DE60029117T2 - DNA Sequenzen zur Erhöhung der Futterausbeute und der Wachstumsrate bei Schweinen - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verabreichung eines endogenen Hormonpeptids, insbesondere die Verabreichung eines endogenen Hormonpeptids mit genbasiertem Material, zur Erhöhung der Futterleistung und der Wachstumsrate von Schweinen.
- Stand der Technik
- Es gab viele Ansätze, um die Wachstumsrate von Nutzvieh zu stimulieren und um die Futterumwandlungsleistungen zu erhöhen. Diese beinhalten die Verwendung von Antibiotika, Chemikalien und die Verwendung biologischer Verbindungen, wie etwa native oder rekombinante Wachstumshormone (GH) oder Wachstumshormonfreisetzende Faktoren (GHRF). Viele dieser Ansätze haben entweder Nebenwirkungen oder sind zu teuer, um sie tatsächlich in landwirtschaftlichen Betrieben oder Viehfarmen einzusetzen.
- Obwohl in der Vergangenheit routinemäßig antibiotische Zusätze verwendet wurden, um die Wachstumsentwicklung und die Futterverwertung zu erhöhen, verringern sich deren Vorteile nun aufgrund von Verbesserungen beim modernen Management der landwirtschaftlichen Betriebe und der möglichen Gefahr der Verbreitung von Antibiotikaresistenz auf andere Tiere, einschließlich Menschen.
- Die frühesten Versuche zur biologischen Verbesserung verwendeten Injektionen von Hypophysenpräparaten, aus denen später das Hypophysen-GH isoliert und gereinigt wurde.
- Das GH produziert eine Vielzahl von Wirkungen auf Körpergewebe, die schließlich zu einem Anstieg der Wachstumsrate und zu einem Gewichtszuwachs führen. In vivo stimuliert das GH die Synthese von Proteinen, den Abbau von Fetten und das Epiphysenwachstum. Diese Wirkungen werden über die Hochregulierung von Somatomedinen, zum Beispiel des insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (IGF-I), vermittelt. Die Produktion und Freigabe des Hypophysen-GH erfolgt unter der Kontrolle von zwei Hypothalamushormonpeptiden. Die Inhibition durch Somatostatin und die Stimulation durch GHRF reguliert die GH-Level im Plasma. Mit zunehmendem Alter der Tiere gibt es schädliche Veränderungen in der GHRF→GH→IGF-I-Achse. Folglich nimmt bei älteren Tieren, einschließlich Menschen, die GH-Produktionsrate ab, und die IGF-I-Antwort auf das GH und den GHRF verringert sich. Dies führt zu Osteoporose, Abnahme von magerem Muskel und zum Anstieg von Fettdepots am Rumpf. Daher wurde aus der Hypophyse extrahiertes GH verwendet, um die natürliche Verringerung an GH zu unterstützen und das Wachstums zu erhöhen. Eine solche Behandlung birgt jedoch die Risiken einer adventiven Pathogenübertragung. Zudem sind die damit verbundenen hohen Kosten ein wesentlicher Nachteil. Da das GH ein Protein ist, wird es durch Darmenzyme leicht verdaut und muss als Injektion verabreicht werden. Ferner muss das GH aufgrund seiner kurzen Serumhalbwertszeit täglich gegeben werden. Dies treibt die Kosten der Behandlung in die Höhe, die daher nur für die Therapie von Menschen möglich ist.
- Die Entwicklung rekombinanter DNA-Technologie und die Verwendung von Mikroben, wie etwa E. coli, um Säugetier-GH zu produzieren, bedeutete, dass homogene GH-Zubereitungen zur Behandlung in großen Mengen produziert werden konnten, wodurch die Kosten reduziert wurden. Außerdem haben jüngste Fortschritte bei der Proteinstabilisierung durch gentechnische Substitutionen in der Primärstruktur und die Entwicklung von Formulierungen mit verzögerter Abgabe die Dosierungsfrequenz auf einmal pro Woche oder zweimal pro Woche reduziert. Mit der Verringerung ihrer Kosten kann die Behandlung kommerziell verwendet werden, um die landwirtschaftliche Produktion zu steigern. Zum Beispiel wird ein rekombinantes Rinder-GH derzeit verwendet, um die Milchproduktion bei einem Drittel des Milchviehs der Vereinigten Staaten von Amerika zu steigern.
- Die Behandlung von Schweinen mit einem porcinen GH konnte die Wachstumsrate erhöhen, das Gerüstprotein ansteigen lassen, während es den Fettanteil reduzierte. Der Vorteil von porcinem GH auf die Wachstumsentwicklung von Schweinen und die Sicherheit und die damit verbundenen wirtschaftlichen Aspekte wurden von Palmer J. Holden (Porcine somatotropin (pST), Biotechnology Information Series (Bio4), Iowa State University, 1993) untersucht. Als Zusammenfassung von Daten aus zwanzig Studien wurde berichtet, dass Schweine, denen porcines GH injiziert wurde, um 15 schneller wuchsen, während sie 21 % weniger Futter verbrauchten, mit mehr Muskelprotein und reduziertem Rückenfett. Diese Produktivitätszuwächse erfolgten jedoch zu beträchtlichen Kosten. Das GH muss erstens aufgrund seiner kurzer Serumhalbwertszeit und schnellen Clearance aus dem Blutstrom täglich injiziert werden, um wirksam zu sein. Folglich muss den Schweinen bis zu 4 mg des porcinen GH-Proteins pro Tag für die Dauer von einem oder zwei Monaten des Veredelungszeitraums gegeben werden, um die GH-Level im Plasma aufrecht zu erhalten, die die Wachstumsentwicklung verbessern. Somit wird für jedes Schwein schließlich bis zu 400 mg GH erforderlich. Zweitens können hohen Dosen toxisch sein und es hat sich gezeigt, dass sie einige negative Nebenwirkungen, wie etwa Atemschwierigkeiten verursachen, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,134,120 beschrieben. Überdies ist das Behandlungsregime das bisher in der Literatur beschrieben wurde zu arbeitsintensiv und traumatisch für das Tier. Auch wenn die US-Patentschriften mit den Nummern 5,015,626 und 5,134,120 die Verwendung von porcinem GH jeweils zur Verbesserung der Fleischqualität und zur Erhöhung des Gewichtzuwachses beschreiben, ist die derzeitige Technologie der GH-Peptid basierten Wachstumsförderer noch nicht wirtschaftlich genug, um sich für die kommerzielle Landwirtschaft zu eignen.
- Die Entdeckung der Wachstumshormonfreisetzenden Faktoren (GHRF) versprach, ein besseres Verfahren der Wachstumsverbesserung bereitzustellen. GHRF ist ein Peptidhormon, das vom Hypothalamus abgesondert wird und die Synthese und Freigabe von GH durch die somatotrophen Zellen des Prähypothalamus spezifisch stimuliert. Durch die Stimulierung der endogenen Produktion von GH wird die tatsächlich erforderliche Dosis sehr viel geringer als die des GH, und stellt somit eine physiologischere Art der Behandlung zu möglicherweise geringeren Kosten bereit. Dennoch scheint es nach unserem besten Wissen noch keine zufrieden stellende und kostengünstige Behandlung für Nutzvieh zu geben. Zum Beispiel wurde die Verwendung von humanen GHRF-Protein-Injektionen zweimal täglich, zur Stimulierung des Wachstums von Schafen in der europäischen Patentschrift Nr. 0,289,186 beschrieben. Längere Injektionen des humanen GHRF induzieren jedoch beim Schaf eine Immunantwort mit neutralisierender Antikörperbildung gegen das humane Protein. Dies verringert die Wirksamkeit einer solchen Behandlung, und die Arbeits- und Materialkosten machen diesen Ansatz unwirtschaftlich. Injektionen von GHRF-Peptid wurden verwendet, um eine länger anhaltendere Stimulation der Produktion von GH beim Schwein zu produzieren. Obwohl einige Versuche bei der Produktion einer Körpergewichtszunahme und eines niedrigeren Gerüstfettgehalt erfolgreich waren, bedeutet das gleiche Problem der schnellen Clearance, dass häufige Dosen erforderlich sind. Daher ist ein neuer Ansatz erforderlich, um die GH-Level für die Wachstumsverbesserung zu supplementieren.
- Da zuerst bewiesen wurde, dass intramuskulär injizierte Plasmid-DNA-Vektoren von den Skelettmuskelzellen aufgenommen und viele Monate lang in vivo exprimiert werden, beinhaltete die Skelettmuskel basierte Gentherapie ein großes Versprechen für die systemische Abgabe therapeutischer Proteine. Diese Skelettmuskelproduktion rekombinanter Proteine, die in das Kreislaufsystem abgesondert werden können, um entfernte Zielorte zu erreichen, ist ideal zur Behandlung von Krankheiten geeignet, die aus Serumproteinmangel entstehen. Plasmidvektoren, obwohl sehr viel weniger wirksam bei der Proteinexpression als viral basierte Vektoren, haben die Vorteile, weniger wahrscheinlich immunogen und nicht in das Wirtsgenom integriert zu sein. Daher wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass sie sicherer sind. Auf dieser Basis eignen sich Plasmidvektoren am besten für Situationen, in denen das therapeutische Protein in geringen Konzentrationen wirksam ist. Somit kann die Injektion von Plasmidvektoren, die das Gen für GHRF exprimieren, ein ideales Verfahren sein, um einen chronischen Zusatz von GHRF in einer wirksamen Dosis anzuwenden, die ausreicht, um die Wachstumsentwicklung von Tieren zu erhöhen. Ferner sollte eine beständige GHRF-Produktion die Behandlungsfrequenz drastisch reduzieren, und folglich die Kosten auf ein wirtschaftlich realisierbares Level senken.
- Unlängst wurde gezeigt, dass ein Plasmid, das eine humane GHRF (hGHRF)-cDNA unter der Kontrolle des minimalen Skelett-α-Aktinpromotors vom Huhn enthält, in der Lage ist, eine Erhöhung der GH-Level im Plasma zu produzieren, wenn es in den Mausmuskel injiziert wird (Draghia-Akli et al, Nature Biotechnology, 15, S. 1285–1289 und WO99/05300). Ferner wurde 3 Wochen nach der Injektion eine Wachstumsverbesserung von ungefähr 15 berichtet. Ihre Verfahren rufen jedoch eine Immunantwort hervor, wie durch die steigenden Serumlevel der neutralisierenden Anti-hGHRF-Antikörper 21 und 28 Tage nach der hGHRF-Geninjektion nachgewiesen wurde. Es wurde gezeigt, dass der begrenzende Faktor bezüglich des Levels der in-situ-Genexpression von injizierten Plasmiden der extrem niedrige Aufnahmegrad von Plasmid-DNA durch die Muskelfasern ist. Um das Level der hGHRF-Expression zu verbessern, injizierten Draghia-Akli und Kollegen zuerst Bupivacain, eine bekannte myotoxische Substanz, bevor sie die Plasmid-DNA in den regenerierenden Muskel injizierten. Obwohl sich zeigte, dass sich das Expressionslevel durch steigende Plasmidaufnahme in den Muskelfasern verbesserte, ist es weder eine wünschenswerte noch eine akzeptable Technik, die bei landwirtschaftlichen Nutztieren angewendet werden kann, die für den menschlichen Konsum bestimmt sind.
- Aufgabe der Erfindung
- Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, einen kostengünstigen Ansatz zur Stimulierung der Wachstumsrate von Schweinen, und zur Erhöhung der Futterverwertungsleistungen durch die Verabreichung eines endogenen Hormonpeptid-GHRF bereitzustellen. Die Mindestaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, der Allgemeinheit eine geeignete Auswahl bereitzustellen.
- Kurzdarstellung der Erfindung
- Dementsprechend wird die Verwendung eines Vektors bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Futterleistung und/oder der Wachstumsraten und/oder zur Verringerung des Fettansatzes bei Schweinen bereitgestellt, wobei der Vektor die Produktion des Wachstumshormonfreisetzenden Faktors (GHRF) stimuliert und:
- – eine einen Promotor zur Expression eines Gens kodierende DNA-Sequenz;
- – eine ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz; und
- – eine das porcine GHRF-(1-44)-Peptid kodierende DNA-Sequenz umfasst,
- Zu den besonders bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung gehören die Varianten, bei denen der Promotor ein Aktinpromotor ist. In Übereinstimmung mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung ist der Aktinpromotor ein Skelettaktinpromotor. Die DNA-Sequenz, die einen Skelettaktinpromotor kodiert, umfasst besonders bevorzugt einen vollständigen Satz der DNA-Sequenz des Skelettaktinpromotors.
- In Übereinstimmung mit anderen bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung beinhaltet die exogene Gensequenz des Weiteren eine DNA-Sequenz, die die nichttranslatierte Polyadenylierungssignal-haltige 3-Strich(3')-Region des Gens des Promotors oder des GHRF kodiert.
- In Übereinstimmung mit noch anderen bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung beinhaltet die exogene Gensequenz des Weiteren eine DNA-Sequenz, die ein Antibiotikumresistenzgen kodiert.
- Der GHRF und sein Signalpeptid, von den cDNA-Sequenzen kodiert, können die entsprechenden natürlichen oder rekombinanten oder synthetischen oder biologisch aktiven Fragmente oder deren Analoga mit ähnlicher Aktivität sein, unter der Voraussetzung, dass der Vektor, der die DNA-Sequenzen umfasst, innerhalb des Bereichs des Vektors aus Anspruch 1 liegt. Es ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, dass die DNA-Sequenz des Promotors, die eine GHRF-Signalpeptid kodierende cDNA-Sequenz und die GHRF kodierende cDNA-Sequenz speziesspezifisch sind.
- Das exogene Mittel zur Stimulierung der Produktion des GHRF, das eine DNA-Sequenz ist, wird bevorzugt mit einem geeigneten Träger vermischt, um subkutan verabreicht zu werden. In Übereinstimmung mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird die exogene DNA-Sequenz auf intramuskulärem Weg verabreicht.
- Das exogene Mittel zur Stimulierung der Produktion des GHRF, der eine DNA-Sequenz ist, das je Tier gegeben wird, liegt bevorzugt im Bereich zwischen 1 und 100 μg je kg Körpergewicht des Tiers.
- Es ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung, eine exogene Gensequenz bereitzustellen, um die endogene Produktion des GHRF zu stimulieren, um die Futterleistung und/oder die Wachstumsraten zu erhöhen und/oder den Fettansatz von Schweinen zu verringern, wobei die exogene Gensequenz eine DNA-Sequenz, die einen Promotor zur Genexpression kodiert, eine cDNA-Sequenz, die ein GHRF-Signalpeptid kodiert und eine komplementäre DNA-Sequenz (cDNA), die ein porcines GHRF-(1-44)-Peptid kodiert, umfasst.
- Es ist ein noch anderer Aspekt dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereitzustellen, um die Futterleistung und/oder die Wachstumsraten zu erhöhen und/oder den Fettansatz von Tieren zu verringern, das die Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die einen Promotor zur Genexpression kodiert, das Anfügen einer cDNA-Sequenz, die ein GHRF-Signalpeptid kodiert und das Anfügen einer cDNA-Sequenz, die ein porcines GHRF-(1-44)-Peptid kodiert, um eine Gensequenz zu bilden, und das Vermischen des Peptids mit einem geeigneten Träger umfasst.
- Andere Aufgaben, Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung ersichtlich. Es versteht sich jedoch, dass die folgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur der Illustration dienen.
- Kurze Beschreibung der Figuren
- Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird beispielhaft und mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert, worin:
-
1 die schematische Darstellung von pUPAGRF zeigt, der pGHRF-Expressionskassette, mit der Anordnung des Promotors, der pGHRF-kodierenden Region und dem Polyadenylierungssignal, während das Kontrollplasmid pUPAX durch Deletion der pGHRF-kodierenden Region produziert wird. -
2 die wichtigsten Schritte zeigt, die mit der Konstruktion des pUPAGRF-Plasmids verbunden sind, wobei die wichtigsten verwendeten Enzyme angegeben werden. -
3 das schematische Diagramm zeigt, das die Konstruktion des pUPAX-Plasmids aus pUPAGRF zeigt. -
4 die Wirkungen der pGHRF-Geninjektion auf das mittlere Körpergewicht von männlichen C57BL/6J-Mäusen über einen Zeitraum von vier Wochen von vier Behandlungsgruppen zeigt, pUPAGRF-Plasmid mit Dosen von 30, 100 und 200 μl, oder 100 μl von Kontroll-pUPAX, wobei Injektion und Wiegen zwischen 14:00 und 16:00 Uhr durchgeführt wurden. -
5 die Unterschiede der prozentualen Gewichtszunahme der Mäuse zeigt, denen das pGHRF-Gen injiziert wurde. -
6 die Wirkungen der pGHRF-Gendosierung auf die Gewichtszunahme beim männlichen Landrace/Yorkshire/Duroc(LYD)-Schwein zeigt. -
7 die Veränderung der mittleren Rückenfettdicke bei Landrace/Yorkshire-Schweinen nach der pGHRF-Geninjektion zeigt. - Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
- Das muskelspezifische GHRF-Expressionssystem wird bevorzugt in einem Plasmidvektor konstruiert. Die komplementären DNA-Sequenzen (cDNA), die das GHRF-Signalpeptid kodieren und der GHRF selbst wurden aus der veröffentlichten Primärpeptidstruktur designed und für die Säugetiercodonverwendung optimiert. Diese cDNA wird unter Verwendung herkömmlicher Oligonukleotidsynthesechemie synthetisiert. Der GHRF und sein Signalpeptid, von den cDNA-Sequenzen kodiert, können die entsprechenden natürlichen oder rekombinanten oder synthetischen oder biologisch aktiven Fragmente oder deren Analoga mit ähnlicher Aktivität sein. Die GHRF-Leadersequenz kodiert ein Signalpeptid in den naszierenden GHRF-Peptiden, die den Export der GHRF-Peptide aus den Muskelzellen und die Absonderung in den allgemeinen Kreislauf in einer aktiven Form leiten werden.
- Die DNA-Sequenzen für Promotor/Enhancer-Elemente und die nichttranslatierten Polyadenylierungssignalhaltigen 3-Strich(3')-Regionen des Promotor/GHRF-Gens werden separat durch Polymerase-Kettenreaktion kloniert. Als ein Beispiel wird der skelettale α-Aktin(skαa)-Promotor/Enhancer verwendet, aber dies ist nicht als Beschränkung der Wahl des Promotors/Enhancers zu verstehen. Es wird der vollständige Satz, aber nicht das minimale Subset eines solchen Aktinpromotors, wie es von Draghia-Akli et al. beschrieben wurde, verwendet. Der Grund ist, dass in-vivo-Studien, die direkte Geninjektion verwendeten, gezeigt haben, dass der vollständige α-Skelettaktinpromotor das höchste Level an Genexpression im Mausmuskel ergab, verglichen mit anderen trunkierten Versionen (Reecy et al., Animal Biotechnology 2: 101–120, 1998).
- Als eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung sind die DNA-Sequenz des Aktinpromotors, die ein GHRF-Signalpeptid kodierende cDNA-Sequenz und die GHRF kodierende cDNA-Sequenz speziesspezifisch.
- Diese DNA-Segmente werden in der folgenden Reihenfolge in ein pUC-Plasmid eingeführt:
Aktinpromotor; humane GHRF-Signalpeptid-cDNA; porcine GHRF-(1-44)-cDNA; nichttranslatierte 3'-Aktinregion. Das pUC-Plasmid enthält auch ein Antibiotikumresistenzgen, zum Beispiel Ampicillinresistenz, das die Selektion ermöglicht, wenn es in E.-coli-Bakterien transformiert wird, sowie als ein ColEl-Replikationsstartpunkt, der die Eigenschaft hoher Plasmid-Kopienzahl verleiht. - E. coli, transformiert mit dem GHRF-Expressionsplasmid, lässt man dann in einem Fermenter unter Ampicillinselektion wachsen. Nach dem Ernten der Zellen und der Freigabe der Plasmide durch alkalische Lyse, wird die Plasmid-DNA von der RNA, der bakteriellen DNA und anderen zellulären, Kontaminanten durch Säulenchromatographie getrennt. Die Integrität der gereinigten Plasmid-DNA wird durch Restriktionsenzymverdauung/Agarosegelelektrophorese und DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Reinheit wird durch das Messen der Absorption bei OD260/280 und Agarosegelelektrophorese bestimmt.
- Die geprüfte Plasmid-DNA wird in einem physiologisch akzeptablen Träger gelöst, auf Pyrogenlevel getestet, dosisangepasst und Tieren mittels intramuskulärer Injektion verabreicht. Als eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung sollte die Gesamtmenge der Plasmid-DNA, die je Tier gegeben wird, im Bereich zwischen 1 und 100 μg je kg Körpergewicht des Nutzviehs liegen.
- Bei der Injektion in den Muskel von Tieren wird der Plasmidexpressionsvektor, der eine DNA ist, in die Muskelzellen aufgenommen. Der Plasmidexpressionsvektor wird dann die Zellen dazu verleiten, GHRF-Peptide zu produzieren. Solche Peptide werden in das Kreislaufsystem freigegeben und stimulieren die Produktion von GH, wenn sie die Hypophyse erreichen. Dies resultiert in der Erhöhung von GH im Kreislaufsystem, das die Wachstumsentwicklung verbessert, in einer schnelleren Wachstumsrate, einer höheren Körpermagermasse und besserer Futterverwertungen resultiert. Ferner ist das produzierte Fleisch magerer und hat weniger Fett, und hat folglich einen höheren Marktwert.
- Ferner wird die normale negative Feedback-Kontrolle des GH über das Hormon Somatostatin umgangen, da die GHRF-Freigabe unter der Kontrolle eines konstitutiven muskelspezifischen Promotors ist. Dies ermöglicht die kontinuierliche Produktion des GH.
- Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter zu illustrieren, nicht aber zu beschränken.
- Beispiel 1
- Konstruktion des pGHRF-Expressionsplasmidsvektors
- Das pGHRF-Expressionskonstrukt wurde entworfen, um die optimale Produktion und Absonderung des pGHRF-Peptids zu ergeben, wenn sie in Säugetiermuskelzellen transfiziert werden (
1 ). - Der skelettale alpha-Aktin(skαa)-Promotor ist ein gut charakterisierter Promotor, der gezeigt hat, dass er eine hochspezifische Genexpression in differenzierten Muskelfaserzellen ergibt (Reecy et al, Gene 180: 23–26, 1996). Ferner besitzt er einen hohen Grad an Sequenzidentität und teilt viele Transkriptionsfaktor-Consensus-Bindungsstellen verglichen mit skαa-Promotoren vom Menschen, Rind und Huhn. Dies lässt darauf schließen, dass dieser Promotor zwischen Säugetieren und Vögeln hoch konserviert ist. Dies wird durch in-vitro-Studien unterstützt, die die Fähigkeit des porcinen skαa-Promotors beweisen, die muskelspezifische Genexpression in Maus-, Ratten- und Schweinezellen zu vermitteln. Folglich wurde dieser 2 kb Promotor ausgewählt, um die muskelspezifische Expression der pGHRF-cDNA anzutreiben.
- Der porcine skαa-Promotor wurde vor einem offenen Leserahmen gespleißt, der die DNA-Sequenz, die für das humane GHRF-Signalpeptid und das porcine reife GHRF-Peptid kodiert, umfasst.
- Da die DNA-Sequenz, die den porcinen GHRF kodiert, nicht verfügbar war, haben wir dies durch reverse Translation der bekannten Peptidstruktur entworfen, mit Optimierung für Säugetiercodonpräferenz. Eine weitere Modifikation der vorliegenden Erfindung enthält die Zugabe von nichttranslatierter 3'-Region des porcinen skelettalen α-Aktingens stromabwärts der kodierenden Region. Dies dient dazu, die Expression des pGHRF-Produkts durch Stabilisierung und Verlängerung der Halbwertszeit des mRNA-Transkripts zu erhöhen. Das Verfahren zur Konstruktion für das pGHRF exprimierende Plasmid wird unten ausführlich beschrieben und in
2 zusammengefasst. - PolyA-Region: Genomische DNA wurde aus porciner Niere gereinigt und für die Amplifikation von porcinen Gensequenzen verwendet. Ein 750 by 3'-Endfragment des skαa-Gens wurde mittels PCR amplifiziert. Diese Region umspannt die Nukleotidnummern 2464 bis 3204 der veröffentlichten Sequenz (Genbank Accession No. U16368) und enthält die nichttranslatierte 3'-Region und das putative Polyadenylierungssignal. Das Produkt wurde dann mit den Restriktionsenzymen Xba I und Sac II geschnitten (unter Verwendung von Schnittstellen, die mit den PCR-Primern eingeführt wurden) und in den Plasmidvektor pBluescript KS+ kloniert, um pSαApA zu bekommen.
- GHRF-kodierende Region: Die GHRF-kodierende Region ist ein offener Leserahmen (ORF), der die DNA-"Leadersequenz" umfasst, die ein Signalpeptid für den humanen GHRF kodiert, gefolgt von einer porcinen Inframe-GHRF-(1-44)-cDNA. Die Leadersequenz, die das vollständige Exon 2 und das teilweise Exon 3 des humanen GHRF-Gens (Genbank Accession No. L10034-5) enthält, wurde aus der humanen genomischen DNA PCR-amplifiziert. Die porcine GHRF-cDNA wurde als zwei Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen konstruiert:
- Diese Oligonukleotide enthielten eine Überlappung, die verwendet wurde, um sie miteinander zu vereinigen (annealen) und dann mit Vent-Polymerase zu füllen. Dieses vereinigte Produkt wurde dann mit Vent-Polymerase PCR-amplifiziert. Die Produkte der Leadersequenz und die porcine GHRF-cDNA wurden jeweils mit T4-Polynukleotidkinase kinasiert und dann durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Dann wurden die Produkte zusammen mit T4-DNA-Ligase aneinander angefügt, und das Ligationsprodukt mit 265 by wurde des Weiteren unter Verwendung von Polyacrylamidgel gereinigt. Dieses ORF-Produkt wurde dann mittels PCR mit Primern, die Xma I- und Xba I-Restriktionsenzymstellen enthalten, re-amplifiziert. Der ORF wurde dann mit Xma I- und Xba I-Enzymen gereinigt, um ein 245 bp-Fragment zu bekommen. Dieses Fragment wurde dann in pSαApA kloniert, um pPGRFpA zu bekommen.
- Promotorregion: Der vollständige 2 kb porcine skelettale α-Aktin(skαa)-Promotor/Enhancer wurde aus porciner genomischer DNA PCR-amplifiziert. Nested-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgte dann auf 1/50 der ersten PCR-Reaktion, um ein DNA-Produkt zu ergeben, das by –1909 bis +76 des porcinen skαa-Gens umspannt (Reecy et al, Gene 180: 23–28, 1996). Dieses Produkt erhielt mit T4-DNA-Polymerase ein glattes Ende und wurde dann mit Eco RI geschnitten. Das gelgereinigte Promotorfragment wurde in die Eco RI- und Eco RV-Stellen von pPGRFpA kloniert, um das Zwischenkonstrukt pSαAPGRFpA zu bekommen.
- Um das fertige Konstrukt zu erhalten, wurde dann diese Expressionskassette mit flankierenden Kpn I- und Sac I-Restriktionsenzymen entfernt und zu Plasmid pUC19 ligiert und mit pUPAGRF bezeichnet. Ein zweites Konstrukt wurde hergestellt, indem die gesamte pGHRF-kodierende Region aus dem Plasmid pUPAGRF durch teilweise Verdauung mit Xho I entfernt wurde (
3 ). Dieses zweite Plasmid, pUPAX, wurde in den Tierversuchen als Kontrolle verwendet. - Die Plasmide wurden getrennt in E. coli K-12 (Stamm DH5α) transformiert und in einem Fermenter unter Verwendung von Kulturmedien, die mit 150 μg/ml Ampicillin angereichert waren, wachsen gelassen. Wenn die Kultur die stationäre Phase erreichte, wurden die bakteriellen Zellen geerntet und durch klassische alkalische Lyse lysiert. Die Plasmide wurden durch Zentrifugieren wiedergewonnen und von kontaminierender zellulärer DNA, RNA und Proteinen durch Anionenaustausch-Chromatographie getrennt. Die Reinheit wurde durch das Messen der Absorption bei 260 und 280 nm geprüft. Die gereinigte Plasmid-DNR wurde durch Agarosegelelektrophorese ebenfalls auf ihre Integrität hin untersucht. Schließlich wurde die Identität durch Verdauung durch Restriktionsenzyme und DNA-Sequenzierung bestätigt.
- Die Plasmid-DNA wurde präzipitiert und in einer pyrogenfreien Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS) erneut aufgelöst und die Konzentration berechnet, indem die Absorption bei 260 nm gemessen wurde. Nach Bestehen der Pyrogentests war die DNA zu diesem Zeitpunkt fertig für die Injektion in Tiere.
- Beispiel 2
- Um die Fähigkeit des pUPAGRF-Konstrukts, die Wachstumsentwicklung zu erhöhen, zu testen, injizierten wir dieses Plasmid in den Musculus quadriceps der Maus.
- Aus einer Brutkolonie von C57BL/6J-Mäusen wurden achtundvierzig männliche Mäuse mit einem Körpergewicht von 14,5 bis 18 g ausgewählt und zufällig in vier Gruppen mit zwölf Mäusen zugeordnet. Jede Gruppe von 12 Mäusen erhielt ein einzige Injektion von 100 μl PBS, die entweder 100 μg des Kontrollplasmids oder jeweils 30, 100 und 200 μg des GHRF-Expressionsplasmids (pUPAGRF) enthielt. Die Mäuse wurden gewogen, zur Identifikation markiert, und erhielten dann eine einzige Injektion in die Mitte des linken Musculus quadriceps. Die Mäuse wurden dann in einem 12-stündigen Tageslicht-Kreislauf in kontrolliertem Klima, minimaler Krankheitsumgebung gehalten und erhielten Standard-Rattennahrung und Wasser. Das Körpergewicht wurde zweimal wöchentlich aufgenommen. Die Mäuse wurden mit Ketamin/Xylazin (0,15 ml je 100 g Körpergewicht) anästhesiert, um Blut- und Gewebeproben zu erhalten. Das Blut wurde durch Kardialpunktion in einer 1 ml-Insulinspritze, die 30 μl 0,5 M EDTA als Antikoagulationsmittel enthielt, gesammelt. Das gesammelte Blut wurde in Eis aufbewahrt, bis das Plasma durch Pelletieren der Zellen bei 6.000 g für 10 Min erhalten wurde. Der gesamte Musculus quadriceps, der die Injektionsstelle beinhaltete, wurde herausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der rechte Lappen der Leber wurde ebenfalls herausgeschnitten und sofort eingefroren. Alle Proben wurden bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.
- Ergebnisse
- Die Mäuse in allen vier Behandlungsgruppen zeigten in dem Vier-Wochen-Zeitraum nach der Injektion schnelles Wachstum und einen Anstieg an Körpergewicht. In dem Zeitraum von 21 Tagen nach der Injektion (P. I) unterschieden sich die Körpergewichtswerte unter allen Gruppen nicht signifikant. Obwohl Mäuse, die 30 μg pUPAGRF erhielten, die höchste Gewichtszunahme zeigten, während die Gruppe mit der höchsten Dosis (200 μg) zurücklag (
4 ), gab es nach 25 Tagen P. I. signifikante Unterschiede zwischen den hohen Dosen und der Kontrolle. 25 Tage P. I. betrug das mittlere Körpergewicht für die Gruppen mit 200, 100 und 30 μg jeweils 26,3, 26,5 und 24,7 g, während das für die Kontrollgruppe 24,5 g (p<0,032, Einzelfaktor ANOVA) betrug. Das mittlere Körpergewicht nach 28 Tagen P. I. betrug 26,8 und 26,6 g für die mit 200 und 100 μg behandelten Mäuse, gegenüber jeweils 24,5 und 25,0 g für die mit 30 μg und mit der Kontrolle behandelten. Wieder gibt es einen signifikanten Unterschied zu den Gewichten der mit der Kontrolle behandelten Mäuse (p<0,0045). - Die Wirkungen der pUPAGRF-Injektionen auf den prozentualen Gewichtszuwachs sind in
5 gezeigt. Vier Wochen nach den Plasmidinjektionen zeigten die mit der Kontrolle behandelten Mäuse einen prozentualen Zuwachs von 48,7 %, jene mit 30 und 100 μg pUPAGRF 56,6 %, während jener mit 200 μg 68,4 % betrug. Diese Ergebnisse zeigen an, dass eine einzige Injektion eines pGHRF-produzierenden Plasmids in der Lage ist, eine signifikante Verbesserung bei der Wachstumsrate junger Mäuse zu produzieren. Bei Dosen bis zu 100 μg gab es eine Verbesserung von ungefähr 8 %, während eine Dosis von 200 μg in der Lage war, eine 19 %-ige Verbesserung des prozentualen Gewichtszuwachses zu ergeben. Diese Ergebnisse sind mit den Beobachtungen von Draghia-Akli im regenerierenden Mausmuskel vergleichbar, während deren Injektionsverfahren die vorherige Injektion von myotoxischem Bupivacain erforderten, um die Plasmidaufnahme und -expression zu erhöhen. - Beispiel 3
- Wir testeten dann die Fähigkeit der pGHRF-Genbehandlung, die Wachstumsentwicklung von landwirtschaftlich gehaltenen Schweinen zu verbessern.
- In dieser Studie wurden Zuchtschweine aus einer Dreifachkreuzung aus Landrace/Yorkshire/Duroc (LYD) verwendet. Junge männliche Schweine wurden auf einem Zuchthof im Alter von 10 Wochen zufällig in drei benachbarte Boxen zugeordnet. Die Schweine erhielten die Plasmidzubereitung mittels einer einzigen Injektion in den Gesäßmuskel mit einer 1½ Inch 16 Gauge Spritze.
- Den Schweinen in Box A und B wurden 1 mg bzw. 4 mg pUPAGRF injiziert, während jene in Box C 4 mg des Kontrollplasmids pUPAX erhielten. Die Schweine erhielten Futter und Wasser ad libitum und wurden wöchentlich gewogen.
- Ergebnisse
- Die Schweine, die eine einzige Injektion mit 1 mg pUPAGRF erhalten hatten, zeigten einen Gewichtszuwachs zwischen 62,53 und 87,17 kg (Anstieg um 37,8 %) in dem Zeitraum von 6 Wochen des Experiments. Die Schweine, denen 4 mg injiziert wurden, wuchsen von einem mittleren Gewicht von 60,20 kg auf 98,28 kg (Zuwachs von 44.1 %). Jene in der Kontrollgruppe wuchsen im gleichen Zeitraum von 58,59 auf 89,33 kg (ein Zuwachs von 34,4 %). Somit zeigten nach 6 Wochen jene Schweine, denen das pGHRF-Expressionsplasmid injiziert wurde, einen prozentual höheren Gewichtszuwachs als jene, denen das Kontrollplasmid injiziert wurde. Ferner scheint es einen Trend für eine dosisabhängige Antwort zu geben, da die Dosis mit 4 mg mehr als die zweifache Verbesserung im Vergleich zur 1 mg-Dosis brachte. In Futterverwertungsleistung ausgedrückt konsumierte die Gruppe mit der 1 mg-Dosis, obwohl sie einen moderaten Zuwachs der Wachstumsrate zeigte, 10 % weniger Futter (Tabelle 1). Überdies gab es keinen Unterschied in der Menge an konsumiertem Futter zwischen der Kontroll- und der Hochdosisgruppe, folglich war pUPAGRF sowohl bei einer Dosis von 1 mg als auch bei einer Dosis von 4 mg in der Lage, eine Verbesserung bei der Futterumwandlung zu ergeben.
- Beispiel 4
- Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkungen der Injektion von 2 mg pUPAGRF-Plasmid in Landrace/Yorkshire(LY)-Schweine auf den Ansatz von Rückenfett zu bestimmen. Zwanzig LY-Schweine, die ungefähr 32 Wochen alt waren und ein durchschnittliches Gewicht von 55 kg hatten, wurden in zwei Gruppen zu je zehn aufgeteilt, wobei jede 5 männliche und 5 weibliche Schweine umfasste. Einer Gruppe wurden 2 mg des pUPAGRF-Plasmids mittels intramuskulärer Injektion verabreichtet. Die zweite Gruppe wurde auf ähnliche Weise mit dem Plasmid pUPAX behandelt und diente der Kontrolle. Die Rückenfettdicke an den Positionen, die längs zum letzten Brustwirbel lagen, wurden wöchentlich unter Verwendung eines Renco Ultraschallmessgeräts bestimmt. Drei Messungen wurden an den Positionen PI, PII und PIII, die 45 mm, 65 mm und 80 mm seitlich vom Zentrum der Wirbelsäule jeweils am letzten Rippenwirbel liegen, vorgenommen, und der Durchschnitt errechnet, um eine mittlere Rückenfettdicke zu ergeben.
- Ergebnisse
- Die Ergebnisse sind in
7 zusammengefasst. Bei den männlichen Schweinen zeigten sowohl die mit pGHRF behandelten Schweine als auch die Kontrollschweine graduelle Anstiege der Rückenfettdicke mit zunehmendem Alter der Tiere, auch wenn jene, die das pGHRF exprimierende Plasmid erhielten, einen reduzierten Zuwachs an Rückenfett zeigten. Weibliche Kontrollschweine zeigten ebenfalls einen graduellen Zuwachs an Rückenfett, der durch die pGHRF-Behandlung unterdrückt wird. Tabelle 2 zeigt die relativen Zuwächse an Rückenfettdicke über den Versuchszeitraum. 60 Tage nach der Injektion reduzierte die pGHRF-Behandlung die Menge an Rückenfettansatz sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen LY-Schweinen. - Die Ergebnisse der Beispiele zeigen, dass die Behandlung mit dem pGHRF-Gen in der Lage ist, Vorteile bei der Wachstumsentwicklung sowohl bei Mäusen als auch bei Schweinen zu produzieren. Die Zuwächse bei den Wachstumsraten sind mit jenen von GH-Behandlungen vergleichbar, allerdings mit einem sehr viel kostengünstigeren Behandlungsregime. Die Menge an pro Tier verwendeter DNA ist mindestens 100 Mal niedriger als die der Wachstumshormoninjektion, über die in der Literatur berichtet wurde. Ferner zeigen die Schweinedaten, dass es Reduzierungen bei der erforderlichen Futtermenge sowie bei der Rückenfettdicke gibt. Folglich wird diese Erfindung für die Nutzviehindustrie vorteilhaft sein, indem sie die Futterleistung und die Wachstumsrate von Nutzvieh erhöht.
Claims (40)
- Verwendung eines Vektors bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Futterleistung und/oder Wachstumsraten und/oder zur Verringerung des Fettansatzes bei Schweinen, wobei der Vektor die Produktion des Wachstumshormonfreisetzenden Faktors (GHRFs) stimuliert und: – eine einen Promotor zur Expression eines Gens kodierende DNA-Sequenz; – eine ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz; und – eine das porcine GHRF (1-44)-Peptid kodierende DNA-Sequenz umfasst und der Vektor zur Verabreichung durch intramuskuläre Injektion formuliert ist.
- Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Promotor zur Expression eines Gens ein Aktinpromotor ist.
- Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Aktinpromotor ein Skelettaktinpromotor ist.
- Verwendung nach Anspruch 3, wobei die einen Skelettaktinpromotor kodierende DNA-Sequenz einen vollständigen Satz der DNA-Sequenz des Skelettaktinpromotors umfasst.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor des Weiteren eine DNA-Sequenz beinhaltet, die von einer nichttranslatierten Polyadenylierungssignal-haltigen 3-Strich (3')-Region des Gens des Promotors oder GHRFs stammt.
- Verwendung nach Anspruch 5, wobei die nichttranslatierte 3'-Region aus dem porcinen Skelett-α-Aktin-Gen ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Vektor des Weiteren eine DNA-Sequenz beinhaltet, die ein Antibiotikumsresistenzgen kodiert.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der GHRF und sein Signalpeptid, von den DNA-Sequenzen kodiert, den natürlichen oder rekombinanten oder synthetischen oder biologisch aktiven Fragmenten oder ihren Analoga mit ähnlichen Aktivitäten entsprechen.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die DNA-Sequenz des Promotors, die ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die den GHRF kodierende DNA-Sequenz speziesspezifisch sind.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Aktinpromotor und das GHRF-Signalpeptid die endogenen aus Schweinen sind.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das GHRF-Signalpeptid ein humanes GHRF-Signalpeptid ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei der Skelettaktinpromotor ein porciner Skelettaktinpromotor ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Vektor vor der Verabreichung mit einem geeigneten Träger vermischt wird.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Medikament so formuliert ist, dass die pro Tier gegebene Menge an Vektor im Bereich von 1 bis 100 μg pro kg Körpergewicht des Schweins liegt.
- Vektor zur Simulierung der endogenen Produktion von GHRF zur Erhöhung der Futterleistung und/oder Wachstumsraten und/oder zur Verminderung des Fettansatzes bei Schweinen, umfassend: – eine einen Promotor zur Expression eines Gens kodierende DNA-Sequenz; – eine ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz; und – eine das porcine GHRF (1-44)-Peptid kodierende DNA-Sequenz.
- Vektor nach Anspruch 15, wobei der Promotor zur Expression eines Gens ein Aktinpromotor ist.
- Vektor nach Anspruch 16, wobei der Aktinpromotor ein Skelettaktinpromotor ist.
- Vektor nach Anspruch 17, wobei die einen Skelettaktinpromotor kodierende DNA-Sequenz einen vollständigen Satz der DNA-Sequenz des Skelettaktinpromotors umfasst.
- Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der Vektor des Weiteren eine DNA-Sequenz beinhaltet, die von einer nichttranslatierten Polyadenylierungssignal-haltigen 3-Strich (3')-Region des Gens des Promotors oder des GHRFs stammt.
- Vektor nach Anspruch 19, wobei die nichttranslatierte 3'-Region aus dem porcinen Skelett-α-Aktin-Gen ist.
- Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei der Vektor des Weiteren eine DNA-Sequenz beinhaltet, die ein Antibiotikumsresistenzgen kodiert.
- Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei der GHRF und sein Signalpeptid, von den DNA-Sequenzen kodiert, den natürlichen oder rekombinanten oder synthetischen oder biologisch aktiven Fragmenten oder ihren Analoga mit ähnlichen Aktivitäten entsprechen.
- Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei die DNA-Sequenz des Promotors, die ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die den GHRF kodierende DNA-Sequenz speziesspezifisch sind.
- Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei der Aktinpromotor und das GHRF-Signalpeptid die endogenen aus Schweinen sind.
- Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei das GHRF-Signalpeptid ein humanes GHRF-Signalpeptid ist.
- Vektor nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei der Skelettaktinpromotor ein porciner Skelettaktinpromotor ist.
- Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Erhöhung der Futterleistung und/oder Wachstumsraten und/oder zur Verminderung des Fettansatzes bei Schweinen, wobei man: – eine einen Promotor zur Expression eines Gens kodierende DNA-Sequenz zur Verfügung stellt; – eine ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz anfügt; und – eine das porcine GHRF (1-44)-Peptid kodierende DNA-Sequenz anfügt, um den Vektor zu bilden.
- Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Promotor zur Expression eines Gens ein Aktinpromotor ist.
- Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Aktinpromotor ein Skelettaktinpromotor ist.
- Verfahren nach Anspruch 29, wobei die einen Skelettaktinpromotor kodierende DNA-Sequenz einen vollständigen Satz der DNA-Sequenz des Skelettaktinpromotors umfasst.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei das Verfahren des Weiteren beinhaltet, dass man eine DNA-Sequenz anfügt, die von einer nichttranslatierten 3'-Polyadenylierungsregion des Spendergens oder des GHRFs stammt.
- Verfahren nach Anspruch 31, wobei die nichttranslatierte 3'-Region aus dem porcinen Skelett-α-Aktin-Gen ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei das Verfahren des Weiteren beinhaltet, dass man eine ein Antibiotikumsresistenzgen kodierende DNA-Sequenz anfügt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 33, wobei die DNA-Sequenzen der Vektorsequenz durch Ligation aneinander angefügt werden.
- Verfahren nach Anspruch 33, wobei die DNA-Sequenzen des Vektors sequenziell in der folgenden Reihenfolge aneinander angefügt werden: Promotor zur Expression eines Gens; GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz; porcines GHRF kodierende DNA-Sequenz; nichttranslatierte 3'-Polyadenylierungsregion des Promotors kodierende DNA-Sequenz; Antibiotikumsresistenzgen kodierende DNA-Sequenz.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 35, wobei der GHRF und sein Signalpeptid, von den DNA-Sequenzen kodiert, den natürlichen oder rekombinanten oder synthetischen, oder biologisch aktiven Fragmenten oder ihren Analoga mit ähnlicher Aktivität entsprechen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 36, wobei die DNA-Sequenz des Promotors, die ein GHRF-Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz und die den GHRF kodierende DNA-Sequenz artspezifisch sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 36, wobei der Aktinpromotor und das GHRF-Signalpeptid die endogenen aus Schweinen sind.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 38, wobei das GHRF-Signalpeptid ein humanes GHRF-Signalpeptid ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 39, wobei der Skelettaktinpromotor ein porciner Skelettaktinpromotor ist.
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