CN107849524B - 一种治疗心脏病的医药组合物 - Google Patents

一种治疗心脏病的医药组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107849524B
CN107849524B CN201680033814.2A CN201680033814A CN107849524B CN 107849524 B CN107849524 B CN 107849524B CN 201680033814 A CN201680033814 A CN 201680033814A CN 107849524 B CN107849524 B CN 107849524B
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
group
adipose
pretreated
adsc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680033814.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107849524A (zh
Inventor
刘绍毅
黄志扬
刘才睿
陈冬生
刘懿德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Numen Biotech Co ltd
Original Assignee
Numen Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Numen Biotech Co ltd filed Critical Numen Biotech Co ltd
Publication of CN107849524A publication Critical patent/CN107849524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107849524B publication Critical patent/CN107849524B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种修复糖尿病性心脏病的医药组合物,组合物含有酯型儿茶素(EGCG)和脂肪干细胞,酯型儿茶素(EGCG)能提升脂肪干细胞能力,增加脂肪干细胞修复受损组织的能力。

Description

一种治疗心脏病的医药组合物
技术领域
本发明提供一种修复糖尿病性心脏病的医药组合物及其使用方法，其特征是，所述修复糖尿病性心脏病的医药组合物含有以酯型儿茶素(EGCG)预处理的脂肪干细胞，所述的经绿茶儿茶素预处理脂肪干细胞的修复受损组织的能力具有明显上升。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由于体内缺乏胰岛素或是胰岛素在靶细胞不能发挥正常的生理作用而起的糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱，临床上证实，有许多疾病会伴随着糖尿病的产生而发生，这些疾病称之为糖尿病的并发症。糖尿病的并发症有心血管疾病、肾脏病变、外围血管病变、眼晴疾病、肝脏疾病或神经病变或外围神经病变等病变。其中每4个糖尿病人中，就有2个有心脏功能异常的状况出现，显示糖尿病性心脏病是糖尿病人主要的并发症。
有相关研究指出糖尿病对心脏所造成的伤害，是透过血糖本身或是糖化终端产物(advanced glycation end products,AGEs)，不论是那种刺激源，都会造成心肌细胞的氧化压力上升，而上升的氧化压力会破坏心肌细胞内的粒腺体，使得细胞凋亡相关蛋白(如caspase-3及t-Bad)等表达量上升。相对的，细胞存活蛋白如p-Akt的表达量下降，而进一步引发心肌细胞的病理反应，如细胞凋亡、心肌细胞肥大、发炎反应甚至纤维化反应。这些病理反应的表现到最后会造成心脏功能的下降，且心肌发炎发生后，其受损细胞无法自行再生，目前的药物治疗无法使受损细胞自行再生，因此无法让心脏功能恢复和解决高血糖的问题。
干细胞疗法具有能治疗糖尿病引起的心脏及心血管病变，能使受损细胞自行再生，使心脏功能恢复。但研究发现干细胞于高糖浓度下的再生能力不佳，如何使干细胞能在高糖环境下仍能维持再生能力是自体干细胞修复糖尿病性心脏病急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种治疗心脏病的医药处组合物，其中所述医药组合物包含干细胞。
较佳地，所述心脏病为糖尿病或高血糖所引起的心脏病。
较佳地，所述医药组合物进一步包含酯型儿茶素(EGGG)。
较佳地，所述干细胞为脂肪干细胞。
较佳地，所述脂肪干细胞与酯型儿茶素预处理2小时。
较佳地，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为低于20μM。
较佳地，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为5-15μg/mL。
本发明提供一种制备治疗心脏病的医药组合物的方法，所述医药组合物包含以酯型儿茶素处理过的1×105颗脂肪干细胞。
较佳地，所述心脏病是由糖尿病或高血糖所引起。
本发明提供一种治疗心脏病的方法，包含将1×105颗的干细胞通过静脉注射给与一个体。
较佳地，所述心脏病为糖尿病或高血糖所引起的心脏病。
较佳地，所述医药组合物进一步包含酯型儿茶素。
较佳地，所述干细胞为脂肪干细胞。
较佳地，所述脂肪干细胞与酯型儿茶素预处理2小时。
较佳地，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度低于20μg/mL。
较佳地，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为5-15μM。
本发明提供一种提升干细胞对醣类耐受度及移动能力的方法，所述方法包含将酯型儿茶素加入干细胞的培养基之中。
较佳地，所述酯型儿茶素的浓度为5-15μΜ。
较佳地，所述方法进一步包含将干细胞于含有所述酯型儿茶素的所述干细胞的培养基中培养2小时后取出。
此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施态样。
附图说明
图1为脂肪干细胞特性，分辨第二代脂肪干细胞的正向标记及负向标；
图2为第二代脂肪干细胞的分化能力测试结果；
图3为在高葡萄糖浓度(33mM)的培养基中绿茶EGCG透过CXCR4的表现强化脂肪干细胞能力，脂肪干细胞生长的菌落分布图；
图4为在高葡萄糖浓度(33mM)的培养基中绿茶EGCG透过CXCR4的表现强化脂肪干细胞能力，脂肪干细胞(ADSC)移动能力的测试；
图5为西方墨点法分析图，以不同剂量的绿茶EGCG预处理脂肪干细胞(ADSC)的蛋白质表达量结果；
图6为西方墨点法，出现CXCR4siRNA时有绿茶EGCG预处理和没有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)的蛋白质表达量结果；
图7为脂肪干细胞(ADSC)的移动能力测试结果，当有或没有CXCR4siRNA出现时，有绿茶EGCG预处理和没有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)的移动能力；
图8为西方墨点法，脂肪干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG(10μM)预处理的脂肪干细胞(ADSC)共同培养的心肌细胞H9c2的蛋白质表达量结果；
图9为西方墨点法，在高糖(33mM)的环境中，干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG(10μM)预处理的脂肪干细胞(ADSC)共同培养的心肌细胞H9c2的蛋白质表达量结果；
图10为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的血糖值和体重结果；
图11为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏超音波图；
图12为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的(A)心脏血液射出率(EF％)和(B)心脏压缩率(FS％)；
图13为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏变化组织结构；
图14为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的动物心肌细胞存活蛋白指标分析结果；
图15为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的动物心肌凋亡相关的蛋白质指标的西方墨点法分析结果；
图16为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的凋亡讯号的量化结果；
图17为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏长寿蛋白指标；
图18为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏超音波和心室肥大蛋白指标，其中，(A)为观察心室中隔舒张末期厚度(Interventricular septal thickness at end diastole,IVSd)，(B)为观察心室中隔收缩末期厚度(Interventricular septal thickness at end systole,IVSs)结果；
图19为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏超音波和心室肥大蛋白指标，其中(A)为观察左心室后壁舒张末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWd)，(B)为观察左心室后壁收缩末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at endsystole,LVPWs)结果；
图20为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏超音波和心室肥大蛋白指针，心肌组织的肥大相关蛋白质分析的西方墨点图；
图21为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏纤维蛋白指标，各组大鼠心脏组织Masson Trichrome切片染色结果；
图22为糖尿病老鼠在有干细胞(ADSC)、有绿茶EGCG预处理的脂肪干细胞(ADSC)自体移植时的心脏纤维蛋白指针，心脏组织均质后测其纤维化相关蛋白分析的西方墨点图；
图23为绿茶EGCG透过增加CXCR4的表达量进而增加脂肪干细胞再生心肌细胞能力的总结图；
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
本发明提供一种治疗心脏病的医药处组合物，所述医药组合物包含以绿茶多酚预处理的干细胞，可具有提升干细胞分化能力的功效。
以下实施例为示例性的说明，并非用于限制本发明的范畴。
实施例1:大鼠脂肪干细胞萃取和实验
脂肪干细胞萃取以手术方式将8月龄Wistar品系公鼠腹腔内脂肪取出，将脂肪切成适当大小后，用含抗生素的生理食盐水洗净脂肪，将洗净的脂肪组织置入含有第二型胶原蛋白酶(0.01％)的生理食盐水中，以37℃水浴加热搅拌约1小时，于室温下以3000rpm离心约10分钟，将下层沈淀物取出后在细胞培养皿中，做细胞培养。
1.脂肪干细胞鉴定实验
脂肪干细胞培养到第二代后才经由尾静脉回输到老鼠体内做自体脂肪干细胞移植治疗，在做干细胞自体移植前，需对培养过的脂肪干细胞做鉴定，确定做移植的细胞为干细胞。本实验鉴定干细胞的方法有二种，其一是鉴定脂肪干细胞膜上的正向标记(positivemarker)及负向标记(negative marker)，正向标记亦即干细胞必需要有的标记；反之，负向标记即为干细胞不能有的标记。由图1得知，干细胞上的正向标记CD90及CD29的表达量分别为95％及98％；反之，负向标记CD45及CD31的表达量分别为0.5％及0.5％。除了干细胞膜上的正、负向标记之外，尚要证明干细胞必需具备分化成为别种细胞的能力，由图2得知，在分化能力的测试中，干细胞具有分化成脂肪细胞的能力。
2.基因与siRNA转殖
将细胞培养在DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养液中，待细胞至80％满使用siRNA,target plasmid(标靶载体)以及DharmaFECT Duo transfectionreagent(转染剂)(Dharmacon,Inc.)进行转殖实验。混合3.5l plasmid(质体)(2g/l)及35lsiRNA(20M)于700l serum-free DMEM(无血清的DMEM)培养液(A管)；同时将DharmaFECTDuo reagent(复合试剂)以1：50比例与serum-free DMEM(不含血清的DMEM培养基)培养液进行混合5分钟(B管)。之后将A管与B管进行混合并置放20分钟。等量加入上述的A管与B管混合物于含有细胞的培养皿中，在37℃培养箱中进行转殖作用，最后收细胞进行相关实验分析。
3.蛋白浓度测定
蛋白质的定量采用Bradford protein assay(Bradford蛋白定量)方法，其原理为蛋白质可与Coomassie billiant blue G-250(考马斯亮蓝G250)形成蓝色复合物，当蓝色越深表示蛋白含量越高。测试方法首先以一系列已知浓度BSA(牛血清蛋白)加入五分之一体积的Bradford protein dye(Bradford蛋白染色剂)，以波长595nm可见光的析亮度做标准曲线，再以同样的方法测得样品的OD值，即可根据标准曲线求得样品蛋白的浓度。
4.西方墨点法
细胞加药处理后，除去培养液并以PBS buffer(磷酸盐缓冲液)进行冲洗(3次)，使用1ml PBS(磷酸盐缓冲液)将细胞从培养皿刮下并置于离心管，4℃以12,000rpm离心10分钟去上层液，加lysis buffer(裂解缓冲液，50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH7.5、1mM BME、1﹪NP40、10﹪glycerol(甘油)、protease inhibitor cocktail table(蛋白酶抑制剂调合剂))将细胞混合完全置于冰上，每5分钟震荡一次持续30分钟，4℃以12,000g离心10分钟后取上层液置于新的离心管，测蛋白浓度。细胞质cytochrome c(细胞色素C)萃取：细胞加药处理后，除去培养液并以PBS buffer进行冲洗(3次)，使用1ml PBS将细胞从培养皿含有刮下并置于离心管，4℃以12,000g离心10分钟去上层液，加extraction buffer(提取缓冲液，50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH 7.5、10﹪glycerol(甘油)、protease inhibitor cocktail table(蛋白酶抑制剂调合剂))混合完全，将细胞连同extraction buffer(50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH 7.5、10glycerol(甘油)、protease inhibitor cocktail table(蛋白酶抑制剂调合剂))置于研磨管，在冰上进行研磨，然后将均质液置于新的离心管，4℃以12,000rpm离心10分钟，取上层液置于新的离心管，测蛋白浓度。取样品蛋白40g加入PBS solution(PBS溶液)与5X loading dye(染剂)混合均匀匀煮沸10分钟，再进行SDS-聚丙烯胺板胶电泳分析。SDS-聚丙烯胺板胶电泳上层胶体为3.75％Stacking gel(浓缩胶)，下层胶体为5﹪和12％Separating gel(分离胶)。将做好的板胶固定到电泳装置上，并将电泳缓冲液(Electrode buffer)注满电泳槽，然后将处理过的蛋白样品溶液加入板胶上所形成的U型槽中，以75伏特进行电泳。电泳结束后进行蛋白转移，将胶体取出，将胶体平铺在一张浸湿的Whatman 3M滤纸上，此时将预先用甲醇浸湿的PVDF membrane(Polyvinylidene Fluoride Membrane，聚二氟乙烯膜)盖在胶体上面，依次在覆盖一张浸湿的3M滤纸，并以玻棒轻赶其间的气泡后装入Transfer Holder(转印夹)，然后置于Electrotransfer Tank(转印槽)(内含Transfer buffer(转印缓冲液))于4℃下，进行100伏特电压转移，电转移1小时之后，取出PVDF membrane(聚二氟乙烯膜)浸入含5％(w/v)脱脂牛奶(Blocking buffer(封闭液))(PBS-non-fat milk powder，PBS-脱脂奶粉)于室温下摇动一个小时。将PVDF membrane(聚二氟乙烯膜)置于4度冰箱中与一级抗体反应12小时，之后以Washing buffer(洗涤液)清洗两次，每一次10分钟，最后再清洗一次倒掉即可。再以Horseradish peroxidase conjugated secondary antibody(辣根过氧化物酶第2抗体)反应2小时，以相同的方式清洗PVDF membrane(聚二氟乙烯膜)。最后将PVDFmembrane(聚二氟乙烯膜)浸入4ml的受质溶液(substrate buffer)进行呈色反应。
5.细胞存活分析
细胞培养于24-well dish(24孔培养板)，细胞加药处理后，除去培养液并以PBSbuffer(PBS溶液)进行冲洗(3次)，换含有0.5mg/ml MTT的培养液，培养约3～4小时后除去培养液并以PBS buffer(PBS溶液)进行冲洗，并加入1ml isopropanol(异丙醇)将紫色formazan(三苯基甲脂)结晶溶解，5分钟后进行OD570nm吸光值测定。
6.DAPI(4,6–diamidino-2-phenylindole)细胞荧光染色
细胞加药处理后，除去培养液并以PBS buffer(PBS溶液)进行冲洗(3次)，室温中将细胞以4％paraformaldehyde(多聚甲醛)进行固定30分钟后，PBS buffer(PBS溶液)洗三次除去paraformaldehyde(多聚甲醛)，加入DAPI(4,6–diamidino-2-phenylindole)(1μg/ml)进行染色30分钟再以PBS溶液洗三次，利用荧光显微镜(340/380nm excitation(激发))波长观察，100X照相存档。
7.细胞凋亡分析
细胞加药处理后，除去培养液并以PBS buffer(PBS溶液)进行冲洗(3次)，室温中将细胞以4％paraformaldehyde(多聚甲醛)进行固定1小时后，PBS buffer洗三次除去paraformaldehyde(多聚甲醛)；之后加入permeabilisation solution(渗透液，0.1％Triton X-100in 0.1％sodium citrate(柠檬酸钠))在4℃进行反应2分钟后再以PBS洗三次。以TUNEL reaction mixture(TUNEL反应混合液，label solution+enzyme solution(酶液))处理反应1小时后利用荧光显微镜(450-500nm excitation)波长观察细胞，100X照相存档。
8.绿茶EGCG强化脂肪干细胞能力实验
干细胞增生实验方面，以干细胞在不同实验条件下所生成的菌落数为主，菌落数愈多，则表示干细胞在这个实验条件下生长的状况愈佳。干细胞分为5个组别，分别为干细胞组(组别1)、干细胞用高糖伤害组(组别2)、EGCG(2.5μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别3)、EGCG(5μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别4)及EGCG(10μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别5)。由图3得知，这5组的菌落数分别为338±38、100±26、152±17、178±22及226±31。与正常组相比，将干细胞培养在高糖的情况下，其干细胞生长的菌落分布会被抑制(组别1>组别2,p<0.001)。相对的，相较于高糖的伤害，不同浓度EGCG处理下，干细胞的菌落分布有回复的现象(组别2<组别3,p<0.05；组别2<组别4,p<0.05；组别2<组别5,p<0.01)。
接下来，测试干细胞在不同实验情况下的移动能力，细胞数目愈多，代表干细胞在这个实验情况下其移动能力愈强。我们将干细胞分成5个组别，分别为干细胞组(组别1)、干细胞用高糖伤害组(组别2)、EGCG(2.5μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别3)、EGCG(5μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别4)及EGCG(10μM浓度)预处理干细胞加高糖伤害组(组别5)。图4是干细胞移动能力的测试，这5组的干细胞移动数目分别为63±10、36±7、55±5、84±6及144±4。与正常组相比，在高糖的伤害下，干细胞移动的能力下降(组别1>组别2,p<0.05)。反之，相较于高糖的伤害，不同浓度EGCG处理下，干细胞的移动能力有回复的现象(组别2<组别3,p<0.05；组别2<组别4,p<0.001；组别2<组别5,p<0.001)。图5为干细胞在不同实验条件下的蛋白质表达量分析，在蛋白质的表达量分析时发现，与正常组比较，在高糖伤害时干细胞移动蛋白CXCR4的表达量下降。反之，相较于高糖的伤害，不同浓度EGCG处理下，干细胞的移动蛋白CXCR4及的表达量有回复的现象。相似的情况可在存活相关蛋白p-Akt的表达量观察到。在干细胞凋亡蛋白cytochrome-C表达量上，与正常组比较，在高糖伤害时干细胞凋亡蛋白cytochrome-C表达量上升。反之，相较于高糖的伤害，不同浓度EGCG处理下，干细胞的凋亡蛋白cytochrome-C表达量有下降的现象。图6为干细胞在不同实验条件下的蛋白质表达量分析，在蛋白质的表达量分析时发现，EGCG增加干细胞的CXCR4及p-Akt等蛋白质的表达将会因为siRNA CXCR4的加入而消失。图7为干细胞的移动能力测试，目的是为了测试干细胞在不同实验条件下其移动能力的多寡，此实验将干细胞分成6组，包括干细胞组(组别1)、干细胞加高糖伤害组(组别2)、EGCG(10μM)预处理干细胞加高糖伤害组(组别3)、加入CXCR4之siRNA(3nM)于组别3(组别4)、加入CXCR4之siRNA(5nM)于组别4(组别5)及加入CXCR4的siRNA(10nM)于组别5(组别6)。这6组的干细胞移动数目分别为288±25、36±7、159±17、84±6、41±8及40±2。其中组别2的干细胞移动数目比组别1明显来得少(p<0.001)，组别3则比组别2多(p<0.001)、组别4比组别3少(p<0.01)、组别5比组别3少(p<0.001)而组别6比组别3少(p<0.001)。
接下来的实验是要检测H9c2心肌细胞在高糖的伤害下，干细胞是否有再生的作用。图8是检测H9c2心肌细胞在不同实验条件下其存活相关蛋白质表达量，与正常组(第1列)相较，在高糖伤害下(第2列)，存活相关蛋白如IGF1、PI3K、Akt及p-Bad蛋白质表达量下降，而这些存活蛋白质的表达量在加入干细胞的再生(第3列)下有回升的状况，而加入以EGCG预处理的干细胞(第4列)则这些存活相关的表达量比未处理的干细胞来得多。图9则为H9c2与干细胞共同培养时在不同实验条件下其存活蛋白p-Akt的表达量。加入高糖能降低H9c2的存活蛋白表达量，而加入干细胞或EGCG预处理的干细胞则能使H9c2心肌细胞的存活蛋白表达量上升，而加入CXCR4的siRNA之后，则干细胞及EGCG预处理干细胞的再生效果则会被抑制。
实施例2:动物实验设计和分析
2月龄Wistar品系公鼠(购自绿色四季公司)分成四组，分别是正常组、以STZ(55mg/kg)诱发成糖尿病组、糖尿病加自体脂肪干细胞治疗组及糖尿病加绿茶EGCG前处理的自体脂肪干细胞治疗组等。大鼠是在日间12小时、夜间12小时的循环下饲养于动物房，饲养期间饮食及饮水自由取食，以二只大鼠共养一个动物笼，饲养期间每二天换动物塾料。当糖尿病组老鼠血糖上升至200mg/dl时，即认定有糖尿病的病症，认定糖尿病组一个月后即以自体干细胞移植做治疗。自体干细胞的回输是每只大鼠以尾静脉方式回输1×106颗干细胞。
1.动物血清及体重分析
实验大鼠共分为4组，分别为正常组(sham)、糖尿病组(DM)、干细胞治疗糖尿病组(DM+ADSC)及EGCG预处理干细胞治疗糖尿病组(DM+E-ADSC)。图10(A)表示实验完成后将动物牺牲后，取其血清来检测血液中的血糖值(glucose in serum)，而sham组、DM组、DM+ADSC组及DM+E-ADSC组的血糖值分别为126±9mg/dl、611±35mg/dl(与sham组比p<0.01)、493±37mg/dl(与DM组比p<0.01)及451±16mg/dl(与DM组比p<0.01)。在体重(body weight)方面，如图10(B)所示，sham组、DM组、DM+ADSC组及DM+E-ADSC组的体重值分别为627±46g、438±28g(与sham组比p<0.05)、473±6g及477±13g。
2.动物心脏超音波分析
动物心脏超音波分析是委托中国医药大学心脏科医师依院内标准操作流程执行，图11～图12为实验大鼠的心脏超音波分析，其目的是分析大鼠在不同的组别其心脏功能为何。图11为心脏超音波分析，红色箭头(黑色箭头)表示心脏收缩时的能力，黑色箭头愈长则表示心脏收缩能力愈差，跟sham组比较，DM组的黑色箭头较长，表示DM组老鼠心脏收缩能力比sham组差；而治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组其黑色箭头较DM组短，这代表DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组老鼠心脏收缩能力比DM组好。图12(A)为心脏血液射出率(EF％)，射出率愈高，则代表心脏功能愈佳，这四组的心脏血液射出率sham组、DM组、DM+ADSC组及DM+E-ADSC组分别为75±4％、52±5％(与sham组比p<0.05)、60±3％及68±1％(与DM组比p<0.05)。图12(B)为心脏压缩率(FS％)，心脏压缩率愈高，代表心脏功能愈佳，这四组的心脏压缩率sham组、DM组、DM+ADSC组及DM+E-ADSC组分别为41±3％、24±3％(与sham组比p<0.05)、28±2％及34±1％(与DM组比p<0.05)。
动物心脏组织肥大路径探讨，左心室的改变意味着心脏功能的改变，在动物牺牲之前，我们替大鼠做心脏超音波检查，来观察糖尿病对左心室的影响及干细胞对左心室的再生效果。图18～图20即是以超音波对各组老鼠其左心室的观察结果。图18A是观察心室中隔舒张末期厚度(Interventricular septal thickness at end diastole,IVSd)，各组间的值分别为sham＝1.36±0.1mm、DM＝0.98±0.2mm、DM+ADSC＝1.22±0.1mm及DM+E-ADSC＝1.2±0.1mm。图18B是观察心室中隔收缩末期厚度(Interventricular septal thicknessat end systole,IVSs)，各组间的值分别为sham＝2.68±0.2mm、DM＝1.49±0.1mm(和sham组比较p<0.01)、DM+ADSC＝2.14±0.1mm(和DM组比较p<0.05)及DM+E-ADSC＝2.26±0.3mm(和DM组比较p<0.05)。图19(A)是观察左心室后壁舒张末期厚度(Left ventricularposterior wall thickness at end diastole,LVPWd)，各组间的值分别为sham＝1.36±0.4mm、DM＝0.85±0.1mm、DM+ADSC＝1.11±0.2mm及DM+E-ADSC＝1.12±0.3mm。图19(B)是观察左心室后壁收缩末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at endsystole,LVPWs)，各组间的值分别为sham＝2.19±0.2mm、DM＝1.3±0.1mm(和sham组比较p<0.05)、DM+ADSC＝1.5±0.3mm及DM+E-ADSC＝2.18±0.1mm(和DM组比较p<0.001)。图20则是心肌组织的肥大相关蛋白质分析，与sham组相比较，肥大相关蛋白如p-GATA4、ANP及BNP在DM组中其蛋白表达量明显上升；在治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC中其肥大相关蛋白表达量则明显比DM组来得低，尤其是DM+E-ADSC这组的肥大相关蛋白表达量最低。相反的，p-NFATc3这个非肥大因子的表达量则和肥大因子的表达量呈反趋势。
3.心脏组织切片、染色及分析
心脏组织切片、染色及分析是委托彰化基督教医院病理部依院内标准操作流程执行，于动物实验结束后将实验大鼠牺牲，取其心脏组织加以切片染色，目的是观察心肌细胞的排列情形及心肌组织间隙大小。若心脏受到伤害，则心肌细胞的排列会紊乱且心肌组织间隙会变大。图13是动物心脏组织切HE片染色分析，与sham组比较，DM组的心脏组织切片染色得知其心肌细胞(蓝色点)的排列呈现紊乱且心肌组织间隙会变大(白色空间)；与DM组比较，治疗组(DM+ADSC及DM+E-ADSC)的心脏组织切片染色观察得知其心肌细胞(蓝色点)的排列较整齐且心肌组织间隙变小(白色空间)。
实施例3:动物心肌细胞细胞培养和分析
胚胎大白鼠心肌转型细胞株H9c2cells(from ATCC CRL-1446)以及脂肪干细胞培养于含有10％fetal bovine serum(胎牛血清，FBS,Hyclone)、1％Antibiotic-Antimycotic(抗菌-抗真菌剂，Gibco)的Dulbeco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Sigma)，培养箱设定5％CO2，37℃恒温的环境，每周更换陪养液2～3次。使用serum-freemedium(无血清培养基)培养心肌细胞over night后便以药物依不同时间点或依不同药物浓度处理心肌细胞。
1.动物心肌细胞存活蛋白分析
动物实验结束后，将各组大鼠心脏游离后并加以均质化，以西方点渍法分析各组大鼠心脏组织中和存活相关的蛋白质其表达量的多寡。由图14可知，和sham组相比，DM组中和存活相关的蛋白质表达量明显下降；而治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组的存活蛋白质的表达量明显比DM组来得高；更进一步观察得知，在DM+E-ADSC这组中的IGF1R、p-PI3K及p-Akt这三个存活相关蛋白的表达量又比DM+ADSC这组来得多。
2.动物心肌细胞凋亡蛋白分析
动物实验结束后，将各组大鼠心脏游离后并加以均质化，以西方点渍法分析各组大鼠心脏组织中和凋亡相关的蛋白质其表达量的多寡。由图15可知，和sham组相比，DM组中和凋亡相关的蛋白质表达量明显上升；而治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组的凋亡蛋白质的表达量明显比DM组来得低；更进一步观察得知，在DM+E-ADSC这组中的凋亡相关蛋白的表达量又比DM+ADSC这组来得低。以TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling)法染色方式来观察心肌细胞的凋亡现象，此染色是以二种染剂TUNEL及DAPI来染心肌细胞，DAPI是染心肌细胞的细胞核(显示蓝色)，是用以确认心肌细胞的多寡；而TUNEL是染凋亡的心肌细胞(显示绿色)，亦即凋亡的心肌细胞会呈现绿色荧光被侦测到。凋亡讯号(绿色)在sham、DM、DM+ADSC及DM+E-ADSC此四组的数据分别为2±1％、14±4％、6±1％及5±2％(如图16)。和sham组相比，DM组的绿色荧光亮点明显比较多(sham<DM,p<0.01)，而治疗组DM+ADSC(DM>DM+ADSC,p<0.05)及DM+E-ADSC(DM>DM+E-ADSC,p<0.05)的绿色荧光高点则明显比DM组少。
3.动物心肌细胞Sirt1相关蛋白分析
动物实验结束后，将各组大鼠心脏游离后并加以均质化，以西方点渍法分析各组大鼠心脏组织中和Sirt1相关的蛋白质其表达量的多寡。由图17可知，和sham组相比，DM组中和Sirt1相关的蛋白质表达量明显下降；而治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组的Sirt1蛋白质的表达量明显比DM组来得高；更进一步观察得知，在DM+E-ADSC这组中的Sirt1相关蛋白的表达量又比DM+ADSC这组来得高。
4.动物心脏组织纤维化路径探讨
动物实验结束后将实验大鼠牺牲，取其心脏组织加以Masson Trichrome(三重染色法)切片染色，目的是观察心脏组织中蓝色部份的胶原蛋白堆积。若蓝色部份的面积愈大，代表胶原蛋白的堆积愈多，则意味着心脏纤维化的状况愈严重。图21是各组大鼠心脏组织Masson Trichrome切片染色的结果，与sham相比，DM组的蓝色胶原蛋白堆积部份明显增多，相对的和DM组比较，治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC的蓝色胶原蛋白堆积部份明显变少。图22是心脏组织均质后测其纤维化相关蛋白的表达量，由图22可知，与sham相比，DM组的纤维化蛋白表达量明显上升；相对的与DM组相比，治疗组DM+ADSC及DM+E-ADSC这二组的纤维化相关蛋白表达量明显下降
由以上相关研究数据得知，糖尿病会引起大鼠的心脏组织的受损，而脂肪干细胞具有恢复糖尿病性心脏组织的再生的能力，若以脂肪干细胞经绿茶EGCG处理后，预处理绿茶EGCG的脂肪干细胞对糖尿病所引起的心脏受损的再生能力具有明显上升。由此可知，以绿茶EGCG预处理脂肪干细胞后，可提升干细胞的再生能力，由细胞实验得知，绿茶EGCG能使脂肪干细胞膜上的CXCR4蛋白质表达量上升，而CXCR4表达量上升后，干细胞的增生能力、存活能力、抗凋亡能力及移动能力均显着上升。而在动物实验中亦得到进一步的数据，证实经绿茶EGCG处理过的干细胞再生的心肌细胞的能力比未经绿茶EGCG处理过的干细胞再生的心肌细胞来得好。而图23则以图示的方式来说明绿茶EGCG如何透过增加CXCR4的表达量进而增加脂肪干细胞再生心肌细胞的能力。
本发明证实以绿茶EGCG透过增加CXCR4表达量以强化脂肪干细胞再生糖尿病性心肌功能损伤的研究，未来在干细胞用于临床用途时，常常会有干细胞回输剂量的问题，若能以绿茶EGCG来处理干细胞的话，就能在干细胞回输时的剂量限制之下，提升干细胞的治疗能力，使干细胞的治疗更加显着。

Claims (14)

1.一种用于治疗心脏病的医药组合物，其特征是，所述医药组合物包含脂肪干细胞以及酯型儿茶素。
2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征是，所述心脏病为糖尿病或高血糖所引起的心脏病。
3.如权利要求1所述的医药组合物，其特征是，所述脂肪干细胞于酯型儿茶素预处理2小时。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其特征是，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为5-15 μM。
5.如权利要求3所述的医药组合物，其特征是，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为低于20 μM。
6.一种预处理的脂肪干细胞在制备治疗心脏病的医药组合物中的用途，其特征是，所述预处理的脂肪干细胞是以酯型儿茶素与脂肪干细胞共同培养。
7.如权利要求6所述的用途，其特征是，所述心脏病是由糖尿病或高血糖所引起。
8.如权利要求6所述的用途，其特征是，所述医药组合物通过静脉注射给予个体。
9.如权利要求8所述的用途，其特征是，将所述脂肪干细胞于酯型儿茶素预处理2小时后再通过静脉注射给予所述个体。
10.如权利要求9所述的用途，其特征是，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为5-15 μM。
11.如权利要求9所述的用途，其特征是，预处理脂肪干细胞的酯型儿茶素的浓度为低于20 μM。
12.一种提升脂肪干细胞对糖类耐受度及移动能力的方法，其特征是，所述方法包含将酯型儿茶素加入脂肪干细胞的培养基之中。
13.如权利要求12所述的方法，其特征是，所述酯型儿茶素的浓度为5-15μΜ。
14.如权利要求12所述的方法，其特征是，所述方法进一步包含将脂肪干细胞于含有所述酯型儿茶素的所述脂肪干细胞的培养基中培养2小时后取出。
CN201680033814.2A 2016-05-20 2016-05-20 一种治疗心脏病的医药组合物 Active CN107849524B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2016/082851 WO2017197648A1 (zh) 2016-05-20 2016-05-20 一种治疗心脏病的医药组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107849524A CN107849524A (zh) 2018-03-27
CN107849524B true CN107849524B (zh) 2021-05-18

Family

ID=60324564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680033814.2A Active CN107849524B (zh) 2016-05-20 2016-05-20 一种治疗心脏病的医药组合物

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107849524B (zh)
WO (1) WO2017197648A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202211063D0 (en) * 2022-07-28 2022-09-14 Adamas Biotech S R L Catechin containing formulations and uses

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877962A (zh) * 2015-04-15 2015-09-02 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种无血清的脂肪干细胞培养基及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140179775A1 (en) * 2012-02-29 2014-06-26 Mead Johnson Nutrition Company Neurogenesis screening method and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877962A (zh) * 2015-04-15 2015-09-02 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种无血清的脂肪干细胞培养基及其制备方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acetylated FoxO1 mediates high-glucose induced autophagy in H9c2 cardiomyoblasts: Regulation by a polyphenol-(-)-epigallocatechin-3-gallate;Jia Liu et al.;《Metabolism》;20141031;第63卷(第10期);第1314页第4段、第1315页左栏第3段 *
EGCG inhibits CTGF expression via blocking NF-B activation in cardiac fibroblast;Yi Cai et al.;《Phytomedicine》;20131231;第20卷;第106-113页 *
Green tea epigallocatechin gallate enhances cardiac function restoration through survival signaling expression in diabetes mellitus rats with autologous adipose tissue-derived stem cells;Tung Sheng Chen et al.;《J Appl Physiol》;20170525;第123卷;第1081-1091页 *
Green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) promotes neural progenitor cell proliferation and sonic hedgehog pathway activation during adult hippocampal neurogenesis;Yanyan Wang et al.;《Mol. Nutr. Food Res.》;20121231;第56卷;第1292-1303页 *
Green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) reduces β-amyloid mediated cognitive impairment and modulates tau pathology in Alzheimer transgenic mice;Kavon Rezai-Zadeh et al.;《BRAIN RESEARCH》;20080407;第1214卷;第177-187页 *
Oral administration of green tea Epigallocatechin-3-gallate reduces oxidative stress and enhances restoration of cardiac function in diabetic rats receiving autologous transplantation of adipose-derived stem cells;Tung Sheng Chen et al.;《Archives of Physiology and Biochemistry》;20190521;第1-9页 *
应用脂肪干细胞治疗心肌梗死的研究进展;李相伯等;《中国胸心血管外科临床杂志》;20131031;第20卷(第5期);第592页右栏第2段 *
李相伯等.应用脂肪干细胞治疗心肌梗死的研究进展.《中国胸心血管外科临床杂志》.2013,第20卷(第5期),第592-595页. *
茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因表达的影响;谢丽华 等;《中医药导报》;20120630;第18卷(第6期);第3-6页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107849524A (zh) 2018-03-27
WO2017197648A1 (zh) 2017-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Cardiac recovery via extended cell-free delivery of extracellular vesicles secreted by cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells
Park et al. Dual stem cell therapy synergistically improves cardiac function and vascular regeneration following myocardial infarction
Xue et al. Exosomes derived from hypoxia-treated human adipose mesenchymal stem cells enhance angiogenesis through the PKA signaling pathway
JP7363003B2 (ja) 間葉系幹細胞由来細胞外小胞
RU2710373C2 (ru) Композиция, включающая экзосому, полученную из стволовых клеток, для индукции адипогенной дифференцировки, регенерации жировой ткани, отбеливания кожи или коррекции морщин
KR101771474B1 (ko) 심장 조직을 처치하는 세포를 이용하는 조성물 및 방법
Johnson et al. Exosomes derived from induced vascular progenitor cells promote angiogenesis in vitro and in an in vivo rat hindlimb ischemia model
KR101039235B1 (ko) 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는치료용 조성물
JP6555691B2 (ja) 間葉系幹細胞の賦活化剤、賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法
EP3862009A1 (en) Composition for skin regeneration and wound healing, comprising induced exosomes
Li et al. Circular RNA 0001273 in exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells (UMSCs) in myocardial infarction.
CN116042517A (zh) 间充质干细胞衍生的外泌体在制备治疗2型糖尿病药物中的应用
KR20080042761A (ko) 렙틴을 이용한 줄기세포 증식방법
Chen et al. Bone marrow derived mesenchymal stromal cells ameliorate ischemia/reperfusion injury-induced acute kidney injury in rats via secreting tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein
Wang et al. Therapeutic effects of conditioned medium from bone marrow-derived mesenchymal stem cells on epithelial-mesenchymal transition in A549 cells
CN113274411A (zh) 经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用
Gopinath et al. Human umbilical cord blood derived stem cells repair doxorubicin-induced pathological cardiac hypertrophy in mice
CN107849524B (zh) 一种治疗心脏病的医药组合物
KR101834800B1 (ko) 심장 조직-유래 세포
Kamdar et al. Cellular therapy promotes endogenous stem cell repair
US20170333388A1 (en) Therapeutic compound and its application in repairing diabetes-related cardiac injuries
US11672830B2 (en) MicroRNA-294 and Lin28A as a driver of cardiac tissue proliferation in response to pathological injury
TW201740961A (zh) 修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物及其治療方法
CN115137828B (zh) miR-302c-3p在制备治疗椎间盘退变药物中的应用
CN113373117B (zh) 一种过表达miR-13474工程化外泌体及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant