해로운 영향 없이, 예를 들어, 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않거나, 대조군 세포와 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40%가 넘는 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않고 삽입될 수 있는 게놈 내의 유전자좌다. 예를 들어, 문헌[Hsin et al., 'Hepatocyte death in liver inflammation, fibrosis, and tumori유전자sis,' 2017]을 참조한다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자좌는 숙주 세포, 예를 들어 간실질세포상에서 현저하게 해로운 영향 없이, 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않거나, 대조군 세포와 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40%가 넘는 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않고, 외인성 유전자가 과발현할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 바람직한 세이프 하버 유전자좌는 삽입된 유전자 서열의 발현이 인접 유전자로부터의 연속판독[read-through] 발현에 의해 교란되지 않는 것일 수 있다. 세이프 하버는 알부민 유전자, 예컨대 인간 알부민 유전자 내에 있을 수 있다. 세이프 하버는 알부민 인트론 1 영역, 예를 들어, 인간 알부민 인트론 1 내에 있을 수 있다. 세이프 하버는, 예를 들어, 간 조직 또는 간실질세포 숙주 세포를 위한 인간 세이프 하버일 수 있다. 일부 구현예에서, 세이프 하버는 숙주 세포 또는 세포 집단, 예컨대 간실질세포 또는 간세포상에서 현저하게 해로운 영향 없이, 예를 들어 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않거나, 대조군 세포와 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40%가 넘는 아포토시스, 괴사 또는 노화를 일으키지 않고, 외인성 유전자가 과발현할 수 있게 한다.

일부 구현예에서, 유전자는 세이프 하버 유전자좌 내로 삽입될 수 있고, 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열, 예를 들어 엑손 1에 의해 암호화된 알부민 신호 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 인간 알부민 엑손 1의 신호 서열의 하류에서 이에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 유전자는 그 자신의 신호 서열을 포함할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입될 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 신호 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 암호화된 인간 알부민의 신호 서열의 하류에서 이에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 유전자는 그 자신의 신호 서열 및 내부 라이보솜 진입 부위[internal ribosomal entry site, IRES]를 포함할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입될 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, AAT 신호 서열 및 IRES 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 암호화된 인간 알부민의 신호 서열의 하류에서 이에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 유전자는 그 자신의 신호 서열 및 IRES를 포함할 수 있고, 세이프 하버 유전자좌에 삽입될 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌의 내인성 신호 서열을 사용하지 않는다. 예를 들어, AAT 신호 서열 및 IRES 서열을 포함하는 AAT 코딩 서열은 인간 알부민 인트론 1 내로 삽입되어, 엑손 1에 의해 암호화된 인간 알부민의 신호 서열과 융합될 수 있다. 이들 구현예에서, 단백질은 IRES 부위에서 번역되고, 키메라성(예를 들어, AAT 단백질에 융합되는 알부민 신호 펩타이드)은 아니며, 이는 유리하게는 비면역원성 또는 저면역원성일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 세포 외로 분비되거나 수송되지 않는다.

일부 구현예에서, 유전자는 세이프 하버 유전자좌 내로 삽입될 수 있고, IRES를 포함할 수 있으며, 임의의 신호 서열을 사용하지 않는다. 예를 들어, IRES 서열을 포함하고 AAT 신호 서열은 포함하지 않는 AAT 코딩 서열은, 인간 알부민 인트론 1에 삽입되어, 엑손 1에 의해 암호화된 인간 알부민의 신호 서열과 융합되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 임의의 신호 서열에 대한 필요성 없이 IRES 부위에서 번역된다. 일부 구현예에서, 단백질은 세포 외로 수송되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 유사분열 세포 분열을 겪지 않는 세포는 '비분열' 세포로 지칭된다. '비분열' 세포는 유사분열 세포 분열을 전혀 또는 거의 겪지 않는 세포 유형, 예를 들어, 여러 유형의 뉴런을 포함한다. '비분열' 세포는 또한 유사분열 세포 분열을 겪을 수 있지만 겪지 않거나 겪을 예정인 세포, 예를 들어 정지 세포를 포함한다. 간세포는, 예를 들어 분열 능력을 유지하지만(예를 들어, 손상 또는 절제되었을 때), 일반적으로 분열하지 않는다. 유사분열 세포 분열 동안 상동성 재조합은 게놈이 보호되고 이중 가닥 절단이 복구되는 메커니즘이다. 일부 구현예에서, '비분열' 세포는, 예를 들어 대조군 분열 세포와 비교하여 상동성 재조합[homologous recombination, HR]이 세포에서 이중 가닥 DNA 절단이 복구되는 일차 메커니즘이 아닌 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, '비분열' 세포는, 예를 들어 대조군 분열 세포와 비교하여 비상동성 말단 접합[non-homologous end joining, NHEJ]이 세포에서 이중 가닥 DNA 절단이 복구되는 일차 메커니즘인 세포를 지칭한다.

비분열 세포 유형은, 예를 들어 활성 NHEJ 이중 가닥 DNA 절단 복구 메커니즘에 의해 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Iyama, DNA Repair (Amst.) 2013, 12(8): 620-636]를 참조한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포, 근육 세포, 또는 뉴런 세포를 포함하되 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간실질세포, 예컨대 마우스, 시노몰구스, 또는 인간의 간실질세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 근세포, 예컨대 마우스, 시노몰구스, 또는 인간의 근세포이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양방향 작제물을 포함하는, 전술한 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 양방향 작제물에 의해 암호화된 이식 유전자 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 형성되는 숙주 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 양방향 핵산 작제물, 및 유전자 편집 시스템, 예컨대 ZFN, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9 시스템을 숙주 세포에 투여하거나 또는 전달함으로써 형성된다.

Ⅱ. 조성물

A. 세이프 하버 알부민 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 또는 SERPINA1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물

알부민 가이드 RNA 조성물, AAT 주형 조성물, 및 게놈 유전자좌, 예컨대 숙주 세포의 세이프 하버 유전자좌 내에 이종 AAT 유전자(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)를 삽입 및 발현하는 데 유용한 방법이 본원에 제공된다. 특히, 본원에 예시되는 바와 같이, 알부민 유전자좌(예를 들어, 인트론 1)에서 이종 AAT 유전자를 표적 및 삽입함으로써, 알부민의 내인성 프로모터를 사용하여 이종 AAT 유전자의 강력한 발현을 구동할 수 있다. 알부민 유전자의 인트론 1 내의 부위를 특이적으로 표적하는 알부민 가이드 RNA, 대체 코돈 사용 빈도를 갖는 SERPINA1 핵산 서열, 및 대체 코돈 사용 빈도를 갖고 SERPINA1 핵산이 아닌 내인성 SERPINA1 핵산에 결합하는, 알부민 가이드 RNA의 식별에 본 개시는 부분적으로 기초한다. 실시예에 나와있고 본원에 더 기재된 바와 같이, AAT 이식유전자의 발현은 내인성 SERPINA1 핵산을 특이적으로 표적하는 gRNA(또는 siRNA)의 동시 또는 비동시 투여에 의해 영향을 받지 않는다.

일부 구현예에서, 예를 들어 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소)와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA 및 이종 AAT 핵산('AAT 이식유전자')을 포함하는 작제물(예를 들어, 공여자 작제물 또는 주형)을 사용하여, 유전자좌, 예컨대 숙주 세포의 알부민 유전자좌(예를 들어, 인트론 1) 내에 이종 AAT 유전자(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)를 도입 또는 삽입하는 데 유용한 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, RNA-가이드 DNA-결합제 및 이종 AAT 핵산을 포함하는 작제물(예를 들어, 공여자)와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA를 사용하여, 숙주세포의 알부민 유전자좌에서 이종 AAT 유전자를 발현하는 데 유용한 조성물이 본원에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 RNA-가이드 DNA 결합제와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA 및 이종 AAT 핵산을 포함하는 양방향 작제물을 사용하여 숙주 세포의 알부민 유전자좌에서 이종 AAT를 발현에 유용한 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 RNA-가이드 DNA-결합제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 함께 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA를 사용하여, 숙주 세포의 알부민 유전자 내 절단(예를 들어, 이중 가닥 절단[DSB] 또는 단일 가닥 절단[single-stranded break, SSB 또는 틈새(nick)])을 유도하는 데 유용한 조성물이 본원에 개시된다. 조성물은 예를 들어, AATD를 치료하기 위해 시험관 내 또는 생체 내에서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 알부민 유전자좌의 인트론 내에서 결합하거나 결합할 수 있는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 1의 인간 알부민 유전자의 인트론 1의 영역 내에서 결합한다. 알부민 가이드 서열의 모든 염기가 언급된 영역 내에서 결합해야 하는 것은 아님이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 염기는 언급된 영역 내에서 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 인접 염기는 언급된 영역 내에서 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 인간 알부민(서열 번호 1)의 인트론 1 내의 부위에서 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소)에 의한 표적 특이적 절단을 매개한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 상기 영역에 결합하거나 결합할 수 있는 가이드 서열을 포함한다는 것이 이해될 것이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 가이드 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 갖는 가이드 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA(gRNA)는 다음에서 선택된 가이드 서열을 포함한다. a) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드; c) 서열 번호 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; d) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드; f) 서열 번호 34-97로 이루어진 군에서 선택되는 서열, 및 g) 서열 번호 2-33에 나열된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오타이드 +/- 다섯 개 뉴클레오타이드에 상보적인 서열. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 표 1을 참조한다.

인간 알부민 인트론 1: (서열 번호 1)

알부민 표적 인간 가이드 RNA 서열 및 염색체 좌표

가이드 ID	가이드 서열	게놈 좌표	서열 번호
G009844	GAGCAACCUCACUCUUGUCU	chr4:73405113-73405133	2
G009851	AUGCAUUUGUUUCAAAAUAU	chr4:73405000-73405020	3
G009852	UGCAUUUGUUUCAAAAUAUU	chr4:73404999-73405019	4
G009857	AUUUAUGAGAUCAACAGCAC	chr4:73404761-73404781	5
G009858	GAUCAACAGCACAGGUUUUG	chr4:73404753-73404773	6
G009859	UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA	chr4:73404727-73404747	7
G009860	UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU	chr4:73404722-73404742	8
G009861	UAGUGCAAUGGAUAGGUCUU	chr4:73404715-73404735	9
G009866	UACUAAAACUUUAUUUUACU	chr4:73404452-73404472	10
G009867	AAAGUUGAACAAUAGAAAAA	chr4:73404418-73404438	11
G009868	AAUGCAUAAUCUAAGUCAAA	chr4:73405013-73405033	12
G009874	UAAUAAAAUUCAAACAUCCU	chr4:73404561-73404581	13
G012747	GCAUCUUUAAAGAAUUAUUU	chr4:73404478-73404498	14
G012748	UUUGGCAUUUAUUUCUAAAA	chr4:73404496-73404516	15
G012749	UGUAUUUGUGAAGUCUUACA	chr4:73404529-73404549	16
G012750	UCCUAGGUAAAAAAAAAAAA	chr4:73404577-73404597	17
G012751	UAAUUUUCUUUUGCGCACUA	chr4:73404620-73404640	18
G012752	UGACUGAAACUUCACAGAAU	chr4:73404664-73404684	19
G012753	GACUGAAACUUCACAGAAUA	chr4:73404665-73404685	20
G012754	UUCAUUUUAGUCUGUCUUCU	chr4:73404803-73404823	21
G012755	AUUAUCUAAGUUUGAAUAUA	chr4:73404859-73404879	22
G012756	AAUUUUUAAAAUAGUAUUCU	chr4:73404897-73404917	23
G012757	UGAAUUAUUCUUCUGUUUAA	chr4:73404924-73404944	24
G012758	AUCAUCCUGAGUUUUUCUGU	chr4:73404965-73404985	25
G012759	UUACUAAAACUUUAUUUUAC	chr4:73404453-73404473	26
G012760	ACCUUUUUUUUUUUUUACCU	chr4:73404581-73404601	27
G012761	AGUGCAAUGGAUAGGUCUUU	chr4:73404714-73404734	28
G012762	UGAUUCCUACAGAAAAACUC	chr4:73404973-73404993	29
G012763	UGGGCAAGGGAAGAAAAAAA	chr4:73405094-73405114	30
G012764	CCUCACUCUUGUCUGGGCAA	chr4:73405107-73405127	31
G012765	ACCUCACUCUUGUCUGGGCA	chr4:73405108-73405128	32
G012766	UGAGCAACCUCACUCUUGUC	chr4:73405114-73405134	33

본원에 개시된 가이드 RNA는 표적 특이적 절단을 매개하여 이중 가닥 절단[DSB]을 초래한다. 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 표적 특이적 절단을 매개하여 단일 가닥 절단[SSB 또는 틈새]을 초래한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 프로토스페이서 인접 모티프[protospacer adjacent motif, PAM]의 상류 영역에 결합한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, PAM 서열은 표적 서열을 함유하는 가닥에 대향하는 가닥에서 발생한다. 즉, PAM 서열은 표적 가닥(가이드 RNA가 결합하는 표적 서열을 함유하는 가닥)의 상보적 가닥에 있다. 일부 구현예에서, PAM은 NGG, NNGRRT, NNGRR(N), NNAGAAW, NNNNG(A/C)TT, 및 NNNNRYAC으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, PAM은 NGG이다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 가이드 RNA 서열은 PAM 서열에 인접한 서열에 상보적이다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열은 인간 참조 게놈 hg38에서의 좌표에 따라 본원의 표에서 선택된 게놈 영역 내의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열은 본원의 표에서 선택된 게놈 영역 내에서 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열은 본원의 표에서 선택된 게놈 영역에 걸쳐 있는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

본원에 개시된 가이드 RNA는 이중 가닥 절단[DSB]을 초래하는 표적 특이적 절단을 매개한다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 표적 특이적 절단을 매개하여, 단일 가닥 절단[SSB 또는 틈새]을 초래한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, 본원에 개시된 Cas 핵산분해효소)에 의한 표적 특이적 절단을 매개하되, 생성된 절단 부위는 알부민 유전자의 인트론 1 내에서 이종 AAT 핵산(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)이 삽입될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 절단 부위는 이종 AAT 유전자가 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 삽입될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 절단 부위는 이종 AAT 유전자가 25-90%, 25-80%, 25-70%, 25-50%, 35-80% 또는 35-70% 삽입될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 절단 부위는 이종 AAT 핵산이 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 삽입될 수 있게 한다. 삽입 속도는 시험관 내 또는 생체 내에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 삽입 비율은, 세포 집단 내에서 삽입된 이종 AAT 핵산을 검출 및 측정하고, 삽입된 이종 AAT 핵산을 함유하는 집단의 백분율을 계산하여 측정될 수 있다. 삽입 비율을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있고 이용할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 삽입 부위의 서열 분석 또는 목적 조직 또는 세포 집단에서 단리되는 mRNA의 서열 분석을 포함한다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA는 이종 AAT 유전자가 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 99% 이상 증가된 발현 또는 분비를 할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, RNA는 AAT 발현의 정상 하한치의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 허용한다. 특정 구현예에서, 발현되는 수준은 내인성 단백질 및 이종 단백질의 조합이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 증가된 발현 또는 분비는, AAT 폴리펩타이드 수준을 검출 및 측정하고, 예를 들어 세포를 치료하거나 대상에게 투여하기 전의 수준을 AAT 폴리펩타이드 수준과 비교하여 측정될 수 있다. 이종 AAT 유전자의 증가된 발현 또는 분비는 시험관 내 또는 생체 내에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, AAT의 분비 또는 발현은 조직 또는 세포 집단(예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서)에 의해 분비되는 단백질을 검출함으로써 또는 예를 들어 효소 연결 면역흡착 검정[enzyme-linked immunosorbent assa, ELISA], HPLC, 질량 분광법[예를 들어, 액체 질량 분광법(예를 들어, LC-MS, LC-MS/MS)], 또는 배양 배지 또는 세포 또는 조직(예를 들어, 간) 추출물을 사용한 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 목적 조직 또는 세포 집단에서 단백질의 총 세포량을 검출함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비 또는 발현은 일차 인간 간실질세포, 예를 들어 배지 또는 세포 샘플에서 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비는 HUH7 세포, 예를 들어 배지 샘플에서 측정된다. 일부 구현예에서, 사용된 세포는 HUH7 세포이다. 일부 구현예에서, AAT의 양을 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소[glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH](살림유전자)의 양과 비교하여 세포 수의 변화를 조절한다. 일부 구현예에서, AAT는, 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편의 PASD 염색에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, AAT는, 예를 들어 폐에서 호중구 엘라스테이스의 억제를 측정함으로써 평가될 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA는 이종 AAT 유전자(예를 들어 기능성 또는 야생형 AAT)의 발현으로 인해 발생하는 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 99% 이상 증가된 활성을 허용한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 AATD를 앓고 있지 않은 대상에서 AAT의 정상 하한치의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 활성 수준을 허용한다. 특정 구현예에서, 활성은 내인성 단백질과 이종 단백질의 조합이다. 예를 들어, 증가된 활성은 단백질분해효소 억제제 활성 수준을 검출 및 측정하고, 해당 수준을 예를 들어, 세포를 치료하거나 대상에 투여하기 전의 활성 수준과 비교함으로써 측정될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 이용가능하고 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Mullins et al., "Standardized automated assay for functional alpha 1-antitrypsin," 1984 및 Eckfeldt et al., "Automated assay for alpha-1-antitiypsin with N-a-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide astrypsin substrate and standardized with p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoateastitrant fortrypsinactivesites," 1982]을 참조한다.

일부 구현예에서, 인간 알부민 유전자좌(서열 번호 1의)의 인트론 1 내의 표적 서열 또는 영역은 알부민 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 적어도 한 개의 불일치를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있되, 가이드 서열의 총 길이는 약 20 또는 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1-4개의 불일치를 함유할 수 있되, 가이드 서열은 약 20개 또는 20개의 뉴클레오타이드이다.

본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 알부민 가이드 RNA는 내인성 SERPINA1 유전자(예를 들어, 돌연변이 SERPINA1 유전자)를 녹다운 또는 녹아웃하기 위해 SERPINA1 가이드 RNA와 조합하여 알부민 유전자의 인트론 1에서 이종 AAT 유전자(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)를 삽입 또는 발현하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas9)를 SERPINA1 내의 표적 DNA 서열로 유도하는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 조성물을 포함한다. gRNA는 표 2에 나타낸 가이드 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호 1,000-1,131 중 어느 하나의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 서열 번호 1,000-1,131에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 SERPINA1 gRNA가 본 개시에 제공된다.

다른 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1,000-1,131의 가이드 서열 중 임의의 두 개 이상에서 선택된 가이드 서열을 포함하는 적어도 두 개의 SERPINA1 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열 번호 1,000-1,131 핵산 중 임의의 것과 각각 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 적어도 두 개의 gRNA를 포함한다.

본원에서 제공된 SERPINA1 가이드 RNA 조성물은 SERPINA1 유전자에서 표적 서열을 인식하도록 설계된다. 예를 들어, SERPINA1 표적 서열은 제공된 RNA-가이드 DNA 결합제에 의해 인식 및 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 SERPINA1 가이드 RNA에 의해 SERPINA1 유전자의 표적 서열로 유도될 수 있되, 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 Cas 단백질은 표적 서열을 절단한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 SERPINA1 가이드 RNA의 선택은 SERPINA1 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 측정된다.

임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 유전자의 임계 영역에서의 돌연변이는 유전자의 비임계 영역에서의 돌연변이보다 덜 허용적일 수 있고, 이에 따라 DSB의 위치는 발생할 수 있는 단백질 녹다운 또는 녹아웃의 양이나 유형에서 중요한 인자이다. 일부 구현예에서, SERPINA1 내의 표적 서열에 상보적이거나 상보성을 갖는 SERPINA1 gRNA는 Cas 단백질을 SERPINA1 유전자의 특정 위치로 유도하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, SERPINA1 gRNA는 SERPINA1의 2번, 3번, 4번, 또는 5번 엑손에서 표적 서열에 상보적이거나 또는 상보성을 갖는 가이드 서열을 갖도록 설계된다.

일부 구현예에서, SERPINA1 gRNA는 AAT의 N 말단 영역을 코딩하는 SERPINA1 엑손의 표적 서열에 상보적이거나 상보성을 갖도록 설계된다.

[표 2]

SERPINA1 표적 및 대조군 가이드 서열 명명법, 염색체 좌표 및 서열

본원에 기재된 알부민 가이드 서열 및 SERPINA1 가이드 서열 각각은 추가 뉴클레오타이드를 더 포함하여, 예를 들어, 3' 말단에서 가이드 서열에 이어서 오는 다음의 예시적 뉴클레오타이드 서열 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(서열 번호 900)를 5'에서 3' 배향으로 갖는 crRNA 또는 가이드 RNA를 형성할 수 있다. sgRNA의 경우, 위의 가이드 서열(서열 번호 2-33의 표 1 및 서열 번호 1,000-1,131의 표 2 각각에 나타낸 알부민 가이드 서열 및 SERPINA1 가이드 서열)은 추가의 뉴클레오타이드를 더 포함하여, 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단에 이어서 오는 다음의 예시적 뉴클레오타이드 서열 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(서열 번호 901)를 5'에서 3' 배향으로 갖는 sgRNA를 형성할 수 있다.

sgRNA의 경우, 가이드 서열은 다음의 변형된 모티프 mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열 번호 300)로 통합될 수 있되, 'N'은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드, 바람직하게는 RNA 뉴클레오타이드일 수 있고, 뉴클레오타이드의 당 모이어티는 라이보스, 디옥시라이보스 또는 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있으며, m은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드이고, *는 뉴클레오타이드 잔기 사이의 포스포로싸이오에이트 연결이고, N'은 집합적으로 가이드 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

sgRNA의 경우, 가이드 서열은 SpyCas9 sgRNA 서열을 더 포함할 수 있다. 아래에 나타낸 SpyCas9 sgRNA 서열의 예는(서열 번호 902: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC - '예시적 SpyCas9 sgRNA-1'), 가이드 서열의 3' 말단에 포함되어 있으며, 아래의 표에 나타낸 바와 같이 도메인과 함께 제공된다. LS는 하부 줄기[lower stem]이다. B는 돌출부[bulge]이다. US는 상부 줄기[upper stem]이다. H1 및 H2는 각각 헤어핀 1 및 헤어핀 2이다. 집합적으로 H1 및 H2는 헤어핀 영역으로 지칭된다. 구조의 모델은 본원에 참조로 포함되는 WO2019237069의 도 10a에 제공된다.

예시적 SpyCas9 sgRNA-1의 뉴클레오타이드 서열은 특정 화학적 변형, 서열 치환 및 절두를 위한 주형 서열로서 작용할 수 있다.

특정 구현예에서, gRNA는, 예를 들어, sgRNA 또는 dgRNA이고, 임의로 화학적 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 sgRNA는 가이드 서열 및 SpyCas9 sgRNA 서열, 예를 들어 예시적 SpyCas9 sgRNA-1을 포함한다. gRNA, 예컨대 sgRNA는 하나 이상의 말단 뉴클레오타이드에서, 예를 들어, 3' 말단 또는 5' 말단에서의 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드에서, 가이드 서열의 5' 말단 및/또는 SpyCas9 sgRNA 서열, 예를 들어 예시적 SpyCas9 sgRNA-1의 3' 말단에서의 변형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-methyl, 2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)[2'-O-(2-methoxyethyl), 2'-O-moe] 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-fluoro, 2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(phosphorothioate, PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 PS 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드 및 PS 연결을 포함한다.

특정 구현예에서, 서열 번호 201('예시적 SpyCas9 sgRNA-1')을 예로서 사용하여, 예시적 SpyCas9 sgRNA-1은 다음 중 하나 이상을 더 포함한다.

A. 단축된 헤어핀 1 영역 또는 치환되고 임의로 단축된 헤어핀 1 영역, 여기서

1. 다음의 뉴클레오타이드 쌍 H1-1 및 H1-12, H1-2 및 H1-11, H1-3 및 H1-10, 또는 H1-4 및 H1-9 중 적어도 한 개는 헤어핀 1에서 왓슨 크릭 짝짓기 뉴클레오타이드로 치환되고, 헤어핀 1 영역은

a. H1-5부터 H1-8까지 중 임의의 한 개 또는 두 개,

b. 다음의 뉴클레오타이드 쌍 H1-1 및 H1-12, H1-2 및 H1-11, H1-3 및 H1-10, 그리고 H1-4 및 H1-9 중 한 개, 두 개, 또는 세 개, 또는

c. 헤어핀 1 영역 중 1-8개의 뉴클레오타이드가 임의로 결여되어 있음; 또는

2. 단축된 헤어핀 1 영역은 4-8개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 4-6개의 뉴클레오타이드가 결여되어 있음; 그리고

a. 위치 H1-1, H1-2, 또는 H1-3 중 하나 이상은 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 201)에 상대적으로 결실되거나 치환됨; 또는

b. 위치 H1-6 내지 H1-10 중 하나 이상은 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 902)과 상대적으로 치환됨; 또는

3. 단축된 헤어핀 1 영역은 5-10개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5-6개의 뉴클레오타이드가 결여되어 있고, 위치 N18, H1-12, 또는 n 중 하나 이상은 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 902)에 상대적으로 치환됨; 또는

B. 단축된 상부 줄기 영역, 여기서 단축된 상부 줄기 영역은 1-6개의 뉴클레오타이드가 결여되어 있고, 단축된 상부 줄기 영역의 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 뉴클레오타이드는 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 201)에 상대적으로 네 개 이하의 치환을 포함함; 또는

C. LS6, LS7, US3, US10, B3, N7, N15, N17, H2-2 및 H2-14 중 임의의 하나 이상에서 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 902)에 상대적인 치환, 여기서 치환기 뉴클레오타이드는 아데닌이 후행하는 피리미딘도 아니고, 피리미딘이 선행하는 아데닌도 아님; 또는

D. 상부 줄기 영역을 갖는 예시적 SpyCas9 sgRNA-1(서열 번호 902), 여기서 상부 줄기 변형은 상부 줄기 영역의 US1-US12 중 임의의 하나 이상에 대한 변형을 포함하되,

1. 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 임의로 선택됨; 또는

2. 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 임의로 포함함.

특정 구현예에서, 예시적 SpyCas9 sgRNA-1, 또는 sgRNA, 예컨대 예시적 SpyCas9 sgRNA-1을 포함하는 sgRNA는 3' 꼬리, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드의 3' 꼬리를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 꼬리는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 사이의 PS 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 사이의 PS 연결을 포함한다.

특정 구현예에서, 헤어핀 영역은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 구현예에서, 상부 줄기 영역은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 구현예에서, 예시적 SpyCas9 sgRNA-1은 하나 이상의 YA 다이뉴클레오타이드를 포함하되, Y는 피리미딘이고, YA 다이뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이의 포스포로싸이오에이트(PS) 연결, 반전된 무염기 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 구현예에서, 예시적 SpyCas9 sgRNA-1은 하나 이상의 YA 다이뉴클레오타이드를 포함하되, Y는 피리미딘이고, YA 다이뉴클레오타이드는 치환된 뉴클레오타이드, 즉 서열 치환된 뉴클레오타이드를 포함하되, 피리미딘은 퓨린에 대해서 치환된다. 특정 구현예에서, 피리미딘이 단일 가이드에서 왓슨 크릭 염기쌍을 형성하는 경우, 치환된 피리미딘 뉴클레오타이드의 왓슨 크릭 염기 뉴클레오타이드가 치환되어 왓슨 크릭 염기쌍을 유지한다.

예시적 spyCas9 sgRNA-1(서열 번호 902)

[표 3]

인간 sgRNA 및 변형 패턴

마우스 알부민 가이드 RNA

가이드 ID	가이드 서열	마우스 게놈 좌표(mm10)	서열 번호
G000551	AUUUGCAUCUGAGAACCCUU	chr5:90461148-90461168	98
G000552	AUCGGGAACUGGCAUCUUCA	chr5:90461590-90461610	99
G000553	GUUACAGGAAAAUCUGAAGG	chr5:90461569-90461589	100
G000554	GAUCGGGAACUGGCAUCUUC	chr5:90461589-90461609	101
G000555	UGCAUCUGAGAACCCUUAGG	chr5:90461151-90461171	102
G000666	CACUCUUGUCUGUGGAAACA	chr5:90461709-90461729	103
G000667	AUCGUUACAGGAAAAUCUGA	chr5:90461572-90461592	104
G000668	GCAUCUUCAGGGAGUAGCUU	chr5:90461601-90461621	105
G000669	CAAUCUUUAAAUAUGUUGUG	chr5:90461674-90461694	106
G000670	UCACUCUUGUCUGUGGAAAC	chr5:90461710-90461730	107
G011722	UGCUUGUAUUUUUCUAGUAA	chr5:90461039-90461059	108
G011723	GUAAAUAUCUACUAAGACAA	chr5:90461425-90461445	109
G011724	UUUUUCUAGUAAUGGAAGCC	chr5:90461047-90461067	110
G011725	UUAUAUUAUUGAUAUAUUUU	chr5:90461174-90461194	111
G011726	GCACAGAUAUAAACACUUAA	chr5:90461480-90461500	112
G011727	CACAGAUAUAAACACUUAAC	chr5:90461481-90461501	113
G011728	GGUUUUAAAAAUAAUAAUGU	chr5:90461502-90461522	114
G011729	UCAGAUUUUCCUGUAACGAU	chr5:90461572-90461592	115
G011730	CAGAUUUUCCUGUAACGAUC	chr5:90461573-90461593	116
G011731	CAAUGGUAAAUAAGAAAUAA	chr5:90461408-90461428	117
G013018	GGAAAAUCUGAAGGUGGCAA	chr5:90461563-90461583	118
G013019	GGCGAUCUCACUCUUGUCUG	chr5:90461717-90461737	119

[표 5]

마우스 알부민 가이드 sgRNA 및 변형 패턴

시노몰구스 알부민 가이드 RNA

가이드 ID	가이드 서열	시노몰구스 게놈 좌표(mf5)	서열 번호
G009844	GAGCAACCUCACUCUUGUCU	chr5:61198711-61198731	2*
G009845	AGCAACCUCACUCUUGUCUG	chr5:61198712-61198732	165
G009846	ACCUCACUCUUGUCUGGGGA	chr5:61198716-61198736	166
G009847	CCUCACUCUUGUCUGGGGAA	chr5:61198717-61198737	167
G009848	CUCACUCUUGUCUGGGGAAG	chr5:61198718-61198738	168
G009849	GGGGAAGGGGAGAAAAAAAA	chr5:61198731-61198751	169
G009850	GGGAAGGGGAGAAAAAAAAA	chr5:61198732-61198752	170
G009851	AUGCAUUUGUUUCAAAAUAU	chr5:61198825-61198845	3*
G009852	UGCAUUUGUUUCAAAAUAUU	chr5:61198826-61198846	4*
G009853	UGAUUCCUACAGAAAAAGUC	chr5:61198852-61198872	173
G009854	UACAGAAAAAGUCAGGAUAA	chr5:61198859-61198879	174
G009855	UUUCUUCUGCCUUUAAACAG	chr5:61198889-61198909	175
G009856	UUAUAGUUUUAUAUUCAAAC	chr5:61198957-61198977	176
G009857	AUUUAUGAGAUCAACAGCAC	chr5:61199062-61199082	5*
G009858	GAUCAACAGCACAGGUUUUG	chr5:61199070-61199090	6*
G009859	UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA	chr5:61199096-61199116	7*
G009860	UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU	chr5:61199101-61199121	8*
G009861	UAGUGCAAUGGAUAGGUCUU	chr5:61199108-61199128	9*
G009862	AGUGCAAUGGAUAGGUCUUA	chr5:61199109-61199129	182
G009863	UUACUUUGCACUUUCCUUAG	chr5:61199186-61199206	183
G009864	UACUUUGCACUUUCCUUAGU	chr5:61199187-61199207	184
G009865	UCUGACCUUUUAUUUUACCU	chr5:61199238-61199258	185
G009866	UACUAAAACUUUAUUUUACU	chr5:61199367-61199387	10*
G009867	AAAGUUGAACAAUAGAAAAA	chr5:61199401-61199421	11*
G009868	AAUGCAUAAUCUAAGUCAAA	chr5:61198812-61198832	12*
G009869	AUUAUCCUGACUUUUUCUGU	chr5:61198860-61198880	189
G009870	UGAAUUAUUCCUCUGUUUAA	chr5:61198901-61198921	190
G009871	UAAUUUUCUUUUGCCCACUA	chr5:61199203-61199223	191
G009872	AAAAGGUCAGAAUUGUUUAG	chr5:61199229-61199249	192
G009873	AACAUCCUAGGUAAAAUAAA	chr5:61199246-61199266	193
G009874	UAAUAAAAUUCAAACAUCCU	chr5:61199258-61199278	13
G009875	UUGUCAUGUAUUUCUAAAAU	chr5:61199322-61199342	195
G009876	UUUGUCAUGUAUUUCUAAAA	chr5:61199323-61199343	196

위의 '*'로 표시된 서열 번호는 이 표시된 gRNA가 시노몰구스 및 인간 둘 다에 적용가능함을 나타낸다.

[표 7]

시노몰구스 sgRNA 및 변형 패턴

위의 '*'로 표시된 서열 번호는 이 표한 sgRNA가 시노몰구스 및 인간 둘 다에 적용가능함을 나타낸다.

[표 8]

SERPINA sgRNA 및 변형

위의 '^*'로 표시된 서열 번호는 이 표시된 gRNA가 시노몰구스 및 인간 둘 다에 적용가능함을 나타낸다.

알부민 또는 SERPINA1 가이드 RNA는 trRNA를 더 포함할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA[sgRNA]로서 회합될 수 있거나 별도의 RNA(dgRNA] 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA의 성분은 예를 들어 포스포다이에스터 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 포스포다이에스터 연결이 아닌 뉴클레오타이드 사이의 하나 이상의 연결을 포함한다.

본원에 기재된 조성물, 용도 및 방법 구현예 각각에서, 가이드 RNA는 '이중 가이드 RNA' 또는 'dgRNA'로서 두 개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는 예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유 연결되지 않을 수 있지만, crRNA 및 trRNA의 부분 사이의 염기 짝짓기를 통해 RNA 이중복합체를 형성할 수 있다.

본원에 기재된 조성물, 용도 및 방법 구현예 각각에서, 가이드 RNA(알부민 gRNA 또는 SERPINA1 gRNA)은 '단일 가이드 RNA' 또는 'sgRNA'로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유 연결되는 표 1 또는 표 2에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA(또는 이의 부분)를 포함할 수 있다. sgRNA는 표 1 또는 표 2에 나타낸 가이드 서열의 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유 연결된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 crRNA 및 trRNA의 부분 사이의 염기 짝짓기를 통해 줄기-루프 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 포스포다이에스터 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열 번호 34-67 또는 120-163 중 어느 하나에 나타낸 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열 번호 2-33, 98-119, 165-170, 172, 174-176, 182-185, 189-193, 195-193, 195, 또는 196의 가이드 서열 중 어느 하나 및 서열 번호 901 또는 902의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 포함하되, 서열 번호 901 또는 902의 뉴클레오타이드는 가이드 서열의 3' 말단에 있고, sgRNA는 표 9, 11 또는 13 또는 서열 번호 300에 나타낸 바와 같이 변형될 수 있다.

일부 구현예에서, trRNA는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템에서 유래되는 trRNA 서열의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, trRNA는 절두된 또는 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 구현예에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 100개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, trRNA는, 예를 들어 특정 이차 구조, 예컨대 하나 이상의 헤어핀 또는 줄기-루프 구조, 또는 하나 이상의 돌출부 구조를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제제는 본원에 기재된 바와 같이 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 개방형 판독틀[open reading frame, ORF]을 포함하는 mRNA, 예컨대 예컨대 Cas 핵산분해효소를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA, 예컨대 Cas 핵산분해효소가 제공되거나, 사용되거나, 투여된다.

C. 변형된 gRNA 및 mRNA

일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA(예를 들어, 알부민 또는 SERPINA1 gRNA)는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA는 정준 A, G, C 및 U 잔기 대신에 또는 이에 더하여 사용된 하나 이상의 비자연 또는 자연 발생 성분 또는 형태의 존재를 기재하기 위해, '변형된' gRNA 또는 '화학적으로 변형된' gRNA로 불린다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 비정준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 합성되며, 여기에서 '변형된'으로 불린다. 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (i) 포스포다이에스터 골격 연결에서 비연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다의, 또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어 대체(예시적 골격 변형); (ii) 라이보스 당의 성분의, 예를 들면, 라이보스 당에서의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어 대체(예시적 당 변형); (iii) '데포스포' 링커를 이용한 포스페이트 모이어티의 전체 대체(예시적 골격 변형); (iv) 비정준 핵 염기를 이용한 것을 포함하는, 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체(예시적 염기 변형); (v) 라이보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형(예시적 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 혹은 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 또는 골격 변형을 포함할 수 있다); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적 당 변형).

위에 열거된 것들과 같은 화학적 변형은 두 개, 세 개, 네 개 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(집합적으로 '잔기')를 포함하는 변형된 gRNA 또는 mRNA를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되며, 예를 들어 모든 염기는 변형된 포스페이트기, 예컨대 포스포로싸이오에이트기를 갖는다. 특정 구현예에서, gRNA 분자의 포스페이트 기 모두 또는 실질적으로 모두는 포스포로싸이오에이트기로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단이나 그 근처에서 적어도 한 개의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단이나 그 근처에서 적어도 한 개의 변형된 잔기를 포함한다.

일부 구현예에서, gRNA는 한 개, 두 개, 세 개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.

비변형된 핵산은, 예를 들어 세포 내 핵산분해효소 또는 혈청에서 발견되는 것들에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 핵산분해효소는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서 본원에 기재된 gRNA는, 예를 들어, 세포 내 또는 혈청 기반 핵산분해효소에 대한 안정성을 도입하기 위해, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 gRNA 분자는, 생체 내 및 생체 외 둘 다의 세포 집단에 도입된 경우 감소된 선천 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 '선천 면역 반응'은, 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론, 및 세포 사멸의 유도와 관련된, 단일 가닥 핵산을 포함하는, 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.

골격 변형의 일부 구현예에서, 변형된 잔기의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체하여 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들어 변형된 핵산에서 존재하는 변형된 잔기는 본원에 기재된 바와 같이 비변형된 포스페이트 모이어티를 변형된 포스페이트기로 대량 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은, 비하전된 링커 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.

변형된 포스페이트기의 예는 포스포로싸이오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 비변형된 포스페이트기에서 인 원자는 아카이랄이다. 단, 비가교 산소 중 하나를 위의 원자 또는 원자의 그룹 중 하나로 대체하여 인 원자를 카이랄로 만들 수 있다. 입체 인 원자는 'R' 구성(본원에서 Rp) 또는 'S' 구성(본원에서 Sp)을 가질 수 있다. 골격은 또한 가교 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로싸이오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 대체하여 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 하나 또는 연결 산소 둘 다에서 발생할 수 있다.

포스페이트기는 특정 골격 변형에서 비인 함유 커넥터에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록세인, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 싸이오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 싸이오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함 할 수 있다.

핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한 작제될 수 있되, 포스페이트 링커 및 라이보스 당은 핵산분해효소 저항 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체된다. 이러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대용물 골격에 의해 결박될 수 있다. 예는 제한 없이 모폴리노, 사이클로뷰틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산[peptide nucleic acid, PNA] 뉴클레오사이드 대용물을 포함할 수 있다.

변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당기에, 즉 당 변형에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실 기(OH)는 여러 상이한 '옥시' 또는 '디옥시' 치환기로 변형, 예를 들면 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실기로의 변형은 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있는데, 이는 하이드록실이 더 이상 탈양성자화되어 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 없기 때문이다.

2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 'R'은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), O(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂OR, 여기서 R은, 예를 들면 H 또는 임의로 치환된 알킬일 수 있고, n은 정수 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)일 수 있다.일부 구현예에서, 2' 하이드록실기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실기 변형은, 2' 하이드록실기를 플루오라이드로 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실기 변형은 2' 하이드록실이, 예를 들어, C_1-6 알킬렌 또는 C_1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해 동일한 라이보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 '잠금된' 핵산[LNA]을 포함할 수 있되, 예시적 가교는 메틸렌, 프로필렌, 에터, 또는 아미노 가교; O-아미노(여기서 아미노는, 예를 들어, NH₂; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH₂)n-아미노(여기서 아미노는, 예를 들면 NH₂; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실기 변형은 라이보스 고리에 C2'-C3' 결합이 결여되어 있는 '비잠금' 핵산['unlocked' nucleic acid, UNA]을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기[methoxyethyl group, MOE](OCH₂CH₂OCH₃, 예를들어 PEG 유도체)를 포함할 수 있다.

'디옥시' 2' 변형은 수소(즉, 디옥시라이보스 당, 예를 들면 부분적으로 dsRNA의 돌출 부분에서); 할로(예를 들면, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 아이오도); 아미노(여기서 아미노는, 예를 들어 NH₂; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 다이헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH₂CH₂NH)nCH₂CH₂-아미노(여기서 아미노는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서 R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 사이아노; 머캅토; 알킬-싸이오-알킬; 싸이오알콕시; 및 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이 아미노로 임의로 치환될 수 있는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알카이닐을 포함할 수 있다.

당 변형은 라이보스에서 상응하는 탄소의 것과 반대되는 입체화학적 구성을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 비염기성 당을 포함할 수 있다. 이러한 비염기성 당은 또한 하나 이상의 구성 당 원자에서 더 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태, 예를 들어 L- 뉴클레오사이드인 하나 이상의 당을 포함할 수 있다.

변형된 핵산에 혼입될 수 있는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기라고도 하는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A, adenine), 구아닌(G, guanine), 사이토신(C, cytosine) 및 유라실(U, uracil)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산에 혼입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 완전히 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 독립적으로 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체 또는 피리미딘 유사체에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를 들어 염기의 자연 발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.

이중 가이드 RNA를 사용하는 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA 각각은 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 또는 tracr RNA의 말단 중 하나 또는 둘 다에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 구현예에서, sgRNA의 말단 중 하나 또는 둘 다에 있는 하나 이상의 잔기는 화학적으로 변형될 수 있거나, 내부 뉴클레오타이드가 변형될 수 있거나, 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예는 3' 말단 변형을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 2017년 12월 8일에 출원된, 'Chemically Modified Guide RNA'라는 제목의 WO2018/107028 A1에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 US20170114334에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 WO2017/136794, WO2017004279, US2018187186, US2019048338에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 변형된 sgRNA는 다음의 서열 mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(서열 번호 300)을 포함하되, 'N'은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드일 수 있고, 전체의 N'은 표 1 기재된 알부민 인트론 1 가이드 서열; 및 표 2에 기재된 SERPINA1 가이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 300이 본원에 포함되되, N'은 표 1에서 본원에 개시된 가이드 서열(서열 번호 2-33) 또는 표 2에서 본원에 개시된 가이드 서열(서열 번호 1,000-1,131) 중 임의의 것으로 대체 된다.

후술한 변형 중 임의의 것은 본원에 기재된 gRNA 및 mRNA에 존재할 수 있다.

용어 'mA', 'mC', 'mU', 또는 'mG'는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용될 수 있다.

2'-O-메틸의 변형은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 주는 것으로 나타난 또 다른 화학적 변형은 할로젠 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리상의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 핵산분해효소 안정성을 증가시킬 수 있다.

본 출원에서, 용어 'fA', 'fC', 'fU', 또는 'fG'는 2'-F로 치환되는 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용될 수 있다.

2'-F의 치환은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

포스포로싸이오에이트(PS) 연결 또는 결합은 포스포다이에스터 연결에서, 예를 들어 뉴클레오타이드 염기 사이의 결합에서 황이 한 개의 비가교 포스페이트 산소를 대체하는 결합을 지칭한다. 포스포로싸이오에이트가 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 데 사용된 경우, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 S-올리고로서 또한 지칭될 수 있다.

'*'는 PS 변형을 나타내는 데 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 PS 결합을 사용해 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용될 수 있다.

용어 'mA*', 'mC*', 'mU*', 또는 'mG*'는 2'-O-Me로 치환되고 PS 결합을 사용해 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용될 수 있다.

아래의 도표는 S-를 비가교 포스페이트 산소로 치환하여, 포스포다이에스터 결합 대신에 PS 결합을 생성하는 것을 보여준다.

무염기성 뉴클레오타이드는 질소 염기가 결여되는 것을 지칭한다. 아래의 그림은 염기가 결여된 무염기[아퓨린(apurinic)이라고도 알려져 있음] 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.

반전된 염기는 정상 5'에서 3' 연결(즉, 5'에서 5' 연결 또는 3'에서 3' 연결)에서 반전된 연결이 있는 것을 지칭한다. 예를 들어,

무염기성 뉴클레오타이드는 반전된 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오타이드는 5'에서 5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 무염기 뉴클레오타이드는 3'에서 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드에서 반전된 무염기 뉴클레오타이드는 또한 반전된 무염기 말단 캡이라고도 할 수 있다.

일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상, 및 3' 말단에서 마지막 세 개, 네 개 또는 다섯 개 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 반전된 무염기 뉴클레오타이드, PS 결합, 또는 안정성 또는 성능을 증가시키기 위한 당업계에 잘 알려진 다른 뉴클레오타이드 변형이다.

일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 네 개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서 마지막 네 개의 뉴클레오타이드는 포스포로싸이오에이트(PS) 결합으로 연결된다.

일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 세 개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서 마지막 세 개의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 세 개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서 마지막 세 개의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 세 개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서 마지막 세 개의 뉴클레오타이드는 반전된 무염기 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA 중 임의의 것은 변형된 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 서열 번호 200에 나타낸 변형 패턴을 포함하되, N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드이고, N의 전부는 핵산분해효소를 표적 서열(예를 들어, 인간 알부민 인트론 1 또는 SERPINA1에서)에 유도하는 가이드 서열(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 나타낸 바와 같은)을 포함한다.

위에 언급된 대로, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제제는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대 본원에 기재된 Cas 핵산분해효소를 암호화하는 개방형 판독틀[ORF]을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA, 예컨대, Cas 핵산분해효소가 제공되거나, 사용되거나, 투여된다. 후술한 바와 같이, Cas 핵산분해효소를 포함하는 mRNA는 Cas9 핵산분해효소, 예컨대 클리베이스, 틈내기효소, 또는 부위 특이적 DNA 결합 활성을 갖는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 핵산분해효소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 핵산분해효소를 암호화하는 ORF는 '변형된 RNA-가이드 DNA 결합제 ORF' 또는 단순히 '변형된 ORF'이고, 이는 ORF가 변형됨을 나타내기 위한 약칭으로 사용된다.

변형된 Cas9 ORF를 포함한 Cas9 ORF는 본원에서 제공되고 당업계에 공지되어 있다. 한 예로서, Cas9 ORF는 코딩 서열이 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 포함하도록 코돈 최적화될 수 있다. 본원에서 사용된 '대체 코돈'은 주어진 아미노산에 대한 코돈 사용 빈도의 변화를 지칭하고, 주어진 발현 시스템에 대해 바람직한 또는 최적화된 코돈(코돈 최적화)일 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직한 코돈 사용 빈도, 또는 주어진 발현 시스템에서 저항성이 우수한 코돈은 당업계에 공지되어 있다. WO2013/176772, WO2014/065596, WO2016/106121, 및 WO2019/067910의 Cas9 코딩 서열, Cas9 mRNA 및 Cas9 단백질 서열은 본원에 참조로 포함된다. 특히, WO2019/067910의 단락 [0449]에 나타낸 표의 ORF 및 Cas9 아미노산 서열, 그리고 WO2019/067910의 단락 [0214]-[0234]에 나타낸 Cas9 mRNA 및 ORF는 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 변형된 ORF는 유리딘 위치 중 적어도 한 개, 다수, 또는 모두에서 변형된 유리딘을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 5번 위치에서, 예를 들어, 할로젠, 메틸 또는 에틸로 변형된 유리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 1번 위치에서, 예를 들어, 할로젠, 메틸 또는 에틸로 변형된 슈도유리딘이다. 변형된 우리딘은, 예를 들어 슈도유리딘, N1-메틸-슈도유리딘, 5-메톡시유리딘, 5-아이오도유리딘, 또는 이들의 조합 일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 5-메톡시유리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 5-아이오도유리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 슈도유리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 N1-메틸-슈도유리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 슈도유리딘과 N1-메틸-슈도유리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 슈도유리딘과 5-메톡시유리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 N1-메틸 슈도유리딘과 5-메톡시유리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 5-아이오도유리딘과 N1-메틸-슈도유리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 슈도유리딘과 5-아이오도유리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 유리딘은 5-아이오도유리딘과 5-메톡시유리딘의 조합이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 5' 캡, 예컨대 Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함한다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트라이포스페이트를 통해 mRNA의 5'에서 3'으로의 사슬의 첫 번째 뉴클레오타이드, 즉, 제1 캡-근위 뉴클레오타이드의 5'번 위치에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오타이드(이는, 예를 들어 ARCA와 연관하여 아래에서 논의된 대로 더 변형 될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오타이드의 라이보스는 둘 다 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오타이드의 라이보스는 2'-메톡시 및 2'-하이드록실 각각을 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오타이드의 라이보스는 둘 다 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115]를 참조한다. 포유동물 mRNA 예컨대 인간 mRNA를 포함한, 대부분의 내인성 고등 진핵 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap0 그리고 Cap1 및 Cap2와 상이한 기타 캡 구조는 선천 면역 시스템의 성분, 예컨대 IFIT-1 및 IFIT-5에 의해 '비자기[non-self]'로 인식되어, 포유동물, 예컨대 인간에서 면역원성일 수 있으며, 이는 I형 인터페론을 포함한 상승된 수준의 사이토카인을 초래할 수 있다. 선천 면역 시스템의 성분, 예컨대, IFIT-1 및 IFIT-5는 또한 mRNA의 번역을 잠재으로 억제하는 Cap1 또는 Cap2 이외의 캡을 갖는 mRNA의 결합에 대해 eIF4E와 경쟁할 수 있다.

캡은 공동전사적으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 항 역 캡 유사체[anti-reverse cap analog, ARCA; Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 AM8045]는 구아닌 리보뉴클레오타이드의 5'번 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트라이포스페이트를 포함하는 캡 유사체이되, 이는 초기에 시험관 내에서 전사물에 혼입될 수 있다 ARCA는 제1 캡-근위 뉴클레오타이드의 2'번 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 초래한다. 예를 들어, 문헌[Stepinski et al., (2001) "Synthesis and properties of mRNA containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495]을 참조한다. ARCA 구조는 아래에 나타나 있다.

CleanCap^TM AG[m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7113] 또는 CleanCap^TM GG[m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7133]를 사용하여 Cap1 구조를 공동전사적으로 제공할 수 있다. CleanCap^TM AG 및 CleanCap^TMGG의 3'-O-메틸화 버전은 또한 각각 TriLink Biotechnologie사에서 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로 이용가능하다. CleanCap^TM AG 구조는 아래에 나와 있다.

또는, 캡은 전사 후[post-transcriptionally] 단계에서 RNA에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 상업적으로 입수 가능하며[New England Biolabs 카탈로그 번호 M2080S], 이의 D1 하위 단위에 의해 제공된 RNA 트라이포스파테이스 및 구아닐릴 전이효소 활성과 D12 하위 단위에 의해 제공된 구아닌 메틸기전이효소를 가지고 있다. 이와 같이, S-아데노실 메싸이오닌 및 GTP의 존재하에 캡0을 제공하기 위해 RNA에 7-메틸구아닌을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027 Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479]을 참조한다.

일부 구현예에서, mRNA는 폴리-아데닐화된[poly-adenylated, poly-A] 꼬리를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아데닌, 임의로 최대 300개의 아데닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다.

D. 공여자 작제물

본원에 기재된 조성물 및 방법은 본 개시의 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제에 의해 생성되는 절단 부위 내로 삽입될 이종 AAT 유전자(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 작제물의 용도를 포함한다. 특정 구현예에서, 공여자 작제물은 본원에서 제공된 양방향 핵산 작제물이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 작제물은 때때로 '공여자 작제물/주형'으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 작제물은 DNA 작제물이다. 공여자 작제물에 대한 다양한 기능성/구조적 변형을 설계하고 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 작제물은 폴리아데닐화 꼬리 서열, 폴리아데닐화 신호 서열, 스플라이스 수여 부위 또는 선별 마커 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은, 예를 들어 코딩 서열의 3' 말단에서 '폴리 A' 신장[stretch]으로서 암호화된다. 적절한 폴리아데닐화 꼬리 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 당업계에 많이 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA(서열 번호 800)은 포유동물 시스템에서 통상적으로 사용되지만, 변이체, 예컨대 UAUAAA(서열 번호 801) 또는 AU/GUAAA(서열 번호 802)가 식별된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [NJ Proudfoot, Genes & Dev. 25(17):1770-82, 2011]을 참조한다.

구현예에서, 공여자 작제물은 양방향 핵산 작제물이다. 일부 구현예에서, 이러한 작제물은 a) 제1 알파-1 항트립신[alpha-1 antitrypsin, AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하는 제1 절편으로서, 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한, 제1 절편; 및 b) 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편으로서, 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도, SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한, 제2 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 절편 및 제2 절편의 코딩 서열은 CpG가 고갈된다. 특정 구현예에서, 작제물은 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 절편은 제1 절편의 3'이다.특정 구현예에서, 작제물은 상동성 팔[homology arm]을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 SERPINA1 표적 siRNA, dsRNA 또는 가이드 RNA의 표적 능력을 차단하거나 감소시키는 코돈 사용 빈도를 갖는다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1,403-1,436, 1,403-1,425, 1,410-1,436, 1,418-1,424, 1,423-1,435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역) 내의 비야생형 코돈의 사용을 포함한다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 다 서열 번호 703의 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1,403-1,436, 1,403-1,425, 1,410-1,436, 1,418-1,424, 1,423-1,435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역) 내의 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개 불일치(예를 들어, 1-10개 불일치, 1-9개 불일치, 1-8개 불일치, 1-7개 불일치, 1-6개 불일치, 1-5개 불일치, 1-4개 불일치, 1-3개 불일치, 1-2개 불일치, 한 개 불일치, 2-10개 불일치, 2-9개 불일치, 2-8개 불일치, 2-7개 불일치, 2-6개 불일치, 2-5개 불일치, 2-4개 불일치, 1-3개 불일치, 두 개 불일치, 3-10개 불일치, 3-9개 불일치, 3-8개 불일치, 3-7개 불일치, 3-6개 불일치, 3-5개 불일치, 3-4개 불일치, 세 개 불일치, 4-10개 불일치, 4-9개 불일치, 4-8개 불일치, 4-7개 불일치, 4-6개 불일치, 4-5개 불일치, 네 개 불일치, 5-10개 불일치, 5-9개 불일치, 5-8개 불일치, 5-7개 불일치, 5-6개 불일치, 다섯 개 불일치, 6-10개 불일치, 6-9개 불일치, 6-8개 불일치, 6-7개 불일치, 여섯 개 불일치, 7-10개 불일치, 7-9개 불일치, 7-8개 불일치, 일곱 개 불일치, 8-10개 불일치, 8-9개 불일치, 또는 여덟 개 불일치)를 포함한다.

특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 711, 712, 721, 722, 731, 732, 741, 742, 751, 752, 761, 762, 771, 772, 781, 782, 791, 792, 796, 및 797에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호711, 712, 721, 722, 731, 732, 741, 742, 751, 752, 761, 762, 771, 772, 781, 782, 791, 792, 796, 및 797에서 선택되는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 양방향 핵산 작제물의 핵산 서열은 서열 번호 711, 712, 721, 722, 731, 732, 741, 742, 751, 752, 761, 762, 771, 772, 781, 782, 791, 792, 796, 및 797에서 선택된다.

작제물의 길이는 삽입되는 유전자의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 200개의 염기쌍[base pairs, bp] 내지 약 5,000개의 bp, 예컨대 약 200개의 bp 내지 약 2,000개의 bp, 예컨대 약 500개의 bp 내지 약 1,500개의 bp일 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 공여자 주형의 길이는 약 200개의 bp, 또는 약 500개의 bp, 또는 약 800개의 bp, 또는 약 1,000개의 염기쌍, 또는 약 1,500개의 염기쌍이다. 다른 구현예에서, 공여자 주형의 길이는 적어도 200 bp, 또는 적어도 500 bp, 또는 적어도 800 bp, 또는 적어도 1,000 bp, 또는 적어도 1,500 bp, 또는 적어도 2,000, 또는 적어도 2,500, 또는 적어도 3,000, 또는 적어도 3,500, 또는 적어도 4,000, 또는 적어도 4,500, 또는 적어도 5,000이다.

작제물은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 단일 및 부분적으로 이중 가닥일 수 있고, 선형 또는 원형(예를 들어, 미니서클) 형태로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제2010/0047805호, 제2011/0281361호, 제2011/0207221호를 참조한다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 외핵분해적 분해에서) 보호받을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이디옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 추가되거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오타이드는 한 개 또는 양 말단에 연결된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해에서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하는 추가 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 변형된 뉴클레오타이드 간 연결, 예를 들어, 예컨대, 포스포로싸이오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 라이보스 또는 디옥시라이보스 잔기의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 작제물은 예를 들어, 복제 원점, 프로모터 및 항생제 저항성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 작제물은 바이러스 요소를 생략할 수 있다. 또한, 공여자 작제물은 리포좀 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합된 핵산으로서 순수한[naked] 핵산으로 도입될 수 있거나 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.

일부 구현예에서, 작제물은 그의 발현이 삽입 부위에서 내인성 프로모터(예를 들어, 공여자가 숙주 세포의 알부민 유전자좌에 통합되는 경우, 내인성 알부민 프로모터)에 의해 구동되도록 삽입될 수 있다. 이러한 경우에, 이식 유전자는 그의 발현을 구동하는 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)가 결여될 수 있다(예를 들어, 무프로모터 작제물). 그럼에도 불구하고, 다른 경우에서 작제물은 프로모터 또는 인핸서, 예를 들어, 통합 시 기능성 단백질의 발현을 구동시키는 항시성 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적(예를 들어, 간 또는 혈소판 특이적) 프로모터를 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 작제물은 신호 펩타이드의 하류에서 이종 AAT 단백질을 암호화 하고 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열에 작동가능한 상태로 연결되는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 간실질세포 분비 단백질에서의 신호 펩타이드이다. 특정 구현예에서, 신호 펩타이드는 AAT 신호 펩타이드이다. 특정 구현예에서, 신호 펩타이드는 알부민 신호 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 인자 IX 신호 펩타이드이다. 작제물은 AAT 신호 펩타이드의 하류에서 이종 AAT 단백질을 암호화 하고 이를 암호화하는 신호 서열에 작동가능한 상태로 연결되는 서열, 예를 들어, 서열 번호 700을 포함할 수 있다. 작제물은 이종 신호 펩타이드의 하류에서 이종 AAT 단백질을 암호화 하고 이종 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열에 작동 가능하게 연결되는 서열을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 방법은 알부민 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열의 하류에서 이종 AAT 단백질을 암호화하고 알부민 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열에에 작동 가능하게 연결되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 AAT 단백질을 암호화하는 핵산의 상동성 비의존성 삽입에서 작용한다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 비분열 세포, 예를 들어, HR이 아닌 NHEJ가 이중 가닥 DNA 절단이 복구되는 일차 기작인 세포에서 작용한다. 핵산은 상동성 비의존성 공여자 작제물일 수 있다.

일부 구현예에서, 공여자 작제물은 기능성 AAT 단백질을 암호화하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 AAT 단백질은 서열 번호 700에 따른 인간 야생형 AAT 단백질 서열이다. 일부 구현예에서, 기능성 AAT 단백질은 서열 번호 702에 따른 인간 야생형 AAT 단백질 서열이다. AAT를 암호화하는 핵산 또한 본원에 예시되고 개시된다. 일부 구현예에서, 작제물은 AAT의 기능성 변이체, 예를 들어 야생형 AAT와 비교하여 증가된 단백질분해효소 억제제 활성을 갖는 변이체를 암호화하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 야생형 AAT와 비교하여 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 기능성 활성을 갖는, 서열 번호 700과 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일한 기능성 변이체를 암호화하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 야생형 AAT와 비교하여 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 기능성 활성을 갖는 서열 번호 702와 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일한 기능성 변이체를 암호화하는 이종 AAT 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 야생형 AAT와 비교하여 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 기능성 활성을 갖는 AAT 단백질의 단편을 암호화하는 이종 AAT 유전자를 포함한다.

이종 AAT 유전자의 향상된 삽입 및 발현을 허용하는 양방향 핵산 작제물이 또한 본원에 기재된다. 간략하게, 본원에 개시된 다양한 양방향 작제물은 적어도 두 개의 핵산 절편을 포함하되, 한 개의 절편(제1 절편)는 이종 AAT(때때로 본원에서 '이식 유전자'로 상호 교환가능하게 지칭됨)를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 반면, 이와 다른 절편(제2 절편)는 해당 서열의 상보적 서열이 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함한다. 양방향 작제물은 cis 내의 적어도 두 개의 핵산 절편를 포함할 수 있되, 한 개의 절편(제1 절편)는 한 배향에서 이종 AAT를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 반면, 이와 다른 절편(제2 절편)는 이와 다른 배향에서 이종 AAT를 암호화하는 서열의 상보적 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 즉, 제1 절편은 제2 절편에 상보적이지만 완전히 상보적인 것은 아니고, 제2 절편의 상보적 절편은 제1 절편에 역 상보적이지만 완전히 역 상보적인 것은 아니며, 둘 다 이종 AAT를 암호화한다. 양방향 작제물은, 스플라이스 수여와 연결되는 이종 AAT를 암호화하는 제1 코딩 서열, 및 스플라이스 수여와 또한 연결되는 다른 배향에서 이의 상보적 서열이 이종 AAT를 암호화하는 제2 코딩 서열을 포함한다. 본원에 기재된 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 징크 핑거 핵산분해효소[ZFN] 시스템; 전사 활성화 유사 효과기 핵산분해효소[TALEN] 시스템)과 조합하여 사용된 경우, 핵산 작제물들의 양방향성은 작제물이 표적 삽입 부위 내부에 어느 하나의 방향으로 삽입되게(한 방향의 삽입에만 제한되는 것은 아님) 하여, 본원에 예시된 대로 a) 하나의 절편의 코딩 서열 또는 2) 이와 다른 절편의 상보적 절편에서 이종 AAT를 발현시킴으로써, 삽입 및 발현 효율성을 향상시킬 수 있다. 다양한 공지된 유전자 편집 시스템은 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 아연 핑거 핵산분해효소[ZFN] 시스템; 전사 활성화 인자 유사 효과기 핵산분해효소[TALEN] 시스템을 포함하는, 본 개시를 실시할 때 사용될 수 있다.

본원에 개시된 양방향 작제물은, 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 또는 하나 이상의 원하는 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특징을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 작제물은 상동성 팔을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 작제물은 상동성 비의존성 공여자 작제물이다. 일부 구현예에서, 부분적으로 핵산 작제물의 양방향 기능으로 인해, 양방향 작제물은 목적 폴리펩타이드(예를 들어, 이종 AAT)의 효율적인 삽입 또는 발현을 허용하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 어느 한 방향(배향)으로 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 이종 AAT의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 발현은 숙주 세포의 프로모터(예를 들어, 이식 유전자가 숙주 세포의 알부민 유전자좌에 통합되는 경우 내인성 알부민 프로모터)에 의해 구동된다. 일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 제1 절편 및 제2 절편을 포함하고, 이들 각각은 이식 유전자의 상류에 스플라이스 수여를 갖는다. 특정 구현예에서, 스플라이스 수여는 숙주 세포의 세이프 하버 부위, 예를 들어 인간 알부민 유전자의 인트론 1의 스플라이스 공여자의 스플라이스 공여자 서열과 양립가능하다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 이종 AAT에 대한 코딩 서열을 포함하는 제1 절편 및 이종 AAT의 코딩 서열의 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편를 포함한다. 따라서, 제1 절편에서 코딩 서열은 이종 AAT를 발현할 수 있는 반면, 제2 절편에서 역 상보적 서열의 상보적 서열은 또한 이종 AAT를 발현할 수 있다. 본원에서 사용된 '코딩 서열'은 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편를 지칭할 때, 제2 절편의 상보적 (코딩) 가닥(즉, 제2 절편에서 역 상보적 서열의 상보적 코딩 서열)을 지칭한다.

제1 절편에서 이종 AAT를 암호화하는 코딩 서열은 이종 AAT를 또한 암호화하는 코딩 서열의 역 상보적 서열에 100% 미만으로 상보적이다. 즉, 일부 구현예에서, 제1 절편은 이종 AAT에 대한 코딩 서열 (1)을 포함하고, 제2 절편은 이종 AAT에 대한 코딩 서열 (2)의 역 상보적 서열이되, 코딩 서열 (1)은 코딩 서열 (2)과 동일하지 않다. 예를 들어, 이종 AAT를 암호화하는 코딩 서열 (1) 또는 코딩 서열 (2)는 코딩 서열 (1) 및 코딩 서열 (2)의 역 상보적 서열이 100% 미만의 상보성을 갖도록 코돈 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 절편의 코딩 서열은 제1 절편의 코딩 서열에 의해 암호화된 동일한 이종 AAT의 하나 이상의 아미노산(즉, 동일한 아미노산 서열)에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용하여 이종 AAT를 암호화한다. 본원에서 사용된 '대체 코돈'은 주어진 아미노산에 대한 코돈 사용 빈도의 변화를 지칭하고, 주어진 발현 시스템에 대해 바람직한 또는 최적화된 코돈(코돈 최적화)일 수도 있고 아닐 수도 있다. 바람직한 코돈 사용 빈도, 또는 주어진 발현 시스템에 대해 저항성이 우수한 코돈은 당업계에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 제2 절편은 헤어핀 형성을 감소시키기 위해 제1 절편의 코딩 서열의 코돈 사용 빈도와 상이한 코돈 사용 빈도를 채택하는 역 상보적 서열을 포함한다. 이러한 역 상보적 서열은 제1 절편에서 코딩 서열의 모든 뉴클레오타이드보다 적은 수의 염기쌍을 형성하지만, 동일한 폴리펩타이드를 임의로 암호화한다. 이러한 경우에서, 제1 절편의, 예를 들어, 폴리펩타이드 A에 대한 코딩 서열은, 양방향 작제물의 제2 절반의 예를 들어, 폴리펩타이드 A에 대한 코딩 서열과 상동성일 수 있지만, 동일하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 절편은 제1 절편의 코딩 서열에 실질적으로 상보적이지 않은(예를 들어, 70% 이하로 상보적인) 역 상보적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 절편은 제1 절편의 코딩 서열에 매우 상보적인(예를 들어, 적어도 90% 상보적인) 역 상보적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 절편은 제1 절편의 코딩 서열에 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 상보성을 갖는 역 상보적 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 절편 및 제2 절편은 CpG가 고갈된다.

폴리펩타이드를 암호화하는 코딩 서열은 하나 이상의 추가 서열, 예컨대 폴리펩타이드에 연결된 신호 서열, 표지 서열, 또는 이종 기능성 서열(예를 들어, 핵 국소화 서열[nuclear localization sequence , NLS])과 같은 아미노- 또는 카복시- 말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 임의로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 코딩 서열은 임의로 하나 이상의 아미노-말단 신호 펩타이드 서열을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 이들 추가 서열 각각은 작제물의 제1 절편 및 제2 절편에서 동일하거나 상이할 수 있다.

본원에 기재된 양방향 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 AAT의 발현에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 선형이다. 예를 들어, 제1 및 제2 절편은 링커 서열을 통해 선형 방식으로 결합된다. 일부 구현예에서, 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편의 5' 말단은 제1 절편의 3' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편의 3' 말단은 제1 절편의 5' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1,000, 1,500, 2,000개 이상의 뉴클레오타이드이다. 당업자에 의해 이해되는 대로, 링커 서열에 더하여 또는 그 대신에 다른 구조적 요소가 제1 및 제2 절편 사이에 삽입될 수 있다.

본원에 개시된 작제물은, 임의의 특정 사용을 위해 필요에 따라 또는 하나 이상의 원하는 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특징을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양방향 핵산 작제물은 상동성 팔을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 부분적으로 핵산 작제물의 양방향 기능으로 인해, 양방향 작제물은 목적 폴리펩타이드의 효율적인 삽입 또는 발현을 허용하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 어느 한 방향으로 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 절편 중 하나 또는 둘 다는 개방형 판독틀의 하류에 폴리아데닐화 꼬리 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열이나 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은, 예를 들어, 코딩 서열의 3' 말단에서 '폴리 A' 신장부로서 제1 또는 제2 절편의 3' 말단에서 암호화된다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 꼬리 서열은, 제1 또는 제2 절편의 3' 말단에서 암호화된 폴리아데닐화 신호 서열 또는 부위의 결과로서 공동전사적으로 제공된다 적합한 폴리아데닐화 꼬리 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 마우스 알부민 및 인간 FIX 스플라이스 수여 부위를 포함하는 적합한 스플라이스 수여 서열이 본원에 개시되고 예시된다. 일부 구현예에서, UAUAAA(서열 번호 801) 또는 AU/GUAAA(서열 번호 802)와 같은 변이체가 식별되었지만, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA(서열 번호 800)는 포유동물 시스템에서 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 문헌 [NJ Proudfoot, Genes & Dev. 25(17):1770-82, 2011]을 참조한다. 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리 서열이 포함된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 작제물은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적으로 단일 및 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 작제물은 단일 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 뉴클레오사이드 유사체를 사용하여) 변형될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 작제물은 작제물의 말단 중 하나 또는 둘 다, 예를 들어 제1 또는 제2 절편에 있는 개방형 판독틀의 5', 또는 이식 유전자 서열 중 하나 또는 둘 다의 5'에 스플라이스 수여 부위를 포함다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여 부위는 NAG를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 스플라이스 수여 부위는 NAG로 이루어진다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여는 알부민 스플라이스 수여이며, 예를 들어, 알부민의 1번 및 2번 엑손과 함께 스플라이싱에 사용된 알부민 스플라이스 수여이다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여는 인간 알부민 유전자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여는 마우스 알부민 유전자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여는 알부민 스플라이스 수여이며, 예를 들어, 알부민의 1번 및 2번 엑손과 함께 스플라이싱에 사용된 마우스 알부민 스플라이스 수여이다. 일부 구현예에서, 스플라이스 수여는 인간 알부민 유전자에서 유래된다. 인공 스플라이스 수여를 포함하는 진핵생물에서 유용한 추가의 적합한 스플라이스 수여 부위가 공지되어 있고, 당업계에서 유래될 수 있다. 예컨대, 문헌[Shapiro, et al., 1987, Nucleic Acids Res., 15, 7155-7174, Burset, et al., 2001, Nucleic Acids Res., 29, 255-259]을 참조한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 작제물은 필요에 따라 하나 이상의 적합한 구조적 특징을 포함하거나 하나 이상의 기능성 이점을 부여하기 위해 말단 중 하나 또는 둘 다에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 작제물을 숙주 세포에 전달에 사용된 방법(들), 예를 들어, 바이러스 벡터 전달의 사용 또는 전달을 위한 지질 나노입자로의 포장의 사용에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형은 제한 없이, 예를 들어, 말단 구조, 예컨대 역위 말단 반복부[inverted terminal repeat, ITR], 헤어핀, 루프, 및 환상면체[toroid]와 같은 다른 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 작제물은 한 개, 두 개 또는 세 개의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 작제물은 두 개 이하의 ITR을 포함한다. 구조적 변형의 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 작제물의 말단 중 하나 또는 둘 다는 당분야에 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 세포 외 분해에서) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이디옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 추가되거나, 자기상보적 올리고뉴클레오타이드는 말단 중 하나 또는 둘 다에 연결된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963 및 Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해에서 작제물을 보호하는 추가 방법은, 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어, 포스포로싸이오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 라이보스 또는 디옥시라이보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드 간 연결의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

작제물은 예를 들어, 복제 원점, 프로모터 및 항생제 저항성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 작제물은 작용제 예컨대 리포좀, 중합체, 또는 폴록사머와 복합체화되는 핵산처럼 순수한 핵산으로서 도입될 수 있거나, 이들은 바이러스성 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.

일부 구현예에서, 발현에 필요하지는 않지만, 본원에 개시된 작제물은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 라이보솜 진입 부위, 펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 목적 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하는 작제물은 다음 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (예를 들어, 인간 코돈에 대한) 코돈 최적화 또는 하나 이상의 당화 부위의 부가. 예를 들어, 문헌[McIntosh et al. (2013) Blood (17):3335-44]을 참조한다.

일부 구현예에서, 대체 코딩 서열을 포함하는 작제물은 핵산 치료제에 의한 발현의 감소에 대해 저항성이 있도록 설계될 수 있다. SERPINA1 유전자를 표적하는 핵산 치료제가 본원에서 제공된다. 강력한 gRNA에는 506-525번, 538-557번 및 412-431번 뉴클레오타이드를 각각 표적하는 G000409, G000414 및 G000415가 포함된다. SERPINA1을 표적하는 RNAi 작용제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, SERPINA1을 표적하는 iRNA 작용제에 관한 WO2018098117, WO2015003113, 및 WO2015195628을 참조한다. 해당 출원에 제공된 강력한 RNAi 작용제는 유전자은행 수탁 번호 NM_001127700.2(본 출원이 출원된 날짜에 이용 가능한 버전에서)의 1,403-1,425번, 1,410-1,436번 및 957-997번 뉴클레오타이드를 표적한다. 핵산 치료제에 대한 코딩 서열 및 발현 작제물의 저항성을 검사하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 핵산 치료제를 표적 부위에 표적하는 방법, 및 이에 따라 특정 표적 부위에 대한 핵산 치료제의 표적을 파괴하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 가이드 RNA에 대한 표적 파괴는, 표적 서열과 가이드에서의 PAM 사이의 불일치, 및 발현 작제물에서의 상보적 서열을 제공하는 것을 포함할 수 있다. PAM의 상류의 +4번 내지 +7번 위치에 있는 핵심 서열은, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9(예를 들어, 문헌[Zheng et al., Sci Rep, 207] 참조)와의 불일치에 특히 민감하다. RNAi 작용제에 대한 표적 파괴는 안티센스 가닥 및 발현 작제물에서 상보적 서열 사이의 불일치를 제공하는 것을 포함할 수 있다. RNAi 작용제의 시드 영역, 즉, siRNA의 안티센스 가닥의 2-7번 또는 2-8번 위치에 있는 6량체 또는 7량체 시드는 불일치에 특히 민감하다(예를 들어, 문헌[Birmingham et al., Nature Methods, 2006] 참조). AATD 치료의 표준은 혈청에서 ATT를 주입하여 AAT 단백질을 보충하는 것에 의존하므로, 양방향 작제물에서 AAT를 발현하는 것만으로도 질환을 치료하기에 충분할 수 있다. 단, 간 병리는 적어도 부분적으로 잘못 접힌 단백질의 축적으로 인해 발생하므로, 간 손상이 발생하면 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 이종 코딩 서열 둘 다 저항성이 있는, 즉 핵산 치료제의 표적이 되지 않는, 이종 AAT의 발현을 위한 양방향 작제물에서 이종 AAT의 발현을 감소시키지 않거나 실질적으로 감소시키지 않고(예를 들어, 5% 이하 감소, 10% 이하 감소) 핵산 치료제를 사용할 수 있다. 본원의 양방향 작제물은 당업계에 공지되어 있고 활성이 강력한 것으로 입증된, 예시적 핵산 치료제에 저항성이 있도록 설계되었다. 단, 본 출원의 출원 시점에,모든 작용제가 인간 대상 치료에 사용하기 위해 규제 당국으로부터 승인을 받지 못하였다. SERPINA1을 표적하는 다른 핵산 치료제가 개발될 가능성 또한 있다. 본원에 제공된 전략 및 방법을 제공하면, 당업자는 SERPINA1을 표적하는 새로 개발된 핵산 치료제에 저항성이 있는 추가 양방향 작제물을 설계할 수 있다.

따라서, AATD와 연관된 하나 이상의 간 손상 증상을 앓고 있는 대상의 AATD를 치료하는 방법에서 내인성 SERPIINA1 유전자를 표적하는 핵산 치료제의 용도가 본원에 제공되되, 대상은 이전에 이종 AAT를 암호화하는 양방향 작제물로 치료되었고, 양방향 작제물 내의 코딩 서열 모두 비야생형 코돈의 사용 빈도를 포함하며, 양방향 작제물 내의 코딩 서열은 내인성 SERPINA1 유전자를 표적하는 핵산 치료제에 의해 표적되지 않으므로, 핵산 치료제는 양방향 작제물로부터 이종 AAT의 발현을 감소시키지 않거나 실질적으로 감소시키지 않고(예를 들어, 5% 이하 감소, 10% 이하 감소) 내인성 SERPINA1 유전자로부터의 발현을 감소시킨다.

E. 유전자 편집 시스템

다양한 공지된 유전자 편집 시스템은 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템; 아연 핑거 핵산분해효소[ZFN] 시스템; 전사 활성화 인자 유사 효과기 핵산분해효소[TALEN] 시스템을 포함하고, 본원에 기재된 양방향 핵산 작제물의 표적된 삽입을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자 편집 시스템은 표적 DNA 서열에서 이중 가닥 절단[DSB] 또는 틈새(예를 들어, 단일 가닥 절단 또는 SSB)을 유도하기 위해 조작되는 절단 시스템의 사용을 포함한다. 절단 또는 틈내기는, 조작된 ZFN, TALEN과 같은 특정 핵산분해효소를 사용하거나 조작된 가이드 RNA와 함께 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여, 표적 DNA 서열의 특정 절단 또는 틈내기를 유도함으로써 발생할 수 있다. 또한, 예를 들어 Argonaute 시스템을 기반으로, 표적된 핵산분해효소는 개발되었고, 추가적인 핵산분해효소는 개발 중이며(예를 들어, 'TtAgo'로 알려진 T. thermophilus에서, 문헌[Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261] 참조), 이는 또한 게놈 편집 및 유전자 치료에 사용될 가능성이 있을 수 있다.

본원에 개시된 Cas9 핵산분해효소와 같은 Cas 핵산분해효소에 대한 가이드 RNA를 사용하는 방법의 경우, 방법은 CRISPR/Cas 시스템(및 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 본원에 개시된 임의의 공여자 작제물)의 사용을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 본 개시는 본원에 개시된 양방향 작제물을 사용하는 이종 AAT의 표적 삽입 및 발현 방법을 고려하고 있음이 이해될 것이며, 이 방법은 본원에 개시된 알부민 가이드 RNA의 유무에 관계없이 수행 될 수 있다 (예를 들어, ZFN 시스템을 사용하여 표적 DNA 서열에 절단을 유발하여 양방향 작제물의 삽입 부위를 생성함).

일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제)을 사용하여 숙주 게놈 내의 원하는 유전자좌에 삽입 부위를 생성할 수 있으며, 이 부위에 본원에 개시된 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)이 삽입되어, 이종 AAT를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 AAT 이식유전자는 예를 들어, 본원에 기재된 세이프 하버 유전자좌에 삽입되는 이의 삽입 부위에 대해 이종일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 알부민 유전자좌(예를 들어, 인트론 1)를 표적하는 본원에 기재된 가이드 RNA(서열 번호 2-33)를 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소)와 함께 본 방법에 따라 사용하여, 삽입 부위를 생성 할 수 있으며, 이 부위에서 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)이 삽입되어, 이종 AAT를 발현할 수 있다. 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 이종 AAT 유전자를 표적 삽입하기 위한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 본원에 예시 및 기재된다(예를 들어, 표 1 참조).

다양한 RNA-가이드 DNA 결합제, 예를 들어, 핵산분해효소, 예컨대, Cas 핵산분해효소, 예를 들어, Cas9의 사용 방법은 또한 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 문맥에 따라, RNA-가이드 DNA 결합제는 핵산(예를 들어, DNA 또는 mRNA) 또는 단백질로 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제를 이미 발현하는 숙주 세포에서 실행될 수 있다.

일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas9 핵산분해효소는 클리베이스 활성을 가지며, 이는 이중 가닥 핵산중간분해효소 활성으로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas9 핵산분해효소는 틈내기효소 활성을 가지며, 이는 또한 단일 가닥 핵산중간분해효소 활성으로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 핵산분해효소를 포함한다. Cas9 핵산분해효소의 예에는 S. 피오게네스, S. 아우레우스(S. aureus), 및 기타 원핵 생물의 II형 CRISPR 시스템(예를 들어, 다음 단락의 목록 참조) 및 이의 돌연변이(예를 들어, 조작된 또는 기타 변이체) 버전을 포함한다. 예를 들어, US2016/0312198 A1 및 US 2016/0312199 A1을 참조한다.

Cas 핵산분해효소 또는 Cas 틈내기효소가 유래될 수 있는 비제한적인 예시적 종은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 월리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 와드스워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스테우렐라 물코시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노게네(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브류키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹터 벡스시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란티크스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스토크 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비야 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오스실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 아시드아미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 박테리움 ND2006(bacterium ND2006), 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다.

일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 스타필로코쿠스 아우레우스의 Cas9 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 프란시셀라 노비시다의 Cpf1 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 아시다미노코쿠스 종의 Cpf1 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006의 Cpf1 핵산분해효소이다. 또 다른 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 프란시셀라 툴라렌시스, 라크노스피라세아에 박테리움, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움, 파르쿠박테리아 박테리움, 스미텔라, 아시다미노코쿠스, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼, 에우박테리움 엘리겐스, 모락셀라 보보쿨리, 렙토스피라 이나다이, 포르피로모나스 크레비오리카리스, 프레보텔라 디시엔스, 또는 포르피로모나스 마카카에의 Cpf1 핵산분해효소이다. 특정 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 아시다미노코쿠스 또는 라크노스피라세아에의 Cpf1 핵산분해효소이다.

일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드 DNA-결합제와 함께 리보핵산단백질 복합체[ribonucleoprotein complex, RNP]라 불린다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 핵산분해효소이다. 일부 구현예에서, gRNA는 Cas 핵산분해효소와 함께 Cas RNP라 불린다. 일부 구현예에서, RNP는 유형-I, 유형-II, 또는 유형-III 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 유형-II CRISPR/Cas 시스템에서 유래한 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, gRNA는 Cas9와 함께 Cas9 RNP라 불린다.

야생형 Cas9는 두 개의 핵산분해효소 도메인, 즉 RuvC 및 HNH를 가진다. RuvC 도메인은 비표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 하나가 넘는 RuvC 도메인 또는 하나가 넘는 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 조성물, 용도 및 방법 구현예 각각에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도한다.

일부 구현예에서, 단백질의 한 개의 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 부분으로 대체되는, 키메라 Cas 핵산분해효소가 사용된다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소 도메인은 Fok1과 같은 상이한 핵산분해효소에서 유래한 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 변형된 핵산분해효소일 수 있다.

다른 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 유형-I CRISPR/Cas 시스템에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 유형-III CRISPR/Cas 시스템에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 단일 가닥 틈내기효소 활성을 갖는데, 즉,하나의 DNA 가닥을 절단하여 '틈새(nick)'으로도 공지된 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 Cas 틈내기효소를 포함한다. 틈내기효소는 dsDNA에서 닉을 생성하는, 즉 DNA 이중 나선의 한 가닥은 자르지만 다른 가닥은 자르지 않는 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 틈내기효소는 예를 들어 촉매 도메인에서 하나 이상의 변형(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 내부핵분해성 활성 부위가 비활성화되는 Cas 핵산분해효소 버전(예를 들어, 위에서 논의된 Cas 핵산분해효소)이다. 예를 들어, Cas 틈내기효소 및 예시적 촉매 도메인 변형에 관한 논의에 대한 미국 특허 제8,889,356호를 참조한다. 일부 구현예에서, Cas 틈내기효소, 예컨대 Cas9 틈내기효소는 비활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 가진다.

일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 하나의 기능성 핵산분해효소 도메인만 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 핵산분해효소 도메인 중 하나가 돌연변이 되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되어 핵산 절단 활성을 감소시키기도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 틈내기효소가 사용된다. 일부 구현예에서, 비활성 RuvC 도메인을 갖는 틈내기효소가 사용된다. 일부 구현예에서, 활성이 감소된 HNH 도메인을 갖는 틈내기효소가 사용된다. 일부 구현예에서, 비활성 HNH 도메인을 갖는 틈내기효소가 사용 된다.

일부 구현예에서, Cas 단백질 핵산분해효소 도메인 내의 보존된 아미노산이 치환되어 핵산분해효소 활성을 감소시키거나 변경한다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 RuvC 또는 RuvC-유사 핵산분해효소 도메인에 아미노산 치환을 포함 할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 핵산분해효소 도메인에서 예시적 아미노산 치환은 D10A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기준)를 포함한다 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771]을 참조한다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소는 HNH 또는 HNH-유사 핵산분해효소 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 핵산분해효소 도메인에서 예시적 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기준)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015)]을 참조한다. 또 다른 예시적 아미노산 치환에는 D917A, E1006A, 및 D1255A가 포함된다(프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 [FnCpf1] 서열[UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)] 기준).

일부 구현예에서, 틈내기효소는 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥 각각에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNA와 조합하여 제공된다. 이 구현예에서, 가이드 RNA는 틈내기효소를 표적 서열로 유도하고 표적 서열의 반대 가닥에 닉(즉, 이중 틈내기)을 생성하여 DSB를 도입한다. 일부 구현예에서, 틈내기효소는 DNA의 반대 가닥을 표적하는 두 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용되어, 표적 DNA에서 이중 닉을 생성된다. 일부 구현예에서, 틈내기효소는 매우 근접하도록 선택된 두 개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용되어, 표적 DNA에서 이중 닉을 생성된다.

일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 하나 이상의 이종 기능성 도메인들을 포함한다(예를 들어, 융합 폴리펩타이드이거나 이를 포함함).

일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드 DNA 결합제가 세포 핵으로 수송하도록 촉진 할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능 도메인은 핵 국지화 신호[nuclear localization signal, NLS]일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 1-10 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 1-5 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 한 개의 NLS와 융합될 수 있다. 한 개의 NLS가 사용될 경우, NLS는 RNA-가이드 DNA 결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 이는 또한 RNA-가이드 DNA 결합제 서열 내부에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 하나가 넘는 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 2, 3, 4, 또는 다섯 개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA-결합제는 두 개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 상황에서, 두 개의 NLS는 동일하거나(예를 들어, 두 개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 카복시 말단에 연결된 두 개의 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 두 개의 NLS와 융합될 수 있는데, 하나는 N-말단에서 그리고 하나는 C-말단에서 연결된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 세 개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 DNA 결합제는 NLS와 융합되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 단립형 서열, 예컨대, 예를 들어 SV40 NLS, PKKKRKV(서열 번호 600) 또는 PKKKRRV(서열 번호 601)일 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 양립형 서열, 예컨대, 핵플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK(서열 번호 602)일 수 있다. 일 특정 구현예에서, 단일 PKKKRKV(서열 번호 600) NLS는 RNA-가이드 DNA 결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커는 임의로 융합 부위에 포함된다.

Ⅲ. 전달 방법

본원에 개시된 가이드 RNA(알부민 gRNA; SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 및 핵산 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)는 당업계에서 이용가능하며 다양한 공지되고 적합한 방법을 사용하여 생체 내 또는 생체 외에서 숙주 세포 또는 대상에 전달될 수 있다. 가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제 및 핵산 작제물은 동일하거나 상이한 전달 방법을 사용하여 적절히 개별적으로 또는 임의의 조합으로 함께 전달될 수 있다.

통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 본원에 개시된 가이드 RNA뿐만 아니라 RNA-가이드 DNA 결합제 및 공여자 작제물을 도입할 수 있다. 본원은 또한, 핵산, 예컨대 비바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 및 예를 들어 네이키드 핵산, 및 리포좀, 지질 나노입자[lipid nanoparticle, LNP], 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합된 핵산을 포함하는 비바이러스 벡터 전달 시스템이 제공된다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다.

핵산의 비바이러스 전달을 위한 방법 및 조성물은 전기천공, 리포펙션, 미세주입, 유전자총, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, LNP, 다중 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 핵산(예를 들어, 네이키드 DNA/RNA), 인공 비리온, 및 DNA의 작용제 개선된 흡수를 포함한다. 핵산의 전달을 위해, 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(RichMar)을 사용한 초음파천공[Sonoporation] 또한 사용될 수 있다.

추가적인 예시적 핵산 전달 시스템에는, AmaxaBiosystems(Cologne, 독일), Maxcyte, Inc.(Rockville, Md.), BTX Molecular Delivery Systems(Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 공급되는 시스템이 포함된다(예를 들어, [미국 특허 제6,008,336호] 참조). 리포펙틴은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호; 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기재되어 있으며, 리포펙틴 시약은 시판되고 있다(예를 들어, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM). 면역지질 복합체와 같은 표적 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 기재된 바와 같다.

가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제 및 공여자 작제물을 단독으로 또는 조합하여 함유하는 다양한 전달 시스템(예를 들어, 벡터, 리포좀, LNP)은 생체 내 세포로의 전달을 위해 유기체에 투여되거나 생체 외 세포 또는 세포 배양물에 투여될 수 있다. 투여는 분자를 도입하여 혈액, 체액 또는 세포와 궁극적으로 접촉시키기 위해 통상적으로 사용된, 주사, 주입, 국소적용 및 전기천공을 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 경로에 의해 시행된다. 이러한 핵산을 투여하는 적절한 방법이 이용가능하며 당업자에게 널리 공지되어 있다.

특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시된 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA); 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 작제물(예를 들어, 양방향 작제물); 또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 서열 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 DNA 또는 RNA 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 기재된 조성물 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 DNA 또는 RNA 벡터, 또는 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 및 조절 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물을 포함하는 벡터는 이종 AAT 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA)를 포함하는 벡터는 또한 본원에 기재된 바와 같이 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다 일부 구현예에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나의 카피를 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 하나가 넘는 가이드 RNA 카피를 포함한다. 하나가 넘는 가이드 RNA가 있는 구현예에서, 가이드 RNA가 동일하지 않아서 상이한 표적 서열들을 표적할 수 있거나, 동일하여 동일한 표적 서열을 표적할 수 있다. 벡터가 하나가 넘는 가이드 RNA를 포함하는 일부 구현예에서, 각 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 핵산분해효소와의 복합체, 예컨대, Cas RNP 복합체 내부에서 다른 상이한 속성들, 예컨대, 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 3' UTR 또는 5' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNA^Lys3, 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 문헌[Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628]을 참조한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합 효소 III[polymerase III, Pol III]에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 H1 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 하나가 넘는 가이드 RNA가 있는 구현예에서, 발현을 구동하는 데 사용된 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드와 가이드 RNA의 trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드가 동일한 벡터에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 및 trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 전사물로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 trRNA는 단일 전사물에서 가공되어 이중 분자 가이드 RNA를 형성할 수 있다. 또는, crRNA 및 trRNA는 단일 분자 가이드 RNA[single-molecule guide RNA, sgRNA]로 전사될 수 있다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 동일한 벡터상의 상응하는 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 또 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동일한 벡터 상에 위치 할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 알부민 gRNA 또는 하나 이상의 SERPINA1 gRNA는 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 알부민 gRNA 또는 하나 이상의 SERPINA1 gRNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 동일한 벡터상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제의 발현은 그들 자신의 상응하는 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 발현은 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제의 발현을 구동시키는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas 단백질 전사물은 단일 전사물 내부에 포함될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas 단백질 전사물의 비번역 영역[untranslated region, UTR] 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서 가이드 RNA는 전사물의 5' UTR 내에 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA는 전사물의 3' UTR 내부에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 전사물의 세포 내 반감기는 3' UTR 내부에 가이드 RNA를 포함시켜 3' UTR의 길이를 단축시킴으로써 감소될 수 있다. 추가 구현예에서, 가이드 RNA는 전사물의 인트론 내부에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA가 전사물로부터 적절하게 스플라이싱되도록 가이드 RNA가 위치하는 인트론에 적합한 스플라이스 부위가 추가될 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 벡터로부터 Cas 단백질과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제 및 가이드 RNA를 일시적으로 근위에서 발현시키면 보다 효율적인 CRISPR RNP 복합체 형성을 촉진할 수 있다.

일부 구현예에서, 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA) 또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이종 AAT 유전자를 포함하는 작제물을 포함하는 동일한 벡터상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 벡터상에서 AAT 유전자를 포함하는 작제물 및 가이드 RNA(또는 RNA-가이드 DNA 결합제)의 근접성은 이러한 작제물이 가이드 RNA/RNA-가이드 DNA 결합제에 의해 생성되는 삽입 부위 내부로 보다 효율적으로 삽입되게 촉진할 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 또는 Cpf1일 수 있는 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 sgRNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA) 및 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 또는 Cpf1일 수 있는 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 crRNA, trRNA, 및 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일 구현예에서, Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 유래된다(즉, Spy Cas9). 일부 구현예에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 (sgRNA일 수 있는) trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 천연 발생 CRISPR/Cas 시스템의 반복 서열 전체 또는 일부가 측면에 있는 가이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이들로 이루어진 핵산은, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 천연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이들로 이루어진 벡터 서열을 더 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내에서 비인접 핵산에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 인접 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대 가닥에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 암호화된다.

일부 구현예에서, 벡터는 본원에 개시된 대로 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 핵산 작제물)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 본원에 개시된 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 핵산 작제물) 이외에도, 본원에 기재된 알부민 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 또는 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소, 예컨대, Cas9)를 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 알부민 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 또는 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 핵산은 각각 또는 둘 다 본원에 개시된 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)를 포함하는 벡터와는 별개의 벡터상에 존재한다. 임의의 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 프로모터, 인핸서, 조절 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 서열을 포함 할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)의 이종 AAT의 발현을 구동시키지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 sgRNA 및 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하되, mRNA는 Cas 핵산분해효소(예컨대 Cas9)일 수 있는 RNA-가이드 DNA 핵산분해효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 및 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하되, mRNA는 Cas 핵산분해효소, 예컨대 Cas9일 수 있는 RNA-가이드 DNA 핵산분해효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, Cas9는 스트렙토코커스 피오게네스(즉, Spy Cas9)에서 유래한다. 일부 구현예에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 (sgRNA일 수 있는) trRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템의 반복 서열 전체 또는 일부가 측면에 있는 가이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이들로 이루어진 핵산은, crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이들로 이루어진 벡터 서열을 더 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 원형일 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 선형일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 지질 나노입자, 리포좀, 비지질 나노입자 또는 바이러스 캡시드로 둘러싸일 수 있다. 비제한적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 이의 야생형 대응물에서 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 용이하게 하거나 벡터의 하나 이상의 속성을 변화시키기 위해 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 속성에는 포장 용량, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사 및 번역이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 포장할 수 있도록 바이러스 게놈의 일부가 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스가 통합되지 않도록, 바이러스 서열의 숙주 게놈으로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예컨대, 인테그레이스)는 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 벡터에서 코딩 서열의 발현을 구동시키기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 헬퍼 의존성일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 증폭하고 바이러스 입자로 포장에 필요한 바이러스 성분(예를 들어, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 바이러스 성분들을 암호화하는 하나 이상의 벡터들을 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분은 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포에 도입될 수 있다 다른 구현예에서, 바이러스는 헬퍼가 없을 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭 및 포장할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 포장에 필요한 바이러스 성분을 암호화할 수 있다.

비제한적인 예시적 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스[adeno-associated virus, AAV] 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터[helper dependent adenoviral vector, HDAd), 단순 헤르페스 바이러스[herpes simplex virus, HSV-1] 벡터, 박테리오파지 T4, 배큘로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터일 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

일부 구현예에서, 'AAV'는 모든 혈청형, 아형 및 자연 발생 AAV뿐만 아니라 재조합 AAV를 지칭한다. 'AAV'는 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 용어 'AAV'는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 'AAV'는 AAV3B, AAVhu.37, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, 및 AAV8을 포함한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 말단 반복서열[native terminal repeat, TR], Rep 단백질 및 캡시드 하위 단위의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 유전자은행과 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 본원에 사용된 'AAV 벡터'는 AAV 기원이 아닌 이종 서열(즉, AAV에 이종인 핵산 서열)을 포함하는 AAV 벡터를 지칭하며, 일반적으로 목적 이종 폴리펩타이드(예를 들어, AAT)를 암호화하는 서열을 포함한다. 작제물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비 영장류 AAV, 및 양 AAV 캡시드 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이종 핵산 서열(이식 유전자)은 적어도 한 개, 적어도 두 개, 적어도 세 개의 AAV 반전된 말단 반복 서열[ITR]에 의해 측면에 위치한다. AAV 벡터는 단일 가닥[ssAAV] 또는 자가 상보적(self-complementary AAV, scAAV)일 수 있다. 특정 구현예에서, AAV 벡터의 하나 이상의 영역은 CpG가 고갈될 수 있다. 특정 구현예에서, ITR은 CpG가 고갈되지 않는다. 특정 구현예에서, ITR은 CpG가 고갈된다.

일부 구현예에서, 렌티바이러스는 통합되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 고클로닝 용량 또는 '유전자미함유[gutless]' 아데노바이러스일 수 있으며, 여기서 5' 및 3' 역위 말단 반복서열[ITR] 및 포장 신호('I')를 제외한 모든 코딩 바이러스 영역은 포장 용량을 증가시키기 위해 바이러스로부터 결실되어 있다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 HSV-1 벡터 일 수 있다. 일부 구현예에서, HSV-1-기반 벡터는 헬퍼 의존적이며, 다른 구현예에서, 헬퍼 독립적이다. 예를 들어, 포장 서열만 유지하는 앰플리콘 벡터는 포장을 위한 구조적 성분을 가지는 헬퍼 바이러스가 필요한 반면, 비필수 바이러스 기능을 제거하는 30kb-결실된 HSV-1 벡터는 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터는 박테리오파지 T4일 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 T4는 바이러스 헤드가 비워질 때 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 포장할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 더 작은 클로닝 용량을 갖는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 시스템의 모든 성분을 전달하기 위해 하나가 넘는 벡터를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 AAV 벡터는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 서열을 포함할 수 있는 반면, 제2 AAV 벡터는 하나 이상의 가이드 서열을 포함 할 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터 시스템은 세포에서 하나 이상의 코딩 서열의 발현을 구동할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 일단 세포에 통합되면 하나 이상의 코딩 서열들의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하지 않는다(예를 들어, 본원에 예시된 대로 알부민 유전자좌가 인트론 1에 삽입되는 경우와 같이 숙주 세포의 내인성 프로모터를 사용함). 세포는 원핵 세포, 예컨대, 예컨대, 박테리아 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 인간세포일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서 발현을 구동시키는 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 야생형일 수 있다. 다른 구현예에서, 프로모터는 보다 효율적이거나 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 프로모터는 절두될 수 있지만 그 기능을 유지한다. 예를 들어, 프로모터는 벡터를 바이러스로 적절하게 포장하기에 적합한 정상 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)과 같은 RNA-가이드 DNA 결합제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터에 의해 암호화된 핵산분해효소는 Cas 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 핵산분해효소를 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열의 카피를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터 시스템은 핵산분해효소를 암호화하는 하나가 넘는 뉴클레오타이드 서열의 카피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산분해효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산분해효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 이종 AAT 유전자를 포함하는 작제물 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 AAT 유전자는 적어도 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 AAT 유전자는 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 유전자는 이종 유전자의 발현을 구동시키는 프로모터에 연결되지 않는다.

일부 구현예에서, 프로모터는 항시성, 유도성 또는 조직 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 항시성 프로모터 일 수 있다. 비제한적인 예시적 항시성 프로모터에는 거대세포 바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV), 유인원 바이러스(SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기(MLP) 프로모터, Rous 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 연장 인자-알파(EF1a) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 기능성 단편, 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 절두된 CMV 프로모터일 수 있다. 다른 구현예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적 유도성 프로모터는 열 충격, 빛, 화학 물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도될 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 예컨대 Tet-On^® 프로모터 Clontech)와 같이 낮은 기저(비유도) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.

일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터, 예를 들어 간에서의 발현에 특이적인 프로모터일 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 벡터 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 하나의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터 시스템은 두 개의 벡터를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 벡터 시스템은 세 개의 벡터를 포함할 수 있다. 다중화에 서로 다른 가이드 RNA가 사용되거나 다수의 가이드 RNA 카피가 사용된 경우 벡터 시스템은 세 개가 넘는 벡터를 포함 할 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터 시스템은 표적 세포로 전달된 후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적 유도성 프로모터는 열 충격, 빛, 화학 물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도될 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는, 예를 들어 Tet-On^® 프로모터(Clontech)와 같이 낮은 기저(비유도) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다.

추가 구현예에서, 벡터 시스템은 특정 조직으로 전달된 후에만 발현을 시작하는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다.

벡터는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(알부민 gRNA 또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제 또는 공여자 작제물을 포함하며, 리포좀, 나노입자, 엑소좀 또는 미세소포에 의해 전달될 수 있다. 벡터는 지질 나노입자[LNP]에 의해 또한 전달될 수 있다. 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(알부민 gRNA 또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제(예를 들어, mRNA) 또는 공여자 작제물은 리포좀, 나노입자, 엑소좀 또는 미세소포에 의해 전달될 수 있다. 개별적으로 또는 임의의 조합으로 이종 AAT 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(알부민 gRNA 또는 SERPINA1 gRNA), RNA-결합 DNA 결합제(예를 들어, mRNA) 또는 공여자 작제물은 LNP에 의해 전달될 수 있다.

지질 나노입자[LNP]는 뉴클레오타이드 및 단백질 카고의 전달에 있어서 잘 알려진 수단이며, 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제 또는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 적절하게 핵산(예를 들어, DNA 또 는 mRNA), 또는 단백질(예를 들어, Cas 핵산분해효소), 또는 단백질과 함께 핵산의 형태로 조성물을 전달한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA) 또는 본원에 개시된 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)를 단독으로 또는 조합하여 숙주 세포 또는 대상에 전달하는 방법이 본원에 제공되되, 성분 중 임의의 하나 이상은 LNP와 회합되어 있다. 일부 구현예에서, 방법은 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 서열)를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA) 또는 본원에 개시된 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물) 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여, LNP와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 핵산 서열)를 더 포함한다.

일부 구현예에서, LNP는 생분해성, 이온화가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카9,12-다이에노에이트)로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 또는 또 다른 이온화가능한 지질을 포함한다. 예를 들어, WO2019067992, WO/2017/173054, WO2015/095340, 및 WO2014/136086의 지질뿐만 아니라 여기에 제공된 참조문헌을 참조한다. 일부 구현예에서, LNP 지질과 연관하여 용어 양이온성 및 이온화가능한은 상호교환 가능하며, 예를 들어 이온화가능한 지질은 pH에 따라 양이온성이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 양방향 작제물과 연관된 LNP는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약을 제조에 사용하기 위한 것이다. 질환 또는 장애는 α1-항트립신 결핍[α1-antitrypsin deficiency, AATD]과 연관된 질환일 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 가이드 RNA, 본원에 기재된 RNA-가이드 DNA 결합제, 또는 본원에 개시된 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물) 중 임의의 것은, 단독으로 또는 조합으로, 노출된 벡터 또는 벡터의 일부분으로서 지질 나노입자 형태로 제형화되거나 지질 나노입자를 통해 투여된다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO/2017/173054를 참조한다.

본원에 개시된 임의의 하나 이상의 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA), RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소 또는 Cas 핵산분해효소를 암호화하는 핵산), 및 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 공여자 작제물(예를 들어, 양방향 작제물)이 동일하거나 상이한 시스템을 사용하여 전달될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 가이드 RNA, RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소), 및 작제물은 동일한 벡터(예를 들어, AAV)에 의해 운반될 수 있다. 또는, RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대 Cas 핵산분해효소(단백질 또는 mRNA) 또는 gRNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA)는 플라스미드 또는 LNP에 의해 운반될 수 있 는 반면, 공여자 작제물은 AAV와 같은 벡터에 의해 운반될 수 있다. 다양한 조합 중 임의의 것의 사용은, 예를 들어 사용의 실용성과 효율성에 의해 지침이 정해진다. 또한, 상이한 전달 시스템은 동일하거나 상이한 경로에 의해(예를 들어, 주입에 의해; 근육내 주사, 꼬리 정맥 주사 또는 다른 정맥 내 주사와 같은 주사에 의해; 복강내 투여 또는 근육내 주사에 의해) 투여 될 수 있다.

상이한 전달 시스템은 시험관 내 또는 생체 내에서 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 작제물, 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA), 및 Cas 핵산분해효소는 시험관 내 또는 생체 내에서 동시에, 예를 들어 한 개의 벡터, 두 개의 벡터, 세 개의 벡터, 개별 벡터, 한 개의 LNP, 두 개 의 LNP, 세 개의 LNP, 개별 LNP, 또는 이들의 조합으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA 또는 Cas 핵산분해효소를 벡터로서 또는 LNP 단독과 회합하여 또는 리보핵산단백질[RNP]로서 함께 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상) 전에, 공여자 작제물은 벡터로서 또는 LNP와 회합하여 생체 내 또는 시험관 내에서 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 작제물은 단일 투여로 전달된다. 일부 구현예에서, 공여자 작제물은 다중 투여로 전달될 수 있다. 또 다른 예로서, 알부민 가이드 RNA 또는 Cas 핵산분해효소는 작제물을, 벡터로서 또는 LNP와 회합되어 전달하기 전에 벡터나 mRNA로서 또는 LNP 단독과 회합되어 또는 리보핵산단백질[RNP]로서 함께 생체 내 또는 시험관 내에서 전달될 수 있다 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 단일 투여로 전달된다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 다중 투여로 전달 될 수 있다. 유사하게, SERPINA1은 RNA 및 Cas 핵산분해효소를 벡터 또는 mRNA로 유도하거나 LNP와 단독으로 또는 함께 리보핵산단백질[RNP]로 회합한다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시된 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA) 중 임의의 것을 투여하기 위한 약학적 제제를 또한 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적 제제는 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 및 본원에 개시된 대로 이종 AAT의 코딩 서열을 포함하는 공여자 작제물을 포함한다. 대상(예를 들어, 인간 대상)으로의 전달에 적합한 약학적 제제는 해당 분야에 잘 알려져 있다.

Ⅳ. 사용 방법

AAT를 암호화하는 유전자는 염색체 14q32.1과 단백질분해효소 억제제[Protease Inhibitor, Pi] 유전자좌의 일부에 위치한다. 정상 AAT는 PiM으로 지칭될 수 있다. PiZ 돌연변이는 동형접합 (ZZ) 및 이형접합(MZ 또는 SZ) 개체의 경우를 포함하여, 간 또는 폐 증상을 유발할 수 있다. PiS 돌연변이는 혈청 AAT를 약간 감소시키고 폐 질환 위험을 더 낮출 수 있다. 여러 다른 대립유전자 돌연변이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Greulich et al. "Alpha-1-antitrypsin deficiency: increasing awareness and improving diagnosis," Ther Adv Respir Dis. 2016]을 참조한다.

AATD는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 현재까지 보고된 150+의 공지된 AAT 돌연변이 중 하나 이상에 대한 하나 이상의 생리학적 증상, 혈액 검사 또는 유전 검사의 존재에 의해 진단될 수 있다. 예를 들어, 앞의 문헌을 참조한다. 혈액 또는 검사의 예에는 혈청 AAT 수준에 대한 검정, 중합효소 연쇄 반응[polymerase chain reaction, PCR] 또는 차세대 서열 분석[next generation sequencing, NGS]에 의한 돌연변이 검출, 면역블롯법을 포함하거나 포함하지 않는 등전 초점법[isoelectric focusing, IEF], AAT 유전자좌 서열 분석 및 혈청 분리기 카드(Z 단백질을 검출하기위한 측면 흐름 검정)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부 구현예에서, AAT 혈청 수준은 면역확산법을 사용하여 150-350 mg/dL 범위 내에서 정상으로 간주 될 수 있다(혈청 수준을 과대평가할 수 있음). 이들 구현예에서, 80 mg/dL의 수준은 정상 범위보다 낮음에도 불구하고 보호적인 것으로, 예를 들어 하나 이상의 증상, 예를 들어 폐기종 위험이 감소된 것으로 간주될 수 있다.

일부 구현예에서, AAT 혈청 수준은 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 90-200 mg/dL 내에서 정상으로 간주될 수 있다. 이들 구현예에서, 50 mg/dL의 수준은 정상 범위보다 낮음에도 불구하고 보호적인 것으로, 예를 들어, 하나 이상의 증상, 예를 들어, 폐기종 위험이 감소된 것으로 간주 될 수 있다.

일부 구현예에서, 약 130 mg/dL, 125 mg/dL, 120 mg/dL, 115 mg/dL, 110 mg/dL, 105 mg/dL, 또는 100 mg/dL 미만의 AAT 혈청 수준은 동형접합 AAT 돌연변이의 가능성이 낮음을 나타내며 또 다른 유전자 검사가 필요하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 약 104 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 동형접합 PiS 가능성을 나타내고, 113 mg/dL는 낮은 동형접합 PiZ 가능성을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAT 혈청 수준은 이형접합 담체들에 관한 제한된 배제 정보를 제공할 수 있으며, 또 다른 유전자 검사가 필요할 수 있는데, 이는 약 150 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 이형접합 담체 PiMZ 가능성을 나타내고, 약 220 mg/dL의 AAT 혈청 수준은 낮은 이형접합 담체 piMS 가능성을 나타내기 때문이다.

검출가능한 생리학적 증상의 예에는, 폐 질환 또는 간 질환; 쌕쌕거림 또는 숨가쁨; 폐 감염 위험 증가; 만성 폐쇄성 폐 질환[chronic obstructive pulmonary disease, COPD]; 기관지염, 천식, 호흡 곤란; 경화증; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 또는 가래; 반복되는 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰 부분의 황변; 배 또는 다리의 부종이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 개체가 COPD 환자, 비반응성 천식 환자, 병인이 알려지지 않은 기관지 확장증 환자, 크립토겐성 간경변/간 질환이 있는 개체, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 괴사성 지방층염 또는 AATD 환자/보균자의 일차 직계가족인 경우 혈액 또는 유전 검사를 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 폐 기능 검사[pulmonary function testing, PFT], 기능성 잔기 용량[functional residual capacity, RFC] 또는 총 폐 용량[total lung capacity, TLC]에서 폐 밀도 손실을 수행할 수 있다.

일부 구현예에서, 치료 대상에는 AAT 혈청이 정상 범위 미만인 개체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료 대상에는 임의의 대립유전자 돌연변이 조합, 예를 들어, ZZ, MZ, MS를 가지는 개체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료 대상에는 기관지확장제를 투여한 후 FEV1이 예상 정상 값의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%인 개체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료 대상에는 기관지경술에 적격인 개체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료 대상에는 적절한 간 및 신장 기능을 가진 개체, 비흡연자, 폐 또는 간엽 절제술을 받지 않은 개체, 이식, 폐 부피 감소 수술을 받지 않은 개체, 치료 직전 COPD 악화 또는 급성 호흡기 감염이 없는 개체, 또는 불안정한 폐심장증이 없는 개체가 포함된다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 개시는 단백질의 분비를 가능하게 하기 위해 인간 세이프 하버 부위, 예컨대, 알부민 세이프 하버 부위에서 이종 AAT(예를 들어, 기능성 또는 야생형 AAT)를 발현시켜 단백질의 분비를 가능하게 하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 그에 따라 폐에서 AATD의 부정적 효과를 완화시킨다. 본 개시는 또한 내인성 SERPINA1 유전자를 녹아웃시킴으로써, AATD를 앓고 있는 환자에서 간 증상을 초래하는 간실질세포에서 AAT 단백질 중합 및 응집과 연관된 AAT의 돌연변이 형태의 생성을 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다. 그 전체가 참조로 포함된 WO/2018/119182를 참조한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 간뿐만 아니라 폐에서 장애의 부정적 효과를 완화시킴으로써 AATD를 치료한다.

AAT는 주로 간실질세포에 의해 합성 및 분비되며 폐에서 호중구 엘라스테이스의 활성을 억제하는 기능을 한다. 기능성 AAT가 충분한 양이 없으면, 호중구 엘라스테이스는 조절되지 않고, 폐에서 폐포는 손상된다. 따라서 SERPINA1의 돌연변이로 인해 AAT 수준이 감소하거나 제대로 기능성 AAT 수준이 감소하면, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환[chronic obstructive pulmonary disease, COPD], 기관지염, 또는 천식을 포함한 폐 병리가 발생한다.

본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, 기능성 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 생체 내 또는 시험관 내에서 숙주 세포에 이종 AAT 핵산의 도입에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 숙주 세포에서, 또는 필요로 하는 대상에서 기능성 이종 AAT를 발현시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 필요로 하는 대상에서 AATD를 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 알부민 유전자좌에서 이종 AAT를 발현시켜서 AATD를 치료하면 기능성(예를 들어, 야생형) AAT의 분비가 향상되고, AATD의 하나 이상의 증상들, 예를 들어 폐에 대한 부정적 효과가 완화된다. 예를 들어, 이종 AAT 발현은 폐 질환 또는 간 질환; 쌕쌕거림 또는 숨가쁨; 폐 감염 위험 증가; COPD; 기관지염, 천식, 호흡 곤란; 경화증; 신생아 황달; 지방층염; 만성 기침 또는 가래; 반복되는 흉부 감기; 피부 또는 눈의 흰 부분의 황변; 배 또는 다리의 부종을 완화시킬 수 있다. 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제 중 임의의 하나 이상의 투여는 기능성(예를 들어, 야생형) AAT 유전자 발현, AAT 단백질 수준(예를 들어, 순환, 혈청, 또는 혈장 수준) 또는 AAT 활성 수준(예를 들어, 트립신 억제)을 증가시킨다(예를 들어, 예컨대, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법으로, 비처리 대조에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 초과하는 AAT 유전자 발현 또는 단백질 수준, 예를 들어, 혈청 내에서 약 40 mg/dL, 45 mg/dL, 50 mg/dL, 60 mg/dL, 70 mg/dL, 80 mg/dL, 90 mg/dL, 100 mg/dL, 또는 110 mg/dL를 초과하는 AAT). 일부 구현예에서, 치료의 효율성은 혈청 또는 혈장 AAT 활성을 측정하여 평가할 수 있되, 대상의 혈청 또는 혈장 수준 또는 AAT의 활성의 증가는 치료의 효율성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료의 효율성은 혈청 또는 혈장 AAT 단백질 또는 활성 수준을 측정하여 평가할 수 있되, 대상의 혈청 또는 혈장 수준 또는 AAT의 활성의 증가는 치료의 효율성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료 효율성은, 예를 들어 응집을 측정하기 위해 간 조직 절편을 PASD 염색하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 효율성은, 예를 들어 폐에서 호중구 엘라스테이스의 억제를 측정하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 효율성은 유전자형 혈청 수준, AAT 폐 기능, 폐활량 측정 검사, 폐 흉부 X선, 폐 CT 스캔, 간 기능 혈액 검사 또는 간 초음파로 평가될 수 있다.

일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 측정 시,예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL 넘게 증가시키는 것을 지칭한다.

일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 보호 수준까지 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어 정상 범위 이내로 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 혈청 AAT 수준을, 예를 들어, 혼탁측정법 또는 면역혼탁측정법 및 정제된 표준을 사용하여 측정 시, 예를 들어, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/dL 넘게 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는, 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, 기준선 혈청 AAT의 개선을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는, 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여, AATD와 연관된 간 질환의 조직학적 등급에 있어서, 예를 들어, 1, 2, 3 이상의 점수까지의 개선을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어, 치료 전후의 대조군과 비교하여 이삭 섬유증 점수의 개선을 의미한다.

정상 또는 건강한 개체(예를 들어, ZZ, MZ 또는 SZ 대립유전자가 없는 개체)에서 AAT 수준은 혈청에서 약 500 μg/ml 내지 약 3,000 μg/ml 사이에서 변화한다. 임상적으로, 순환 AAT의 수준은 효소적 또는 면역학적 검정(예를 들어, ELISA)에 의해 측정될 수 있으며, 이 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Stoller, J. and Aboussouan, L. (2005) Alpha1-antitrypsin deficiency. Lancet 365: 2225-2236; Kanakoudi F, Drossou V, Tzimouli V, et al: Serum concentrations of 10 acute-phase proteins in healthy term and pre-term infants from birth to age 6 months. Clin Chem 1995;41:605-608; Morse JO: Alpha-1-antitrypsin deficiency. N Engl J Med 1978;299:1045-1048, 1099-1105; Cox DW: Alpha-1-antitrypsin deficiency. In The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Vol 3. Seventh edition. Edited by CR Scriver, AL Beaudet, WS Sly, D Valle. New York, McGraw-Hill Book Company, 1995, pp 4125-4158]을 참조한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AATD를 앓고 있는 대상(예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체) 또는 AATD가 발병할 위험이 있는 대상(예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체)에서 AAT(예를 들어, 기능성 AAT 또는 야생형 AAT)의 혈청 또는 혈장 수준을 약 500 μg/ml 이상까지 증가시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AAT 단백질 수준을 약 1,500 μg/ml까지 증가시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AAT 단백질 수준을 약 1,000 μg/ml 내지 약 1,500 μg/ml, 약 1,500 μg/ml 내지 약 2,000 μg/ml, 약 2,000 μg/ml 내지 약 2,500 μg/ml, 약 2,500 μg/ml 내지 약 3,000 μg/ml 이상까지 증가시키는 데 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AATD를 앓고 있는 대상에서의 AAT의 혈청 또는 혈장 수준을 약 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, μg/ml 이상까지 증가시키는 데 유용하다.

일부 구현예에서 본원에 개시된 조성물 및 방법은 AATD를 앓고 있는 대상(예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립 유전자를 보유한 개체) 또는 AATD가 발병할 위험이 있는 대상 (예를 들어, ZZ, MZ, 또는 SZ 대립유전자를 보유한 개체)에서 AAT의 혈청 또는 혈장 수준을 투여하기 전의 대상의 AAT 혈청 또는 혈장 수준에 비해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 이상까지 증가시키는 데 유용하다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 숙주 세포에서 이종 기능성 AAT 단백질 또는 AAT 활성을 숙주 세포에 투여하기 전의 AAT 수준, 예를 들어, 정상 수준에 비해 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 이상까지 증가시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 세포는 간세포이다.

일부 구현예에서, 세포(숙주 세포), 예를 들어 간, 폐, 소화 기관, 신장, 위, 근위 및 원위 소장, 췌장, 부신 또는 뇌 중 임의의 하나 이상의 조직에서 유래하는 세포, 또는 세포 집단은 AAT를 발현 할 수 있다.

일부 구현예에서, 방법은 LNP 중의 가이드 RNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예컨대, Cas9 핵산분해효소를 암호화하는 mRNA)를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 AAT 단백질을 암호화하는 AAV 핵산 작제물, 예컨대 양방향 AAT 작제물을 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA 및 Cas9를 암호화하는 mRNA를 포함하는 CRISPR/Cas9 LNP는 정맥 내로 투여될 수 있다. AAV AAT 공여자 작제물은 정맥 내로 투여될 수 있다. CRISPR/Cas9 LNP 용량의 예시에는 약 0.1, 0.25, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 또는 10 mpk(RNA)가 포함된다. 단위 mg/kg 및 mpk는 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다. AAT 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 AAV의 예시 용량은 약 10¹¹, 10¹², 10¹³, 및 10¹⁴ vg/kg의 MOI를 포함하며, 임의로 MOI는 약 1 x 10¹³ 내지 1 x 10¹⁴ vg/kg 일 수 있다.

일부 구현예에서, 방법은 AAT 단백질의 치료 유효량을 발현하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 개체에서 순환 AAT 활성의 치료 유효 수준을 달성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 정상의 적어도 약 5% 내지 약 50%의 AAT 활성을 달성하는 단계를 포함한다. 방법은 정상의 적어도 약 50% 내지 약 150%의 AAT 활성을 달성하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 환자의 기준선 AAT 활성에 비해 정상 AAT 활성의 적어도 약 1% 내지 약 50%, 또는 정상 AAT 활성의 적어도 약 5% 내지 약 50%, 또는 정상 AAT 활성의 적어도 약 50% 내지 약 150%의 AAT 활성 증가를 달성하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은, 예를 들어 적어도 1년의 내구성 효과를 달성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은, 예를 들어 적어도 1년의 내구성 있고 지속적인 방식으로 치료 효과를 달성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 순환 AAT 활성 수준 또는 수준은 적어도 한 개월 간 안정적이다. 일부 구현예에서 정상 상태 활성 또는 AAT 단백질 수준은 적어도 7일, 적어도 14일, 또는 적어도 28일까지 달성된다. 추가 구현예에서, 방법은 단회 투여 후 AAT 활성 또는 수준을 적어도 1년 간 유지하는 단계를 포함한다.

알부민 유전자좌로의 삽입을 포함하는 추가 구현예에서, 개체의 순환 알부민 수준은 정상이다. 이 방법은 개체의 순환 알부민 수준을 정상 순환 알부민 수준의 ±5%, ±10%, ±15%, ±20%, or ±50% 내로 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 개체의 알부민 수준은 치료되지 않은 개체의 알부민 수준과 비교하여 최소 4주, 8주, 12주 또는 20주까지 변하지 않는다. 특정 구현예에서, 개체의 알부민 수준은 일시적으로 떨어진 다음 정상 수준으로 되돌아간다. 특히, 방법은 혈장 알부민 수준의 현저한 변화를 검출하지 않는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 기재된 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단으로 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 알부민 유전자, 예컨대 인간 알부민 유전자를 변형(예를 들어, 이중 가닥 절단 생성)하는 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단으로 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 알부민 인트론 1 영역, 예컨대 인간 알부민 인트론 1을 변형(예를 들어, 이중 가닥 절단 생성)하는 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단으로 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 인간 세이프 하버, 예를 들어, 간 조직 또는 간실질세포의 숙주 세포를 변형(예를 들어, 이중 가닥 절단 생성)하는 방법 및 용도를 포함한다. 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 알부민 유전자좌 내부로 삽입함으로써, 숙주 세포 또는 세포 집단, 예컨대 간세포에 현저하게 유해한 영향을 주지 않으면서 SERPINA1 유전자가 과발현될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 숙주 세포로 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1을 변형(예를 들어, 이중 가닥 절단 생성)하는 방법 및 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1(서열 번호 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 함유하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 시험관 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 투여는 생체 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 공여자 작제물은 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하는 양방향 작제물이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 알부민 gRNA, 공여자 작제물(예를 들어, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물), 및 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 숙주 세포에 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물을 도입하는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1(서열 번호 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 함유하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 a) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 번호 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96 또는 97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; d) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드; f) 서열 번호 34-97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; 및 g) 서열 번호 2-33에 열거된 게놈 좌표의 15개 연속 뉴클레오타이드 +/- 다섯 개 뉴클레오타이드에 상보적인 서열에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 알부민 gRNA, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 및 본원에 기재된 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 숙주 세포에서 이종 AAT (예를 들어, 기능성 또는 야행형 AAT) 를 발현하는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 이 방법 및 용도를 필요로 하는 대상은 신생아 내지 2세 연령; 2 내지 12세 연령; 또는 12 내지 21세 연령이다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1(서열 번호 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 함유하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 a) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 또는 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 번호 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 또는 97로 이루어진 군에 서 선택되는 서열; d) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; f) 서열 번호 34-97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; 및 g) 서열 번호 2-33에 열거된 게놈 좌표들 내부의 또는 이에 걸친 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속 뉴클레오타이드에 상보적인 서열에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 시험관 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 투여는 생체 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 및 본원에 기재된 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소)를 치료를 필요로 하는 대상에게 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 AATD 치료 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 마우스 또는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1(서열 번호 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 함유하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 a) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; b) 서열 번호 2, 8, 13, 19, 28, 29, 31, 32, 33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; c) 서열 번호 34, 40, 45, 51, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 72, 77, 83, 92, 93, 95, 96, 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; d) 서열 번호 2-33으로 구성된 그룹에서 선택되는 서열에 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일한 서열; e) 서열 번호 2-33으로 이루어진 그룹에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드; f) 서열 번호 34-97로 이루어진 군에서 선택되는 서열; 및 g) 서열 번호 2-33에 열거된 게놈 좌표들의 15개 연속 뉴클레오타이드 +/- 다섯 개 뉴클레오타이드에 상보적인 서열에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 알부민 gRNA, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 및 본원에 기재된 RNA-가이드 DNA 결합제(예를 들어, Cas 핵산분해효소) 중 임의의 하나 이상을 투여 또는 전달하는 단계를 포함한 간세포에서 기능성 AAT를 증가시키는 방법 또는 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 마우스 또는 인간 알부민 유전자좌의 인트론 1(서열 번호 1) 내부의 영역에 결합할 수 있는 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열에 적어도 95% 동일하거나 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA는 서열 번호 4, 13, 17, 19, 27, 28, 30, 또는 31 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 시험관 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 투여는 생체 내에서 시행된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 간세포이다.

본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 전달 시스템 및 방법을 사용하여 전달될 수 있다. 조성물은 시험관 내 또는 생체내에서 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA 및 Cas 핵산분해효소는 시험관 내 또는 생체 내에서 동시에, 예를 들어 한 개의 벡터, 두 개의 벡터, 개별 벡터, 한 개의 LNP, 두 개의 LNP, 개별 LNP 또는 이들의 조합으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 알부민 gRNA 또는 Cas 핵산분해효소를 벡터로서 또는 LNP 단독과 회합하여 또는 리보핵단백질[RNP]로서 함께 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상) 전에, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물은 벡터로서 또는 LNP와 회합하여 생체 내 또는 시험관 내에서 전달될 수 있다. 또 다른 예로서, 작제물을 벡터로서 또는 LNP와 회합하여 전달하기 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상) 전에, 가이드 RNA 및 Cas 핵산분해효소는 벡터로서 또는 LNP 단독과 회합하여 또는 리보핵단백질[RNP]로서 함께 생체 내 또는 시험관 내에서 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물을 전달하기 전에, 가이드 RNA 및 Cas 핵산분해효소는 LNP와 회합되어 숙주 세포에 전달된다.

일부 구현예에서, 양방향 핵산 작제물은 이종 AAT를 암호화하는 서열을 포함하되, AAT 서열은 야생형 AAT, 예를 들어 서열 번호 700 또는 702이다.일부 구현예에서, 서열은 AAT의 기능성 변이체를 암호화한다. 예를 들어, 이러한 변이체는 야생형 AAT보다 증가된 트립신 억제 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 서열은 서열 번호 702에 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 동일하고, 야생형 AAT에 비해 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 활성을 가지는 AAT 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 서열은 AAT의 기능성 단편을 암호화하되, 단편은 야생형 AAT에 비해 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 100% 이상의 활성을 보유한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물은 핵산 벡터, 예컨대 AAV 벡터, 예를 들어 AAV8로 투여된다. 일부 구현예에서, 공여자 작제물은 상동성 팔을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 대상은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간이다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 정맥 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제는 간 순환으로 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제를 단일 투여하는 것은 AAT의 발현 및 분비를 바람직한 수준으로 증가시키기에 충분하다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물, 알부민 gRNA 및 RNA-가이드 DNA 결합제를 포함하는 조성물을 1회 넘게 투여하는 것은, 치료 효과를 최대화에 유익할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 양방향 핵산 작제물의 다회 여, 알부민 gRNA, 및 RNA-가이드 DNA 결합제의 다중 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키고 또는 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 알부민 가이드 RNA의 다중 투여는 AAT 의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키거나 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, Cas 핵산분해효소의 다중 투여는 AAT의 발현 및 분비를 원하는 수준으로 증가시키거나 축적 효과를 통해 편집을 최대화하기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, AATD를 치료하는 방법은 서열 번호 1,000-1,131의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 gRNA를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 1,000-1,131의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 gRNA가 AATD를 치료하기 위해 투여된다. SERPINA1 가이드 RNA는 Cas 단백질 또는 mRNA 또는 Cas 단백질, 예컨대 Cas9를 암호화하는 벡터와 함께 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상의 혈청, 간, 간 조직, 간세포, 또는 간실질세포에서 AAT(예를 들어, 돌연변이, 비기능성 AAT)의 축적을 감소 또는 방지하는 단계를 포함한 AATD 치료 방법이 제공되며, 이는 서열 번호 1,000-1,131의 가이드 서열들 중 임의의 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 1,000-1,131의 가이드 서열들 중 임의의 하나 이상을 포함하는 SERPINA1 gRNA는 간, 간 조직, 간세포, 또는 간실질세포에서 AAT(예를 들어, 돌연변이, 비기능성 AAT)의 축적을 감소 또는 방지하기 위해 투여된다. gRNA는 RNA-가이드 DNA 결합제, 예컨대, Cas 단백질 또는 mRNA 또는 Cas 단백질, 예컨대 Cas9를 암호화하는 벡터와 함께 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, Cas 단백질과 함께 표 2의 가이드 서열들을 포함하는 SERPINA1 gRNA는 DSB를 유도하고, 복구 중 비상동성 말단 연결[non-homologous ending joining, NHEJ]은 SERPINA1 유전자에서 돌연변이를 초래한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 초래하고, 이는 SERPINA1 유전자에서 프레임 이동 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질과 함께 표 2의 가이드 서열들을 포함하는 gRNA는 DSB를 유도하고, NHEJ 복구는 주형 핵산 작제물의 삽입을 매개한다. 일부 구현예에서, 주형 핵산의 삽입은 분비된 AAT 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 주형 핵산의 삽입은 분비된 이종 AAT 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 주형 핵산의 삽입은 혈액, 혈청 또는 혈장 AAT 단백질 수준을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA를 투여하는 것은 대상에 의해 생성된 내인성 알파-1 항트립신[AAT] 수준을 감소시키므로, 간에서 AAT의 축적 및 응집을 방지한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA의 단일 투여는 내인성 단백질의 발현을 녹다운시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA의 단일 투여는 내인성 단백질의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키기에 충분하다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 SERPINA1 가이드 RNA를 1회 넘게 투여하는 것은 누적 효과를 통해 편집을 최대화하는 데 유익할 수 있다.

일부 구현예에서, 내인성 AAT 단백질 발현은 가이드 RNA 이외의 핵산 치료제의 투여로 인해 감소된다. 특정 구현예에서, 핵산은 RNAi 작용제이다. SERPINA1을 표적하는 예시적 iRNA 작용제는 예를 들어 WO2018098117, WO2015003113 및 WO2015195628A2에 제공되어 있다. 957-977, 1,418-1,424번 및 1,423-1,435번 뉴클레오타이드를 표적하는 강력한 RNAi 작용제가 기재되었다. 대상에서 내인성 AAT 단백질의 발현을 감소시키고 AATD를 치료하기 위한 RNAi 작용제의 제조 방법 및 그의 용도는 인용된 공보에 제공되어 있으며 당업계에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA를 투여하는 것은 대상에 의해 생성된 순환 알파-1 항트립신[AAT]의 수준을 증가시키고, 이로써 높은 호중구 엘라스테이스 활성과 연관된 손상을 예방한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA의 단일 투여 또는 다중 투여는 기능성 AAT 단백질의 발현을 증가시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA의 단일 투여 또는 다중 투여는 AAT 단백질 활성의 발현을 보충하거나 회복시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 삽입 가이드 RNA는 AAT 혈청 수준을, 예를 들어, 보호 수준(예를 들어, 면역확산에 의해 측정할 때 80 mg/dL 이상, 비탁법 또는 면역비탁법 및 정제 표준을 사용하여 측정할 때 50 mg/dL 이상)까지 증가시킨다. 일부 구현예에서, 삽입 가이드 RNA는 AAT 혈청 수준을, 예를 들어, 정상 수준(예를 들어, 면역확산에 의해 측정할 때 150-350 mg/dL, 비탁법 또는 면역비탁법 및 정제 표준을 사용하여 측정할 때 90-200 mg/dL)까지 증가시킨다. 일부 구현예에서, 삽입 가이드 RNA는, 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여 AATD와 연관된 간 질환의 조직학적 등급 분류를, 예를 들어 1, 2, 3점 이상까지 개선시킨다. 일부 구현예에서, 삽입 가이드 RNA는, 예를 들어 치료 전후에 대조군과 비교하여 이샤크(Ishak) 섬유증 점수의 개선을 초래한다. 일부 구현예에서, 단일 투여는, 예를 들어 폐 기능 검사[PFT], 기능성 잔기 용량[RFC], 또는 총 폐 용량[TLC]에서 폐 밀도 손실에 의해 검정된 대로 폐 질환 측정을 개선시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 삽입 가이드 RNA를 1회 넘게 투여하는 것은 누적 효과를 통해 편집의 최대화에 유익할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물을 사용한 치료 효능은, 전달하고 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 10년 후에 나타난다.

일부 구현예에서, 치료는 AATD와 연관된 폐 질환 진행을 지연 또는 중단시킨다. 일부 구현예에서, 폐 질환은 대상의 폐 구조, 폐 기능 또는 증상의 변화로 측정한다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 대상의 증가된 생존 시간으로 측정한다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 폐 징후의 발달을 지연시키는 것에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 폐 징후의 발달의 지연으로 측정한다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 임의의 하나 이상의 COPD, 폐기종 또는 호흡곤란의 진행의 지연으로 측정한다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 기침, 가래 생성 또는 천명 중 임의의 하나 이상의 개선 또는 안정화로 측정한다.

일부 구현예에서, 치료는 간 질환 진행을 지연시키거나 중단시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 간 질환 척도를 개선시킨다. 일부 구현예에서, 간 질환은 대상의 간 구조, 간 기능 또는 증상의 변화로 측정한다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 대상에서 간 이식을 지연시키거나 피하는 능력으로 측정한다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 대상의 증가된 생존 시간으로 측정한다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 혈액 내 간 효소의 감소로 측정한다. 일부 구현예에서, 간 효소는 알라닌 아미노기 전이효소[alanine transaminase, ALT] 또는 아스파테이트 아미노기 전이효소[aspartate transaminase, AST]이다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 생검 결과에 기초하여 간 내 반흔 조직의 발달 지연 또는 반흔 조직의 감소로 측정된다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 피로, 쇠약, 가려움증, 식욕 부진, 식욕 부진, 체중 감소, 메스꺼움 또는 복부팽만감과 같은 환자 보고 결과를 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 부종, 복수 또는 황달의 감소로 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 문맥압항진증의 감소로 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 간암 발생률의 감소로 측정된다.

일부 구현예에서, 치료 효능은 영상화 방법을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 영상법은 초음파, 컴퓨터 단층촬영, 자기공명영상 또는 탄성촬영술이다.

일부 구현예에서, 혈청 또는 간의 AAT 수준(예를 들어, 돌연변이, 비기능성 AAT)은 조성물 투여 전 혈청 또는 간 AAT 수준(예를 들어, 돌연변이, 비기능성 AAT)과 비교하여 70-95%, 80-95%, 85-95%, 80-99% 또는 85-99%까지 감소된다.

일부 구현예에서, SERPINA1 유전자의 편집 퍼센트는 70-99%이다. 일부 구현예에서, 편집 퍼센트는 70-95%, 80-95%, 85-95%, 80-99%, 또는 85-99%이다.

일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1 또는 표 2, 또는 표 3의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나 이상의 가이드 RNA(알부민 gRNA; 또는 SERPINA1 gRNA)의 용도는, AATD를 앓고 있는 인간 대상에 대한 의약의 제조를 위해 제공된다.

일부 구현예에서, 본 개시는 AATD의 폐 증상을 완화시키는 데 적합한 증강 요법과 함께 표 1 또는 표 2에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 병용 요법을 제공한다. 일부 구현예에서, 폐 질환에 대한 증강 요법은 문헌[Turner, BioDrugs 2013 Dec;27(6):547-58]에 기재된 바와 같이 인간 혈장으로부터 정제된 AAT를 이용한 정맥 내 요법이다. 일부 구현예에서, 증강 요법은 Prolastin^®, Zemaira^®, Aralast^® 또는 Kamada^®를 사용한다.

일부 구현예에서, 병용 요법은, 야생형 ATT 서열을 표적하는 siRNA와 함께 제1 알파-1 항트립신[AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열 및 제2 알파-1 항트립신[AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하는 양방향 작제물과 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는, 야생형 또는 돌연변이 AAT의 발현을 더 감소시키거나 제거할 수 있는 임의의 siRNA이다. 일부 구현예에서, siRNA는, 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 및 양방향 작제물 중 임의의 하나 이상을 투여한 후 투여된다. 일부 구현예에서, siRNA는, 표 1의 gRNA 조성물 및 본원에 제공된 양방향 작제물 중 임의의 것으로 치료한 후 정기적으로 투여된다.

일부 구현예에서, 병용 요법은, 금연, 예방 백신, 기관지 확장제, 유도된 경우 산소 보충, 및 흡연 연관 COPD 환자를 위해 고안된 하나 이상의 치료와 함께, 제1 알파-1 항트립신[AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열 및 제2 알파-1 항트립신[AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하는 양방향 작제물과 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나를 포함하는 gRNA 중 임의의 하나를 포함한다.

이러한 기재 및 예시적 구현예들은 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 구현예에 있어서, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 구현예에서 사용된 수량, 백분율 또는 비율, 및 기타 수치값을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 이들이 그렇게 이미 변형되지 않은 정도로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대의 표시가 없는 한, 본 명세서 및 첨부된 구현예에 제시된 숫자 매개변수들은 근사치로서 얻고자 하는 속성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 그리고 본 발명의 구현예들의 범위에 대한 균등론 적용을 제한하고자 하는 시도로서가 아니라, 각 숫자 변수는 적어도 기록된 유효 자릿수의 수를 고려하여 그리고 통상의 올림법을 적용하여 해석되어야 한다.

인간 AAT 단백질 서열 (서열 번호 700)(NCBI 참조 번호: NP_000286):

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK

인간 AAT 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 701)(NCBI 참조 번호: NM_000295):

ACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGACAATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTGAGGATCCCCAGGGAGATGCTGCCCAGAAGACAGATACATCCCACCATGATCAGGATCACCCAACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCTGAGTTCGCCTTCAGCCTATACCGCCAGCTGGCACACCAGTCCAACAGCACCAATATCTTCTTCTCCCCAGTGAGCATCGCTACAGCCTTTGCAATGCTCTCCCTGGGGACCAAGGCTGACACTCACGATGAAATCCTGGAGGGCCTGAATTTCAACCTCACGGAGATTCCGGAGGCTCAGATCCATGAAGGCTTCCAGGAACTCCTCCGTACCCTCAACCAGCCAGACAGCCAGCTCCAGCTGACCACCGGCAATGGCCTGTTCCTCAGCGAGGGCCTGAAGCTAGTGGATAAGTTTTTGGAGGATGTTAAAAAGTTGTACCACTCAGAAGCCTTCACTGTCAACTTCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGATCAACGATTACGTGGAGAAGGGTACTCAAGGGAAAATTGTGGATTTGGTCAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTTGCTCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGGCAAATGGGAGAGACCCTTTGAAGTCAAGGACACCGAGGAAGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCTATGATGAAGCGTTTAGGCATGTTTAACATCCAGCACTGTAAGAAGCTGTCCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAATACCTGGGCAATGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGAAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAAATGAAGACAGAAGGTCTGCCAGCTTACATTTACCCAAACTGTCCATTACTGGAACCTATGATCTGAAGAGCGTCCTGGGTCAACTGGGCATCACTAAGGTCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCTGAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTCAAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCTCCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCTCAACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTCCCTGGATGACATTAAAGAAGGGTTGAGCTGGTCCCTGCCTGCATGTGACTGTAAATCCCTCCCATGTTTTCTCTGAGTCTCCCTTTGCCTGCTGAGGCTGTATGTGGGCTCCAGGTAACAGTGCTGTCTTCGGGCCCCCTGAACTGTGTTCATGGAGCATCTGGCTGGGTAGGCACATGCTGGGCTTGAATCCAGGGGGGACTGAATCCTCAGCTTACGGACCTGGGCCCATCTGTTTCTGGAGGGCTCCAGTCTTCCTTGTCCTGTCTTGGAGTCCCCAAGAAGGAATCACAGGGGAGGAACCAGATACCAGCCATGACCCCAGGCTCCACCAAGCATCTTCATGTCCCCCTGCTCATCCCCCACTCCCCCCCACCCAGAGTTGCTCATCCTGCCAGGGCTGGCTGTGCCCACCCCAAGGCTGCCCTCCTGGGGGCCCCAGAACTGCCTGATCGTGCCGTGGCCCAGTTTTGTGGCATCTGCAGCAACACAAGAGAGAGGACAATGTCCTCCTCTTGACCCGCTGTCACCTAACCAGACTCGGGCCCTGCACCTCTCAGGCACTTCTGGAAAATGACTGAGGCAGATTCTTCCTGAAGCCCATTCTCCATGGGGCAACAAGGACACCTATTCTGTCCTTGTCCTTCCATCGCTGCCCCAGAAAGCCTCACATATCTCCGTTTAGAATCAGGTCCCTTCTCCCCAGATGAAGAGGAGGGTCTCTGCTTTGTTTTCTCTATCTCCTCCTCAGACTTGACCAGGCCCAGCAGGCCCCAGAAGACCATTACCCTATATCCCTTCTCCTCCCTAGTCACATGGCCATAGGCCTGCTGATGGCTCAGGAAGGCCATTGCAAGGACTCCTCAGCTATGGGAGAGGAAGCACATCACCCATTGACCCCCGCAACCCCTCCCTTTCCTCCTCTGAGTCCCGACTGGGGCCACATGCAGCCTGACTTCTTTGTGCCTGTTGCTGTCCCTGCAGTCTTCAGAGGGCCACCGCAGCTCCAGTGCCACGGCAGGAGGCTGTTCCTGAATAGCCCCTGTGGTAAGGGCCAGGAGAGTCCTTCCATCCTCCAAGGCCCTGCTAAAGGACACAGCAGCCAGGAAGTCCCCTGGGCCCCTAGCTGAAGGACAGCCTGCTCCCTCCGTCTCTACCAGGAATGGCCTTGTCCTATGGAAGGCACTGCCCCATCCCAAACTAATCTAGGAATCACTGTCTAACCACTCACTGTCATGAATGTGTACTTAAAGGATGAGGTTGAGTCATACCAAATAGTGATTTCGATAGTTCAAAATGGTGAAATTAGCAATTCTACATGATTCAGTCTAATCAATGGATACCGACTGTTTCCCACACAAGTCTCCTGTTCTCTTAAGCTTACTCACTGACAGCCTTTCACTCTCCACAAATACATTAAAGATATGGCCATCACCAAGCCCCCTAGGATGACACCAGACCTGAGAGTCTGAAGACCTGGATCCAAGTTCTGACTTTTCCCCCTGACAGCTGTGTGACCTTCGTGAAGTCGCCAAACCTCTCTGAGCCCCAGTCATTGCTAGTAAGACCTGCCTTTGAGTTGGTATGATGTTCAAGTTAGATAACAAAATGTTTATACCCATTAGAACAGAGAATAAATAGAACTACATTTCTTGCA

P00450로 암호화된 알파 1-항트립신 폴리펩타이드(서열 번호 702):

EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK

인간 AAT 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 703)(NCBI 참조 번호: NM_001127700.2):

AGAGTCCTGAGCTGAACCAAGAAGGAGGAGGGGGTCGGGCCTCCGAGGAAGGCCTAGCCGCTGCTGCTGCCAGGAATTCCAGGTTGGAGGGGCGGCAACCTCCTGCCAGCCTTCAGGCCACTCTCCTGTGCCTGCCAGAAGAGACAGAGCTTGAGGAGAGCTTGAGGAGAGCAGGAAAGGTGGGACATTGCTGCTGCTGCTCACTCAGTTCCACAGGACAATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTGAGGATCCCCAGGGAGATGCTGCCCAGAAGACAGATACATCCCACCATGATCAGGATCACCCAACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCTGAGTTCGCCTTCAGCCTATACCGCCAGCTGGCACACCAGTCCAACAGCACCAATATCTTCTTCTCCCCAGTGAGCATCGCTACAGCCTTTGCAATGCTCTCCCTGGGGACCAAGGCTGACACTCACGATGAAATCCTGGAGGGCCTGAATTTCAACCTCACGGAGATTCCGGAGGCTCAGATCCATGAAGGCTTCCAGGAACTCCTCCGTACCCTCAACCAGCCAGACAGCCAGCTCCAGCTGACCACCGGCAATGGCCTGTTCCTCAGCGAGGGCCTGAAGCTAGTGGATAAGTTTTTGGAGGATGTTAAAAAGTTGTACCACTCAGAAGCCTTCACTGTCAACTTCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGATCAACGATTACGTGGAGAAGGGTACTCAAGGGAAAATTGTGGATTTGGTCAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTTGCTCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGGCAAATGGGAGAGACCCTTTGAAGTCAAGGACACCGAGGAAGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCTATGATGAAGCGTTTAGGCATGTTTAACATCCAGCACTGTAAGAAGCTGTCCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAATACCTGGGCAATGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGAAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAAATGAAGACAGAAGGTCTGCCAGCTTACATTTACCCAAACTGTCCATTACTGGAACCTATGATCTGAAGAGCGTCCTGGGTCAACTGGGCATCACTAAGGTCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCTGAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTCAAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCTCCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCTCAACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTCCCTGGATGACATTAAAGAAGGGTTGAGCTGGTCCCTGCCTGCATGTGACTGTAAATCCCTCCCATGTTTTCTCTGAGTCTCCCTTTGCCTGCTGAGGCTGTATGTGGGCTCCAGGTAACAGTGCTGTCTTCGGGCCCCCTGAACTGTGTTCATGGAGCATCTGGCTGGGTAGGCACATGCTGGGCTTGAATCCAGGGGGGACTGAATCCTCAGCTTACGGACCTGGGCCCATCTGTTTCTGGAGGGCTCCAGTCTTCCTTGTCCTGTCTTGGAGTCCCCAAGAAGGAATCACAGGGGAGGAACCAGATACCAGCCATGACCCCAGGCTCCACCAAGCATCTTCATGTCCCCCTGCTCATCCCCCACTCCCCCCCACCCAGAGTTGCTCATCCTGCCAGGGCTGGCTGTGCCCACCCCAAGGCTGCCCTCCTGGGGGCCCCAGAACTGCCTGATCGTGCCGTGGCCCAGTTTTGTGGCATCTGCAGCAACACAAGAGAGAGGACAATGTCCTCCTCTTGACCCGCTGTCACCTAACCAGACTCGGGCCCTGCACCTCTCAGGCACTTCTGGAAAATGACTGAGGCAGATTCTTCCTGAAGCCCATTCTCCATGGGGCAACAAGGACACCTATTCTGTCCTTGTCCTTCCATCGCTGCCCCAGAAAGCCTCACATATCTCCGTTTAGAATCAGGTCCCTTCTCCCCAGATGAAGAGGAGGGTCTCTGCTTTGTTTTCTCTATCTCCTCCTCAGACTTGACCAGGCCCAGCAGGCCCCAGAAGACCATTACCCTATATCCCTTCTCCTCCCTAGTCACATGGCCATAGGCCTGCTGATGGCTCAGGAAGGCCATTGCAAGGACTCCTCAGCTATGGGAGAGGAAGCACATCACCCATTGACCCCCGCAACCCCTCCCTTTCCTCCTCTGAGTCCCGACTGGGGCCACATGCAGCCTGACTTCTTTGTGCCTGTTGCTGTCCCTGCAGTCTTCAGAGGGCCACCGCAGCTCCAGTGCCACGGCAGGAGGCTGTTCCTGAATAGCCCCTGTGGTAAGGGCCAGGAGAGTCCTTCCATCCTCCAAGGCCCTGCTAAAGGACACAGCAGCCAGGAAGTCCCCTGGGCCCCTAGCTGAAGGACAGCCTGCTCCCTCCGTCTCTACCAGGAATGGCCTTGTCCTATGGAAGGCACTGCCCCATCCCAAACTAATCTAGGAATCACTGTCTAACCACTCACTGTCATGAATGTGTACTTAAAGGATGAGGTTGAGTCATACCAAATAGTGATTTCGATAGTTCAAAATGGTGAAATTAGCAATTCTACATGATTCAGTCTAATCAATGGATACCGACTGTTTCCCACACAAGTCTCCTGTTCTCTTAAGCTTACTCACTGACAGCCTTTCACTCTCCACAAATACATTAAAGATATGGCCATCACCAAGCCCCCTAGGATGACACCAGACCTGAGAGTCTGAAGACCTGGATCCAAGTTCTGACTTTTCCCCCTGACAGCTGTGTGACCTTCGTGAAGTCGCCAAACCTCTCTGAGCCCCAGTCATTGCTAGTAAGACCTGCCTTTGAGTTGGTATGATGTTCAAGTTAGATAACAAAATGTTTATACCCATTAGAACAGAGAATAAATAGAACTACATTTCTTGCA

인간 AAT 단백질 신호 서열(서열 번호 705)

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA

[표 9A]

서열 번호 770, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 780, 790, 795 및 1,564에 제공된 주형에 공통적인 서열은 다음과 같다.

스플라이스 수여 Fwd:

taggtcagtgaagagaagaacaaaaagcagcatattacagttagttgtcttcatcaatctttaaatatgttgtgtggtttttctctccctgtttccacag(서열 번호1,301)

스플라이스 수여 Rev:

ctgtggaaacagggagagaaaaaccacacaacatatttaaagattgatgaagacaactaactgtaatatgctgctttttgttcttctcttcactgaccta(서열 번호 1,302)

서열 번호 1,564에 대한 스플라이스 수여 Fwd

TGCATAATCTAAGTCAAATGGAAAGAAATATAAAAAGTAACATTATTACTTCTTGTTTTCTTCAGTATTTAACAATCCttttttttCTTCCCTTGCCCAG(서열 번호 1,554)

서열 번호 1,564에 대한 스플라이스 수여 Rev

CTGGGCAAGGGAAGaaaaaaaaGGATTGTTAAATACTGAAGAAAACAAGAAGTAATAATGTTACTTTTTATATTTCTTTCCATTTGACTTAGATTATGCA(서열 번호 1,555)

모든 주형에 공통적인 종결 서열 Fwd는 다음과 같다.

CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTT(서열 번호 1,304)

종결인자 Rev:

ggggataccccctagagccccagctggttcttttctcctcagaagCCATAGAGCCCATCTCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATTCTATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCATGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCTagg(서열 번호 1,305)

[표 9B]

일부 구현예에서, 삽입 주형은 서열번호 717(작제물 7) 또는 719(작제물 8)의 SERPINA1 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입 주형은 서열번호 717(작제물 7) 또는 719(작제물 8)와 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입 주형은 409-431, 409-410, 412-431, 415-418, 506-528, 506-525, 519-522, 527-528, 538-560, 538-557, 551-554, 559-560, 957-977, 970-976, 1,403-1,436, 1,403-1,425, 1,410-1,436, 1,418-1,424, 1,423-1,435번 염기, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 서열의 영역(또는 하나 이상의 영역)에서 비야생형 코돈 사용 빈도를 포함한다.

실시예

아래의 실시예는 개시된 특정 구현예들을 예시하기 위해 제공하며, 임의의 방식으로 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1. 재료 및 방법

차세대 서열 분석[Next-generation sequencing, NGS] 및 표적상 절단 효율 분석

제조사의 프로토콜에 따라 상업적 키트, 예를 들어 Zymo Research DNA Extraction 키트(카탈로그 번호 D3012)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다.

게놈의 표적 위치에서의 편집 효율성을 정량적으로 판정하기 위해 딥 서열 분석을 활용하여, 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 식별하였다. PCR 프라이머를 목적 유전자(예를 들어, SERPINA1) 내의 표적 부위 주변에 설계하였고, 목적 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열 설계를 해당 분야의 표준과 같이 수행하였다.

제조업체의 프로토콜(Illumina)에 따라 추가 PCR을 수행하여, 서열 분석을 위한 화학 물질을 첨가하였다. 앰플리콘을 Illumina MiSeq 기기에서 서열 분석하였다. 판독물은 품질 점수가 낮은 것들을 제거한 후 인간 참조 게놈(예를 들어, hg38)에 대해 정렬하였다. 판독물을 함유하는 생성 파일을 참조 게놈에 매핑하였고(BAM 파일), 여기서 목적 표적 영역과 중첩되는 판독물을 선택하고 야생형 판독물 수 대 삽입 또는 결실['인델(indel)']을 함유하는 판독물의 수를 계산하였다.

실시예에서 사용되는 편집 백분율(예를 들어, '편집 효율성' 또는 '인델 퍼센트')은 야생형을 포함하는 서열 판독물의 총 수에 대한 삽입 또는 결실('인델')이 있는 서열 판독물의 총 수로 정의한다.

지질 나노입자의 제조

지질 성분을 다양한 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. RNA 카고(예를 들어, Cas9 mRNA 및 sgRNA)를 25 mM 시트레이트 완충액, 100 mM NaCl, pH 5.0에 용해시켜 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카고 농도를 생성하였다.

지질 핵산 어셈블리는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)로도 부르는, 이온화 가능한 지질 A((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, 콜레스테롤, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및 1,2-다이미리스토일-라세미-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000(PEG2k-DMG)를 각각 50:38:9:3 몰비로 함유하였다. 달리 명시하지 않는 한, 지질 핵산 어셈블리를, 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비는 약 6으로, gRNA 대 mRNA의 중량비는 1:2로 제형화하였다.

지질 나노입자[Lipid nanoparticle, LNP]는, 에탄올 중 지질을 2 부피의 RNA 용액 및 1 부피의 물과 충돌 제트 혼합을 활용한 교차 흐름 기술을 사용하여 제조하였다. 에탄올 중 지질은 2 부피의 RNA 용액과 혼합 교차를 통해서 혼합하였다. 물의 제4 스트림을 인라인 티를 통해 교차의 출구 스트림과 혼합하였다(WO2016010840 도 2 참조). LNP를 한 시간 동안 실온[room temperature, RT]에서 유지하였고, 이에 더해 물(대략 1:1 v/v)로 희석하였다. LNP를 평판 카트리지[싸토리우스(Sartorius), 100 kD MWCO]에서 접선 유동 여과를 사용하여 농축하고, 완충액을 50 mM 트리스, 45 mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스, pH 7.5(TSS)로 교환하였다. 또는, LNP는 100 kDa Amicon 스핀 필터를 사용하여 임의로 농축하고, 완충액은 PD-10 탈염 칼럼(GE)을 사용하여 TSS로 교환하였다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP를 추가 사용 전까지 4 ℃ 또는 -80 ℃에 보관하였다.

mRNA의 시험관 내 전사[In vitro transcription, 'IVT']

N1-메틸 슈도-U를 함유하는 캡핑 및 폴리아데닐화된 mRNA를 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생성하였다. T7 프로모터, 전사를 위한 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 다음 조건으로 XbaI를 이용하여 37 ℃에서 두 시간 동안 배양하여 선형화하였다. 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL XbaI(NEB), 및 1배 반응 완충액. XbaI를 반응물을 65 ℃에서 20분 동안 가열함으로써 비활성화하였다. 선형화된 플라스미드를 효소 및 완충액 염에서 정제하였다. 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응을 다음 조건으로 37 ℃에서 1.5-4시간 동안 배양하여 수행하였다. 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; 2-5 mM의 각각의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP(Trilink); 10-25 mM ARCA(Trilink); 5 U/μL T7 RNA 중합 효소(NEB); 1 U/μL 마우스 Rnase 억제제(NEB); 0.004 U/μL 무기 대장균 파이로포스파테이트(NEB); 및 1배 반응 완충액. TURBO Dnase(ThermoFisher)를 0.01 U/μL의 최종 농도까지 첨가하였고, 반응물을 추가 30분 동안 배양하여 DNA 주형을 제거하였다. mRNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 MegaClear 전사 클린-업 키트(ThermoFisher) 또는 Rneasy Maxi 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 또는, mRNA를 침전 프로토콜을 통해서 정제하였고, 이어서 일부 경우에 HPLC-기반 정제하였다. 간략하게는, Dnase 분해 후, mRNA는 LiCl 침전, 아세트산 암모늄 침전 및 아세트산 소듐 침전을 사용하여 정제하였다. HPLC 정제된 mRNA의 경우, LiCl 침전 및 재구성 후, mRNA를 RP-IP HPLC에 의해 정제하였다(예를 들어, 문헌[Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142] 참조). 풀링을 위하여 선정된 분획을 조합하였고 전술한 바와 같이 아세트산소듐/에탄올 침전에 의해 탈염하였다. 추가 대안적 방법에서, mRNA를 LiCl 침전 방법으로 정제한 다음 추가 접선 유동 여과에 의해 추가로 정제하였다. RNA 농도를 260 nm(Nanodrop)에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였고, 전사물은 Bioanlayzer(Agilent)로 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.

스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes, 'Spy') Cas9 mRNA를 서열 번호 857-864에 따른 개방형 해독틀을 암호화하는 플라스미드 DNA에서 생성하였다(표 9B의 서열 참조).서열 번호 857-864가 RNA와 연관하여 아래에 언급될 때, T는 U(전술한 바와 같이 N1-메틸 슈도우리딘임)로 대체되어야 함이 이해된다. 실시예에 사용된 메신저 RNA는 5' 캡 및 3' 폴리-A 꼬리, 예를 들어, 최대 100 nts를 포함하고, 표 9B의 서열 번호 858-862에 의해 식별된다. 가이드 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성된다.

클로닝 및 플라스미드 제조

상업적 공급업체에 의해 AAV2 ITR 측면에 있는 양방향 삽입 작제물을 합성하고 pUC57-Kan으로 클로닝하였다. 생성된 작제물(P00147)을 다른 벡터에 대한 모 클로닝 벡터로 사용하였다. 다른 삽입 작제물(ITR 없음) 또한 상업적으로 합성하고 pUC57로 클로닝하였다. 정제된 플라스미드를 BglII 제한 효소(New England BioLabs, 카탈로그 번호 R0144S)로 분해하고 삽입 작제물들을 모 벡터로 클로닝하였다. 플라스미드를 Stbl3^TM 화학적 반응능 대장균(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 C737303)에서 번식시켰다.

AAV 생산

HEK293 세포에서 삼중 형질감염을 사용하여 AAV8 및 AAV-DJ 생산을 위한 목적 작제물을 가진 게놈을 포장하고 생성된 벡터를 일상적인 방법, 예를 들어 크로마토그래피 또는 아이오딕산올 구배 초원심분리를 통해 용해된 세포 및 배양 배지 둘 다에서 정제하였다(예를 들어, 문헌[Lock et al., Hum Gene Ther. 2010 Oct; 21(10):1259-71] 참조). 단리된 AAV를 저장 완충액(0.001% Pluronic F68을 갖는 PBS)에서 투석하였다. AAV 역가는 ITR 영역 내에 위치한 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR에 의해 측정하였다.

LNP 및 AAV의 생체 내 전달

6-8주령의 마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통해 AAV 및 LNP 둘 다, 또는 비히클(AAV 비히클의 경우 PBS + 0.001% Pluronic, LNP 비히클의 경우 TSS)을 투여하였다. AAV는 본원에 기재한 바와 같은 양[벡터 게놈/마우스(vector genomes/mouse, 'vg/ms')]으로 동물당 0.1 mL의 부피로 투여하였다. LNP를 TSS로 희석하고 본원에 표시된 양인 약 5 μl/그램으로 투여하였다. LNP 및 AAV의 부피는 투여 전에 혼합하고 동시에 투여한다. 치료 후 다양한 시점에서, 추가 후술한 대로 특정 분석을 위해 혈청을 수집하였다.

인간 알파 1-항트립신[Human Alpha 1-Antitrypsin, hA1AT] ELISA 분석

생체 내 시험을 위해 혈액을 수집하고 표시된 대로 혈청을 단리하였다. 총 인간 알파 1-항트립신 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 Alpha 1-항트립신 ELISA 키트(인간)(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)를 사용하여 측정하였다. 혈청 hA1AT 수준을 4 매개변수 로지스틱 적합을 사용하여 표준 곡선에서 정량하고, 혈청 μg/mL로 표시하였다.

가이드 서열은 가이드 번호 앞에 0을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다는 것으로 이해된다. 즉, G000400은 G400과 동일하거나 400 이전의 중간 숫자에 0이 있다.

실시예 2 - hSERPINA1 PIZ 이식 유전자의 생체 내 편집

세 개의 sgRNA를 hSERPINA1 PIZ 변이체 이식 유전자에서의 인델 형성 및 알파-1-항트립신[A1AT] 단백질의 발현을 통한 편집에 대해 평가하였다. 본 실시예에서 검사검사한 LNP는 실시예 1에 기재된 대로 제조하여 마우스에 전달하였다. 표 8에 명시한 세 개의 sgRNA를 용량 반응 검정에서 네 개의 용량 수준(0.3, 0.1, 0.03 및 0.01 mg/kg)에서 각각 평가하였다. 투여하고 3주 후, 동물을 안락사하고, 간 조직 및 혈액을 수집하여 간 편집 및 혈청 내 hA1AT 발현 수준을 각각 평가하였다. 인델 형성은 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS에 의해 측정하였다. 혈청 내 인간 A1AT 수준은 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의해 측정하였다. hSERPINA1 유전자좌의 편집 결과는 도 1 및 표 10에 나타내었다. 혈청 hA1AT 수준은 도 2a 및 표 11에 나타내었다. 혈청 내 A1AT의 상대적 발현은 TSS 그룹과 비교하여 백분율로 계산하였으며, 도 2b 및 표 11에 나타내었다.

마우스 간에서의 평균 편집 퍼센트

처리군	가이드	용량(mpk)	평균 인델%	SD	샘플
그룹 1	G000409	0.01	7.0	3.9	4
그룹 2	G000409	0.03	20.2	3.0	4
그룹 3	G000409	0.1	45.3	2.6	4
그룹 4	G000409	0.3	44.3	2.0	4
그룹 5	G000414	0.01	4.1	1.6	4
그룹 6	G000414	0.03	22.7	6.4	4
그룹 7	G000414	0.1	39.2	4.0	4
그룹 8	G000414	0.3	42.2	3.5	4
그룹 9	G000415	0.01	2.4	0.6	4
그룹 10	G000415	0.03	11.1	3.2	4
그룹 11	G000415	0.1	31.2	2.6	4
그룹 12	G000415	0.3	39.4	2.3	4
그룹 13	TSS	-	0.1	0.0	4

혈청 내 hA1AT 수준

처리군	가이드	용량(mpk)	평균 μg/mL A1AT	SD	% A1AT KD	샘플
그룹 1	G000409	0.01	1,647.6	270.2	23.8	4
그룹 2	G000409	0.03	804.4	159.8	62.8	4
그룹 3	G000409	0.1	181.5	35.2	91.6	4
그룹 4	G000409	0.3	14.9	18.2	99.3	4
그룹 5	G000414	0.01	2,328.8	247.7	0.0	4
그룹 6	G000414	0.03	1,239.7	210.7	42.6	4
그룹 7	G000414	0.1	220.4	48.9	89.8	4
그룹 8	G000414	0.3	47.1	7.8	97.8	4
그룹 9	G000415	0.01	2,118.0	186.3	2.0	4
그룹 10	G000415	0.03	1,858.9	225.3	14.0	4
그룹 11	G000415	0.1	489.2	140.3	77.4	4
그룹 12	G000415	0.3	156.1	12.6	92.8	4
그룹 13	TSS	-	2,161.0	306.1	-	4

실시예 3. 인간 SERPINA1을 표적하는 sgRNA의 표적 외 분석

생화학적 검정(예를 들어, 문헌[Cameron et al., Nature Methods. 6, 600-606; 2017] 참조)을 사용하여 Cas9 표적 SERPINA1에 의해 절단된 잠재 표적 외 게놈 부위를 발견하였다. 세포에서 정제된 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 Cas9 및 sgRNA의 시험관 내에서 조립된 리보핵산단백질[ribonucleoprotein, RNP]로 분해하여, sgRNA 스페이서 서열과 상동성을 갖는 표적상 부위 및 잠재 표적 외 부위에서 DNA 절단을 유도하였다. gDNA 분해 후, 편집된 단편 풍부화 및 NGS 라이브러리 작제를 용이하게 하기 위해, 유리 gDNA 단편 말단을 어댑터로 연결하였다. NGS 라이브러리를 서열 분석하고 생물정보학 분석을 통해 판독물을 분석하여 유리 DNA 말단의 게놈 좌표를 측정하였다. 이어서, 판독물이 축적된 인간 게놈의 위치를 잠재 표적 외 부위로서 주석을 달았다.

위에 사용된 생화학적 검정과 같은 공지된 표적 외 검출 검정에서는, 다른 맥락, 예를 들어 목적 일차 세포에서 검증할 수 있는 잠재 부위에 대해 '다양한 시도를 고려하기'위해, 의도적으로 다수의 잠재 표적 외 부위을 일반적으로 복구한다. 예를 들어, 생화학 검정은 일반적으로 잠재 표적 외 부위의 수를 과도하게 나타내는데, 이는 검정이 세포 환경이 없는 정제된 고분자량 게놈 DNA를 활용하고, 사용된 Cas9 리보핵산단백질의 용량에 따라 달라지기 때문이다. 따라서, 이들 검정에 의해 식별된 잠재 표적 외 부위는, 식별된 잠재 표적 외 부위의 표적화된 서열 분석을 사용하여 검증하였다.

표적화된 서열 분석에 대한 하나의 접근법에서, Cas9 및 목적 sgRNA(예를 들어, 평가를 위한 잠재 표적 외 부위를 갖는 sgRNA)를 PHH 또는 PCH 세포에 도입하였다. 이어서, 세포를 용해하고 잠재 표적 외 부위(들) 측면에 있는 프라이머를 사용하여 NGS 분석을 위한 앰플리콘을 생성하였다. 특정 수준에서 인델의 식별은 잠재 표적 외 부위를 검증하는 데 사용할 수 있는 반면, 잠재 표적 외 부위에서 발견된 인델의 결여는 활용된 표적 외 검정에서 거짓 양성을 나타낼 수 있다.

표적 인델 활성을 보여주는 가이드를 이러한 검정을 통해 잠재 표적 외 게놈 절단 부위에 대하여 검사하였다. 복구 구조를 검증하기 위해 표적 외 절단 부위에서 통계적으로 연관된 인델 비율을 사용하여, 복구 구조를 유전자좌에서 수동으로 검사하였다.

가이드 G000409, G000414 및 G000415 중 임의의 것에 대해 검증된 표적 외 편집 활성은 식별하지 않았다.

실시예 4. 일차 마우스 간실질세포에서의 시험관 내 SERPINA1 삽입 주형 검증

일차 마우스 간실질세포[Primary Mouse Hepatocyte, PMH](Gibco, Amarillo, Texas, 로트 # MC837)를 Corning(Corning, NY, 카탈로그 번호 354407)의 96-웰 바이오 코트 플레이트에 웰당 45,000개의 세포에서 플레이팅하였다. 플레이팅 48시간 후, Cas9 mRNA(가이드 대 mRNA 비율은 2:1)를 갖는 마우스 알부민 인트론 1-표적 sgRNA를 함유하는 LNP는, 나열된 삽입 플라스미드를 함유하는 AAV뿐만 아니라 얼음에서도 해동하였다. LNP를 3% FBS 윌리엄스 E 배지[William's E Media](ThermoFisher, Waltham, MA, 카탈로그 번호 A1217601) 중 1 mg Cas9 mRNA/mL 희석하고, '치료되지 않'거나 'AAV만' 받은 웰을 제외한 모든 실험 웰에 웰당 100 μL을 투여하였다. AAV 제제를 웰당 10 μL 물까지 희석하여 AAV가 투여된 각 웰에 대해 5e5의 감염 다중도[multiplicity of infection, MOI]를 달성하였다. 세포를 37 ℃에서 96시간 동안 배양하였다.

96시간 후, 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가한 후 세포를 37 ℃에서 배양하였다. 추가 96시간 후, 세포 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 ELISA(Aviva Biosystems, San Diego, CA, 카탈로그 번호 OKIA00048)를 통한 hAAT 정량화를 위해 배지를 수집하였다. ELISA를 제조업체 프로토콜에 따라 수행하였다. 한편, 나머지 세포를 CellTiter Glo 2.0 세포 생존력 검정(Promega, Madison, WI, 카탈로그 번호 G9241)에 활용하여 각 웰의 상대 세포 수를 정량화하였다. A1AT ELISA 결과는 세포 수를 보정하기 위해 Cell Titer Glo 값으로 정규화하였다. 결과는 도 3에 나와 있다.

실시예 5 hSERPINA1 PIZ 이식 유전자를 발현하는 마우스를 이용한 hSERPINA1의 mAlbumin 유전자좌로의 생체 내 삽입

hSERPINA1의 mAlbumin 유전자좌로의 생체 내 삽입은, hSERPINA1 PIZ 변이체 이식 유전자를 발현하는 수컷 NSG-PIZ 마우스 및 수컷 야생형 NSG 마우스에서 평가되어, 삽입 후 6개월까지 단백질 발현의 지속성을 평가하였다. NSG-PiZ 마우스는 면역결핍 NOD scid 감마(NOD scid gamma, NSG) 배경에 인간 SERPINA1 PiZ 변이체(Glu342Lys)의 복수의 카피를 보유하는 이식유전자 마우스이다. NSG-PiZ 및 야생형 NSG 마우스는 모두 젝슨 연구실[Jackson Laboratory]에서 입수하였다. 본 실시예에서 검사한 ssAAV 및 LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하여 수컷 NSG 마우스(그룹 1-3) 및 NSG-PIZ 수컷 마우스(그룹 4-6)에 전달하였다.

전술한 대로 제조된 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666(마우스 알부민을 표적함)을 운반하는 LNP의 (전체 RNA 카고 함량에 대한) 1 mg/kg을 마우스에게 투여하였다. 그룹 2와 5에 작제물 Nanoluc(nanoluc)에서 유래한 ssAAV를 마우스당 5e11 vg에서 추가로 투여하였다. 그룹 3 및 6에 작제물 1 A1AT 주형에서 유래한 ssAAV를 마우스당 5e11 vg에서 추가로 투여하였다(표 12). 혈청 내 인간 A1AT 수준은 투여하고 1주, 2주 및 3주 차에, 그 이후에는 투여하고 최대 6개월까지 매월 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의해 측정하였다. 이 키트는 인간 A1AT에 특이적이며 삽입된 주형에 의해 생산된 PiZ 변이체와 야생형 A1AT를 둘 다 검출한다. 투여하고 6개월 후, 동물을 안락사하고, 혈액을 수집하고, hA1AT 혈청 수준을 평가하기 위해 혈청을 준비하였다. 간 효소 정량화를 위해 혈청을 IDEXX 연구소로 전달하였다.

도 4a 및 표 13은 ELISA에 의해 측정된 다양한 시점에서의 혈청 내 hA1AT 단백질 수준을 나타낸다. 도 4b는 혈청 ALT 활성을 나타내고, 표 14는 혈청 ALT 및 AST 활성을 나타낸다.

처리군	계통	AAV	가이드
그룹 1	NSG	비히클	비히클
그룹 2	NSG	작제물 Nanoluc	G000666
그룹 3	NSG	작제물 1	G000666
그룹 4	NGS-PiZ	비히클	비히클
그룹 5	NGS-PiZ	작제물 Nanoluc	G000666
그룹 6	NGS-PiZ	작제물 1	G000666

[표 13]

ELISA로 측정한 혈청 내 hA1AT 수준

*마우스 한 마리는 21주차 이전에 빈사 상태로 발견하여 안락사하였다.

간 효소 혈청 수준(AST 및 ALT)

그룹	계통	AAV	평균 AST	AST SD	평균 ALT	ALT SD
1	NSG	비히클	83.6	47.5	46.6	34.1
2	NSG	Nanoluc	107.0	87.1	61.0	80.0
3	NSG	작제물 1	130.6	102.0	44.4	47.2
4	NSG-PiZ	비히클	100.8	14.4	35.0	11.0
5	NSG-PiZ	Nanoluc	158.4	90.1	38.4	7.3
6	NSG-PiZ	작제물 1	225.2	61.9	52.5	12.9

실시예 6 - mAlbumin 유전자좌로의 hSERPINA1의 생체 내 삽입: AAV 주형 검사

일곱 개의 양방향 ssAAV 작제물을 사용하여 수컷 C57BL 마우스 알부민 유전자좌로의 hSERPINA1의 삽입을 검사하였다. 본 실시예에서 검사한 ssAAV 및 LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하여 마우스에 전달하였다.

6-8주령의 마우스에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666(마우스 알부민 표적)을 운반하는 LNP의 (전체 RNA 카고 함량에 대한) 1 mg/kg을 투여하였다. 일곱 개의 ssAAV는 5e11 vg/ms의 용량에서 평가하였다(표 15). 투여하고 1, 2, 3주 차에 혈액을 수집하였다. 투여하고 4주 후, 동물을 안락사하고, 간 조직 및 혈액을 수집하여 간 편집 및 혈청 내 hA1AT 발현 수준을 각각 평가하였다. 인델 형성은 NGS에 의해 측정하였고, 혈청은 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의해 인간 알파1 항트립신hA1AT] 혈청 발현을 측정하기 위해 준비하였다. 혈청 hA1AT 수준은 투여하고 1, 2, 3 및 4주 차에 도 5 및 표 16에 나타내었다.

처리군	가이드(1mpk)	AAV 작제물 ID	AAV 용량(vg/ms)
1	G000666	작제물 1	5e11
2	G000666	작제물 2	5e11
3	G000666	작제물 7	5e11
4	G000666	작제물 3	5e11
5	G000666	작제물 10	5e11
6	G000666	작제물 5	5e11
7	G000666	작제물 9	5e11

[표 16]

실시예 7 - mAlbumin 유전자좌로의 hSERPINA1의 생체 내 삽입: 용량 반응

세 개의 양방향 ssAAV 작제물을 사용하여 수컷 C57BL 마우스 알부민 유전자좌로의 hSERPINA1의 삽입을 용량 반응 검정으로 검사하였다. 본 실시예에서 검사한 ssAAV 및 LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하여 마우스에 전달하였다. 6-8주령의 마우스에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666(마우스 알부민 표적)을 운반하는 LNP의 (전체 RNA 카고 함량에 대한) 1mg/kg을 투여하였다. P00450에서 유래한 세 가지 ssAAV는 세 가지 용량, 즉 5e10, 1e11 및 5e11 vg/ms에서 평가하였다(표 17). 투여하고 1, 2, 5, 10주 및 14주 차에 혈액을 수집하고, ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의해 인간 알파1 항트립신[hA1AT] 혈청 발현을 측정하기 위해 혈청을 준비하였다. 혈청 hA1AT 수준은 투여하고 1, 2, 5, 10 및 14주 차(표 18)에 도 6a-6c와 표 18에 나타내었다.

처리군	가이드(1mpk)	AAV 작제물 ID	AAV 용량(vg/ms)
1	G000666	작제물 7	5e10
2	G000666	작제물 7	1e11
3	G000666	작제물 7	5e11
4	G000666	작제물 8	5e10
5	G000666	작제물 8	1e11
6	G000666	작제물 8	5e11
7	G000666	작제물 1	5e10
8	G000666	작제물 1	1e11
9	G000666	작제물 1	5e11

[표 18]

*마우스는 구금 장치에서 출혈하는 동안 사망하였다.

실시예 8 - 서열 특이적 핵산 작용제에 대한 SERPINA1 개방형 판독틀의 민감성

렌티바이러스 플라스미드 작제물은 SERPINA1 개방형 판독틀의 단일 카피를 사용하여 개별적으로 설계되었으며, 각각은 삽입 작제물인 작제물 1, 작제물 7 및 작제물 8에서 다양한 목적 유전자[gene of interest, GOI] 서열에 해당한다. 렌티바이러스 벡터는 GOI 발현을 구동하기 위한 EF1a 프로모터, 및 선택을 위한 퓨로마이신 저항성을 함유한다.

설계는 표 19에 나타낸 삽입 작제물을 기반으로 하였다.

렌티바이러스 작제물	설명	삽입 작제물의 성분
작제물 20	SERPINA1 천연 신호 서열 있음	없음
작제물 21	SERPINA1, 신호 서열 없음	작제물 1
작제물 22	SERPINA1, 신호 서열 없음, CpG가 고갈됨	작제물 7
작제물 23	SERPINA1, 신호 서열 없음, CpG가 고갈됨, 대체 코돈 사용 빈도 1	작제물 7, 작제물 8
작제물 24	SERPINA1, 신호 서열 없음, CpG가 고갈됨, 대체 코돈 사용 빈도 2	작제물 8

서열 분석 시, 렌티바이러스 작제물, 설계된 작제물에서의 변화를 작제물 23에서 식별하였다. 구체적으로, G000409의 표적 서열에서 세 개의 불일치가 있는 것이 아닌, 한 개의 불일치만 있었다. 설계에서의 변화는 암호화된 아미노산 서열의 변화를 초래하지 않았다. G000409의 표적 서열, SERPINA1의 야생형 서열, 작제물 20, 및 작제물 7/8의 정렬을 나타내었고, G000409 표적 부위와의 차이는 밑줄로 표시되어 있다.

표 20에 나타낸 서열 특이적 핵산 작용제를 실험에서 검사하였다.

핵산 작용제

명칭	표적 서열의 서열 번호 703.	서열 번호
siRNA2	1,405-1,425	980(센스) 982(안티센스)
siRNA3	957-977	981(센스) 984(안티센스)
G000409	506-525	1,129
G000414	538-557	1,130
G000415	413-431	1,131

Hepa1.6 마우스 간세포암 세포(ATCC, Manassas, VA, 카탈로그 번호 CRL-1380)를 DMEM 배지(Millipore Sigma, Burlington, MA, 카탈로그 번호 D5796) 및 10%의 소 태아 혈청이 있는 6-웰 접시(Thermo Fisher, Waltham, MA, 카탈로그 번호 140675)에 웰당 250,000개 세포에서 플레이팅하고 37 ℃에서 배양하였다. 24시간 후, 렌티바이러스를 MOI 6에서 세포에 투여하여(24시간 후 세포가 두 배로 증가하여 각 웰의 총 세포 수가 500,000개의 세포와 같다고 가정함), 렌티바이러스 유전자 작제물의 통합 및 발현을 가능하게 하였다.

24시간 후, 형질도입 및 대조군 세포를 야생형 SERPINA1을 표적하는 shRNA(웰당 최종 농도 10 nM shRNA) 또는 sgRNA/Cas9 mRNA(1:2 비율, 총 3 μg의 웰당 RNA에서)를 함유하는 LNP로 처리하고 37 ℃배양으로 복귀시켰다.

LNP로 처리하고 48시간 후, 퀴아젠 RNA이지 미니 키트(Qiagen RNAeasy Mini Kit)(Hilden, Germany, 카탈로그 번호 74104)를 사용하여 RNA를 수확하고 고용량 RNA-to-cDNA 키트(Thermo Fisher, Waltham, MA, 카탈로그 번호 4388950)를 사용하여 cDNA로 전환시켰으며, 둘 다 제조업체의 프로토콜을 따랐다.

액적 디지털 PCR[droplet digital PCR, ddPCR] 프라이머 프로브 세트는 각 렌티바이러스 작제물(Bio-Rad, Hercules, CA, 카탈로그 번호 10031277)의 발현에서 생성되는 전사물을 검출하도록 설계되었다. 마우스 베타 액틴 발현을 검출하기 위한 대조군 프라이머 프로브 세트도 Bio-Rad(카탈로그 번호 10031256)에서 주문하였다. cDNA 샘플을 제조업체의 프로토콜에 따라 ddPCR을 통해 적절한 프라이머 프로브 세트로 분석하였다.

cDNA 정량화와 관련된 실험을 위해, 물에서 (1 μg RNA 투입을 이용한 20 μL 반응물에서 생성된) cDNA를 1:10,000로 희석하였다. 프로브(dUTP 없음, 카탈로그 번호 1863024)용 Bio-Rad ddPCR 슈퍼믹스를 얼음에서 해동하였다. 각 샘플(10 μL 슈퍼믹스 + 7 μL 물 + 1 μL 10,000배 희석된 cDNA + 1 μL SERPINA1 프로브 세트 + 1 μL 대조군 유전자 프로브 세트)에 대해 20 μL 반응물을 생성하고 96-웰 플레이트(Bio-Rad 카탈로그 번호 12001925)에 배열하였다.

제조업체 프로토콜에 따라Bio-Rad 자동화된 액적 생성기(카탈로그 번호 1864101)를 사용하여 액적을 생성하였다. 이어서, 이 기계로 생성된 액적을 응용 바이오시스템 베리티프로 열 순환기[Applied Biosystems VeritiPro Thermal Cycler](카탈로그 번호 A48141)를 사용하여 다음의 제조업체 조건(표 21)으로 열순환시켰다.

[표 21]

열순환 조건

열순환 후, ddPCR 샘플을 Bio-Rad QX200 액적 판독기(카탈로그 번호 184003)에 탑재하고, 샘플을 유전자 발현 'GEX' 검정으로서 분석하였다. 판독기는 각 샘플에 대한 결과를 생성하여 각 표적, SERPINA1 및 대조군 유전자의 농도(카피/μL)를 제공하였다.

각 샘플에 대한 SERPINA1 전사물의 농도를 측정하고, 마우스 베타 액틴의 농도로 정규화하여 세포 수 변동을 보정하였다. 이어서, 정규화한 값을 처리하지 않은 대조군 샘플과 비교하여 shRNA 또는 CRISPR-KO를 처리한 후 전사물의 상대적 감소를 측정하였으며, 값 1은 SERPINA1 mRNA 수준의 100% 감소를 나타내고 0은 SERPINA1 mRNA 수준의 감소가 없음을 나타낸다. 표 22는 비표적 대조군과 비교하여 hSERPINA1 전사물의 감소 퍼센트를 나타낸다. 각 샘플을 먼저 렌티바이러스 벡터(표에서 행으로 표시함)로 처리한 다음, shRNA 또는 CRISPR sgRNA를 함유하는 LNP(표에서 열로 표시함)로 처리하였다.

[표 22]

비표적 대조군과 비교하여 hSERPINA1 전사물의 감소 퍼센트.

실시예 9 - hSERPINA1를 시노몰구스 알부민 유전자좌로 생체 내에서 삽입한 후 cSERPINA1 이식 유전자의 생체 내 녹다운

hSERPINA1 전달을 위한 AAV 제제

현탁 바이러스 생산 세포(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A35347)의 삼중 형질감염을 사용하여, 일상적인 생산 방법으로 AAV8에 대한 목적 유전자[GOI]를 가진 게놈을 포장하였다. 형질감염하고 3일 후, 벤조네이즈(Benzonase) 처리를 포함하는 세포 용해를 통해 세포 배양물에서 AAV 벡터를 수확하여, 플라스미드, 숙주 세포, 및 임의의 다른 유리 DNA 및 RNA를 분해하였다. 이어서, 수확 물질을 심층 여과로 정화하여 임의의 세포 파편 및 큰 분자를 제거한 다음, 작은 분자의 제거, 완충액 교환 및 부피 감소를 위해 접선 유동 여과를 수행하였다. 이후 AAV 벡터를 친화도 크로마토그래피를 통해 정제하고, 전체 AAV 입자(게놈 역가 대 캡시드 역가의 비로 평가함)를 음이온 교환 크로마토그래피로 풍부화하였다. 마지막으로, 정제된 AAV 벡터를 완충액 교환하고, 원심분리 필터 단위을 사용하여 최종 제제 완충액(0.001% Pluronic F68을 갖는 PBS, pH 7.4)으로 농축하였다. 게놈 역가 측정을 위해, ITR 영역 내에 위치한 프라이머/프로브를 사용하는 ddPCR을 포함하는 생산의 각 배치에 대한 12개의 검사 패널을 제공하였다.

시노몰구스 혈청에서의 시노몰구스 및 인간 알파-1-항트립신[hA1AT] LC-MS/MS 분석

생체 내 시험을 위해 혈액을 수집하고, 표시한 대로 혈청을 단리하였다. 총 cA1AT 및 hA1AT 수준은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법[liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS]을 사용하여 측정하였다. 인간 혈장에서 유래한, 정제 동결 건조된 천연 hA1AT는, 아테네 리서치 앤 테크놀로지(Athens Research & Technology)에서 수득하였다. 시노몰구스 혈청에서 유래한, 정제 동결 건조된 천연 cA1AT는, 내부적으로 제조하였다. 동결 건조된 cA1AT 및 hA1AT를 표준 및 품질 대조군에 적절한 농도로 소 태아 혈청에서 용해하였다. 혈청 샘플을 소 태아 혈청으로 10배 희석하였다. 1,900 ng/mL의 안정하고 표지한 내부 표준 5 μL를 송아지 태아 혈청을 희석한 샘플, 표준 및 품질 대조군 5 μL에 추가하였다. 이어서, 샘플을 25 μL 트라이플루오로에탄올로 변성하고, 5 μL의 200 mM DTT를 첨가하기 직전에 25 μL의 50 mM 탄산수소암모늄으로 희석하고, 55 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 환원한 샘플을 10 μL의 200 mM 아이오도아세트아마이드로 처리하고, 진탕하면서 암실에서 실온으로 한 시간 동안 배양하였다. 샘플을 400 μL의 50 mM 탄산수소암모늄:메톨(65:35)로 희석하고, 20 μL의 1 g/L 트립신으로 처리하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 분해는 10 μL의 폼산으로 종료되었다.

야생형 cA1AT 및 hA1AT 펩타이드의 식별

순수한 A1AT 분해물을 LC-MS/MS로 분석하고 야생형 대립유전자를 함유하는 서명 펩타이드를 식별하였다. 구체적으로, 야생형 cA1AT는 중표지한 특이적 펩타이드(SANLHLPR; 서열 번호 1,559)를 사용하여 검출하였고, 야생형 hA1AT는 상이한 중표지한 야생형 특이적 펩타이드(SASLHLPK; 서열 번호 1,560)를 사용하여 검출되었다. 조합한 야생형 cA1AT 및 hA1AT 농도는 제3 중표지한 펩타이드(AVLTIDEK; 서열 번호 1,561)를 사용하여 검출하였다. 이러한 펩타이드 각각은 굵은 밑줄로 표시한 위치에 단일 13C615N-류신을 혼입하여 합성하였다.

질량 분석법을 이용한 혈청 cA1AT 및 hA1AT 수준 측정

전술한 방법에 따라 혈청을 분해하였다. 분해 후, 분해한 혈청을 컬럼에 탑재하고 후술한 바와 같이 LC-MS/MS로 분석하였다. 야생형 cA1AT 및 hA1AT 수준의 식별을 교정 곡선과 비교하여 획득하였다.

LC-MS/MS 조건

LC-MS/MS 분석은 2.1 x 50 mm C8 컬럼으로 수행하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 폼산으로 구성하였으며, 이동상 B는 아세토나이트릴 중 0.1% 폼산으로 구성하였다. 바늘 세척액은 메탄올:물(35:65) 중 0.1% 폼산, 1% 다이메틸설폭사이드로 구성하였다. A1AT 분해의 분석은 질량 분광계에서 다음의 매개변수로 수행하였다. (a) 이온 공급원: 터보 스프레이 이온 드라이브; (b) 커튼 가스: 35.0; (c) 충돌 가스: 중간; (d) 이온 스프레이 전압: 5,500; (e) 온도: 500 ℃; (f) 이온 공급원 가스 1:50; 및 (g) 이온 공급원 가스 2:50.

시노몰구스 알부민 유전자좌에 hSERPINA1를 생체 내로 삽입한 후 cSERPINA1 이식유전자의 생체 내 녹다운

인간 및 시노몰구스 알부민 유전자(G009860)와 교차 반응성인 제형화한 sgRNA와 AAV8 발현 벡터(AAV8-SERPINA1)의 조합에서의 인간 SERPINA1 양방향 작제물(작제물 1)을, 수컷 시노몰구스 원숭이 내 인간 SERPINA1 유전자 삽입에 대해 평가하였다. 인간 알부민 sgRNA의 표적 부위는 시노몰구스 원숭이에서 보존하여, 인간 SERPINA1 이식유전자가 시노몰구스 원숭이 알부민 유전자좌로 삽입되도록 한다. 인간 SERPINA1 유전자를 삽입한 후, 시노몰구스 SERPINA1(G014418)에 특이적인 가이드를 시노몰구스 (c)SERPINA1 유전자 녹아웃에 대해 평가하였고, 유전자 편집의 마커로서 혈청 시노몰구스 (c)A1AT의 검출에 의해 평가하였다. 사용한 가이드는 아래 표에 나타내었다.

[표 23]

sgRNA

원숭이(n=3)에 AAV8-SERPINA1(1.5E13 vg/㎏)의 일시 용량[bolus dose]을 정맥 내로 투여한 후, 시험 1일 차에 위에 제공한 대로 Cas9 mRNA(3.0 ㎎/㎏)를 갖는 LNP 형태로 제형화한 G009860를 30분 간 IV로 주입하였다. 시험 245일 차에, 원숭이에게 위에서 제공한 대로 Cas9 mRNA(3.0 ㎎/㎏)를 갖는 LNP 형태로 제형화한 시노몰구스 특이적 SERPINA1 가이드 G014418를 30분 간 IV로 주입하였다. 시험 1일 차에, 비히클 대조군(n=3)에 AAV 완충액의 일시 용량으로 투여한 후, LNP 완충액를 30분 간 주입하였다. 시험 245일 차에, 비히클 대조군에게 LNP 완충액를 30분 간 주입하였다. 시험 1일 차의 AAV 일시 투여 한 시간 전 및 시험 245일 차의 LNP 주입 한 시간 전에, 모든 원숭이는 2 ㎎/㎏ 덱사메타손의 일시 용량으로 전처리하였다. 본 시험에서 검사한 AAV 및 LNP는, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 제조하였다. 혈청 cA1AT/hA1AT 수준 및 유전자 편집은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 측정하였다.

모든 동물을 sgRNA 표적 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이체 및 기존 항-AAV8 중화 항체에 대해 사전 선별하였다. 혈장 중 AAV 및 LNP 성분의 약동학 평가는 모든 처리한 동물에 대한 이력 범위 내에 있었으며, 이는 모든 생성물의 성공적인 투여를 나타낸다. 임상 병리학(임상 화학, 혈액학, 응고) 및 사이토카인 모니터링에서, 임의의 매개변수 상승이 1주일 내에 기준선으로 돌아가는 임의의 특이한 결과가 나오지 않았다.

AAV8-SERPINA1로 처리한 동물 및 제형화한 G009860은 증가된 수준의 혈청 hA1AT를 발현하였지만(표 24 및 도 9a 및 9b), 완충액 대조군에서는 hA1AT 발현을 관찰하지 못하였다. 제형화한 G009860으로 처리한 동물의 평균 인델%는 44.2인 반면, 완충액 대조군에서는 아무것도 관찰하지 못하였다(표 25 및 도 7). hA1AT 수준은 4주 차에 최대 평탄역[plateau]에 도달하였고, 비선형 적합 단일상 회합[nonlinear fitting one-phase association]을 모델로 하여, 52주 차까지 평균 정상 상태 수준인 1,126 μg/mL를 유지하였다. 259일 차에 제형화한 G014418로 녹아웃 처리한 후 인간 hA1AT의 변화를 관찰하지 않았다(표 27 및 도 8).

245일 차에 cA1AT 녹아웃 처리 후, 제형화한 G014418로 처리한 동물은 감소된 수준의 혈청 cA1AT를 발현하였지만, 완충액 대조군에서는 발현의 변화를 관찰하지 못하였다(표 26 및 도 9a 및 9b). 제형화한 G014418로 처리한 동물은 평균 44.0의 인델%을 가졌지만, 완충액 대조군에서는 아무 것도 관찰하지 못하였다(표 27 및 도 8). cA1AT 수준은 녹아웃 처리 전에 2,005 μg/mL에서 유지하였고 4주 후에 최대 cA1AT 감소를 관찰하였으며, 비선형 피팅 평탄역을 모델로 하여, 52주 차까지 652 μg/mL의 평균 정상 상태 수준을 유지하였고, 이어서 단일상이 붕괴하였다. cA1AT 녹아웃 처리 후 hA1AT의 변화를 관찰하지 못하였다.

혈청 내 hA1AT 수준

시험 일자 표지	SASLHLPK(서열 번호 1,560)로 측정한 NHP 내 hA1AT 혈청 농도(μg/mL)
	비히클 대조군			삽입 처리
	1,001	1,002	1,003	2,001	2,002	3,003
D-10	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL
D-7	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL
D-5	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL
D1	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL	BQL
D7	BQL	BQL	BQL	384	158	305
D14	BQL	BQL	BQL	635	429	772
D28	BQL	BQL	BQL	1,030	819	1,100
D42	BQL	BQL	BQL	1,270	922	1,470
D56	BQL	BQL	BQL	1,120	816	1,090
D70	BQL	BQL	BQL	1,110	867	800
D78	BQL	BQL	BQL	1,260	804	1,370
D84	BQL	BQL	BQL	1,345	849	1,670
D98	BQL	BQL	BQL	1,285	935	1,700
D112	BQL	BQL	BQL	1,290	858	1,640
D126	BQL	BQL	BQL	1,345	848	1,845
D140	BQL	BQL	BQL	922	692	1,240
D154	BQL	BQL	BQL	973	691	1,260
D168	BQL	BQL	BQL	981	674	1,360
D182	BQL	BQL	BQL	1,040	634	1,150
D196	BQL	BQL	BQL	1,030	767	1,250
D210	BQL	BQL	BQL	911	564	1,090
D224	NR	NR	BQL	1,350	889	1,670
D238	BQL	BQL	BQL	1,140	780	1,260
D252	BQL	BQL	BQL	1,080	779	1,160
D258	BQL	BQL	BQL	1,160	738	1,220
D266	BQL	BQL	BQL	1,060	752	1,330
D272	BQL	BQL	BQL	1,110	632	1,050
D280	BQL	BQL	BQL	1,300	857	1,470
D294	BQL	BQL	BQL	1,390	860	1,500
D308	BQL	BQL	BQL	1,230	699	1,510
D322	BQL	BQL	BQL	1,300	800	1,450
D336	BQL	BQL	BQL	1,280	785	1,550
D350	BQL	BQL	BQL	1,420	906	1,300
D364	BQL	BQL	BQL	1,310	821	1,560

BQL: 정량 한계 미만, NR: 분석 문제로 인해 보고되지 않음.

[표 25]

간 생검 14일 차의 시노몰구스 알부민 유전자좌에서의 편집

혈청 내 cA1AT 수준

시험 일자 표지	SANLHLPR(서열 번호 1,559)로 측정한 NHP 내 cA1AT 혈청 농도(μg/mL)
	비히클 대조군			삽입 처리
	1,001	1,002	1,003	2,001	2,002	3,003
D-10	2,050	2,100	2,370	1,870	1,080	2,170
D-7	2,140	2,020	2,460	1,810	NR	2,260
D-5	2,320	2,190	2,400	1,880	1,100	2,110
D1	2,710	2,620	2,890	2,430	1,310	2,490
D7	2,540	2,100	2,290	2,120	1,050	2,250
D14	2,530	2,350	2,490	1,900	1,220	2,350
D28	2,120	2,100	2,200	2,200	1,230	2,260
D42	2,290	2,180	2,800	2,320	1,260	2,420
D56	1,910	2,060	2,370	2,280	1,190	1,870
D70	1,790	1,900	1,900	1,380	1,110	1,990
D78	1,820	1,710	1,710	1,510	1,130	2,040
D84	2,175	2,220	2,260	2,095	1,165	2,415
D98	2,130	1,945	2,085	2,065	1,270	2,415
D112	2,225	2,080	2,385	2,310	1,320	2,310
D126	2,430	2,315	2,340	2,375	1,195	2,480
D140	2,890	2,800	2,740	2,970	1,430	2,630
D154	2,940	2,820	2,770	2,610	1,520	2,860
D168	3,000	2,670	2,930	2,980	1,530	2,900
D182	3,110	2,710	2,930	2,750	1,410	2,840
D196	3,330	2,860	2,970	2,770	1,490	2,920
D210	2,890	2,950	2,980	2,500	1,450	2,780
D224	NR	NR	2,790	2,330	1,430	2,830
D238	2,450	2,300	2,710	2,340	1,320	2,590
D252	2,450	2,440	2,940	1,540	1,330	1,710
D258	2,350	2,360	2,650	878	1,100	1,150
D266	2,630	2,420	2,790	519	1,210	762
D272	2,420	2,030	2,560	487	1,100	631
D280	2,600	2,470	2,680	472	1,100	536
D294	2,630	2,430	2,700	439	1,000	588
D308	2,340	2,430	2,540	446	943	644
D322	2,520	2,550	2,620	411	1,010	545
D336	2,390	2,540	2,630	410	1,030	533
D350	2,690	2,390	2,640	428	1,060	525
D364	2,610	2,310	2,490	428	1,050	512

NR: 분석 문제로 인해 보고되지 않음.

[표 27]

간 생검 259일 차의 시노몰구스 SERPINA1 유전자좌에서의 편집

실시예 10 - 시노몰구스 알부민으로 hSERPINA1의 생체 내 삽입

제형화한 알부민 가이드 G009860과 조합된 고유의 hSERPINA1 서열(작제물 7 및 작제물 8)을 갖는 AAV를 위에서 제공한 대로 수컷 시노몰구스 원숭이에서 인간 SERPINA1 유전자 삽입에 대해 평가하였다.

두 원숭이 그룹(n = 4/그룹, 수컷 두 마리 및 암컷 두 마리)에 AAV8의 일시 용량(작제물 7 또는 작제물 8 중 하나의 hSERPINA1 서열을 갖는 1.5E13 vg/㎏)을 정맥내로 투여한 후, 제형화한 알부민 가이드 G009860(3.0 ㎎/㎏)를 30분 간 IV로 주입하였다. 비히클 대조군 그룹(n = 2, 수컷 한 마리 및 암컷 한 마리)에 AAV 완충액의 일시 용량을 투여한 후, LNP 완충액을 30분 간 주입하였다. 모든 원숭이는 AAV 일시 투여 한 시간 전에 2 mg/kg 덱사메타손의 일시 용량으로 전처리하였다. 본 시험에서 검사한 AAV 및 LNP는, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 제조하였다. 혈청 cA1AT/hA1AT 수준 및 유전자 편집은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 측정하였다.

모든 동물을 sgRNA 표적 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이체 및 기존 항-AAV8 중화 항체에 대해 사전 선별하였다. 혈장 중 AAV 및 LNP 성분의 약동학 평가는, 3,502번 동물에서의 AAV 성분을 제외한 모든 처리한 동물에 대한 이력 범위 내에 있었다. 3,502번 동물에 대한 시험 문서에서 AAV 투여 중 잘못된 투여를 언급하였다. 3,502번 동물에서 AAV에 대한 혈장 노출은, 투여 문제를 나타낸 이력 범위보다 10배 낮았다. 이러한 사항을 고려하여, 3,502번 동물은 유효성 평가에서 제외되었다. 임상 병리학(임상 화학, 혈액학, 응고) 및 사이토카인 모니터링에서, 임의의 매개변수 상승이 1주일 내 기준선으로 돌아가는 임의의 일반적인 결과가 나타나지 않았다.

작제물 7 또는 작제물 8 및 제형화한 알부민 가이드 G009860을 함유하는 AAV로 처리한 동물은 증가된 혈청 hA1AT 수준을 발현하였지만, 완충액 대조군에서는 발현을 관찰하지 못하였다(표 28 및 도 11). 제형화한 알부민 가이드 G009860으로 처리한 동물은 작제물 7 그룹에서 37.6, 그리고 작제물 8 그룹에서 42.2의 평균 인델%을 가졌다. 완충액 대조군 그룹에 대한 어떠한 인델도 관찰하지 못하였다(표 29 및 도 10). hA1AT 수준은 작제물 7 그룹에서 평균 882 μg/mL, 그리고 작제물 8 그룹에서 평균 1,223 μg/mL로 4주 차에 최대 평탄역에 도달하였고, 삽입 처리는 cA1AT 수준에 영향을 주지 않았다(표 30).

[표 28]

혈청 내 hA1AT 수준

BQL: 정량 한도 미만, NR: 분석 문제로 인해 보고되지 않음, 제외: 제외된 값

[표 29]

[표 30]

혈청 내 cA1AT 수준

NR: 분석 문제로 인해 보고되지 않음. 제외: 제외된 값

실시예 11 - 호중구 엘라스테이스 억제에 대한 혈청 hA1AT의 평가

천연 인간 A1AT의 호중구 엘라스테이스 억제 활성을 SerpinA1 널(null) 마우스의 양방향 작제물에서 발현되는 hA1AT 서열의 활성과 비교하였다. hA1AT 단백질은 알부민 유전자좌에 삽입한 후 양방향 작제물에서 발현하였으며, 천연 인간 A1AT 단백질에 존재하지 않는 인간 알부민 삽입 부위의 N-말단에서 세 개의 아미노산을 함유한다.

mRNA는 천연 인간 A1AT(native-A1AT), 또는 알부민 유전자좌에 삽입한 후 양방향 작제물에서 발현되는 인간 A1AT(Alb-A1AT)를 암호화하며, 이를 지질 제형화하고 2 ㎎/㎏의 용량으로 세핀A1(SerpinA1) 널 마우스(젝슨 연구소, 그룹당 n = 4)에 정맥 내로 전달하였다. 투여하고 여섯 시간 후 혈액을 수집하였고, A1AT를 암호화하는 mRNA로 처리되지 않은 대조군 널 마우스, 및 내인성 A1AT를 발현하는 야생형 마우스와 비교하여 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의한 인간 A1AT의 정량화, 및 호중구 엘라스테이스의 억제를 위해 혈청을 제조하였다.

ELISA에 의해 측정한 대로 발현 작제물에서의 A1AT의 발현은 도 12a 및 표 31에 나타내었다.

[표 31]

SerpinA1 널 마우스에서의 A1AT의 발현

상업적으로 입수 가능한 호중구 엘라스테이스 비색 약물 발견 키트(카탈로그 번호 BLM-AK947; Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY)를 사용하여 호중구 엘라스테이스를 억제하는 혈청 A1AT의 능력을 측정하였다. 생체 내 시험에서의 혈청을 A1AT의 정확한 평가를 가능하게 하기 위해 제조하였다. 혈청 샘플을 PBS에서 3배 희석하고 0.22 μm 스핀 필터(카탈로그 번호 UFC30GV; Sigma)를 통해 여과하였다. 200 마이크로리터의 알파 1 수지 선택[Alpha 1 Select Resin](카탈로그 번호 17547201; Cytiva, Marlborough, MA)을 빈 컬럼(카탈로그 번호 731-1550; BioRad)에 첨가하고 600 μL의 PBS로 3회 세척하였다. 여과된 A1AT-함유 혈청 샘플 600 μL를 컬럼에 도입하고 실온에서 40분 동안 회전시키면서 배양하였다. 컬럼을 PBS로 3회 세척하고, A1AT 단백질을 500 μL의 용출 완충액(2M MgCl2, 20 mM 트리스 pH 7.5)을 첨가하여 용출하였다.

이어서 정제된 샘플을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하는 호중구 엘라스테이스 억제 검정에 사용하였다. 요약하면, 키트의 성분을 얼음 위에서 해동하고, 억제제 및 기질을 작업용 원액 농도로 희석하였다. 호중구 엘라스테이스 효소 및 엘라스타티날 억제제 대조군을 검정 완충액에 희석하고, 마이크로플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다. 정제된 혈청 샘플을 다양한 농도에서 희석하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분 동안 배양하여 억제제/효소 상호작용을 가능하게 하였다. 이어서 비색 기질을 도입하고, 플레이트를 10분 동안 1분의 시간 간격으로 A_{405 nm}의 플레이트 판독기에서 판독하였다. 정제된 혈청 샘플의 억제 퍼센트를 측정하기 위해, 표준 값을 mOD 대 시간으로 그래프에 표시하고, 반응이 선형인 시점 범위를 측정하였다. 반응 속도(mOD/분)를 측정하고, 데이터 그래프의 선형 부분에 적합한 선의 기울기를 정의하였다. 억제 퍼센트는 표 32 및 도 12b에 나와 있다.

정제된 혈청 샘플에서 호중구 엘라스테이스의 억제 퍼센트

샘플	평균 억제%	SD 억제%	N
Alb-A1AT	21.27	5.07	5
천연 A1AT	22.28	0.79	5
WT 마우스	95.56	1.62	4
널 마우스(대조군)	17.25	0	1
125 μg/mL 억제제(엘라스타티날)(대조군)	88.22	0	1

Alb-A1AT

GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGGCGCGCCACCAUGAAGUGGGUAACCUUUAUUUCCCUUCUUUUUCUCUUUAGCUCGGCUUAUUCCAGGGGUGUGUUUCGUCGAGAUGCACUUGAGGAUCCCCAGGGAGAUGCUGCCCAGAAGACAGAUACAUCCCACCAUGAUCAGGAUCACCCAACCUUCAACAAGAUCACCCCCAACCUGGCUGAGUUCGCCUUCAGCCUAUACCGCCAGCUGGCACACCAGUCCAACAGCACCAAUAUCUUCUUCUCCCCAGUGAGCAUCGCUACAGCCUUUGCAAUGCUCUCCCUGGGGACCAAGGCUGACACUCACGAUGAAAUCCUGGAGGGCCUGAAUUUCAACCUCACGGAGAUUCCGGAGGCUCAGAUCCAUGAAGGCUUCCAGGAACUCCUCCGUACCCUCAACCAGCCAGACAGCCAGCUCCAGCUGACCACCGGCAAUGGCCUGUUCCUCAGCGAGGGCCUGAAGCUAGUGGAUAAGUUUUUGGAGGAUGUUAAAAAGUUGUACCACUCAGAAGCCUUCACUGUCAACUUCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGAUCAACGAUUACGUGGAGAAGGGUACUCAAGGGAAAAUUGUGGAUUUGGUCAAGGAGCUUGACAGAGACACAGUUUUUGCUCUGGUGAAUUACAUCUUCUUUAAAGGCAAAUGGGAGAGACCCUUUGAAGUCAAGGACACCGAGGAAGAGGACUUCCACGUGGACCAGGUGACCACCGUGAAGGUGCCUAUGAUGAAGCGUUUAGGCAUGUUUAACAUCCAGCACUGUAAGAAGCUGUCCAGCUGGGUGCUGCUGAUGAAAUACCUGGGCAAUGCCACCGCCAUCUUCUUCCUGCCUGAUGAGGGGAAACUACAGCACCUGGAAAAUGAACUCACCCACGAUAUCAUCACCAAGUUCCUGGAAAAUGAAGACAGAAGGUCUGCCAGCUUACAUUUACCCAAACUGUCCAUUACUGGAACCUAUGAUCUGAAGAGCGUCCUGGGUCAACUGGGCAUCACUAAGGUCUUCAGCAAUGGGGCUGACCUCUCCGGGGUCACAGAGGAGGCACCCCUGAAGCUCUCCAAGGCCGUGCAUAAGGCUGUGCUGACCAUCGACGAGAAAGGGACUGAAGCUGCUGGGGCCAUGUUUUUAGAGGCCAUACCCAUGUCUAUCCCCCCCGAGGUCAAGUUCAACAAACCCUUUGUCUUCUUAAUGAUUGAACAAAAUACCAAGUCUCCCCUCUUCAUGGGAAAAGUGGUGAAUCCCACCCAAAAAUAAUAGGCUAGCCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG (서열 번호 1,562)

천연 A1AT

GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGGCGCGCCACCAUGCCGUCUUCUGUCUCGUGGGGCAUCCUCCUGCUGGCAGGCCUGUGCUGCCUGGUCCCUGUCUCCCUGGCUGAGGAUCCCCAGGGAGAUGCUGCCCAGAAGACAGAUACAUCCCACCAUGAUCAGGAUCACCCAACCUUCAACAAGAUCACCCCCAACCUGGCUGAGUUCGCCUUCAGCCUAUACCGCCAGCUGGCACACCAGUCCAACAGCACCAAUAUCUUCUUCUCCCCAGUGAGCAUCGCUACAGCCUUUGCAAUGCUCUCCCUGGGGACCAAGGCUGACACUCACGAUGAAAUCCUGGAGGGCCUGAAUUUCAACCUCACGGAGAUUCCGGAGGCUCAGAUCCAUGAAGGCUUCCAGGAACUCCUCCGUACCCUCAACCAGCCAGACAGCCAGCUCCAGCUGACCACCGGCAAUGGCCUGUUCCUCAGCGAGGGCCUGAAGCUAGUGGAUAAGUUUUUGGAGGAUGUUAAAAAGUUGUACCACUCAGAAGCCUUCACUGUCAACUUCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGAUCAACGAUUACGUGGAGAAGGGUACUCAAGGGAAAAUUGUGGAUUUGGUCAAGGAGCUUGACAGAGACACAGUUUUUGCUCUGGUGAAUUACAUCUUCUUUAAAGGCAAAUGGGAGAGACCCUUUGAAGUCAAGGACACCGAGGAAGAGGACUUCCACGUGGACCAGGUGACCACCGUGAAGGUGCCUAUGAUGAAGCGUUUAGGCAUGUUUAACAUCCAGCACUGUAAGAAGCUGUCCAGCUGGGUGCUGCUGAUGAAAUACCUGGGCAAUGCCACCGCCAUCUUCUUCCUGCCUGAUGAGGGGAAACUACAGCACCUGGAAAAUGAACUCACCCACGAUAUCAUCACCAAGUUCCUGGAAAAUGAAGACAGAAGGUCUGCCAGCUUACAUUUACCCAAACUGUCCAUUACUGGAACCUAUGAUCUGAAGAGCGUCCUGGGUCAACUGGGCAUCACUAAGGUCUUCAGCAAUGGGGCUGACCUCUCCGGGGUCACAGAGGAGGCACCCCUGAAGCUCUCCAAGGCCGUGCAUAAGGCUGUGCUGACCAUCGACGAGAAAGGGACUGAAGCUGCUGGGGCCAUGUUUUUAGAGGCCAUACCCAUGUCUAUCCCCCCCGAGGUCAAGUUCAACAAACCCUUUGUCUUCUUAAUGAUUGAACAAAAUACCAAGUCUCCCCUCUUCAUGGGAAAAGUGGUGAAUCCCACCCAAAAAUAAUAGGCUAGCCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG(서열 번호 1,563)

실시예 12 - SERPINA1 널 마우스에서 순차적인 siRNA 침묵화 및 CRISPR 편집에 대한 주형 삽입 서열의 저항성

삽입 주형 서열의 핵산분해효소 저항성은, 주형을 삽입하고 야생형 인간 SERPINA1을 표적하는 siRNA 처리로 후속 처리함으로써 SERPINA1 널 마우스에서 검사하였다. 작제물 1은 야생형 코딩 서열 및 SERPINA1에 대한 코돈 최적화된 서열을 포함한다. 코돈 최적화된 서열은 siRNA2 및 siRNA3의 안티센스 서열에 완전히 상보적이지 않다.

0일 차에, SERPINA1 널 마우스(n = 수컷 아홉 마리, 암컷 아홉 마리)에 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666(마우스 알부민 표적)을 운반하는 LNP의 (전체 RNA 카고 함량에 대한) 마우스당 1 mg/kg, 및 1.5e11 vg에서 작제물 1 A1AT 주형에서 유래된 ssAAV를 투여하였다. 모든 시약을 전술한 바와 같이 제조하고 투여하였다. 14일 차 및 28일 차에 혈액을 수집하고, siRNA로 처리하기 전에 혈청을 제조하였다. 28일 차, 29일 차, 및 30일 차에, 마우스(n = 그룹당 수컷 세 마리 및 암컷 세 마리)를 siRNA2 또는 siRNA3(0.3 mg/kg)로 제형화한 LNP, 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 32일 차에 혈액을 수집하고 혈청을 준비하였다.

혈청 중 인간 A1AT 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)에 의해 측정하였다.

도 13a 및 표 33은 28일 차(투여 전) 및 32일 차(투여 후)에 ELISA에 의해 측정된 hA1AT 단백질 수준을 나타낸다. 도 13b 및 표 34는 siRNA2 또는 siRNA3 투여 후 A1AT의 녹다운 퍼센트를 나타낸다.

[표 33]

siRNA 투여 전후 ELISA에 의해 측정한 hA1AT 수준

[표 34]

siRNA2 및 siRNA3 투여 후 녹다운 퍼센트

실시예 13 - 다양한 스플라이스 수여가 있는 양방향 작제물의 SERPINA1 삽입

작제물 11은 인간 혈청 알부민 스플라이스 수여 부위가 있는 작제물 8의 SERPINA1 코딩 서열을 갖는 양방향 작제물이다. 양방향 ssAAV 작제물 7 및 11을 사용하여 C57BL 마우스 알부민 유전자좌로의 hSERPINA1의 삽입을 검사하였다. 본 실시예에서 검사한 ssAAV 및 LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하여 마우스에 전달하였다.

8-9주령의 마우스에게 Cas9 mRNA 및 sgRNA G000666(마우스 알부민 표적)을 운반하는 LNP의 (전체 RNA 카고 함량에 대한) 1 mg/kg을 투여하였다. ssAAV는 표 35에 제공된 용량으로 평가하였다.

작제물 7 및 11에 대한 투여 요법

	LNP 용량	AAV 용량	N
비히클	X	X	4
작제물 11	1 mpk	2.5e13 vg/kg	5
작제물 11	1 mpk	7.5e12 vg/kg	5
작제물 11	1 mpk	2.5e12 vg/kg	5
작제물 7	1 mpk	2.5e13 vg/kg	5
작제물 7	1 mpk	7.5e12 vg/kg	5
작제물 7	1 mpk	2.5e12 vg/kg	5

투여하고 1주 차 및 2주 차에 혈액을 수집하였다. 투여하고 4주 후, 동물을 안락사하고, 간 조직 및 혈액을 수집하여 간 편집 및 혈청 내 hA1AT 발현 수준을 각각 평가한다. 인델 형성은 NGS로 측정정한다. 혈청은 ELISA(Aviva Biosystems, 카탈로그 번호 OKIA00048)로 인간 알파1 항트립신[hA1AT] 혈청 발현을 측정하기 위해 제조하였다. 투여하고 1주 차 및 2주 차의 혈청 hA1AT 수준은 도 14 및 표 36에 나와 있다.

[표 36]

작제물 7 및 11 투여 후 혈청 A1AT 수준

BLOD = 검출 한계 미만

[표 37]

추가 서열

서열목록 전자파일 첨부

Claims

양방향 핵산 작제물로서,
a) 제1 알파-1 항트립신[alpha-1 antitrypsin, AAT] 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하는 제1 절편으로서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한, 제1 절편; 및
b) 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 역 상보적 서열을 포함하는 제2 절편으로서, 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도는 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용 빈도 및 상기 SERPINA1 유전자의 코돈 사용 빈도와 상이한, 제2 절편을 포함하되,
상기 작제물은 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는 양방향 핵산 작제물.
제1항에 있어서, 상기 제2 절편은 상기 제1 절편의 3'인, 양방향 핵산 작제물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작제물은 상동성 팔[homology arm]을 포함하지 않는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 절편은 링커에 의해 상기 제2 절편에 연결되는, 양방향 핵산 작제물.
제4항에 있어서, 상기 링커는 길이가 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1,000, 1,500, 또는 2,000개의 뉴클레오타이드인, 양방향 핵산 작제물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 링커는 CpG가 고갈된, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 절편 각각은 폴리아데닐화 꼬리 서열, 폴리아데닐화 신호 서열 또는 폴리아데닐화 부위를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 스플라이스 수여 부위[splice acceptor site]를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제8항에 있어서, 상기 스플라이스 수여 부위는 인간 스플라이스 수여 부위를 포함하는, 양방향 작제물.
제8항에 있어서, 상기 스플라이스 수여 부위는 마우스 스플라이스 수여 부위를 포함하는, 양방향 작제물.
제8항에 있어서, 상기 작제물은 상기 제1 절편의 상류에 제1 스플라이스 수여 부위 및 상기 제2 절편의 하류에 제2 (역) 스플라이스 수여 부위를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 이중 가닥, 선택적으로 이중 가닥 DNA인, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 단일 가닥, 선택적으로 단일 가닥 DNA인, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 코돈 최적화된, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열은 CpG가 고갈되고, 상기 제2 코딩 서열도 CpG가 고갈된, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 다음 말단 구조, 즉, 헤어핀, 루프, 역위 말단 반복부[inverted terminal repeat, ITR], 또는 환상면체[toroid] 중 하나 이상을 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제16항에 있어서, 상기 말단 구조는 CpG가 고갈된, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 한 개, 두 개, 또는 세 개의 역위 말단 반복부[ITR]를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 두 개 이하의 ITR을 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제19항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 1,403-1,425번 염기, 선택적으로 1,418-1,424번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제20항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 1,410-1,436번 염기, 선택적으로 1,423-1,435번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제21항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 957-977번 염기, 선택적으로 970-976번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 409-431번 염기, 선택적으로 409-410 및 415-418번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 506-528번 염기, 선택적으로 519-522 및 527-528번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 538-560번 염기, 선택적으로 551-554 및 559-560번 염기에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 및 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 모두 서열 번호 703의 409-431번, 506-528번, 538-560번, 957-977번, 및 1,403-1,436번 염기 중 적어도 두 개의 염기 영역, 적어도 세 개의 염기 영역, 적어도 네 개의 염기 영역, 또는 다섯 개의 염기 영역 모두에 상응하는 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 영역 내 야생형 SERPINA1 유전자 서열에서 적어도 한 개, 적어도 두 개, 또는 적어도 세 개의 불일치를 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 771, 772, 781, 및 782에서 선택되는 서열을 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열은 서열 번호 771, 772, 781, 및 782에서 선택되는 서열을 포함하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양방향 핵산 작제물의 핵산 서열은 서열 번호 770, 780, 및 1,564에서 선택되는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양방향 작제물은 서열 번호 700 또는 702의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양방향 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 CpG가 고갈된, 양방향 핵산 작제물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양방향 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 CpG가 고갈되되, 상기 ITR은 CpG가 고갈되지 않은, 양방향 핵산 작제물.
SERPINA1 핵산 서열을 세포 또는 세포 집단에 도입하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 다음을 투여하여 상기 SERPINA1 핵산을 상기 세포 또는 세포 집단에 도입하는 단계를 포함하는 방법:
i) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물;
ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(guide RNA, gRNA):
a) 적어도 95% 서열 번호 2-33인 서열;
b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드;
c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열.
제33항에 있어서, 상기 세포 또는 세포 집단은 간 세포를 포함하는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 간 세포는 간 실질 세포[hepatocyte]인, 방법.
간 세포 또는 세포 집단에서 알파-1 항트립신[AAT] 분비를 증가시키는 방법으로서, 간 세포 또는 세포 집단에 다음을 투여하여 상기 간 세포 또는 상기 세포 집단에서 AAT 분비를 증가시키는 단계를 포함하는 방법:
i) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물;
ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA):
a) 적어도 95% 서열 번호 2-33인 서열;
b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드;
c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열.
제36항에 있어서, 상기 간 세포는 간실질세포인, 방법.
제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포 집단은 투여 전의 수준과 비교하여 기능성 AAT를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가한 수준으로 발현하는, 방법.
대상에서 알파-1 항트립신[AAT]을 발현하는 방법으로서, 다음을 투여하여 대상에서 AAT를 발현하는 단계를 포함하는 방법:
i) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물;
ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA):
a) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 서열;
b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드;
c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열.
대상에서 알파-1 항트립신 결핍[alpha-1 antitrypsin deficiency, AATD]을 치료하는 방법으로서, 다음을 투여하여 상기 대상에서 AATD를 치료하는 단계를 포함하는 방법:
i) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물;
ii) RNA-가이드 DNA 결합제; 및
iii) 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 알부민 가이드 RNA(gRNA):
a) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 서열;
b) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 내 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드;
c) 서열 번호 2-33으로 이루어진 군에서 선택되는 서열.
제39항 또는 제40항에 있어서,
(a) 상기 대상의 기능성 AAT의 수준은 적어도 약 500 μg/ml까지 증가하거나,
(b) 상기 대상의 기능성 AAT의 수준은 투여 전의 상기 대상의 기능성 AAT 수준과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 대상에서 상기 기능성 AAT의 수준은 투여 후 적어도 1년 동안 유지되는, 방법.
제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 혈청 또는 혈장에서 측정되는, 방법.
제43항에 있어서, 혈청 내 상기 AAT의 수준은 적어도 500 μg/ml, 적어도 571 μg/ml, 적어도 750 μg/ml, 적어도 1,000 μg/ml, 500-4,000 μg/ml, 500-3,500 μg/ml, 750-3,500 μg/ml, 1,000-3,500 μg/ml, 1,000-3,000 μg/ml, 또는 1,000-2,700 μg/ml인, 방법.
제44항에 있어서, 상기 수준은 상기 양방향 핵산 작제물을 투여하고 적어도 8주, 적어도 9주, 적어도 10주, 적어도 11주, 또는 적어도 12주 후에 측정되는, 방법.
제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 간 또는 폐 기능이 손상된, 방법.
제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 상기 대상에서 폐기종의 진행을 지연시키는, 방법.
제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 양방향 핵산 작제물의 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
제48항에 있어서, 상기 방법은 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 치료제의 투여를 포함하는 방법.
제49항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 치료제는 siRNA, dsRNA 또는 가이드 RNA인, 방법.
제50항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 치료제는 서열 번호 703의 957-977번, 1,403-1,425번, 또는 1,410-1,436번 뉴클레오타이드를 표적하는 RNAi 작용제, 및 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 가이드 RNA에서 선택되는, 방법.
제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[double-stranded break, DSB]을 유도하는 단계를 더 포함하는 방법.
제52항에 있어서, 상기 방법은 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 내인성 SERPINA1 유전자를 변형하는 단계를 더 포함하는 방법.
제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DSB는 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 유도되거나, 상기 내인성 SERPINA1 유전자는 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉하거나 상기 대상에게 상기 양방향 핵산 작제물을 투여한 후에 변형되는, 방법.
제33항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 상기 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 2, 3, 4, 또는 5번 엑손에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 둘 다를 표적으로 하지 않는, 방법.
제33항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 방법.
제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 SERPINA1 가이드 RNA는
서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 가이드 서열;
서열 번호 1,129-1,131과 적어도 95% 동일한 가이드 서열; 또는
서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 서열의 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
제33항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 생체 내에서 시행되는, 방법.
제33항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 투여되는, 방법.
제33항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드 DNA 결합제 또는 알부민 gRNA는 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 전달 또는 투여되는, 방법.
제33항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드 DNA 결합제 또는 SERPINA1 gRNA는 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 형태로 전달 또는 투여되는, 방법.
제62항에 있어서, 상기 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
제63항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스[adeno associate viral, AAV] 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
제64항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
제33항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드 DNA 결합제는 클래스 2 Cas 핵산분해효소인, 방법.
제66항에 있어서, 상기 Cas 핵산분해효소는 Cas9 핵산분해효소인, 방법.
제67항에 있어서, 상기 Cas9 핵산분해효소는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 핵산분해효소인, 방법.
제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 핵산분해효소는 클리베이스(cleavase)인, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 벡터.
제70항에 있어서, 상기 벡터는 아데노 연관 바이러스[AAV] 벡터인 벡터.
제71항에 있어서, 상기 AAV는 단일 가닥 게놈[single-stranded genome, ssAAV] 또는 자가 상보적 게놈[self-complementary genome, scAAV]을 포함하는, 벡터.
제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드로 이루어진 군에서 선택되는 벡터.
제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상동성 팔을 포함하지 않는 벡터.
제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 CpG가 고갈된 벡터.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
제77항에 있어서, 상기 숙주 세포는 간 세포인 숙주 세포.
제78항에 있어서, 상기 숙주 세포는 간실질세포인 숙주 세포.
제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 비분열 세포 유형인 숙주 세포.
제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 양방향 작제물에 의해 암호화된 상기 AAT 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 양방향 핵산 작제물을 포함하는 대상에서 내인성 알파-1 항트립신[AAT]의 발현을 감소시키는 방법으로서, 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 상기 양방향 핵산 작제물의 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 상기 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
제82항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 siRNA, dsRNA 또는 가이드 RNA인, 방법.
제83항에 있어서, 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 핵산 치료제는 서열 번호 703의 957-977번, 1,403-1,425번, 또는 1,410-1,436번 뉴클레오타이드를 표적하는 RNAi 작용제, 및 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 표적 가이드 RNA에서 선택되는, 방법.
제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
제85항에 있어서, 상기 방법은 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 이중 가닥 절단[DSB]을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 내인성 SERPINA1 유전자를 변형하는 단계를 포함하는 방법.
제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 상기 내인성 인간 SERPINA1 유전자의 2, 3, 4, 또는 5번 엑손에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제1 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 상기 제2 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열 모두를 표적으로 하지 않는, 방법.
제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SERPINA1 유전자 표적 핵산 작용제는 SERPINA1 가이드 RNA이되, 이는 서열 번호 703의 412-431번, 506-525번, 또는 538-557번 뉴클레오타이드에 상응하는 위치의 상기 내인성 SERPINA1 유전자 내에서 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 방법.
제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 SERPINA1 가이드 RNA는
서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 가이드 서열;
서열 번호 1,129-1,131과 적어도 95% 동일한 가이드 서열; 또는
서열 번호 1,129-1,131에서 선택되는 서열의 17, 18, 19 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 양방향 핵산 작제물의 상기 AAT 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 현저하게 감소시키지 않으면서 상기 내인성 SERPINA1 유전자의 발현을 감소시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 상승된 간 효소를 갖는, 방법.
제92항에 있어서, 상기 대상은 하나 이상의 간 효소의 적어도 3배 정상 상한치[upper limit of normal, ULN]를 갖는, 방법.
제93항에 있어서, 상기 하나 이상의 간 효소는 알라닌 아미노전이효소[alanine aminotransferase, ALT] 및 아스파테이트 아미노전이효소[aspartate aminotransferase, AST]에서 선택되는, 방법.
제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 간 효소를 임상적으로 적절하게 감소시키는 방법.
제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 치료로 인해 상기 상승된 간 효소가 3배 ULN 이내로 감소하는, 방법.
제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상에서 간 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법.