CN110772538A - 一种间充质干细胞外泌体制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明关于干细胞技术领域,特别是关于一种脐带间充质干细胞外泌体制剂及其应用,具体包括:质量比是1:0.15~0.25的间充质干细胞来源的外泌体与姜黄素单磷酸酯盐包合物,以及药学上可接受的载体;其中,所述姜黄素单磷酸酯盐包合物是以具有不同取代度的羟丙基‑β‑环糊精混合物为主体,以姜黄素单磷酸酯盐为客体,包合制备而成的包合物。所述制剂中外泌体的纯度和含量较高,制备制剂中的增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物时无沉淀析出,包合率水平较高,所述制剂可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的,不具有副作用或副作用小、且不会引起施用者不适反应。
Description
技术领域
本发明关于干细胞技术领域,特别是关于一种间充质干细胞外泌体制剂及其应用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30~150nm),现今,其特指直径在40~100nm的盘状囊泡。1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现,1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体,且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡,参与细胞间通讯,对外泌体的研究兴趣日益增长,无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据这一定义,在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞。根据分化潜能的不同,干细胞可分为全能干细胞(totipotent stem cel1)、三胚层多潜能干细胞(pluripotent stem cel1)、单胚层多能干细胞(multipotent stem cel1)和单能干细胞(unipotent stem cel1)。本领域现有技术中也有亚全能干细胞的概念,认为在胚胎发育过程中会有亚全能干细胞存留在人体多种组织中,其分化潜能仅次于全能干细胞,是一种原始干细胞亚群,处于干细胞等级结构的最上层。通过一系列的探索,人们已经从骨髓和脂肪组织中获得了亚全能干细胞,并对它的表型和生物学功能进行了鉴定。亚全能干细胞的特征在于其具有上皮样形态、Flk1+表型、无成瘤性且单克隆来源的该细胞在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能,可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs,且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs,免疫原性比骨髓MSCs低,并且具有取材方便,无伦理学争议等优点,因此越来越受到研究工作者们的关注。
凌浩等发现,间充质干细胞源性外泌体是间充质干细胞分泌的同质性膜囊泡,含有大量且种类繁多的蛋白质、细胞因子和微小RNA等生物活性物质,在心肌梗死、高血压、心力衰竭和心肌病等的防治方面有极高的应用前景。陈晨等发现,间充质干细胞源性外泌体具有低免疫原性和长循环半衰期以及可携带小分子物质穿过血脑屏障等特点,能促进神经细胞生长和神经元分化等,有助于改善受损的神经系统功能和增强血管神经发生,成为治疗神经退行性疾病的新兴治疗手段。然而,脐带间充质干细胞外泌体的应用报道则较少。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案,其并不必然属于本专利申请的现有技术,在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下,上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞外泌体制剂,所述制剂中外泌体的纯度和含量较高,制备制剂中的增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物时无沉淀析出,包合率水平较高,所述制剂可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的,不具有副作用或副作用小、且不会引起施用者不适反应。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案包括下述几个方面。
第一个方面,本发明提供一种间充质干细胞外泌体制剂,其具体包括:
质量比是1:0.15~0.25的间充质干细胞来源的外泌体与姜黄素单磷酸酯盐包合物,以及
药学上可接受的载体;
其中,所述姜黄素单磷酸酯盐包合物是以具有不同取代度(DS)的羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)混合物为主体,以姜黄素单磷酸酯盐为客体,包合制备而成的包合物。
本申请所述的以间充质干细胞来源的外泌体为制剂主要成分、以姜黄素单磷酸酯盐包合物为制剂增效成分的制剂,其制备简单、材料来源广泛、且相较于微米级的细胞,外泌体的提取方法更为简单灵活且容易保存。通过施用本申请所述之间充质干细胞外泌体制剂,可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的。而且本发明的外泌体制剂不具有副作用或副作用小、且不会引起施用者不适反应,因此能够应用于减肥、降脂等领域。
进一步地,所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、口腔干细胞、脂肪来源的间充质细胞、人脐带血来源的间充质干细胞和人胚胎来源的间充质干细胞中的一种或多种。
进一步地,所述间充质干细胞来源的外泌体可由本技术领域现有技术提取制备,包括但不限于下述方法:
培养间充质干细胞,在细胞融合度为85~95%时,收集培养上清;
去除所述培养上清中的间充质干细胞、细胞碎片和细胞器,得到粗提液;
用孔径为0.22μm滤膜过滤所述粗提液,得到滤液;及
将所述滤液固液分离,得到间充质干细胞的外泌体。
上述间充质干细胞的外泌体的制备方法,通过在细胞融合度为85~95%时收集间充质干细胞的培养上清,使得培养上清中的外泌体的含量高,种类较多;接着先去除培养上清中的细胞、细胞碎片和细胞器,然后去除直径较大的囊泡,最后超高速离心得到间充质干细胞的外泌体,通过渐进的方式,一步步地纯化间充质干细胞的外泌体,使得到的间充质干细胞的外泌体纯度高。
进一步地,所述姜黄素单磷酸酯盐包括姜黄素单磷酸酯单盐或二盐;更进一步地,所述姜黄素单磷酸酯盐为钠盐和/或钾盐;需要说明的是,所述姜黄素单磷酸酯的结构式如式(1)所示。
进一步地,所述具有不同取代度的羟丙基-β-环糊精混合物包含:
DS=4.5的羟丙基-β-环糊精,和
DS=7.8的羟丙基-β-环糊精,
其中,具有DS=4.5的羟丙基-β-环糊精占比不高于10.0wt%。
进一步地,所述增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物由以下步骤制备得到:
1)HP-β-CD溶解于pH=2.0的磷酸液中制成4.0~5.0wt%的HP-β-CD酸液;
2)姜黄素单磷酸酯盐中加入大量无水乙醇使之溶解;
3)恒温恒定转速下将姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液以逐渐递减的方式滴加至HP-β-CD酸液中,滴加完毕后通入氮气并密封,避光下继续搅拌包合;
4)平衡后混悬液以不低于20000r/min高速离心,收集上清液冻干即得。
本申请中,以pH=2.0的磷酸液溶解HP-β-CD,可将HP-β-CD最大化地溶解,节省原材料的同时提高反应效率,然后以逐渐递减的方式将姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液滴加至HP-β-CD酸液进行包合,可以较大程度上提高姜黄素单磷酸酯盐与HP-β-CD的包合率。
进一步地,步骤3)所述恒温恒定转速具体是:恒温30~38℃,优选35℃;恒定转速90~150r/min,优选90~120r/min。
进一步地,步骤3)所述以逐渐递减的方式滴加是指:下1min内的滴加量/上1min内的滴加量=90%,也即是(Vn)/(Vn-1)=90%,Vn为某第n分钟内的滴加量,Vn-1是某第n-1分钟内的滴加量,其中n=2,3,4,5,……,nmax,15≤nmax≤30,也就是说需要在15~30min内滴加完毕。制备所述增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物的过程中,由于乙醇中的姜黄素单磷酸酯盐突然进入到大量酸液中,难免会出现姜黄素单磷酸酯盐析出的情况,以本申请所述逐渐递减的方式滴加姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液可有效避免上述析出沉淀,特别的是,并非任意选择的逐渐递减的滴加方式均可取得相同的效果,如下1min内的滴加量/第1min内的滴加量=90%或者下1min内的滴加量/上1min内的滴加量=95%递减滴加模式,还是不可避免地出现析出沉淀,随之伴随的弊端还包括包合率的降低。
进一步地,步骤3)所述包合温度是30~38℃,优选35℃;包合时间是8~24h,优选12~16h。
进一步地,步骤4)所述冻干时,控制压力<8Pa,在-50~-60℃下先预冻4~6h,然后在-60~-80℃冻干24h。
进一步地,制备增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物的方法中,姜黄素单磷酸酯盐与HP-β-CD的重量比是1:4~7。
进一步地,所述外泌体制剂为注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等的形式。
进一步地,所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。
进一步地,相对于所述外泌体制剂的总体积,所述外泌体制剂中的外泌体含量为30~100μg/mL。
另一个方面,本申请还提供上述一个方面所述间充质干细胞外泌体制剂在制备用于预防或治疗多脂的药物、保健品或营养补充剂中的应用。
又一个方面,本申请还提供上述一个方面所述间充质干细胞外泌体制剂在制备用于降脂的药物、保健品或营养补充剂中的应用。
通过施用本申请所述之间充质干细胞外泌体制剂,可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的。而且本发明的外泌体制剂不具有副作用或副作用小、且不会引起施用者不适反应,因此能够应用于减肥、降脂等领域。
本发明的有益效果为:
1)本发明通过在细胞融合度为85~95%时收集间充质干细胞的培养上清,使得培养上清中的外泌体的含量高,种类较多;接着先去除培养上清中的细胞、细胞碎片和细胞器,然后去除直径较大的囊泡,最后超高速离心得到间充质干细胞的外泌体,通过渐进的方式,一步步地纯化间充质干细胞的外泌体,使得到的间充质干细胞的外泌体纯度高。
2)制备所述增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物的过程中,由于乙醇中的姜黄素单磷酸酯盐突然进入到大量酸液中,难免会出现姜黄素单磷酸酯盐析出的情况,以本申请所述逐渐递减的方式滴加姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液可有效避免上述析出沉淀;
3)本申请所述的以间充质干细胞来源的外泌体为制剂主要成分、以姜黄素单磷酸酯盐包合物为制剂增效成分的制剂,其制备简单、材料来源广泛、且相较于微米级的细胞,外泌体的提取方法更为简单灵活且容易保存;
4)通过施用本申请所述之间充质干细胞外泌体制剂,可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的。而且本发明的外泌体制剂不具有副作用或副作用小、且不会引起施用者不适反应,因此能够应用于减肥、降脂等领域。
本发明采用了上述技术方案提供范文,弥补了现有技术的不足,设计合理,操作方便。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂,所附附图的说明如下:
图1为本发明羟丙基-β-环糊精的结构示意图;
图2为本发明姜黄素单磷酸酯结构示意图;
图3为本发明实施例的包合物的包合率数据统计示意图;
图4为本发明的外泌体制剂对Chang liver细胞增值作用的影响示意图;
图5为本发明的外泌体制剂对OA诱导的Chang liver细胞脂质堆积的影响示意图。
具体实施方式
除非另有定义,本文所使用的技术和科学术语,具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料;但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的,并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等,其整体被并入本文中作为参考。若有冲突,以本说明书包括定义为准。
除非另外说明,所有的wt%、百分数、份数、比例等都以重量计。
在本文中,术语“由……制得”等同于“包含”。本文中所用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“含有”或其任何其他变体意在涵盖非排它性的包括。例如,包含一系列要素的组合物、工艺、方法、制品或设备并不一定只限于那些要素,而是还可以包含这些组合物、工艺、方法、制品或设备所未明确列举的要素或所固有的其他要素。
连接词“由……组成/构成”不包含任何未明确列举的要素、步骤或成分。如果出现在权利要求中,该连接词将使该权利要求限于所描述的材料而不包含未描述的材料,但仍包含与那些所描述的材料通常相关的杂质。当连接词“由……组成/构成”出现在权利要求的特征部分,而非紧接前序部分时,其仅限于特征部分中所阐述的要素;其他要素并未被从权利要求整体中排除。
连接词“基本上由……组成/构成”用于定义除字面上所述的那些材料、步骤、特征、组分或要素之外还包含另外的材料、步骤、特征、组分或要素的组合物、方法或设备,前提是这些另外的材料、步骤、特征、组分或要素不实质性地影响所要求保护的发明的基本特征和新颖特征。术语“基本上由……组成/构成”处于“包含/包括”和“由……组成/构成”之间的中间地带。
连接词“基本上不包含/包括”或“基本上不含有”组分表示本发明的热塑性组合物基于所述热塑性组合物的总重量应包含低于1重量%、或低于0.5重量%、或低于0.1重量%、或为0重量%的该组分。
术语“包含/包括”意图包括术语“基本上由……组成/构成”和“由……组成/构成”所涵盖的实施方案。相似地,术语“基本上由……组成/构成”意图包括术语“由……组成/构成”所涵盖的实施方案。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或者其它数值或参数时,应理解其具体公开了由任何较大的范围限值或优选值和任何较小的范围限值或优选值的任何一对数值所形成的所有范围,而无论范围是否分别被公开。例如,当描述“1至5”的范围时,所描述的范围应理解为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等的范围。除非另外说明,在本文描述数值范围之处,所述范围意图包括范围端值以及该范围内的所有整数和分数。
当术语“约”用于描述数值或范围的端点值时,所公开的内容应理解为包括所指的具体值或端值。
此外,除非明确表示相反含义,“或者(或)”是指包容性的“或者(或)”,而非排它性的“或者(或)”。例如,以下任一条件都适用条件A“或”B:A是真(或存在)并且B是假(或不存在),A是假(或不存在)并且B是真(或存在),以及A和B均为真(或存在)。
此外,在本发明的要素或组分之前的不定冠词“一”和“一种”意图表示所述要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种,除非明确表示数量为单数,否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
除非具体说明,本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的,而非限制性的。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试,但本文仍描述了合适的方法和材料。
以下详细描述本发明。
实施例1:一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供一种间充质干细胞外泌体制剂,其具体包括:
质量比是1:0.2的间充质干细胞来源的外泌体与姜黄素单磷酸酯盐包合物,以及药学上可接受的载体;
其中,所述姜黄素单磷酸酯盐包合物是以具有DS=4.5及DS=7.8的HP-β-CD混合物为主体,以姜黄素单磷酸酯单钾盐为客体,包合制备而成的包合物。
所述外泌体制剂为注射剂形式。
所述药学上可接受的载体是生理盐水。
相对于所述外泌体制剂的总体积,所述外泌体制剂中的外泌体含量为1000μg/mL。
所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞,其分离和培养过程采用全骨髓培养法,具体包括:
1)采用乙醚对SD大鼠进行麻醉后断颈处死,然后将其浸泡到75%乙醇中浸泡消毒30min;
2)用手术剪剪开大腿外侧皮肤,剥离肌肉及关节处的肌肉附着点,完整取下股骨,依次浸泡到75%乙醇和双抗浓度为10%的PBS中10min,然后用PBS冲洗股骨3遍;
3)用灭菌后的手术剪将股骨两端剪掉,露出骨髓腔,然后用注射器吸取完全培养基(CLG-DMEM+15%FBS+1%P/S),从股骨一端插入注射器针头,冲洗骨髓腔3遍,在股骨另一端放置离心管收集骨髓悬液;
4)将骨髓悬液接种到细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中;待显微镜下观察可见贴壁铺展的细胞时,进行半量换液,之后每3d换液;
5)待细胞生长达到90%融合时,胰酶消化处理收集细胞,用血球计数板测定细胞的密度,然后根据收获细胞的数量进行传代培养。
所述间充质干细胞来源的外泌体可由本技术领域现有技术提取制备,包括但不限于下述方法:
培养骨髓间充质干细胞,在细胞融合度为90%时,收集培养上清;
去除所述培养上清中的间充质干细胞、细胞碎片和细胞器,得到粗提液;
用孔径为0.22μm滤膜过滤所述粗提液,得到滤液;及
将所述滤液固液分离,得到间充质干细胞的外泌体。
所述具有不同取代度的羟丙基-β-环糊精混合物中,具有DS=4.5的羟丙基-β-环糊精占比是10.0wt%。
所述增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物由以下步骤制备得到:
1)HP-β-CD溶解于pH=2.0的磷酸液中制成4.5wt%的HP-β-CD酸液;
2)姜黄素单磷酸酯单钾盐中加入大量无水乙醇使之溶解;
3)恒温恒定转速下将姜黄素单磷酸酯单钾盐的乙醇溶液以逐渐递减的方式滴加至HP-β-CD酸液中,滴加完毕后通入氮气并密封,避光下继续搅拌包合;
4)平衡后混悬液以不低于20000r/min高速离心,收集上清液冻干即得。
本实施例所述制备增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物时还包括下述a)~e)所列之限定:
a)步骤3)所述恒温恒定转速具体是:恒温35℃;恒定转速120r/min;
b)步骤3)所述以逐渐递减的方式滴加是指:下1min内的滴加量/上1min内的滴加量=90%,也即是(Vn)/(Vn-1)=90%,Vn为某分钟内的滴加量,Vn-1是某n-1分钟内的滴加量,其中n=2,3,4,5,……,20,也就是说需要在20min内滴加完毕;
c)步骤3)所述包合温度是35℃,包合时间是15h;
d)步骤4)所述冻干时,控制压力<8Pa,在-55℃下先预冻5h,然后在-75℃冻干24h;
e)制备增效成分姜黄素单磷酸酯盐包合物的方法中,姜黄素单磷酸酯盐与HP-β-CD的重量比是1:5。
实施例2:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例的外泌体制剂中不含有姜黄素单磷酸酯盐包合物。
实施例3:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例制备所述姜黄素单磷酸酯盐包合物时,选用DS=4.5的HP-β-CD为主体。
实施例4:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例制备所述姜黄素单磷酸酯盐包合物时,选用DS=7.8的HP-β-CD为主体。
实施例5:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例制备所述姜黄素单磷酸酯盐包合物时,将姜黄素单磷酸酯单钾盐的乙醇溶液滴加至HP-β-CD酸液中的逐渐递减的方式具体是下1min内的滴加量/上1min内的滴加量=95%,也即是(Vn)/(Vn-1)=90%,Vn为某分钟内的滴加量,Vn-1是某n-1分钟内的滴加量,其中n=2,3,4,5,……,20,也就是说需要在20min内滴加完毕。
实施例6:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例制备所述姜黄素单磷酸酯盐包合物时,将姜黄素单磷酸酯单钾盐的乙醇溶液滴加至HP-β-CD酸液中的逐渐递减的方式具体是下1min内的滴加量/第1min内的滴加量=90%,也即是(Vn)/(V1)=90%,Vn为某分钟内的滴加量,其中n=2,3,4,5,……,20,也就是说需要在20min内滴加完毕。
实施例7:另一种间充质干细胞外泌体制剂:
本实施例提供另一种间充质干细胞外泌体制剂,本实施例所用方法与材料与实施例1基本相同,不同之处在于本实施例制备所述姜黄素单磷酸酯盐包合物时,将姜黄素单磷酸酯单钾盐的乙醇溶液滴加至HP-β-CD酸液中的方式是等量的方式进行滴加,即每一分钟的滴加量相同。
实验例1:包合率检测:
准确称取姜黄素单磷酸酯盐包合物冻干品适量,加入少量无水乙醇超声20min,结束后转移至100mL棕色容量瓶中,加入无水乙醇稀释至刻度,以无水乙醇为空白,在423nm波长处测定包合物的吸光度,根据回归方程得到包合物中姜黄素的含量,根据公式(3)计算包合率:
包合率=(CE/CT)×100%(3)
式(3)中,CE是由紫外分光光度法在423nm波长处测定的被包合的姜黄素单磷酸酯盐的重量,CT是最初加入的姜黄素单磷酸酯盐的总重量。
依据本实验例方法检测实施例1、3~6中的姜黄素单磷酸酯盐包合物的包合率,统计数据如图2所示。由图2的图示可以看出,本申请的优选实施例1中姜黄素类包合物的包合率最高,超过了95%,而其余实施例,无论是以单一高或低取代度的HP-β-CD,还是将姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液以衡量或者与本申请所述之递减方式不同的逐渐递减方式滴加至HP-β-CD酸液中,所制得的姜黄素单磷酸酯盐包合物的包合率均有显著的下降,可以推导其生物利用度会有所降低。
实验例2:降脂作用检测:
本实施例提供一种脐带间充质干细胞外泌体制剂在降脂中的应用,具体包括所述脐带间充质干细胞外泌体制剂可降低Chang liver细胞的脂质堆积。
其应用及检测包括下述步骤:
A)乳清酸(OA)诱导Chang liver细胞脂肪堆积模型的建立:
分别用25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、125μmol/L、150μmol/L、175μmol/L、200μmol/L、225μmol/LOA诱导Chang liver细胞脂肪堆积,经倒置显微镜观察细胞内脂肪形态及OD值的测定,确定OA最佳浓度。实验过程中,经过观察发现当OA终浓度高于100μmol/L时Chang liver细胞大量死亡,终浓度低于100μmol/L时细胞形态正常,且能观察到明显的红色“珠串”,经测定终浓度75μmol/L组分的OD值最高,故终浓度为75μmol/LOA诱导Chang liver细胞脂肪堆积效果最佳。
B)外泌体制剂对Chang liver细胞增值作用的影响:
利用MTT法来测定终浓度30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL的外泌体制剂对Chang live细胞增殖作用的影响,结果如图4所示当外泌体制剂终浓度高于100μg/mL时,细胞存活率明显下降,与空白组存在显著性差异。因此后续降脂活性测定实验中终浓度应不高于100μg/mL。
C)外泌体制剂对OA诱导的Chang liver细胞脂质堆积的影响:
以辛伐他汀(Simvastatin,终浓度为100μg/mL)为阳性对照组,在外泌体制剂对Chang live细胞增殖影响研究的基础上,探究本申请不同实施例的外泌体制剂(终浓度是100μg/mL)对OA诱导的Chang liver细胞脂质堆积的影响。酶标仪358nm处测OD值,结果如图5所示。由图5可知,模型组与空白组相比,脂质堆积明显,说明终浓度为75μmol/LOA诱导Chang liver细胞脂肪堆积效果显著。与模型组相比,阳性对照组和加药组OD值均有降低,说明阳性药和外泌体制剂均有降脂活性,且本申请实施例1中的泌体制剂终对降低细胞内脂质堆积效果最佳,几乎与辛伐他汀持平。因此,通过施用本申请所述之间充质干细胞外泌体制剂,可明显降低Chang liver细胞的脂质堆积,从而实现减脂的目的,因此能够应用于减肥、降脂等领域。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
虽然上述具体实施方式已经显示、描述并指出应用于各种实施方案的新颖特征,但应理解,在不脱离本公开内容的精神的前提下,可对所说明的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。另外,上述各种特征和方法可彼此独立地使用,或可以各种方式组合。所有可能的组合和子组合均旨在落在本公开内容的范围内。上述许多实施方案包括类似的组分,并且因此,这些类似的组分在不同的实施方案中可互换。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明,但本领域技术人员应理解,本发明可超出具体公开的实施方案延伸至其它的替代实施方案和/或应用以及其明显的修改和等同物。因此,本发明不旨在受本文优选实施方案的具体公开内容限制。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞外泌体制剂,其特征在于具体包括:
质量比是1:0.15~0.25的间充质干细胞来源的外泌体与姜黄素单磷酸酯盐包合物,以及
药学上可接受的载体;
其中,所述姜黄素单磷酸酯盐包合物是以具有不同取代度的羟丙基-β-环糊精混合物为主体,以姜黄素单磷酸酯盐为客体,包合制备而成的包合物。
2.根据权利要求1所述的制剂,其特征在于:所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、口腔干细胞、脂肪来源的间充质细胞、人脐带血来源的间充质干细胞和人胚胎来源的间充质干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制剂,其特征在于:所述姜黄素单磷酸酯盐包括姜黄素单磷酸酯单盐或二盐。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制剂,其特征在于:所述具有不同取代度的羟丙基-β-环糊精混合物包含:
DS=4.5的羟丙基-β-环糊精,和
DS=7.8的羟丙基-β-环糊精,
其中,具有DS=4.5的羟丙基-β-环糊精占比不高于10.0wt%。
5.根据权利要求1~4任一项所述的制剂,其特征在于:所述姜黄素单磷酸酯盐包合物由以下步骤制备得到:
1)HP-β-CD溶解于pH=2.0的磷酸液中制成4.0~5.0wt%的HP-β-CD酸液;
2)姜黄素单磷酸酯盐中加入大量无水乙醇使之溶解;
3)恒温恒定转速下将姜黄素单磷酸酯盐的乙醇溶液以逐渐递减的方式滴加至HP-β-CD酸液中,滴加完毕后通入氮气并密封,避光下继续搅拌包合;
4)平衡后混悬液以不低于20000r/min高速离心,收集上清液冻干即得。
6.根据权利要求5所述的制剂,其特征在于:步骤3)所述以逐渐递减的方式滴加是指:下1min内的滴加量/上1min内的滴加量=90%,也即是(Vn)/(Vn-1)=90%,Vn为某第n分钟内的滴加量,Vn-1是某第n-1分钟内的滴加量,其中n=2,3,4,5,……,nmax,15≤nmax≤30,也就是说需要在15~30min内滴加完毕。
7.根据权利要求1~6任一项所述的制剂,其特征在于:所述外泌体制剂为注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等的形式。
8.根据权利要求1~6任一项所述的制剂,其特征在于:相对于所述外泌体制剂的总体积,所述外泌体制剂中的外泌体含量为30~100μg/mL。
9.权利要求1~8任一项所述间充质干细胞外泌体制剂在制备用于预防或治疗多脂的药物、保健品或营养补充剂中的应用。
10.权利要求1~8任一项所述所述间充质干细胞外泌体制剂在制备用于降脂的药物、保健品或营养补充剂中的应用。
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