CN111281889A - 人脐带间充质干细胞外泌体的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人脐带间充质干细胞外泌体的用途。具体为人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。可通过促进CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰岛β细胞，使β‑细胞的数量和功能增加，进而对1型糖尿病小鼠产生较好的血糖调控作用。

Description

人脐带间充质干细胞外泌体的用途

技术领域

本发明涉及药物治疗领域，尤其涉及人脐带间充质干细胞外泌体的用途。

背景技术

无论是1型还是2型糖尿病，随着其病理进展都会出现β-细胞结构和功能的进行性破坏，最终引起胰岛素分泌的绝对不足，而引起各种糖尿病并发症，最终危及患者生命。

目前糖尿病的治疗主要有以下几种方法：胰岛素及其类似物、胰岛素增敏剂、胰岛素促泌剂以及一些新型降糖药。但由于这些药物的治疗目的在于降糖，只能起到对症治疗的目的，而无法达到对因治疗的目的。因此，随着病程进展，会导致胰腺β-细胞进行性破坏，最终导致其功能丧失。因此，如何保护内源性胰岛β-细胞，使其结构和功能免于破坏，甚至促进内源性胰腺组织胰岛β-细胞功能恢复是目前研究的热点和难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞外泌体的用途。

为实现上述目的，本发明提供一种人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。

进一步，所述用途为降低血糖的用途。

进一步，所述用途为增加胰岛β-细胞的用途。

进一步，所述用途为增加内源性分泌胰岛素的胰岛细胞再生的用途。

本发明的实施例验证了人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSCs-Exo)可通过促进CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰岛β细胞，使β-细胞的数量和功能增加，进而对1型糖尿病小鼠产生较好的血糖调控作用。

附图说明

图1是动态光散射法测定外泌体粒径结果图(纵坐标为粒径占比，横坐标为粒径大小)。

图2是扫描电镜观察外泌体的大小与形态图(比例尺为100nm)。

图3是hucMSCs-Exo的标志性标志物western blot检测结果图。

图4是hucMSCs-Exo体外处理胰腺组织后H&E染色结果图。

图5是hucMSCs-Exo治疗小鼠期间小鼠体重的检测结果图。

图6是hucMSCs-Exo第一次治疗后小鼠血糖值的对比图。

图7是hucMSCs-Exo治疗治疗全部结束小鼠血糖值前后对比图。

图8是hucMSCs-Exo治疗小鼠前后小鼠HOMA-B值结果图。

图9是hucMSCs-Exo治疗小鼠后胰腺组织H&E染色结果图。

图10是hucMSCs-Exo治疗小鼠后胰腺组织胰岛数量统计结果图。

图11是hucMSCs-Exo治疗小鼠后小鼠胰腺组织Insulin和CK19免疫荧光染色结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：细胞培养及hucMSCs-Exo分离鉴定

1、分离：

用含有10％胎牛血清的DMEM/F-12 1:1(指含有10％胎牛血清的DMEM与F-12的体积比为1:1)培养基培养人脐带间充质干细胞(hucMSCs)，该细胞由新生儿脐带分离得到。诱导分化前一天，将hucMSCs细胞接种至10厘米培养板中，使第二天细胞汇合度为50-70％，1xPBS润洗三次，更换为无血清DMEM/F-12 1:1(指无血清DMEM与F-12的体积比为1:1)培养基，继续培养至48小时收集上清，再次加入无血清培养基，48小时后再次收集培养上清。收集的细胞培养上清按照4℃，3000rpm，15分钟，4℃，10000xg，30分钟，过0.22um滤膜，100000xg离心80分钟，得到沉淀,再用1xPBS润洗一次，100000xg离心80分钟，得到沉淀即为外泌体即为hucMSCs-Exo(人脐带间充质干细胞来源的外泌体)。

2、鉴定：

1)、粒径分布

取100μL外泌体样品用PBS稀释至1mL并混匀，将稀释后的样品加入10mm方形聚苯乙烯样品池(DTS0012)中，应用NanoZS90纳米粒径分析仪，通过动态光散射法测量样品的粒径和多分散系数，结果见图1。其外泌体粒径约为158nm，

2)、透射电子显微镜

取外泌体适量，用PBS稀释后滴加于铜网上，1％磷钨酸负染，再滴至专用铜网上，待其自然挥干，用透射电子显微镜观察、拍照。结果见图2，图2的A和B均为本发明的外泌体。电镜结果同样显示外泌体大小与形态和文献报道相一致。

3)、蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测hucMSCs-Exo特异性蛋白的表达

(1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

a.安装洗净的玻璃板(1.5mm或1.0mm)，在两板之间加满蒸馏水检漏。

b.按表1分别配制浓缩胶和分离胶。

表1聚丙烯酰胺凝胶配方表

试剂名称	分离胶(10％)	浓缩胶(5％)
			ddH<sub>2</sub>O	4mL	1.7mL
30％丙烯酰胺	3.3mL	0.5mL
			4×lower buffer	2.5mL	无
4×upper buffer	无	0.75mL
			10％过硫酸铵	0.1mL	0.03mL
TEMED	0.006mL	0.003mL

c.在两板间加入新配的10％分离胶约8mL，用2mL无水乙醇压胶。

d.待分离胶完全凝固后，倒掉上层的无水乙醇，并用吸水纸吸干。加入新配的5％浓缩胶至玻璃板最顶部，迅速插入梳子，应避免产生气泡。待完全凝固后，垂直拔出梳子。

e.安装跑胶装置，内槽加入1×Running buffer检漏。确定不漏后在内外槽加入1×Running buffer，取3μL蛋白Marker和蛋白样品各50μg依次上样。用80V电压跑胶。约3h后，溴酚蓝跑出分离胶，停止电泳。

(2)、免疫印迹

a.转膜：于甲醇中浸泡PVDF膜15min，在1×Transfer buffer中将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白于4℃冰箱中用80V的电压转至PVDF膜上，90min后停止。

b.封闭：将膜浸没于封闭液中，室温封闭1h。

c.一抗孵育：用5％BSA分别稀释TSG101，CD9，CD63或GAPDH一抗，具体比例参照说明书，于摇床上4℃过夜孵育。

d.洗膜：回收一抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。

e.二抗孵育：用封闭液稀释二抗，具体比例参照说明书，于摇床上室温孵育1h。

f.洗膜：回收二抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。

g.显影：预冷显影仪，把膜放入显影仪隔板中，将ECL显影液的A液和B液按等体积混合后均匀滴加于膜上，调节明场亮度和清晰度，调至化学发光，每10s曝光一次。保存并标注不同曝光强度的照片。

h.采用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/i_i)分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白表达的相对强度。

结果见图3。图3为hucMSCs-Exo的标志性蛋白的表达结果图。从图3可以看出：在48和96小时时均有特异性表达外泌体标志物TSG101、CD9、CD63和GAPDH。表明已经成功地提取出hucMSCs的外泌体即hucMSCs-Exo。

实施例2：、hucMSCs-Exo的体外功能实验

1、小鼠1型糖尿病模型建立

(1)购买8周龄C57BL/6J雄性小鼠，禁食后12小时。

(2)避光称取适量链脲佐菌素(STZ)溶于柠檬酸缓冲液中，配制10mg/mL STZ溶液，现配现用。小鼠称重，造模组以60mg/kg STZ连续小鼠腹腔注射5天，对照组小鼠腹腔注射相应体积柠檬酸缓冲液。由于STZ水溶液极不稳定，且见光易分解，故整个过程需避光进行，且在30min之内完成。给药1h后喂食。

(3)三天后测量小鼠血糖，小鼠血糖大于16.7mM即视为造模成功。由于糖尿病小鼠会出现多饮多食多尿的症状，需勤更换垫料，及时添加粮食和水，避免小鼠死亡。制备糖尿病小鼠持续观察14天，待血糖稳定。

2、hucMSCs-Exo的体外功能实验

hucMSCs-Exo与小鼠胰腺组织切片共培养：

将野生型(WT)或造模成功的小鼠(T1D)用CO₂处死，分离胰腺组织，在胰腺头部切出1毫米的薄片，分别与PBS(con)或外泌体(Exosome)共同培养，96小时后进行H&E染色，拍照观察，结果如图4所示，其中WT con表示PBS处理野生型(即为野生型对照组)，WT+exosomes表示外泌体处理野生型组,T1D con表示PBS处理T1D组(即为T1D对照组),T1D+exosomes表示外泌体处理T1D组。从图4可以看出，外泌体处理T1D组与T1D对照组(Con)组相比，胰岛显示更好的完整性，β-细胞数量也更多。提示hucMSCs外泌体具有体外保护胰岛及促胰岛数量增加的作用。

3.hucMSCs-Exo的体内功能实验

1)、1型糖尿病小鼠模型构建：购买约8周龄的C57BL/6J雄性小鼠，禁食过夜后，腹腔注射60mg/kg STZ(上述配置的10mg/mL STZ溶液)(首次禁食12小时，后4次禁食10小时)，约两周后，小鼠血糖稳定至20-25mmol/L。

2)、hucMSCs-Exo的治疗：注射柠檬酸缓冲液的小鼠为对照组，将糖尿病(T1D)小鼠分为四组，分别为PBS组，Uc-MSCs组，外泌体低剂量组(exosome 50μg)，外泌体高剂量组(exosome 150μg)，每组6只小鼠。造模成功后第三周的小鼠记为Week0，在week0和week1之间连续按分组方案处理3次，week8和week12之间按分组方案连续处理两次。实验过程中每周检测小鼠体重(Body weight)和血糖(Blood Glucose)。分别于实验开始前(Week0)和实验结束后(Week13)测空腹血糖，并从尾静脉采血，测胰岛素含量，用下述公式计算HOMA-B，HOMA-B＝(20×FPI)/(FPG-3.5),FPI为空腹胰岛素含量，单位为mU/L，FPG为空腹血糖浓度，单位为mmol/L。

3)、小鼠胰岛素含量测定

(1)按HKU Li Ka Shing Faculty of Medicine(Hong Kong)超灵敏小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒说明书进行。设置标准孔和待测样品孔，分别取5μL标准品和样品加入到相应孔中。

(2)将100×检测抗体溶液用实验缓冲液稀释到1×，每孔加入100μL。

(3)用封板膜封板后，600rpm振荡孵育1h。30×洗涤液用蒸馏水稀释至1×备用。

(4)小心揭掉封板膜，弃去板内液体，用力甩干，加入300μL 1×洗涤液，室温静置20后弃去，重复4次，尽量甩干板内液体。

(5)每孔加入100μL底物溶液，室温避光孵育15min。

(6)每孔加入100μL终止液终止反应，缓慢摇晃几秒，确保溶液充分混合。

(7)酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光值，按说明书计算各样品孔中胰岛素的含量。

结果如图5-8所示，图5中，圆点线代表野生型空白对照组，正方形线代表PBS治疗组，黑色三角形线代表Uc-MSCs治疗组，白色三角形线代表exosomes 50μg治疗组，五角星形线代表exosomes 150μg治疗组。从图5可知在治疗期间小鼠体重保持稳定，图6-图7可知：血糖监测结果显示，首次治疗后，Uc-MSCs组和外泌体低剂量组(exosome 50μg)小鼠血糖下降明显，与PBS组相比有显著性差异；再次治疗后外泌体治疗组(低剂量及高剂量)小鼠血糖均下降明显，与PBS治疗组相比有显著性差异。治疗前后的结果表示外泌体高剂量组(exosome150μg)小鼠血糖值在治疗前后有显著性差异，血糖下降明显。从图8可以看出外泌体治疗后，尤其是高剂量外泌体治疗组，小鼠HOMA-B稍有提升。可以看出外泌体可以有效地降低T1D小鼠血糖，使糖尿病小鼠胰岛β-细胞功能(HOMA-B)增加。

4)胰腺组织的H&E、IF染色及观察：

a.石蜡包埋

(1)颈椎脱臼法处死小鼠，采取小鼠胰腺组织或肾组织，将组织浸泡于PBS中，规整组织大小和形状，洗净残留血迹后置于EP管中。

(2)将组织置于4％多聚甲醛中，4℃固定过夜。PBS洗三次，每次15min。

(3)组织脱水：将组织依次浸泡于30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇中，各30min，梯度脱水。

(4)组织透明：将硬蜡和软蜡提前放入70℃水浴锅中加热使其溶解。将组织放于1:1二甲苯/乙醇混合液中浸泡20min。加二甲苯透明，透明时间根据组织状态而定，约5-10min。

(5)组织浸蜡：组织透明后，在1:1二甲苯/硬蜡混合液中浸泡30min，软蜡中浸泡1.5h，最后放于硬蜡中浸泡2.5h。由于硬蜡和软蜡在室温下较快凝固，故此过程需全程在70℃水浴锅中进行。

(6)组织包埋：提前2h打开石蜡包埋机，加入硬蜡待其完全融化。将EP管置于室温使硬蜡凝固，切下EP管底部包含组织的部分，浸泡于装满石蜡的槽内，使组织游离。干净硬蜡润洗金属槽，向槽内灌满硬蜡，冷却至金属槽底部出现一层薄雾，立即将组织块放置于槽正中心，扣包埋盒，灌满硬蜡。

(7)将金属槽置于冰上冷却，待石蜡彻底凝固后，于4℃保存。

(8)用石蜡切片机切片，调至切片厚度为5μm，连续切薄片，选取有组织的切片进行后续步骤。

(9)展片：提前将水煮沸，排尽水中的气泡，将水倒入展片槽中冷却至45℃。将连续四张切片置于50％乙醇中展开，约1min后，用一干净载玻片小心挑取石蜡切片于45℃水中，充分展片，将切片平铺吸附固定于氨基载玻片上。镜检，观察组织形态。

(10)烤片：将载玻片置于烤片机上，45℃过夜，4℃保存。

b.H&E染色

(1)脱蜡：将上述石蜡切片浸泡于二甲苯中，每次10min，重复三次。之后在1:1二甲苯/乙醇溶液中浸泡15min。

(2)梯度复水：将石蜡切片依次浸泡于100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、ddH2O、ddH2O中，每个溶液中各浸泡5min。

(3)石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水后，苏木精常温染色2.5min，迅速用自来水冲洗。

(4)0.1％盐酸乙醇浸泡10s，流水缓慢滴洗，之后依次浸泡于30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇中，每次1min。

(5)伊红染色1min后，迅速置于无水乙醇中1min，之后在无水乙醇中浸泡5min，重复两次。

(6)1:1二甲苯/乙醇溶液中浸泡15min，之后浸泡于二甲苯溶液5min，重复三次。

(7)滴取少量中性树胶于组织上，盖上盖玻片，吸水纸覆盖于载玻片上，小心均匀按压，挤出多余中性树胶，室温干燥保存。

(8)镜检，观察组织染色情况，分析实验结果。见图9-10。

图9为对照组或hucMSCs-Exo治疗组小鼠胰腺组织H&E形态学观察图。其中con表示野生型空白对照小鼠组，PBS表示1型糖尿病小鼠PBS对照治疗组，Uc-MSCs表示一型糖尿病小鼠Uc-MSCs治疗组，exosomes-50μg表示一型糖尿病小鼠外泌体低剂量治疗组,exosomes-150μg表示1型糖尿病小鼠外泌体高剂量治疗组。从图9可以看出与PBS治疗组相比，外泌体治疗组(包括低剂量和高剂量治疗组)小鼠胰腺组织胰岛数量明显增多，胰岛较大且更加完整致密。图10为对H&E形态学观察中胰岛数目进行技术并进行统计分析结果图(^##P<0.01与对照组相比；*p<0.05,***p<0.001与PBS组相比)。其中con表示野生型空白对照小鼠组，PBS表示1型糖尿病小鼠PBS对照治疗组，Uc-MSCs表示一型糖尿病小鼠Uc-MSCs治疗组，exosomes-50μg表示1型糖尿病小鼠外泌体低剂量治疗组,exosomes-150μg表示1型糖尿病小鼠外泌体高剂量治疗组。从图10可以看出PBS治疗组胰岛数量明显少于con组，与PBS组相比，其余各个治疗组小鼠胰腺组织胰岛数量都显著增加，具有显著性差异，尤其是外泌体治疗组。

c.免疫荧光染色

(1)抗原热修复：组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，PBS洗3次，每次2min；准备两份pH为6.0的柠檬酸缓冲液，共同放入微波炉中高火煮沸2min，在其中一份柠檬酸缓冲液中放入石蜡切片，95-100℃低火持续加热20min，每隔几分钟吸取另一份柠檬酸缓冲液补液，自然冷却至室温。

(2)将切片置于装有PBS的培养皿中清洗三次，每次5min。每次清洗后要用吸水纸将多余的液体吸去，再在下一培养皿中清洗，注意不要干片。细胞通透，加入0.1％Triton，室温放置10-15min。(Triton或皂苷可使细胞膜通透性增强，便于抗体入核)。

(3)PBS洗3次，每次5min。吸水纸擦干片子，用5％BSA根据说明书推荐比例配制一抗，滴取少量一抗于组织上，4℃孵育过夜。

(4)PBS洗3次，每次5min。吸水纸擦干片子，用5％BSA根据说明书推荐比例配制荧光素标记的二抗，滴加少量二抗于组织上，将切片置于湿盒中，室温避光孵育1h。

(5)PBS洗3次，每次5min。在载玻片上滴加适量含DAPI的封片剂封片，吸干多余封片剂，用指甲油封住玻片四周。

(6)用倒置荧光显微镜观察，根据不同染料选择不同波段的激发光，分析实验结果见图11。对不同处理的小鼠胰腺组织进行免疫荧光染色。DAPI：特异性染细胞核；Insulin：胰岛素，染色阳性表示可分泌胰岛素的胰岛β-细胞；CK19：胰腺导管上皮细胞的标志物；Merge：表示Insulin/CK19共染，出现共染表明hucMSCs-Exo治疗后促进了糖尿病小鼠内源性CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素(Insulin)的胰腺β-细胞。

图11为hucMSCs-Exo治疗可促进糖尿病小鼠内源性CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰腺β-细胞的免疫荧光(IF)结果图。其中a表示WT con组DAPI单染图，b表示WT con组Insulin单染图，c表示WT con组CK19单染图，d表示WT con组Insulin和CK19共染图，e表示T1D+PBS组DAPI单染图，f表示T1D+PBS组Insulin单染图，g表示T1D+PBS组CK19单染图，h表示T1D+PBS组Insulin和CK19共染图，i表示T1D+Uc-MSCs组DAPI单染图，j表示T1D+Uc-MSCs组Insulin单染图，k表示T1D+Uc-MSCs组CK19单染图，l表示T1D+Uc-MSCs组Insulin和CK19共染图，m表示T1D+exosomes 50μg组DAPI单染图，n表示T1D+exosomes 50μg组Insulin单染图，o表示T1D+exosomes 50μg组CK19单染图，p表示T1D+exosomes 50μg组Insulin和CK19共染图，q表示T1D+exosomes 50μg组DAPI单染图，r表示T1D+exosomes 50μg组Insulin单染图，s表示T1D+exosomes 50μg组CK19单染图，t表示T1D+exosomes 50μg组Insulin和CK19共染图。从图11可以看出造模后糖尿病小鼠胰腺组织破坏，胰岛素(Insulin)染色减少或消失，而hucMSCs-Exo治疗糖尿病小鼠后，胰岛素染色阳性，同时也可以观察到hucMSCs-Exo治疗糖尿病小鼠胰腺组织Insulin/CK19共染，表明hucMSCs-Exo治疗后促进了糖尿病小鼠内源性CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素(Insulin)的胰腺β-细胞。

可以看出：人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSCs-Exo)可通过促进CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰岛β细胞，使β-细胞的数量和功能增加，进而对1型糖尿病小鼠产生较好的血糖调控作用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。

2.如权利要求1所述人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途，其特征在于，所述用途为降低血糖的用途。

3.如权利要求1所述人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途，其特征在于，所述用途为增加胰岛β-细胞的用途。

4.如权利要求1所述人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途，其特征在于，所述用途为增加内源性分泌胰岛素的胰岛细胞再生的用途。

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