JP2023184168A - 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物 - Google Patents

脈管障害の予防又は治療用医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023184168A
JP2023184168A JP2022098156A JP2022098156A JP2023184168A JP 2023184168 A JP2023184168 A JP 2023184168A JP 2022098156 A JP2022098156 A JP 2022098156A JP 2022098156 A JP2022098156 A JP 2022098156A JP 2023184168 A JP2023184168 A JP 2023184168A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mir
microrna
exosomes
precursor
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022098156A
Other languages
English (en)
Inventor
耕司 上野
Koji Ueno
公一 濱野
Koichi Hamano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yamaguchi University NUC
Original Assignee
Yamaguchi University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yamaguchi University NUC filed Critical Yamaguchi University NUC
Priority to JP2022098156A priority Critical patent/JP2023184168A/ja
Publication of JP2023184168A publication Critical patent/JP2023184168A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

【課題】本発明の課題は、脈管障害、特に重症下肢虚血の予防又は治療に用いられる医薬組成物を提供することにある。【解決手段】（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体；又は（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；を有効成分とする、脈管障害の予防又は治療用医薬組成物を調製する。【選択図】図１

Description

本発明は、脈管障害の予防又は治療用医薬組成物や、血管新生の促進作用を有するマイクロＲＮＡを含有する脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法に関する。
重症下肢虚血等の脈管障害における治療の第一選択は、ステントを使用した血管内治療やバイパス手術であるが、症例によっては、それらの血行再建手術を実施できない患者もいる。また、手術が成功しても、末梢循環が改善されない症例も存在している。そして、閉塞性動脈硬化による潰瘍や壊疽を有する重症下肢虚血患者においては、虚血部位の血流を改善させない限り下肢切断を回避することはできないのが現状である。その為に、日本では年間約４万人、米国では年間約１６万人が指・下肢切断を余儀なくされている。また、重症下肢虚血患者の５年後の死亡率は７０％を超えている。これは大腸癌のステージ４よりも悪い予後を示している。
こうした重症下肢虚血患者に対して、末梢循環を改善する方法として細胞移植による血管新生療法の開発が世界中で実施されている。細胞移植による血管新生療法の治療効果は、移植された細胞が生体に生着して血管を作るのではなく、移植された細胞が分泌する因子が生体の細胞を活性化させることで、生体の細胞が血管を作ると考えられている。このような治療効果はパラクライン効果と呼ばれている。このパラクライン効果をもたらす因子の中で重要であると考えられているのが、エクソソームである。
エクソソームは細胞が分泌する直径約２０～１２０ｎｍの脂質二重膜からなる膜小胞であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク等を内包している。エクソソームは、エクソソームを分泌する細胞の特性を受け継いでいると考えられている。細胞移植により血管新生をもたらす幹細胞が分泌するエクソソーム自体が血管新生をもたらす効果を持つことが動物モデルで報告されている。これまでの幹細胞や血管内皮細胞由来のエクソソームが血管新生を誘導する機序解析から、幹細胞や血管内皮細胞由来のエクソソームに内包されているマイクロＲＮＡとして、ｍｉＲ１２６－３ｐやｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが血管新生において重要であることが報告されている（非特許文献１、２参照）。さらに、トロンビン処理された間葉系幹細胞由来のエクソソームが虚血脳症や皮膚傷の治療効果を示すことが開示されている（特許文献１、２参照）。しかしながら、これまでのエクソソームによる血管新生療法の開発は、幹細胞由来エクソソームをそのまま投与する方法であり、エクソソームの機能を増強させる方法については着目されていなかった。
また、エクソソームが注目される理由の一つとして、エクソソームには免疫原性がないことが報告されている点である。免疫原性がなければ、細胞移植では議論の一つになる同種（他家）細胞移植による免疫拒絶の課題が克服できる。そのため、活きのよい細胞から分泌されるエクソソームを単離して、治療薬としてエクソソームを投与する治療法の開発が世界中で活発に実施されている。
本発明者らは、重症下肢虚血に対してエクソソームを用いる方法として、Ｓ１００Ａ８、ＣＤ７２、または、その両方に対するリガンドを膜表面上に提示し、虚血組織に集積するエクソソームを開示した（特許文献３参照）。さらに、本発明者らは、低酸素処理により血管成長因子の産生量が増加する細胞シートについて開示した（特許文献４、５参照）。
特表２０２０－５１４４００号公報 特表２０１９－５２０３６５号公報 特開２０２０－１７４５７３号公報 国際公開第２０１６／０４３２０１号パンフレット 国際公開第２０１６／０６８２１７号パンフレット
Prabhu Mathiyalagan et al., Circ Res.2017; 120:1466-1476 doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.310557 Meng Ye et al., Int J Biol Sci. 2019; 15(1): 158-168 doi: 10.7150/ijbs.28392
本発明の課題は、脈管障害、特に重症下肢虚血の予防又は治療に用いられる医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、血清中のエクソソームに含まれるマイクロＲＮＡや、低酸素培養によって分泌されるエクソソームに含まれるマイクロＲＮＡに着目した。その結果、血管新生効果を有する６つのマイクロＲＮＡを同定した。さらに、それらのマイクロＲＮＡをエクソソームに人工的に内包させてマウス下肢虚血モデルに投与したところ、血流が改善することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体；又は
（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；
を有効成分とする、脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
〔２〕前記脈管障害が、重症下肢虚血、脳血管障害、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、糖尿病性脈管障害、又はリンパ管障害である、上記〔１〕に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
〔３〕（ａ）に記載のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体、又は（ｂ）に記載の発現ベクターが核酸送達媒体の中に包含されていることを特徴とする、上記〔１〕に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
〔４〕核酸送達媒体が、脂質二重膜からなる膜小胞であることを特徴とする、上記〔３〕に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
〔５〕ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、生体から分離された脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法であって、
哺乳動物細胞にｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入して、前記発現ベクターを含有する哺乳動物細胞を作製する工程Ａ；及び
前記工程Ａで作製した哺乳動物細胞を培養してｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を発現させる工程Ｂ；
を含む、前記方法。
また、本発明の別の態様としては、（Ｉ）（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体、又は（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、脈管障害の予防又は治療方法や、（II）脈管障害の予防又は治療用医薬組成物の製造のための、（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体、又は（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの使用や、（III）脈管障害の予防又は治療に用いるための、（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体又は（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを挙げることができる。ここで、「有効量」は、対象において予防又は治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。したがって、投与対象の疾患の重症度、投与される剤形、年齢、体重、性別、投与時間、投与経路及び治療期間等によって調整できる。
本発明の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物により、脈管障害の予防又は治療が可能となる。また、本発明のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、生体から分離された脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法により、脈管障害の予防又は治療に有効なマイクロＲＮＡを含有する膜小胞を作製することが可能となる。
実施例１において、マウス下肢虚血モデルに対する血管新生マイクロＲＮＡ内包エクソソームの筋肉注射投与後の血流評価を行った結果である。 実施例２において、マウス下肢虚血モデルに対するｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソーム投与後のｂＦＧＦの発現変化を調べた結果である。 実施例３において、ｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃ及びコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソームに内包されているｍｉＲ－７０９の発現をｑＰＣＲによって解析した結果である。左カラムがスクランブル、右カラムがｍｉＲ－７０９を内包させたエクソソームの場合である（図３Ｂ、図４も同じ）。 実施例３において、ヒト大動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＡｏＥｃ）にエクソソームを添加し、ｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃ及びコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソーム内のｍｉＲ－７０９の発現をｑＰＣＲによって解析した結果である 実施例３において、ヒト大動脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＡｏＥｃ）にエクソソームを添加して８時間後、２４時間後のＨＡｏＥｃにおけるＢｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｋｉｎａｓｅ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｘ（ＢＭＸ）およびｂＦＧＦの発現変化をｑＰＣＲで解析した結果である。 実施例４において、歯髄幹細胞を低酸素培養した場合の４９０ｎｍの吸収に基づく細胞増殖能、エクソソーム濃度、エクソソームに内包されているＶＥＧＦ量を調べた結果である。 実施例４において、２次スクリーニングとしてマイクロＲＮＡ内包エクソソーム添加によるＨＡｏＥｃの細胞増殖アッセイを行った結果である。 実施例４において、マウス下肢虚血モデルに対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソーム投与後の血流改善効果を調べた結果である。 実施例５において、マウス下肢虚血モデルに対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソーム投与後の血管新生因子の発現を調べた結果である。
本発明の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物は、
（ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体；又は
（ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、「本件発現ベクター」ともいう）；
を有効成分とする、脈管障害の予防又は治療用医薬組成物であれば特に制限されず、以下、「本件医薬組成物」ともいう。
また、本発明のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、生体から分離された脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法は、ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、生体から分離された脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法であって、
哺乳動物細胞にｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入して、前記発現ベクターを含有する哺乳動物細胞を作製する工程Ａ；及び
前記工程Ａで作製した哺乳動物細胞を培養してｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を発現させる工程Ｂ；
を含む、前記方法であれば特に制限されず、以下、「本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法」ともいう。
本明細書において、脈管障害とは、血管（動脈若しくは静脈）又はリンパ管の障害を意味し、重症下肢虚血、脳血管障害、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、糖尿病性脈管障害、又はリンパ管障害を挙げることができる。
本明細書におけるマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種（以下、「本件マイクロＲＮＡ」ともいう）である。ここで、上記本件マイクロＲＮＡは、一本鎖の成熟マイクロＲＮＡであっても、上記一本鎖の成熟マイクロＲＮＡに、その成熟マイクロＲＮＡと相補的な塩基配列を有する２本鎖のマイクロＲＮＡであってもよい。本件マイクロＲＮＡのうち、一本鎖の成熟マイクロＲＮＡのポリヌクレオチドは、
（Ｉ）配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
として表すことができる。
また、本件マイクロＲＮＡには、以下の（II）又は（III）に示す一本鎖の成熟マイクロＲＮＡの変異体も含まれる。
（II）配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、付加、又は置換したポリヌクレオチドであって、血管新生の促進作用を有するポリヌクレオチド
（III）配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、血管新生の促進作用を有するポリヌクレオチド
上記（II）又は（III）において、血管新生の促進作用を有するか否かは、たとえば、配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、付加、又は置換したポリヌクレオチド、あるいは配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを用いて、後述の実施例に記載の方法に準じて、大腿動脈での新生血管の観察による血管新生能の評価や、マウス下肢虚血モデルにおける血流比による血流評価や、ｂＦＧＦなどの血管新生因子の発現量の測定などによって確認することができる。
本明細書におけるｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとしては、上記本件マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであればよい。具体的には、たとえば一本鎖の成熟マイクロＲＮＡである、配列番号１～６示す塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ順に配列番号７～１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとして表すことができる。
上記一本鎖の成熟マイクロＲＮＡ、及び上記一本鎖の成熟マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を以下の表１に示す。表１中、ＭＩＭＡＴはアクセッション番号である。これらの配列は、マイクロＲＮＡデータベース（URL: www.mirbase.org/textsearch.shtml?q=0031416）で確認することができる。
上記「１又は数個」としては、１～５個が好ましく、１～４個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１～２個が特に好ましく、１個が最も好ましい。また、配列番号１～６のいずれかに示す塩基配列において５’末端の核酸塩基７～９核酸塩基からなるシード配列は保持していることが好ましい。すなわち、（II）としては、（II）’配列番号１～６に示す塩基配列においてシード配列は保持し、かつ配列番号１～６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、付加、又は置換したポリヌクレオチドであって、転写産物が血管新生の促進作用を有するポリヌクレオチド、（III）としては、（III）’配列番号１～６に示す塩基配列においてシード配列は保持し、かつ配列番号１～６に示す塩基配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、転写産物が血管新生の促進作用を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
上記マイクロＲＮＡの前駆体とは、ステムループ構造であり、前駆体の鎖に上記一本鎖成熟マイクロＲＮＡ若しくはその変異体を含有しているものを意味する。マイクロＲＮＡの前駆体の長さとしては５０～１００ｎｔ、好ましくは６５～８５ｎｔを挙げることができる。
上記本件マイクロＲＮＡあるいは上記本件マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性の向上若しくは安定化のため、若しくは相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるために、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等の修飾を施した類似体、あるいは核酸誘導体としてもよい。さらに、上記本件マイクロＲＮＡは、そのパッセンジャー鎖を化学修飾した二本鎖ＲＮＡであるマイクロＲＮＡミミックでもよい。
上記糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよい。糖部修飾ヌクレオチド類似体の具体例には、２’－Ｏ－メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－Ｏ－[２－(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’－フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックド人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、及びエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］を挙げることができ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am．Chem. Soc., 123， 4653 (2001)］、及びペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J．Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。
上記リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものを挙げることができる。リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体の具体例としては、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等［細胞工学， 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］を挙げることができる。
上記核酸誘導体としては、核酸に比べて、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、当該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよい。具体例には、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６－ＦＡＭ付加誘導体、及びビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
上記本件マイクロＲＮＡの由来としては特に制限されないが、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、マウス、ウサギを挙げることができる。
本件発現ベクターに用い、本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドと連結させる発現ベクターとしては、哺乳動物細胞と接触させて細胞内に導入し、本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドにコードされた所定の本件マイクロＲＮＡ若しくはそれらの前駆体を哺乳動物細胞において発現させることが可能な発現ベクターであればよく、非ウイルス系ベクターであっても、ウイルス系ベクターであってもよく、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、又はウイルスベクター等の公知のベクターを使用することができる。
さらに、本件発現ベクターには、選別マーカーをさらに含有してもよい。具体的には、ピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、アンピシリン、ルシフェラーゼや、ｍＣｈｅｒｒｙやＧＦＰ等の蛍光タンパク質を挙げることができる。
本明細書において、核酸送達媒体としては、本件マイクロＲＮＡ若しくはそれらの前駆体、あるいは本件発現ベクターを生体内に送達可能な媒体であれば特に制限されないが、生体組織又は生体試料由来の拡散送達媒体の場合には生体から分離された核酸送達媒体であることが好ましい。核酸送達媒体の具体的な例としては、脂質二重膜からなる膜小胞、界面活性剤ペプチド、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性ポリマー、非カチオン性ポリマー、βグルカン、アテロコラーゲン、ＰＬＧＡナノ粒子、スーパーアパタイトを挙げることができる。上記脂質二重膜からなる膜小胞としては、エクソソーム、カチオン性リポソーム、非カチオン性リポソームを挙げることができる。界面活性剤ペプチドとしては、たとえば４～１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなるペプチド界面活性、具体的には、Ａ６Ｋ（特開２０１６－７４６６３、特開２０１４－１３９２３５号公報参照）を挙げることができる。なお、上記核酸送達媒体には、ウイルスベクターやプラスミドベクター等のようにＤＮＡ断片を連結するベクターは含まれない。
本件マイクロＲＮＡ若しくはそれらの前駆体、あるいは本件発現ベクターは、上記核酸送達媒体の中に包含されていてもよく、あるいは上記核酸送達媒体と結合若しくは接着していてもよい。
本件医薬組成物における「医薬組成物」という用語は、予防又は治療上有効量の本件マイクロＲＮＡ若しくはそれらの前駆体、あるいは本件マイクロＲＮＡ若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、「本件有効成分」ともいう）、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は溶剤を含んでなる組成物を意味する。本件医薬組成物の剤型としては、溶液剤、ローション剤、噴霧剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることができるが、散剤、顆粒剤などの固形製剤、軟膏剤、又はゲル化剤とすることもできる。前記液剤の製造方法としては、例えば本件有効成分を生理食塩水、ＰＢＳ等の緩衝液、滅菌水などの溶剤と混合する方法や、さらにそれらの溶剤に懸濁化剤、乳化剤、抗酸化剤等を混合する方法を挙げることができる。必要に応じてフィルターろ過等により滅菌処理してもいい。また、固形製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
本明細書において、「予防」という用語には、脈管障害の発症を抑制若しくは防止すること、及び脈管障害の再発を抑制することが含まれる。「治療」という用語には、脈管障害を治癒すること、脈管障害の症状を軽減させること、及び脈管障害の進展を抑制することが含まれる。
本件医薬組成物の投与方法としては、所望の脈管障害の予防又は治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内注射による投与や、脈管障害部分又はその周辺部分への筋肉注射による投与等挙げることができる。また、本件医薬組成物の投与量、投与回数及び投与濃度は、投与対象の脈管障害の状態や投与対象の体重等に応じて適宜調節することができる。特に複数回の静脈内注射によって、より脈管障害を高めることが可能となる。
本件医薬組成物の投与対象としては、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、マウス、ウサギを挙げることができる。
＜本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法＞
本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法における工程Ａにおいて、哺乳動物細胞に本件発現ベクターを導入する方法としては特に制限されないが、リン酸カルシウム法、リポソームを用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法等の公知の方法を用いるほか、市販の形質転換キットを用いることができる。なお、用語「導入」とは、形質導入によって外来ＤＮＡを細胞に流入させることを意味する。
上記本件発現ベクターを導入する哺乳動物細胞としては、幹細胞でも非幹細胞であってもよく、また浮遊細胞であっても接着細胞であってもよい。具体的には、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞等の非幹細胞や、歯髄幹細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞を挙げることができる。
また、本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法における工程Ｂにおいて、上記哺乳動物細胞を培養する際の培地としては特に制限されないが、血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ－１６４０、ＦＩ２００、ＨＥ１００、ＨＥ４００（Ｇｍｅｐ社）、ＨＦＤＭ－１（＋）（細胞科学研究所社）、ＡＤＳＣ－４（コージンバイオ社）等を挙げることができる。また、培養時間は２４～１６８時間、培養温度は３３～３７℃を挙げることができる。なお、工程Ｂの培養によって、細胞内に本件マイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、脂質二重膜からなる膜小胞が作製され、その膜小胞が細胞外に分泌されるため、培地中に上記膜小胞が蓄積することとなる。
培養後の培地は、遠心（たとえば２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）してエクソソーム等の膜小胞を含む画分を得て、その画分から膜小胞を分離又は単離することができる。膜小胞を分離又は単離する方法は特に制限されないが、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）等の濾過、超遠心法を用いる他、市販の膜小胞単離キットを用いることもできる。また、ＣＤ９、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のエクソソームマーカーに基づいて膜小胞を濃縮することもできる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
［実施例１］血管新生能を有するマイクロＲＮＡの同定（１）
血管新生能を有するマイクロＲＮＡとして、ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、及びｍｉＲ－８１１０を次の方法により同定した。
（１次スクリーニング）
マウスとして、血管新生能が高いＣ５７ＢＬ／６マウス（オス、８週齢）及び血管新生能が低いＢＡＬＢ／Ｃマウス（オス、８週齢）を用いた。下肢虚血モデルとして、それぞれのマウスにおいて、イソフルラン麻酔下で左大腿動脈を２箇所結紮後、結紮間の左大動脈を電気メスで切断し、切開部は２～３針縫合した。
下肢虚血モデルを作製して２４時間後、採血して血漿を作製した。具体的には、１ｍＬシリンジに２６Ｇ針を取付けて、生理食塩水で調製した１％ＥＤＴＡを０．１ｍＬ取り、腹部大静脈から採血（約１～１．１ｍＬ）し、１．５ｍＬチューブに移してそのチューブを氷上に置いた。前記１．５ｍＬチューブを遠心（１，２００ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）し、エクソソームを含む上清（約４００～５００μＬ）を新しい１．５ｍＬチューブに移し、－８０℃で保存した。
次に、マイクロＲＮＡを以下の方法で抽出した。－８０℃から上記１．５ｍＬチューブを取り出し、氷上に１時間静置することで、上記で得られたエクソソームを含む上清を解凍した。１．５ｍＬチューブを軽く振り、遠心（１０，０００ｇ、２０ｍｉｎ）し、上清４００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、ＰＢＳ ２００μＬを入れてＶｏｒｔｅｘで攪拌し、ｓｐｉｎ ｄｏｗｎした。次に、１．５ｍＬチューブにＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ）（＃ ４４８４４５０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１２０μＬ入れてＶｏｒｔｅｘで攪拌し、室温で１０分間静置後、遠心（１０，０００ｇ、５ｍｉｎ、室温）した。遠心後、上清を１,０００μＬマイクロピペットで除去し、再度、遠心（１０，０００ｇ、３０ｓｅｃｏｎｄ、室温）した。遠心後の上清を２００μＬマイクロピペットで除去した。Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃４４７８５４５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、エクソソームに内包されているマイクロＲＮＡを抽出した。抽出したマイクロＲＮＡは１．５ｍＬチューブに入れて－８０℃で保存した。抽出したマイクロＲＮＡの発現解析は、ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ（東レ社に委託）で行った。
上記マイクロＲＮＡの発現解析により、血管新生能が高いＣ５７ＢＬ／６下肢虚血マウスに特異的に発現した、すなわちＢＡＬＢ／ｃ下肢虚血マウスでは発現が検出されず、Ｃ５７ＢＬ／６下肢虚血マウスのみ検出されたＮｏ．１～Ｎｏ．３１の３１種類のマイクロＲＮＡを表２に示す。また、ＢＡＬＢ／ｃ下肢虚血マウスと比較してＣ５７ＢＬ／６下肢虚血マウスで発現レベルが２０倍以上であったＮｏ．３２～Ｎｏ．４３の１２種類のマイクロＲＮＡを表３に示す。こうして、血管新生能を有するマイクロＲＮＡの候補として、１次スクリーニングにより４３種類のマイクロＲＮＡを同定した。
（２次スクリーニング）
・ベクターの作製
１次スクリーニングで同定した４３種類のマイクロＲＮＡを発現するベクターを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のゲノムＤＮＡを、表４のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（＃ＲＲ００１Ａ、タカラバイオ社）を使用して増幅し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（＃６０２３、タカラバイオ社）を使用してＴ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（＃３２７０、タカラバイオ社）に結合した。そして、Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０に挿入されたゲノムＤＮＡ配列を、それぞれ表５に記載の制限酵素で切り出し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を使用して、切り出したＤＮＡ断片をｐｍＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ（＃Ｚ２５４２Ｎ、タカラバイオ社）に挿入した。
・マイクロＲＮＡ内包エクソソームの作製
２４－ウェル プレートに２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と１０％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培地で、１×１０５ｃｅｌｌ／５００μＬ／ウェルで播種し、一晩培養した。
２４－ウェル プレートの１ウェルにおいて、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μＬとＯｐｔｉ－ＭＥＭTM Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、上記で作製した、１次スクリーニングで同定したマイクロＲＮＡを発現する４３種類のベクターとコントロールとしてベクターのみ、合計４４種類のベクター２μｇを２９３Ｔ細胞に導入し、一晩培養した。ウェルから培養液を除去し、１ウェルにＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と１０％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培地１．２ｍＬを入れて、３日間培養した。
３日間培養した培養液を１．５ｍＬチューブに移し、遠心（２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）し、その上清１ｍＬと、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（＃４４７８３５９、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）０．５ｍＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、Ｖｏｒｔｅｘで攪拌後、４℃で一晩培養した。一晩４℃に置いた１．５ｍＬチューブを遠心（１０，０００ｇ、６０ｍｉｎ、４℃）し、上清を１,０００μＬマイクロピペットで除去し、再度、遠心（２～４秒）後、上清を２００μＬマイクロピペットで除去した。ペレットのエクソソームを再懸濁する為に、Ｏｐｔｉ－ＭＥTM Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍを４２０μＬ入れて、１０分以上静置後、Ｖｏｒｔｅｘで攪拌してＳｐｉｎ ｄｏｗｎしてマイクロＲＮＡ内包エクソソーム溶液を調製した。
・Ａｏｒｔｉｃ ｒｉｎｇ ａｓｓａｙ
ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹の左右の大腿動脈を採取し、ＰＢＳに浸した。ピンセットとメスを使用して、顕微鏡下で大腿動脈を細切した。９６－ウェル プレートを氷上に置き、１ウェル毎にマトリゲルを５０μＬずつ入れ、その上に細切した大腿動脈を置き、そのウェルに再度マトリゲル５０μＬを入れた後に、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩培養した。１回の実験では、上記の９６－ウェル プレートの４４ウェルに細切した大腿動脈を入れた。一晩培養後、１ウェル毎に上記で作製したマイクロＲＮＡ内包エクソソーム溶液５０μＬを入れて５～７日間、培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。顕微鏡下での観察で、細切した大腿動脈から新生血管が観察された場合、そのウェルに添加したマイクロＲＮＡ内包エクソソームを血管新生能があると判断した。この実験を３回実施して１回でも新生血管が観察されたものは、血管新生能があると判断し、血管新生能があるマイクロＲＮＡとして、表６に記載のマイクロＲＮＡ１４種類を同定した。
（３次スクリーニング）
マウス下肢虚血モデルに対する血管新生マイクロＲＮＡ内包エクソソームの筋肉注射投与後の血流評価を以下の方法で行った。
・マイクロＲＮＡ内包エクソソームの作製
６－ウェル プレートに２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社及び１０％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地で播種し培養した。細胞密度が８０～９０％になった後、ウェルから培養液を除去し、１ウェルにＤＭＥＭ及び５％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳを含む培地を２ｍＬほど加えて一晩培養した。
６－ウェル プレートの１ウェルに、導入するベクター（２次スクリーニングで同定した表６に示すマイクロＲＮＡを発現する１４種類のベクターとコントール（ベクターのみ）の計１５種類のベクター（マイクロＲＮＡ内包エクソソームの作製欄に記載の方法で作製）２μｇを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μＬ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭTM Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２９３Ｔ細胞に導入し、一晩培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。ウェルから培養液を除去し、１ウェルにＤＭＥＭ及び５％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳの培地を２ｍＬほど入れて、５日間培養した。
５日間培養した培養液を２ｍＬチューブに移し、遠心（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）し、新しい２本の１．５ｍＬに、遠心後の上清１ｍＬずつ、及びＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（＃４４７８３５９、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）０．５ｍＬずつを入れ、攪拌後、４℃で一晩培養した。一晩４℃に置いた１．５ｍＬチューブを遠心（１０，０００ｇ、６０ｍｉｎ、４℃）し、上清を１,０００μＬマイクロピペットで除去し、再度、遠心後（２～４秒）、上清を２００μＬマイクロピペットで除去した。ＰＢＳ ４００μＬで２本の１．５ｍＬチューブのペレットを再懸濁して１本のサンプルとしてマイクロＲＮＡ内包エクソソーム溶液とし、４℃に保存した。
・マウス下肢虚血モデルへのエクソソーム溶液の投与
マウスとしてＢＡＬＢ／Ｃマウス（オス、７週齢）を用い、前記マウスの左大腿部の動脈と静脈を１か所結紮後、切開部を２針縫合して下肢虚血モデルを作製した。下肢虚血モデル作製の翌日に縫合糸を切断し、左大腿部の２箇所に５０μＬずつ上記エクソソーム溶液を投与し（６－ウェル プレートの１ウェル２ｍＬで作製した培養液のうち０．５ｍＬ分のエクソソームを投与）、再度、切開部を２針縫合した。経時的に、血流をドップラー（ｌａｓｅｒ ｓｐｅｃｋｌｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＯＭＥＧＡ ＺＯＮＥ， Ｏｍｅｇａ Ｗａｖｅ社））で測定した。１５群（マイクロＲＮＡ内包エクソソームが１４群、コントロールが１群）で行ったが、１回の実験では１群は３匹で実験を行い、２回独立した実験を行い、各群は合計６匹として解析した。結果を図１に示す。
図１より、ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、及びｍｉＲ－８１１０を内包したエクソソームを投与した場合は、コントロールと比較してそれぞれ１．９６倍、１．７３倍、１．５７倍、１．５３倍の血流比となることが明らかとなった。したがって、ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、及びｍｉＲ－８１１０は、重症下肢虚血をはじめとする虚血組織における虚血関連疾患の治療に効果があることが示された。なお、実施例１で発現させたｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、及びｍｉＲ－８１１０は、それぞれ順に配列番号１～４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（表１参照）である。
［実施例２］ｍｉＲ－７０９の血管新生能評価
マウス下肢虚血モデルに対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ（化学修飾を施した二本鎖ＲＮＡ）を内包させたエクソソーム投与後の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の発現変化について、以下の方法により調べた。なお、ｂＦＧＦは血管新生を促す因子である。
・マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソームの作製
ｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃおよびコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅは、味の素バイオファーマサービス・ジーンデザイン社により合成した。２９３Ｔ細胞は、Ｌ－グルタミンを添加したＨＥ１００（＃ＨＥ１００－００１０、Ｇｍｅｐ社）で培養した。１０ｃｍ ｄｉｓｈに、２９３Ｔを２×１０６ ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬで播種し、一晩培養した。１０ｃｍ ｄｉｓｈ １枚に対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃの導入は、マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ ６００ｐｍｏｌを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎTM ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（＃１３７７８０７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社） ２５μＬを用いて実施し、約２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを導入して２４時間後に１０ｃｍ ｄｉｓｈから培養液を除去し、新しい培地１０ｍＬを加えた後に３日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。同一のマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ内包エクソソームを含む培養液は、１０ｃｍ ｄｉｓｈ ２枚で作製した。培養液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（＃ＵＦＣ９０１０２４、メルク社）を用いて濃縮した。マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ内包エクソソームの濃縮は、ｑＥＶ２ ７０カラム（７０ｎｍ：メイワフォーシ社）を通すことで行い、４℃で保存した。濃縮されたエクソソームの濃度は、ＣＤ９／ＣＤ６３ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（＃ＥＸＨ０１０２ＥＬ、コスモ・バイオ社）で測定した。
マウスとしてＢＡＬＢ／Ｃマウス（オス、１４ヵ月齢）を用い、前記マウスの左大腿部動脈を１か所結紮後、切開部を２針縫合して下肢虚血モデルを作製した。マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ内包エクソソームは１００ｐｇ／２００μＬで調整した。下肢虚血モデル作製４日後に縫合糸を切断し、左大腿部の２箇所に１００μＬずつエクソソームを投与し（エクソソーム１００ｐｇ分）、再度、切開部は２針で縫合した。エクソソームを投与して２日後に、左大腿部を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃ＡＭ７０２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に浸漬させて４℃に一晩保存した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（＃７４１０４、キアゲン社）を使用して、採取した組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（＃ＲＲ０３６Ａ、タカラバイオ社）を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４４７２９１８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。ｂＦＧＦの発現を解析するためのｑＰＣＲに用いたプライマーを表７に示す。ｂＦＧＦの発現はＡＣＴＢの発現を基準として、その相対値として求めた。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、ｍｉＲ－７０９を内包するエクソソームを下肢虚血モデルに投与するによって、下肢虚血モデルにおいてｂＦＧＦの発現が増加することが確認された。したがって、ｍｉＲ－７０９は重症下肢虚血の治療に効果があることが示された。また、実施例１の３次スクリーニングにおけるｍｉＲ－７０９の血流改善の機序において、血管新生誘導能があるｂＦＧＦの発現が上昇することが関与すると考えられる。
［実施例３］ヒト大動脈内皮細胞ＨＡｏＥｃにおけるｍｉＲ－７０９の発現
ヒト大動脈由来の内皮細胞であるＨＡｏＥｃに対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃ内包エクソソーム添加後の遺伝子発現を解析した。
実施例２と同様の方法で、ｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃ及びコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソームを作製した。得られたエクソソーム内のｍｉＲ－７０９の発現をｑＰＣＲによって解析した。結果を図３Ａに示す。次に、ヒト大動脈内皮細胞ＨＡｏＥｃ（＃ Ｄ１００３９、タカラバイオ社）を６－ウェル プレートの１ウェルに６×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬで播種し、一晩培養した。上記で作製したｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃ及びＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソームをＰＢＳで１,０００ｐｇ／１,０００μＬに調整し、ウェルにエクソソーム１,０００ｐｇと培地を添加した。添加から８時間後、２４時間後、４８時間後のＨＡｏＥｃにおけるｍｉＲ－７０９の発現をＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｑＰＣＲで解析した。ｍｉＲ－７０９の発現は、ｍｉＲ－１８６－５ｐを基準とした相対値で解析した。結果を図３Ｂに示す。また、エクソソームを添加して８時間後、２４時間後のＨＡｏＥｃにおけるＢｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｋｉｎａｓｅ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｘ（ＢＭＸ）およびｂＦＧＦの発現変化をｑＰＣＲで解析した。発現は、ＡＣＴＢを基準とした相対値で解析した（ΔＣｔ法）。結果を図４示す。ｑＰＣＲに用いたプライマーを表８に示す。
図３Ａにより、作製したｍｉＲ－７０９ ｍｉｍｉｃ内包エクソソームにおいてｍｉＲ－７０９の発現が確認された。また、図３Ｂから明らかなように、ＨＡｏＥｃにｍｉＲ－７０９を内包したエクソソームを添加することによってｍｉＲ－７０９がＨＡｏＥｃの細胞内に取り込まれることすることを確認した。
ＣＤ１５７陽性の内皮細胞は、内皮幹細胞を多く含んでいると報告されており、内皮幹細胞の細胞表面抗原分子として、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が報告されている。また、ＣＤ１５７およびＣＤ２００を発現している内皮幹細胞では、非受容体型チロシンキナーゼの一つであり、動脈のマーカーとして知られているＢＭＸの発現が高いと報告されている（Cell Stem Cell. 2018 Mar 1;22(3):384-397）。図４から明らかなように、ＨＡｏＥｃにｍｉＲ－７０９を内包したエクソソームを添加することによってＢＭＸ及びｂＦＧＦの遺伝子発現が上昇することが確認された。このように、ｍｉＲ－７０９内包エクソソームがヒト大動脈由来内皮細胞に取り込まれ、動脈マーカーであるＢＭＸの発現が上昇していることから、ｍｉＲ－７０９がヒト大動脈由来内皮細胞を活性化させることができると考えられた。また、ｂＦＧＦの発現も上昇していることから、ｍｉＲ－７０９は大動脈由来内皮細胞を活性化させて血管新生を促す作用があると考えられた。
［実施例４］血管新生能を有するマイクロＲＮＡの同定（２）
血管新生能を有するマイクロＲＮＡとして、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐを次の方法により同定した。
（スクリーニング前の検討）
・歯髄幹細胞を低酸素培養した場合の細胞増殖能、エクソソーム分泌量、エクソソームに内包されているＶＥＧＦ量
移植前の細胞を低酸素培養することで、細胞の機能が増強されることを、本発明者らは報告している（Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 Feb;294(2):H590-5. doi: 10.1152/ajpheart.00856.2007.、Biochem Biophys Res Commun. 2014 Feb 14;444(3):370-5. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.01.054.、Am J Transl Res. 2014 Oct 11;6(5):570-9.、特許第６５４４６５６号、特許第６５８３８３０号）。そこで、歯髄幹細胞を低酸素培養（３３℃、５％ＣＯ２、２％Ｏ２）および通常培養（３７℃、５％ＣＯ２、大気圧酸素濃度）の条件で７日間培養したときの細胞増殖能、エクソソーム分泌量、エクソソームに内包されているＶＥＧＦ量を比較した。
細胞増殖能：
歯髄幹細胞（Ｄｅｎｔａｌ Ｐｕｌｐ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、＃ＰＴ－５０２５、ＬＯＮＺＡ社）を１，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬに調整し、８枚の９６－ウェル プレートの３ウェルずつに１００μＬずつ播種し、その周囲のウェルにはＰＢＳ ３００μＬを入れ、９６－ウェル プレートを低酸素培養（３３℃、５％ＣＯ２、２％Ｏ２）または通常培養（３７℃、５％ＣＯ２、大気圧酸素濃度）の培養器に入れたて培養した。培地としてはＫＢＭ ＡＤＳＣ－４（＃１６０３００４４、コージンバイオ社）を用いた。そして、播種から１日後、３日後、５日後、７日後の細胞増殖（細胞活性）をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（＃Ｇ３５８０、プロメガ社）で反応後、４９０ｎｍの吸光度をＡＲＶＯ Ｘ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。
歯髄幹細胞を７日間培養したときの培養液へのエクソソーム分泌量：
歯髄幹細胞を７日間培養後の培養液中のエクソソームの濃度は、ＣＤ９／ＣＤ６３ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（＃ＥＸＨ０１０２ＥＬ、コスモ・バイオ社）で測定した。
歯髄幹細胞を７日間培養したときのエクソソームに内包されているＶＥＧＦ量：
歯髄幹細胞を７日間培養後の培養液中のエクソソームは、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（＃４４７８３５９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と混合し、遠心でペレットにされ、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃４４７８５４５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の試薬であるＥｘｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬを加えて攪拌した後に、－８０℃で保存した。ＶＥＧＦ濃度は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＶＥＧＦ（＃ ＤＶＥ００）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔで測定した。
結果を図５に示す。図５中、左から順に細胞増殖能、エクソソーム分泌量、エクソソームに内包されているＶＥＧＦ量である。
図５の結果から、低酸素培養では通常培養の場合と比較して細胞数は少なく、かつエクソソーム量も少ないにもかかわらず、エクソソームに内包されているＶＥＧＦ量が多いことが明らかとなった。血管新生に重要な働きをするＶＥＧＦ量が、低酸素培養によりエクソソーム内で上昇したことから、低酸素培養により歯髄幹細胞が分泌するエクソソームには、血管新生能を有するマイクロＲＮＡの内包量が上昇するのではないかと考えられた。そこで、歯髄幹細胞を低酸素培養して以下に記載の方法で血管新生能を有するマイクロＲＮＡのスクリーニングを行った。
（１次スクリーニング）
ＫＢＭ ＡＤＳＣ－４を用いて、１０ｃｍ ｄｉｓｈ １枚に歯髄幹細胞（Ｄｅｎｔａｌ Ｐｕｌｐ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、＃ＰＴ－５０２５、ＬＯＮＺＡ社）を２×１０５ｃｅｌｌ ／１０ｍＬとなるように播種した。播種した歯髄幹細胞は、低酸素培養（３３℃、５％ＣＯ２、２％Ｏ２）および通常培養（３７℃、５％ＣＯ２、大気圧酸素濃度）、それぞれの培養条件下で、１０ｃｍ ｄｉｓｈを１０枚ずつで７日間培養した。７日間培養後、培養液を５０ｍＬチューブに移し、遠心（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）し、上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（＃ＵＦＣ９０１０２４、メルク社）を用いて濃縮した。約９ｍＬの濃縮液が得られた。その濃縮液は、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（＃４４７８３５９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と混合し、遠心によりペレットにした。ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（＃ ２１７０８４、キアゲン社）を用いて、上記ペレットからエクソソームに内包されているマイクロＲＮＡを１５０μＬのＨ２Ｏで抽出した。そのうち１２０μＬをアレイ解析に使用して、低酸素培養された歯髄幹細胞が分泌するエクソソームが内包するマイクロＲＮＡの変化を調べた。結果を表９に示す。表９中、Ｈｙｐｏは低酸素培養下、Ｎｏｒｍａｌは通常培養下、Ｈｙｐｏ／Ｎｏｒｍｏのｒａｔｉｏは通常培養下に対する低酸素培養下のマイクロＲＮＡの発現量の比を意味する。なお、抽出したマイクロＲＮＡの発現解析は、ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ（東レ社に委託）で行った。また、Ｎｏ．１～５は低酸素培養で新たに発現したマイクロＲＮＡ、Ｎｏ．６～１３は低酸素培養下で発現量が通常培養下と比較して２．５倍以上になったマイクロＲＮＡである。
表９に示すように、いずれも低酸素条件下で培養した場合に、マイクロＲＮＡの発現が増加していることが確認された。なお、以後の実験においてＮｏ．８を除くＮｏ．１～７、９～１３を用いた。
・ベクター作製
１次スクリーニングで同定した１２種類（Ｎｏ．８以外）のマイクロＲＮＡを発現するベクターを以下の方法で作製した。まず、２９３Ｔ細胞由来のゲノムＤＮＡを表１０のプライマーとＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（＃ＲＲ００１Ａ、タカラバイオ社）を使用して増幅させ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（＃６０２３、タカラバイオ社）を使用してＴ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（＃３２７０、タカラバイオ社）に結合させた。そして、Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０に挿入されたゲノムＤＮＡ配列を、表１１に記載されている制限酵素で切り出して、ｐｍＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ（＃Ｚ２５４２Ｎ、タカラバイオ社）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を使用して挿入して１２種類のベクターを作製した。
（２次スクリーニング）
・マイクロＲＮＡ内包エクソソームの作製
１次スクリーニングで同定したｈａｓ－ｍｉＲ－１９７３（表９ Ｎｏ８）を除くマイクロＲＮＡを発現する、上記で作製した１２種類のベクターとコントール（ベクターのみ）を導入する為に、２９３Ｔ細胞をＬ－グルタミン添加ＨＥ１００で、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、６－ウェル プレートの１ウェルに２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。６－ウェル プレートの１ウェルに導入するベクター２μｇを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭTM Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。ウェルから培養液を除去し、１ウェルにＬ－グルタミン添加ＨＥ１００を２ｍＬずつ入れて、３日間培養した。
３日間培養した培養液を２ｍＬチューブに移し、遠心（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）し、培養上清を新しい２ｍＬチューブに移した。ｑＥＶ ｏｒｉｇｉｎａｌ ７０カラム（メイワフォーシス社）を使用して、培養上清中のエクソソームを単離し、４℃に保存した。単離されたエクソソームの濃度は、ＣＤ９／ＣＤ６３ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（＃ＥＸＨ０１０２ＥＬ、コスモ・バイオ社）で測定した。
・ｍｉＲＮＡ内包エクソソーム添加によるＨＡｏＥｃの細胞増殖アッセイ
ＨＡｏＥｃを、内皮細胞増殖培地ＭＶ２：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＭＶ ２（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）（＃ Ｄ１２０２０、タカラバイオ社）で培養した。ＨＡｏＥｃを内皮細胞増殖培地ＭＶ２で、１，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬに調整し、９６－ウェル プレートの１ウェルに１００μＬずつ播種した。上記単離したエクソソームをＰＢＳで７５０ｐｇ／ｍＬに調整し、１ウェルに１００μＬずつ添加した。同一のエクソソームは、３ウェルで実験を行った。細胞を播種した周囲のウェルにはＰＢＳを３００μＬずつ入れた。ＨＡｏＥｃは、７日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）後、細胞増殖（細胞活性）はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（＃Ｇ３５８０、プロメガ社）で反応後、４９０ｎｍの吸光度をＡＲＶＯ Ｘ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。結果を図６に示す。
図６より、Ｎｏ６のｍｉＲ－４４８５－３ｐ、Ｎｏ７のｍｉＲ－７６５、Ｎｏ１０のｍｉＲ－４２８４及びＮｏ１１のｍｉＲ－３６７８－３ｐを内包するエクソソームの添加によって、ＨＡｏＥｃの増殖を促すことが明らかとなった。
（３次スクリーニング）
マウス下肢虚血モデルに対する血管新生マイクロＲＮＡ内包エクソソームの筋肉注射投与後の血流評価を行った。
・マイクロＲＮＡ内包エクソソームの作製
６－ウェル プレートに２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と５％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培地で１ウェルに２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。６－ウェル プレートの１ウェルに、ｍｉＲ－４４８５－３ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－４２８４及びｍｉＲ－３６７８－３ｐの４種類のマイクロＲＮＡを発現するベクター、及びコントール（ベクターのみ）２μｇを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌとＯｐｔｉ－ＭＥＭTM Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。ウェルから培養液を除去し、１ウェルにＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と５％ Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培地２ｍＬを入れて、５日間培養した。培養液を２ｍＬチューブに移し、遠心（３，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）し、新しい２本の１．５ｍＬそれぞれに、遠心後の上清１ｍＬと、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）（＃４４７８３５９、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）０．５ｍＬを入れ、Ｖｏｒｔｅｘで攪拌後、４℃で一晩培養した。一晩４℃に置いた１．５ｍＬチューブを遠心（１２，０００ｇ、６０ｍｉｎ、４℃）し、上清を１,０００μＬマイクロピペットで除去し、再度、遠心後（１２，０００ｇ、１ｍｉｎ、４℃）し、上清を２００μＬマイクロピペットで除去した。ＰＢＳ ４００μＬで２本の１．５ｍＬチューブのペレットを再懸濁して１本のサンプルとしてマイクロＲＮＡ内包エクソソーム溶液とし、４℃に保存した。
マウスとしてＢＡＬＢ／Ｃマウス（オス、８週齢）を用い、左大腿部の動脈と静脈を１か所結紮後、切開部は２針で縫合してマウス下肢虚血モデルを作製した。マウス下肢虚血モデル作製の翌日に縫合糸を切断し、左大腿部の２箇所に５０μＬずつエクソソーム溶液を投与し（６－ウェル プレートの１ウェル２ｍＬで作製した培養液のうち０．５ｍＬ分のエクソソームを投与）、再度、切開部を２針縫合した。経時的に、血流をドップラー（ｌａｓｅｒ ｓｐｅｃｋｌｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＯＭＥＧＡ ＺＯＮＥ， Ｏｍｅｇａ Ｗａｖｅ社））で測定した。１群は６匹で実験を行った。結果を図７に示す（Ordinary one-way ANOVA解析）。
図７より、コントロールに対してｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６７８－３ｐ、ｍｉＲ－４４８５－３ｐ及びｍｉＲ－４２８４の血流はそれぞれ順に２．９３倍、１．９４倍、１．２３倍、１．１９倍であった。したがって、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐはマウス下肢虚血モデルにおいて血流改善効果を示すことが確認された。なお、実施例４で発現させたｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６７８－３ｐは、それぞれ順に配列番号５９、６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（表１参照）である。
［実施例５］マウス下肢虚血モデルに対するマイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソーム投与後の遺伝子発現変化
（マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃを内包させたエクソソームの作製）
ｍｉＲ－７６５ ｍｉｍｉｃおよびコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソームは、実施例４と同じ方法で作製した。
マウスとしてＢＡＬＢ／Ｃマウス（オス、８週齢）を用い、前記マウスの左大腿部動脈を１か所結紮後、切開部を２針縫合して下肢虚血モデルを作製した。ｍｉＲ－７６５ ｍｉｍｉｃおよびコントロールであるＳｃｒａｍｂｌｅを内包させたエクソソームは１００ｐｇ／１００μＬで調整した。下肢虚血モデル作製４日後に縫合糸を切断し、左大腿部の２箇所に５０μＬずつエクソソームを投与し（エクソソーム１００ｐｇ分）、再度、切開部は２針で縫合した。エクソソームを投与して２日後に、左大腿部を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒTM Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃ＡＭ７０２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に浸漬させて４℃保存した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（＃７４１０４、キアゲン社）を使用して、採取した組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（＃ＲＲ０３６Ａ、タカラバイオ社）を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲTM Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４４７２９１８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。血管新生因子であるｂＦＧＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ及びデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）の発現を解析するためのｑＰＣＲに用いたプライマーを表１２に示す。それぞれの発現はＡＣＴＢの発現を基準として、その相対値として求めた。結果を図８に示す。
図８より、ｍｉＲ－７６５により、血管新生因子であるｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ及びＨＤＤのいずれも発現が増加していることが確認された。これらの結果から、ｍｉＲ－７６５による下肢虚血モデルにおける血流改善には、血管新生因子の発現増加が関与することが示された。

Claims (5)

  1. （ａ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体；又は
    （ｂ）ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；
    を有効成分とする、脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
  2. 前記脈管障害が、重症下肢虚血、脳血管障害、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、糖尿病性脈管障害、又はリンパ管障害である、請求項１に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
  3. （ａ）に記載のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体、又は（ｂ）に記載の発現ベクターが核酸送達媒体の中に包含されていることを特徴とする、請求項１に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
  4. 核酸送達媒体が、脂質二重膜からなる膜小胞であることを特徴とする、請求項３に記載の脈管障害の予防又は治療用医薬組成物。
  5. ｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を含有する、生体から分離された脂質二重膜からなる膜小胞の作製方法であって、
    哺乳動物細胞にｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入して、前記発現ベクターを含有する哺乳動物細胞を作製する工程Ａ；及び
    前記工程Ａで作製した哺乳動物細胞を培養してｍｉＲ－７０９、ｍｉＲ－１２４７－３ｐ、ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｍｉＲ－８１１０、ｍｉＲ－７６５及びｍｉＲ－３６７８－３ｐから選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ、若しくはそれらの前駆体を発現させる工程Ｂ；
    を含む、前記方法。

JP2022098156A 2022-06-17 2022-06-17 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物 Pending JP2023184168A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022098156A JP2023184168A (ja) 2022-06-17 2022-06-17 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022098156A JP2023184168A (ja) 2022-06-17 2022-06-17 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023184168A true JP2023184168A (ja) 2023-12-28

Family

ID=89333596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022098156A Pending JP2023184168A (ja) 2022-06-17 2022-06-17 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2023184168A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7275193B2 (ja) 筋ジストロフィーの処置における心筋球由来細胞およびこのような細胞によって分泌されたエキソソーム
JP6675851B2 (ja) 疾患の処置のためのトリシクロ−ｄｎａアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物及び方法
JP6621409B2 (ja) Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物
US20230330130A1 (en) Vesicles comprising a pten inhibitor and uses of same
US7420050B2 (en) TGF-β-specific covalently closed antisense molecule
JP7336769B2 (ja) 骨格筋ジストロフィーを治療する方法及び組成物
CN112135907A (zh) 具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途
JPH09507381A (ja) 血管平滑筋細胞の増殖の阻害
KR20180005546A (ko) 약물이 탑재된 엑소좀 또는 나노베지클을 이용한 약학적 조성물
JP6833456B2 (ja) 皮膚線維症処置剤
US20140348889A1 (en) Compositions and Methods for Treating and Preventing Neointimal Stenosis
CN108251420B (zh) 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用
AU2013325384A1 (en) Amphiregulin-specific double-helical oligo-RNA, double-helical oligo-RNA structure comprising double-helical oligo-RNA, and composition for preventing or treating respiratory diseases containing same
JP2007523839A (ja) 血管新生性障害の治療法
US20040220131A1 (en) Method for treatment of cancerous angiogenic disorders
JP2023184168A (ja) 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物
JP7193849B2 (ja) 虚血組織に集積するエクソソームおよびその製造方法
JP7360170B2 (ja) 虚血病変部位特異的な遺伝子治療法
WO2017078526A2 (en) Antisense oligonucleotide-mediated exon skipping as systemic therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa (rdeb).
WO2006126600A1 (ja) 血管閉塞性疾患用医薬組成物
KR20150095705A (ko) 조직 재생 촉진제
US20180126048A1 (en) Nanoparticle-medicated genetic delivery of growth inhibiting genes on balloon angioplasty to suppress intimal hyperplasia
RU2800729C2 (ru) Везикулы, содержащие ингибитор pten, и их применение
CN108251421A (zh) 抑制人和动物中COL1A1基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用
WO2024165603A1 (en) Pharmaceutical composition for use in treatment of venous thromboembolism