DE60122121T2

DE60122121T2 - Medizinische vorrichtungen für gentherapieverfahren

Info

Publication number: DE60122121T2
Application number: DE60122121T
Authority: DE
Inventors: Maria Wellesley PALASIS
Original assignee: Boston Scientific Ltd Barbados
Current assignee: Boston Scientific Ltd Barbados
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: EP1267954A1; AU2001238518B2; AU3851801A; JP2004516230A; DE60122121D1; CA2404300A1; WO2001074413A1; US20080038312A1; EP1267954B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer medizinischen Vorrichtung zur regulierten Freisetzung und langzeitigen Expression eines oder mehrerer Produkte und therapeutischer Wirkstoffe innerhalb des Körpers eines Patienten. Insbesondere betrifft diese Erfindung Gen- oder Zelltherapien, bei denen das genetische Material auf eine Oberfläche einer insertierbaren oder implantierbaren medizinischen Vorrichtung beschichtet ist und an einer Zielstelle in dem Körper des Patienten freigesetzt wird.
I. Hintergrund der Erfindung
Die Gentherapie stellt einen attraktiven Ansatz zur Bekämpfung vieler hartnäckiger kardiovasculärer Erkrankungen dar. Im Stand der Technik bekannte Gentherapieverfahren leiden unter mehreren Beschränkungen, die die Verwendung dieser Therapie im klinischen Bereich nicht erfolgreich verlaufen lässt. Unter den verschiedenen Faktoren, die für das Versagen dieses Therapiesystems in vivo verantwortlich sind, sind die kurzzeitige Expression von therapeutischen Genprodukten, die niedrigen Niveaus der Genexpression und die fehlende Ortsspezifität. Der Mangel einer adäquaten Integration in das Gastgenom oder die Zurückweisung des Transgens oder des Trägervektors durch die Immunantwort sind unter den verschiedenen Faktoren, die für die kurze Dauer und das geringe Niveau der Expression der Genprodukte verantwortlich gemacht werden.
Fortschritte in der Interventionsradiologie und den innovativen Gestaltungen der Angioplastik mit Ballons und Stents haben das therapeutische Potenzial von Gen- und Zelltherapiebehandlungen gesteigert. Die langfristige Freisetzung von Arzneistoffen wurde durch anhaltende und lokalisierte Freisetzung von Arzneistoffen in vivo erreicht. Ein potentieller Nachteil gegenüber der herkömmlichen lokalisierten Arzneistoffverabreichung ist die unkontrollierte Art und Weise, mit der der Arzneistoff oder die Arzneistofflösung von der Verabreichungsvorrichtung freigesetzt wird. Es ist oftmals notwendig, den Zeitraum, über den der Arzneistoff freigesetzt wird, zu regulieren und/oder zu verlängern. Zum Beispiel könnte es vorteilhaft sein, die Freisetzungszeit von Stunden auf Tage oder sogar Wochen zu verlängern. Außergewöhnlich lange Freisetzungszeiten, bis zu mehreren Monaten, sind oft erwünscht, zum Beispiel, wenn der Arzneistoff aus einer implantierten Vorrichtung, wie einem Stent, freigesetzt wird.
Die therapeutische Verwendung von herkömmlichen Arzneimittelverabreichungsvorrichtungen ist weiter durch Schwierigkeiten beschränkt, die mit dem erhöhten Trauma der Gefäßwand, dem schnellen Auswaschen des Arzneistoffs, der Verwendung von therapeutischen Mitteln mit einem einzigen Wirkmechanismus und dergleichen in Verbindung gebracht werden. Für einen umfassenderen Überblick über dieses Gebiet siehe zum Beispiel: „Edelman E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:3773, 1990; „Localized release of perivascular heparin inhibits intimal proliferation after endothelial injury without systemic anticoagulation", Okada T., et al., Neurosurgery, 25:892, 1989; "Iontophoretic transmyocardial drug delivery: A novel approach to antiarrhythmic drug therapy", Avitall B., et al., CIRC., 85:1582, 1992; "Direct intraarterial wall injection of microparticles via a catheter: A potential drug delivery strategy following angioplasty," Wilinsky R., et al., Amer. Heart J., 122:1136, 1991; and "Local anticoagulation without systemic effect using a polymer heparin delivery system", Okada T., et al., Stroke, 19:1470, 1988.
Ein Weg, um eine ortsspezifische und lang anhaltende Expression eines therapeutischen Genprodukts in vivo zu erhalten, ist die Einarbeitung von genetischem Material in Form von nackter DNA oder einer Plasmid-DNA in eine Vorrichtungsbeschichtung. Die Transformationseffizienz von nackter DNA oder Plasmid-DNA ist jedoch sehr gering relativ zu der DNA, die durch einen Lipidträger oder durch virale Vektoren bereitgestellt wird. Virale Vektoren stellen eine sehr effiziente Methode zur Einführung fremder Gene in Zellen dar. Unglücklicherweise sind die viralen Vektoren für gewöhnlich sehr labil und sind nicht im Stande, das Beschichtungsverfahren ohne eine Verlust an Aktivität zu überstehen. Daher ist die Einarbeitung von viralen Teilchen in eine Vorrichtungsbeschichtung in seiner gegenwärtigen Form wahrscheinlich kein gangbarer Weg.
Verschiedene Berichte in der wissenschaftlichen Literatur deuten an, dass rekombinante virale Vektoren den effizienten Transfer von fremden Genen in somatische Zellen, einschließlich vaskuläre Endothelialzellen und glatte Muskelzellen, erleichtern. Frühere, auf eine Therapie ausgerichtete Strategien beruhten auf einen Gentransfer durch Platzieren einer Vorrichtung, die transformierte Zellen enthielt, innerhalb des Körpers des Patienten. Das Konzept des direkten Gentransfers auf die Zielzellpopulation, was die Notwendigkeit für eine Zellkultur beseitigte, stießen die Entwicklung von Katheter-basierenden Genfreisetzungssystemen an. Obgleich verschiedene Prototypen die in vivo Freisetzung von viralen Vektoren an vaskulare Wände, welche zu einer Expression von fremden Genen führte, demonstrierten, sind die gegenwärtig verfügbaren Systeme durch die Anzahl und Infektiösität des verabreichten Virus, der traumatischen Verletzung der Gefäßwand während der Verabreichung und der Unterbrechung des Blutflusses während der Verabreichung beschränkt.
Adenoassoziierte Viren (AAV) sind virale Teilchen mit einzigartigen Charakteristika. Er ist lösungsmittel- und hitzestabil, so dass es die Verarbeitungsbedingungen, die zur Einarbeitung des Virus in eine Vorrichtungsbeschichtung notwendig sind, widerstehen kann. Weiter kann es bei Raumtemperatur für mehrere Monate ohne Verlust an Aktivität gelagert werden. Die Verwendung von Vektoren, die von adenoassoziierten Virusvektoren für den Transfer von Genen in vitro und in vivo abgeleitet wurden, ist beschrieben worden (siehe insbesondere US Patente Nrn. 4,797,368, 5,139,941 und 5,851,521). Diese Patente beschreiben verschiedene von adenoassoziierten Viren abgeleitete Konstrukte, bei denen die Replikase- (rep) oder die cap-Gene deletiert wurden und durch ein Gen von Interesse ersetzt wurden.
Die WO 990071 bezieht sich auf ein Verfahren zur Beschichtung von Stents, umfassend ein biokompatible Struktur, die ein genetisches Material trägt, das ein erstes therapeutisches Mittel, das eine Vektor umfasst, der ein erstes Polynukleotid enthält, bei dem der Vektor ein adenoassoziierter Virusvektor ist, und ein zweites therapeutisches Mittel, d.h. ein antimikrobielles Mittel, ein Antikoagulanz, ein anti-mitotisches Mittel, umfasst.
Ein Nachteil der von adenoassoziierten Viren vermittelten Freisetzung von Genen ist, dass der Eintritt der Proteinexpression um ungefähr zwei Wochen nach der Einführung in die Zelle verzögert ist. Die Behandlung von sich ausbreitenden Krankheiten, wie der Restenose, werden wahrscheinlich eine unmittelbare Proteinexpression benötigen, um die proliferative Antwort zu bewirken, die im Allgemeinen etwa drei Tage nach der Implantation der Vorrichtung ihr Maximum aufweist und für gewöhnlich nach zwei Wochen abklingt.
Die Erfindung, wie sie hier offenbart und beschrieben ist, überwindet diese zuvor genannten Beschränkungen der Systeme zur Genfreisetzung und Arzneistofffreisetzung des Standes der Technik. Die Vorrichtung dieser Erfindung erleichtert die Freisetzung einer Polyonukleotidsequenz von Interesse auf eine kontrollierte und stabile Art und Weise in vivo. Die mechanischen Schwierigkeiten, die mit den insertierbaren oder implantierbaren medizinischen Vorrichtungen des Standes der Technik in Verbindung gebracht wurden, wurden durch die hier beschriebene Erfindung durch die Verwendung einer Polymerbeschichtung, die imstande ist, eine adäquate Biegefestigkeit zur Verfügung zu stellen, die es ermöglicht, die Porösität und Hydratationskapazität der Vorrichtung zu regulieren, überwunden. Ein neue Gentherapieverfahren ist offenbart, dass die Schwierigkeiten des Standes der Technik bezüglich der Stabilität während des Beschichtungsverfahrens, der Ortsspezifität und der Stabilität der Expression einer Polynukleotidsequenz in vivo überwindet.
Diese Charakteristika und einige andere, die hier offenbart sind, machen die medizinische Vorrichtung dieser Erfindung interessant für eine Vielzahl von therapeutischen Verfahren, einschließlich der Gen- und Zelltherapie.
II. Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt der Erfindung wird eine medizinische Vorrichtung mit einer biokompatiblen Struktur zur Verfügung gestellt, die ein genetisches Material trägt. Die biokompatible Struktur umfasst eine biokompatible polymere Beschichtung, die mindestens einen Teil der Struktur beschichtet und ein genetisches Material trägt. Das genetische Material umfasst: a) einen ersten therapeutischen Wirkstoff, umfassend einen Vektor, der ein erstes Polynukleotid enthält, das eine Genexpression liefert, die ausreichend ist zum Herstellen einer therapeutisch ausreichenden Menge eines oder mehrer Produkte, die von dem ersten Polynukleotid kodiert werden, und b) einen zweiten therapeutischen Wirkstoff, der einen nicht-genetischen therapeutischen Wirkstoff umfasst, wobei der nicht-genetische therapeutische Wirkstoff ein angiogenetischer Wirkstoff ist.
Die genetisch beschichtete medizinische Vorrichtung der Erfindung umfasst vorzugsweise einen Stent, ein Katheter oder eine Kombination davon. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die medizinische Vorrichtung oder Struktur der Erfindung einen Stent, der aus einem biokompatiblen Material, einschließlich biostabilen oder biologisch abbaubaren Materialien, aufgebaut ist. Mehr bevorzugt ist der Stent ein metallischer Stent. Der Stent kann jedwede Gestalt aufweisen und aus jedwedem biokompatiblen Material aufgebaut sein, das geeignet ist, um die gesamte oder einen Teil einer röhrenförmigen oder spiralförmigen Vorrichtung in einer geöffneten, expandierten, spiralisierten oder röhrenförmigen Form während der Lagerung und/oder der sich anschließenden Implantation zu halten. Geeignete biokompatible Materialien für einen Stent schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, nicht-rostender Stahl, Nickel, Silber, Platin, Gold, Titan, Iridium, Wolfram, Ni-Ti-Legierungen (d.h. Nitinol), Iconel, Mischungen aus Poly-1-Milchsäuren (PLLA) und Poly-ε-Caprolacton (PCL) und dergleichen.
Durch die medizinische Vorrichtung der Erfindung wird ein Verfahren zur Inhibierung oder Behandlung von Restenose in einem Patienten, vorzugsweise einem Tier, zur Verfügung gestellt, indem es dem Patienten an einer vorher bestimmten Stelle des Körpers verabreicht wird. Die Verabreichungsstelle ist vorzugsweise eine Stelle mit einer mechanischen Verletzung einer Arterienwand, die durch die Behandlung einer atherosklerotischen Läsion durch Angioplastie zugefügt wurde.
In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer medizinischen Vorrichtung für die kontrollierte Freisetzung eines genetischen Materials an einen Patienten zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst: (A) das Aufbringen einer Polymerbeschichtung auf mindestens einen Teil einer medizinischen Vorrichtung; (B) das Aufbringen eines genetischen Materials auf die Polymerbeschichtung, um eine genetisch beschichtete medizinische Vorrichtung zu erhalten, wobei das genetische Material umfasst: (a) einen ersten therapeutischen Wirkstoff umfassend einen ein erstes Polynukleotid enthaltenden Vektor, der eine Genexpression liefert, die ausreichend ist zum Herstellen einer therapeutisch ausreichenden Menge eines angiogenetischen Wirkstoffs, und (b) einen nicht-genetischen therapeutischen Wirkstoff, der ein angiogenetischer Wirkstoff ist. Die Schritte (A) und (B) sind nicht auf eine Reihenfolge begrenzt und das Verfahren umfasst das Auftragen von B vor oder gleichzeitig mit A.
III. Detaillierte Beschreibung der Erfindung Wie hier verwendet, sind die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert:
„Nacktes Polynukleotid", wie es hier verwendet wird, schließt jedwedes Nukleinsäuremolekül ein, das nicht in einen viralen, Plasmid- oder anderen Nicht-Plasmid-Polynukleotidträger eingearbeitet ist.
„Genetisches Material", wie es hier verwendet wird, schließt jedwedes biologisch aktive Material ein, das in der Zelltherapie oder Gentherapie dieser Erfindung verwendet wird, unabhängig davon, ob sie vivo-, ex vivo- oder in vitro-Kulturen sind, einschließlich bakterielle, virale, prokaryotische oder eukaryotische Zellkulturen in transformierten oder nicht-transformierten Zuständen; native oder fremde Polynucleotide, rekombinante oder natürliche Polynucleotide, einschließlich Reporter-Gene, Marker-Gene, regulatorische Sequenzen, antisense-Moleküle und dergleichen. Zusätzlich kann das genetische Material nicht-genetische Wirkstoffe in Kombination mit den zuvor genannten Verbindungen und Zusammensetzungen einschließen.
„Produkt", wie es hier verwendet wird, schließt jedwedes Protein, Peptid, Polypeptid, Polynucleotid, in sense- oder antisense-Orientierung, einschließlich DNA, RNA, DNA/RNA-Hybride, ein. Der Ausdruck Protein, Peptid, und Polypeptid werden hier austauschbar verwendet.
„Therapeutischer Wirkstoff", wie er hier verwendet wird, schließt jedwede Verbindung, Zusammensetzung oder kleines Molekül ein, das ein vorteilhafte biologische oder eine medizinische Reaktion in vitro, ex vivo, oder in vivo induziert. Therapeutische Wirkstoffe sind zum Beispiel jedwedes Protein, Peptid, Polypeptid, Polynucleotide, kleine Moleküle, Antibiotika, nicht-genetische Wirkstoffe, therapeutische Polymere, Zellen oder eine Kombination davon.
„Medizinische Vorrichtung", wie es hier verwendet wird, schließt jede implantierbare oder einsetzbare medizinische Vorrichtung, entweder teilweise oder als Ganzes, ein.
„Stent", wie es hier verwendet wird, schließt jedwede röhrenförmige oder helicale Vorrichtung ein, die verwendet wird, um eine Körperöffnung oder Höhle, einschließlich Pfropfen, aufrecht zu erhalten oder zu stützen.
„Ballonkatheter", wie es hier verwendet wird, schließt einen Katheder ein, der einen Ballon oder eine Vielzahl von Ballonen aufweist, die aufgeblasen oder entleert werden können, ohne den Katheder nach dem Einsetzen in den Körper zu entfernen.
„Therapeutisch ausreichende Menge", wie es hier beschrieben ist, bedeutet eine wirksame Menge eines Wirkstoffs oder eines Produkts, die durch die Natur und die chemische Zusammensetzung des jeweiligen Wirkstoffs oder verwendeten Produkts bestimmt ist.
Die Erfindung beschreibt eine medizinische Vorrichtung und ein Verfahren zur Freisetzung eines genetischen Materials in der Vaskulatur oder den Kanälen eines Patienten. Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung, wie sie hier offenbart sind, stellen eine Kontrolle über die Freisetzung, den Zielort, den Zeitraum der Exponierung, die Dauer und die Menge eines oder mehrerer Produkte und therapeutischer Wirkstoffe innerhalb des Körpers des Patienten zur Verfügung. Die lokale Expression von Genen ist insbesondere wünschenswert bei Therapien, die die Verwendung eines chemotherapeutischen Wirkstoffes betreffen, insbesondere wenn die Therapie auf ein einzelnes Organ oder eine Stelle gerichtet ist und die nicht-systemische Exponierung dieser Stelle innerhalb des Körpers erfordert. Das Genfreisetzungssystem gemäß dieser Erfindung stellt in Kombination mit der Verwendung von Vorrichtungen, wie Stents oder intravenöse Katheder, eine wirksame Vorrichtung und System für die Genfreisetzung sowohl in vivo als auch ex vivo zur Verfügung.
Die medizinische Vorrichtung dieser Erfindung ist eine Vorrichtung, die für die Einführung in den Körper, zum Beispiel in die Speiseröhre, Trachean, Kolon, Därme, Gallentrakt, Harntrakt, das vaskuläre System, Ureter, Urethra, die Bronchen, das Pankreas-Duktus-System, die Därme, den nasolacrimalen Duktus, die Sinus-kavitäten, das Auge, die Eileiter und dergleichen, angepasst ist.
Insbesondere ist, wie hier offenbart, die medizinische Vorrichtung gemäß dieser Erfindung jedwede insertierbare oder implantierbare medizinische Vorrichtung. Beispiele der medizinischen Vorrichtung der Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Katheder, Stents, Nadelinjektionskatheder, Blutklumpenfilter, vaskulare Transplantate, Stent-Transplantate, Gallen-Stents, Kolon-Stents, bronichale oder für die Lunge geeignete Stents, Speisenröhren-Stents, Harnröhren-Stents, Aneurysma-füllende Spiralen und andere spiralisierte Spiralvorrichtungen, Vorrichtungen für die trans-myocardiale Revaskularization („TMR"), für die precutane myocardiale Revaskularization („PMR"), hypoderme Nadeln, Clips für weiches Gewebe, Haltevorrichtungen und dergleichen.
Die medizinische Vorrichtung der Erfindung wird durch bekannte Techniken an die Zielstellen gebracht und/oder implantiert. Der Transport kann wahlfrei innerhalb einer Hülle, die die beschichtete medizinische Vorrichtung bedeckt, durchgeführt werden, um dazu beizutragen, die Freisetzung des genetischen Materials vor dem Erreichen des Zielorts zu inhibieren.
Während die Struktur, die in der medizinischen Vorrichtung eingeschlossen ist, auf eine Vielzahl von Art und Weisen konfiguriert werden kann, ist die Struktur vorzugsweise als ein Stent konfiguriert, der aus einem biokompatiblen Material, einschließlich biostabilen oder biologisch abbaubaren Materialien, aufgebaut ist. Mehr bevorzugt ist der Stent ein metallischer Stent. Der Stent kann jedwede Gestalt aufweisen und kann aus jedwedem biokompatiblen Material, das geeignet ist, um die gesamte oder einen Teil einer röhrenförmigen oder spiralisierten Spiralvorrichtung in einer geöffneten, expandierten, spiralisierten oder röhrenförmigen Form während der Lagerung und/oder im Anschluss an die Implantation zu halten, aufgebaut sein. Geeignete biokompatible Material für einen Stent schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, nicht-rostender Stahl, Nickel, Silber, Platin, Gold, Titan, Iridium, Wolfram, Ni-Ti-Legierungen (d.h. Nitinol), Inconel, Gemische aus Poly-1-Milchsäure (PLLA)/Poly-ε-Caprolacton (PCL) oder dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird auf der äußeren Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung, wie ein Stent, ein biologisch abbaubares resorbierbares Polymer zur Verfügung gestellt. Der Stent, der gemäß der Erfindung hier offenbart ist, stellt eine adäquate Zugfestigkeit zur Verfügung, um als eine Gerüstvorrichtung zu wirken, ermöglicht die Regulierung der Porosität und der Hydrationsskapazität und, falls dies erwünscht ist, baut sich zu Produkten ab, die zu dem genetischen Material, das darauf imprägniert ist, oder gegenüber den Zellen der vaskulären Wand eines Patienten nicht toxisch sind.
In dem Umfang dieser Erfindung umfasst sind Stents, die eine mikroporöse Röhre oder eine spiralförmige Feder umfassen, die zum Beispiel aus aliphatischen Polyestergemischen unter Verwendung einer Flotation-Ausfällung oder manueller Spritzguß/Wickel-Techniken hergestellt wurde.
Eine andere bevorzugte medizinische Vorrichtung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein beschichteter Stent, der in Verbindung mit einem Ballonkatheder verwendet wird. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Stent, der an einen Ballonkatheder angeheftet ist, in eine Arterie eingeführt. Das Aufblähen des Ballons expandiert den Stent und drückt ihn leicht in die Wände der behandelten Arterie. Wenn der Ballon geschrumpft wird, bleibt der Stent zurück um die Arterienwand zu verstärken. Mehr bevorzugt ist der Stent ein ballon-expandierbarer Stent oder ein selbst expandierender Stent, d.h. von dem Typ der mit superelastischen Materialien wie Nitinol, gebildet ist, wie es in der US Patentnummer 5,954,706 beschrieben ist.
Die Erfindung umfasst auch einen Katheder zur Freisetzung von genetischem Material an einer gewünschten Stelle innerhalb des Körpers oder innerhalb der Wand einer Körperhöhle. Der Katheder weist vorzugsweise einen expandierbaren Teil auf, der auf einen Kathederschaft aufmontiert ist, wobei der expandierbare Teil vorzugsweise durch einen regulierten Druck expandierbar ist, d.h. um den Querschnitt einer Körperhöhle zu füllen und um gegen die Wand der Körperhöhle zu pressen.
Die Vorrichtung, oder mindestens ein Teil der Oberfläche der Vorrichtung, die mit der Zielstelle in Kontakt kommt, wird mit einer polymeren Beschichtung beschichtet. Jedwede geeignete Oberfläche der medizinischen Vorrichtung kann mit einer polymeren Beschichtung beschichtet werden. Die Oberflächen, die beschichtet werden sollen, können zum Beispiel Vertiefungen, Löcher, Fugen, Schlitze, flache Oberflächen, obere oder innere Oberflächen und dergleichen umfassen, die innerhalb oder auf der medizinischen Vorrichtung vorliegen. Es ist nicht notwendig, dass die gesamte Oberfläche beschichtet wird, es kann vielmehr auch nur ein Teil der Oberfläche beschichtet werden. Falls zum Beispiel ein expandierbarer Katheder verwendet wird, wird mindestens ein Teil der äußeren Oberfläche des expandierbaren Teils mit einer polymeren Beschichtung beschichtet.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Polymerbeschichtung zur Verfügung gestellt, die eine Oberfläche der medizinischen Vorrichtung schützt und bedeckt und die Freisetzung des genetischen Materials aus der Beschichtung während der trans-vaskularen oder trans-duktalen Verabreichung verhindert, bis es an die Zielstelle innerhalb des Körpers gebracht wurde. Die Polymerbeschichtung reguliert vorzugsweise die Freisetzungskinetiken des genetischen Materials von der medizinischen Vorrichtung.
Als polymere Beschichtung wird jedwedes medizinisch akzeptables natürliches oder synthetisches Polymer verwendet. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das Polymer zum Beispiel in Wasser lösliche, thermisch abbau bare oder biologisch abbaubare Polymere. Beispiele des Polymeren dieser Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt, Polycaprolacton, Polyorthoester, Poly-Milchsäuren, Mischungen aus Poly-1-Milchsäure/Poly-ε-Caprolacton, Polyglcolsäuren, Carbowachse, Gelatine, Chitosan, Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid, Polyethylenglycol, Albumin, Plurongel F-127, Collagen, Alginate, Zelluloseverbindungen, Polyvinylpyrrolidon oder eine Kombination davon.
Auch im Umfang der Erfindung umfasst sind biostabile Polymere mit einer Porosität, die ausreicht, um eine Freisetzung von Wirkstoffen zu erlauben. Das genetische Material, einschließlich transformierter Zellen, muss nicht freigesetzt werden sondern kann auch in einer biostabilen Freisetzungsmatrix auf Proteinbasis gefangen bleiben.
Die Dicke der Polymerbeschichtung liegt vorzugsweise zwischen 1 und 1000 μm, mehr bevorzugt zwischen 10 und 100 μm und am meisten bevorzugt zwischen 5 und 50 μm, pro Gesamtschichten. Schichten von Polymerbeschichtung, von 1 bis 40 Schichten, wobei jede Schicht eine Dicke von 1 bis 10 μm/Beschichtungsschicht aufweist, werden auf die jeweilige(n) Oberfläche(n) der medizinischen Vorrichtung aufgebracht.
Wenn die beschichtete(n) Oberfläche(n) der medizinischen Vorrichtung mit dem Blut des Patienten oder anderen Geweben und Organen in dem Körper in Berührung kommt (kommen), wird das genetische Material im Wesentlichen davon freigesetzt. In Abhängigkeit von Wahl der Polymerbeschichtung, der Freisetzungsstelle oder der jeweilig beabsichtigten Gen- oder Zelltherapiestrategie, wird die Freisetzung des genetischen Materials entweder sofort erfolgen oder erfolgt nach einer regulierten Verzögerungszeit von etwa 1 bis mehreren Minuten (zum Beispiel 1, 5, 10, 20, 30, 60 oder 90 Minuten), um es der medizinischen Vorrichtung zu ermöglichen, die Zielstelle zu erreichen.
Das genetische Material gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung schließt eine oder mehrere Polynucleotide, die durch einen Vektor in Kombination mit einem Träger getragen werden, ein. Der Vektor und der Träger sind jeweils Teil des ersten bzw. des zweiten therapeutischen Mittels. Der Vektor, der Träger oder beide werden verwendet, um eukaryotische oder prokaryotische Zellen zu transformieren, zu transfizieren oder zu transduzieren, wobei die Zellen dann auf die gleiche oder eine andere Beschichtungsschicht aufgetragen werden oder darauf imprägniert werden. Die Ausdrücke Transformation, Transduktion und Transfektion werden hier miteinander austauschbar verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das genetische Material transfizierte Zellen.
Die transformierten Zellen stellen Produkte und therapeutische Mittel von Interesse an der Transplantationsstelle zur Verfügung. Das Freisetzungsmedium wird wie benötigt formuliert, um die Zellfunktion und Lebensfähigkeit aufrecht zu erhalten. Die Zellen, die in der Zelltherapie verwendet werden, sind zum Beispiel von einem Patienten oder aus einer anderen Quelle, einschließlich aus Säugetier- oder Nicht-Säugetier-Quellen, und aus einer Vielzahl von Geweben und Organen, einschließlich zum Beispiel unter anderem aus Knochenmark, Blut oder der Leber abgeleitet. Im Allgemeinen sind die Zellen menschlichen Ursprungs (autolog oder allogen) oder tierischen Ursprungs (xenogen). Diese Erfindung umfasst die Verwendung von Zellen unter einem breiten Bereich von Entwicklungs- und Wachstumsbedingungen. Zum Beispiel wird die Verwendung von differenzierten Zellen, nicht-differenzierten Zellen, Stammzellen oder Vorläuferzellen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung in Erwägung gezogen. Falls dies erwünscht ist, werden die nicht-differenzierten Zellen chemisch oder physikalisch induziert, um in einen gewünschten Zelltyp zu differenzieren.
Der erfindungsgemäße hier beschriebene Vektor umfasst einen rekombinaten Vektor. Vorzugsweise ist der Vektor ein viraler oder Plasmid-Vektor, mehr bevorzugt ist der Vektor ein viraler Vektor, der bezüglich der Replikation defizient ist, der thermostabil ist, der ortsspezifisch ist und der eine verzögerte Expression zur Verfügung stellt. Am meisten bevorzugt ist der virale Vektor stabil, übersteht die Beschichtungsprozesse und weist eine geringe Immunogenizität auf. Ein Beispiel des bevorzugten Vektors dieser Erfindung ist der adenoasseziierte virale Vektor.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Vektor mit einer verzögerten Expression, der die Expression des ersten Polynucleotids im Allgemeinen von 1 bis 3 Wochen nach der Verabreichung an den Patienten verzögert. Die Expression der Produkte und die Stabilität der Expression innerhalb des Körpers eines Patienten werden letztendlich durch Faktoren, wie die jeweilige Stelle der Verabreichung innerhalb eines Körpers des Patienten, d.h. dem Organ, dem Gewebe oder den Zelltypen, beeinflusst.
Der Träger dieser Erfindung umfasst zum Beispiel einen viralen Vektor, einen nicht-viralen Vektor, einen nicht-plasmidischen Vektor oder nackte Nucleinsäure. Der Träger ist vorzugsweise ein Träger mit früher Expression, der eine transiente Expression des zweiten Polynucleotids von Interesse, welches er trägt, zur Verfügung stellt. Der Träger mit früher Expression führt im Allgemeinen zu einer Expression des zweiten Polynucleotids in 1 bis 2 Tagen oder früher nach der Verabreichung der medizinischen Vorrichtung innerhalb des Körpers des Patienten. Diese transiente Expression kann für mehrere Wochen in den Zielzellen fortgesetzt sein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das erste Polynucleotid durch einen Vektor mit verzögerter Expression und das zweite Polynucleotid durch einen Vektor mit früher Expression getragen. Das erste Polynucleotid integriert sich in das Genom von Zellen an oder in der Nähe der Zielstelle und etabliert eine verzögerte und stabile Expression auf einem Niveau, das ausreicht, um eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Produkte in diesen Zellen zu erzeugen. Ein Beispiel einer verzögerten Expression ist eine Expression, die um etwa 2 Tage bis etwa drei Wochen verzögert ist. Eine ausreichende Häufigkeit der Expression ist eine Expression, die in zwischen 5% und 90% der Zellen, die dem Vektor ausgesetzt sind, induziert wird. Im Mittel expremieren zwischen 20% und 80% der Zellen, die dem Vektor ausgesetzt sind, das Produkt, das durch das erste Polynucleotid kodiert ist.
Ein bevorzugter nicht-plasmidischer Vektor dieser Erfindung schließt zum Beispiel Liposome, Lipofectin, Lipoplexe, Polyplexe, Dextrane, Starburst-Dendrimer-Konjugate, Polybenren, Dimethylsulfoxid, Protaminsulfat, Antikörper-Konjugate, Polylysin-Konjugate, Gramacidin-S, künstliche Konjugate, virale Umhüllungen, viral-ähnliche Teilchen, Nano- oder Mikro-Teilchen, Polyvinylpyrrolidon, SP 1017, oder eine Kombination davon ein.
Es versteht sich, dass das Design des Vektors und des Trägers, wie sie vorstehend diskutiert wurden, von Faktoren, wie der Wahl der Wirtszelle, die transformiert werden soll, und/oder des Typs der Produkte, die expremiert werden sollen, abhängen kann. Weiter sollten auch die Vektor-Kopierzahl, die Fähigkeit, die Kopierzahl zu kontrollieren, und die Expression jedweder anderer Produkte, die durch das erste oder das zweite Polynucleotid dieser Erfindung kodiert werden, wie antibiotische Marker oder Antisense-Moleküle, auch in Betracht gezogen werden.
Nicht-beschränkende Beispiele von viralen Vektoren oder Vektoren, die von viralen Quellen abgeleitet sind, schließen adenvirale Vektoren, Herpes-simplex-Vektoren, Papilloma-Vektoren, adenoassoziierte virale Vektoren, retrovirale Vektoren, Alpha-Virus-Vektoren, Lentivirus-Vektoren und dergleichen ein. Wie zuvor beschrieben ist der virale Vektor dieser Erfindung vorzugsweise ein replikationsdefizienter Virus und ist daher unfähig, sich autonom in der Zielzelle zu replizieren. Im Allgemeinen fehlt dem Genom der replikationsdefizienten Viren, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mindestens die Region, die für die Replikation des Virus in der infizierten Zelle notwendig ist. Diese Regionen können entweder entfernt (ganz oder zum Teil) sein, nicht-funktionell gemacht worden sein oder durch andere Sequenzen, insbesondere durch die Sequenz des Gens von Interesse, substituiert worden sein. Das replikationsdefiziente Virus kann die Sequenzen auf seinem Genom, die für die Einkapselung der viralen Teilchen notwendig sind, behalten.
Wie zuvor beschrieben ist ein bevorzugter Vektor dieser Erfindung ein viraler Vektor, der von einem Adenovirus oder einem adenoassoziierten Virus (AAV) abgeleitet ist. Adenoassoziierte Viren sind DNA-Viren von relativ kleiner Größe, die auf stabile und stellen-spezifische Art und Weise in das Genom von Zellen, die sie infizieren, integrieren. Diese Viren sind im Stande, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren, ohne jedwede Effekte bezüglich des Zellwachstums, der Mophologie oder der Differenziation zu induzieren. Weiter erscheinen sie nicht an Erkrankungen des Menschen beteiligt zu sein und zeigen eine geringe Immunogenizität.
Zwei allgemeine Typen von adenoassoziierten viralen Vektoren werden verwendet. Bei dem ersten Typ wird das Kapsid-Gen entfernt und Fremd-DNA (etwa 2 kb) an der Deletionsstelle inseriert. Dieser Typ von Vektor behält das Replikase-Gen bei und kann an einer spezifischen Stelle in das Wirtsgenom integrieren. Der zweite Vektortyp enthält einfach ein oder mehrere terminale Wiederholungseinheiten (zuzüglich einiger zusätzlicher Basen) des AAV an beiden Enden der Fremd-DNA. In einigen Fällen kann solch ein Vektor integrieren und mit einer Häufigkeit > 50% transformieren, jedoch kann das Auftreten der Stellenspezifität verringert sein.
Es existieren verschiedene Serotypen von Adenoviren mit unterschiedlichen Strukturen und Eigenschaften. Unter diesen Serotypen wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung den humanen Adenoviren vom Typ 2 oder Typ 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder den Adenoviren tierischen Ursprungs der Vorzug gegeben, jedoch können andere adenoassoziierte Subtypen, wie die Subtypen 1, 3, 4 und 6–42, auch verwendet werden. Die Adenoviren tierischen Ursprungs, die in nerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Adenoviren aus dem Hund, dem Rind oder der Maus ein. Vorzugsweise ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein adenoassoziierter Virus aus dem Hund vom Typ 2 (CAV2) oder er ist gemischten Ursprungs vom Menschen und Hund.
Eingeschlossen in den Umfang der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Adenoviren, die größere strukturelle Merkmale des Ad:Pac-beta-Galaktosidase (beta-Gal)-Gens teilen. Das bedeutet, dass die Erfindung die Verwendung von replikationsdefizienten E1-, E3-deletierten Adenoviren einschließt, die zum Beispiel E1a-Enhancer/Verpackungs-Signale an dem 3'-Ende umfassen. Die Viren haben an der E1-Deletionsstelle eine nicht-adenovirale kodierende Sequenz, die funktionsfähig an ein Promotor gebunden ist. Die nicht-adenovirale kodierende Sequenz kann ein Markergen sein (wie das Nukleus-lokalisierende beta-Gal-Gen, das Luziferasegen und der gleichen). Die kodierende Sequenz kann auch ein Gen sein, das ein therapeutisch aktives Molekül (Beispiele davon werden vorstehend gegeben) kodiert. Der Promotor, an den die kodierende Sequenz funktionsfähig gebunden ist, ist zum Beispiel ein starker viraler Promotor, wie der CMV-Promotor/Enhancer oder der Promotor des synzytialen Atemwegsvirus (RSV), ein gewebespezifischer Promotor oder ein induzierbarer Promotor (d.h. ein Metallothionin-Promotor).
Der Vektor und der Träger tragen das erste beziehungsweise das zweite Polynukleotid. Das erste und das zweite Polynukleotid sind das gleiche oder verschiedene Polynokleotide gemäß dieser Erfindung und sind in jedweder molekular akzeptablen Form. Molekular akzeptable Formen schließen zum Beispiel DNA, Ribozyme, anti-sense- DNA oder -RNA, nackte DNA, cDNA, RNA, ein DNA/ RNA-Hybrid, genomische DNA und der gleichen ein.
Das erste oder zweite Polynukleotid oder beide kodieren für ein oder mehrere Produkte. Produkte umfassen zum Beispiel Proteine, Peptide, Polypeptide oder Polynukleotid-Moleküle in sense- oder antisense-Orientierung. Unter einem Produkt versteht sich jedwedes translationale, nach der Translation modifizierte oder nicht-translationale Produkt eines Polynukleotids unabhängig von der Größe oder Form. Produkte schließen als primäres Beispiel diejenigen Produkte ein, die für einen Defekt oder eine Defizienz in einem Tier kompensieren können, oder diejenigen, die durch toxische Wirkungen wirken, um für den Körper schädliche Zellen zu begrenzen oder zu entfernen.
Das erste therapeutische Mittel dieser Erfindung umfasst genetische Materialien wohingegen das zweite therapeutische Mittel der Erfindung entweder genetische oder nichtgenetische Materialien umfassen kann. Das nichtgenetische Material umfasst jedwedes Molekül oder Verbindung, die eine vorteilhafte biologische oder medizinische Reaktion in vitro, ex vitro oder in vivo induzieren kann. Ein Beispiel einer vorteilhaften biologischen Reaktion ist eine Reaktion, die den Einbau des genetischen Materials in die Zellen stimuliert oder dessen Chance erhöht.
Innerhalb des Umfangs der therapeutischen Mittel der Erfindung sind die diejenigen Mittel eingeschlossen, die den Gentransfer und die Integration in Zellen und Gewebe steigern. Diese Mittel schließen Verbindungen ein, wie zum Beispiel Polybren, Poly-L-lysin, Dextransulfat, Polyvinylpyrrolidon, SP 1017 (Supratek Pharma), andere polykationische Substanzen, Dexamethason, Substanzen, die die Permeabilität von Geweben erhöhen, wie Detergenzien und Lipide, zum Beispiel NP-40, und SDS, das die Permeabilität von Geweben erhöht. Weitere Beispiele von therapeutischen Mitteln der Erfindung schließen immunsuppremierende Mittel, wie Cyklosporin, Dexamethason und Antikörper gegen Cytokine, wie unter anderem TNF-alpha, ein.
Nicht begrenzende Beispiele von Produkten und therapeutischen Mitteln der Erfindung schließen ein: anti-thrombogene Mittel wie Heparin, Heparinderivate, Urokinase und PPACK (Dextrophenylalaninprolinargininchlormethylketon); Erythropoietin; Antioxidanzien, angiogene und anti-angiogene Mittel und Faktoren; Mittel zur Blockierung der Proliferation glatter Muskelzellen, wie Rapamycin, Angiopeptin, monoclonale Antikörper, die imstande sind die Proliferation galtter Muskelzellen zu blockieren, entzündungshemmende Mittel, wie Östrogen; Calciumeintrittsblockierer; anti-neoplastische/anti-proliferative/anti-mitotische Mittel, wie Angiostatin und Thymidinkinase-Inhibitoren; Nitrofurantoin; anästhesierende Mittel, wie Lidocain, Bupivacain und Ropivacain; Nitro-oxidsynthase (NOS); Anti-Gerinnungsmittel, wie D-Phe-Pro-Arg, eine RGD-Peptid-enthaltende Verbindung, Anti-Thrombin-Verbindungen; Antagonisten des Plättchenrezeptors; Anti-Thrombin-Antikörper, Antikörper gegen den Anti-Plättchen-Rezeptor; Prostaglandin-Inhibitoren, Plättchen-Inhibitoren; Promotoren des vaskulären Zellwachstums; Antagonisten eines Wachstumsfaktorrezeptors; Transkriptionsaktivatoren und Translationspromotoren; Inhibitoren des vaskulären Zellwachstums, wie Inhibitoren der Wachstumsfaktoren; Antagonisten eines Wachstumfaktorsrezeptors; Transkriptionsrepressoren; Translationrepressoren; Replikationsinhibitoren; inhibierende Antikörper; Antikörper, die gegen Wachstumsfaktoren gerichtet sind; bifunktionale Moleküle, die aus einem Wachstumsfaktor und einem Cytotoxin bestehen, bifunktionale Moleküle, die aus einem Antikörper und einem Cytotoxin bestehen; cholesterinsenkende Mittel; Vasodilatationsmittel; Mittel, die mit den endogenen vasoaktiven Mechanismen interferieren; und Überlebensgene, die gegen den Zelltod schützen, wie anti-apoptotische Faktoren der Bcl-2-Familie.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kodieren das erste oder das zweite Polynukleotid oder beide angiogene oder anti-angiogene Mittel, wie saure und basische Fibroplasten-Wachstumsfaktoren, vaskulare endotheliale Wachstumsfaktoren, hif-1, epidermale Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren α und β, Plättchen-abgeleitete endotheliale Wachstumsfaktoren, Plättchenabgeleitete Wachstumsfaktoren, der Tumornecrosefaktor α, ein Hepatocyt-Wachstumsfaktor und ein Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, AKT, Inhibitoren des Zellzyklus, einschließlich CDK-Inhibitoren, Retinoplastoma, p53, p16, p27, Anti-Restenose-Mittel, Thymidin-Kinase („TK"), ein FAS-Ligand, hKIS, Häm-Oxygenase, Stickstoffoxide und Kombinationen davon.
Noch andere Produkte, die durch die ersten oder die zweiten Polynukleotidsequenzen oder beiden kodiert werden können, schließen monocyte chemoattraktive Proteine („MCP-1") und die Familie der knochenmorphogenen Proteine („BMP's") ein. Die bekannten Proteine schließen BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15 und BMP-16 ein. Gegenwärtig bevorzugte BMP's sind jedwede der BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7. Diese dimeren Proteine können als Homodimere, Heterodimere oder Komibnationen davon alleine oder zusammen mit anderen Molekülen zur Verfügung gestellt werden. Alternativ oder zusätzlich können Moleküle zur Verfügung gestellt werden, die imstande sind, eine stromaufwärts oder stromabwärts erfolgende Wirkung auf die BMP-Expression zu induzieren. Solche Moleküle schließen jedwede „hedgehog"-Proteine ein oder die Nukleinsäuren, die sie kodieren.
Im Allgemeinen kann das erste oder das zweite Polynukleotid oder beide funktionsfähig an mindestens eine die Transkription regulierende Sequenz auf eine Art und Weise angebunden werden, die die Expression der Polynukleotidsequenz erlaubt. Regulierende Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und sind ausgewählt, um die Gen-Expression zu steuern. Dem folgend schließt der Ausdruck die Transkription regulierende Sequenz Promotoren, Enhancers und andere Expressionskontrollelemente ein. Solche regulierenden Sequenzen sind in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) beschrieben.
Die regulierenden Sequenzen, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, können zum Beispiel Sequenzen einschließen, die natürlich verantwortlich für die Exprimierung eines Gens sind, unter der Maßgabe, dass diese Sequenzen auch imstande sind, in der infizierten Zelle ihren Dienst zu verrichten. Die Sequenzen können auch Sequenzen eines anderen Ursprungs sein (verantwortlich für eine Exprimierung oder Regulierung der Expression von verschiedenen Proteinen oder selbst sogar von synthetischen Proteinen). Insbesondere können die Sequenzen Sequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen sein oder Sequenzen, die davon abgeleitet sind, wobei die Sequenzen zum Beispiel die Transkription eines Gens auf eine spezifische oder nicht-spezifische Weise oder auf eine induzierbare oder nicht-induzierbare Weise stimulieren oder unterdrücken. Als ein Beispiel können sie Promotorsequenzen sein, die aus dem Wirtgenom abgeleitet sind, oder sie können von dem Genom eines Virus stammen, insbesondere die Promotoren der adenoviralen E1A- und MLP-Gene, ein CMV- oder ein LTR-RSV-Promotor.
Andere regulierende Sequenzen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung schließen eukaryotische Promotoren ein, die ubiquitäre Promotoren umfassen (HPRT, Vimentin, Actin, Tibulin etc), intermediäre Filament-Promotoren (Desmin, Neurofilamente, Keratin, GFAP etc.); therapeutische Genpromotoren (MDR-Typ, CFTR, Faktor-VIII etc.); gewebespezifische Promotoren (Actin-Promotor in glatten Muskelzellen); Promotoren, welche präferenziell in sich teilenden Zellen aktiviert sind, oder Promotoren, die auf einen Stimulus reagieren (Steroidhormonrezeptor, Retinoesäurerezeptor etc.). Die frühen und späten Promotoren von SV40; unmittelbar frühe Adenovirus- oder Cytomegalovirus-Promotoren; lac-System; trp-System; T7-Promotor, dessen Expression durch die T7-RNA-Polymerase gesteuert ist; große Operator- und Promotorregionen der Lamda-Phage; Kontrollregionen für virales Hüllenprotein; der Promotor für eine 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme; Promotoren der Säurephosphatase, d.h. Pho5; Promotoren des Alpha-Paarungsfaktors der Hefe; Polyhedron-Promotor des Baculovirussystems und andere Sequenzen von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihren Viren regulieren, und verschiedene Kombinationen davon, sind im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind das erste Polynukleotid, das zweite Polynukleotid oder beide stromaufwärts zu der kodierenden Sequenz an eine Signalsequenz angebunden, die die synthetisierten Produkte in die sekretorischen Wege der Zielzelle leitet. Während diese Signalsequenz eine natürliche Signalsequenz sein kann, kann sie auch jedwede andere funktionale Signalsequenz (zum Beispiel diejenige des Gens für Timidinkinase) sein oder eine künstliche Signalsequenz.
Die Menge des genetischen Materials, das auf die medizinische Vorrichtung aufgebracht ist, ist eine wirksame Menge, um eine Expression zu induzieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „eine Menge, die wirksam ist, um eine Expression zu induzieren", diejenige Menge des genetischen Materials, das die Expression eines Produkts, das durch eine oder mehrere der Polynucleotidsequenz(en) von Interesse kodiert, bewerkstelligt. Mittel zur Bestimmung einer wirksamen die Expression induzierenden Menge einer Nukleinsäuresequenz sind im Stand der Technik gut bekannt.
Wie zuvor beschrieben wird das erste und das zweite Polynucleotid dieser Erfindung durch den Vektor bzw. den Träger getragen. Gemäß ihrer jeweiligen Struktur und ihres jeweiligen Designs beeinflussen die Vektor- und Trägermoleküle die Expression und Integration der Polynucleotide innerhalb des Körpers des Empfängers. Das Vektor- und Trägersystem dieser Erfindung stellt die fortgesetzte Expression eines Produkts in vivo sicher.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das zweite Polynucleotid das gleiche wie das erste Polynucleotid und befindet sich in einem frühen Expressionsvektor, der entweder in das Genom der Zielzellen integriert oder einen transienten Expressionsweg eingeht, wobei das/die Produkte) transient in den Zielzellen expremiert wird/werden. Die transiente Expression dauernd für gewöhnlich etwa eine bis etwa vier Wochen nach der Verabreichung der medizinischen Vorrichtung an den Patienten.
Zum Beispiel umfasst das erste therapeutische Mittel eine Polynucleotidsequenz, die ein Inhibitorgen für den Zellzyklus kodiert, wie RB, oder einen Promoter der Endothelialisierung, wie den vaskularen endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Diese Gene befinden sich auf einem verzögerten Expressionsvektor. Das zweite therapeutische Mittel umfasst eine Polynucleotidsequenz, die für ein cytotoxisches Gen, wie Fast, kodiert, welches sich auf einem frühen Expressionsvektor befindet. Daher sind Freisetzungskinetiken und die Dauer der Freisetzung des ersten und des zweiten therapeutischen Mittels reguliert.
Im Allgemeinen sind die Freisetzungskinetiken des genetischen Materials durch viele Faktoren bestimmt, einschließlich zum Beispiel der Struktur der medizinischen Vorrichtung, der Struktur, Porosität und Dicke der Polymerbeschichtung; der Natur des genetischen Materials (d.h. transformierte Zellen, Polynucleotidträger etc.), der Zielstelle der Therapie und so weiter. Eine austarierte Balance zwischen diesen Parametern stellt eine kontrollierte und stabile Freisetzung des genetischen Materials von der Vorrichtungsbeschichtung an oder in die Umgebung der Zielstelle innerhalb des Körpers des Patienten zur Verfügung.
Expremierte Produkte, gemäß der Erfindung, sind im Allgemeinen nützlich für jede Anwendung zur Behandlung, Vermeidung oder andersartiger Beeinflussung des Verlaufs einer Krankheit oder Gewebe- oder Organ-Fehlfunktion. Zum Beispiel werden Produkte verwendet, um die Angiogenese zu inhibieren, Restenose zu vermeiden oder behandeln, Cardiomyopathy, Herzversagen oder andere Fehlfunktionen des Herzens zu behandeln; cystische Fibrose oder eine andere Fehlfünktion der Lunge zu behandeln; bösartige oder nicht-bösartige Zellproliferationen zu behandeln oder inhibieren; oder induzierende Nerven-, Blutgefäß- oder Gewebs-Regeneration in einem besonderen Gewebe oder Organ zu induzieren.
Eine bevorzugte Ausführung dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer Behandlung der vaskularen Thrombose oder der angioplastischen Restenose, insbesondere der koronaren vaskularen Thrombose und angioplastischen Restenose, wodurch die Häufigkeit von Gefäß-Rethrombose und -Restenose, instabiler Angina, myocardialer Infarktion und des plötzlichen Tods verringert wird. Die medizinische Vorrichtung und das Verfahren dieser Erfindung kann verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die schwerwiegende Komplikationen aufweisen, was zu einem Thrombus führt. Spezifische Beispiele schließen Patienten mit akuter myocardialer Infarktion (AMI) ein und Patienten, die versagte PTCA (perkutane transluminale koronare Angioplastie) aufweisen und einen abrupten thrombotischen Verschluss der anvisierten Arterie aufweisen.
Organe und Gewebe, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden, schließen jedwedes Gewebe oder Organ eines Säugetiers ein, unabhängig davon, ob es injiziert oder implantiert ist oder ob in vivo oder ex vivo. Nicht-beschränkende Beispiele schließen das Herz, die Lunge, das Gehirn, die Leber, Skelettmuskel, glatte Muskeln, die Nieren, die Blase, die Gedärme, den Bauch, den Pankreas, die Eierstöcke, die Prostata, Knorpel und Knochen ein. Andere Organsysteme, die für die Behandlung empfänglich sind, schließen jedwedes Organsystem ein, in dem Material durch das Organ von einer Quelle fließt, so dass ein Faktor in einer Beschichtung verabreicht werden kann. Beispielhafte Organe schließen Lymphknoten, den Gallengang, den Harntrakt, die Lunge und den Raum ein, der durch die cerebro-spinale Flüssigkeit okkupiert ist, und dergleichen ein. Beispiele anderer Gewebe, die auf diese Art und Weise behandelt werden können, schließen den Bauch und die Gedärme ein, wo Wachstumsfaktoren dabei helfen, die Reparatur von Geschwülsten, die Reparatur von externer Schwulstbildung der Haut und die allgemeine Wundreparatur zu beschleunigen.
Es versteht sich, dass, da die Transformation von geeigneten Zielzellen in vivo einen ersten Schritt in der Gentherapie darstellt, die Auswahl des jeweiligen Genverabreichungssystem von solchen Faktoren wie dem Phenotyp des beabsichtigen Ziels und dem Verabreichungsweg abhängt. Weiter versteht es sich, dass das jeweilige Polynucleotidkonstrukt, das für die in-vivo-Transformation bereit gestellt wird, auch für die in-vitro-Transformation der Zellen, wie für die Verwindung in ex-vivo- oder in-situ-Gewebskultursystemen, nützlich ist.
Nachdem die Erfindung nun beschrieben worden ist, ist dieselbe durch Verweis auf spezifische Beispiele leichter zu verstehen, wobei die Beispiele zum Zwecke der Erläuterung zur Verfügung gestellt sind und es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung zu beschränken, soweit es hier nicht anders spezifiziert ist.
Beispiel 1 Intravaskulärer lokaler Gentransfer, der durch einen metallischen beschichteten Stent vermittelt wird.
Ein replikations-defizienter rekombinater Adenovirus, der ein Lac-Z-Reportergen für die kernspezifische β-Galactosidase(Ad-β-gal) trägt wird für diese Untersuchung verwendet. Die Beschichtung des Stents wird durchgeführt, indem ein metallischer Stent in eine Gelatinelösung, die einen Quervernetzer enthält, für 10 Sekunden eingetaucht wird und dann an der Luft getrocknet wird. Die Dicke der Beschichtung wird reguliert, so dass sie etwa 5–10 μm beträgt. Der beschichtete Stent wird auf einen 4,0 oder 3,0 mm großen PTCA- (perkutane transluminale Koronarangioplastie-) Ballon montiert und in einer Ad-β-gal-Viruslösung (2 × 10¹⁰ pfu/ml) für 3 min untergetaucht und dann in die Halsschlagadern einer Ratte implantiert. Die Beschichtung des Stents und die Implantation werden bei einer signifikanten Anzahl von Ratten wiederholt.
Die Tiere werden 7, 14 und 21 Tage nach der Implantation getötet. β-Galactosidase-Expression wird durch die X-Gal-Färbemethode bewertet. Die Expression des Transgens kann in allen Tieren detektiert werden. In Gefäßen mit entblößtem Endothel wird eine Genexpression in Subintima, Media und Adventitia gefunden. Diese Untersuchung zeigt die Durchführbarkeit und Wirksamkeit eines Adenovirus-vermittelten Gentransfers an lokalisierte Arterienwände durch einen Protein-beschichteten metallischen Stent.
Beispiel 2 Herstellung eines resorbierbaren mikroporösen intravaskulären Stents oder Gen- und Zelltherapie-Anwendungen
Resorbierbare, mikroporöse, endoluminale Stents werden aus Gemischen von Poly-1-Milchsäure (PLLA) und Poly-β-Caprolacton (PCL) hergestellt. Sowohl schraubenförmige als auch röhrenförmige Stentdesigns werden durch Lösungsmittelgießverfahren und Flotations-Niederschlags-Herstellungsverfahren erhalten. Ein Bereich von PLLA/PCL-Mischungsverhältnissen und Verfahrensvariablen werden verwendet, um ihren Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften, die Porosität und die Abbaugeschwindigkeit des Stents zu untersuchen. Polymermischungen mit höheren PLLA-Anteilen zeigen höhere elastische Moduli und letztendlich erhaltene Zugfestigkeit, eine geringere Elongation, Porosität und Abbaugeschwindigkeiten als Polymermischungen mit einem höheren PCL-Gehalt. Stents mit geeigneten mechanischen Eigenschaften für die Verwendung und Trägerung der Gefäßwand werden erhalten. Poly(ethylenoxid) wird in diese Vorrichtungen unter Verwendung einer Säurequelltechnik eingearbeitet, was die Porenstruktur öffnet und den hydrophilen Charakter verbessert, wodurch die Aufnahme von rekombinaten adenoviralen Vektoren ermöglicht wird. Die im Verhältnis 50:50 vermischten PLLA/PCL-Stents werden mit rekombinatem Adenovirus (AdCM β Gal, kodierend für eine kernlokalisierende Variante der β-Galactosidase von Escherichia coli) imprägniert. Kultivierte CV-1-Zellen, die mit Stents, die mit dem rekombinaten Virus imprägniert sind, inkubiert wurden, expremieren kernlokalisierte β-Galactosidase-Aktivität, was bestätigt, dass das absorbierte Virus aus der Matrix in einer infektiösen Form freigesetzt wird, wobei die Kinetiken nahelegen, das die genetisch gesteigerten endovaskulären Vorrichtungen dieses Designs brauchbar sind.
Beispiel 3 Biologische Aktivität der freigesetzten DNA
Die biologische Aktivität von adenoviraler DNA, freigesetzt aus der Oberfläche einer beschichteten medizinischen Vorrichtung, wird untersucht, indem HEK-293-Zellen in vitro transfiziert werden. Die Ergebnisse geben an, dass die freigesetzte DNA biologisch aktiv ist und eine hohe Transfektions-Effizienz aufweist.
Beispiel 4 Herstellung eines replikationsdefizienten adenoviralen Vektors
Unter Verwendung von standardgemäßen rekombinaten DNA-Techniken werden replikationsdefiziente adenovirale Virions hergestellt, die ein Gen expremieren, das für einen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) kodiert. Eine erfolgreiche Rekombination des Plasmids und der adenoviralen DNA führt zu der Erzeugung eines vollen adenoviralen Genoms (abzüglich zum Beispiel von E1- oder E3-Deletionen), wobei die Polynucleotidsequenz von VEGF in die E1- und/oder E3-deletierten Regionen kloniert ist. Der Adenovirus kann eine oder mehrere Endonuclease-Spaltstellen, d.h. Restriktionsstellen, die einzigartig für den Adenovirus sind, einschließen. Verschiedene Stellen können verwendet werden. Vorzugsweise ist jedoch die Sequenz, die durch die Endonuclease erkannt wird, mindestens 6 Basen lang und mehr bevorzugt mindestens 8, und zwar stromabwärts von der (den) Spaltstelle(n). Eine Endonuclease-Spaltstelle kann auch an der E3-Deletionsstelle vorhanden sein. Die rekombinanten Virione sind Replikationsdefizient, da sie wesentliche adenovirale E1-Gensequenzen nicht aufweisen. Jedoch wird die HEK-293-Zelllinie stabil mit dem E1-Gen transfiziert, wodurch seine essentielle Funktion in trans zur Verfügung gestellt wird. Das replikationsdefiziente rekombinante Adenovirus ist somit replikationsdefizient in 293-Zellen, was Zelllyse und Virion-Produktion erzeugt. Die Virione, die erzeugt werden, erzeugen keine lytischen Infektionen in anderen Zelltypen, sie können jedoch VEGF expremieren.
Beispiel 5 Herstellung von replikationdefizienten adenoassoziierten viralen Vektoren
Der replikationsdefiziente rekombinante adenoassoziierte virale Vektor (AAV) wird hergestellt, indem ein Plasmid, enthaltend eine Polynucleotidsequenz von Interesse, die durch zwei AAV-invertierte endständige Wiederholungsregionen (ITR) flankiert ist, und ein Plasmid, dass die AAV-Einkapselungsgene (rep- und cap- Gene) trägt, in einer Zelllinie, die mit einem humanen Helfervirus (zum Beispiel einem Adenovirus) infiziert ist, co-transfiziert werden. Die endständigen AAV-Wiederholungen (zuzüglich einer weniger zusätzlicher Basen) sind an beiden Enden der Fremd-DNA vorhanden. Die AAV-Rekombinanten, die erzeugt werden, werden dann durch Standardverfahren gereinigt. Die replikationsdefizienten rekombinanten adenoassoziierten Vektoren werden auch hergestellt, indem das Capsid-Gen deletiert wird und durch Fremd-DNA (etwa 2 kb) substituiert wird. Die Vektoren integrieren in das Genom der Empfängerzellen und transformieren diese Zellen mit > 50% Häufigkeit.
Beispiel 6 Anwendungen der adenoassoziierten Virusgentherapie in der prä-klinischen klinischen Phase
Experiment 1 Ein Stickstoffoxidsynthase (NOS)-enthaltender adenoassoziierter Vektor wird im Anschluss an eine Koronarangioplastie zur Vermeidung der Restenose verwendet. Die Verabreichung wird über einen Katheder (d.h. einem mit einem Ballon an der Spitze versehenen Katheder) oder zum Beispiel über einen Stent bewirkt. Der NOS-SMC (glatte Muskelzellen) enthaltende adenoassoziierte Virus wird verwendet, um die Reendothelializierung zu fördern und die Proliferation des verletzten Segments zu verringern und dadurch die Restenose zu vermeiden.
Experiment 2 Ein Stickstoffoxidsynthase (NOS)-enthaltender adenoassoziierter Vektor wird verwendet, um artherosklerotische Arterien zu behandeln. Endotheliale Fehlfunktion ist ein früh auftretendes Ereignis in der Artherosklerose. Die Einführung eines (NOS)-enthaltenden Adenovirus an einer Läsionsstelle vermeidet das Voranschreiten von komplexen Läsionen und fördert die Heilung, sobald er entwickelt ist. Eine Verabreichung wird wie zuvor beschrieben bewirkt (d.h. durch einen Katheder oder durch einen Stent).
Experiment 3 Ein Stickstoffoxidsynthase (NOS)-enthaltender adenoassoziierter Vektor wird in einer Krebstherapie verwendet. NOS wird verwendet, um den Zelltod zu fördern. Demgemäß wird der NOS-Adenovirus-Vektor gut vaskularisierten Tumoren verabreicht, um die Erzeugung von cytotoxischen Niveaus an NOS zu bewirken. Die Verabreichung kann durch direkte Injektion oder Implantation in das Krebsgewebe oder zum Beispiel durch intravaskuläre Injektion bewirkt werden. Die verwendete jeweilige Isoform ist mNOS.
Beispiel 7 Expremierung von zwei Produkten, die durch zwei Polynucleotidsequenzen von Interesse, die durch zwei Expressionsvektoren getragen sind, kodiert werden
Der replikationsdefiziente rekombinante adenoassoziierte virale Vektor (AAV) wird hergestellt, indem ein Plasmid, enthaltend einen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), der durch zwei AAV-invertierte endständige Wiederholungsregionen (ITR) flankiert ist, und ein Plasmid, dass die AAV-Einkapselungsgene (rep- und cap- Gene) trägt, in einer Zelllinie, die mit einem humanen Helfervirus (zum Beispiel einem Adenovirus) infiziert ist, co-transfiziert werden. Die endständigen AAV-Wiederholungen (zuzüglich einer weniger zusätzlicher Basen) sind an beiden Enden der Fremd-DNA vorhanden. Die AAV-Rekombinanten, die erzeugt werden, werden dann durch Standardverfahren gereinigt. Die replikationsdefizienten rekombinanten adenoassoziierten Vektoren werden auch hergestellt, indem das Capsid-Gen deletiert wird und durch Fremd-DNA (etwa 2 kb) mit einer Polynucleotidsequenz, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Gens eines Zellzyklusinhibitors oder eines Promotors der Endothelializierung kodiert, substituiert wird, so dass ein vaskulärer endothialer Wachstumsfaktor (VEGF) in den oben hergestellten replikationsdefizienten AAV-Vektor kloniert wird. Der rekombinante AAV-Vektor, der so hergestellt wurde, wird als Vektor mit verzögerter Expremierung verwendet. Die zweite Sequenz von Interesse ist eine Polynucleotidsequenz, die den FAS-Liganden kodiert. Diese Sequenz wird in einen von einem Adenovirus abgeleiteten Vektor kloniert, der unter Steuerung des frühen Promotors von SV40 steht. Sowohl der rekombinante AAV-Vektor als auch der adenovirusabgeleitete Vektor werden auf eine oder mehrere Schichten einer Beschichtung der Oberfläche eines Stents aufgetragen oder darin eingearbeitet. Der Stent wird an einen Patienten nach einer Koronarangioplastie zu Vermeidung der Restenose verabreicht. Der VEGF-enthaltende rekombinante AAV-Vektor wird verwendet, um die Reendothelializierung des verletzten Segments zu fördern und dadurch die Restenose zu vermeiden.
Sowohl der Vektor für die frühe Expression als auch die Vektoren für die verzögerte Expression sind wirksam in dieser Therapie. Der Vektor für die verzögerte Expression integriert in das Genom der Empfängerzellen und transformiert diese Zellen mit einer Häufigkeit > 50%. Der Vektor für die frühe Expression expremiert transient das Produkt von FAS L etwa 1 oder 2 Tage nach der Bereitstellung an die Zielzellen. Die transiente Expression von FAS L wird etwa 1 bis 4 Wochen in dem Körper des Patienten fortgesetzt.

Claims

Medizinische Vorrichtung umfassend: Eine ein genetisches Material tragende biokompatible Struktur, wobei die biokompatible Struktur eine Polymerbeschichtung umfasst, die wenigstens einen Teil der Struktur bedeckt, wobei das genetische Material umfasst: (a) einen ersten therapeutischen Wirkstoff umfassend einen Vektor, der ein erstes Polynucleotid enthält, der eine Genexpression liefert, die ausreichend ist zum Herstellen einer therapeutisch ausreichenden Menge eines oder mehrerer Produkte, die von dem ersten Polynucleotid kodiert werden, wobei das erste Polynucleotid einen angiogenetischen Wirkstoff kodiert; und (b) einen zweiten therapeutischen Wirkstoff, der einen nicht-genetischen therapeutischen Wirkstoff umfasst, wobei der nichtgenetische therapeutische Wirkstoff ein angiogenetischer Wirkstoff ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor ein adeno-assoziierter viraler Vektor ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor einen viralen Vektor umfasst.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei der Vektor thermostabil, replikations-defizient, nicht-immunogen, oder eine Kombination davon ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Expression in 20% bis 80% der dem genetischen Material ausgesetzten Zellen erreicht wird.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerbeschichtung Polyurethan, Silikon, EVA, Poly-L-Milchsäure/Poly-e-caprolacton-Gemische oder eine Kombination davon umfasst.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerbeschichtung 1 bis 40 Schichten mit einer Dicke von 1 bis 10 μm/Beschichtungsschicht aufweist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Struktur ein Stent ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei der Stent ein metallischer Stent ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei der Stent eine aus aliphatischen Polyester-Gemischen hergestellte Spiralfeder ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei der Stent eine aus aliphatischen Polyester-Gemischen hergestellte mikroporöse Röhre ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der erste therapeutische Wirkstoff und der zweite therapeutische Wirkstoff in eine gleiche Schicht der Polymerbeschichtung aufgebracht oder darin imprägniert werden.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor ortsspezifisch ist.
Medizinische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor regulatorische Sequenzen enthält.
Verfahren zum Herstellen einer medizinischen Vorrichtung zur gesteuerten Abgabe eines genetischen Materials, wobei das Verfahren umfasst: (A) Aufbringen einer Polymerbeschichtung auf wenigstens einen Teil einer medizinischen Vorrichtung; (B) Aufbringen eines genetischen Materials auf die Polymerbeschichtung unter Erhalt einer genetisch beschichteten medizinischen Vorrichtung, wobei das genetische Material umfasst; (a) einen ersten therapeutischen Wirkstoff umfassend einen ein erstes Polynukleotid enthaltenden Vektor, der eine Genexpression liefert, die ausreichend ist zum Herstellen einer therapeutisch ausreichenden Menge eines angiogenetischen Wirkstoffs; und (b) einen nicht-genetischen therapeutischen Wirkstoff, der ein angiogenetischer Wirkstoff ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor ein adenoassoziierter viraler Vektor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor einen viralen Vektor umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der virale Vektor thermostabil, replikations-defizient, nicht-immunogen, oder eine Kombination davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Expression in 20% bis 80% der dem genetischen Material ausgesetzten Zellen erreicht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor ein Vektor vom verzögerten Expressionstyp ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die verzögerte Expression eine Expression ist, die von zwei Tagen bis drei Wochen nach Verabreichung in vivo verzögert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Beschichtung Polyurethan, Silikon, EVA, Poly-L-Milchsäure/Poly-e-caprolaton-Gemische, oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Polymerbeschichtung ungefähr 1 bis ungefähr 40 Schichten mit einer Dicke von 1 bis 10 μm/Beschichtungsschicht aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die medizinische Vorrichtung ein Stent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Stent eine aus aliphatischen Polyester-Gemischen hergestellte Spiralfeder ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Stent eine aus aliphatischen Polyester-Gemischen hergestellte mikroporöse Röhre ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Stent ein metallischer Stent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der erste therapeutische Wirkstoff und der nicht-genetische therapeutische Wirkstoff auf eine gleiche Schicht der Beschichtung aufgebracht oder darin imprägniert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der nicht-genetische therapeutische Wirkstoff ein Protein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der nicht-genetische therapeutische Wirkstoff ein kleines Molekül ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der nicht-genetische therapeutische Wirkstoff ein nicht-Protein-basierter Wirkstoff ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor Liposomen, Lipofektin, Lipoplexe, Polyplexe, Dextrane, Starburst Dendrimer-Konjugate, Polybren-dimethylsulfoxid, Protaminsulfat, Antikörper-Konjugate, Polylysin-Konjugate, Gramazidin S, künstliche Konjugate, virale Hüllen, virus-artige Partikel, Nano- oder Mikro-Partikel oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor ortspezifisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Vektor regulatorische Sequenzen enthält.