KR20150095705A - 조직 재생 촉진제 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 신규한 조직 재생 촉진제 및 조직 재생 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 하기와 연관된다: 활성화 성세포, 활성화 성세포의 분해물, MMP14, MMP14와 함께 처리된 콜라겐, 및 활성화 성세포의 분비물로 구성된 군으로부터 선택된 구성요소를 포함하는 조직 재생 촉진, 세포 분화 촉진 및/또는 세포 증식 촉진을 위한 조성물; MMP14를 억제하는 물질을 포함하는 세포 증식을 억제하기 위한 조성물; 및 MMP14와 함께 처리된 콜라겐을 포함하는 세포 배양 기질(substrate).

Description

조직 재생 촉진제{TISSUE REGENERATION ACCELERATOR}

본 발명은 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 조직 재생 촉진, 세포 분화 촉진 및/또는 세포 증식 촉진을 위한 조성물, MMP14 억제 물질을 포함하는 세포 증식 억제를 위한 조성물, MMP14로 처리한 콜라겐을 포함한 세포 배양기 재료 등에 관한 것이다.

생체 조직은 손상을 받게 되면 손상 부분을 보완하도록 재생하고 그 기능을 회복하려고한다. 예를 들면, 간은 그 절반 이상을 절제하고도 단기간에 재생하여 거의 원래의 크기 및 기능을 회복하는 것으로 알려져 있다. 조직 재생에 관한 연구는 간을 중심으로 오래전부터 행해지고 있어 다양한 연구 결과가 보고되고 있지만, 조직 재생에 대한 자세한 기전은 여전히 모르는 부분이 많다. 조직의 재생에는 여러 종류의 세포가 복잡하게 관계성을 맺고 있다고 생각하지만, 이러한 세포 중에서 중요한 역할을 담당하고 있는지에 대해서는 결정적인 견해는 얻어지지 않고 있다.

조직 재생 기전을 알아내기 위해 조직 염색이나 세포 염색 등에 의한 손상 조직의 시간적 변화 및 각종 생리 활성 물질의 조직 재생에 미치는 영향 등을 분석하여 진행되고 있다. 예를 들면, 비 특허 문헌 1에는 마우스 간 부분적인 절제 모델에서 특정 페놀 타입의 간유동 내피 세포가 VEGFR2(vascular endothelial growth factor-A receptor-2)를 통해 내피 세포 특이적 전사 인자로 있는 LDL의 상향 조정에 의해 간세포의 증식이 초래되어, 내피 세포 자체가 증식하여 간 재생이 이루어진다는 가설이 제시되고 있다.

그러나 활발한 연구 활동에도 불구하고 조직 재생에 관한 메커니즘은 아직 극히 일부가 공개되어있는 것에 지나지 않고, 연구에 대한 더 많은 노력이 요구되고 있다.

Ding 외., Nature. 2010 Nov 11;468(7321):310-5.

본 발명은 신규한 조직 재생 촉진제 및 조직 재생 방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 실시예의 연구를 진행시키는 가운데, 활성화 성세포가 조직의 재생에 중요한 역할을 하고 있는것, 활성화 성세포의 분비물이 조직 재생의 핵심 줄기 세포의 증식 및 분화를 유도하고, 활성화 성세포가 발현하는 MMP14의 작용을 받은 콜라겐이 조직 실질 세포의 증식을 유도하는 것, 또한 상기 증식 유도에 콜라겐에 존재하는 RGD 서열이 관여하는 것을 각각 제목으로, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다.

(1) 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 조직 재생 촉진용 조성물.

(2) 조직 재생이 장애 조직 또는 이식 조직에서 발생 (1)에 기재된 조성물.

(3) 장애 또는 이식을 받은 날로부터 4일 이내에 투여되는, (2)에 기재된 조성물.

(4) 장애 또는 이식을 받은 날부터 1일 이내에 투여되는, (2)에 기재된 조성물.

(5) 장애가 조직 파괴, 염증, 괴사, 섬유화 수술적 침습 장기 부전으로 이루어진 군에서 선택되는, (2) 내지 (4) 중 하나의 조성물.

(6) 조직 재생 조직 줄기 세포의 분화 및 / 또는 증식을 동반하는 (1) ~ (5)의 어느 하나에 기재된 조성물.

(7) 조직 재생 조직 실질 세포의 증식을 수반하는 (1) ~ (6)의 어느 하나에 기재된 조성물.

(8) 활성화 성세포가 HGF, EGF, MMP14로 이루어진 군에서 선택되는, 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 (1) 내지 (7)의 어느 하나에 기재된 조성물.

(9) 조직 재생이 억제된 상태를 갖는 개체에 대해서 사용하는 (1) 내지 (8) 중 하나의 조성물.

(10) 조직 재생이 억제된 상태가 염증, 괴사, 섬유화, 장기 부전, 혈소판 감소, 유전자 이상, 노르 아드레날린의 감소로 이루어진 군에서 선택되는 (9)에 기재된 조성물.

(11) (1) 내지 (10) 중 하나에 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 조직 재생을 촉진하는 방법.

(12) 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함하는 줄기 세포의 분화 및/또는 증식을 위한 조성물.

(13) 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분과 줄기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 조직 줄기 세포를 분화 및/또는 증식시키는 방법.

(14) 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 세포 증식 촉진용 조성물.

(15) 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리 한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물.

(16) MMP14을 저해하는 물질을 포함하는 세포 증식 억제용 조성물.

(17) MMP14을 저해하는 물질이 작용하는 세포가 CAF 및/또는 종양 세포인 (16)에 기재된 조성물.

(18) MMP14로 처리한 콜라겐을 포함한 세포 배양기 재료.

(19) MMP14로 처리한 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 용기.

본 발명에 의해 생체 내에서의 조직 재생뿐만 아니라 생체 외에서 조직 형성도 촉진시킬 수 있기 때문에, 생물학적, 의학적으로 상당한 기여가 기대된다.

또한, 본 발명에 따른 조직 재생의 촉진은 조직 재생이 억제되어있는 상황, 예를 들어, 섬유증 등의 질환을 수반하는 상황 등에서 특히 유용하다.

도 1은 간의 부분적인 절제 쥐에 대한 처리의 흐름을 나타낸 도이다.
도 2는 간의 부분적인 절제 후 5일 및 10일째에 채취한 각 군의 간 모양, 간의 부분적인 절제술 전 및 수술 직후의 간장과의 비교를 나타낸 도이다.
도 3은 채취한 각 군의 간 무게의 추이를 나타낸 도이다.
도 4는 간의 부분적인 절제 후 5일째에 채취한 간 조직을 FITC-TUNEL, α-SMA 및 DAPI에서 공유 염색 한 형광 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 5는 간의 부분적인 절제 후 5일째에 채취한 간 조직을 FITC-TUNEL, α-SMA 및 DAPI에서 공유 염색 한 형광 현미경 이미지에서, α-SMA 양성 TUNEL 양성 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 6은 간의 부분적인 절제 후 5일째에 채취한 간 조직을 Ki67 및 DAPI에서 공유 염색 한 형광 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 7은 간의 부분적인 절제 후 5일째에 채취한 간 조직을 Ki67 및 DAPI에서 공유 염색 한 형광 현미경 이미지에서 Ki67 양성 세포 수를 나타낸 도이다.
도 8은 간의 부분적인 절제 후 5일째에 채취한 간 조직을 CD133 및 DAPI에서 공유 염색 한 형광 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 9는 실험예 3의 각 군에 실시한 조치의 개요를 나타낸 도이다.
도 10은 채취한 각 군의 간 모습을 간의 부분적인 절제 직후(0 일) 간과 비교하여 나타낸 도이다.
도 11은 채취 한 각 군의 간 무게, 간의 부분적인 절제 직후(0 일) 간과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 간의 부분적인 절제 후 간 조직의 α-SMA 양성 세포의 경시 변화를 나타낸 도이다.
도 13은 간의 부분적인 절제 후 간 조직의 α-SMA 양성 세포 수의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 정지형태의 간 성세포(stellate cell)(위) 및 활성 형태의 간 성세포(아래)의 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 15는 줄기 세포와 성세포가 접촉하기 위한 공동 배양에 있어서, GFP/알부민 모두에 양성인 콜로니(colony)의 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 16은 줄기 세포와 성세포가 접촉하기 위한 공동 배양에 있어서, EGF와 HGF를 첨가하였을 때, GFP/알부민 모두에 양성인 콜로니의 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 17은 줄기 세포와 성세포의 접촉 공동배양에 있어서, GFP/알부민 모두에 양성인 콜로니 수를 나타낸 그래프이다.
도 18은 줄기 세포와 성세포의 접촉 공동배양에 있어서, GFP/알부민 모두에 양성인 콜로니의 면적을 나타낸 그래프이다.
도 19는 줄기 세포와 성세포의 비접촉 공동배양에 있어서, GFP/알부민 모두에 양성인 콜로니의 면적을 나타낸 그래프이다.
도 20은 줄기 세포와 성세포의 비접촉 공동배양에 있어서, GFP/알부민 모두에 양성인 세포의 증식을 흡광도로 나타낸 그래프이다.
도 21은 간의 부분적인 절제 후 간 조직에서 DNA 합성의 시간에 따른 변화를 나타낸 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 22는 간의 부분적인 절제 후 간 조직에서 BrdU 양성 세포의 비율의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 23은 간의 부분적인 절제 후 간 조직에서 DNA 합성의 시간에 따른 변화를 나타낸 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 24는 간의 부분적인 절제 후 간 조직에서 BrdU 양성 세포 비율의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 25는 간세포와 성세포를 공동배양했을 때의 BrdU 양성 간세포를 나타낸 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 26은 간세포와 성세포를 공동배양했을 때의 BrdU 양성 간세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 27은 다양한 처리를 한 콜라겐에서 간세포를 배양했을 때의 BrdU 양성 세포를 나타낸 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 28은 다양한 처리를 한 콜라겐에서 간세포를 배양했을 때의 BrdU 양성 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 29는 간세포와 MMP14 및/또는 HGF의 발현을 감소시킨(knock-down) 성세포를 공동 배양했을 때의 BrdU 양성 간세포를 나타낸 현미경의 이미지를 나타낸 도이다.
도 30은 간세포와 MMP14 및/또는 HGF의 발현을 감소시킨 성세포를 공동 배양했을 때의 BrdU 양성 간세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 31은 MMP14 처리 콜라겐에서 간세포를 RGD 펩타이드(peptide)의 존재 하에서 배양했을 때의 BrdU 양성 세포를 나타낸 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 32는 MMP14 처리 콜라겐에서 간세포를 RGD 펩타이드의 존재 하에서 배양했을 때의 BrdU 양성 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 하나의 양태는 활성화 성세포(stellate cell), 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물에 관한 것이다.

활성화 성세포는 생체에서 분리한 성세포를 계대 배양하여 얻을 수 있다. 성세포는 간, 췌장, 신장, 대장, 폐 등의 여러 조직에 존재하는 것으로 알려져 있으며(Zhao 및 Burt, J Mol Histol., 2007, Mar; 38(1):53-64), 상기 중에 하나를 사용할 수 있다. 성세포의 분리는 알려진 임의의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 간성세포의 분리방법의 구체적인 예는 하기 실험예 5.(1)에 개시되어 있다. 활성화 성세포는 αSMA의 발현을 특징으로 하고 있으며, 이를 마커로 선별할 수 있다.

활성화 성세포는 HGF, EGF, MMP14로 이루어진 군에서 선택되는 단백질의 발현을 증가시키는 처리가 가해진 것이 바람직하다. HGF, EGF 및 MMP14의 유전자는 알려진 것이며, 또한 유전자 도입법도 당업계 분야에서 잘 알려져 있다.

활성화 성세포 분해물은 활성화 성세포를 물리적 및/또는 화학적 방법을 포함한 다양한 방법으로 분해하여 얻을 수 있다. 분해는 세포를 분해하기 위해 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 삼투압 충격법, 동결 융해법, 계면 활성제 사용, 효소 소화법, 초음파 처리, 프렌치 프레스(french press), 박격포에 의한 분쇄, 균질기에 의한 파쇄, 유리 구슬에 의한 파쇄 등을 사용할 수 있다. 분해 기술은 단백질을 변성시키지 않거나 약하게 변성하는 것이 바람직하다. 관련된 기술을 이용함으로써 세포막에 발현하는 MMP14을 그 기능을 손상시키지 않고 얻을 수 있다. 또한 활성화 성세포 분해물은 세포막 성분을 포함하는 것이 바람직하다.

MMP14(MT1-MMP라고도 함)는 세포막에 발현하는 MMP이다. MMP14는 콜라겐 I에 작용할 수 있다. 본 발명에 의해, MMP14의 콜라겐 I에 대한 작용이 세포의 증식에 깊이 관여하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 MMP14는 세포막에 발현하고 있는 것뿐만 아니라 세포막에서 유리 된 것도 포함된다. MMP14는 자연계에 존재하는 것 및 인공적으로 제작한 것도 있다. 따라서 MMP14는 재조합 MMP14를 포함한다. 유리형(free-form)의 MMP14는 알려진 것이며(예, Jo at el., Biochem J. 2000. Feb 1; 345 Pt3: 511-9 등), 시판도 되고 있다(예를 들면, R&D systems, Cat No.918-MP-010, 918-MPN-010 등). MMP14 아미노산 및 이를 암호화하는 염기 서열은 알려져 있다(예들 들어, 인간 MMP14의 염기 서열은 GenBank에 세션번호 NM_004995, 아미노산 서열은 GenBank에 세션번호 NP_004986으로 등록되어 있다).

본 발명의 MMP14는 그 기능적 변이체를 포함한다. MMP14의 기능적 변이체는 한정되지 않고, 예를 들면, (i) 해당 단백질의 아미노산 서열에 1개 또는 2개 이상, 일반적으로 1개 또는 수 개의 변이가 있거나, 또한 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 변이체, (ii) 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산 또는 상기 핵산과 동일한 폴리펩타이드(polypeptide)를 암호화하는 핵산의 염기 서열에 1개 또는 2개 이상, 일반적으로 1개 또는 수 개의 변이 핵산에 의해 암호화되고, 또한 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 변이체, (iii) 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산, 상기 핵산과 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 (ii)의 변이체를 암호화하는 핵산의 상보적인 가닥(complemental strand), 또는 엄격한 조건(stringent condition)에서 상기 절편이 이형 핵산에 의해 암호화되어 있고, 해당 단백질과 동등한 기능을 갖는 변이체, (iv) 해당 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 변이체, (v) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화되어 있고, 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 변이체 등을 들 수 있다.

당업자는 MMP14의 배열 정보를 기초로 상기 기능적 변이체를 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 화학합성, 제한효소에 의한 핵산의 절단 또는 삽입 부위 특이적 변이 도입, 방사선 또는 자외선 조사 등에 따라 적절하게 제작할 수 있다.

변이체가 MMP14와 동일한 기능을 갖는 여부는 상기 변이체를 MMP14의 알려진 기능에 제한되지 않고, 예를 들면, 콜라겐 분해 등에 대해 알려진 방식으로 분석하고 적절한 대조군과 양성 대조군으로의 MMP14와 비교하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 변이체에 있어서, 상기 기능이 대조군보다 더 있다면 예를 들어, 10% 이상, 25% 이상, 75% 이상, 심지어 100% 이상 뛰어난 경우 및/또는 상기 기능이 CSABP의 1/100 이상, 1/50 이상, 1/25 이상, 1/10 이상, 1/5 이상, 심지어 1/2 이상인 경우, 상기 변이체를 MMP14의 기능적 변이체에 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "엄격한 조건"이라는 용어는 당업계에서 잘 알려진 매개 변수이며 표준 프로토콜집, 예를 들어 Sambrook 등., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press(2001)과 Ausubel 등., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992) 등에 기재되어 있다.

본 발명의 엄격한 조건, 예를 들어 65℃에서 3.5×SSC(0.15M 염화 나트륨/0.15M 구연산 나트륨, pH7), 피콜(ficoll) 0.02%, 폴리 비닐 피롤리돈 0.02%, 소 혈청 알부민 0.02%, NaH₂PO₄ 425mM(pH7), SDS 0.05%, EDTA 2mM로 구성된 하이브리드화(hybridization) 완충용액에 의한 하이브리드화를 가리킨다. 하이브리드화 후 DNA가 옮겨진 막은 실온의 2×SSC에서 0.1 내지 0.5×SSC/0.1×SDS에서 68℃까지의 온도에서 세척한다. 또는 엄격한 조건의 하이브리드화는 ExpressHyb(R)Hybridization Solution(Clontech 사) 등의 상용화된 하이브리드화 완충용액을 이용하여 공급자가 제시한 하이브리드화 및 세척조건으로 하였다.

상기 정도의 엄격함(stringent)을 생기게 하는 사용 가능한 다른 조건, 시약 등이 존재하지만, 당업자는 해당 조항에 통한다고 생각되기 때문에 이러한 내용을 본 명세서에서 특별히 언급하고 있지 않다. 반면 단백질의 변이체를 암호화하는 핵산을 명확히 식별할 수 있도록 조건을 조작하는 것이 가능하다.

본 발명의 MMP14 및/ 또는 그 기능적 변이체는 상기 단백질 자체와 그 기능적 변이체 외에도 상기 단백질과 그 기능적 변이체를 암호화하는 핵산을 포함한다.

MMP14로 처리한 콜라겐은 콜라겐을 MMP14로 처리하여 얻을 수 있다. 콜라겐으로서는 예를 들면 콜라겐 I을 사용할 수 있다. 처리에 사용하는 MMP14는 상기 MMP14(MMP14의 기능적 변이체를 포함)외에 MMP14를 발현하는 세포 자체 또는 MMP14를 포함하는 상기 세포 분해물일 수 있다. MMP14에 의한 처리 시간은 예를 들어, MMP14가 작용할 수 있는 온도에서 1 내지 120시간, 3 내지 60시간, 6 내지 48시간, 12 내지 36시간 등이 바람직하다. MMP14로 처리한 콜라겐은 RGD 서열이 세포와 상호작용 할 수 있는 상태가 되어있는 것이 바람직하다.

활성화 성세포 분비물은 활성화 성세포의 배양 상층액 등에서 얻을 수 있다. 배양 상층액은 그대로 사용해도 되고, 투석 및 동결 건조 등으로 농축하여 사용할 수 있다. 활성화 성세포 분비물에는 여러 가지 단백질이 포함되어 있기 때문에 단백질이 변성되지 않도록 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 의해 재생이 촉진되는 조직은 특별히 한정되지 않고 전신의 여러 조직을 포함한다. 관련된 조직으로는 한정되지 않고, 예를 들어, 성세포가 존재하는 조직 섬유화와 발생한 조직, 줄기 세포가 존재하는 조직 등을 들 수 있다. 구체적으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 간, 췌장, 신장, 대장, 폐, 비장, 심장, 골수, 성대, 피부, 복막, 눈, 혈관 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 장애 조직 또는 이식 조직에서 발생하는 조직 재생에 도움이 된다. 장애 조직은 조직 파괴, 염증, 괴사, 섬유화 수술적 침습, 장기 부전 등을 받은 조직을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여시기는 특별히 한정되지 않지만, 장애 또는 이식을 받은 날로부터 4일 이내 또는 장애 또는 이식을 받은 날부터 1일 이내에 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 의한 조직 재생은 줄기 세포의 분화 및/또는 증식을 수반하는 일일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 의한 조직 재생은 조직 실질 세포의 증식을 수반하는 일일 수 있다. 줄기 세포의 분화 예를 들어, 분화 세포에 특이적인 세포 마커의 검출, 분화 세포가 나타내는 기능의 검출 등에 의해 평가될 수 있다. 세포의 증식은 다양한 알려진 방법, 예를 들어, 시간에 따른 살아있는 세포 수의 계산, 조직의 크기, 부피 또는 무게 측정, DNA 합성량의 측정, WST-1법, BrdU(브로모 디옥시 우리딘(bromo deoxyuridine)법, ³H 티미딘(thymidine) 포착법 등으로 평가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조직 재생이 억제된 상태를 갖는 개체에 대해서 이용할 수 있다. 조직 재생이 억제된 상태로는 한정되지 않고, 예를 들면, 염증, 괴사, 섬유화, 장기 부전, 혈소판 감소, 유전자 이상, 노르아드레날린(noradrenaline)의 감소 등을 포함한다.

본 발명의 조성물에서 유효 성분의 배합량은 조성물이 투여된 경우 조직 재생을 촉진하는 양인 것이 바람직하다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 소요된 양은 공지되어 있거나 배양 세포 등을 이용한 실험관 내(in vitro) 시험과 마우스, 랫드, 개, 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 조직 재생의 촉진은 조직의 기능, 무게, 크기 등의 회복을 생화학 검사, X-ray, 초음파, MRI, CT, 내시경 등을 이용한 화상 진단 등으로 평가할 수 있다. 유효 성분의 배합량은 조성물의 투여 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1 단위에 배합 유효 성분의 양은 1회 투여에 필요한 유효 성분의 양을 복수 분의 1로 할 수 있다. 소요 배합량의 조정은 당업자가 적절히 할 수 있다.

본 발명은 또한 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 배합하는 것을 포함하여 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물을 제조하는 방법, 상기 성분의 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물의 제조에 사용 및 조직 재생 촉진에 이용하는 상기 성분에 관한 것이다. 상기 제조 방법 또는 사용에 있어서 각 성분과 그 배합량은 이미 상술한 바와 같다. 각 성분의 배합은 알려진 임의의 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 조성물, 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함, 개체에서 조직 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 방법의 개체는 조직에 장애를 받고 있거나 조직 이식을 받았을 수 있다. 장애는 한정되지 않고, 예를 들어, 조직 파괴, 염증, 괴사, 섬유화 수술적 침습, 장기 부전 등을 포함한다. 조성물의 투여는 예를 들어, 장애 또는 이식을 받은 날로부터 4일 이내에 결함 또는 이식을 받은 날로부터 1일 이내라도 좋다.

본 발명은 또한 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함하는 줄기세포의 분화 및/또는 증식을 위한 조성물, 상기 성분을 배합하는 것을 포함하는 줄기세포의 분화 및/또는 성장을 위한 조성물을 제조하는 방법, 상기 성분의 줄기세포의 분화 및/또는 성장을 위한 조성물의 제조에 사용, 줄기세포의 분화 및/또는 증식에 이용하는 상기 성분, 및 상기 성분과 줄기세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 줄기세포를 분화 및/또는 증식시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 조직 줄기세포(체세포 줄기세포, 성체 줄기세포) 배아 줄기세포, iPS 세포 등을 포함한다. 줄기세포는 분화능, 만능성, 다능성 또는 단일 가능성도 있다. 조직 줄기세포로는 한정되지 않고, 예를 들면, 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 피부 줄기세포, 근육 줄기세포, 생식 줄기세포 등을 들 수 있다. 줄기 세포는 자기 유래의 것이라도 동종의 다른 개체 또는 이종 개체의 것이라도 좋다. 분화 및/또는 증식시킨 줄기세포는 그것을 필요로 하는 개체로 이식할 수 있다.

상기 방법은 실험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 이루어지고 있다. 상기 조성물, 방법 또는 사용에 있어서 각 성분과 그 배합량은 이미 상술 한 바와 같다. 각 성분의 배합은 알려진 임의의 방법에 따라 실시 할 수 있다. 상기 조성물, 방법 또는 사용의 유효 성분으로 MMP14를 사용하는 경우, 증식 촉진의 대상이 되는 세포의 주위에 콜라겐 (특히 콜라겐 I)가 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 세포 증식을 촉진하는 성분물, 상기 성분을 배합하는 것을 포함하는 세포 증식을 촉진하기 위한 조성물을 제조하는 방법, 상기 성분의 세포 증식을 촉진하기 위한 조성물의 제조에 사용, 세포 증식의 촉진에 사용하는 상기 성분 및 상기 성분과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

증식을 촉진하는 세포는 한정되지 않고, 예를 들면, 간, 췌장, 신장, 대장, 폐, 비장, 심장, 골수, 성대, 피부, 복막, 눈, 혈관 등의 세포들 수 있다. 세포는 자기 유래의 것이라도 동종의 다른 개체 또는 이종 개체의 것이라도 좋다. 분화 및/또는 증식시킨 세포는 그것을 필요로 하는 개체에 이식할 수 있다.

상기 방법은 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 에서 이루어지고 있다. 상기 조성물, 방법 또는 사용에 있어서 각 성분과 그 배합량은 이미 상술 한 바와 같다. 각 성분의 배합은 알려진 임의의 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기 조성물, 방법 또는 사용의 유효 성분으로 MMP14를 사용하는 경우, 증식 촉진의 대상이 되는 세포의 주위에 콜라겐(특히 콜라겐 I)이 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 MMP14을 억제하는 물질을 포함한 세포 증식을 억제하기 위한 조성물, 상기 물질을 배합하는 것을 포함하여 세포 증식을 억제하기 위한 조성물을 제조하는 방법, 상기 물질, 세포 증식을 억제하기 위한 조성물의 제조에 사용 세포 증식의 억제에 사용하는 상기 물질 및 상기 물질과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 MMP14을 억제하는 물질을 포함한 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 조성물, 상기 물질을 배합하는 것을 포함하여 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법 상기 물질의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 조성물의 제조에 사용 세포 증식성 질환의 치료에 사용하는 상기 물질 및 상기 물질의 치료 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하여 세포 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

MMP14을 저해하는 물질로는 한정되지 않고, 예를 들면, MMP14의 생산 및/또는 활성을 저해하는 약물과 MMP14의 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물 등이 포함된다. MMP14의 생산을 억제하는 약물로는 한정되지 않고, 예를 들면 MMP14를 암호화하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보 자임(ribozyme), 역방향(aitisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(chimera polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.

MMP14의 저해는 MMP14 저해 물질을 작용시켜 않은 경우에 비해 세포에서 MMP14의 발현과 활성이 저해되고 있는 것으로 결정할 수 있다. MMP14의 발현은 알려진 임의의 방법, 제한되지 않고, 예를 들면, 항 MMP14 항체를 이용한 면역 침강 법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블롯 법, 면역 조직 화학 법, 면역 세포 화학 법, 유동 세포 계측법 법, MMP14을 암호화하는 핵산 또는 그 독특한 조각 또는 그 핵산의 전사산물(예: mRNA) 또는 접합 산물에 특이적으로 접합하는(hybridize) 핵산을 이용한 다양한 이종 교잡 법, 노던 블롯 방법, 서던 블랏 법, 다양한 PCR 법 등으로 평가할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 경우, RNAi 분자 RNA 간섭을 유발할 임의의 분자를 의미하며, 이에 국한되지 않고 siRNA(small interfering RNA), miRNA(micro RNA), shRNA(short hairpin RNA) ddRNA(DNA- directed RNA) piRNA(Piwi-interacting RNA) rasiRNA(repeat associated siRNA) 등의 이중 가닥 RNA 및 이러한 변형체 등을 포함한다. 이러한 RNAi 분자는 시판되고 있는지 알려진 배열 정보에 기반하여 설계, 제작하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용하는 경우 역방향 핵산 RNA, DNA, PNA 또는 이러한 복합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 경우, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드는 한정되지 않고, 예를 들면, 일본특허공개 2003-219893에 기재된 표적 유전자의 발현을 억제하는 DNA와 RNA로 이루어진 2 가닥 폴리 뉴클레오티드를 포함한다.

증식을 억제하는 세포로는 한정되지 않고, 예를 들면, 그 증식이 악영향을 미치는 세포, 그 증식이 질환에 관여하는 세포 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 종양 세포, 암세포 활성화 성세포 등을 들 수 있다. MMP14을 억제하는 물질은 이러한 세포에 투여하여도 좋지만, 이러한 세포의 증식을 보조하는 MMP14 발현 세포, 예를 들어, CAF (암 수반 섬유 아세포) 등에 투여할 수 있다.

세포 증식성 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양, 과형성 증, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 부신 질환, 홍 판 증, 진성 다혈증, 백반증, 증식 흉터, 편평 태선 및 흑자 증 등을 들 수 있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 조성물, 방법 등의 유효 성분이 핵산 예를 들어, RNAi 분자, 리보 자임, 역방향 핵산, DNA / RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 등의 경우 이러한 무가공의 핵산으로 그대로 사용할 수도 있지만, 여러 가지의 벡터에 삽입할 수도 있다. 벡터로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지 미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등의 공지 된 임의의 것을 사용할 수 있다. 벡터는 삽입되는 핵산의 발현을 증강 프로모터를 최소한 포함하는 것이 바람직하며,이 경우 그 핵산은 그러한 프로모터와 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다고는 프로모터의 작용에 의해 그 핵산을 암호화하는 단백질이 적절하게 생산되도록 상기 핵산과 프로모터가 배치되어있는 것을 의미한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능하지만 없어도 되고, 또한 유전자의 전사는 숙주 세포의 핵 외부에서 수행되거나 핵 내에서 이루어질 수 있다. 후자의 경우, 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합되어있다.

또한 유효 성분은 각종 비 바이러스성 지질이나 단백질 담체에 삽임시킬 수도 있다. 사용되는 담체로는 한정되지 않고, 예를 들면, 콜레스테롤, 리포좀, 항체 프로토마, 사이클로 텍스트린 나노 입자, 융합 펩타이드, 앱타머(aptamer), 생분해성 폴리 젖산 코폴리머, 폴리머 등이 세포 내로 유입하는 효율을 높일 수 있다 (예를 들어, Pirollo and Chang, Cancer Res 2008; 68 (5) : 1247-50 등 참조). 특히 양이온성 리포좀과 고분자(예를 들어, 폴리에틸렌 이민 등)가 유용하다. 소요 담체로서 유용한 폴리머의 추가에 대한 예시로는 예를 들어, US 2008 / 0207553, US 2008/0312174 등에 기재된 것 등을 들 수 있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 조성물은 생체 조직 재생, 질환의 치료 등의 의료 용도에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 각종 조성물은 약제 학적 조성물로 할 수 있다. 약학 조성물에 있어서는, 유효 성분의 효과를 방해하지 않는 한 유효 성분을 다른 어떤 성분과 결합할 수 있다. 그런 어떤 성분으로는 예를 들어, 다른 화학 치료제 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수 있다. 또한 투여 경로 및 약물 방출 양식 등에 따라 상기 조성물을 적절한 재료, 예를 들어, 장용성성의 코팅과 시한 붕괴성 물질로 피복하여도 좋고, 또한 적절한 약물 방출 시스템에 통합될 수 있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 경구 및 비경을 모두 포함하는 다양한 경로 예를 들어, 한정하지 않고 경구, 정맥 내, 근육 내 피하 국소 종양 내 직장 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 경점막, 경피, 비강, 복강 내, 폐 내부와 자궁 등의 경로로 투여하여도 좋고, 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제제해도 좋다. 사용되는 제형 및 제제 방법은 임의의 공지의 것을 적절히 채택 할 수 있다(예를 들어, 표준 약제 학적 와타나베 喜照ら 편, 南江堂 2003 년 등 참조).

예를 들어, 경구 투여에 적합한 제형으로는 한정하지 않고, 산제, 과립제, 정제, 캡슐 제, 액제, 현탁제, 유제, 겔 화제, 시럽제 등이 또한 비경구 투여에 적합한 제형으로는 용액성 주사제, 현탁성 주사액, 우유탁성 주사제, 사용시 조제형 주사제 등의 주사제가 꼽힌다. 비경구 투여용 제제는 동종이식편, 수성 또는 비 수성의 등장성 무균 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 특정 조직이나 세포에 표적화 되어 있어도 좋다. 표적화 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 암의 전달을 도모하는 경우는 한정되지 않고, 예를 들어 제제를 EPR(enhanced permeability and retention) 효과의 발현에 적합한 직경 50 ~ 200μm 특히 75 내지 150μm 등의 크기의 수동형 타겟팅과 CD19, HER2, 트랜스페린(transferrin) 수용체, 엽산 수용체, VIP 수용체, EGFR(Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2) : E128-47) RAAG10(특표 2005-532050), PIPA(특표 2006-506071), KID3(특표 2007-529197) 등의 리간드와 RGD 모티브와 NGR 모티브를 갖는 펩타이드, F3, LyP-1(Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6) : 759-68) 등을 표적화제로서 이용하는 액티브 타겟팅 등의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 레티노이드 또는 그 유도체가 암세포와 CAF의 표적화제로서 유용하게 알려져 있기 때문에 (WO 2008/120815), 레티노이드를 표적화 제로 포함 담체를 이용할 수도있다. 소요 담체는 상기 문헌 외에도 WO 2009 / 036368, WO 2010 / 014117, WO 2012/170952에 기재되어있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 어떤 형태로 공급 되어도 좋지만, 저장 안정성의 관점에서 사용시 조제 가능한 형태, 예를 들어 의료 현장 또는 그 근방에서 의사 및/또는 약사, 간호사, 또는 기타 치료사 등에 의해서 준비될 수 있는 형태로 제공하고 있다. 제시된 실험예는 본 발명의 조성물은 지질과 단백질, 핵산 등의 안정적인 저장이 어려운 성분을 포함 할 때 특히 유용하다. 이 경우, 본 발명의 조성물은 이러한 필수 구성 요소 중 적어도 하나를 포함 1 개 또는 2 개 이상의 용기로 제공되며 사용 전에 예를 들어, 24 시간 이내, 바람직하게는 3 시간 전 이내, 보다 바람직하게는 사용 직전에 준비된다. 조제시에는 준비하는 장소에서 일반적으로 사용 가능한 시약, 용매 분배기구 등을 적절하게 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 여러 조성물에 포함되는 유효 성분을 단독으로 또는 함께 포함하는 1 개 또는 2 개 이상의 용기를 포함하는 조성물의 제조 장비, 및 그러한 키트 형태에서 제공하는 각종 조성물의 필요 구성 요소에 관한것이다. 본 발명의 키트는 상기 외에 본 발명의 여러 조성물의 제조 방법 및 투여 방법 등이 기재된 지시, 예를 들면 설명서와 CD, DVD 등 전자 기록 매체 등을 포함하고 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 여러 조성물을 완성하기 위한 구성 요소 모두를 포함해도 되지만, 반드시 모든 구성 요소를 포함하지 않아도 된다. 따라서, 본 발명의 키트는 의료 현장이나 실험실 등에서 일반적으로 사용 가능한 시약과 용매, 예를 들어, 무균 물이나 생리 식염수, 포도당 용액 등을 포함 않아도 된다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 여러 방법의 유효량은 예를 들어, 조직의 재생에 관해서는 조직의 재생을 촉진하거나, 조직 재생의 지연을 해소하는 양 이어도 좋고 질환 처리에 관해서는, 질환의 증상을 감소 또는 질환의 진행을 지연 또는 중단하는 양 일 수 있으며, 바람직하게는 질환을 억제 또는 치료하는 양이다. 또한 투여에 의한 이익을 초과 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 필요한 양은 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험과 마우스, 랫드, 개 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명의 처리 방법에 사용하는 약물의 용량은 당업자에게 공지되어있다거나 위의 시험 등에 의해 적절히 결정할 수 있다.

본 명세서에 기재되는 본 발명의 처리 방법에 있어서 투여하는 유효 성분의 구체적인 복용량은 치료를 요하는 개체에 관한 다양한 조건, 예를 들어, 재생을 저해하는 상태의 유무, 증상의 위독한 저도, 개체의 일반적인 건강 상태, 나이, 체중, 개체의 성별, 식사, 투여시기 및 빈도, 병용하고 있는 의약, 치료의 반응, 제형 및 치료에 대한 적합성 등을 고려하여 결정될 수 있다.

투여 경로로는 경구 및 비경을 모두 포함하는 다양한 경로, 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 피하, 국소 종양내 직장 동맥내, 문맥내, 심실내, 경점막, 경피, 비강, 복강내, 폐 내부와 자궁 등의 경로가 포함된다.

투여 빈도는 사용제나 조성물의 성상이나 위의 것을 포함한 해당 조건에 따라 다르지만, 예를 들면, 1일 여러 번 (즉 1일 2,3,4 회 또는 5 회 이상), 1일 1 시간, 며칠마다 (즉 2, 3, 4, 5, 6, 7일 마다 등) 1주일마다, 몇 주마다 (즉 2,3,4 주마다 등)도 있다.

본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 "개체"는 모든 생물 개체를 의미하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간 개체이다. 본 발명에서 개체는 정상인이라도 어떤 질환을 앓고 있는 것이 바람직하지만, 특정 질병의 처리가 도모되는 경우에는 일반적으로 걸리는 질환을 앓고 있는 병적 상태 위험을 갖는 개체를 의미한다.

또한 용어 "처리"는 본 명세서에서 사용하는 경우, 질환의 치료 임시 관해 또는 예방 등을 목적으로 하는 의학적으로 허용되는 모든 종류의 예방 및 / 또는 치료 적 개입을 포함한다. 예를 들어, "처리"의 용어는 질환의 진행을 지연 또는 중단 병변의 철회 또는 손실, 발병의 예방 또는 재발의 방지 등을 포함한 다양한 목적의 의학적으로 허용되는 개입을 포함한다.

본 발명은 또한 MMP14로 처리한 콜라겐을 포함한 세포 배양기 재료에 관한 것이다. MMP14로 처리한 콜라겐은 여러 조성물 등에 관해 상술 한 바와 같다.

본 발명의 세포 배양기 재료는 세포 성장의 발판이 될 것이며, 막과 같은 형태, 젤 형태 등 여러 가지 형태를 가져도 좋다. 세포 배양기 재료는 무균인 것이 바람직하지만, 비 멸균 상태로 제공되며 사용시에 멸균할 수 있다. 본 발명의 세포 배양기 재료는 세포 배양 용기를 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 코팅 농도는 한정되지 않고, 예를 들면 콜라겐의 농도를 0.01 ~ 1000μg/cm², 0.1 ~ 100μg/cm², 1 ~ 50μg/cm², 5 ~ 25μg/cm²이 바람직하다.

또한, 본 발명은 MMP14로 처리 한 콜라겐 또는 MMP14 및 콜라겐을 포함하는 세포 배양기 재료 제작 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 MMP14로 처리한 콜라겐 세포 배양기 재료로 사용하기 위한 정보와 콜라겐을 MMP14으로 처리하기 위한 정보 등을 포함하는 지침, 예를 들어, 설명서와 CD, DVD 등 전자 기록 매체 등을 포함 할 수도 있다.

본 발명은 또한 MMP14로 처리한 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 용기에 관한 것이다. 세포 배양 용기는 알려진 모든 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 배양 용기는 MMP14로 처리 한 콜라겐 세포 배양 용기에 코팅하여 제조하거나 세포 배양 용기에 미리 코팅한 콜라겐을 MMP14로 처리하여 제조할 수 있다. 처리에 사용한 MMP14는 세포막에 붙어 있거나 세포막에서 유리하고 있다. 따라서 콜라겐의 처리는 콜라겐이 코팅된 세포 배양 용기에서 활성화 성세포 등의 MMP14를 발현하는 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 콜라겐의 처리에 사용한 MMP14을 발현하는 세포는 처리 후에 제거하거나, 그대로 세포 배양 용기에 남겨두고 여기에 증식시키는 세포를 더해도 좋다. 상기 세포 배양 용기는 세포 증식 능력이 뛰어나 세포 배양을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 또한 성세포는 줄기 세포의 분화를 유도할 수 있기 때문에 성세포를 더 포함하는 세포 배양 용기는 줄기 세포의 분화 유도에도 사용할 수 있다. 콜라겐의 코팅 농도는 한정되지 않고, 예를 들어 0.01 ~ 1000μg/cm², 0.1 ~ 100μg/cm², 1 ~ 50μg/cm², 5 ~ 25μg/cm²이 바람직하다.

또한, 본 발명은 MMP14로 처리한 콜라겐 또는 MMP14 및 콜라겐을 포함하는, MMP14로 처리 한 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 용기의 제작 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 MMP14로 처리한 콜라겐 세포 배양 용기를 코팅하기 위한 정보와 세포 배양 용기에 코팅된 콜라겐을 MMP14으로 처리하기 위한 정보 등을 포함하는 지침,예를 들어, 설명서와 CD, DVD 등 전자 기록 매체 등을 포함하고 있다. 본 발명의 키트는 세포 배양 용기를 포함할 수 있으나, 시판의 세포 배양 용기를 별도로 준비하여 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 MMP14로 처리한 콜라겐 세포 배양 용기를 코팅하는 공정 또는 세포 배양 용기에 코팅된 콜라겐을 MMP14로 처리하는 공정을 포함하는, MMP14로 처리한 콜라겐이 코팅된 세포 배양 용기 제조 방법에 관한 것이다. 처리에 사용하는 MMP14는 세포막에 붙어 있거나 세포막에서 유리하고 있다. 따라서 세포 배양 용기에 코팅된 콜라겐을 MMP14로 처리하는 공정은 콜라겐이 코팅된 세포 배양 용기에서 활성화 성세포 등의 MMP14를 발현하는 세포를 배양하거나 세포 배양 용기에 코팅 된 콜라겐과 MMP14를 발현하는 세포 분해물을 접촉시키는 것을 포함한다.

실시예

본 발명을 다음의 예에서 더욱 상세히 설명하지만, 이들은 예시에 불과하며 본 발명을 결코 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 VA-lip siRNA 의 조제

(1) siRNA의 준비

콜라겐(I ~ IV 형)의 공통 분자 샤페론(chaperon)인 인간 HSP47의 쥐 상동체, gp46(GenBank Accession No. M69246 서열 번호 1)의 염기 서열을 표적으로 하는 siRNA(홋카이도 시스템 과학, Sapporo, Japan)의 센스 사슬과 안티센스 사슬은 하기의 것을 사용하였다.

A : GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (gp46의 염기 서열에서 제 757 염기에서 시작 센스 가닥 siRNA 서열 번호 2)

B : GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU (안티센스 가닥 siRNA 서열 번호 3)

siRNArandom (siRNAscramble라고 칭하는 경우도 있다)은 하기를 이용하였다.

C : CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (센스 가닥 siRNA 서열 번호 4)

D : GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (안티센스 가닥 siRNA 서열 번호 5)

일부 실험에서 6'- 카르복시 플루오레세인 (6'-carboxy fluorescein; 6-FAM) 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC) 5 '말단에 결합된 센스 사슬을 이용하였다. 이러한 배열은 BLAST 검색에서 알려진 다른 쥐 mRNA와 상동을 갖지 않는 것을 확인했다.

(2) VA-lip siRNA의 준비

양이온 성 지질로, O, O'- 디 테트라 데카 노일 -N- (α- 트리메틸 제거 모니오 아세틸) 디 에탄올 아민 클로라이드 (DC-6-14), 콜레스테롤 및 지오 레일 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE)을 4 : 3 : 3의 몰비로 포함하는 양이온 성 리포좀 (Lipotrust)를 홋카이도 시스템 과학 (Sapporo, Japan)에서 구입했다. 리포좀은 사용 전에 동결 건조하의 지질 혼합물에 교반하는 조건에서 다시 증류수(DDW)를 첨가하여 1mM (DC-6-14)의 농도로 조제하였다. VA 결합 리포좀을 제조하기 위해 DMSO에 녹인 200 nmol 비타민 A(레티놀, Sigma, USA)를 리포좀 현탁액(DC-6-14으로서 100 nmol)과 1.5ml 튜브에서 교반하면서 25 ℃에서 혼합하였다. siRNAgp46을 담지하는 VA 결합 리포좀(VA-lip-siRNAgp46)을 준비하기 위해 siRNAgp46 용액(DDW 중에 580 pmol/μl)을 레티놀 결합 리포솜 용액에 교반하면서 실온하에서 첨가하였다. siRNA 및 DC-6-14과의 몰비는 1:11.5, 또한 비타민 A, DC-6-14 및 siRNA의 몰비는 11.5:11.5:1이었다. in vitro에서 사용하기에 바람직한 용량을 얻기 위해 VA-lip siRNA를 인산 완충 식염수(PBS)으로 재구성했다.

실시예 2 간 부분 절제 쥐에 VA-lip siRNAgp46 투여에 의한 간 재생에 미치는 영향

(1) 간 부분 절제 쥐의 제작 및 처리

간 부분 절제 쥐는 수컷 SD 쥐(150 ~ 200g) (Slc Japan, Shizuoka, Japan) 간 전체의 약 70 %에 해당하는 왼쪽 간장 잎과 중엽을 절제하여 제작하였다. 상기 간 부분 절제 쥐에 실험예 1에서 제작한 VA-lip siRNAgp46(군 I) VA-lip siRNAscramble(mock 컨트롤, 군 II) 또는 5 % 포도당 (siRNA 비 함유 컨트롤, 군 III)을 300μl/시간의 용량으로 1일 간격으로 총 5 회(즉 간 부분 절제 후 1,3,5,7 및 9 일째) 꼬리 정맥에 투여하였다(도 1, n = 6). 또한 각 siRNA는 쥐 체중의 0.75mg/kg으로 사용했다.

(2) 채취 조직의 평가

3 번째와 5 번째 투여 종료 24 시간 후(즉 간 부분 절제 후 5 일째 및 10 일째)에 간 부분 절제한 쥐의 간을 채취하였다. 채취 한 간은 모양을 관찰하고 무게를 측정한 후 OCT 화합물을 이용하여 봉매하고 동결 절편을 제작하였다. 얻어진 절편을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; PFA)로 고정하고 이어서 5% 염소 혈청 함유 PBS로 블로킹을 실시하고 PBS로 세 한 후 Cy3 표식 항 α 평활근 액틴(α-SMA) 항체(Sigma), 항 Ki-67 항체(Dako) 또는 항 CD133 항체를 이용하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. PBS로 세척한 후 Alexa488 표지 염소 항 마우스 항체(Invitrogen)를 이용하여 실온에서 60 분간 반응시켰다. PBS로 세척한 후 ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)에 봉입하여 형광 현미경으로 관찰을 실시했다. 또한 채취 한 간 동결 절편의 Tunel 염색은 In situ Apoptosis Detection Kit(Takara Bio, Japan)를 이용 제조자의 지시에 따라 실시했다. α-SMA와 Tunel의 공동 염색은 FITC-TUNEL 항체 및 Cy3 표식 항 α-SMA 항체를 사용하였다. 양성 세포 수는 5 시야 (배율 200 배)의 평균치를 산출했다.

(3) 결과

도 2는 간 부분 절제 후 5 일째 및 10 일째에 채취 한 각 군 간 모양, 간 부분 절제술 전 및 수술 직후의 간장과 비교해 보여준다. 또한, 도 3에 채취 한 각 군의 간 무게의 추이를 나타낸다. 상기 두 개의 도에서 알 수 있듯이 간은 군 II 및 III에서는 5일째에 이미 절제 이전 크기 및 중량을 회복했지만, VA-lip siRNAgp46을 투여한 군 I에서는 절제 후 10 일이 지나도 간 크기 및 무게가 회복되지 않았다.

다음으로, 절제 후 5 일째에 채취 한 간 조직을 FITC-TUNEL, α-SMA 및 DAPI에서 공유 염색했는데, 군 I에서 α-SMA 양성 세포의 TUNEL 양성 세포의 수가 다른 군에 비해 현저하게 많은 것으로 나타났다(도 4 및 도 5). 이것은 활성화 간성세포 등의 α-SMA 양성 세포는 VA-lip siRNAgp46에 따르면 gp46의 억제에 의해 대량으로 사멸을 일으키는 것을 나타내고 있다.

또한 수술 후 5 일째에 채취 한 간 조직을 Ki67 및 DAPI에서 공유 염색했는데, 군 I에서 Ki67 양성 세포가 같이 간 부분 절제술을 실시한 다른 군(군 II와 군 III)에 비해 현저하게 부족한 것을 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한 군 II와 무리 III에서 Ki67 양성 세포의 수는 간 부분 절제를하지 않은 정상 간 조직보다 현저하게 많은 Ki67 세포 증식 마커 이기 때문에, 간 부분 절제술 후 간 조직에서 왕성한 세포 증식이 발생하는 것을 말해주고 있다. 또한 수술 후 5 일째에 채취 한 간 조직을 CD133 및 DAPI에서 공유 염색했는데, 군 I의 CD133 양성 세포가 같이 간 부분 절제술을 실시한 다른 군(군 II와 군 III)에 비해 현저하게 부족한 것으로 나타났다(도 8). CD133는 줄기 세포 마커이기 때문에, 상기 결과는 VA-lip siRNAgp46를 통하여 줄기 세포의 증식이 현저히 억제된 것을 나타내는 것이다.

상기 각 염색 결과를 모두 고려하면, α-SMA 양성 세포의 세포 사멸에 의해 간 조직에서 줄기 세포를 포함한 세포의 증식이 억제된 것이고 반대로 말하면, α-SMA 양성 세포가 간 부분 절제 이후 조직 재생을 위한 간 조직의 세포 증식, 특히 줄기 세포의 증식에 필수적임을 나타내는 것이다.

실시예 3 간 부분 절제 쥐에 VA-lip siRNAgp46 투여시기에 의한 간 재생에 미치는 영향

(1) 간 부분 절제 쥐의 제작 및 처리

실시예 2와 동일한 방법으로 간 부분 절제 쥐를 제작하였다. 상기 간 부분 절제 쥐에 하기 조치를 취하였다(도 9);

A 군 : 무 처리 (무 처치 대조군),

B 군 : 5 % 포도당 (용매 대조군),

C 군 : VA-lip siRNAscramble (mock 대조군),

D 군 : VA-lip siRNAgp46 (시험 군),

E 군 : VA-lip siRNAgp46 (지연 치료군) (각 군 모두 n = 4).

VA-lip siRNAgp46 및 VA-lip siRNAscramble는 실시예 1에서 제작한 것을 사용했다. B ~ D 군은 각각의 투여 물을 300μl/회 용량으로 1일 간격으로 총 6 회(즉 간 부분 절제 후 0,2,4,6,8 및 10 일째), E 군은 총 4 회 (즉 간 부분 절제 후 4,6,8 및 10 일째) 꼬리 정맥 투여했다. 또한 각 siRNA는 쥐 체중에 0.75mg/kg으로 사용했다.

(2) 채취 조직의 평가

6 번째(E 군은 4 번째)의 투여가 종료 된 24 시간 후(즉 간 부분 절제 후 11 일째)에 간 부분 절제 쥐의 간을 채취하였다. 채취 한 간은 모양을 관찰하고 무게를 측정 한 후 OCT 화합물을 이용하여 봉매하고 동결 절편을 제작하였다. 얻어진 절편을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 이어서 5% 염소 혈청 함유 PBS로 블로킹을 실시하였고 PBS로 세척 한 후 Cy3 표지 항 α 평활근 액틴(α-SMA) 항체(Sigma)를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBS로 세척 한 후 ProLong (R) Gold with DAPI(Invitrogen)에 봉입하여 형광 현미경으로 관찰하였다.

(3) 결과

도 10 및 도 11에 (2)에서 채취한 각 군의 간 모양과 무게를 간 부분 절제 직후(0 일), 간에 비하여 각각 나타낸다. 두 도에서 알 수 있듯이 간은 A 내지 C 및 E 군에서 수술 전 크기 및 중량을 회복했지만, VA-lip siRNAgp46을 제 0 일째부터 투여 한 D 군에서는 수술 후 11 일이 지난 도 간 크기 및 무게는 회복되지 않았다. 또한 같은 용량의 VA-lip siRNAgp46을 제 4 일째부터 투여 한 E 군 간 크기 및 무게의 회복이 인정된 것으로부터, VA-lip siRNAgp46을 조직 재생의 초기 단계에서 투여할 일이 분명 해졌다.

실시예 4 간 부분 절제술 후 간 조직의 α- SMA 양성 세포 수의 시간에 따른 변화

(1) 간 부분 절제 쥐의 제작 및 채취 조직의 평가

실시예 2와 동일한 방법으로 간 부분 절제 쥐를 제작하였다. 간 부분 절제 쥐에서 간 부분 절제술 후 0,1,2,3,4,5 또는 6 일째 간을 채취하였다. 채취 한 간 조직을 OCT 화합물을 이용하여 봉매하고 동결 절편을 제작하였다. 얻어진 절편을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 이어서 5% 염소 혈청 함유 PBS로 블로킹을 실시하였고 PBS로 세척한 후 Cy3 표지 항 α 평활근 액틴(α-SMA) 항체(Sigma)를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBS로 세척한 후 ProLong (R) Gold with DAPI (Invitrogen)에 봉입하여 형광 현미경으로 관찰하였다.

(2) 결과

도 12 및 도 13의 결과에서 α-SMA 양성 세포의 수가 간 부분 절제 후 3일째에 급격히 증가하고 이후 완만하게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 실시예 2 및 3의 결과와 성세포가 활성화하면 α-SMA를 발현하게 되는 것을 고려하면 조직 재생의 초기 단계에서 조직에 존재하는 성세포가 활성화하고 조직 재생을 위한 세포 증식을 유도하는 것을 시사하는 것이다.

실시예 5 줄기 세포의 분화에 대한 성세포의 관여

(1) 세포의 준비

성세포로는 SD 쥐 간에서 채취 한 간성세포를 사용 하였다. 즉 먼저 SD 쥐에 EGTA 용액 및 콜라게나제(collagenase) 용액을 관류한 후 간장을 채취하고 채취 한 간을 미세하게 절단한 후, 셀 스트레이너(strainer, 공경 100μm)로 여과하였다. 얻어진 세포 현탁액에 HBSS + 0.25 % BSA(Bovine Serum Albumin) 용액을 첨가하여 4 ℃, 500rpm에서 2 분간 원심분리 하였다. 상층액을 채취하여 4℃, 1300rpm에서 5 분간 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거한 후 HBSS + 0.25 % BSA 용액을 첨가하고 Nycodenz의 농도가 13.2%가 되도록 28.7% Nycodenz 용액(Axis Shield, Oslo, Norway)를 첨가하여 혼합하였다. HBSS + 0.25 % BSA 용액을 중층 한 후 4℃, 1400×g에서 20분간 원심분리 하였다. 원심 종료 후, 중간층을 채취하여 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's medium) + 10 % 소 태아 혈청(FBS) 배지를 이용하여 배양하였다. 배양 1일째 세포를 정지형 간성세포(qHSC)로하고, 또한 배양 5 일째 계대를 실시하여 2일간 배양 한 것을 활성형 간성세포(aHSC)로 하였다(도 14) .

줄기 세포로는 4 주령의 GFP 유전자 도입 쥐(Slc Japan)의 간에서 채취하여 간 줄기 세포를 사용하였다. 먼저 GFP 유전자 도입 쥐에 EGTA 용액 및 콜라게나제 용액을 관류한 후 간장을 채취하고 채취 한 간을 미세하게 절단한 후, 셀 스트레이너(공경 100μm)로 여과하였다. 얻어진 세포 현탁액에 행크스 평형 염액 (HBSS) + 0.25% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 첨가하여 4℃, 500rpm에서 2 분간 원심분리 하였다. 상층액을 채취하여 4℃, 1300rpm에서 5분간 원심을 실시했다. 상층액을 제거한 후, 침전물에 MACS (R) (Magnetic Activating Cell Sorting) 버퍼(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)를 첨가하여 혼합하였다. 세포 수를 계산 후 FITC 결합 마우스 항 CD45 항체(BD Pharmingen), 토끼 다클론 항 CD133 항체(Abcam) 및 마우스 단클론 항 EpCAM 항체(Santa Cruz)를 이용하여 MACS (R)를 실시해, CD133 양성, EpCAM 양성 , CD45 음성 세포를 채취하고 쥐 간 줄기 세포로 본 실험에 사용하였다.

(2) 줄기 세포와 성세포의 접촉 공 배양

I형 콜라겐으로 코팅된 커버 유리(IWAKI, Tokyo, Japan)를 넣은 6-well plate에 상기 (1)에서 얻은 aHSC를 5 × 10⁴개/웰의 밀도로 파종하여 배양기에서 37℃, 5%, CO₂에서 48시간 배양하였다.

aHSC 파종 2일 후에, 상기 (1)에서 얻은 간 줄기 세포를 3×10⁴개/웰의 밀도로 웰의 aHSC에 파종하여 배양기에서 37℃, 5%, CO₂에서 9일 모두 배양하였다(매체로서 DME/F12(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium/Nutrient F-12 Ham) + 10% FBS + ITS(10 mg/l 인슐린, 5.5 mg/l 트랜스페린, 0.67 μg/l 셀레늄) + 0.1μM 데키사메사존 + 10mM 니코틴 + 50μg/ml β- 머캅토 에탄올 + 2mM L- 글루타민 + 5mM Hepes 사용). 조건에 따라서는 20 ng/ml의 EGF 및/또는 50 ng/ml의 HGF를 공동 배양을 시작할 때 첨가하였다. 또한 컨트롤로 간 줄기 세포만을 aHSC가 존재하지 않는 상태에서 같이 배양하였다.

공동 배양 9일째 간세포 표지자인 알부민에 대한 항체(토끼 다클론, MP Biomedicals)에서 면역 염색을 수행하고, 도립현미경 (Nikon)를 이용하여 100 배의 배율로 GFP/알부민 모두의 양성 콜로니를 촬영한 후, 얻어진 이미지를 바탕으로 GFP/알부민 모두의 양성 콜로니의 수를 계산하고, 면적을 NIS-Elements software (Nikon)을 이용하여 산출하였다(도 15 내지 18).

(3) 줄기 세포와 별 세포의 비접촉 공동 배양

세포 배양 인서트(공경 0.4μm, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 상기 (1)에서 얻은 aHSC를 5×10⁴ 개/웰의 밀도로 파종하여 배양기에서 37℃, 5%, CO₂에서, DMEM + 10 % FBS를 사용하여 48시간 배양하였다. aHSC 파종 2일 후에, 상기 (1)에서 얻은 간 줄기 세포를 I형 콜라겐으로 코팅된 커버 유리(IWAKI, Tokyo, Japan)를 넣은 24-well plate (BD Falcon)에 1×10⁴ 개/웰 밀도로 파종했다. 이어 aHSC을 포함하는 상기 셀 배양 인서트를 24-well plate의 well에 넣고 배양기에서 37℃, 5%, CO₂에서 10일동안 공동 배양하였다(매체로서 DME/F12(Dulbecco 's Modified Eagle's Medium/Nutrient F -12 Ham) + 10 % FBS + ITS (10 mg/l 인슐린, 5.5 mg/l 트랜스페린, 0.67 μg/l 셀레늄) + 0.1μM 데키사메사존 + 10mM 니코틴 아미드 + 50 μg/ml β- 머캅토 에탄올 + 2mM L- 글루타민 + 5mM Hepes 사용). 또한 컨트롤로 간 줄기 세포만을 aHSC가 존재하지 않는 상태에서 같이 배양하였다.

공동 배양 10 일째, 항 알부민 항체(토끼 다클론성, MP Biomedicals)에서 면역 염색을 실시한 후, 도립현미경 (Nikon)를 이용하여 100배의 배율로 알부민 양성 콜로니를 촬영하여 얻어진 이미지를 토대로 알부민 양성 콜로니의 면적을 NIS-Elements software(Nikon)을 이용하여 산출하였다 (도 19).

다른 실험에서는 공동 배양 10일째에 Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)를 사용하여 마이크로 플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다(도 20).

(4) 결과

도 15 내지 18에 나타난 접촉 공동 배양 실험 결과에서 간 줄기 세포를 활성 형 간성세포와 공동 배양하였을 때, 간 줄기 세포의 간세포로의 분화 및 증식이 생기는 것으로 밝혀졌다. 또한, 간 줄기 세포의 간세포로의 분화 및 증식은 EGF와 HGF의 첨가에 의해 현저하게 촉진되는 것으로 밝혀졌다. 도 19 및 20에 나타난 비접촉 공동 배양 실험 결과는 활성형 간성세포가 간 줄기 세포와 접촉하지 않는 상태여도 간 줄기 세포의 간세포로의 분화·증식을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 결과는 활성형 간성세포에서 분비되는 체액성 인자가 간 줄기 세포의 간세포로의 분화·증식을 유도하는 것을 나타내는 것이다.

실시예 6 간 부분 절제술 후 간 조직에서 DNA 합성의 시간에 따른 변화

(1) BrdU 양성 세포의 시간에 따른 변화

실시예 2와 동일한 방법으로 간 부분 절제 쥐를 제작하였다. 간 부분 절제 후 간에서 DNA 합성의 시간에 따른 변화를 알아보기 위해 쥐에게 BrdU를 100μg/g 체중의 농도로 복강 주사하였다. BrdU 투여 후 3시간째에 간 조직을 채취했다. 채취 한 간 조직은 10% 포르말린에 고정하고 파라핀을 처리하였다. 파라핀 포매 한 간 조직은 5μm 두께로 절편하고 10mM 구연산 버퍼를 사용하여 120℃에서 20분간 부활화를 실시한 후, 5% 염소 혈청을 이용하여 차단했다. 차단 후 마우스 단클론 항 BrdU 항체(MBL)를 37℃에서 60분간 반응시켰다. 절편을 PBS로 세척 후 Alexa488 표지 염소 항 마우스 IgG(Invitrogen)을 37℃에서 60분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 DAPI를 포함하는 봉입제를 이용하여 봉입하고 간 조직 내에서 BrdU의 혼잡을 관찰하였다. 상기 결과를 도 21에 나타내었다.

쥐 간 부분 절제술 후 간 조직에서 DNA 합성이 이루어지고 있는 세포의 비율을 측정하기 위해, 간 부분 절제술을 한 쥐에 대해 BrdU를 100μg/g 체중의 농도로 복강 주사하였다. BrdU 투여 후 3시간 만에 문맥보다 0.03 % 콜라게나제 용액으로 관류 한 후 간 조직을 채취하여 세절하여 세포 현탁액을 얻었다. 상기 세포 현탁액을 0.25% BSA를 포함하는 행크스 용액 (Invitrogen)에서 세포 농도가 1 × 10⁷ 개/100μl가되도록 조정하고, APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체(BioLegends)를 더해 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후 유동 세포 계측법을 사용하여 BrdU 양성 세포 수를 측정했다. 상기 결과를 도 22에 나타내었다. 도에서 쥐 간 부분 절제술 후 간에서의 BrdU 양성 세포의 비율은 BrdU 양성 세포 수를 유동 세포 계측법에서 분석한 전체 세포 수로 나눈 값으로 나타내었다.

도 21 및 22에 나타낸 결과에서 간 부분 절제술 후 간 조직에서의 DNA 합성이 두 봉우리 성이 증가하는 것을 알 수 있다. 즉 절제의 1일 후 첫 번째 피크가 2일 후에는 다소 진정하지만, 3일 후에 다시 증가하고 4일 이후에는 점차 감소하였다.

(2) BrdU 양성 간세포의 시간에 따른 변화

실시예 2와 동일한 방법으로 간 부분 절제 쥐를 제작하였다. 간 부분 절제 후 간에서 간세포의 DNA 합성의 시간에 따른 변화를 알아보기 위해 쥐에게 BrdU를 100μg/g 체중의 농도로 복강 주사하였다. BrdU 투여 후 3시간째에 간 조직을 채취했다. 채취 한 간 조직은 10% 포르말린에 고정하고 파라핀했다. 파라핀 포매 한 간 조직은 5μm 두께로 절편하고 10mM 구연산 버퍼를 사용하여 120℃에서 20분간 부활화를 실시한 후, 5% 염소 혈청을 이용하여 차단했다. 차단 후 APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체(BioLegends) 및 염소 항 HNF4α 항체(Santa Cruz)를 37℃에서 60분간 반응시켰다. 절편을 PBS로 세척 후 Alexa488 표지판 양 항 염소 IgG(Invitrogen)을 37℃에서 60분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 DAPI를 포함 봉입 제를 이용하여 봉입하고 간 조직에서 간세포에 의한 BrdU의 혼잡을 관찰했다. 상기 결과를 도 23에 나타내었다.

쥐 간 부분 절제술 후 간 조직에서 DNA 합성이 이루어지고 있는 줄기 세포의 비율을 측정하기 위해, 간 부분 절제술을 한 쥐에 대해 BrdU를 100μg/g 체중의 농도로 복강 주사하였다. BrdU 투여 후 3시간째에 문맥보다 0.03 % 콜라게나제 용액으로 관류한 후 간 조직을 채취하여 세절하여 세포 현탁액을 얻었다. 상기 세포 현탁액을 0.25% BSA를 포함하는 행크스 용액 (Invitrogen)에서 세포 농도가 1×10⁷ 개/100μl가되도록 조정하고, APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체 (BioLegends) 및 염소 항 HNF4α 항체 (Santa Cruz)을 첨가하고 37 ℃에서 60 분간 반응시켰다.

도 23 및 24에 나타낸 결과에서 간세포의 증식은 간 부분 절제술 1일 이후에 피크를 나타낸 후 서서히 감소하는 것을 알 수 있다. 간세포를 포함한 간장에 존재하는 전체 세포의 증식은 도 21 및 22와 같이 간 부분 절제술 1일 후. 3일 후에 2 개의 피크를 갖는 결과, 1일 후 첫 번째 피크는 간세포의 증식 이 주체이며, 3일 후 두 번째 피크는 간세포 이외의 세포, 예를 들어, 줄기 세포 등의 증식에 의한 것으로 생각된다.

실시예 7 간세포의 증식에 대한 성세포의 관여

(1) 간세포로 별 세포와 공동 배양

별 세포가 간세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해, 간세포로 별 세포와 공동 배양하였다. 실시예 5에서 얻은 aHSC를 60mm 접시에 1×10⁵개의 농도로 파종하고 10 % FBS 가압 DMEM을 사용하여 37 ℃, 5 % CO2에서 24 시간 배양하였다. 배양 24시간째에 배지를 제거하고, Opti-MEM I reducing medium (Invitrogen)를 첨가하여 siRNA를 transfection의 준비가 될 때까지 전 배양 하였다. siRNA를 최종 농도가 10nM이 되도록 RNAiMAX(Invitrogen)와 혼합하고 실온에서 15 분간 방치하여 siRNA 복합체를 얻었다. 사용한 siRNA는 하기와 같다:

GFP siRNA (Ambion, Silencer GFP siRNA, Cat. No.AM4626),

Scramble siRNA : 실시예 1에 기재된 것,

gp46 siRNA : 실시예 1에 기재된 것.

siRNA 복합체를 전 배양 한 aHSC에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 5 시간째에 배지를 10% FBS 가압 DMEM으로 대체하여 37℃, 5% CO₂에서 48 시간 배양하였다. 배양 48시간째에 배지를 제거하고, Opti-MEM I reducing medium에 추가 siRNA를 transfection할 준비가 될 때까지 전 배양 하였다. 최종 농도가 10nM이 되도록 siRNA(GFP siRNA, Scramble siRNA, gp46 siRNA)를 RNAiMAX와 혼합하고 실온에서 15분간 방치하였다. siRNA 복합체를 전 배양 한 aHSC에 첨가하고, 37℃, 5 % CO₂에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 5시간째에 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 트립신-EDTA 용액을 사용하여 HSC를 회수했다.

회수 한 HSC는 사전에 GFP 유전자 도입 쥐 간에서 채취 한 콜라겐 I로 코팅 한 35mm 접시에 5×10⁴ 개의 농도로 파종한 간세포에 5×10⁴개/접시의 농도로 37℃, 5% CO₂에서 48시간 배양하였다. 배양 48시간째에 배지를 10mM BrdU 및 10 % FBS를 포함하는 DME/F12 배지로 교체하고 37℃, 5 % CO₂에서 24 시간 더 배양하였다. 배양 24시간째에 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 4 % PFA를 첨가하여 실온에서 30분간 고정하였다. 고정 후 PBS로 세척하고, 0.2N HCl 및 0.1 % Triton X-100을 포함한 PBS를 첨가하여 투명 처리를 실시하였다.

(2) 형광 현미경으로 관찰

상기 (1)에서 투명 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 5 % 염소 혈청으로 차단하고 마우스 단클론 항 BrdU 항체(MBL) 및 토끼 다 클론 항 GFP 항체(Invitrogen)를 첨가하여 일차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시했다. 일차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 Alexa488 표지 염소 항 토끼 IgG(Invitrogen) 및 Alexa555 표지 염소 항 마우스 IgG(Invitrogen)를 첨가하여 이차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 이차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 DAPI를 포함 봉입 제를 이용하여 세포를 봉입하였다. 형광 현미경 이미지를 도 25에 나타내었다.

(3) FACS 분석

BrdU 양성 GFP 양성 간세포의 비율을 측정하기 위해 상기 (1)에서 투명 처리 한 세포를 PBS로 세척한 후 APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체 및 FITC 표지 토끼 다클론 항 GFP 항체를 가하여 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 항체 반응 종료 후 PBS로 세포를 세척하여 FACS 분석으로 BrdU 양성 GFP 양성 간세포의 비율을 측정하였다. 상기 결과를 도 26에 나타내었다. BrdU 양성 세포의 비율은 BrdU 양성 세포 수를 유동 세포 계측법으로 분석하여 전체 세포 수로 나눈 값으로 나타내었다.

도 25 및 26에 나타낸 결과로부터 간세포를 aHSC로 공동 배양하면 줄기 세포를 단독으로 배양했을 때보다 간세포의 증식이 높아지지만 aHSC에 gp46 siRNA를 작용시키면 상기 효과가 억제됨을 알 수 있었다. 상기 결과는 aHSC가 간세포의 증식에 관여하고 있음을 나타내는 것이다.

실시예 8 다양한 처리를 한 콜라겐이 간세포의 증식에 미치는 영향

(1) 다양한 처리 된 콜라겐에서 간세포의 배양

쥐 꼬리 유래 콜라겐 I (Sigma)를 10μg / cm²의 농도에서 60mm 접시에 코팅하였다. 변성 콜라겐 I은 쥐 꼬리 유래 콜라겐 I를 60 ℃에서 30 분간 처리하고 10μg / cm²의 농도에서 60mm 접시에 코팅하였다. MMP14 처리 콜라겐 I은 쥐 꼬리 유래 콜라겐 I를 활성형 MMP14 (R & D System)를 포함한 반응액 (0.1μg / ml 트립신 3(Recombinant Human Active Trypsin3 R & D systems, Cat. No. 3714-SE), 50mM Tris, 0.15M NaCl, 10mM CaCl2,5μM ZnCl2,0.05 % (v/v) Brij35, pH7.5)를 이용하여 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 MMP14 처리 콜라겐 I를 10μg /cm²의 농도에서 60mm 접시에 코팅하였다. 간세포는 쥐 간에서 채취하여 2×10⁵개/접시의 농도로 파종하여 37℃, 5 % CO₂에서 48시간 배양하였다. 배양 48시간째에 배지를 10μM BrdU 및 10 % FBS를 포함하는 DME/F12 배지로 대체하여 37℃, 5 % CO₂에서 24시간 더 배양하였다. 배양 24시간째에 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 4% PFA를 첨가하여 실온에서 30분간 고정하였다. 고정 후 PBS로 세척하고, 0.2N HCl 및 0.1 % Triton X-100을 포함한 PBS를 첨가하여 투명 처리를 실시하였다.

(2) 형광 현미경으로 관찰

상기 (1)에서 투명 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 5% 염소 혈청으로 차단하고 마우스 단클론 항 BrdU 항체(MBL) 및 토끼 다 클론 항 GFP 항체(Invitrogen)를 첨가하여 일차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 일차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 Alexa488 표지 염소 항 토끼 IgG(Invitrogen) 및 Alexa555 표지 염소 항 마우스 IgG(Invitrogen)를 첨가하여 이차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 이차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 DAPI를 포함 봉입 제를 이용하여 세포를 봉입하였다. 형광 현미경 이미지를 도 27에 나타내었다.

(3) FACS 분석

BrdU 양성 간세포의 비율을 측정하기 위해 상기 (1)에서 투명 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체를 첨가하여 항체 반응을 4 ℃에서 30분간 실시하였다. 항체 반응 종료 후 PBS로 세포를 세척하여 FACS 분석으로 BrdU 양성 간세포의 비율을 측정하였다. 상기 결과를 도 28에 나타내었다. BrdU 양성 세포의 비율은 BrdU 양성 세포 수를 유동 세포 계측법으로 분석한 전체 세포 수 (3×10⁴개)로 나눈 것으로 나타내었다.

도 27 및 28에 나타낸 결과에서 변성 콜라겐 I 및 MMP14 처리 콜라겐 I로 코팅한 접시는 처리되지 않은 콜라겐 I로 코팅 한 접시에 비해 간세포의 증식이 촉진되는 것을 알 수 있었다. HSC는 콜라게나제 활성을 갖는 MMP14가 발현하고 있기 때문에 상기 결과는 HSC에 의한 간세포의 증식 촉진의 요인으로 HSC가 발현하는 MMP14의한 콜라겐의 작용이 관여하고 있는 것을 시사하는 것이다.

실시예 9 aHSC 의 MMP14 의 발현이 간세포의 증식에 미치는 영향

(1) 간세포와 성세포의 공동 배양

성세포가 간세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해, 간세포와 성세포를 공동 배양하였다. 실시예 5에서 얻은 aHSC를 60mm 접시에 1×10⁵개의 농도로 파종하고 10 % FBS 가압 DMEM을 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂에서 24시간 배양하였다. 배양 24시간째에 배지를 제거하고, Opti-MEM I reducing medium(Invitrogen)를 첨가하여 siRNA를 transfection의 준비가 될 때까지 전 배양 하였다. siRNA를 최종 농도가 10nM이 되도록 RNAiMAX(Invitrogen)와 혼합하고 실온에서 15분간 방치하여 siRNA 복합체를 얻었다. 사용 한 siRNA는 하기와 같다:

GFP siRNA (Ambion, Silencer GFP siRNA, Cat. No.AM4626),

MMP14 siRNA :

센스 사슬 : 5'-GCUCAUUCAUGGGUAGCGATT-3 '(서열 번호 6),

안티센스 가닥 : 5'-UCGCUACCCAUGAAUGAGCCT-3 '(서열 번호 7),

HGF siRNA :

센스 사슬 : 5'-AUAUCUUUCCGGCAAGAAUUUGUGC-3 '(서열 번호 8),

안티센스 가닥 : 5'-GCACAAAUUCUUGCCGGAAAGAUAU-3 '(서열 번호 9).

siRNA 복합체를 전 배양 한 aHSC에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 5시간째에 배지를 10% FBS 가압 DMEM으로 대체하여 37℃, 5% CO₂에서 48시간 배양하였다. 배양 48시간째에 배지를 제거하고, Opti-MEM I reducing medium을 추가 siRNA를 transfection의 준비가 될 때까지 전 배양하였다. 최종 농도가 10nM이 되도록 siRNA(GFP siRNA, MMP14 siRNA, HGF siRNA)를 RNAiMAX와 혼합하고 실온에서 15분간 방치하였다.

siRNA 복합체를 전 배양 한 aHSC에 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 5 시간째에 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 트립신-EDTA 용액을 사용하여 HSC를 회수하였다.

회수 한 HSC는 사전에 GFP 유전자 도입 쥐 간에서 채취 한 콜라겐 I로 코팅 한 35mm 접시에 5×10⁴개의 농도로 파종 한 간세포에 5×10⁴개/접시의 농도로 37 ℃, 5 % CO₂에서 48시간 배양하였다. 배양 48시간째에 배지를 10mM BrdU 및 10 % FBS를 포함한 DME/F12 배지로 교체하고 37℃, 5% CO₂에서 24시간 더 배양하였다. 배양 24시간째에 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 4 % PFA를 첨가하여 실온에서 30 분간 고정하였다. 고정 후 PBS로 세척하고, 0.2N HCl 및 0.1 % Triton X-100을 포함한 PBS를 첨가하여 투명 처리를 실시하였다.

(2) 형광 현미경으로 관찰

상기 (1)에서 투명 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 5 % 염소 혈청으로 차단하고 마우스 단클론 항 BrdU 항체(MBL) 및 토끼 다 클론 항 GFP 항체(Invitrogen)를 첨가하여 일차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 일차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 Alexa488 표지 염소 항 토끼 IgG(Invitrogen) 및 Alexa555 표지 염소 항 마우스 IgG(Invitrogen)를 첨가하여 이차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 이차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 DAPI를 포함 봉입 제를 이용하여 세포를 봉입하였다. 형광 현미경 이미지를 도 29에 나타내었다.

(3) FACS 분석

BrdU 양성 GFP 양성 간세포의 비율을 측정하기 위해 상기 (1)에서 투명 처리한 세포를 PBS로 세척한 후 APC 표지판 마우스 단클론 항 BrdU 항체 및 FITC 표지 토끼 다클론 항 GFP 항체를 가하여 항체 반응을 4℃에서 30분간 실시하였다. 항체 반응 종료 후 PBS로 세포를 세척하여 FACS 분석으로 BrdU 양성 GFP 양성 간세포의 비율을 측정하였다. 상기 결과를 도 30에 나타내었다. BrdU 양성 세포의 비율은 BrdU 양성 세포 수를 유동 세포 계측법으로 분석하고 전체 세포 수로 나눈 값으로 나타내었다.

도 29 및 30에 나타낸 결과에서 aHSC 의한 간세포의 증식 촉진에 aHSC가 발현하는 MMP14가 참여하고 있으며, 그 기여도가 간세포의 증식 촉진의 핵심 요소로 알려진 HGF를 능가함을 알 수 있다.

실시예 10 MMP14 처리 콜라겐에서 RGD 서열이 간세포의 증식에 미치는 영향

GFP 유전자 도입 쥐 간에서 채취 한 쥐 간세포를 2×10⁵개/ml의 농도로 DME/F12 배지에 파종하여 서로 다른 농도의 펩타이드(컨트롤 펩타이드(H-Gly-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser -OH, Peptides International, Cat. No. PFA-3907-PI) : 500μg/ml, GRGDS 펩타이드(펩티드 연구소, Cat. No. 4189-v) : 100μg/ml, 200μg/ml, 500μg/ml)를 이외에 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 종료 후 쥐 간세포를 MMP14로 처리 한 콜라겐 I를 코팅 한 35mm 접시에 5×10⁴개/접시의 농도로 파종하여 10mM BrdU 및 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 DME/F12 매체 37 ℃, 5 % CO₂에서 72시간 배양하였다. 배양 종료 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 4% PFA를 가하고 실온에서 30분간 고정하였다. 고정 후 PBS로 세척하고, 0.2N HCl 및 0.1 % Triton X-100을 포함한 PBS를 첨가하여 투명 처리를 실시하였다.

PBS로 세척한 후 5% 염소 혈청으로 차단하고 마우스 단클론 항 BrdU 항체(MBL) 및 토끼 다클론 항 GFP 항체(Invitrogen)를 첨가하여 일차 항체 반응을 37 ℃에서 60분간 실시하였다. 일차 항체 반응 후 PBS로 세척하여 Alexa488 표지 염소 항 토끼 IgG(Invitrogen) 및 Alexa555 표지 염소 항 마우스 IgG(Invitrogen)를 첨가하여 이차 항체 반응을 37℃에서 60분간 실시하였다. 이차 항체 반응 후 PBS로 세척하고 DAPI를 포함하는 봉입제를 이용하여 세포를 봉입하였다. 형광 현미경 이미지를 도 31에 나타내었다. 증식 세포의 비율은 BrdU 양성 세포 수를 계산 한 전체 세포 수로 나눈 값으로 나타내었다 (도 32).

도 31 및 32에 나타낸 결과에서 aHSC 의한 간세포의 증식 촉진에 RGD 서열이 관여하고있는 것으로 나타났다. 이 때문에 aHSC가 발현 MMP14의 작용에 의해 노출 된 콜라겐 I의 RGD 서열이 간세포의 증식 촉진에 관여하는 것을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> Nitto Denko Corporation <120> Agent for promoting tissue regeneration <130> PCT2629ND <150> JP 2012-280261 <151> 2012-12-21 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2063 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 agcggacgct gtctgaggag tagagcctgc ctgagagcga gtgtcccgtc ggtcccggag 60 cagcccagcc cggcccagcc ctcacaggtc ctctgtggtg cacacagccc acctcccagc 120 catgcgctct ctccttctgg gcaccttatg cctcctggct gtggccctgg cagccgaggt 180 gaagaaacct gtagaggccg cagcccctgg tactgcggag aagctgagtt ccaaggcgac 240 cacactggca gagcgcagca caggcctggc cttcagcctg tatcaggcaa tggccaaaga 300 tcaggcggtg gagaatatcc tcctgtcacc cttggtggtg gcctcatccc tgggccttgt 360 gtcactgggt ggtaaagcca ccacagcttc gcaggcgaag gcagtgttga gcgctgagaa 420 gctgcgggat gaggaggtgc acacggggct gggcgagctc gtgcgctccc tcagtaactc 480 cactgcgcgc aatgtgacct ggaaactggg cagccgcctg tacgggccca gctccgtgag 540 cttcgccgat gacttcgtgc gcagcagtaa gcaacactac aactgtgaac actccaagat 600 caacttccga gacaagcgca gcgcgctgca gtccatcaac gagtgggcct cgcagaccac 660 cgacggcaag ctgccagagg tcaccaagga tgtggagcgc acggatgggg cactgctcgt 720 taatgccatg ttctttaagc cgcactggga tgagaagttc caccataaga tggtagacaa 780 ccgtggcttc atggtgaccc gctcctacac tgtgggtgtt acgatgatgc accggacagg 840 cctctacaac tactatgacg acgagaagga gaagctgcag ctggtggaga tgcccttggc 900 ccataagctc tccagcctca tcatcctcat gccccaccac gtagaaccgc tcgagcgcct 960 ggagaagttg ctgaccaagg agcaactaaa gacctggatg gggaagatgc agaagaaggc 1020 tgttgccatc tccctgccca agggagtggt ggaggtgacc catgacctgc agaaacatct 1080 ggccggactg ggcctgactg aggccatcga caagaacaag gcagacttat cgcgcatgtc 1140 tggcaagaag gatctgtacc tggccagtgt gttccacgcc actgccttcg agtgggacac 1200 agagggcaac ccctttgacc aggacatcta cgggcgtgag gagctgcgca gccccaagct 1260 gttctatgcc gaccacccct tcatcttcct ggtgcgagat aatcagagcg gctccttgct 1320 gttcattggc cgcctggtcc ggcccaaggg agacaagatg cgagacgagt tgtagagtcc 1380 aagagtggtc gtggcgtggc atggcgggaa gtagccagag gttcctgaga cacatgggtg 1440 ctattgtggg gggaggggga ggcaccaacc ctggatagtc cacgggtggg ggggggttgg 1500 cagtgcagat cggaattccc ataggtctga gtaggtattt ttagacaaga gtccactccg 1560 ttagacatgg agcccagaca ctatgagacc aaattcaggg gtgtcacagc cattctagcc 1620 ctgccccaca agttttatat ccaatctagc ctcaacagtc aatcagtgtt catattcgtg 1680 gccaagcatt ctgtctgtga gacaatcgag ttgggtgggg gtagggcggc ctagcctctc 1740 tgtcaccatg ccctgagccc tcggttttcc tgttcacctc tgattccctt taaccacaaa 1800 actaggagcc tgtggtccca gaactgccca cccttaaaat cgattctttg ccgcagcagt 1860 gggagttggg gagaccatgc ataggagggc tccttggcat atccggccct agagccatta 1920 cattacattg acaactcaac tttgcttctg ttttctccct ttttgagttt ttcaaggaat 1980 gggggtttgg ggaaggggaa gcctttattg ctttcaaaac aagaacagtt tgtcaatttt 2040 ttttgaataa accttttcca atg 2063 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> gp46 siRNA sense strand <400> 2 guuccaccau aagaugguag acaacag 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> gp46 siRNA antisense strand <400> 3 guugucuacc aucuuauggu ggaacau 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA random sense strand <400> 4 cgauucgcua gaccggcuuc auugcag 27 <210> 5 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA random antisense strand <400> 5 gcaaugaagc cggucuagcg aaucgau 27 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MMP14 siRNA sense strand <400> 6 gcucauucau ggguagcgat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MMP14 siRNA antisense strand <400> 7 ucgcuaccca ugaaugagcc t 21 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HGF siRNA sense strand <400> 8 auaucuuucc ggcaagaauu ugugc 25 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HGF siRNA antisense strand <400> 9 gcacaaauuc uugccggaaa gauau 25

Claims (19)

1. 활성화 성세포(stellate cell), 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 조직 재생 촉진용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 조직 재생은 장애 조직 또는 이식 조직에서 발생한 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 장애 또는 이식을 받은 날로부터 4일 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
4. 제 2항에 있어서, 상기 장애 또는 이식을 받은 날로부터 1일 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애가 조직 파괴, 염증, 괴사, 섬유화, 수술적 침습, 장기 부전으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 재생은 조직 줄기 세포의 분화 및/또는 증식을 수반하는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 재생은 조직 실질 세포의 증식을 수반하는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 성세포는 HGF, EGF, MMP14로 이루어진 군에서 선택되는 단백질의 발현을 증가시키는 처리를 한 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 재생은 억제된 상태를 갖는 개체에 대해서 이용하는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
   
10. 제 9항에 있어서, 상기 조직 재생이 억제된 상태는 염증, 괴사, 섬유화, 장기 부전, 혈소판 감소, 유전자 이상, 노르아드레날린(noradrenaline)의 감소로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 재생 촉진용 조성물.
    
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이를 필요로하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 조직 재생을 촉진하는 방법.
    
12. 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함하는 줄기 세포의 분화 및/또는 성장용 조성물.
    
13. 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분과 줄기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 조직 줄기 세포를 분화 및/또는 증식시키는 방법.
    
14. 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한 세포 증식 촉진용 조성물.
    
15. 활성화 성세포, 활성화 성세포 분해물, MMP14, MMP14로 처리한 콜라겐 및 활성화 성세포 분비물로 이루어진 군에서 선택되는 성분과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식을 촉진시키는 방법.
    
16. MMP14를 저해하는 물질을 포함하는 세포 증식 억제용 조성물.
    
17. 제 16항에 있어서, 상기 MMP14를 저해하는 물질이 작용하는 세포가 CAF 및/또는 종양세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
18. MMP14로 처리한 콜라겐을 포함한 세포 배양기 재료.
    
19. MMP14로 처리한 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 용기.

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