TW201440785A - 組織再生促進劑 - Google Patents

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Yoshiro Niitsu
Akihiro Yoneda
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Nitto Denko Corp
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Abstract

本發明之目的在於提供一種新穎的組織再生促進劑及組織再生促進方法。本發明是關於一種用以促進組織再生、促進細胞分化及/或促進細胞增殖之組成物，其含有選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、基質金屬蛋白酶14(MMP14)、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物；本發明又關於一種用以抑制細胞增殖之組成物、一種細胞培養基材等，其中，該組成物包含一MMP14抑制物質，該細胞培養基材包含經MMP14處理之膠原蛋白。

Description

組織再生促進劑
本發明是關於一種用以促進組織再生、促進細胞分化及/或促進細胞增殖之組成物，其含有選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14(matrix metalloproteinase 14，基質金屬蛋白酶14)、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物；本發明又關於一種用以抑制細胞增殖之組成物、一種細胞培養基材等，其中，該組成物包含一MMP14抑制物質，該細胞培養基材包含經MMP14處理之膠原蛋白。
活體的組織若受到損傷，則會再生以修補損傷部分，使其機能回復。例如肝臟，已知即使切除其一半以上，亦能在短期內再生，回復到幾乎是原本的大小及機能。關於組織再生的研究，從以前開始即以肝臟為主來進行，且已報告有各種發現，但關於組織再生的詳細機制，仍然有許多不明之處。組織的再生，被認為複雜地牽涉到複數種類的細胞，但就連這些細胞中的哪一種是擔任主要任務，仍然未獲得決定性的見解。
組織再生機制的闡明，是藉由分析下述現象而逐漸進展：由組織染色或細胞染色等所得之損傷組織的經時變 化、或各種生理活性物質對於組織再生所造成的影響。例如，在非專利文獻1中，顯示出下述假說：在小鼠部分肝臟切除模式中，特定表現型的肝竇內皮細胞(hepatic sinusoidal endothelial cells)會藉由Id1亦即內皮細胞專一性轉錄因子的調升(up-regulation)(此調升是經由VEGFR2(vascular endothelial growth factor-A receptor-2，血管內皮生長因子-A受體-2)來進行)，來引起肝細胞之增殖，繼而使內皮細胞本身增殖，藉此進行肝臟的再生。
然而，即便已有許多研究，但關於組織再生的機制目前仍然僅有極少部分受到闡明，仍謀求更進一步的研究努力。
[先前技術文獻] (非專利文獻)
非專利文獻1：Ding et al., Nature. 2010 Nov 11；468(7321)：310-5
本發明之目的在於提供一種新穎的組織再生促進劑及組織再生促進方法。
本發明人為了解決上述問題而專心進行研究，結果分別發現下述情形：活化之星狀細胞在組織再生方面擔任重要任務、活化之星狀細胞的分泌物會誘導幹細胞(幹細胞為組織再生的中心)之增殖和分化、受到活化之星狀細胞表現之MMP14所作用的膠原蛋白會誘導組織實質細胞的增殖、以 及此增殖之誘導是與存在於膠原蛋白中的RGD(Arg-Gly-Asp)序列有關連，從而完成本發明。
亦即，本發明是關於下述事項。
(1)一種用以促進組織再生之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
(2)如(1)所述之組成物，其中，組織再生是發生在創傷組織(traumatic tissue)或移植組織中。
(3)如(2)所述之組成物，其係在受到創傷或移植之日起4日以內進行投予。
(4)如(2)所述之組成物，其係在受到創傷或移植之日起1日以內進行投予。
(5)如(2)~(4)中任一項所述之組成物，其中，創傷是選自由下述所構成之群組：組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭。
(6)如(1)~(5)中任一項所述之組成物，其中，組織再生會伴隨著組織幹細胞之分化及/或增殖。
(7)如(1)~(6)中任一項所述之組成物，其中，組織再生會伴隨著組織實質細胞之增殖。
(8)如(1)~(7)中任一項所述之組成物，其中，活化之星狀細胞是經施以使蛋白質之表現增加的處置而成，該蛋白質選自由下述所構成之群組：HGF(hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子)、EGF(epidermal growth factor，表皮細胞生長因子)、MMP14。
(9)如(1)~(8)中任一項所述之組成物，其係使用於具有組織再生受到抑制之狀態的對象。
(10)如(9)所述之組成物，其中，組織再生受到抑制之狀態是選自由下述所構成之群組：發炎、壞死、纖維化、器官衰竭、血小板數量減少、基因異常、正腎上腺素減少。
(11)一種於對象中促進組織再生之方法，其包含一步驟，該步驟是將如(1)~(10)中任一項所述之組成物，投予至需要該組成物之對象中。
(12)一種用於幹細胞之分化及/或增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
(13)一種使組織幹細胞分化及/或增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使一成分與幹細胞進行接觸，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
(14)一種用以促進細胞增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
(15)一種促進細胞增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使一成分與細胞進行接觸，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
(16)一種用以抑制細胞增殖之組成物，其包含一阻礙MMP14之物質。
(17)如(16)所述之組成物，其中，該阻礙MMP14之物質所作用的細胞是CAF(癌相關纖維母細胞，cancer-associated fibroblasts)及/或腫瘤細胞。
(18)一種細胞培養基材，其包含經MMP14處理之膠原蛋白。
(19)一種細胞培養容器，該容器被覆有經MMP14處理之膠原蛋白。
藉由本發明，不僅可促進體內的組織再生，也可促進體外的組織形成，因此可期待在生物學上、醫學上有龐大的貢獻。
又，藉由本發明所獲得之組織再生之促進，在組織再生受到抑制之狀況中特別有用，該組織再生受到抑制之狀況是例如伴隨著纖維化等疾病之狀況等。
圖1是顯示對於肝臟部分切除(partial hepatectomy，PH)大鼠之處置的流程圖。
圖2是顯示肝臟部分切除後第5日和第10日所採集之各組肝臟與肝臟部分切除前和切除當時(剛切除時)之肝臟的外觀比較圖。
圖3是顯示所採集之各組肝臟重量的演變的圖表。
圖4是顯示將肝臟部分切除後第5日所採集之肝組織以FITC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)-TUNEL(Terminal deoxynucleotidyltransferasemediated dUTP-biotin nick end labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-生物素切口末端標記法)、α-SMA(α-smooth muscle actin，α平滑肌肌動蛋白)及DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)共同染色的螢光顯微鏡影像的圖。
圖5是顯示將肝臟部分切除後第5日所採集之肝組織以FITC-TUNEL、α-SMA及DAPI共同染色的螢光顯微鏡影像中之α-SMA陽性TUNEL陽性細胞數量的圖。
圖6是顯示將肝臟部分切除後第5日所採集之肝組織以Ki67和DAPI共同染色的螢光顯微鏡影像的圖。
圖7是顯示將肝臟部分切除後第5日所採集之肝組織以Ki67和DAPI共同染色的螢光顯微鏡影像中之Ki67陽性細胞數量的圖。
圖8是顯示將肝臟部分切除後第5日所採集之肝組織以 CD133和DAPI共同染色的螢光顯微鏡影像的圖。
圖9是顯示實施例3中各組所施予處置的概要的圖。
圖10是顯示所採集之各組肝臟外觀與肝臟部分切除當時(第0日)之肝臟的比較圖。
圖11是顯示所採集之各組肝臟重量與肝臟部分切除當時(第0日)之肝臟的比較的圖表。
圖12是顯示肝臟部分切除後的肝組織中之α-SMA陽性細胞的經時變化的圖。
圖13是顯示肝臟部分切除後的肝組織中之α-SMA陽性細胞數量的經時變化的圖。
圖14是顯示靜止型肝臟星狀細胞(上圖)和活性型肝臟星狀細胞(下圖)的顯微鏡影像的圖。
圖15是顯示幹細胞與星狀細胞之接觸共培養中GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落(colony)的顯微鏡影像的圖。
圖16是顯示幹細胞與星狀細胞之接觸共培養中添加EGF和HGF時的GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落的顯微鏡影像的圖。
圖17是顯示幹細胞與星狀細胞之接觸共培養中GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落的數量的圖表。
圖18是顯示幹細胞與星狀細胞之接觸共培養中GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落的面積的圖表。
圖19是顯示幹細胞與星狀細胞之非接觸共培養中GFP/白 蛋白均為陽性之細胞群落的面積的圖表。
圖20是顯示以吸光度來表示幹細胞與星狀細胞之非接觸共培養中GFP/白蛋白均為陽性之細胞數量的增殖情形的圖表。
圖21是顯示肝臟部分切除後之肝組織中的DNA合成之經時變化的顯微鏡影像。
圖22是顯示肝臟部分切除後之肝組織中的BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine，5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷)陽性細胞之比例之經時變化的圖表。
圖23是顯示肝臟部分切除後之肝組織中的DNA合成之經時變化的顯微鏡影像。
圖24是顯示肝臟部分切除後之肝組織中的BrdU陽性細胞之比例之經時變化的圖表。
圖25是顯示將肝細胞與星狀細胞共同培養時之BrdU陽性肝細胞的顯微鏡影像。
圖26是顯示將肝細胞與星狀細胞共同培養時之BrdU陽性肝細胞之比例的圖表。
圖27是顯示將肝細胞培養於經施以各種處理之膠原蛋白上時之BrdU陽性細胞的顯微鏡影像。
圖28是顯示將肝細胞培養於經施以各種處理之膠原蛋白上時之BrdU陽性細胞之比例的圖表。
圖29是顯示將肝細胞與經基因抑制(knockdown)MMP14 及/或HGF之星狀細胞共同培養時之BrdU陽性肝細胞的顯微鏡影像。
圖30是顯示將肝細胞與經基因抑制MMP14及/或HGF之星狀細胞共同培養時之BrdU陽性肝細胞之比例的圖表。
圖31是顯示將肝細胞在RGD胜肽存在下培養於經MMP14處理之膠原蛋白上時之BrdU陽性細胞的顯微鏡影像。
圖32是顯示將肝細胞在RGD胜肽存在下培養於經MMP14處理之膠原蛋白上時之BrdU陽性細胞之比例的圖表。
本發明的一個實施態樣，是關於一種用以促進組織再生之組成物，其中包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
活化之星狀細胞，可以將分離自活體之星狀細胞進行繼代培養(passage culture)而獲得。已知星狀細胞存在於肝臟、胰臟、腎臟、腸道、肺等的各種組織中(Zhao and Burt,J Mol Histol.2007 Mar；38(1)：53-64)，這些組織中的星狀細胞均可利用。星狀細胞的分離，可以採用已知的任意方法來進行。肝臟星狀細胞之分離方法的具體例子，已例示於後述的實施例5的(1)中。活化之星狀細胞的特徵在於α-sMA之表現，可將α-SMA作為標記(marker)來進行篩選。
活化之星狀細胞，可以是經施予下述處置而成之星 狀細胞：使選自由HGF、EGF、MMP14所構成之群組中的蛋白質的表現增加。作為該處置，並無限定，例如可舉出：將編碼有前述蛋白質之基因導入活化之星狀細胞。編碼有HGF、EGF及MMP14之基因已經是習知技術，並且基因之導入方法也在該技術領域中為人熟知。
活化之星狀細胞的分解物，可以藉由將活化之星狀細胞以包括物理性及/或化學性方法在內的各種方法來分解而獲得。分解時，可以使用已知的分解細胞的任意方法，例如：滲透壓衝擊法、冷凍解凍法、界面活性劑之使用、酵素消化法、超音波處理、法式細胞破碎法(French Press)、研缽粉碎、均質機粉碎、玻璃珠粉碎等。分解方法，較佳是不會使蛋白質變性的方法、或是輕度變性的方法。藉由使用該方法，可以獲得在細胞膜上所表現的MMP14而無損於其機能。又，活化之星狀細胞的分解物，較佳是含有細胞膜成分。
MMP14(又稱為MT1-MMP(膜型基質金屬蛋白酶-1，membrane Type 1-metalloproteinase))，是表現在細胞膜上的基質金屬蛋白酶。MMP14可以作用於第一型膠原蛋白(膠原蛋白I)。根據本發明人的研究，闡明了MMP14對於第一型膠原蛋白之作用係與細胞增殖有深切關連。
本發明中的MMP14，不僅包含表現在細胞膜上的MMP14，也包含從細胞膜游離出的MMP14。MMP14可以是天然存在之物，也可以是人工製作之物。從而，MMP14包含重組的MMP14。游離型的MMP14是已知物(例如Jo et al.,Biochem J.2000 Feb 1；345 Pt 3：511-9等)，市面上也有販售 (例如R&D Systems，Cat No.918-MP-010、918-MPN-010等)。MMP14的胺基酸序列及編碼該序列之鹼基序列已經習知(例如，人類MMP14之鹼基序列已登錄為GenBank登錄號(accession number)NM_004995，胺基酸序列已登錄為GenBank登錄號NP_004986。
本發明中的MMP14，亦包含其功能性突變體。MMP14的功能性突變體，並無限定，例如可以舉出下述突變體：(i)於該蛋白質的胺基酸序列上有1個或2個以上、典型而言有1個或數個變異，但仍具有與該蛋白質同等功能的突變體；(ii)藉由具有編碼有該蛋白質之基因之鹼基序列的核酸所編碼、或藉由在與該核酸同樣編碼有相同多肽的核酸的鹼基序列上有1個或2個以上，典型而言有1個或數個變異的核酸所編碼，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(iii)藉由具有編碼有該蛋白質之基因之鹼基序列的核酸、與該核酸同樣編碼有相同多肽的核酸、或編碼有(ii)之突變體的核酸等核酸的互補股(complementary strand)所編碼、或藉由於該些互補股的片段上以嚴苛(stringent)條件進行雜合(hybridize)之核酸所編碼，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(iv)具有與該蛋白質之胺基酸序列有60%以上、較佳是70%以上、進而較佳是80%以上、更佳是90%以上、特佳是95%以上的相同性的胺基酸序列，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(v)藉由與編碼該蛋白質之基因的鹼基序列有60%以上、較佳是70%以上、進而較佳是80%以上、更佳是90%以上、特佳是95%以上的相同性的核酸所編碼，並 且具有與該蛋白質同等功能的突變體等。
發明所屬技術領域中具有通常知識者，可以基於MMP14的序列資訊，藉由已知的任意方法，例如化學合成、藉限制酶切割或插入核酸、導入具有部位專一性的突變、放射線或紫外線之照射等，來適當地製作上述功能性突變體。
某一突變體是否具有與MMP14同等的功能，可以藉由下述來評估：針對MMP14的已知功能(該功能並無特別限定，例如膠原蛋白分解能力等)，藉由已知的任意方法來分析該突變體，與適當的陰性對照、或與作為陽性對照之MMP14進行比較，藉此進行評估。例如，當某一突變體在上述功能方面優於陰性對照時，例如，當優異10%以上、25%以上、50%以上、75%以上、甚至100%以上，及/或該機能是CSABP的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、甚至1/2以上時，該突變體即包含於MMP14的功能性突變體之中。
本說明書中所使用的「嚴苛條件」之用語，是所屬技術領域中所習知的參數，已記載於標準的實驗程序集，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press(2001)、或是Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)等。
本發明中的嚴苛條件，例如是指在65℃中藉由下述雜合緩衝液進行之雜合，該緩衝液是由下述所構成：3.5×SSC(0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH值為7)、Ficoll(聚蔗 糖)0.02%、聚乙烯吡咯啶酮0.02%、牛血清白蛋白0.02%、NaH2PO4 25mM(pH值為7)、SDS 0.05%、EDTA 2mM。雜合之後，將移置有DNA的膜，以2×SSC在室溫中清洗，繼而以0.1~0.5×SSC/0.1×SDS在68℃下的溫度中進行清洗。或者，嚴苛的雜合，也可以使用ExpressHyb(R) Hybridization Solution(Clontech公司)等市售的雜合緩衝液，在製造者所記載之雜合及清洗條件下進行。
雖然有其他可使用的條件、試劑等可以產生同等程度之嚴苛度之結果，但發明所屬技術領域中具有通常知識者理應已熟知該條件，因此對於這些其他條件、試劑等，本說明書中並未特別記載。但是，可以操作條件以便能夠明確地鑑別出編碼有蛋白質突變體的核酸。
本發明中的MMP14及/或其功能性突變體，除了該蛋白質本身或其功能性突變體以外，也包含編碼有該蛋白質或其功能性突變體的核酸。
經MMP14處理之膠原蛋白，可以用MMP14來處理膠原蛋白而獲得。作為膠原蛋白，例如可以使用第一型膠原蛋白。用於處理之MMP14，除了上述MMP14(包含MMP14的功能性突變體)以外，亦可以是表現MMP14的細胞本身、或是含有MMP14的前述細胞的分解物。作為藉由MMP14進行的處理時間，例如，在MMP14可進行作用的溫度中，可以是1~120小時、3~60小時、6~48小時、12~36小時等。經MMP14處理之膠原蛋白，較佳是RGD序列可以與細胞互相作用的狀態。
活化之星狀細胞的分泌物，可以從活化之星狀細胞的培養上清液等之中獲得。培養上清液可以直接使用，也可以藉由透析或冷凍乾燥等方式來濃縮使用。活化之星狀細胞的分泌物中含有各種蛋白質，因此較佳是以不使蛋白質變性的方式來處理。
藉由本發明之組成物來促進再生的組織，並無特別限定，包含全身的各種組織。作為該組織，並無限定，例如可以舉出：存在星狀細胞之組織、發生纖維化之組織、存在幹細胞之組織等。具體而言，並無限定，例如可以舉出：肝臟、胰臟、腎臟、腸道、肺、脾臟、心臟、骨髓、聲帶、皮膚、腹膜、眼、脈管等。
本發明之組成物，對於在創傷組織或移植組織中所發生的組織再生，相當有用。創傷組織包含了受到組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭等的組織。本發明之組成物的投予時期，並無特別限定，較佳是在受到創傷或移植之日起4日以內、或是在受到創傷或移植之日起1日以內進行投予。
藉由本發明之組成物所進行的組織再生，可伴隨著幹細胞之分化及/或增殖。又，藉由本發明之組成物所進行的組織再生，可伴隨著組織實質細胞之增殖。幹細胞之分化，例如可以藉由下述方式來評估：對於分化細胞具專一性的細胞標記之檢測、分化細胞所顯示之功能之檢測等。細胞之增 殖，可以藉由各種已知的方法來評估，例如：經時性的活細胞數之計數；組織之尺寸、體積或重量之測定；DNA合成量之測定；WST-1(water soluble tetrazolium salt-1，水溶性四唑鹽)法；BrdU(5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷)法、3H胸腺嘧啶核苷摻入法等。
本發明之組成物，可使用於具有組織再生受到抑制之狀態的對象。作為組織再生受到抑制之狀態，並無限定，例如包含：發炎、壞死、纖維化、器官衰竭、血小板數量減少、基因異常、正腎上腺素減少等。
本發明之組成物中的有效成分的調配量，當投予組成物時，可以是促進組織再生的量。又，較佳是不發生超過由投予所獲利益之不良影響的量。該量可以是習知，或是藉由使用培養細胞等之體外(in vitro)試驗、或藉由在小鼠、大鼠、犬或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定，這種試驗法已經為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。組織再生之促進，可以藉由採用生化檢查、X光照相、超音波、核磁共振、電腦斷層攝影、內視鏡等之圖像診斷等，來評估組織的功能、重量、大小等之回復情形。有效成分的調配量，可以依據組成物的投藥態樣而變化。例如，當1次投予中採用複數單位的組成物時，調配於1單位的組成物中的有效成分的量，可以設為1次投予中所需的有效成分的量的複數分之一。該調配量的調整，可以由所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。
本發明又關於一種用以促進組織再生之組成物的製造方法，中包含一步驟，該步驟是調配一選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物；本發明並且關於前述成分在用以促進組織再生之組成物的製造上之用途、及用以促進組織再生之前述成分。
關於上述製造方法或用途中的各成分或其調配量，是如同先前所述。各成分的調配，可以依循已知的任意方法來進行。
本發明又關於一種於對象中促進組織再生之方法，其包含一步驟，該步驟是將上述組成物投予至需要該組成物之對象中。本方法中的對象，可以是組織受到創傷、或受到組織移植的對象。前述創傷並無限定，例如包含：組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭。組成物的投予，例如，可以在受到創傷或移植之日起4日以內、或在受到創傷或移植之日起1日以內進行。
本發明又關於一種用於幹細胞之分化及/或增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物；本發明亦關於：一種用於幹細胞之分化及/或增殖之組成物的製造方法，其包含一調配前述成分之步驟；一種前述成分在用於幹細胞之分化及/或增殖之組成物的製造上之用途；一種用於幹細胞之分化及/或增殖之前述成分；及，一種 使幹細胞分化及/或增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使前述成分與幹細胞進行接觸。
幹細胞並無特別限定，例如包含：組織幹細胞(體幹細胞、成體幹細胞)、胚胎幹細胞、iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)等。幹細胞可以是全能性(totipotency)、萬能性(pluripotency)、多能性(multipotency)或單能性(unipotent)。作為組織幹細胞，並無限定，例如可以舉出：神經幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、皮膚幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞等。幹細胞可以是來自本身的幹細胞，也可以是來自同物種之其他個體或異物種之個體的幹細胞。分化及/或增殖之幹細胞，可移植至需要該幹細胞之對象中。
上述方法，可以在體外、體內或離體(ex vivo)進行。關於上述組成物、方法或用途中的各成分或其調配量，是如同先前所述。各成分的調配，可以依循已知的任意方法來進行。當使用MMP14作為上述組成物、方法或用途中的有效成分時，較佳是膠原蛋白(特別是第一型膠原蛋白)存在於作為促進增殖之對象的細胞的周圍。
本發明又關於一種用以促進細胞增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物；本發明亦關於：一種用以促進細胞增殖之組成物的製造方法，其包含一調配前述成分之步驟；一種前述成分在用以促進細胞 增殖之組成物的製造上之用途；一種用以促進細胞增殖之前述成分；及，一種促進細胞增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使前述成分與細胞進行接觸。
促進增殖之細胞，並無限定，例如可以舉出下述部位的細胞：肝臟、胰臟、腎臟、腸道、肺、脾臟、心臟、骨髓、聲帶、皮膚、腹膜、眼、脈管等。細胞可以是來自本身的細胞，也可以是來自同物種之其他個體或異物種之個體的細胞。分化及/或增殖之細胞，可移植至需要該細胞之對象中。
上述方法，可以在體外、體內或離體進行。關於上述組成物、方法或用途中的各成分或其調配量，是如同先前所述。各成分的調配，可以依循已知的任意方法來進行。當使用MMP14作為上述組成物、方法或用途中的有效成分時，較佳是膠原蛋白(特別是第一型膠原蛋白)存在於作為促進增殖之對象的細胞的周圍。
本發明又關於：一種用以抑制細胞增殖之組成物，其包含一阻礙MMP14之物質；一種用以抑制細胞增殖之組成物的製造方法，其包含一調配前述物質之步驟；一種前述物質在用以抑制細胞增殖之組成物的製造上之用途；一種用以抑制細胞增殖之前述物質；及，一種抑制細胞增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使前述物質與細胞進行接觸。
本發明又關於：一種用以處置細胞增殖性疾病之組成物，其包含一阻礙MMP14之物質；一種用以處置細胞增殖性疾病之組成物的製造方法，其包含一調配前述物質之步驟；一種前述物質在用以處置細胞增殖性疾病之組成物的製造上 之用途；一種用以處置細胞增殖性疾病之前述物質；及，一種用以處置細胞增殖性疾病之方法，其包含一步驟，該步驟是將治療有效量之前述物質投予至需要該物質之對象中。
作為阻礙MMP14之物質，並無限定，例如包含：阻礙MMP14之生成及/或活性的藥物、或是促進MMP14之分解及/或失活的藥物等。作為阻礙MMP14之生成的藥物，並無限定，例如可以舉出：對應於編碼有MMP14之DNA的RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸、及表現該等之載體(vector)等。
MMP14之阻礙，可以藉由下述情形來決定：相較於不使MMP14阻礙物質作用時的情形，MMP14的表現或活性在細胞中受到阻礙。MMP14的表現，可以藉由已知的任意方法而不加以限定地進行評估，例如：利用抗MMP14抗體之免疫沉降法；EIA(enzyme immunoassay，酵素免疫分析法)；ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析法)；IRA(immunoradioassay，免疫放射分析)；IRMA(immunoradiometric assay，免疫放射量測定)；西方墨點法；免疫組織化學法；免疫細胞化學法；流動式細胞計數法；利用對於下述物質會專一性地雜合之核酸的各種雜合法，該物質是編碼有MMP14之核酸、或是其特有片段或該核酸的轉錄產物(例如mRNA)或是剪接(splicing)產物；北方墨點法；南方墨點法；各種PCR(polymerase chain reaction，聚合酶連鎖反應)方法等。
在本說明書中使用時，RNAi分子是指會造成RNA 干擾的任意分子，並無限定，包含：siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)、miRNA(micro RNA，微RNA)、shRNA(short hairpin RNA，小髮夾RNA)、ddRNA(DNA-directed RNA，DNA介導之RNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA，Piwi相互作用RNA)、rasiRNA(repeat associated siRNA，重複相關小干擾RNA)等的雙股RNA及這些RNA的變體。這些RNAi分子可使用市售物，也可基於已知的序列資訊等來設計、製作。
又，在本說明書中使用時，反義核酸包含RNA、DNA、PNA、或該等之複合物。
在本說明書中使用時，DNA/RNA嵌合多核苷酸並無限定，例如包含日本專利特開2003-219893號所述之阻礙標的基因表現的由DNA與RNA所構成的雙股多核苷酸。
作為抑制增殖之細胞，並無限定，例如可舉出：其增殖會造成不良影響的細胞、其增殖與疾病有關的細胞等。具體而言，例如可舉出：腫瘤細胞、癌細胞、活化之星狀細胞等。抑制MMP14的物質，可以投予至該些細胞，也可以投予至輔助該些細胞增殖的MMP14表現細胞，例如CAF(癌相關纖維母細胞)等。
作為細胞增殖性疾病，並無限定，例如可舉出：良性或惡性腫瘤、增生、瘢瘤、庫欣氏症候群、原發性皮質醛酮症、紅斑症、紅血球過多症、白斑症、增生性疤痕、扁平苔癬及著色斑等。
本說明書中所述之本發明之各種組成物、方法等之 中，當有效成分是核酸時，例如，是RNAi分子、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸等時，這些核酸可以直接使用裸核酸，亦可使其承載於各種載體。作為載體，可利用下述的習知的任意物：質體載體、噬菌體載體、噬菌質體(phagemid)載體、黏接質體(cosmid)載體、病毒載體等。載體較佳為至少含有增強所承載之核酸的表現的啟動子(promoter)，此時，該核酸較佳為與該啟動子以能夠操作的方式連接。所謂的與該啟動子以能夠操作的方式連接，是意味著使該核酸與啟動子配置為能夠藉由啟動子的作用而適當地生成該核酸所編碼的蛋白質。載體可以是能在宿主細胞內複製、或不能在宿主細胞內複製，又，基因之轉錄可以在宿主細胞的核外進行，也可以在核內進行。後者的情形中，核酸亦可嵌入於宿主細胞的基因體(genome)之中。
又，有效成分也可以承載於各種非病毒性脂質或蛋白質攜帶體上。作為該攜帶體，並無限定，例如可以舉出：膽固醇、微脂體、抗體之原體(protomer)、環狀糊精奈米粒子、融合肽、適體(aptamer)、生物可分解性聚乳酸共聚物、聚合物等，可以提高被攝入細胞內的效率(例如參照Pirollo and Chang,Cancer Res.2008；68(5)：1247-50等)。其中以陽離子性微脂體或聚合物(例如聚乙烯亞胺等)特別有用。作為該攜帶體而言有用的聚合物，其進一步的例示則例如可以舉出如美國專利US 2008/0207553號、US 2008/0312174號申請案等所記載者。
在本說明書所記載之本發明的各種組成物，可以用 於活體內的組織再生、疾病處置等醫療用途。因此，本發明的各種組成物可以作為醫藥組成物。醫藥組成物中，只要不妨礙有效成分的效果，則亦可將有效成分與其他任意成分組合。作為此種任意成分，例如可舉出：其他化學治療劑、藥理學上可容許的攜帶體、賦形劑、稀釋劑等。而且，視投予路徑或藥物釋放形式等而定，亦可將上述組成物以適當的材料被覆，例如以腸溶性的塗覆物、或經時分解性的材料來被覆，或者亦可組合於適當的藥物釋放系統。
在本說明書所記載之本發明的各種組成物(包含各種醫藥組成物)中，可以藉包括經口及非經口之兩者在內的各種路徑來投予，例如，並不受限定而可舉出：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑，並且可以製成適合於各投予路徑的劑型。該劑型及製劑方法，可適當採用任意的習知者(例如參照：標準藥劑學，渡邊喜照等人編輯，南江堂於2003年出版)。
例如，作為適合於經口投予的劑型，並不受限定而可舉出：散劑、顆粒劑、錠劑、膠囊、液劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿等，又，作為適合於非經口投予的劑型，則可舉出溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳濁性注射劑、用時調製型注射劑等注射劑。非經口投予用製劑，可以是移植片、水性或非水性之等張性無菌溶液或懸浮液的形態。
本說明書所記載之本發明的各種組成物(包含各種醫藥組成物)，亦可將特定組織或細胞作為標靶(targeting， 標靶化)。標靶化可以藉由已知的任意方法來達成。在企圖輸送至罹癌處的情形中，並無限定，例如可使用下述方法：藉由將製劑作成適合於表現EPR(enhanced permeability and retention，滲透及滯留增強效應)效應的直徑50~200μm且特別是75~150μm等尺寸而進行的被動標靶(passive targeting)；或是藉由利用CD19、HER2、運鐵蛋白受體、葉酸受體、VIP受體、EGFR(Torchilin,AAPS J.2007；9(2)：E128-47)、RAAG10(日本專利特表2005-532050號)、PIPA(日本專利特表2006-506071)、KID3(日本專利特表2007-529197)等的配體、或具有RGD功能區(motif)和NGR功能區之胜肽、F3、LyP-1(Ruoslahti et al.,J Cell Biol.2010；188(6)：759-68)等作為標靶藥物而進行的主動標靶(active targeting)等。又，因為已知類視色素(retinoid)或其衍生物在作為對癌細胞或CAF之標靶藥物而言很有用(WO 2008/120815)，所以也可以利用含有類視色素作為標靶藥物的攜帶體。該攜帶體，除了上述文獻以外，也記載於WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO2012/170952等。
本說明書所記載之本發明的各種組成物(包含各種醫藥組成物)，雖然可以用任一形態來提供，但從保存安定性的觀點而言，較佳是能夠於使用時調製的形態，例如能夠在醫療現場或附近，由醫師及/或藥師、護理師、或其他醫務人員等進行調製的形態來提供。該形態，在本發明之組成物含有脂質或蛋白質、核酸等難以安定保存的成分時特別有用。此時，本發明之組成物，是以1個或2個以上的容器來 提供，該容器含有本發明之組成物之必要構成要素的至少一個，並且本發明之組成物是在使用之前，例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、以及更佳為正要使用前進行調製。於調製之際，可適當地使用在調製場所中通常可取得的試藥、溶劑、調劑器具等。
因此，本發明，又關於一種組成物的調製套組，其中包含1個或2個以上的容器，該容器是單獨或組合地含有本發明之各種組成物中所能含有的活性成分，本發明亦關於以此種套組之形態來提供的各種組成物的必要構成要素。本發明之套組，除了上述之外，亦可含有記載了關於本發明之各種組成物之調製方法或投予方法等的指示，例如說明書、或CD、DVD等電子記錄媒體等。又，本發明之套組雖然可包含用以完成本發明之各種組成物的全部構成要素，但並不一定需含有全部的構成要素。因此，本發明之套組中，亦可不含有在醫療現場或實驗設施等通常可取得的試藥或溶劑，例如無菌水、生理食鹽水、或葡萄糖溶液等。
本說明書所記載之本發明的各種方法中，所謂的有效量，例如，在關於組織再生方面，是能夠促進組織再生、或消除組織再生延遲情形的量，在關於疾病處置方面，是能夠減輕疾病症狀、或能延遲或停止疾病惡化的量，較佳是抑制或治癒疾病的量。又，較佳是不發生超過由投予所獲利益之不良影響的量。該量可藉由使用培養細胞等之體外試驗、或藉由在小鼠、大鼠、犬或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定，這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知 識者所熟知。又，本發明的處置方法中所使用的藥物的用量，為發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知，或者可以藉由上述試驗等來適當地決定。
本說明書所記載之本發明的處置方法中所投予的有效成分之具體用量，可以考慮關於需要處置之對象的各種條件來決定，該條件是例如：是否有阻礙再生之狀態、症狀的嚴重度、對象的一般健康狀態、年齡、體重、對象的性別、飲食、投予的時期及頻率、所併用的醫藥、對治療的反應性、劑型、及對治療的遵從性等。
作為投予路徑，包括經口及非經口之兩者在內的各種路徑，例如包括：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑。
投予頻率是依照所使用之製劑或組成物的性狀、或者包括上述在內的對象的條件而異，例如可以是1日多次(亦即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每數日(亦即每2、3、4、5、6、7日等)1次、每週1次、每隔數週(亦即每2、3、4週等)1次。
在本說明書中使用的情形中，用語「對象」的意思是任意的生物個體，較佳是動物、更佳是哺乳動物、進而更佳是人類之個體。在本發明中，雖然對象可以是健康者也可以是罹患某種疾病者，但當目的為處置特定疾病時，典型而言意思是已罹患該疾病、或是具有罹患風險的對象。
又，用語「處置」，在本說明書中使用時，是以疾病之 治癒、暫時緩解或預防等為目的，而包含了醫學上所容許之全部種類的預防性及/或治療性之介入。例如，「處置」之用語，包含了各種目的之醫學上可容許之介入，其中包含了疾病惡化的延遲或停止、病變之消退或消失、發病之預防或復發之防止等。
本發明又關於一種細胞培養基材，其中包含經MMP14處理之膠原蛋白。關於經MMP14處理之膠原蛋白，是如同上述關於各種組成物等的地方所說明。
本發明之細胞培養基材，是細胞生育的立足點，可以採用膜狀、凝膠狀等各種形態。細胞培養基材較佳是無菌狀態，但亦可用非無菌狀態來提供而在使用時才滅菌。本發明之細胞培養基材，可以用於被覆細胞培養容器。被覆濃度並無限定，例如可以是膠原蛋白濃度為0.01~1000μg/cm2、0.1~100μg/cm2、1~50μg/cm2、5~25μg/cm2。
又，本發明亦關於一種細胞培養基材製作套組，其中包含經MMP14處理之膠原蛋白、或包含MMP14和膠原蛋白。該套組中，亦可含有一指示，該指示中包含：將經MMP14處理之膠原蛋白使用作為細胞培養基材的資訊、或是以MMP14來處理膠原蛋白的資訊等，例如，該套組中亦可含有說明書、或CD、DVD等電子記錄媒體等。
本發明又關於一種細胞培養容器，該容器被覆有經MMP14處理之膠原蛋白。細胞培養容器可使用已知的任意之物。本發明之細胞培養容器，可以是將經MMP14處理之膠原蛋白被覆於細胞培養容器而製造，也可以是將預先被覆於細 胞培養容器之膠原蛋白以MMP14來處理而製造。用於處理之MMP14，可以附著於細胞膜上，也可以從細胞膜游離出。從而，膠原蛋白之處理，可包括下述方式：在被覆有膠原蛋白之細胞培養容器中，培養會表現MMP14的細胞，例如活化之星狀細胞等。使用於處理膠原蛋白的會表現MMP14之細胞，可以在處理之後去除，也可以直接殘留於細胞培養容器中，並於其中加入增殖之細胞。此細胞培養容器的細胞增殖能力優異，可用以促進細胞培養。又，星狀細胞因為能誘導幹細胞分化，因此，進而包含星狀細胞的細胞培養容器，亦可用於幹細胞之分化誘導。膠原蛋白的被覆濃度，並無限定，例如可以是0.01~1000μg/cm2、0.1~100μg/cm2、1~50μg/cm2、5~25μg/cm2。
又，本發明亦關於一種細胞培養容器之製作套組，該容器被覆有經MMP14處理之膠原蛋白，該套組中包含經MMP14處理之膠原蛋白、或包含MMP14和膠原蛋白。該套組中，亦可含有一指示，該指示中包含：用經MMP14處理之膠原蛋白來被覆細胞培養容器的資訊、或是以MMP14來處理已被覆於細胞培養容器之膠原蛋白的資訊等，例如，該套組中亦可含有說明書、或CD、DVD等電子記錄媒體等。本發明之套組可包含細胞培養容器，亦可另外準備市售的細胞培養容器而使用。
本發明進而關於一種細胞培養容器之製造方法，該容器被覆有經MMP14處理之膠原蛋白，該方法包含下述步驟：用經MMP14處理之膠原蛋白來被覆細胞培養容器的步 驟、或以MMP14來處理已被覆於細胞培養容器之膠原蛋白的步驟。用於處理之MMP14，可以附著於細胞膜上，也可以從細胞膜游離出。從而，以MMP14來處理已被覆於細胞培養容器之膠原蛋白的步驟，包括下述方式：在被覆有膠原蛋白之細胞培養容器中，培養會表現MMP14的細胞，例如活化之星狀細胞等；或者使被覆於細胞培養容器之膠原蛋白與表現MMP14的細胞的分解物互相接觸。
[實施例]
以下述實施例詳細地說明本發明，但該些實施例僅為例示，並非用以限定本發明。
[實施例1]VA-lip siRNA之製備 (1)siRNA之製備
人類HSP47(熱休克蛋白47)，亦即膠原蛋白(第一型~第四型)的共通分子伴侶蛋白，其大鼠同源物為gp46，以gp46(GenBank Accession No.M69246，序列編號1)之鹼基序列為標的之siRNA(北海道System Science公司，札幌，日本)的正義股及反義股，是採用下述之物。
A：GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG(起始於gp46之鹼基序列上的第757個鹼基的正義股siRNA，序列編號2)
B：GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU(反義股siRNA，序列編號3)
siRNA random(又稱為siRNA scramble)，是使用以下之物。
C：CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG(正義股siRNA，序列編號4)
D：GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU(反義股siRNA，序列編號5)
在數個實驗中，使用了由6’-羧基螢光素(6-FAM，6'-carboxy fluorescein)或螢光異硫氰酸鹽(FITC)鍵結於5’末端而成之正義股。這些序列已確認在BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)檢索中與已知的其他大鼠mRNA不具有相同性。
(2)VA-lip siRNA之製備
從北海道System Science公司(札幌，日本)購入以4：3：3的莫耳比含有下述物質的陽離子性微脂粒(Lipotrust)：氯化O,O’-二-四癸醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯)二乙醇胺(DC-6-14)、膽固醇、及二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)。微脂粒，是在使用前，於攪拌條件下將再蒸餾水(DDW，double distilled water)添加至經冷凍乾燥之脂質混合物中，藉此調製成1mM(DC-6-14)的濃度。在25℃中，將溶解於DMSO之200nmol的維生素A(視網醇，Sigma，美國)，與微脂粒懸浮液(DC-6-14為100nmol)一起在1.5ml管中一邊攪拌、一邊混合，而製備VA結合微脂粒。在室溫中，一邊攪拌、一邊將siRNAgp46溶液(在DDW中為580pmol/μl)添加至視網醇結合微脂粒溶液中，而製備承載siRNAgp46之VA結合微脂粒(VA-lip-siRNAgp46)。siRNA與DC-6-14的莫耳比 是1：11.5，又，維生素A、DC-6-14及siRNA的莫耳比是11.5：11.5：1。以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)將VA-lip siRNA復原(reconstitute)，以獲得在體外使用時所期望的用量。
[實施例2]對於肝臟部分切除大鼠投予VA-lip siRNA46所致之對於肝臟再生之影響 (1)肝臟部分切除大鼠之製作及處置
肝臟部分切除大鼠，是藉由將雄性SD大鼠(150~200g)(Slc Japan，靜岡，日本)的相當於肝臟全體之約70%的肝臟左葉及中葉切除，所製作而成。對於該肝臟部分切除大鼠，將實施例1所製作之VA-lip siRNAgp46(實驗組I)、VA-lip siRNAscramble(空白對照(mock control)、實驗組II)、或5%葡萄糖(不含siRNA之對照組，實驗組III)，以300μl/次的容量，隔日且共計5次(亦即在肝臟部分切除後的第1、3、5、7及9日)進行尾靜脈投予(圖1，n=6)。另外，各siRNA，是相對於大鼠體重為0.75mg/kg來使用。
(2)採集組織之評估
在第3次及第5次之投予結束的24小時後(亦即肝臟部分切除後的第5日及第10日)，採集肝臟部分切除大鼠的肝臟。所採集的肝臟，在觀察外觀、測定重量之後，使用OCT冰凍切片包埋劑(Optimal Cutting Temperature compound)進行包埋，而製作冰凍切片。將所獲得之切片以4%聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定，繼而以含5%山羊血清之PBS來施以阻斷(blocking)，以PBS清洗之後，使用Cy3標記 抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Sigma)、抗Ki-67抗體(Dako)或抗CD133抗體，於4℃整夜反應(overnight)。以PBS清洗之後，使用Alexa488標記山羊抗小鼠抗體(Invitrogen)，在室溫中反應60分鐘。以PBS清洗之後，以ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)(含DAPI之抗螢光衰減封片劑)封片，以螢光顯微鏡進行觀察。又，所採集之肝臟冷凍切片的Tunel染色，是使用In situ Apoptosis Detection Kit(Takara Bio，日本)，依循製造者之指示來進行。α-SMA與Tunel的共同染色中，是使用FITC-TUNEL抗體及Cy3標記抗α-SMA抗體。陽性細胞數，是以5個視野(倍率為200倍)的平均值所算出。
(3)結果
圖2中顯示肝臟部分切除後第5日及第10日所採集之各組的肝臟外觀，與肝臟部分切除前及剛切除時之比較。又，圖3中顯示所採集之各組肝臟重量的演變。由此二圖可知，在實驗組II及實驗組III中，肝臟在第5日時已經回復到切除前的大小及重量，但投予VA-lip siRNAgp46的實驗組I中，即使切除後經過10日，肝臟的大小及重量仍未回復。
繼而，將切除後第5日所採集的肝臟組織以FITC-TUNEL、α-SMA及DAPI共同染色，結果明顯可知，在實驗組I中，α-SMA陽性細胞中的TUNEL陽性細胞的數目，顯著多於其他實驗組(圖4及圖5)。此現象表示，活化之肝臟星狀細胞等的α-SMA陽性細胞，藉由VA-lip siRNAgp46 所致之對gp46的抑制，而引起大量的細胞凋亡。
進而，將切除後第5日所採集之肝臟組織以Ki67及DAPI共同染色，結果明顯可知，相較於同樣進行肝臟部分切除的其他實驗組(實驗組II及實驗組III)，實驗組I中的Ki67陽性細胞顯著變少(圖6及圖7)。另外，相較於未進行肝臟部分切除的正常肝臟組織，實驗組II及實驗組III中的Ki67陽性細胞的數目亦顯著較多，Ki67是細胞增殖的標記物，因此顯示出，在肝臟部分切除後，肝臟組織中發生旺盛的細胞增殖情形。
又，將切除後第5日所採集之肝臟組織以CD133及DAPI共同染色，結果明顯可知，相較於同樣進行肝臟部分切除的其他實驗組(實驗組II及實驗組III)，實驗組I中的CD133陽性細胞顯著變少(圖8)。CD133是幹細胞的標記，因此該結果顯示出，藉由VA-lip siRNAgp46，幹細胞之增殖顯著地受到抑制。
若合併考量上述的各染色結果，則顯示出，包括肝臟組織中之幹細胞在內的細胞之增殖，會由於α-SMA陽性細胞的細胞凋亡而受到抑制，反而言之，用於肝臟部分切除後之組織再生的肝臟組織中之細胞增殖方面，且特別是幹細胞之增殖方面，α-SMA陽性細胞是不可或缺的。
[實施例3]對於肝臟部分切除大鼠投予VA-lip siRNA46之時期對於肝臟再生之影響 (1)肝臟部分切除大鼠之製作及處置
與實施例2同樣地進行而製作肝臟部分切除大鼠。於該 肝臟部分切除大鼠中，施以下述處置(圖9)。
A組：無處置(無處置對照組)
B組：5%葡萄糖(溶劑對照組)
C組：VA-lip siRNAscramble(空白對照(mock control)組)
D組：VA-lip siRNAgp46(實驗組)
E組：VA-lip siRNAgp46(延遲投予組)(各組均為n=4)
VA-lip siRNAgp46及VA-lip siRNAscramble，是使用實施例1中所製作者。B~D組，是將各自的投予物以300μl/次的容量，隔日且共計6次(亦即在肝臟部分切除後的第0、2、4、6、8及10日)進行尾靜脈投予，E組則是共計4次(亦即在肝臟部分切除後的第4、6、8及10日)進行尾靜脈投予。另外，各siRNA，是相對於大鼠體重為0.75mg/kg來使用。
(2)採集組織之評估
在第6次(E組中則是第4次)投予結束之24小時後(亦即肝臟部分切除後的第11日)，採集肝臟部分切除大鼠的肝臟。所採集的肝臟，在觀察外觀、測定重量之後，使用OCT冰凍切片包埋劑進行包埋，而製作冰凍切片。將所獲得之切片以4%聚甲醛固定，繼而以含5%山羊血清之PBS來施以阻斷，以PBS清洗之後，使用Cy3標記抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Sigma)，於4℃整夜反應。以PBS清洗之後，以ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)封片，以螢光顯微鏡進行觀察。
(3)結果
圖10及圖11中分別顯示：前述(2)中所採集之各組的肝臟外觀及重量，與剛進行肝臟部分切除(第0日)時之肝臟之比較。由此二圖可知，在A~C及E組中，肝臟已經回復到切除前的大小及重量，但在從第0日起即投予VA-lip siRNAgp46的D組中，即使切除後經過11日，肝臟的大小及重量仍未回復。又，從第4日起投予相同用量之VA-lip siRNAgp46的E組中可確認到肝臟大小及重量之回復情形，可明顯得知，VA-lip siRNAgp46應該在組織再生的早期階段即進行投予。
[實施例4]肝臟部分切除後之肝臟組織中之α-SMA陽性細胞數的經時變化 (1)肝臟部分切除大鼠之製作及採集組織之評估
與實施例2同樣地進行而製作肝臟部分切除大鼠。在肝臟部分切除後第0、1、2、3、4、5或6日，從肝臟部分切除大鼠上採集肝臟。將所採集的肝臟使用OCT冰凍切片包埋劑進行包埋，而製作冰凍切片。將所獲得之切片以4%聚甲醛固定，繼而以含5%山羊血清之PBS來施以阻斷，以PBS清洗之後，使用Cy3標記抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Sigma)，於4℃整夜反應。以PBS清洗之後，以ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)封片，以螢光顯微鏡進行觀察。
(2)結果
由圖12及圖13所示之結果可知，α-SMA陽性細胞的數 目在肝臟部分切除後第3日急遽地增加，之後則緩緩地減少。若考慮到實施例2~3之結果、以及若星狀細胞活化則會表現α-SMA之情形，則前述結果暗示：在組織再生的早期階段，存在於組織中的星狀細胞會活化而引起用於組織再生之細胞增殖情形。
[實施例5]星狀細胞與幹細胞分化之關連 (1)細胞之製備
作為星狀細胞，是使用採集自SD大鼠肝臟之肝臟星狀細胞。亦即，首先於SD大鼠中灌流EGTA溶液(ethyleneglycol bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid，乙二醇雙(2-胺基乙醚)四乙酸)及膠原蛋白酶溶液之後，採集肝臟，將採集之肝臟細切之後，以細胞篩網(孔徑100μm)過濾。於所獲得之細胞懸浮液中添加HBSS(Hank's Balanced Salt Solution，Hank平衡鹽溶液)+0.25%BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)溶液，以4℃、500rpm離心2分鐘。採集上清液，以4℃、1300rpm離心5分鐘。去除上清液之後，加入HBSS+0.25%BSA溶液，並以使Nycodenz(碘海醇)之濃度成為13.2%之方式加入28.7%之Nycodenz溶液(Axis Shield，奧斯陸，挪威)而混合。疊加HBSS+0.25%BSA溶液之後，以4℃、1400×g離心20分鐘。離心結束後，採集中間層，使用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)+10%胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)培養基來進行培養。將培養第1日的細胞作為靜止型肝臟星狀細胞(qHSC)，並且於培養第5日進行繼代培養，將進而培養2日的細胞作為活性型肝臟星 狀細胞(aHSC)(圖14)。
作為幹細胞，是使用採集自4週齡之GFP(green fluorescent protein，綠色螢光蛋白)基因轉殖大鼠(Slc Japan)之肝臟的肝臟幹細胞。首先，於GFP基因轉殖大鼠中灌流EGTA溶液及膠原蛋白溶液，之後採集肝臟，將採集之肝臟細切之後，以細胞篩網(孔徑100μm)過濾。於所獲得之細胞懸浮液中添加Hank平衡鹽溶液(HBSS)+0.25%牛血清白蛋白(BSA)溶液，以4℃、500rpm離心2分鐘。採集上清液，以4℃、1300rpm離心5分鐘。去除上清液之後，對於沈澱物添加MACS(R)(Magnetic Activating Cell Sorting，磁性活化細胞分離)緩衝液(Miltenyi Biotec，奧本，加州，美國)並混合。計算細胞數之後，使用FITC標記小鼠抗CD45抗體(BD Pharmingen)、兔抗CD133多株(polyclonal)抗體(Abcam)及小鼠抗EpCAM單株(monoclonal)抗體(Santa Cruz)來進行MACS(R)，採集CD133陽性、EpCAM陽性、CD45陰性細胞，作為大鼠肝臟幹細胞來使用於本實驗中。
(2)幹細胞與星狀細胞之接觸共培養
在置入經被覆第一型膠原蛋白之蓋玻片(IWAKI，東京，日本)的6孔盤中，以5×104個/孔的密度接種上述(1)所獲得之aHSC，於細胞培養箱中以37℃、5%CO2培養48小時。於接種aHSC的2日之後，於孔中之aHSC上以3×104個/孔的密度來接種上述(1)所獲得之肝臟幹細胞，於細胞培養箱中以37℃、5%CO2共同培養9日(作為培養基，是使用DME/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham)+10%FBS+ITS(10mg/l胰島素、5.5mg/l運鐵蛋白、0.67μg/l硒)+0.1μM地塞米松(dexamethasone)+10mM菸鹼醯胺+50μg/ml β-巰乙醇+2mM L-麩醯胺酸+5mM Hepes)。依據條件而在共同培養開始時添加20ng/ml之EGF及/或50ng/ml之HGF。又，作為對照組，在不存在aHSC的狀態下以同樣的方式而僅培養肝臟幹細胞。
在共同培養的第9日，以肝臟幹細胞標記物亦即對於白蛋白之抗體(兔多株抗體，MP Biomedicals)來進行免疫染色，使用倒裝顯微鏡(Nikon)並以100倍之倍率來拍攝GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落，基於所獲得之影像來計算GFP/白蛋白均為陽性之細胞群落數，並且使用NIS-Elements software(Nikon)來計算面積(圖15~18)。
(3)幹細胞與星狀細胞之非接觸共培養
在細胞培養小杯(cell culture insert)(孔徑0.4μm，BD Falcon，富蘭克林湖，紐澤西，美國)上以5×104個/孔的密度來接種上述(1)所獲得之aHSC，使用DMEM+10%FBS於細胞培養箱中以37℃、5%CO2培養48小時。於接種aHSC的2日之後，在置入經被覆第一型膠原蛋白之蓋玻片(IWAKI，東京，日本)的24孔盤(BD Falcon)中，以1×104個/孔的密度接種上述(1)所獲得之肝臟幹細胞。繼而，將包含aHSC的上述細胞培養小杯插入24孔盤的孔中，於細胞培養箱中以37℃、5%CO2共同培養10日(作為培養基，是使用DME/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham)+10%FBS+ITS(10mg/l胰島素、5.5mg/l運鐵蛋白、0.67μg/l硒)+0.1μM地塞米松+10mM菸鹼醯胺+50μg/ml β-巰乙醇+2mM L-麩醯胺酸+5mM Hepes)。又，作為對照組，在不存在aHSC的狀態下以同樣的方式而僅培養肝臟幹細胞。
在共同培養的第10日，以抗白蛋白抗體(兔多株抗體，MP Biomedicals)進行免疫染色，使用倒裝顯微鏡(Nikon)並以100倍之倍率來拍攝白蛋白陽性之細胞群落，基於所獲得之影像並使用NIS-Elements software(Nikon)來計算白蛋白陽性之細胞群落的面積(圖19)。
在其他實驗中，在共同培養的第10日，使用Premix WST-1 細胞增殖分析系統(Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System)(Takara，東京，日本)，並且使用(Bio-Rad Laboratories，赫克力斯(Hercules)，加州，美國)來進行細胞增殖之測定(圖20)。
(4)結果
由圖15~圖18所示之接觸共培養實驗的結果明顯可知，藉由將肝臟幹細胞與活性型肝臟星狀細胞共同培養，會發生肝臟幹細胞分化為肝細胞及增殖的情形。又，明顯可知，肝臟幹細胞朝肝細胞之分化、增殖，會藉由EGF及HGF之添加而顯著地受到促進。
由圖19及圖20所示之非接觸共培養實驗的結果則明顯 可知，活性型肝臟星狀細胞即便在不與肝臟幹細胞接觸的狀態下，亦會誘導肝臟幹細胞朝肝細胞之分化、增殖。
這些結果顯示，活性型肝臟星狀細胞所分泌的體液因子(humoral factor)會誘導肝臟幹細胞朝肝細胞之分化、增殖。
[實施例6]肝臟部分切除後之肝組織中的DNA合成之經時變化 (1)BrdU陽性細胞之經時變化
與實施例2同樣地進行而製作肝臟部分切除大鼠。對於大鼠，以100μg/g體重的濃度將BrdU注射至腹腔內，以便調查肝臟部分切除後之肝臟內的DNA合成之經時變化。於投予BrdU的第3小時，採集肝臟組織。所採集之肝臟組織，以10%福馬林固定，並以石蠟包埋。將石蠟包埋之肝臟組織作成5μm厚的切片，使用10mM之檸檬酸緩衝液，於120℃進行活化20分鐘之後，使用5%山羊血清進行阻斷。阻斷後，以小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)於37℃反應60分鐘。以PBS清洗切片之後，以Alexa488標記之山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)於37℃反應60分鐘。以PBS清洗之後，使用含有DAPI之封片劑進行封片，觀察肝臟組織內的BrdU攝入情形。結果顯示於圖21。
對於經施以肝臟部分切除之大鼠，以100μg/g體重的濃度將BrdU注射至腹腔內，以便測定在大鼠肝臟部分切除後之肝組織內進行DNA合成的細胞的比例。於投予BrdU的第3小時，由門脈灌流0.03%膠原蛋白酶溶液，之後採集肝臟組織並加以細切，獲得細胞懸浮液。將此細胞懸浮液以含有 0.25%BSA之Hank溶液(Invitrogen)來調整以使細胞濃度成為1×107個/100μl，加入APC標記小鼠抗BrdU單株抗體(BioLegends)，於37℃反應60分鐘。反應結束後，使用流動式細胞儀來計測BrdU陽性細胞數。結果顯示於圖22。圖中，大鼠肝臟部分切除後的肝臟內之BrdU陽性細胞的比例，是表示BrdU陽性細胞數除以流動式細胞儀所分析之全部細胞數而獲得的比例。
由圖21及圖22所示之結果可知，肝臟經部分切除後，肝組織內的DNA合成情形會雙峰性地增加。亦即，在切除的1日後會有最初的波峰，在2日後會稍微平息，在3日後會再度增加，4日後則緩緩地降低。
(2)BrdU陽性肝細胞之經時變化
與實施例2同樣地進行而製作肝臟部分切除大鼠。對於大鼠，以100μg/g體重的濃度將BrdU注射至腹腔內，以便調查肝臟部分切除後之肝臟內的肝細胞中之DNA合成之經時變化。於投予BrdU的第3小時，採集肝臟組織。所採集之肝臟組織，以10%福馬林固定，並以石蠟包埋。將石蠟包埋之肝臟組織作成5μm厚的切片，使用10mM之檸檬酸緩衝液，於120℃進行活化20分鐘之後，使用5%山羊血清進行阻斷。阻斷後，以APC標記小鼠抗BrdU單株抗體(BioLegends)及山羊抗HFN4α抗體(Santa Cruz)於37℃反應60分鐘。以PBS清洗切片之後，以Alexa488標記之綿羊抗山羊IgG(Invitrogen)於37℃反應60分鐘。以PBS清洗之後，使用 含有DAPI之封片劑進行封片，觀察肝臟組織內之肝細胞所進行的BrdU攝入情形。結果顯示於圖23。
對於經施以肝臟部分切除之大鼠，以100μg/g體重的濃度將BrdU注射至腹腔內，以便測定在大鼠肝臟部分切除後之肝組織內進行DNA合成的肝細胞的比例。於投予BrdU的第3小時，由門脈灌流0.03%膠原蛋白酶溶液，之後採集肝臟組織並加以細切，獲得細胞懸浮液。將此細胞懸浮液以含有0.25%BSA之Hank溶液(Invitrogen)來調整以使細胞濃度成為1×107個/100μl，加入APC標記小鼠抗BrdU單株抗體(BioLegends)及山羊抗HFN4α抗體(Santa Cruz)於37℃反應60分鐘。以PBS清洗之後，以Alexa488標記之綿羊抗山羊IgG(Invitrogen)於37℃反應60分鐘。反應結束後，使用流動式細胞儀來計測BrdU陽性且HFN4α陽性之細胞數。結果顯示於圖24。圖中，大鼠肝臟部分切除後的肝臟內之BrdU陽性肝細胞的比例，是表示BrdU陽性肝細胞數除以流動式細胞儀所分析之全部肝細胞數而獲得的比例。
由圖23及圖24所示之結果可知，肝細胞之增殖會在肝臟部分切除的1日後達到波峰，之後緩緩地減少。包括肝細胞在內的存在於肝臟中的全部細胞之增殖，係如圖21及圖22所示，在肝臟部分切除後的1日後與3日後具有2個波峰，其中，1日後的最初的波峰被認為是以肝細胞之增殖為主體，3日後的第二個波峰則被認為是由肝細胞以外的細胞(例如，幹細胞等)的增殖所致。
[實施例7]肝細胞增殖與星狀細胞之關連 (1)肝細胞與星狀細胞之共同培養
進行肝細胞與星狀細胞之共同培養，以便評估星狀細胞對於肝細胞增殖所賦予的影響。將實施例5所獲得之aHSC以1×105個的濃度接種於60mm培養皿中，使用加入10%FBS之DMEM，以37℃、5%CO2培養24小時。於培養後第24小時去除培養基，加入Opti-MEM I還原培養基(Opti-MEM I reducing medium)(Invitrogen)，培養至siRNA轉染(transfection)的準備工作完成前為止。使siRNA以最終濃度成為10nM的方式與RNAiMAX(Invitrogen)混合，於室溫靜置15分鐘，而獲得siRNA複合物。所使用的siRNA係如下所述。
GFP siRNA(Ambion，Silencer GFP siRNA，Cat.No.AM4626)Scramble siRNA：如實施例1所記載
gp46 siRNA：如實施例1所記載
將siRNA複合物添加至經預培養(preculture)之aHSC，以37℃、5%CO2培養5小時。於培養後第5小時，將培養基置換為添加10%FBS之DMEM，以37℃、5%CO2培養48小時。於培養後第48小時，去除培養基，加入Opti-MEM I reducing medium，預培養至siRNA轉染的準備工作完成前為止。使siRNA(GFP siRNA、Scramble siRNA、gp46 siRNA)以最終濃度成為10nM的方式與RNAiMAX混合，於室溫靜置15分鐘。將siRNA複合物添加至經預培養之aHSC，以37℃、5%CO2培養5小時。於培養後第5小時，去除培養基，以PBS清洗之後，使用胰蛋白酶-EDTA溶液來回收HSC。
對於預先採集自GFP基因轉殖大鼠肝臟且以5×104個的濃度接種於經被覆第一型膠原蛋白之35mm培養皿中而成之肝細胞，以5×104個/盤的濃度來加入前述回收之HSC，以37℃、5%CO2培養48小時。於培養後第48小時，將培養基置換為含有10mM BrdU及10%FBS的DME/F12培養基，以37℃、5%CO2進而培養24小時。於培養後第24小時，去除培養基，以PBS清洗後，加入4%PFA，於室溫固定30分鐘。固定後，以PBS清洗，加入含有0.2N HCl及0.1%Triton X-100的PBS，進行穿透處理。
(2)螢光顯微鏡下之觀察
以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後以5%山羊血清進行阻斷，加入小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)及兔抗GFP多株抗體(Invitrogen)，於37℃進行一級抗體(primary antibody)反應60分鐘。一級抗體反應後，以PBS清洗，加入Alexa488標記山羊抗兔IgG(Invitrogen)及Alexa555標記山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)，於37℃進行二級抗體(secondary antibody)反應60分鐘。二級抗體反應後，以PBS清洗，使用含有DAPI之封片劑將細胞進行封片。螢光顯微鏡影像顯示於圖25。
(3)FACS分析
為了測定BrdU陽性且GFP陽性之肝細胞的比例，以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後加入APC標記小鼠 抗BrdU單株抗體及FITC標記兔抗GFP多株抗體，於37℃進行抗體反應60分鐘。抗體反應結束後，以PBS清洗細胞，藉由FACS分析來測定BrdU陽性且GFP陽性之肝細胞的比例。結果顯示於圖26。BrdU陽性細胞的比例，是表示BrdU陽性細胞數除以流動式細胞儀所分析之全部細胞數而獲得的比例。
由圖25及圖26所示之結果可知，若肝細胞與aHSC共同培養，則肝細胞增殖情形會高於單獨培養肝細胞時的情形，但若使gp46 siRNA作用於aHSC，則該效果會受到抑制。這些結果顯示，aHSC與肝細胞之增殖有關連。
[實施例8]施以各種處理之膠原蛋白對於肝細胞增殖之影響 (1)於施以各種處理之膠原蛋白上的肝細胞培養情形
以10μg/cm2的濃度將源自大鼠尾部之膠原蛋白I(Sigma)被覆於60mm培養皿。變性膠原蛋白I，是將源自大鼠尾部之膠原蛋白I以60℃處理30分鐘，再以10μg/cm2的濃度被覆於60mm培養皿。經MMP14處理之膠原蛋白I，是使用含有活性型MMP14(R & D System)的反應液(0.1μg/ml胰蛋白酶3(Recombinant Human Active Trypsin3，R&D systems，Cat.No.3714-SE)、50mM Tris、0.15M NaCl、10mM CaCl2、5μM ZnCl2、0.05%(v/v)Brij35，pH7.5)，使源自大鼠尾部之膠原蛋白I在室溫中反應20小時。反應結束後，以10μg/cm2的濃度將經MMP14處理之膠原蛋白I被覆於60mm培養皿。從大鼠肝臟採集肝細胞，以2×105個/盤的濃度接種，以37℃、 5%CO2培養48小時。於培養後第48小時，將培養基置換為含有10μM BrdU及10%FBS的DME/F12培養基，以37℃、5%CO2進而培養24小時。於培養後第24小時，去除培養基，以PBS清洗後，加入4%PFA，於室溫固定30分鐘。固定後，以PBS清洗，加入含有0.2N HCl及0.1%Triton X-100的PBS，進行穿透處理。
(2)螢光顯微鏡下之觀察
以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後以5%山羊血清進行阻斷，加入小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)及兔抗GFP多株抗體(Invitrogen)，於37℃進行一級抗體反應60分鐘。一級抗體反應後，以PBS清洗，加入Alexa488標記山羊抗兔IgG(Invitrogen)及Alexa555標記山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)，於37℃進行二級抗體反應60分鐘。二級抗體反應後，以PBS清洗，使用含有DAPI之封片劑將細胞進行封片。螢光顯微鏡影像顯示於圖27。
(3)FACS分析
為了測定BrdU陽性肝細胞的比例，以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後加入APC標記小鼠抗BrdU單株抗體，於4℃進行抗體反應30分鐘。抗體反應結束後，以PBS清洗細胞，藉由FACS分析來測定BrdU陽性肝細胞的比例。結果顯示於圖28。BrdU陽性細胞的比例，是表示BrdU陽性細胞數除以流動式細胞儀所分析之全部細胞數(3×104個)而 獲得的比例。
由圖27及圖28所示之結果可知，相較於經未處理之膠原蛋白I被覆之培養皿，在經變性膠原蛋白I及經MMP處理之膠原蛋白I被覆的培養皿中，肝細胞之增殖受到促進。HSC中，有具有膠原蛋白酶活性之MMP14表現，因此上述結果暗示，由HSC所致之促進肝細胞增殖的原因之一，係與HSC所表現之MMP14的對於膠原蛋白之作用有關連。
[實施例9]aHSC中的MMP14之表現對於肝細胞增殖之影響 (1)肝細胞與星狀細胞之共同培養
進行肝細胞與星狀細胞之共同培養，以便評估星狀細胞對於肝細胞增殖所賦予的影響。將實施例5所獲得之aHSC以1×105個的濃度接種於60mm培養皿中，使用加入10%FBS之DMEM，以37℃、5%CO2培養24小時。於培養後第24小時去除培養基，加入Opti-MEM I reducing medium(Invitrogen)，培養至siRNA轉染的準備工作完成前為止。使siRNA以最終濃度成為10nM的方式與RNAiMAX(Invitrogen)混合，於室溫靜置15分鐘，而獲得siRNA複合物。所使用的siRNA係如下所述。
GFP siRNA(Ambion，Silencer GFP siRNA，Cat.No.AM4626)MMP14 siRNA：
正義股：5’-GCUCAUUCAUGGGUAGCGATT-3’(序列編號6)
反義股：5’-UCGCUACCCAUGAAUGAGCCT-3’(序列編號7)
HGF siRNA：
正義股：5’-AUAUCUUUCCGGCAAGAAUUUGUGC-3’(序列 編號8)
反義股：5’-GCACAAAUUCUUGCCGGAAAGAUAU-3’(序列編號9)
將siRNA複合物添加至經預培養之aHSC，以37℃、5%CO2培養5小時。於培養後第5小時，將培養基置換為添加10%FBS之DMEM，以37℃、5%CO2培養48小時。於培養後第48小時，去除培養基，加入Opti-MEM I reducing medium，預培養至siRNA轉染的準備工作完成前為止。使siRNA(GFP siRNA、MMP14 siRNA、HGF siRNA)以最終濃度成為10nM的方式與RNAiMAX混合，於室溫靜置15分鐘。將siRNA複合物添加至經預培養之aHSC，以37℃、5%CO2培養5小時。於培養後第5小時，去除培養基，以PBS清洗之後，使用胰蛋白酶-EDTA溶液來回收HSC。
對於預先採集自GFP基因轉殖大鼠肝臟且以5×104個的濃度接種於經被覆第一型膠原蛋白之35mm培養皿中而成之肝細胞，以5×104個/盤的濃度來加入前述回收之HSC，以37℃、5%CO2培養48小時。於培養後第48小時，將培養基置換為含有10mM BrdU及10%FBS的DME/F12培養基，以37℃、5%CO2進而培養24小時。於培養後第24小時，去除培養基，以PBS清洗後，加入4%PFA，於室溫固定30分鐘。固定後，以PBS清洗，加入含有0.2N HCl及0.1%Triton X-100的PBS，進行穿透處理。
(2)螢光顯微鏡下之觀察
以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後以5%山羊血清進行阻斷，加入小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)及兔抗GFP多株抗體(Invitrogen)，於37℃進行一級抗體反應60分鐘。一級抗體反應後，以PBS清洗，加入Alexa488標記山羊抗兔IgG(Invitrogen)及Alexa555標記山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)，於37℃進行二級抗體反應60分鐘。二級抗體反應後，以PBS清洗，使用含有DAPI之封片劑將細胞進行封片。螢光顯微鏡影像顯示於圖29。
(3)FACS分析
為了測定BrdU陽性GFP陽性肝細胞的比例，以PBS清洗上述(1)中經穿透處理之細胞，之後加入APC標記小鼠抗BrdU單株抗體和FITC標記兔抗GFP多株抗體，於4℃進行抗體反應30分鐘。抗體反應結束後，以PBS清洗細胞，藉由FACS分析來測定BrdU陽性GFP陽性肝細胞的比例。結果顯示於圖30。BrdU陽性細胞的比例，是表示BrdU陽性細胞數除以流動式細胞儀所分析之全部細胞數而獲得的比例。
由圖29和圖30所示之結果可知，aHSC所致之肝細胞增殖促進情形，係與aHSC所表現之MMP14有關，其幫助的程度會提升HGF，該HGF已知為促進肝細胞增殖之關鍵因素。
[實施例10]經MMP14處理之膠原蛋白上的RGD序列對於肝細胞增殖之影響
將預先採集自GFP基因轉殖大鼠肝臟的大鼠肝細胞，以 2×105個/ml的濃度接種於DME/F12培養基中，加入不同濃度的胜肽(對照肽(control peptide)(H-Gly-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-OH，Peptides International，Cat.No.PFA-3907-PI)：500μg/ml；GRGDS肽(胜肽研究所，Cat.No.4189-v)：100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml)，於37℃反應30分鐘。將反應結束後的大鼠肝細胞，以5×104個/盤的濃度接種於經被覆以MMP14處理而成之第一型膠原蛋白之35mm培養皿中，在含有10mM BrdU及10%胎牛血清的DME/F12培養基中，以37℃、5%CO2培養72小時。培養結束後，去除培養基，以PBS清洗後，加入4%PFA，於室溫固定30分鐘。固定後，以PBS清洗，加入含有0.2N HCl及0.1%Triton X-100的PBS，進行穿透處理。
以PBS清洗後，以5%山羊血清進行阻斷，加入小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)及兔抗GFP多株抗體(Invitrogen)，於37℃進行一級抗體反應60分鐘。一級抗體反應後，以PBS清洗，加入Alexa488標記山羊抗兔IgG(Invitrogen)及Alexa555標記山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)，於37℃進行二級抗體反應60分鐘。二級抗體反應後，以PBS清洗，使用含有DAPI之封片劑將細胞進行封片。螢光顯微鏡影像顯示於圖31。增殖細胞的比例，是表示BrdU陽性細胞數除以所計算之全部細胞數而獲得的比例(圖32)。
由圖31及圖32所示之結果可知，aHSC所致之肝細胞增殖促進情形，係與RGD序列有關。此結果暗示，藉由aHSC所表現之MMP14的作用而曝露出的膠原蛋白I之RGD序列， 與肝細胞增殖促進情形有關。
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<212> DNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 1
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gp46 siRNA正義股
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gp46 siRNA反義股
<400> 3
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<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA random正義股
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<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA random反義股
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<223> MMP14 siRNA正義股
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<212> DNA
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<220>
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<223> HGF siRNA正義股
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<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HGF siRNA反義股
<400> 9

Claims (19)

  1. 一種用以促進組織再生之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、基質金屬蛋白酶14(MMP14)、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
  2. 如請求項1所述之組成物，其中，組織再生是發生在創傷組織或移植組織中。
  3. 如請求項2所述之組成物，其係在受到創傷或移植之日起4日以內進行投予。
  4. 如請求項2所述之組成物，其係在受到創傷或移植之日起1日以內進行投予。
  5. 如請求項2~4中任一項所述之組成物，其中，創傷是選自由下述所構成之群組：組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭。
  6. 如請求項1~5中任一項所述之組成物，其中，組織再生會伴隨著組織幹細胞之分化及/或增殖。
  7. 如請求項1~6中任一項所述之組成物，其中，組織再生會伴隨著組織實質細胞之增殖。
  8. 如請求項1~7中任一項所述之組成物，其中，活化之星狀細胞是經施以使蛋白質之表現增加的處置而成，該蛋白質選自由下述所構成之群組：肝細胞生長因子、表皮細胞生長因子、MMP14。
  9. 如請求項1~8中任一項所述之組成物，其係使用於具有組織再生受到抑制之狀態的對象。
  10. 如請求項9所述之組成物，其中，組織再生受到抑制之狀態是選自由下述所構成之群組：發炎、壞死、纖維化、器官衰竭、血小板數量減少、基因異常、正腎上腺素減少。
  11. 一種於對象中促進組織再生之方法，其包含一步驟，該步驟是將如請求項1~10中任一項所述之組成物，投予至需要該組成物之對象中。
  12. 一種用於幹細胞之分化及/或增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
  13. 一種使組織幹細胞分化及/或增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使一成分與幹細胞進行接觸，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
  14. 一種用以促進細胞增殖之組成物，其包含一成分，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
  15. 一種促進細胞增殖之方法，其包含一步驟，該步驟是使一成分與細胞進行接觸，該成分是選自由下述所構成之群組中的成分：活化之星狀細胞、活化之星狀細胞的分解物、MMP14、經MMP14處理之膠原蛋白、及活化之星狀細胞的分泌物。
  16. 一種用以抑制細胞增殖之組成物，其包含一阻礙MMP14之物質。
  17. 如請求項16所述之組成物，其中，該阻礙MMP14之物質所作用的細胞是癌相關纖維母細胞及/或腫瘤細胞。
  18. 一種細胞培養基材，其包含經MMP14處理之膠原蛋白。
  19. 一種細胞培養容器，該容器被覆有經MMP14處理之膠原蛋白。
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