TW201740961A - 修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物及其治療方法 - Google Patents

Abstract

本發明是關於一種修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物及其使用方法，尤其關於一種提供含有酯型兒茶素(EGCG)和脂肪幹細胞的醫藥組合物，酯型兒茶素(EGCG)能提升脂肪幹細胞能力，增加脂肪幹細胞修復受損組織的能力，以進行修復糖尿病性心臟病之使用方法。

Description

修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物及其治療方法

本發明提供一種修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物及其使用方法，其中該修復糖尿病性心臟病之醫藥組合物含有以酯型兒茶素(EGCG)預處理之脂肪幹細胞，所述之經綠茶兒茶素預處理脂肪幹細胞的修復受損組織的能力具有明顯上升。

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種由於體內缺乏胰島素或是胰島素在靶細胞不能發揮正常的生理作用而起的糖、蛋白質和脂肪代謝紊亂，臨床上證實，有許多疾病會伴隨著糖尿病的產生而發生，這些疾病稱之為糖尿病的併發症。糖尿病的併發症有心血管疾病、腎臟病變、週邊血管病變、眼晴疾病、肝臟疾病或神經病變或週邊神經病變等病變。其中每4個糖尿病人中，就有2個有心臟功能異常的狀況出現，顯示糖尿病性心臟病是糖尿病人主要的併發症。

有相關研究指出糖尿病對心臟所造成的傷害，是透過血糖本身或是糖化終端產物(advanced glycation end products,AGEs)(11)，不論是那種刺激源，都會造成心肌細胞的氧化壓力上升，而上升的氧化壓力會破壞心 肌細胞內的粒腺體，使得細胞凋亡相關蛋白(如caspase-3及t-Bad)等表現量上升。相對的，細胞存活蛋白如p-Akt的表現量下降，而進一步引發心肌細胞的病理反應，如細胞凋亡、心肌細胞肥大、發炎反應甚至纖維化反應。這些病理反應的表現到最後會造成心臟功能的下降，且心肌發炎發生後，其受損細胞無法自行再生，目前的藥物治療無法使受損細胞自行再生，因此無法讓心臟功能恢復和解決高血糖的問題。

幹細胞療法具有能治療糖尿病引起的心臟及心血管病變，能使受損細胞自行再生，使心臟功能恢復。但研究發現幹細胞於高糖濃度下之再生能力不佳，如何使幹細胞能在高糖環境下仍能維持再生能力是自體幹細胞修復糖尿病性心臟病急需解決的問題。

本發明提供一種治療心臟發炎之醫藥處組合物，其中該醫藥組合物包含一幹細胞。

較佳地，該心臟發炎係為糖尿病或高血糖所引起。

較佳地，該醫藥組合物進一步包含酯型兒茶素。

較佳地，該幹細胞為脂肪幹細胞。

較佳地，該脂肪幹細胞與酯型兒茶素預處理2小時。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為低於20μM。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為5-15μg/mL。

本發明提供一種治療心臟發炎之方法，其中該方法包含將1X10⁵顆之幹細胞藉由靜脈注射給與一個體。

較佳地，該心臟發炎係為糖尿病或高血糖所引起。

較佳地，該醫藥組合物進一步包含酯型兒茶素。

較佳地，該幹細胞為脂肪幹細胞。

較佳地，該脂肪幹細胞與酯型兒茶素預處理2小時。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度低於20μg/mL。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為為5-15μM。

本發明提供一種提升幹細胞對醣類耐受度及移動能力之方法，該方法包含將一酯型兒茶素加入一幹細胞之培養基之中。

較佳地，該酯型兒茶素之濃度為5-15μM。

較佳地，該方法進一步包含將幹細胞於含有該酯型兒茶素的該幹細胞之培養基中培養2小時後取出。

發明內容旨在提供本發明內容的簡化摘要，以使閱讀者對本發明內容具備基本的理解。此發明內容 並非本發明內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

第1圖為脂肪幹細胞特性，分辨第二代脂肪幹細胞的正向標記及負向標；第2圖為第二代脂肪幹細胞的分化能力測試結果；第3圖為在高葡萄糖濃度(33mM)的培養基中綠茶EGCG透過CXCR4的表現強化脂肪幹細胞能力，脂肪幹細胞生長的菌落分佈圖；第4圖為在高葡萄糖濃度(33mM)的培養基中綠茶EGCG透過CXCR4的表現強化脂肪幹細胞能力，脂肪幹細胞(ADSC)移動能力的測試；第5圖為西方墨點法分析圖，以不同劑量的綠茶EGCG預處理脂肪幹細胞(ADSC)的蛋白質表現量結果；第6圖為西方墨點法，出現CXCR4 siRNA時有綠茶EGCG預處理和沒有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)的蛋白質表現量結果；第7圖為脂肪幹細胞(ADSC)的移動能力測試結果，當有或沒有CXCR4 siRNA出現時，有綠茶EGCG預處理和沒有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)的移動能力； 第8圖為西方墨點法，和脂肪幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG(10μM)預處理的脂肪幹細胞(ADSC)共同培養的心肌細胞H9c2的蛋白質表現量結果；第9圖為西方墨點法，在高糖(33mM)的環境中，幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG(10μM)預處理的脂肪幹細胞(ADSC)共同培養的心肌細胞H9c2的蛋白質表現量結果；第10圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的血糖值和體重結果；第11圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟超音波圖；第12圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的(A)心臟血液射出率(EF%)和(B)心臟壓縮率(FS%)；第13圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟變化組織圖；第14圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的動物心肌細胞存活蛋白指標分析結果；第15圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有 綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的動物心肌凋亡相關的蛋白質指標的西方墨點法分析結果；第16圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的凋亡訊號(綠色亮點)分析結果；第17圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟長壽蛋白指標；第18圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟超音波和心室肥大蛋白指標，(A)觀察心室中隔舒張末期厚度(Interventricular septal thickness at end diastole,IVSd)，(B)觀察心室中隔收縮末期厚度(Interventricular septal thickness at end systole,IVSs)結果；第19圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟超音波和心室肥大蛋白指標，(A)觀察左心室後壁舒張末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWd)，(B)觀察左心室後壁收縮末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at end systole,LVPWs)結果；第20圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟超音波和 心室肥大蛋白指標，心肌組織的肥大相關蛋白質分析的西方墨點圖；第21圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟纖維蛋白指標，各組大鼠心臟組織Masson Trichrome切片染色結果；第22圖為糖尿病老鼠在有幹細胞(ADSC)或和有綠茶EGCG預處理的脂肪幹細胞(ADSC)自體移植時的心臟纖維蛋白指標，心臟組織均質後測其纖維化相關蛋白分析的西方墨點圖；第23圖為總結圖；

為了使本發明內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

本發明提供一種治療心臟發炎之醫藥處組合物，其中該醫藥組合物包含一以綠茶多酚預處理之幹細胞，可具有提升幹細胞分化能力的功效。

以下實施例為示例性之說明，並非用於限制本發明之範疇。

實施例1：大鼠脂肪幹細胞萃取和實驗

脂肪幹細胞萃取以手術方式將8月齡Wistar品系公鼠腹腔內脂肪取出，將脂肪切成適當大小後，用含抗生素之生理食鹽水洗淨脂肪，將洗淨之脂肪組織置入含有第二型膠原蛋白酶(0.01%)的生理食鹽水中，以37℃水浴加熱攪拌約1小時，於室溫下以3000rpm離心約10分鐘，將下層沈澱物取出後在細胞培養皿中，做細胞培養。

1. 脂肪幹細胞鑑定實驗

脂肪幹細胞培養到第二代後才經由尾靜脈回輸到老鼠體內做自體脂肪幹細胞移植治療，在做幹細胞自體移植前，需對培養過的脂肪幹細胞做鑑定，確定做移植的細胞為幹細胞。本實驗鑑定幹細胞的方法有二種，其一是鑑定脂肪幹細胞膜上的正向標記(positive marker)及負向標記(negative marker)，正向標記亦即幹細胞必需要有的標記；反之，負向標記即為幹細胞不能有的標記。由圖1得知，幹細胞上的正向標記CD90及CD29的表現量分別為95%及98%；反之，負向標記CD45及CD31的表現量分別為0.5%及0.5%。除了幹細胞膜上的正、負向標記之外，尚要證明幹細胞必需具備分化成為別種細胞的能力，圖2得知，在分化能力的測試中，幹細胞具有分化成脂肪細胞的能力。

2. 基因與siRNA轉殖

將細胞培養在DMEM培養液中，待細胞至80%滿使用siRNA,target plasmid以及DharmaFECT Duo transfection reagent(Dharmacon,Inc.)進行轉殖實驗。混合3.5 1 plasmid(2g/l)及351 siRNA(20M)於7001 serum-free DMEM培養液(A tube)；同時將DharmaFECT Duo reagent以1：50比例與serum-free DMEM培養液進行混合5分鐘(B tube)。之後將A tube與B tube進行混合並置放20分鐘。等量加入上述的A與B混合物於含有細胞的培養皿中，在37℃培養箱中進行轉殖作用，最後收細胞進行相關實驗分析。

3. 蛋白濃度測定

蛋白質的定量採用Bradford protein assay方法，其原理為蛋白質可與Coomassie billiant blue G-250形成藍色複合物，當藍色越深表示蛋白含量越高。測試方法首先以一系列已知濃度BSA加入五分之一體積的Bradford protein dye，以波長595nm可見光之析光度做一標準曲線，再以同樣的方法測得樣品之O.D.值，即可根據標準曲線求得樣品蛋白之濃度。

4. 西方墨點法

細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，使用1ml PBS將細胞從培養皿含有刮下並置於離心管，4℃以12,000rpm離心10分鐘去上層液，加 lysis buffer(50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH 7.5、1mM BME、1% NP40、10% glycerol、protease inhibitor cocktail table)將細胞混合完全置於冰上，每5分鐘震盪一次持續30分鐘，4℃以12,000g離心10分鐘後取上層液置於新的離心管，測蛋白濃度。細胞質cytochrome c萃取：細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，使用1ml PBS將細胞從培養皿含有刮下並置於離心管，4℃以12,000g離心10分鐘去上層液，加extraction buffer(50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH 7.5、10% glycerol、protease inhibitor cocktail table)混合完全，將細胞連同extraction buffer(50mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1.0mM EDTA pH 7.5、10glycerol、protease inhibitor cocktail table)置於研磨管，在冰上進行研磨，然後將均質液置於新的離心管，4℃以12,000rpm離心10分鐘，取上層液置於新的離心管，測蛋白濃度。取樣品蛋白40g加入PBS solution與5X loading dye混合均勻勻煮沸10分鐘，再進行SDS-聚丙烯胺板膠電泳分析。SDS-聚丙烯胺板膠電泳之上層膠體為3.75% Stacking gel，下層膠體為5%和12% Separating gel。將做好之板膠固定到電泳裝置上，並將電泳緩衝液(Electrode buffer)注滿電泳槽，然將處理過的蛋白樣品溶液加入板膠上所形成的U型槽中，以75伏特進行電泳。電泳結束後進行蛋 白轉移，將膠體取出，將膠體平鋪在一張浸濕的Whatman 3M濾紙上，此時將預先用甲醇浸濕的PVDF membrane蓋在膠體上面，依次在覆蓋一張浸濕的3M濾紙，並以玻棒輕趕其間的氣泡後裝入Transfer Holder，然後置於Electrotransfer Tank(內含Transfer buffer)於4℃下，進行100伏特電壓轉移，電轉移1小時之後，取出PVDF membrane浸入含5%(w/v)脫脂牛奶(Blocking buffer)(PBS-non-fat milk powder)於室溫下搖動一個小時。將PVDF membrane置於4度冰箱中與一級抗體反應overnight，之後以Washing buffer清洗兩次，每一次10分鐘，最後再清洗一次倒掉即可。再以Horseradish peroxidase conjugated secondary antibody反應2小時，以相同的方式清洗PVDF membrane。最後將PVDF membrane浸入4ml的受質溶液(substrate buffer)進行呈色反應。

5. 細胞存活分析

細胞培養於24-well dish，細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，換含有0.5mg/ml MTT的培養液，培養約3~4小時後除去培養液並以PBS buffer進行沖洗，並加入1ml isopropanol將紫色formazan結晶溶解，5分鐘後進行O.D.570nm吸光值測定。

6. DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)細胞螢光染色

細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，室溫中將細胞以4% paraformaldehyde進行固定30分鐘後，PBS buffer洗三次除去paraformaldehyde，加入DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)(1μg/ml)進行染色30分鐘再以PBS洗三次，利用螢光顯微鏡(340/380nm excitation)波長觀察，100X照相存檔。

7. 細胞凋亡分析

細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，室溫中將細胞以4% paraformaldehyde進行固定1小時後，PBS buffer洗三次除去paraformaldehyde；之後加入permeabilisation solution(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)在4℃進行反應2分鐘後再以PBS洗三次。以TUNEL reaction mixture(label solution+enzyme solution)處理反應1小時後利用螢光顯微鏡(450-500nm excitation)波長觀察細胞，100X照相存檔。

8. 綠茶EGCG強化脂肪幹細胞能力實驗

幹細胞增生實驗方面，以幹細胞在不同實驗條件下所生成的菌落數為主，菌落數愈多，則表示幹細胞在這個實驗條件下生長的狀況愈佳。幹細胞分為5個組別，分別為幹細胞組(組別1)、幹細胞用高糖傷害組(組別 2)、EGCG(2.5μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別3)、EGCG(5μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別4)及EGCG(10μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別5)。由圖3得知，這5組的菌落數分別為338±38、100±26、152±17、178±22及226±31。與正常組相比，將幹細胞培養在高糖的情況下，其幹細胞生長的菌落分佈會被抑制(組別1>組別2,p<0.001)。相對的，相較於高糖的傷害，不同濃度EGCG處理下，幹細胞的菌落分佈有回復的現象(組別2<組別3,p<0.05；組別2<組別4,p<0.05；組別2<組別5,p<0.01)。接下來，測試幹細胞在不同實驗情況下的移動能力，細胞數目愈多，代表幹細胞在這個實驗情況下其移動能力愈強。我們將幹細胞分成5個組別，分別為幹細胞組(組別1)、幹細胞用高糖傷害組(組別2)、EGCG(2.5μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別3)、EGCG(5μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別4)及EGCG(10μM濃度)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別5)。圖4是幹細胞移動能力的測試，這5組的幹細胞移動數目分別為63±10、36±7、55±5、84±6及144±4。與正常組相比，在高糖的傷害下，幹細胞移動的能力下降(組別1>組別2,p<0.05)。反之，相較於高糖的傷害，不同濃度EGCG處理下，幹細胞的移動能力有回復的現象(組別2<組別3,p<0.05；組別2<組別4,p<0.001；組別2<組別5,p<0.001)。 圖5為幹細胞在不同實驗條件下的蛋白質表現量分析，在蛋白質的表現量分析時發現，與正常組比較，在高糖傷害時幹細胞移動蛋白CXCR4的表現量下降。反之，相較於高糖的傷害，不同濃度EGCG處理下，幹細胞的移動蛋白CXCR4及的表現量有回復的現象。相似的情況可在存活相關蛋白p-Akt的表現量觀察到。在幹細胞凋亡蛋白cytochrome-C表現量上，與正常組比較，在高糖傷害時幹細胞凋亡蛋白cytochrome-C表現量上升。反之，相較於高糖的傷害，不同濃度EGCG處理下，幹細胞的凋亡蛋白cytochrome-C表現量有下降的現象。圖6為幹細胞在不同實驗條件下的蛋白質表現量分析，在蛋白質的表現量分析時發現，EGCG增加幹細胞的CXCR4及p-Akt等蛋白質的表現將會因為siRNA CXCR4的加入而消失。圖7為幹細胞的移動能力測試，目的是為了測試幹細胞在不同實驗條件下其移動能力的多寡，此實驗將幹細胞分成6組，包括幹細胞組(組別1)、幹細胞加高糖傷害組(組別2)、EGCG(10μM)預處理幹細胞加高糖傷害組(組別3)、加入CXCR4之siRNA(3nM)於組別3(組別4)、加入CXCR4之siRNA(5nM)於組別4(組別5)及加入CXCR4之siRNA(10nM)於組別5(組別6)。這6組的幹細胞移動數目分別為288±25、36±7、159±17、84±6、41±8及40±2。其中組別2的幹細胞移動數目比組別1明顯來得少 (p<0.001)，組別3則比組別2多(p<0.001)、組別4比組別3少(p<0.01)、組別5比組別3少(p<0.001)而組別6比組別3少(p<0.001)。接下來的實驗是要檢測H9c2心肌細胞在高糖的傷害下，幹細胞是否有再生的作用。圖8是檢測H9c2心肌細胞在不同實驗條件下其存活相關蛋白質表現量，與正常組(第1列)相較，在高糖傷害下(第2列)，存活相關蛋白如IGF1、PI3K、Akt及p-Bad蛋白質表現量下降，而這些存活蛋白質的表現量在加入幹細胞的再生(第3列)下有回升的狀況，而加入以EGCG預處理之幹細胞(第4列)則這些存活相關的表現量比未處理的幹細胞來得多。圖2G則為H9c2與幹細胞共同培養時在不同實驗條件下其存活蛋白p-Akt的表現量。加入高糖能降低H9c2的存活蛋白表現量，而加入幹細胞或EGCG預處理之幹細胞則能使H9c2心肌細胞的存活蛋白表現量上升，而加入CXCR4的siRNA之後，則幹細胞及EGCG預處理幹細胞的再生效果則會被抑制。

實施例2：動物實驗設計和分析

2月齡Wistar品系公鼠(購自綠色四季公司)分成四組，分別是正常組、以STZ(55mg/kg)誘發成糖尿病組、糖尿病加自體脂肪幹細胞治療組及糖尿病加綠茶EGCG前處理之自體脂肪幹細胞治療組等，如下圖所示。大鼠是在日間12小時、夜間12小時的循環下飼養於動物 房，飼養期間飲食及飲水自由取食，以二隻大鼠共養一個動物籠，飼養期間每二天換動物塾料。當糖尿病組老鼠血糖上升至200mg/dl時，即認定有糖尿病的病症，認定糖尿病組一個月後即以自體幹細胞移植做治療。自體幹細胞的回輸是每隻大鼠以尾靜脈方式回輸1x10⁶顆幹細胞。

1. 動物血清及體重分析

實驗大鼠共分為4組，分別為正常組(sham)、糖尿病組(DM)、幹細胞治療糖尿病組(DM+ADSC)及EGCG預處理幹細胞治療糖尿病組(DM+E-ADSC)。圖10(A)表示實驗完成後將動物犧牲後，取其血清來檢測血液中的血糖值，而sham組、DM組、DM+ADSC組及DM+E-ADSC組的血糖值分別為126±9mg/dl、611±35mg/dl(與sham組比p<0.01)、493±37mg/dl(與DM組比p<0.01)及451±16mg/dl(與DM組比p<0.01)。在體重方面，如圖10B所示，sham組、DM組、DM+ADSC組及DM+E-ADSC組的體重值分別為627±46g、438±28g(與sham組比p<0.05)、473±6g及477±13g。

2. 動物心臟超音波分析

動物心臟超音波分析是委託中國醫藥大學心臟科醫師依院內標準操作流程執行，圖11~圖12為實驗大鼠之心臟超音波分析，其目的是分析大鼠在不同的組 別其心臟功能為何。圖11為心臟超音波分析，紅色箭頭表示心臟收縮時的能力，紅色箭頭愈長則表示心臟收縮能力愈差，跟sham組比較，DM組的紅色箭頭較長，表示DM組老鼠心臟收縮能力比sham組差；而治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組其紅色箭頭較DM組短，這代表DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組老鼠心臟收縮能力比DM組好。圖12為心臟血液射出率(EF%)，射出率愈高，則代表心臟功能愈佳，這四組的心臟血液射出率sham組、DM組、DM+ADSC組及DM+E-ADSC組分別為75±4%、52±5%(與sham組比p<0.05)、60±3%及68±1%(與DM組比p<0.05)。圖12為心臟壓縮率，心臟壓縮率愈高，代表心臟功能愈佳，這四組的心臟壓縮率sham組、DM組、DM+ADSC組及DM+E-ADSC組分別為41±3%、24±3%(與sham組比p<0.05)、28±2%及34±1%(與DM組比p<0.05)。

動物心臟組織肥大路徑探討，左心室的改變意味著心臟功能的改變，在動物犧牲之前，我們替大鼠做心臟超音波檢查，來觀察糖尿病對左心室的影響及幹細胞對左心室的再生效果。圖18~圖20即是以超音波對各組老鼠其左心室的觀察結果。圖18A是觀察心室中隔舒張末期厚度(Interventricular septal thickness at end diastole,IVSd)，各組間的值分別為sham=1.36±0.1mm、DM=0.98±0.2mm、DM+ADSC=1.22±0.1mm及 DM+E-ADSC=1.2±0.1mm。圖18B是觀察心室中隔收縮末期厚度(Interventricular septal thickness at end systole,IVSs)，各組間的值分別為sham=2.68±0.2mm、DM=1.49±0.1mm(和sham組比較p<0.01)、DM+ADSC=2.14±0.1mm(和DM組比較p<0.05)及DM+E-ADSC=2.26±0.3mm(和DM組比較p<0.05)。圖19是觀察左心室後壁舒張末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWd)，各組間的值分別為sham=1.36±0.4mm、DM=0.85±0.1mm、DM+ADSC=1.11±0.2mm及DM+E-ADSC=1.12±0.3mm。圖19是觀察左心室後壁收縮末期厚度(Left ventricular posterior wall thickness at end systole,LVPWs)，各組間的值分別為sham=2.19±0.2mm、DM=1.3±0.1mm(和sham組比較p<0.05)、DM+ADSC=1.5±0.3mm及DM+E-ADSC=2.18±0.1mm(和DM組比較p<0.001)。圖20則是心肌組織的肥大相關蛋白質分析，與sham組相比較，肥大相關蛋白如p-GATA4、ANP及BNP在DM組中其蛋白表現量明顯上升；在治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC中其肥大相關蛋白表現量則明顯比DM組來得低，尤其是DM+E-ADSC這組的肥大相關蛋白表現量最低。相反的，p-NFATc3這個非肥大因子的表現量則和肥大因子的表現量呈反趨勢。

3. 心臟組織切片、染色及分析

心臟組織切片、染色及分析是委託彰化基督教醫院病理部依院內標準操作流程執行，於動物實驗結束後將實驗大鼠犧牲，取其心臟組織加以切片染色，目的是觀察心肌細胞的排列情形及心肌組織間隙大小。若心臟受到傷害，則心肌細胞的排列會紊亂且心肌組織間隙會變大。圖13是動物心臟組織切HE片染色分析，與sham組比較，DM組的心臟組織切片染色得知其心肌細胞(藍色點)的排列呈現紊亂且心肌組織間隙會變大(白色空間)；與DM組比較，治療組(DM+ADSC及DM+E-ADSC)的心臟組織切片染色觀察得知其心肌細胞(藍色點)的排列較整齊且心肌組織間隙變小(白色空間)。

實施例3：動物心肌細胞細胞培養和分析

胚胎大白鼠心肌轉型細胞株H9c2 cells(from ATCC CRL-1446)以及脂肪幹細胞培養於含有10% fetal bovine serum(FBS,Hyclone)、1% Antibiotic-Antimycotic(Gibco)的Dulbeco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Sigma)，培養箱設定5% CO2，37℃恆溫的環境，每週更換陪養液2~3次。使用serum-free medium培養心肌細胞over night後便以藥物依不同時間點或依不同藥物濃度處理心肌細胞。

1. 動物心肌細胞存活蛋白分析

動物實驗結束後，將各組大鼠心臟游離後並加以均質化，以西方點漬法分析各組大鼠心臟組織中和存活相關的蛋白質其表現量的多寡。由圖14可知，和sham組相比，DM組中和存活相關的蛋白質表現量明顯下降；而治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組的存活蛋白質的表現量明顯比DM組來得高；更進一步觀察得知，在DM+E-ADSC這組中的IGF1R、p-PI3K及p-Akt這三個存活相關蛋白的表現量又比DM+ADSC這組來得多。

2. 動物心肌細胞凋亡蛋白分析

動物實驗結束後，將各組大鼠心臟游離後並加以均質化，以西方點漬法分析各組大鼠心臟組織中和凋亡相關的蛋白質其表現量的多寡。由圖15可知，和sham組相比，DM組中和凋亡相關的蛋白質表現量明顯上升；而治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組的凋亡蛋白質的表現量明顯比DM組來得低；更進一步觀察得知，在DM+E-ADSC這組中的凋亡相關蛋白的表現量又比DM+ADSC這組來得低。圖16則是以TUNEL染色方式來觀察心肌細胞的凋亡現象，此染色是以二種染劑TUNEL及DAPI來染心肌細胞，DAPI(藍色點部份)是染心肌細胞的細胞核，是用以確認心肌細胞的多寡；而TUNEL(綠色點部份)是染凋亡的心肌細胞，亦即凋亡的心肌細胞會呈現綠色螢光被偵測到。由圖16得知，凋亡訊號(綠色亮點) 在sham、DM、DM+ADSC及DM+E-ADSC此四組的數據分別為2±1%、14±4%、6±1%及5±2%。和sham組相比，DM組的綠色螢光亮點明顯比較多(sham<DM,p<0.01)，而治療組DM+ADSC(DM>DM+ADSC,p<0.05)及DM+E-ADSC(DM>DM+E-ADSC,p<0.05)的綠色螢光高點則明顯比DM組少。

3. 動物心肌細胞Sirt1相關蛋白分析

動物實驗結束後，將各組大鼠心臟游離後並加以均質化，以西方點漬法分析各組大鼠心臟組織中和Sirt1相關的蛋白質其表現量的多寡。由圖17可知，和sham組相比，DM組中和Sirt1相關的蛋白質表現量明顯下降；而治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組的Sirt1蛋白質的表現量明顯比DM組來得高；更進一步觀察得知，在DM+E-ADSC這組中的Sirt1相關蛋白的表現量又比DM+ADSC這組來得高。

4. 動物心臟組織纖維化路徑探討

動物實驗結束後將實驗大鼠犧牲，取其心臟組織加以Masson Trichrome切片染色，目的是觀察心臟組織中藍色部份的膠原蛋白堆積。若藍色部份的面積愈大，代表膠原蛋白的堆積愈多，則意味著心臟纖維化的狀況愈嚴重。圖21是各組大鼠心臟組織Masson Trichrome切片染色的結果，與sham相比，DM組的藍色膠原蛋白堆 積部份明顯增多，相對的和DM組比較，治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC的藍色膠原蛋白堆積部份明顯變少。圖22是心臟組織均質後測其纖維化相關蛋白的表現量，由圖可知，與sham相比，DM組的纖維化蛋白表現量明顯上升；相對的與DM組相比，治療組DM+ADSC及DM+E-ADSC這二組的纖維化相關蛋白表現量明顯下降

由以上相關研究數據得知，糖尿病會引起大鼠的心臟組織的受損，而脂肪幹細胞具有恢復糖尿病性心臟組織的再生的能力，若以脂肪幹細胞經綠茶EGCG處理後，預處理綠茶EGCG的脂肪幹細胞對糖尿病所引起的心臟受損的再生能力具有明顯上升。由此可知，以綠茶EGCG預處理脂肪幹細胞後，可提升幹細胞的再生能力，由細胞實驗得知，綠茶EGCG能使脂肪幹細胞膜上的CXCR4蛋白質表現量上升，而CXCR4表現量上升後，幹細胞的增生能力、存活能力、抗凋亡能力及移動能力均顯著上升。而在動物實驗中亦得到進一步的資料，證實經綠茶EGCG處理過之幹細胞再生之心肌細胞之能力比未經綠茶EGCG處理過之幹細胞再生之心肌細胞來得好。而圖23則以圖示的方式來說明綠茶EGCG如何透過增如CXCR4的表現量進而增如脂肪幹細胞再生心肌細胞的能力。

本發明證實以綠茶EGCG透過增加CXCR4表現量以強化脂肪幹細胞再生糖尿病性心肌功能損傷的研究，未來在幹細胞用於臨床用途時，常常會有幹細胞回輸劑量的問題，若能以綠茶EGCG來處理幹細胞的話，就能在幹細胞回輸時的劑量限制之下，提升幹細胞的治療能力，使幹細胞的治療更加顯著。

Claims (15)

1. 一種治療心臟發炎之醫藥處組合物，其中該醫藥組合物包含一脂肪幹細胞。
2. 如申請專利範圍請求項第1項所述之醫藥處組合物，其中該心臟發炎係為糖尿病或高血糖所引起。
3. 如申請專利範圍請求項第1項所述之醫藥處組合物，其中該醫藥組合物進一步包含酯型兒茶素。
4. 如申請專利範圍請求項第1項所述之醫藥處組合物，其中該脂肪幹細胞與酯型兒茶素預處理2小時。
5. 如申請專利範圍請求項第4項所述之醫藥處組合物，其中預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為5-15μM。
6. 如申請專利範圍請求項第4項所述之醫藥處組合物，其中預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為低於20μM。
7. 一種治療心臟發炎之方法，其中該方法包含將1x10⁵顆脂肪幹細胞藉由靜脈注射給與一個體。
8. 如申請專利範圍請求項第7項所述之醫藥處組合物，其中該個體之心臟發炎係為糖尿病或高血糖所引起。
9. 如申請專利範圍請求項第7項所述之方法，其中該方法進一步包含將1x10⁵顆之酯型兒茶素藉由靜脈注射給與該個體。
10. 如申請專利範圍請求項第7項所述之方法，其中該脂肪幹細胞與酯型兒茶素預處理2小時。
11. 如申請專利範圍請求項第10項所述之醫藥處組合物，其中預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為5-15μM。
12. 如申請專利範圍請求項第10項所述之方法，其中預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為低於20μM。
13. 一種提升幹細胞對醣類耐受度及移動能力之方法，該方法包含將一酯型兒茶素加入一幹細胞之培養基之中。
14. 如申請專利範圍請求項第13項所述之方法，其中該酯型兒茶素之濃度為5-15μM。
15. 如申請專利範圍請求項第13項所述之方法，其中該方法進一步包含將幹細胞於含有該酯型兒茶素的該幹細胞之培養基中培養2小時後取出。