CN116042517A - 间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用 - Google Patents

间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，外泌体为miR‑146a，miR‑146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞胰岛素的分泌功能；以及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用、一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用和一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用。

Description

间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus)是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。在中国成年人中，糖尿病的总体患病率估计为10.9％，前驱糖尿病的患病率为35.7％。在糖尿病患者中，以2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)为主，占90％以上。2型糖尿病是指由于遗传和(或)环境因素引起胰岛素分泌不足和(或)胰岛素抵抗(机体对胰岛素敏感性下降，不能有效利用)，导致血糖水平增高的一种慢性病。生活方式和环境的显著变化已使T2DM成为全球健康问题。
人类的胰岛细胞包括胰岛A细胞(α细胞)和胰岛B细胞(β细胞)，α细胞约占胰岛细胞的20％，分泌胰高血糖素(glucagon)，胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，能够使血糖明显升高；β细胞占胰岛细胞的60％-70％，分泌胰岛素(insulin)，胰岛素是机体内唯一能够降低血糖的激素。β细胞去分化是一种解释功能性β细胞丧失的新机制，即正常胰岛β细胞褪去成熟细胞的特征和功能，退化成具有多分化潜能的前体细胞，或适应逆向分化为其他类型的细胞，进而丧失部分或全部胰岛素分泌能力的现象。胰岛β细胞“去分化”程度越高，胰岛素的分泌功能下降越明显。在去分化过程中，β细胞不发生凋亡，而是随着关键β细胞标志物表达的减少而丧失原有成熟β细胞的身份，转变为表达神经元素3(NGN3)和八聚体结合蛋白-4(OCT4))等转录因子的内分泌前体细胞。
干细胞具有独特的生物学特性、极强的自我更新能力、多向分化潜能以及分泌多种细胞因子等特性，是实现胰岛再生的最佳种子细胞。干细胞治疗能够使部分糖尿病患者停用胰岛素治疗或减少胰岛素用量，其治疗糖尿病的有效性及安全性也得到了有效验证。外泌体(Exosome,EXO)是细胞分泌的细胞外纳米颗粒，含有生物活性分子，包括蛋白质、脂质和核酸。参与糖尿病葡萄糖代谢的外泌体引起了人们的关注。研究发现，脂肪来源的外泌体可以将miR-99b转移到肝细胞中，从而调节成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的表达并参与葡萄糖代谢。还有研究已经发现心肌细胞来源的外泌体可以直接将GLUT蛋白和糖酵解酶转移到内皮细胞来调节葡萄糖转运。这些研究表明，携带活性成分的外泌体可能是介导MSC在糖尿病中的治疗效果的关键因子。有证据表明，外泌体比其他纳米粒子具有更多优势，可能是糖尿病治疗的潜在的“智能”纳米医学。
目前，国内外诸多研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)可以改善2型糖尿病胰岛功能并增强胰岛素分泌，然而，关于MSC的具体作用目前研究比较缺乏。间充质干细胞外泌体对胰岛β细胞去分化的作用还未曾研究，获得一种逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的骨髓间充质干细胞外泌体，来促进2型糖尿病胰岛功能，提高糖尿病治疗效果具有重要意义。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。
为此，本公开第一方面提供了一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。在2型糖尿病患者中，部分功能性β细胞可能出现功能丧失，从而导致胰岛素分泌不足，β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。因此，间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用中具有良好的前景，将间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a应用于制备治疗2型糖尿病药物中时，能够改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述外泌体为骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够通过提取骨髓间充质干细胞分泌的外泌体来获得所需的外泌体。
在本公开所涉及的第一方面的应用中，可选地，所述骨髓间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括：用完全培养基冲洗骨髓腔体，获得骨髓；将骨髓液接种培养，更换新的完全培养基，在随后的培养中使用FBS+双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养；培养全目标融合度后进行传代；用PBS清洗细胞表面，加入胰酶消化细胞，进行传代培养；当传代培养至第3-4代达到目标融合度时，更换为不含外泌体的血清的完全培养基，培养预定时间后收集细胞上清；将上清液离心，去除残留细胞及碎片，过滤后，加入外泌体提取试剂，离心，取沉淀，得到所述骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够获取得到骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。
在本公开所涉及的第一方面的应用中，可选地，所述外泌体为脐带间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够通过提取脐带间充质干细胞分泌的外泌体来获得所需的外泌体。
在本公开所涉及的第一方面的应用中，可选地，所述脐带间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括：在无菌条件下，将脐带剪成小段，进行洗涤，去除脐带的动静脉；将脐带剪碎，于培养皿中贴壁，置于培养箱内培养；在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，进行超速梯度离心，使用外泌体提取试剂，提取得到所述脐带间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够获取得到脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
在本公开所涉及的第一方面的应用中，可选地，miR-146a靶向β细胞中的Numb并抑制Numb在β细胞中的表达，以逆转β细胞去分化。
在本公开所涉及的第一方面的应用中，可选地，β-catenin(β-连环蛋白)受Numb调控，miR-146a通过miR-146a/Numb/β-catenin信号通路逆转β细胞去分化。
本公开第二方面提供了一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
本公开第三方面提供了一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能，因此，间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂的应用中具有良好的前景。
本公开第四方面提供了一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善胰岛功能。在2型糖尿病患者中，胰岛功能通常出现损伤。β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能，从而治疗胰岛损伤。
根据本公开，能够提供一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用、一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用、一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用、以及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的骨髓来源间充质干细胞外泌体的透射电镜图。
图2为本发明实施例1所述的外泌体标志western-blot的鉴定结果示意图。
图3为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对血糖曲线变化示意图。
图4为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对葡萄糖耐量的影响结果示意图。
图5为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对胰岛素敏感性的影响结果示意图。
图6为本发明实施例1所述的血清胰岛素水平示意图。
图7为本发明实施例1所述的外泌体干预治疗对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图8为本发明实施例1所述的miR-146a敲低的外泌体对血糖曲线变化的影响结果示意图。
图9为本发明实施例1所述的miR-146a敲低的外泌体对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图10a为本发明实施例1胰腺切片中Numb表达的免疫荧光染色。
图10b为本发明图10a中的NUMB荧光强度的统计分析。
图11为本发明实施例1的Numb的mRNA水平的RT-qPCR分析结果。
图12为本发明实施例1的INS-1细胞中NUMB的Western印迹结果。
图13为本发明实施例1的Numb的mRNA水平的RT-qPCR分析结果。
图14为本发明实施例1的INS-1细胞中NUMB的Western印迹结果。
图15为本发明实施例1的miR-146a靶向野生型或突变型的NumbmRNA的3‘UTR的序列示意图。
图16为本发明实施例1的荧光素酶活性示意图。
图17为本发明实施例1的Numb过表达时的GSIS分析结果。
图18为本发明实施例1的siRNA敲除Numb的表达时的GSIS分析结果。
图19为本发明实施例1的转染Numb的胰岛中Pdx1、Foxo1、Ngn3和Oct4的RT-qPCR分析结果。
图20为本发明实施例1的siRNA敲除Numb的表达时胰岛中Pdx1、Foxo1、Ngn3和Oct4的RT-qPCR分析结果。
图21为本发明实施例1的经bmMDEs处理的胰岛中β-连环蛋白的免疫印迹结果。
图22为本发明实施例1的用miR-146a模拟物转染的原代胰岛中β-连环蛋白核易位的免疫印迹结果。
图23为本发明实施例1的用miR-146a抑制剂联合bmMDEs处理的原代胰岛中β-连环蛋白核易位的免疫印迹结果。
图24为本发明实施例1的XAV-939和XAV-939+miR-146a干预处理时的GSIS分析结果。
图25为本发明实施例1的转染miR-146a+XAV-939的胰岛中Pdx1、Foxo1、Ngn3和Oct4的RT-qPCR分析结果。
图26为本发明实施例1的Numb过表达和siRNA处理后β-连环蛋白的核转移的变化。
图27为本发明实施例2所述的脐带间充质干细胞诱导分化后的图。
图28为本发明实施例2所述的脐带间充质干细胞表型鉴定示意图。
图29为本发明实施例2所述的外泌体透射电镜图。
图30为本发明实施例2所述的外泌体标志western-blot的鉴定结果示意图。
图31为本发明实施例2所述的外泌体干预治疗对胰岛β细胞去分化的影响结果示意图。
图32为本发明实施例2所述的外泌体对血糖曲线变化的影响结果示意图。
具体实施方式
以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
需要说明的是，本发明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，例如所包括或所具有的一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可以包括或具有没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
另外，在本发明的下面描述中涉及的小标题等并不是为了限制本发明的内容或范围，其仅仅是作为阅读的提示作用。这样的小标题既不能理解为用于分割文章的内容，也不应将小标题下的内容仅仅限制在小标题的范围内。
骨髓来源间充质干细胞(bmMSC)存在于骨髓基质中，具有自我更新和多向分化潜能。bmMSC在体外可被诱导分化为骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等不同的组织细胞，是组织修复及再生医学研究的热点和重点。外泌体(exosome)携带的RNA中主要为miRNA，已证实miRNA在调节胰岛β细胞功能方面起着至关重要的作用。外泌体是直径约100nm、由脂质双分子层包裹的囊泡。通过传递囊泡内包含的RNA(mRNA，miRNA和其他RNA)、蛋白质和脂质等物质进行细胞间通讯，影响包括细胞因子的产生、细胞增殖、凋亡和新陈代谢等多种生命活动。bmMSC外泌体(bmMDEs)作为旁分泌途径的重要表现形式，因其具有多种生物活性和细胞间通讯功能而被认为是一种有前途的无细胞疗法。
本公开涉及一种间充质干细胞衍生的外泌体(以下有时候简称为外泌体)在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。间充质干细胞(MSC)为糖尿病提供了一种有前景的治疗策略。
在一些示例中，外泌体为miR-146a。在一些示例中，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。在一些示例中，miR-146a靶向β细胞中的Numb并抑制Numb在β细胞中的表达，以逆转β细胞去分化。miR-146a结合至β细胞中的Numb mRNA的3'UTR区并抑制Numb在β细胞中的表达，以逆转β细胞去分化。β-catenin受Numb调控，miR-146a通过miR-146a/Numb/β-catenin信号通路逆转β细胞去分化。
在2型糖尿病患者中，部分功能性β细胞可能出现功能丧失，从而导致胰岛素分泌不足。β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能，因此，间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用中具有良好的前景。
在一些示例中，上述外泌体可以为骨髓间充质干细胞分泌的外泌体或脐带间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够通过提取骨髓或脐带间充质干细胞分泌的外泌体来获得所需的外泌体。
在一些示例中，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法可以包括：用完全培养基冲洗骨髓腔体，获得骨髓液；将骨髓液接种培养，更换新的完全培养基，在随后的培养中使用FBS+双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养；培养全目标融合度后进行传代；用PBS清洗细胞表面，加入胰酶消化细胞，进行传代培养；当传代培养至第3-4代达到目标融合度时，更换为不含外泌体的血清的完全培养基，培养预定时间后收集细胞上清；将上清液离心，去除残留细胞及碎片，过滤后，加入外泌体提取试剂，离心，取沉淀，得到骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够获取得到骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。
在一些示例中，脐带间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法可以包括：在无菌条件下，将脐带剪成小段，进行洗涤，去除脐带的动静脉；将脐带剪碎，于培养皿中贴壁，置于培养箱内培养；在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，进行超速梯度离心，使用外泌体提取试剂，提取得到脐带间充质干细胞分泌的外泌体。由此，能够获取得到脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
本公开还涉及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用，外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
本公开还涉及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用，外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能，因此，间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂的应用中具有良好的前景。
本公开还涉及一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用，外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善胰岛功能。在2型糖尿病患者中，胰岛功能损伤通常包括β细胞去分化，β细胞去分化是指β细胞转化为具有多向分化潜能的内分泌祖细胞，β细胞去分化后则失去了胰岛素分泌能力，本公开中的间充质干细胞衍生的外泌体miR-146a能够通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能，从而治疗胰岛损伤。
本公开涉及的专有名词缩写及其解析：
STZ:Streptozocin链脲佐霉素；
MSCs:Mesenchymal stem cells间充质干细胞；
bmMSC:Bone marrow mesenchymal stem cell骨髓间充质干细胞；
bmMDEs:Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes骨髓间充质干细胞来源的外泌体；
IDEs:INS-1-derived exosomes INS-1衍生的外泌体；
T2DM:Type 2diabetes mellitusⅡ型糖尿病；
IPGTT:Intraperitoneal glucose tolerance test腹腔内葡萄糖耐量试验；
IPITT:Intraperitoneal insulin tolerance test腹腔内胰岛素耐受性试验；
FBS:Fetal bovine serum牛胎儿血清；
PBS:Phosphate-buffered saline磷酸盐缓冲盐水；
HFD:High-fat diet高脂饮食；
HG:High glucose高葡萄糖；
NC:Negative control阴性对照；
GSIS:Glucose-stimulated insulin secretion葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
下面详细叙述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
为便于理解本发明，下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明，且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本领域技术人员应该理解，附图只是实施例的示意图，附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
实施例1
在本公开的实施例1中，通过高脂饮食+STZ诱导建立2型糖尿病模型的大鼠，进行bmMSC来源外泌体干预，分别检测外泌体干预后大鼠的血糖、糖耐量、胰岛素敏感性、血清胰岛素水平的变化，胰岛β细胞去分化水平。根据miRNA高通量测序筛选出功能性miR-146a，通过建立miR-146a敲低的细胞系，并干预2型糖尿病大鼠。miR-146a在外泌体逆转胰岛β细胞去分化方面具有积极的作用。bmMSC外泌体富含的miR-146a能改善2型糖尿病大鼠血糖、逆转胰岛β细胞去分化，起到治疗2型糖尿病的作用。
在本实施例1中，所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
本实施例1中，对骨髓间充质干细胞(bmMSC)的提取与分离包括：
(1)股骨的分离：选取4周龄左右的雄性SD大鼠，过量麻醉剂处死后用75％乙醇浸泡5分钟，随后移入超净台，在无菌条件下分离大鼠的双侧股骨和胫骨。
(2)骨髓的获取：剪掉股骨两端，暴露骨髓腔，用5ml注射器吸取完全培养基(79％DMEM/F12培养基+20％FBS+1％双抗)冲洗腔体，反复抽打2-3次收获骨髓。
(3)种板：按照一条股骨所提骨髓液接种至六孔板中一个孔的原则进行种板，每孔约2.5ml。放至37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养，24小时后更换新的完全培养基。在随后的培养中使用10％FBS+1％双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养。
(4)传代：细胞融合度达90％时可进行传代。用PBS清洗细胞表面，加入适当胰酶消化细胞，按照每孔细胞传至一个25cm2培养瓶的原则进行传代培养。选取第3-4代细胞用于后续实验。
本实施例中，bmMSC来源外泌体的提取与鉴定包括：
当第3-4代bmMSCs融合至50％左右时，更换为不含外泌体的血清的完全培养基，48小时后收集细胞上清。将上清液于4℃、2000g离心20分钟以去除残留细胞及碎片。0.22μm无菌过滤器过滤后将条件培养基移入新的15ml离心管，加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂，4℃过夜后，4℃、5000g离心30分钟，沉淀即为外泌体。将所有含外泌体的沉淀重悬于PBS中或溶解于RNA裂解缓冲液中，-80℃保存以进行后续实验。
将提取到的外泌体用透射电镜的方法对其直接大小以及形态进行检测，结果如图1所示；用western-blot的方法检测外泌体标志TSG101、CD9，以及内质网标记蛋白Calnexin，进一步对其进行鉴定，结果如图2所示。
在本实施例1中，研究bmMSC来源外泌体对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞去分化的影响实验，如下：
(1)高脂饮食+STZ诱导建立2型糖尿病模型与外泌体干预
4周龄雄性SD大鼠用于构建2型糖尿病模型。适应性喂养一周后，给予高脂饮食喂养4周，禁食不禁饮12小时后称量体重，然后按照30mg/kg剂量腹腔注射STZ（0.1M柠檬酸盐缓冲盐水中的30mg/kg，pH=4.5，单剂量，S0130；Sigma-Aldrich），继续高脂饮食。STZ注射后隔日测大鼠空腹血糖，连续2次测得空腹血糖≥16.7mmol/L即为2型糖尿病(T2DM)建模成功。从STZ注射后第5天开始，尾静脉注射bmMSCs(5×106细胞/大鼠，两周一次，共5个周期)或bmMSCs来源的外泌体bmMDEs(10mg/kg，每3天注射一次，持续10周)。正常对照组及T2DM组尾静脉注射等体积的PBS(0.2ml)，每3天一次，共10周。
(2)检测大鼠的血糖变化。
STZ注射前后，每周对大鼠血糖进行监测，记录数据并作出血糖曲线进行统计学分析。结果如图3所示，STZ注射之后，实验组大鼠的空腹血糖迅速升高且>16.7mmol/L。与T2DM组相比，bmMSC来源的外泌体大大改善了高血糖症，且在干预结束后血糖仍呈持续低水平状态。
(3)检测大鼠葡萄糖耐量、胰岛素敏感性。
最后一次干预1周后进行检测。葡萄糖耐量检测：实验前大鼠禁食不禁饮14-16小时，称完体重后，按1.5g/kg剂量腹腔注射50％葡萄糖溶液。分别于0、30、60、120、180分钟监测大鼠血糖。胰岛素敏感性检测：实验前大鼠禁食不禁饮4-6小时，称完体重后，按2IU/kg剂量腹腔注射胰岛素。分别于0、30、60、120、180分钟监测大鼠血糖。由图4、图5可以看出，bmMSC来源的外泌体干预组T2DM大鼠葡萄糖耐量异常和胰岛素敏感性下降得到显著改善，主要表现为禁食后血糖水平下降，糖负荷/胰岛素负荷后血糖升高/降低幅度较T2DM组明显降低，且峰值恢复更为迅速，曲线下面积较模型组低。
(4)检测大鼠血清胰岛素水平。
大鼠过夜禁食不禁饮，10％水合氯醛麻醉后，迅速逐层打开胸腔，行心尖取血，使用Elisa试剂盒检测血清胰岛素水平。由图6可知，外泌体干预后血清胰岛素水平明显升高。图6中，最左边框为Control+PBS，中间框为T2DM+PBS，最右边框为T2DM+bmMDEs。
(5)检测胰岛β细胞去分化情况。
大鼠胰腺组织石蜡切片行胰岛素与胰岛β细胞标志物PDX1/FOXO1、胰岛祖细胞标志物NGN3/OCT4免疫荧光染色。如图7结果显示，相较于正常对照组，T2DM胰岛β细胞标志物(PDX1、FOXO1)表达下降、胰岛祖细胞标志物(NGN3、OCT4)表达显著上升；外泌体干预10周后，PDX1、FOXO1表达上调、NGN3、OCT4表达下调。以上结果表明，bmMSC来源的外泌体能够逆转胰岛β细胞去分化。图7中，最左边框为Control+PBS，中间框为T2DM+PBS，最右边框为T2DM+bmMDEs。
在本实施例1中，为了研究间充质干细胞外泌体对逆转胰岛β细胞去分化的机理，确定外泌体富含的miR-146a对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞去分化的影响，对骨髓间充质干细胞进行了海绵抑制剂转染，提取外泌体干预2型糖尿病大鼠。转染干细胞敲低了外泌体中miRNA-146a的表达，发现敲低miRNA-146后外泌体逆转β细胞的作用下降了，逆向证明miRNA-146a在外泌体发挥功能中的重要性。
(1)慢病毒转染bmMSCs及exosome提取。
1)将细胞状态良好的第2代bmMSCs胰酶消化后计数种到12孔板，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2)当细胞融合达50％左右时更换培养基，分别更换为新的完全培养基、慢病毒阴性对照剂(sponge inhibitor NC序列：5’TTCTCCGAACGTGTCACGT3’)、miR-146a knock down慢病毒(miR-146a sponge inhibitor序列：5’TAACCCATGGAATTCAGTTCTCACGATAACCCATGGAATTCAGTTCTCAACCGGTAACCCATGGAATTCAGTTCTCATCACAACCCATGGAATTCAGTTCTCATTTTTTC3’)，37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
3)12小时后更换新的培养基。
4)转染48小时后，每孔加入嘌呤霉素建立miR-146a敲除的稳转细胞系。提RNA/蛋白检测转染效率。
5)加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂分别提取miR-NC KD组外泌体(bmMDEsmiR-NC KD)及miR-146a KD(bmMDEs miR-146a KD)组外泌体。
(2)miR-146a对2型糖尿病大鼠血糖及胰岛β细胞去分化的作用。
STZ注射后，大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L。除外第一部分所用大鼠外，其余大鼠分为以下4组(n＝7/组)：正常对照组、T2DM组、T2DM+bmMDEs miR-NC KD组、T2DM+bmMDEsmiR-146a KD(miR-146a-knockdown bmMSCs)组。从STZ注射后第5天开始，将两种bmMDEs(10mg/kg)重悬于0.2ml PBS中，通过尾静脉注入大鼠体内，每3天注射一次，持续10周。正常对照组及T2DM组尾静脉注射等体积的PBS，每3天一次，共10周。
结果如图8所示，所有注射STZ的大鼠1周后空腹血糖水平均升高至～18mmol/L。与T2DM+PBS组和T2DM+bmMDEs miR-146a KD干预组相比，T2DM+bmMDEs miR-NC KD干预组大鼠的空腹血糖明显降低。
大鼠胰腺组织石蜡切片行胰岛素与胰岛β细胞标志物PDX1/FOXO1、胰岛祖细胞标志物NGN3/OCT4免疫荧光染色。如图9结果显示，与T2DM+PBS组和T2DM+bmMDEs miR-146a KD组相比，T2DM+bmMDEs miR-NC KD组治疗后的T2DM大鼠胰岛中PDX1和FOXO1的表达水平升高，而NGN3和OCT4表达降低。这些数据表明，bmMDEs携带的miR-146a在改善T2DM大鼠血糖和逆转β细胞去分化方面具有重要作用。图9中，四条竖直框从左至右依次为Control+PBS，T2DM+PBS，T2DM+bmMDEs miR-NC KD，T2DM+bmMDEs miR-146aKD。这些数据表明，miR-146a敲低的外泌体减弱了其改善β细胞功能和逆转去分化的能力。
(3)miR-146a的调控机制。
使用mirna靶基因预测数据库TargetScan (https://www.targetscan.org)来预测miR-146a的潜在靶点，在所有具有miR-146a保守位点的预测靶点中，有一种人类同源膜结合蛋白NUMB被注意到，已知NUMB在糖尿病患者中表达上调，并正向调节胰岛祖细胞的标记物NGN3的表达。如图10a和图10b所示，与对照组相比，T2DM大鼠胰岛中NUMB的表达水平显著上调，而bmMDE处理降低了NUMB的表达。如图11和图12所示，HG（high glucose，高糖饮食）处理后Numb的表达增强，miR-146a模拟物使胰岛中Numb的mRNA水平和INS-1细胞中的蛋白水平下调。如图13和图14所示，bmMDEs降低了HG处理后Numb的表达，而miR-146a抑制剂减弱了bmMDEs在胰岛mRNA水平上的作用和在INS-1细胞中的蛋白水平上的作用。如图15所示，通过生物信息学分析，Numb基因的3‘UTR包含miR-146a的假定结合位点，为了进一步验证Numb和miR-146a之间的关联，我们构建了含有野生型3‘UTR(Numb3’UTR WT)和突变的3‘UTR(Numb3’UTR MUT)的荧光素酶报告质粒。如图16所示，miR-146a模拟物显著降低了含有Numb3’UTR WT的INS-1细胞中的荧光素酶活性，但对Numb 3’UTRMUT细胞没有显著影响(图16)，表明miR-146a是结合Numb mRNA的3'UTR区进行作用。此外，为了确定Numb在胰岛上的功能，我们在胰岛中过表达了全长的Numb和通过小干扰rna(siRNAs)敲除了Numb的表达。GSIS（glucose stimulated insulin secretion 葡萄糖刺激的胰岛素分泌）实验表明，Numb过表达能够抑制GSIS，而抑制Numb的表达则减弱了HG环境下对GSIS的抑制(如图17和图18所示)。最后，我们在体外检测了Numb对胰岛β细胞去分化的影响。RT-qPCR结果显示，Numb过表达后，Pdx1和Foxo1的表达水平显著降低，而Ngn3和Oct4的表达水平显著升高(如图19所示)。抑制Numb后所获得的效果与图20中所示的miR-146a模拟物的效果相似(如图20所示)。这些数据表明，Numb是miR-146a调控β细胞功能和去分化的直接下游靶点，miR-146a结合至β细胞中的Numb mRNA的3'UTR区并抑制Numb在β细胞中的表达，以逆转β细胞去分化。
β-连环蛋白是一种已知的位于Numb状态的下游的信号分子，因此，我们在体外研究了β-连环蛋白是否在T2DM模型中介导了bmMDEs的改善作用。首先，我们检测了不同干预条件下β-连环蛋白的蛋白水平。我们发现，经bmMDEs处理的胰岛中，β-连环蛋白的核蛋白水平升高，而细胞质中β-连环蛋白的蛋白水平没有变化，如图21和图22所示，免疫印迹分析表明，在bmMDE处理后检测到原代胰岛中β-连环蛋白的核转移，在miR-146a-mimic组中也检测了类似的结果。如图23所示，当miR-146a的表达被抑制时，bmMDEs增加β-连环蛋白核蛋白水平的作用减弱。为了证实β-连环蛋白信号通路的激活，我们使用了β-连环蛋白抑制剂XAV-939来促进β-连环蛋白的降解。如图24所示，XAV-939干预处理破坏了GSIS，而miR-146a模拟物有效地减轻了这种破坏。然后如图25所示，miR-146a模拟物提高了hg处理的胰岛中Pdx1和Foxo1的表达水平，并降低了Ngn3和Oct4的表达水平。然而，当与XAV-939结合时，miR-146a模拟物的作用部分恢复。然后，我们分别验证了原代胰岛和INS-1细胞中Numb和β-连环蛋白之间的关系。如图26所示，过表达Numb后，β-连环蛋白的核蛋白水平下降，而敲除Numb后，其核蛋白水平升高，图中β-actin和GAPDH作为内参(loading controls)。这些结果表明，Numb/β-连环蛋白是miR-146a调控胰岛和β细胞功能和去分化的下游效应因子。miR-146a通过miR-146a/Numb/β-连环蛋白信号通路逆转β细胞去分化。
根据以上结果，能够发现bmMSC来源的外泌体能够改善2型糖尿病大鼠血糖、促进胰岛素分泌、逆转胰岛β细胞去分化，进而恢复减退的胰岛功能，达到治疗2型糖尿病的作用，其中外泌体富含的miR-146a在该过程中发挥了重要作用。
实施例2
本发明实施例2中，所述间充质干细胞外泌体由如下方法制备而成：
(1)在无菌条件下，将脐带剪成小段，充分洗涤，去除脐带的动静脉。
(2)将脐带小段剪碎，置于培养皿中，直接与皿底贴壁，置于37℃、5％CO 2培养箱内培养，4h后添加完全培养基。每隔3d换液一次。
(3)在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，进行超速梯度离心，即提取得到脐带来源间充质干细胞外泌体。
步骤(1)中，冲洗用液体为：无菌生理盐水+1％双抗。
步骤(2)中，培养用完全培养基为20％FBS+1％青链双抗的低糖α-MEM培养液。
步骤(3)中，收集上清液提取外泌体前将培养基更换为10％无外泌体FBS+1％青链双抗的低糖α-MEM培养液。
所述脐带来源间充质干细胞外泌体具有CD44、CD90标志。
所述脐带来源间充质干细胞外泌体来源于人脐带。
在本实施例2中，使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。所使用的方法，如HE染色、Westernblot等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述。
本实施例2中，人间充质干细胞的分离与鉴定包括：
在无菌条件下，将脐带剪成小段，充分洗涤，去除脐带的动静脉，将脐带小段剪碎，置于培养皿中，直接与皿底贴壁，置于37℃、5％CO 2培养箱内培养，4h后添加20％FBS和5％青链双抗的低糖α-MEM培养液。3d后更换培养液，每隔3d换液一次。待MSC融合达70～80％后，用0.25％的胰酶消化，传代培养，取P3代细胞进行实验。取P3代细胞成脂成骨诱导如图27所示，其中，图27中的(a)为成脂分化，图27中的(b)为成骨分化，并做表型CD44、CD90、CD34、CD45鉴定，如图28所示，结果证明分离的细胞为间充质干细胞。
在本实施例2中，将P3代的MSC种植于培养皿的中，当细胞融合达60～80％，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养培养48～72h后，收集细胞上清，以2000rpm的转速离心10min，然后以10000rpm的转速离心30min，去除细胞或者细胞碎片。使用外泌体提取试剂盒依照说明书分离提取MSC外泌体，电镜下观察(如图29所示)。用Western blot鉴定MSC外泌体相关蛋白CD63、CD81的表达，结果如图30所示，收集到的蛋白均有表达CD81和CD63，说明分离得到了间充质干细胞外泌体。
MSCs外泌体对体外胰岛β细胞去分化的影响：
胰岛β细胞株在高糖培养基中培养72h后，分别予以不同浓度EXO(0、10、20、30μg/ml)干预24h，检测各组β细胞PDX1、MafA、INS1、INS2、Ngn3、Nanog、Oct4基因mRNA表达水平。结果如图31所示，与对照组相比，高糖可使β细胞表面标志物(PDX1、MafA、INS1、INS2)表达减少、去分化指标(Ngn3、Nanog、Oct4)表达增加；EXO作用后，减轻了糖毒性诱导的β细胞去分化程度。
图31中，MSCs外泌体对体外胰岛β细胞去分化的影响(PDX1：胰岛素基因表达的关键调节子，结合于胰岛素基因的A3元件，调节胰岛素基因的表达；MafA：是一种碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构的转录因子，结合于胰岛素基因的启动子，启动胰岛素基因的表达；Ngn3：功能主要是作为内分泌前体细胞基因转录的激活子；Nanog：胚胎干细胞核心转录因子；Oct4：八聚体结合蛋白-4，都是反映细胞多能性的经典标记)。
在本实施例2中，脐带MSC外泌体可降低STZ诱导的T2DM大鼠的空腹血糖，其实验步骤如下：
STZ诱导T2DM大鼠模型的建立：
选取4周龄60g左右SD大鼠，高脂饮食(HFD)喂养4周后禁食12h，按30mg/kg一次性腹腔注射STZ柠檬酸溶液，72h后尾静脉全血血糖大于16.7mmol/L为糖尿病模型造模成功；对照组则注射等量柠檬酸缓冲液。
尾静脉内给予MSC外泌体可降低STZ诱导的T2DM大鼠的空腹血糖：
STZ诱导的T2DM模型，在注射STZ后第5天尾静脉输注100μl浓度为10μg/ml的MSCs外泌体，隔日一次，共10周；检测大鼠的空腹血糖，结果如图32所示，MSC外泌体治疗组大鼠的空腹血糖明显低于未治疗组(P<0.05)。
本实施例2中，上述脐带来源间充质干细胞外泌体的制备方法，操作简单可行，提出了脐带来源间充质干细胞外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的新用途，以及在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的新用途，脐带来源间充质干细胞外泌体可有效降低2型糖尿病空腹血糖，逆转胰岛β细胞去分化，治疗2型糖尿病胰岛功能损伤。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述外泌体为骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述骨髓间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括：
用完全培养基冲洗骨髓腔体，获得骨髓液；
将骨髓液接种培养，更换新的所述完全培养基，在随后的培养中使用FBS+双抗的DMEM/F12完全培养基进行培养；
培养全目标融合度后进行传代；用PBS缓冲液清洗细胞表面，加入胰酶消化细胞，进行传代培养；
当传代培养至第3-4代时，更换为不含外泌体的血清的完全培养基，培养预定时间后收集细胞的上清液；
将上清液离心，去除残留细胞及碎片，过滤后，加入外泌体提取试剂，离心，取沉淀，得到所述骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述外泌体为脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
所述脐带间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法包括：
在无菌条件下，将脐带剪成小段，进行洗涤，去除脐带的动静脉；
将脐带剪碎，于培养皿中贴壁，置于培养箱内培养；
在体外培养体系中对脐带间充质干细胞进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，进行超速梯度离心，使用外泌体提取试剂，提取得到所述脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
miR-146a靶向β细胞中的Numb并抑制Numb在β细胞中的表达，以逆转β细胞去分化。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，
β-连环蛋白受Numb调控，miR-146a通过miR-146a/Numb/β-连环蛋白信号通路逆转β细胞去分化。
8.一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备降低血糖含量制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
9.一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备逆转胰岛β细胞去分化制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善β细胞的胰岛素的分泌功能。
10.一种间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病胰岛功能损伤的生物制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体为miR-146a，miR-146a通过逆转β细胞去分化以改善胰岛功能。
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