JP7406793B2 - ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１７年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５２３，９４９号の利益を主張するものである。

連邦政府の資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所から受けた助成金番号ＧＭ１０８８０３およびＤＯ０２００１２の下で政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

本開示は、化学修飾リボヌクレオチドおよび２つのオーバーハング一本鎖テイルからなる、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に有用な新規２テイルｓｉＲＮＡ化合物に関する。化学修飾ヌクレオチドは、予想外に高い有効性、取込みおよび組織分布を実現するためにパターン化されている。

化学修飾リボヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ修飾および２’－メトキシ修飾）および／または化学修飾リンカー（例えば、ホスホロチオエート修飾）を含む治療用ＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡｉを促進する能力を維持しながら、対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比べて高いヌクレアーゼ耐性を示すことが既知である。例えば、Ｆｏｓｎａｕｇｈら（米国特許出願公開第２００３／０１４３７３２号）を参照されたい。

しかし、神経性疾患および他の疾患の処置のためにＲＮＡｉを効率的にデリバリーするために、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での特定の細胞型への頑強かつ非毒性のデリバリー、特に中枢神経系組織へのデリバリーはまだ必要とされている。

本発明は、新しいクラスのｓｉＲＮＡ治療法として機能することができる新規２テイル化学修飾オリゴヌクレオチドの発見に基づいている。驚くべきことに、２テイル化学修飾ｓｉＲＮＡ（ｔｔ－ｓｉＲＮＡ）は、線条体内注射および脳室内注射の両方の後に、１テイルｓｉＲＮＡにおいて観察されるものを上回る広範な分布および保持を示すことが見出された。

したがって、本発明の１つの態様において、本明細書において提供されるのは、５’末端、３’末端、およびアンチセンス鎖との相補性領域を有するセンス鎖；５’末端、３’末端、およびセンス鎖との相補性領域、ならびにｍＲＮＡ標的に対する相補性領域を有するアンチセンス鎖；少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、センス鎖の３’末端にあるオーバーハング領域；ならびに少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖の３’末端にあるオーバーハング領域を含む二本鎖核酸化合物である。

別の実施形態において、アンチセンス鎖は５’リン酸部分を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端にある部分Ｒを含む。ある実施形態において、Ｒは、

からなる群から選択される。

さらに別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。

さらに別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、化学修飾ヌクレオチドからなる。

別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、センス鎖内の相補性領域内のヌクレオチドは、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖内の相補性領域内のヌクレオチドは、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドである。別の実施形態において、各相補的塩基対は、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は独立して、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は独立して、少なくとも４個の連続する２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。

別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、３番目および４番目にあるヌクレオチドは２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端の１番目および２番目にあるヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。

さらに別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域はそれぞれ独立して、４個、５個、６個、７個または８個のホスホロチオエート化ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、センス鎖の３’末端またはアンチセンス鎖の３’末端から１～７番目または１～８番目にあるヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介してそれぞれ接続されている。

別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は、同じ数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は、異なる数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する。

別の実施形態において、オーバーハング領域は脱塩基ヌクレオチドを含む。

さらに別の実施形態において、構造は、式（Ｉ～ＶＩＩＩ）：

式Ｉ～ＶＩＩＩのある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態の式Ｉ～ＶＩＩＩにおいて、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ化学修飾ヌクレオチドからなる。別の実施形態の式Ｉ～ＶＩＩＩにおいて、センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。

別の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的に対して完全な相補性を有する。さらに別の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的に対して８０％～９９％の間の相補性を有する。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖核酸化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、疾患または障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に治療的有効量の本明細書に記載の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法である。

ある実施形態において、疾患または障害は神経性である。ある実施形態において、疾患または障害はハンチントン病である。ある実施形態において、そのような処置を必要とする対象はヒトである。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、標的臓器、標的組織または標的細胞への本明細書に記載の化合物の選択的インビボデリバリーのための方法であって、化合物を対象に投与することを含む方法である。ある実施形態において、標的臓器は脳である。ある実施形態において、標的細胞は一次皮質ニューロンである。ある実施形態において、化合物のデリバリーは、脂質製剤によって媒介されない。

ある実施形態において、化合物は、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射、線条体内注射または脳室内注射により投与される。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、神経性疾患または障害を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に治療的有効量の本明細書に記載の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法である。

ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、式（Ｉ）または式（ＶＩ）の構造を有する。ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、式（ＩＶ）または式（ＶＩＩ）の構造を有する。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、それを必要とする対象におけるＨＴＴ遺伝子の発現を阻害する方法であって、本明細書に記載の核酸化合物を対象に導入することを含む、方法である。

さらに別の態様において、本明細書において提供されるのは、ハンチンチン病を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に治療的有効量の本明細書に記載の核酸化合物を投与することを含む方法である。

ある実施形態において、核酸化合物は、患者の脳に投与される。別の実施形態において、核酸化合物は、線条体内注射により投与される。別の実施形態において、核酸化合物は、脳室内注射により投与される。

別の実施形態において、本明細書に記載の核酸化合物を脳に投与すると、線条体内のＨＴＴ ｍＲＮＡが減少する。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の核酸化合物を脳に投与すると、皮質内のＨＴＴ ｍＲＮＡが減少する。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、５’末端、３’末端、およびアンチセンス鎖との相補性領域を有するセンス鎖、５’末端、３’末端、標的ＲＮＡとの相補性領域を有するアンチセンス鎖、７個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、センス鎖の３’末端にある第１のオーバーハング領域、ならびに７個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖の３’末端にある第２のオーバーハング領域を含む二本鎖核酸化合物である。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、５’末端、３’末端、およびアンチセンス鎖との相補性領域を有するセンス鎖、５’末端、３’末端、標的ＲＮＡとの相補性領域を有するアンチセンス鎖、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、センス鎖の３’末端にある第１のオーバーハング領域、ならびにホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、アンチセンス鎖の３’末端にある第２のオーバーハング領域を含み、センス鎖内の相補性領域内のヌクレオチドが、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖内の相補性領域内のヌクレオチドが、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖との相補性領域が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、二本鎖核酸化合物である。

上述の発明の概要は非限定的であり、開示されている化合物および方法の他の特徴ならびに利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

本発明の前述および他の特徴ならびに利点は、添付図面と併せて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明からさらに詳しく理解されるであろう。特許または出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面が添付された本特許または本特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁より提供される。

図１は、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および１テイルｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）の代表的な構造ならびにｓｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｈｓｉＲＮＡで処理後のＨｅＬａ細胞内のｍＲＮＡ発現を示す線グラフを示す。 図２は、同じ数の全ホスホロチオエートを維持しながら長さが異なるホスホロチオエート化テイルを有する２テイルｓｉＲＮＡ（ｔｔ－ｓｉＲＮＡ）の４つの例を示す。すべての場合において、アンチセンス鎖は、化学的に結合した５’リン酸を有する。 図３は、ｔｔ－ｓｉＲＮＡがＨｅＬａ細胞内の効率的なｍＲＮＡサイレンシングを示すことを示す線グラフを示す。示した濃度の２テイルｓｉＲＮＡでマウス一次皮質ニューロンを１週間処理した。ｍＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０を使用して測定した。データをハウスキーピング遺伝子（ＰＰＩＢ）に対して規格化し、未処理対照のパーセントとしてグラフ化した。 図４Ａ～Ｂは、一次皮質ニューロン内のｔｔ－ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡサイレンシングの効率を示す。図４Ａは、濃度が漸増する４つの異なるｔｔ－ｓｉＲＮＡで処理後の一次皮質ニューロン細胞内のハンチンチンｍＲＮＡ発現を示す線グラフを示す。図４Ｂは、１テイルｓｉＲＮＡまたはｔｔ－ｓｉＲＮＡ（７－１３－７）で処理後の一次皮質ニューロン内のハンチンチンｍＲＮＡ発現を示す線グラフである。 図５は、長さが異なるホスホロチオエート化テイルを有し、全ホスホロチオエートの数が漸増する２テイルｓｉＲＮＡの４つの例を示す。 図６は、ｔｔ－ｓｉＲＮＡで処理後６時間および２４時間の一次ニューロンの免疫蛍光像を示す（赤色＝ｔｔ－ｓｉＲＮＡ、青色＝ＤＡＰＩ）。 図７は、陰性対照、１テイルｓｉＲＮＡまたはｔｔ－ｓｉＲＮＡの線条体内注射後４８時間の３００μｍの脳切片の免疫蛍光像を示す（赤色＝ｔｔ－ｓｉＲＮＡ、青色＝ＤＡＰＩ）。 図８は、１テイルｓｉＲＮＡまたは４つの異なるｔｔ－ｓｉＲＮＡのうちの１つで処理後のＨｅＬａ細胞内のハンチンチンｍＲＮＡ発現を表す線グラフを示す。 図９Ａ～Ｂは、一次皮質ニューロン内のハンチンチンｍＲＮＡサイレンシングを示す。図９Ａは、濃度が漸増する１テイルｓｉＲＮＡまたは３つの異なるｔｔ－ｓｉＲＮＡのうちの１つのいずれかで処理後１週間の一次皮質ニューロン内のハンチンチンｍＲＮＡ発現を示す線グラフである。図９Ｂは、濃度が漸増する１テイルｓｉＲＮＡまたは４つの異なるｔｔ－ｓｉＲＮＡのいずれかで処理後１週間の一次皮質ニューロン内のハンチンチンｍＲＮＡ発現を示す線グラフを示す。 図１０は、立体選択的なホスホロチオエート分を含む２テイルｓｉＲＮＡを示す。 図１１は、ある例示の実施形態による２テイルｓｉＲＮＡの骨格結合を示す。 図１２は、ある例示の実施形態による２テイルｓｉＲＮＡの糖修飾を示す。 図１３は、２つの二本鎖ｓｉＲＮＡを含む非対称化合物を示す。

本明細書において提供されるのは、インビボ遺伝子サイレンシングに効果的な新規２テイル化学修飾二本鎖核酸である。１つの態様において、（ａ）５’末端、３’末端、およびアンチセンス鎖との相補性領域を有するセンス鎖；（ｂ）５’末端、３’末端、およびセンス鎖との相補性領域を有するアンチセンス鎖；（ｃ）少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、センス鎖の３’末端にあるオーバーハング領域；ならびに（ｄ）少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、アンチセンス鎖の３’末端にあるオーバーハング領域を含む二本鎖核酸化合物が提供される。

ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、第２のｔｔ－ｓｉＲＮＡを含まないｔｔ－ｓｉＲＮＡであり、両方のｔｔ－ｓｉＲＮＡが３’位において互いに結合されている。

ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、以下の構造を有するリンカーを介して３’位において互いに結合された２つのｔｔ－ｓｉＲＮＡからなっていない：

ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、図１３に示す化合物の構造を持たない。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、１８～２２個の連続するヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖のオーバーハング領域は、アンチセンス鎖のオーバーハング領域と同じ数のヌクレオチドを有する（すなわち、二本鎖核酸は対称である）。ある実施形態において、センス鎖のオーバーハング領域は、アンチセンス鎖のオーバーハング領域と異なる数のヌクレオチドを有する（すなわち、二本鎖核酸は非対称である）。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は独立して、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は独立して、５個、６個または７個のヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域の両方が、５個、６個または７個のヌクレオチドからなる。

二本鎖核酸化合物のセンス鎖およびアンチセンス鎖の相補性領域は一緒に、二本鎖核酸化合物の「二本鎖領域」を構成する。ある実施形態において、二本鎖領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチド長である（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖の相補性領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチド長である）。特定の実施形態において、二本鎖領域は、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は化学修飾ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ化学修飾ヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖内の二本鎖領域内のヌクレオチドは、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドであり、かつ／またはアンチセンス鎖内の二本鎖領域内のヌクレオチドは、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドである。

ある実施形態において、二本鎖領域の各相補的塩基対は、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域はそれぞれ独立して、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域はそれぞれ独立して、少なくとも４個（例えば、４個、５個、６個、７個または８個）の連続する２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端の１～４番目（すなわち、１番目、２番目、３番目および４番目）、１～５番目、１～６番目または１～７番目にある１個または複数のヌクレオチドは、２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端の１～４番目にあるヌクレオチドは２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端の１番目および２番目のうちの一方または両方にあるヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は独立して、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のホスホロチオエート化ヌクレオチドからなる。

ある実施形態において、センス鎖の３’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の１～４番目（すなわち、１番目、２番目、３番目および４番目）、１～５番目、１～６番目、１～７番目、１～８番目にある１個または複数のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は、同じ数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は、互いに比べて異なる数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する。

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖のオーバーハング領域は、１個または複数の脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、オーバーハング領域の各ヌクレオチドは脱塩基である。

ある実施形態において、二本鎖核酸のセンス鎖は、標的との相同性を有する。特定の実施形態において、センス鎖は、標的との完全な相同性を有する。

ある実施形態において、二本鎖核酸のアンチセンス鎖は、標的との相補性を有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的との完全な相補性を有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的との部分的な相補性を有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的との９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％の相補性を有する。ある実施形態において、アンチセンス鎖は、標的に対して８０％～９９％の間の相補性を有する。特定の実施形態において、標的はＨＴＴ遺伝子である。

特定の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、哺乳類またはウイルスのｍＲＮＡである。別の特定の実施形態において、標的は、標的ｍＲＮＡのイントロン領域である。特定の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、神経障害に関連する遺伝子、例えば、ＨＴＴにより産生される。

ある実施形態において、二本鎖核酸化合物は、以下の式（Ｉ～ＶＩＩＩ）から選択される構造を有する：

ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ化学修飾ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。例示的な実施形態において、二本鎖核酸化合物は、式（Ｉ）または式（ＶＩ）の構造を有する。別の例示的な実施形態において、二本鎖核酸化合物は、式（ＩＶ）または式（ＶＩＩ）の構造を有する。
別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖核酸化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に治療的有効量の本明細書に記載の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法である。

本方法のある実施形態において、疾患または障害は神経性である。ある実施形態において、神経性疾患はハンチントン病である。別の実施形態において、疾患は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、皮質基底核認知症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、レビー小体病を伴うパーキンソン病、外傷後神経変性および慢性外傷性脳障害からなる群から選択される。

ある実施形態において、そのような処置を必要とする対象はヒトである。別の実施形態において、そのような処置を必要とする対象はマウスである。別の実施形態において、そのような処置を必要とする対象はラットである。別の実施形態において、そのような処置を必要とする対象はサルである。別の実施形態において、そのような処置を必要とする対象はヒツジである。別の実施形態において、そのような処置を必要とする対象はイヌである。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、神経性疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に治療的有効量の本明細書に記載の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法である。

定義
本明細書において他に定義されない限り、本明細書において使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に記載の定義が、あらゆる辞書または外的定義に優先する。文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、特に記載しない限り、「および／または」を意味する。「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定するものではない。本明細書において使用されるとき、他に記載されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への参照は、複数のタンパク質分子を含む。

一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。本明細書に記載の方法および技術は一般に、特に記載のない限り、当技術分野において周知の従来の方法にしたがって、様々な一般的な参考文献、および本明細書全体にわたって引用および議論されているより具体的な参考文献に記載の通り実施される。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様にしたがって、当技術分野において一般に行われる通り、または本明細書に記載の通り実施される。本明細書に記載の分析化学と、合成有機化学と、医薬品化学および薬化学とに関連して使用される命名法ならびにそれらの実験手順および実験技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤およびデリバリーならびに患者の処置に使用される。

本開示をより容易に理解することができるように、選ばれた用語を以下で定義する。

「相補的な」という用語は、ワトソン－クリック塩基対形成を示すヌクレオチド間の関係を指し、またはワトソン－クリック塩基対形成を経てハイブリダイズし、二本鎖核酸を形成するオリゴヌクレオチドを指す。「相補性」という用語は、別のオリゴヌクレオチドに対して部分的または完全に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖）の状態を指す。第２のオリゴヌクレオチドに対して相補性を有するとして本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに対して１００％、９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超または５０％超相補的であってよい。

オリゴヌクレオチド配列の文脈において本明細書において使用されるとき、「Ａ」は、アデニン塩基（例えば、アデノシンまたはその化学修飾誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｇ」は、グアニン塩基（例えば、グアノシンまたはその化学修飾誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｕ」は、ウラシル塩基（例えば、ウリジンまたはその化学修飾誘導体）を含むヌクレオシドを表し、「Ｃ」は、シトシン塩基（例えば、シチジンまたはその化学修飾誘導体）を含むヌクレオシドを表す。

本明細書において使用されるとき、「３’末端」という用語は、そのリボース環の３’炭素にある非修飾ヒドロキシル基を含む核酸の末端を指す。

本明細書において使用されるとき、「５’末端」という用語は、そのリボース環の５’炭素に結合されたリン酸基を含む核酸の末端を指す。

本明細書において使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、複素環式塩基およびその糖でできた分子を指す。

本明細書において使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、その３’または５’糖ヒドロキシル基上にリン酸基を有するヌクレオシドを指す。

「標的ｍＲＮＡ配列に対して、標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を導くのに十分に相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えば、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、その鎖が、ＲＮＡｉによって標的ｍＲＮＡの破壊をトリガーするのに十分な配列を有することを意味する。

本明細書において使用されるとき、「単離されたＲＮＡ」（例えば、「単離されたｔｔ－ｓｉＲＮＡ」、「単離されたｓｉＲＮＡ」または「単離されたｓｉＲＮＡ前駆体」）という用語は、組換え技術により産生されたとき他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学合成されたとき化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないＲＮＡ分子を指す。

「識別ＲＮＡサイレンシング（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」という用語は、ＲＮＡ分子が、例えば、両方のポリヌクレオチド配列が同じ細胞内に存在するとき、「第１」または「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害するが、「第２」または「非標的」ポリヌクレオチド配列」の発現を実質的に阻害しない能力を指す。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は標的遺伝子に対応し、一方、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的遺伝子に対応する。他の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は標的アレルに対応し、一方、非標的ポリヌクレオチド配列は非標的アレルに対応する。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメント）をコードするＤＮＡ配列である。他の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によりコードされる標的ｍＲＮＡである。

本明細書において使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する低干渉ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡ分子は様々な長さ（一般に１８～３０塩基対の間）を有し得、その標的ｍＲＮＡに対して様々な程度の相補性を含み得る。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２本の別個の鎖の二重鎖、ならびに二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を含む。

本明細書において使用されるとき、「アンチセンス鎖」という用語は、標的遺伝子またはｍＲＮＡに対してある程度の相補性を含み、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖に対する相補性を含むｓｉＲＮＡ二重鎖の鎖を指す。

本明細書において使用されるとき、「センス鎖」という用語は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対する相補性を含む、ｓｉＲＮＡ二重鎖の鎖を指す。

本明細書において使用されるとき、「オーバーハング」または「テイル」という用語は、一本鎖である、すなわち、ｓｉＲＮＡ二重鎖の他の鎖と対になった塩基ではない（すなわち、ｓｉＲＮＡ二重鎖の他の鎖との二重鎖を形成しない）センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの一方または両方の３’末端にある３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを指す。

本明細書において使用されるとき、「２テイルオリゴヌクレオチド」または「ｔｔ－ｓｉＲＮＡ」という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖、センス鎖およびアンチセンス鎖が塩基対を形成した二重鎖領域、ならびにセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端のそれぞれに位置する１つのオーバーハング一本鎖テイルを含む二本鎖ｓｉＲＮＡを指す。一本鎖テイルのそれぞれは独立して、他の鎖からのヌクレオチドとの二重鎖を形成しない３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のオーバーハングヌクレオチドを含む。ｔｔ－ｓｉＲＮＡのオーバーハング一本鎖テイルのそれぞれは、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含むかまたはからなる。

特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約８～２０の間のヌクレオチド長もしくはヌクレオチドアナログ長、約１０～１８の間のヌクレオチド長もしくはヌクレオチドアナログ長、約１２～１６の間のヌクレオチド長もしくはヌクレオチドアナログ長または約１３～１５の間のヌクレオチド長もしくはヌクレオチドアナログ長の二重鎖領域（例えば、約８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の塩基対の二重鎖領域）を含む。

特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの各オーバーハングは、少なくとも約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個または約１０個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの各オーバーハングは、約４、約５、約６または約７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、センス鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖オーバーハングと同じ数のヌクレオチド長である。他の実施形態において、センス鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖オーバーハングより少数のヌクレオチドを有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖オーバーハングは、センス鎖オーバーハングより少数のヌクレオチドを有する。

特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個または約３０個のヌクレオチドの長さをそれぞれ有するセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約１５～約２５個の間のヌクレオチドの長さをそれぞれ有するセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、それぞれ約２０ヌクレオチド長であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は同じ長さである。他の実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は異なる長さである。
特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個または約７５個のヌクレオチドの全長（アンチセンス鎖の３’末端からセンス鎖の３’末端まで）を有する。特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約１５～約３５個の間のヌクレオチドの全長を有する。他の例示的実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約２０～約３０個の間のヌクレオチドの全長を有する。他の例示的実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約２２～約２８個の間のヌクレオチドの全長を有する。特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個または約３０個のヌクレオチドの全長を有する。

本明細書において使用されるとき、「化学修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む標準的でないヌクレオチドを指す。例示的なヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドのある種の化学的特性を改変するが、その所期の機能を果たすヌクレオチドアナログの能力を保持するように、任意の位置において修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例には、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６－（２－アミノ）プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンについては８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどが含まれる。ヌクレオチドアナログには、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザアデノシン；Ｏ－およびＮ－修飾（例えば、アルキル化された、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、あるいは当技術分野において既知の）ヌクレオチド；ならびにHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載のものなどの他の複素環修飾ヌクレオチドアナログも含まれる。

ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分に対する修飾を含んでもよい。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＣＯＯＲまたはＯＲ（式中、Ｒは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである）から選択される基によって置き換えられてもよい。その他の可能な修飾には、米国特許第５，８５８，９８８号および第６，２９１，４３８号に記載の修飾が含まれる。

本明細書において使用されるとき、「代謝的に安定化された」という用語は、２’－ヒドロキシル基から２’－Ｏ－メチル基に化学修飾されたリボヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を指す。特定の実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡの二重鎖領域は、１つもしくは複数の２’－フルオロ修飾および／または１つもしくは複数の２’－メトキシ修飾を含む。特定の例示的な実施形態において、二重鎖領域は、センス鎖内およびアンチセンス鎖内のうちの一方または両方に交互の２’－フルオロ修飾および交互の２’－メトキシ修飾を含む。

本明細書において使用されるとき、「ホスホロチオエート」という用語は、リン酸基の酸素のうちの１個または複数を硫黄で置換することにより修飾されたヌクレオチドのリン酸基を指す。ホスホロチオエートは、カチオン性対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど）をさらに含む。「ホスホロチオエート化ヌクレオチド」という用語は、別のヌクレオチドとの１つまたは２つのホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの一本鎖テイルは、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含むかまたはからなる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、図１２に示す１つまたは複数のヌクレオチド間結合を含むように修飾されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択される１つまたは複数のヌクレオチド間結合を含む。

本明細書に記載のある種のヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートを含め、生理的ｐＨにおいて－１の形式電荷を含み、カチオン性部分、例えば、ナトリウムもしくはカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムもしくはマグネシウムなどのアルカリ土類金属、またはアンモニウムもしくはグアニジニウムイオンにより形式電荷のバランスがとれるものと理解される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、図１１に示す１つまたは複数のヌクレオチド間骨格結合を含むように修飾されてもよい。

本明細書において使用されるとき、「脂質製剤」という用語は、リポソーム製剤、例えば、細胞内への核酸の侵入を促進するためにリポソームを使用して核酸との凝集体を形成するリポソーム製剤を指してもよい。理論によって制限されることなく、リポソームは細胞内への侵入に有用であり、その理由は、リン脂質二重層が細胞膜のリン脂質二重層と容易に融合し、それによって核酸を細胞に侵入させるからである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、図１２に示す１つまたは複数のヌクレオチド間結合を含むように修飾されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択される１つまたは複数のヌクレオチド間結合を含む。

本明細書に記載のある種のヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートを含め、生理的ｐＨにおいて－１の形式電荷を含み、カチオン性部分、例えば、ナトリウムもしくはカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムもしくはマグネシウムなどのアルカリ土類金属、またはアンモニウムもしくはグアニジニウムイオンにより形式電荷のバランスがとれるものと理解される。

ｓｉＲＮＡ設計
いくつかの実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖からなる二重鎖であり、アンチセンス鎖は、ＲＮＡｉを媒介するのにｈｔｔ ｍＲＮＡに対して十分な相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を有する。特定の例示的な実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡ分子は、約１０～５０個またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、すなわち、各鎖は、１０～５０個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログもしくはヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの組合せ）を含む。他の例示的実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖内に約１６～３０個、例えば、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドの長さを有し、鎖のうちの１つは、ＲＮＡｉを媒介するのに標的領域に対して十分に相補的である。特定の例示的な実施形態において、鎖がアニールされたとき、二重鎖の末端のそれぞれまたは両方において４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の残基のオーバーハングが生じるように、鎖の末端において整列しない（すなわち、相対する鎖内に相補的塩基が存在しない）少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の塩基が存在するように鎖は整列する。特定の例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０～５０個またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、すなわち、各鎖は、１０～５０個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログもしくはヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの組合せ）を含む。特に例示的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖内に約１６～３０個、例えば、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドの長さを有し、鎖のうちの１つは、標的配列に対して実質的に相補的であり、他の鎖は、第１鎖と同一であるかまたは実質的に同一である。

一般に、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、当技術分野において既知の任意の方法を使用することにより、例えば、以下のプロトコールを使用することにより設計することができる：

１．ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、標的配列に特異的であるべきである。第１鎖は、標的配列に対して相補的であるべきであり、他の鎖は、第１鎖に対して実質的に相補的である。１つの実施形態において、標的配列は、突然変異型ｈｔｔアレルの伸長ＣＡＧリピートの外側である。別の実施形態において、標的配列は、ｈｔｔアレルのコーディング領域の外側である。例示的な標的配列は、標的遺伝子の５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）またはイントロン領域から選択される。これらの部位におけるｍＲＮＡの切断は、対応する突然変異型タンパク質の翻訳を排除すべきである。ｈｔｔ遺伝子の他の領域からの標的配列もターゲティングに適している。センス鎖は、標的配列に基づいて設計される。さらに、Ｇ／Ｃ含量がより低い（３５～５５％）ｓｉＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が５５％より高いものより活性が高くなり得る。したがって、１つの実施形態において、本発明は、Ｇ／Ｃ含量３５～５５％を有する核酸分子を含む。

２．ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択された標的部位の配列に基づいて設計される。特定の例示的な実施形態において、センス鎖は、約１９～２５個のヌクレオチド、例えば、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のヌクレオチドを含む。特に例示的な実施形態において、センス鎖は、１９個、２０個または２１個のヌクレオチドを含む。しかし、１９個未満のヌクレオチドまたは２５個を超えるヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡもＲＮＡｉを媒介するように機能し得ることを当業者なら理解するであろう。したがって、そのような長さのｓｉＲＮＡも、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持する限り、本発明の範囲内である。より長いＲＮＡサイレンシング剤は、ある種の哺乳類細胞においてインターフェロンまたはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）応答を誘発することが示されており、これは望ましくない可能性がある。特定の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はＰＫＲ応答を誘発しない（すなわち、十分に短い長さである）。しかし、より長いＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、ＰＲＫ応答を生じさせることができない細胞型またはＰＫＲ応答が代替手段により下方制御もしくは減弱された状況では有用であり得る。

本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡ分子は、ｔｔ－ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介できるような、標的配列との十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ媒介切断を起こすのに十分に標的遺伝子の標的配列部分と同一のヌクレオチド配列を含むｔｔ－ｓｉＲＮＡが特に適している。したがって、例示的な実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的の一部と十分に同一の配列を有するように設計される（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｈａｖｅ ｔｏ ｈａｖｅ）。例えば、センス鎖は、標的部位と１００％の同一性を有してもよい。しかし、１００％の同一性は必要ではない。センス鎖と標的ＲＮＡ配列との間の８０％を超える同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに１００％の同一性が特に適している。本発明は、ＲＮＡｉの効率および特異性を向上させるためのある種の配列多様性を許容できるという利点を有する。１つの実施形態において、センス鎖は、野生型アレルと突然変異型アレルとの間で少なくとも１個の塩基対が異なる標的領域、例えば、機能獲得型変異を含む標的領域など、標的領域を有する４個、３個、２個、１個または０個のミスマッチヌクレオチドを有し、他の鎖は、第１鎖と同一であるかまたは実質的に同一である。さらに、１個もしくは２個のヌクレオチドの小挿入または小欠失を有するｓｉＲＮＡ配列もＲＮＡｉの媒介に有効であり得る。あるいは、ヌクレオチドアナログ置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効であり得る。

配列同一性は、当技術分野において既知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定することができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを決定するために、最適な比較目的で配列を整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１の配列または第２の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置にあるヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じ残基で占められているときは、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性パーセント（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに対してスコアにペナルティーを課してもよい。

配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。１つの実施形態において、アラインメントは、十分な同一性を有する整列された配列のある部分にわたって生成されるが、同一性の程度が低い部分にわたって生成されない（すなわち、ローカルアラインメント）。配列の比較のために利用されるローカルアラインメントアルゴリズムの例示的な、非限定的な例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77にあるように変更された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。

別の実施形態において、アラインメントは、適切なギャップを導入することにより最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の長さにわたって決定される（すなわち、ギャップありアラインメント）。比較目的でギャップありアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のギャップありＢＬＡＳＴを利用することができる。別の実施形態において、アラインメントは、適切なギャップを導入することにより最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の全長にわたって決定される（すなわち、グローバルアラインメント）。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの例示的な非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重み付き残差表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用することができる。

３．ｔｔ－ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖は、通常、センス鎖と同じ長さであり、相補的ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡの鎖は、４～１５個、例えば、４個、５個、６個または７個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対になる。

４．当技術分野において既知の任意の方法を使用して、可能性のある標的を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較し、他のコード配列に対して顕著な相同性を有するすべての標的配列を考慮から外す。そのような配列相同性検索のための１つのそのような方法は、ＢＬＡＳＴとして既知であり、これは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトにおいて利用可能である。

５．あなたの評価基準を満たす１つまたは複数の配列を選択する。

ｔｔ－ｓｉＲＮＡの設計および使用に関するさらなる一般情報は、Ｔｈｅ Ｍａｘ－Ｐｌａｎｋ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈｅ Ｃｈｅｍｉｅのウェブサイトにおいて利用可能な"The siRNA User Guide”において見出すことができる。

あるいは、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズすることができる（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間ハイブリダイゼーション、続いて洗浄）ヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義することができる。別の例示的なハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中７０℃もしくは１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションとその後の０．３×ＳＳＣ中７０℃における洗浄または４×ＳＳＣ中７０℃もしくは４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションとその後の１×ＳＳＣ中６７℃における洗浄を含む。５０塩基対長未満になると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くすべきであり、Ｔｍは、以下の式にしたがって決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の数）。１８～４９塩基対長の間のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）［式中、Ｎは、ハイブリッド内の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍの［Ｎａ＋］）］。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の別の例は、参照により本明細書に組み込まれているSambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4に記載されている。

陰性対照ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、選択されたｔｔ－ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するべきであるが、適切なゲノムに対する顕著な配列相補性を有するべきでない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計され得る。適切なゲノム中のその他の任意の遺伝子に対する相同性が陰性対照にないように相同性検索を実施することができる。さらに、陰性対照ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の塩基ミスマッチを配列に導入することにより設計することができる。

６．ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型または突然変異型ハンチンチンｍＲＮＡ）を破壊する有効性を検証するために、ショウジョウバエベースのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ｍＲＮＡ発現系において標的ｃＤＮＡ（例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ）を使用してｓｉＲＮＡをインキュベートすることができる。^３２Ｐを使用して放射標識された新たに合成された標的ｍＲＮＡ（例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ）が、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーにより検出される。切断された標的ｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。適した対照は、ｓｉＲＮＡの省略および非標的ｃＤＮＡの使用を含む。あるいは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子に対する顕著な配列相補性はない対照ｓｉＲＮＡが選択される。そのような陰性対照は、選択されたｔｔ－ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を無作為に混合することにより設計することができる。適切なゲノム中のその他の任意の遺伝子に対する相同性が陰性対照にないように相同性検索を実施することができる。さらに、陰性対照ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の塩基ミスマッチを配列に導入することにより設計することができる。

修飾ヌクレオチド
ある実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、２テイルオリゴヌクレオチドは化学修飾ヌクレオチドからなる。２テイルオリゴヌクレオチドの特定の実施形態において、９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超または５０％超の核酸は、化学修飾ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは化学修飾される。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端の１番目および２番目にあるヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。ある実施形態において、３’末端の１～６番目または３’末端の１～７番目にあるヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。他の実施形態において、３’末端にある少なくとも５個のヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている。

デリバリーおよび分布
別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載の核酸を患者の特定の臓器に選択的にデリバリーするための方法であって、２テイルｓｉＲＮＡが選択的にデリバリーされるように、本明細書に記載の２テイルｓｉＲＮＡを患者に投与することを含む方法である。１つの実施形態において、臓器は肝臓である。別の実施形態において、臓器は腎臓である。別の実施形態において、臓器は脾臓である。別の実施形態において、臓器は心臓である。別の実施形態において、臓器は脳である。

本明細書に記載の組成物は、代謝的に安定な２テイルｓｉＲＮＡの単純で効率的な非毒性のデリバリーを促進し、様々な組織においてインビボで治療標的の強力なサイレンシングを促進する。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、標的臓器、標的組織または標的細胞への本明細書に記載の化合物の選択的インビボデリバリーのための方法であって、化合物を対象に投与することを含む方法である。ある実施形態において、標的臓器は脳である。ある実施形態において、標的細胞は一次皮質ニューロンである。ある実施形態において、化合物のデリバリーは、脂質製剤によって媒介されない。

ある実施形態において、本方法は、標的臓器に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％選択的であり、すなわち、対象に投与されたｔｔ－ｓｉＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％が標的臓器に位置する。

特定の例示的な実施形態において、化合物または医薬組成物は、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射、線条体内注射または脳室内注射により投与される。特定の実施形態において、化合物または医薬組成物は、脳室内注射により投与される。

合成ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソームトランスフェクションおよびエレクトロポレーションを含む、当技術分野において既知の方法により細胞内へデリバリーすることができる。標的遺伝子（すなわち、ｈｔｔ遺伝子）の長期抑制を得るために、かつある特定の状況下でのデリバリーを促進するために、組換えＤＮＡコンストラクトから１つまたは複数のｔｔ－ｓｉＲＮＡを細胞内で発現させることができる。細胞内の長期標的遺伝子抑制を可能にするために組換えＤＮＡコンストラクトからｓｉＲＮＡ二重鎖を細胞内で発現させるためのそのような方法は当技術分野において既知であり、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡを発現させることができる哺乳類のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター系（例えば、Ｈ１またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系（Tuschl, T., 2002, supra）；（Bagella et al., 1998；Lee et al., 2002, supra；Miyagishi et al., 2002, supra；Paul et al., 2002, supra；Yu et al., 2002), supra；Sui et al., 2002, supra）が含まれる。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩによる転写終結は、ＤＮＡ鋳型内の４つの連続するＴ残基のラン（ｒｕｎ）で起こり、特定配列においてｓｉＲＮＡ転写を終了させる機構を提供する。ｓｉＲＮＡは、５’－３’方向および３’－５’方向の標的遺伝子の配列に対して相補的であり、ｓｉＲＮＡの２本の鎖を同じコンストラクトまたは別個のコンストラクトにおいて発現させることができる。Ｈ１またはＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターにより駆動され、細胞内で発現されたヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現を阻害することができる（Bagella et al., 1998；Lee et al., 2002, supra；Miyagishi et al., 2002, supra；Paul et al., 2002, supra；Yu et al., 2002), supra；Sui et al., 2002, supra）。Ｔ７プロモーターの制御下にｓｉＲＮＡ配列を含むコンストラクトも、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現させるベクターと共に細胞内へコトランスフェクトされたとき、機能的ｓｉＲＮＡを作る（Jacque et al., 2002, supra）。単一コンストラクトは、同じ遺伝子または同義遺伝子を標的にする、ｈｔｔをコードする遺伝子の複数の領域など、ｓｉＲＮＡをコードしている複数の配列を含んでもよく、例えば、別個のＰｏｌＩＩＩプロモーター部位により駆動され得る。

ウイルス媒介デリバリー機構もまた、例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター転写制御下にｓｉＲＮＡを持つ組換えアデノウイルスを作成することにより、ｓｉＲＮＡの発現を通じて標的遺伝子の特定のサイレンシングを誘導するために使用することができる（Xia et al., 2002, supra）。これらの組換えアデノウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染は、内在性標的遺伝子発現の減少を可能にする。ｓｉＲＮＡの標的遺伝子を発現するトランスジェニックマウスへの組換えアデノウイルスベクターの注射は、標的遺伝子発現をインビボで減少させる。Ｉｄ。動物モデルにおいて、全胚エレクトロポレーションは、着床後のマウス胚内へ合成ｓｉＲＮＡを効率的にデリバリーすることができる（Calegari et al., 2002）。成体マウスにおいて、ｓｉＲＮＡの効率的デリバリーは、溶液を含む大量のｓｉＲＮＡを尾静脈から動物に急速注射（５秒以内）する「高圧」デリバリー技術によって実現することができる（Liu et al., 1999, supra；McCaffrey et al., 2002, supra；Lewis et al., 2002。ナノ粒子およびリポソームもまた、ｓｉＲＮＡを動物内にデリバリーするために使用することができる。特定の例示的な実施形態において、細胞内へ、例えば、神経系細胞（例えば、脳細胞）内へ１つまたは複数のｓｉＲＮＡをデリバリーするために組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）およびその随伴ベクターを使用することができる（米国特許出願第２０１４／０２９６４８６号、第２０１０／０１８６１０３号、第２００８／０２６９１４９号、第２００６／００７８５４２号および第２００５／０２２０７６６号）。

修飾ｔｔ－ｓｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本明細書に記載の本発明のＲＮＡサイレンシング剤（またはその任意の部分）、例えば、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡサイレンシング剤の活性がさらに改善されるように修飾されてもよい。例えば、上述のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載の修飾のいずれかで修飾されてもよい。修飾は、標的識別のさらなる向上、薬剤の安定性の向上（例えば、分解の防止）、細胞取込みの促進、標的効率の向上、結合（例えば、標的への）における有効性の改善、薬剤に対する患者の耐性の改善および／または毒性の低減に部分的に役立ち得る。

１）標的識別を向上させるための修飾
特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、単一ヌクレオチド標的識別を向上させるために不安定化ヌクレオチドで置換されてもよい（その両方が参照により本明細書に組み込まれている２００７年１月２５日に出願された米国特許出願第１１／６９８，６８９号および２００６年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／７６２，２２５号を参照されたい）。そのような修飾は、標的ｍＲＮＡ（例えば、機能獲得型変異ｍＲＮＡ）に対するｔｔ－ｓｉＲＮＡの特異性に顕著に影響を与えることなく、非標的ｍＲＮＡ（例えば、野生型ｍＲＮＡ）に対するｔｔ－ｓｉＲＮＡの特異性を消失させるのに十分である場合がある。

特定の例示的な実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、少なくとも１個のユニバーサルヌクレオチドをそのアンチセンス鎖に導入することにより修飾される。ユニバーサルヌクレオチドは、４種類の通常のヌクレオチド塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）のいずれかと無差別に塩基対形成が可能な塩基部分を含む。ユニバーサルヌクレオチドは、ＲＮＡ二重鎖の安定性またはＲＮＡサイレンシング剤および標的ｍＲＮＡのガイド鎖により形成される二重鎖の安定性への影響が比較的小さいため、特に適している。例示的なユニバーサルヌクレオチドには、デオキシイノシン（例えば、２’－デオキシイノシン）、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホルアミデート－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシンおよび２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択されるイノシン塩基部分またはイノシンアナログ塩基部分を有するユニバーサルヌクレオチドが含まれる。特に例示的な実施形態において、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン残基またはその天然に存在するアナログである。

特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、特異性決定ヌクレオチド（すなわち、疾患関連多型を認識するヌクレオチド）から５ヌクレオチド以内に少なくとも１個の不安定化ヌクレオチドを導入することにより修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内の位置において導入されてもよい。例示的な実施形態において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドの位置において導入される（すなわち、不安定化（ｄｅｓｔａｂｌｉｌｉｚｉｎｇ）ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドとの間に２個の安定化ヌクレオチドが存在するように）。２本の鎖または鎖部分（例えば、ｔｔ－ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）を有するＲＮＡサイレンシング剤において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含まない鎖または鎖部分に導入されてもよい。特定の例示的な実施形態において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含む同じ鎖または鎖部分に導入される。

２）有効性および特異性を向上させるための修飾
特定の実施形態において、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、非対称設計規則にしたがってＲＮＡｉの媒介における有効性および特異性の向上を促進するために改変されてもよい（米国特許第８，３０９，７０４号、第７，７５０，１４４号、第８，３０４，５３０号、第８，３２９，８９２号および第８，３０９，７０５号を参照されたい）。そのような改変は、アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの切断または翻訳抑制を優先的に導き、したがって標的切断およびサイレンシングの効率を向上または改善するように、センス鎖に有利なようにｓｉＲＮＡ（例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから産生されたｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖がＲＩＳＣに侵入するのを容易にする。特定の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端（ＡＳ５’）とセンス鎖３’末端（Ｓ３’）との間の塩基対強度を、前記ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端（ＡＳ３’）とセンス鎖５’末端（Ｓ’５）との間の結合強度または塩基対強度と比べて低くすることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は向上される。

１つの実施形態において、第１鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に、第１鎖またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端との間より少数のＧ：Ｃ塩基対が存在するように、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの非対称性が向上されてもよい。別の実施形態において、第１鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在するように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性が向上されてもよい。特定の例示的な実施形態において、ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択される。他の実施形態において、第１鎖またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端との間に少なくとも１つのゆらぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕが存在するように、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの非対称性が向上されてもよい。他の実施形態において、稀なヌクレオチド、例えば、イノシン（Ｉ）を含む少なくとも１個の塩基対が存在するように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性が向上されてもよい。特定の例示的な実施形態において、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに別の実施形態において、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１個の塩基対が存在するように、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡの非対称性が向上されてもよい。特定の例示的な実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２－アミノ－Ｇ、２－アミノ－Ａ、２，６－ジアミノ－Ｇおよび２，６－ジアミノ－Ａからなる群から選択される。

３）安定性が向上したｔｔ－ｓｉＲＮＡ
本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、細胞培養のための血清中または増殖培地中の安定性を改善するために、さらに修飾することができる。安定性を向上させるために、３’－残基は、分解に対して安定化されてもよく、例えば、それらは、プリンヌクレオチド、特にアデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択されてもよい。あるいは、修飾アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換が許容され、ＲＮＡ干渉の効率に影響を与えない。

例示的な態様において、本発明は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比べてインビボ安定性が向上されるように、第１鎖および第２鎖を含み、修飾ヌクレオチドによる内部ヌクレオチドの置換により第２鎖および／または第１鎖が修飾されるｔｔ－ｓｉＲＮＡを特徴とする。本明細書において定義される通り、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外の任意の位置に存在するヌクレオチドである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内または二重鎖もしくは二本鎖分子の鎖内に存在し得る。１つの実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１個の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。別の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。さらに別の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、すべての内部ヌクレオチドの置換により修飾される。

本発明の例示的な実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチドアナログは、標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ媒介活性または翻訳抑制活性が実質的に影響されない、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端にある領域内の位置に位置してもよい。特に、末端は、修飾ヌクレオチドアナログを取り込むことにより安定化されてもよい。

例示的なヌクレオチドアナログには、糖修飾および／または骨格修飾リボヌクレオチドが含まれる（すなわち、リン酸－糖骨格に対する修飾が含まれる）。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾されてもよい。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに結合しているリン酸エステル基は、修飾された基、例えば、ホスホチオエート基の修飾された基によって置き換えられる。例示的な糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＯＮ（式中、Ｒは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選択される基によって置き換えられる。

特定の実施形態において、修飾は、２’－フルオロ修飾、２’－アミノ修飾および／または２’－チオ修飾である。特定の例示的な修飾には、２’－フルオロシチジン、２’－フルオロウリジン、２’－フルオロアデノシン、２’－フルオログアノシン、２’－アミノシチジン、２’－アミノウリジン、２’－アミノアデノシン、２’－アミノグアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオウリジンおよび／または５－アミノアリルウリジンが含まれる。特定の実施形態において、２’－フルオロリボヌクレオチドは、あらゆるウリジンおよびシチジンである。別の例示的な修飾には、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５－メチルシチジン、リボチミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロシチジンおよび５－フルオロウリジンが含まれる。２’－デオキシヌクレオチドおよび２’－Ｏｍｅヌクレオチドもまた、本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用することができる。別の修飾残基には、デオキシ脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチルウリジン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンが含まれる。特定の例示的な実施形態において、２’部分は、結合部分が２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドであるようなメチル基である。

例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗し（非常に安定であり）、ｍＲＮＡに対して単一ヌクレオチド識別を持つ糖修飾ヌクレオチドを含む（Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447、Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975、Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81）。これらの分子は２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸を有し、２’－デオキシ－２’’－フルオロウリジンなどの修飾の可能性がある。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’－エンド構造に制限し、それによって、塩基対形成のためにヌクレオチドを事前に構築し、１塩基あたり１０℃もオリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させることにより、オリゴヌクレオチドの特異性を向上させる。

別の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ヌクレアーゼ消化に対する耐性が高く、分子に対する改善された結合特異性を与えるポリアミド骨格を形成することができる中性の２－アミノエチルグリシン部分でヌクレオチドの糖－リン酸部分が置き換えられた修飾ヌクレオチドをＰＮＡは含む（Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500）。

同じく例示されるのは、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに、少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチドである。アデノシンデアミナーゼの活性を阻止するために塩基が修飾されてもよい。例示的な修飾核酸塩基には、５位において修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザアデノシン；Ｏ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されず、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンが適している。上述の修飾は組み合わせられてもよいことに留意されたい。

他の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を改変するために、例えば、体内における半減期を長くするために、架橋結合を使用することができる。したがって、本発明は、核酸の２本の架橋した相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含む。本発明はまた、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、染料）などにコンジュゲートされた、またはコンジュゲートされていない（例えば、その３’末端において）ＲＮＡサイレンシング剤を含む。このようにしてｓｉＲＮＡ誘導体を改変すると、対応するｓｉＲＮＡと比べて細胞取込みを改善したり、得られるｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的活性を向上させたりすることができて、細胞内のｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用であり、または対応するｓｉＲＮＡと比べてｓｉＲＮＡ誘導体の安定性が改善する。

他の例示的な修飾には以下が含まれる：（ａ）２’修飾、例えば、センス鎖内またはアンチセンス鎖内の、特にセンス鎖上のＵ上の２’ＯＭｅ部分の提供、または３’オーバーハング内の、例えば、３’末端における２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端とは、文脈により示されるように、分子の３’原子にあること、または最３’部分、例えば、最３’Ｐまたは２’位にあることを意味する）；（ｂ）骨格の修飾、例えば、リン酸骨格内のＳによるＯの置き換えによる修飾、例えば、Ｕ上もしくはＡ上またはその両方、特にアンチセンス鎖上のホスホロチオエート修飾の提供；例えば、ＳによるＰの置き換えによる；（ｃ）Ｃ５アミノリンカーによるＵの置き換え；（ｄ）ＧによるＡの置き換え（特定の実施形態において、配列変化は、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖上に位置する）；および（ｄ）２’位、６’位、７’位または８’位における修飾。例示的な実施形態は、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖上にこれらの修飾のうちの１つまたは複数が存在する実施形態、またはアンチセンス鎖が、より少数のそのような修飾を有する実施形態である。さらに別の例示的な修飾には、３’オーバーハング内のメチル化Ｐの、例えば、３’末端における使用；２’修飾の組合せ、例えば、２’ＯＭｅ部分の提供および骨格の修飾、例えば、ＳによるＰの置き換えによる修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供、または３’オーバーハング内のメチル化Ｐの、例えば、３’末端における使用；３’アルキルによる修飾；３’オーバーハング内の脱塩基ピロリドンによる、例えば、３’末端における修飾；ナプロキセン、イブプロフェン、または３’末端における分解を阻害する他の部分による修飾が含まれる。

４）細胞取込みを向上させるための修飾
他の実施形態において、本発明の化合物は、化学的部分、例えば、標的細胞（例えば、神経細胞）による細胞取込みを向上させるための化学的部分で修飾されてもよい。したがって、本発明は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、染料）などにコンジュゲートされた、またはコンジュゲートされていない（例えば、その３’末端において）ｔｔ－ｓｉＲＮＡを含む。コンジュゲートは、当技術分野において既知の方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子に負荷された核酸について記載）；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)（ナノ粒子と結合した核酸について記載）；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)（挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に結合された核酸について記載）；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)（ナノ粒子に結合された核酸について記載）の方法を使用して達成することができる。

特定の実施形態において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、親油性部分にコンジュゲートされる。１つの実施形態において、親油性部分は、カチオン性基を含むリガンドである。別の実施形態において、親油性部分は、ｔｔ－ｓｉＲＮＡの片方または両方の鎖に結合されている。例示的な実施形態において、親油性部分は、ｔｔ－ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に結合されている。別の例示的な実施形態において、親油性部分は、センス鎖の３’末端に結合されている。特定の実施形態において、親油性部分は、コレステロール、ビタミンＤ、ＤＨＡ、ＤＨＡｇ２、ＥＰＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはカチオン染料（例えば、Ｃｙ３）からなる群から選択される。

医薬組成物および投与方法
１つの態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載の治療的有効量の１つまたは複数の２テイルｓｉＲＮＡ化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。別の特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の式Ｉ～ＶＩＩＩの化合物および医薬的に許容される担体を含む。

本発明は、本明細書に記載の予防処置および／または治療処置のための上述の薬剤の使用に関する。したがって、本発明のモジュレーター（例えば、ｔｔ－ｓｉＲＮＡ剤）は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は典型的には、核酸分子、タンパク質、抗体または調節化合物および医薬的に許容される担体を含む。本明細書において使用されるとき、「医薬的に許容される担体」という言葉は、医薬投与と適合するあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。

本発明の医薬組成物は、その所期の投与経路と適合するように処方される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内（ＩＶ）、皮内、皮下（ＳＣまたはＳＱ）、腹腔内、筋肉内、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）および経粘膜投与が含まれる。非経口、皮内もしくは皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を使用して調整することができる。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアルに封入することができる。

注射使用に適した医薬組成物には、滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与については、適した担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、容易な通針性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含む、溶媒または分散媒が可能である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合、必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に挙げた原料のうちの１つまたは組合せと共に適切な溶媒に取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散剤は、基礎分散媒および上に挙げたものからの必要な他の原料を含む滅菌媒体に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、例示的な調製方法は、あらかじめ滅菌濾過したその溶液から、活性成分に何らかの別の所望の原料を加えた粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。

そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が特に適している。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にするために患部組織の部位へそのような化合物を標的化し、それによって副作用を軽減するデリバリーシステムを設計するよう注意すべきである。

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のためのある範囲の用量の処方において使用することができる。そのような化合物の用量は、典型的には、ほとんどまたは全く毒性がない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるＥＣ５０（すなわち、最大半量の応答が得られる試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が得られるように動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

処置方法
１つの態様において、本発明は、疾患もしくは障害のリスクがある（または罹患の可能性が高い）対象を処置する予防法および治療法の両方を提供する。１つの実施形態において、疾患または障害は、神経性疾患または障害である。特定の実施形態において、疾患または障害はハンチントン病である。

別の態様において、本発明は、全部または一部が機能獲得型変異タンパク質によって引き起こされる疾患もしくは障害のリスクがある（または罹患の可能性が高い）対象を処置する予防法および治療法の両方を提供する。１つの実施形態において、疾患または障害は、トリヌクレオチドリピート疾患または障害である。別の実施形態において、疾患または障害はポリグルタミン障害である。特定の例示的な実施形態において、疾患または障害は、ハンチンチンの発現に関連する障害であり、ハンチンチンの変化、特にＣＡＧリピートコピー数の増幅が、臨床症状がハンチントン病患者において見られるものを含むようなハンチンチン遺伝子（構造または機能）またはハンチンチンタンパク質（構造または機能または発現）の欠損につながる障害である。

本明細書において使用される「処置」または「を処置する」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患への素因の治癒、回復、緩和、軽減、改変、矯正、寛解、改善または作用を目的とした、患者への治療剤（例えば、ＲＮＡ剤またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン）の適用または投与、あるいは疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害への素因を有する患者からの単離組織もしくは細胞株への治療剤の適用または投与と定義される。

１つの態様において、本発明は、治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン）を対象に投与することにより、上述の疾患または障害を対象において防止するための方法を提供する。疾患のリスクがある対象は、例えば、本明細書に記載の診断アッセイもしくは予後アッセイのいずれかまたは組合せにより同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が防止されるように、あるいは、その進行が遅延されるように、疾患または障害に特徴的な症状が顕在化する前に行うことができる。

本発明の別の態様は、対象を治療的に処置する、すなわち、疾患または障害の症状発現を変える方法に関する。例示的な実施形態において、本発明の調節方法は、遺伝子との配列特異的干渉が実現されるように、機能獲得型変異を発現する細胞を、遺伝子内の１つまたは複数の標的配列に特異的な治療剤（例えば、ｔｔ－ｓｉＲＮＡまたはそれをコードするベクターもしくはトランスジーン）と接触させるものである。これらの方法は、インビトロで（例えば、薬剤を使用して細胞を培養することにより）、あるいは、インビボで（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施することができる。

神経系細胞への取込み向上のために修飾されたｔｔ－ｓｉＲＮＡは、体重１ｋｇあたり約１．４ｍｇ未満または体重１ｋｇあたり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５もしくは０．００００１ｍｇ未満および体重１ｋｇあたり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０^１６コピー）または体重１ｋｇあたり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ナノモル未満のＲＮＡサイレンシング剤の単位用量で投与することができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内または筋肉内、くも膜下腔内に、または脳内に直接）、吸入投与または局所適用により投与することができる。特に適した用量は、２、１または０．１ｍｇ／体重ｋｇ未満である。

臓器へ直接の（例えば、脳、脊柱などに直接の）ｔｔ－ｓｉＲＮＡのデリバリーは、臓器あたり約０．００００１ｍｇ～約３ｍｇ、または臓器あたり約０．０００１～０．００１ｍｇ、臓器あたり約０．０３～３．０ｍｇ、眼あたり約０．１～３．０ｍｇまたは臓器あたり約０．３～３．０ｍｇ程度の用量が可能である。用量は、神経性疾患または障害（例えば、ハンチントン病）を処置または防止するのに有効な量にすることができる。１つの実施形態において、単位用量は、１日に１回より少ない頻度で、例えば、２日毎、４日毎、８日毎または３０日毎より少ない頻度で投与される。別の実施形態において、単位用量は、一定頻度で投与されない（例えば、規則的な頻度ではない）。例えば、単位用量は一度に投与されてもよい。１つの実施形態において、有効用量が他の従来の治療様式と共に投与される。

１つの実施形態において、対象に、初期用量および１回または複数回の維持用量のｔｔ－ｓｉＲＮＡが投与される。１回または複数回の維持用量または用量は一般に初期用量より低く、例えば、初期用量の半分である。維持レジメンは、１日あたり０．０１μｇ～１．４ｍｇ／体重ｋｇの範囲の、例えば、１日あたり１０、１、０．１、０．０１、０．００１または０．００００１ｍｇ／体重ｋｇの１回または複数回の用量で対象を処置すること含み得る。維持用量は、典型的には、５日毎、１０日毎または３０日毎に１回未満で投与される。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的な状態に応じて変わる一定の期間続いてもよい。特定の例示的な実施形態において、用量は、１日あたり１回未満で、例えば、２４時間、３６時間、４８時間またはそれ以上の時間あたり１回未満で、例えば、５日毎または８日毎に１回未満でデリバリーすることができる。処置後、患者を、患者の状態の変化および疾患状態の症状の緩和について監視することができる。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに顕著に応答しない場合は増やしてもよく、または化合物の用量は、疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が消失した場合または望まれない副作用が観察される場合は減らしてもよい。

有効用量を、所望の通り、または特定の状況下で適切であると考えられる通り、単一用量または２回以上の用量で投与することができる。注射の繰り返しまたは頻繁な注射を容易にすることが望まれるならば、デリバリーデバイス、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または嚢内）またはリザーバーの植込みが賢明であろう。１つの実施形態において、医薬組成物は、複数のＲＮＡサイレンシング剤種を含む。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤種は、天然に存在する標的配列に関して、別の種に対して非オーバーラップかつ非隣接である配列を有する。別の実施形態において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤はアレル特異的である。別の実施形態において、複数のＲＮＡサイレンシング剤種は、２つ以上の標的配列（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の標的配列）を標的にする。

処置が成功した後、疾患状態の再発を防止するために、本発明の化合物が体重１ｋｇあたり０．０１μｇ～１００ｇの範囲の維持用量で投与される維持療法を患者に受けさせることが望ましい場合がある（米国特許第６，１０７，０９４号を参照されたい）。

別の態様において、本明細書において提供されるのは、ハンチントン病を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に治療的有効量の本明細書に記載の化合物、ｓｉＲＮＡもしくは核酸、または前記化合物、ｓｉＲＮＡもしくは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。

特定の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物は、様々な経路により対象の神経系にデリバリーすることができる。例示的な経路には、くも膜下腔内、柔組織（例えば、脳内）、経鼻および経眼デリバリーが含まれる。組成物はまた、例えば、静脈内、皮下または筋肉内注射により全身デリバリーが可能であり、これは、末梢ニューロンへのＲＮＡサイレンシング剤のデリバリーに特に有用である。例示的なデリバリー経路は、脳に直接、例えば、脳室内もしくは脳の視床下部内に、または脳の外側野内もしくは背側野内に直接である。神経系細胞デリバリー用ＲＮＡサイレンシング剤は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。

例えば、組成物は、１つまたは複数のＲＮＡサイレンシング剤および医薬的に許容される担体を含むことができる。本発明の医薬組成物は、局所処置または全身処置が望まれるかによって、および処置される領域によって、いくつかの方法で投与することができる。投与は、局所（眼、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口が可能である。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、くも膜下腔内または脳室内（例えば、側脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ））投与が含まれる。特定の例示的な実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書に記載の様々な適した組成物および方法を使用して（ｓｕｉｎｇ）、血液脳関門（ＢＢＢ）を通してデリバリーされる。

デリバリー経路は、患者の障害に依存し得る。例えば、ハンチントン病を有すると診断された対象は、本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡを脳内に直接投与することができる（例えば、基底核の淡蒼球内または線条体内および線条体（ｃｏｒｐｏｓ ｓｔｒｉａｔｕｍ）の中型有棘ニューロン近傍）。本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡに加えて、患者は、二次療法、例えば、対症療法および／または疾患特異的療法を投与することができる。二次療法は、例えば、対症療法（例えば、症状を緩和するため）、神経保護療法（例えば、疾患進行を遅らせたり、止めたりするため）または回復療法（例えば、疾患過程を逆行させるため）が可能である。ハンチントン病の処置については、例えば、対症療法には、薬物ハロペリドール、カルバマゼピンまたはバルプロエートが含まれ得る。他の療法には、精神療法、理学療法、言語療法、伝達補助および記憶補助、社会支援サービスならびに食事アドバイスが含まれ得る。

ＲＮＡサイレンシング剤は、脳の神経系細胞にデリバリーすることができる。組成物が血液脳関門を通過する必要のないデリバリー法を利用することができる。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤を含む医薬組成物は、疾患罹患細胞を含む領域に直接注射することにより患者にデリバリーすることができる。例えば、医薬組成物は、脳内に直接注射することによりデリバリーすることができる。注射は、脳の特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球）への定位的注射により可能である。ＲＮＡサイレンシング剤は、中枢神経系の複数領域内（例えば、脳の複数領域内および／または脊髄内）にデリバリーすることができる。ＲＮＡサイレンシング剤は、脳の拡散領域内にデリバリーすることができる（例えば、脳の皮質への拡散デリバリー）。

１つの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、一端が組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球の中に植え込まれたカニューレまたは他のデリバリーデバイスによりデリバリーすることができる。カニューレは、ＲＮＡサイレンシング剤のリザーバーに接続することができる。流れまたはデリバリーは、ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたはミニポンプ、例えばＡｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）によって媒介することができる。１つの実施形態において、組織から離れた領域内、例えば、腹部内にポンプおよびリザーバーが植え込まれ、ポンプまたはリザーバーから放出部位に至る導管によりデリバリーが行われる。脳へのデリバリー用デバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号および第５，８１４，０１４号に記載されている。

本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるようにさらに修飾することができる。例えば、ＲＮＡサイレンシング剤を関門通過させることができる分子にＲＮＡサイレンシング剤をコンジュゲートすることができる。そのような修飾ＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、脳室内もしくは筋肉内注射または経肺デリバリーによるなど、任意の所望の方法により投与することができる。

特定の実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤をデリバリーするためにエキソソームが使用される。エキソソームは、全身注射後、ＢＢＢを通過して、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤およびタンパク質をニューロンに特異的にデリバリーすることができる（Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011 Apr; 29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2012 Dec; 7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Maeger I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May; 12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Maeger I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv. Drug Deliv Rev. 2013 Mar; 65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008を参照されたい）。

特定の実施形態において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤のデリバリーがＢＢＢを通過するように１つまたは複数の親油性分子が使用される［Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔ （２０１１）］。次いで、ＲＮＡサイレンシング剤は、薬物をその活性型へと放出するために、例えば、親油性偽装の酵素分解により活性化されるであろう。

特定の実施形態において、ＢＢＢの透過性を高めて本発明のＲＮＡサイレンシング剤のデリバリーを可能にするために、１つまたは複数の受容体媒介透過性化化合物を使用することができる。これらの薬物は、内皮細胞間のタイトジャンクションを緩める血中浸透圧の上昇により、ＢＢＢの透過性を一時的に高める［El-Andaloussi (2012)］。タイトジャンクションを緩めることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の通常の静脈内注射を実施することができる。

特定の実施形態において、ＢＢＢを通して本発明のＲＮＡサイレンシング剤をデリバリーするために、ナノ粒子ベースのデリバリーシステムが使用される。本明細書において使用されるとき、「ナノ粒子」は、典型的には中実の生分解性コロイド系であるポリマーナノ粒子を指し、薬物または遺伝子担体として広く調査されている（S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, and J. L. Pedraz, "Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research," Clinical and Translational Oncology, vol. 14, no. 2, pp. 83-93, 2012）。ポリマーナノ粒子は、２つの主要なカテゴリーである天然高分子および合成高分子に分類される。ｓｉＲＮＡデリバリー用の天然高分子には、シクロデキストリン、キトサンおよびアテロコラーゲンが含まれるがこれらに限定されない（Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, and A. Ji, "Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo," Current Drug Metabolism, vol. 11, no. 2, pp. 182-196, 2010）。合成高分子には、十分に調査されているポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（ｄｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびデンドリマーが含まれるがこれらに限定されない（X. Yuan, S. Naguib, and Z. Wu, "Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles," Expert Opinion on Drug Delivery, vol. 8, no. 4, pp. 521-536, 2011）。ナノ粒子および他の適したデリバリーシステムの総説については、Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, and Young-Seok Cho, "Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 782041, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/782041（その全体が参照により組み込まれている）を参照されたい。

本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、網膜障害、例えば、網膜症を処置するためなど、眼に投与することができる。例えば、医薬組成物は、眼の表面または近傍組織、例えば、眼瞼内側に適用することができる。それらは、例えば、噴霧により、点眼において、洗眼剤または軟膏として局所的に適用することができる。軟膏または滴下可能な液体は、アプリケーターまたは点眼器などの当技術分野において既知の経眼デリバリーシステムによりデリバリーすることができる。そのような組成物には、ムコミメティクス（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）、防腐剤、例えばソルビン酸、ＥＤＴＡまたはベンジルクロニウムクロリド（ｂｅｎｚｙｌｃｈｒｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）および通常量の希釈剤および／または担体が含まれ得る。医薬組成物はまた、眼の内部に投与することができ、選択された領域もしくは構造に医薬組成物を導入することができる針または他のデリバリーデバイスにより導入することができる。ＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物はまた、眼パッチにより適用することができる。

一般に、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、任意の適した方法により投与することができる。本明細書において使用されるとき、局所デリバリーは、眼、粘膜、体腔表面を含む身体の任意の表面または任意の内部表面へのＲＮＡサイレンシング剤の直接適用を指し得る。局所投与用製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点眼、スプレーおよび液体が含まれ得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要な場合または望ましい場合がある。局所投与はまた、対象の表皮もしくは真皮に、またはその特定の層もしくは下層組織にＲＮＡサイレンシング剤を選択的にデリバリーするための手段として使用することもできる。

くも膜下腔内または脳室内（例えば、脳室内）投与用組成物は、緩衝剤、希釈剤および他の適した添加剤も含んでもよい滅菌水溶液を含んでもよい。くも膜下腔内または脳室内投与用組成物は、典型的には、トランスフェクション試薬、または例えば、ＲＮＡサイレンシング剤に結合された親油性部分以外の別の親油性部分を含まない。

非経口投与用製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適した添加剤も含んでもよい滅菌水溶液を含んでもよい。脳室内注射は、脳室内カテーテルにより、例えば、リザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にすることができる。静脈内使用については、製剤を等張にするために、溶質の総濃度を制御すべきである。

本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡは、経肺デリバリーにより対象に投与することができる。経肺デリバリー組成物は、分散剤内の組成物が肺に到達し、そこで肺胞領域を通じて直接血液循環中に容易に吸収されるように、分散剤の吸入によりデリバリーすることができる。経肺デリバリーは、肺疾患を処置するための全身デリバリーおよび局所デリバリーの両方に有効であり得る。１つの実施形態において、経肺デリバリーにより投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように修飾されている。

経肺デリバリーは、噴霧化、エアロゾル化、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒ）および乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む様々な手法により実現することができる。デリバリーは、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器および乾燥粉末分散デバイスにより実現することができる。定量式デバイスが特に適している。噴霧器または吸入器を使用する利益のうちの１つは、デバイスが自給式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に処方することができる薬物をデリバリーする。ＲＮＡサイレンシング剤組成物は、単独で、または適した粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として安定に貯蔵することができる。吸入用組成物のデリバリーは、タイマー、用量カウンター、時間測定デバイスまたは時間表示装置を含み得る投薬タイミング要素によって媒介することができ、これは、デバイスに組み込まれたとき、エアロゾル医薬の投与中、服用トラッキング、コンプライアンスモニタリングおよび／または患者への服用トリガリングを可能にする。

担体として有用な医薬賦形剤のタイプには、安定剤、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、増量剤、例えば炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩、例えば塩化ナトリウムなどが含まれる。これらの担体は結晶形でも非晶形でもよく、またはその２つの混合物であってもよい。

特に価値のある増量剤には、適合性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはそれらの組合せが含まれる。適した炭水化物には、単糖、例えばガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖、例えばラクトース、トレハロースなど；シクロデキストリン、例えば２－ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－．ｂｅｔａ．－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）；および多糖、例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど；アルジトール、例えばマンニトール、キシリトールなどが含まれる。炭水化物の特に適した群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリンおよびマンニトールが含まれる。適したポリペプチドにはアスパルテームが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。

ｐＨ調整剤または緩衝剤には、有機酸と塩基とから調製された有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい。

本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、経口および経鼻デリバリーにより投与することができる。例えば、これらの膜を通じて投与される薬物は、作用発現が速く、治療血漿レベルを与え、肝代謝の初回通過効果を回避し、不適な胃腸（ＧＩ）環境への薬物の曝露を回避する。別の利点には、薬物を容易に適用し、局在させ、除去することができるような膜部位への容易な接近が含まれる。１つの実施形態において、経口または経鼻デリバリーにより投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液脳関門を通過できるように修飾されている。本開示に記載の方法は、本明細書に開示の特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変わり得ると理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定するためのものではないと理解されるべきである。

さらに、本明細書に記載の実験は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の従来の分子技術および細胞生物学的技術および免疫学的技術を使用する。そのような技術は当業者に周知であり、文献において十分に説明されている。例えば、すべての補遺を含むAusubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)、MR GreenおよびJ. Sambrook著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)ならびにHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)を参照されたい。

本明細書に開示の実施形態の範囲から逸脱することなく、適した均等物を使用して、本明細書に記載の方法の他の適した修正および適合を行うことができることが当業者には容易に明らかになるであろう。今まで特定の実施形態を詳細に説明してきたが、それらは、例示のみを目的として記載される、限定するためのものではない以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。

実施例１：２テイルｓｉＲＮＡの合成
ＭｅｒＭａｄｅ １２（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｇ、Ｔｅｘａｓ）、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ ８９０９）およびＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０および１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、固相合成条件下、修飾（２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ）ホスホルアミデート（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、ＭＡ）を使用して２テイルｓｉＲＮＡ（ｔｔ－ｓｉＲＮＡ構造の例については図２および図５を参照されたい）を合成した。末端がＵｎｙｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、＃Ｎ－４０００－１０）の長鎖アルキルアミンを使用して官能化された制御された孔ガラスまたはＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ（登録商標）のいずれかの上で、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチド鎖を成長させた。標準的なヨウ素酸化サイクルの代わりに０．１Ｍ １，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、ＲＮ－１６８９）を使用してホスホロチオエートを加えた。６５℃の４０％メチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、４２６４６６）を１５分間使用してオリゴヌクレオチドを脱保護した。オリゴヌクレオチドを凍結乾固し、水中に再懸濁させ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬ－ＳＡＸ ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬ－ＳＡＸ、ＰＬ１７５１－３１０２、１０００Å、５０×１５０ｍｍ、１０μｍまたはＡｇｉｌｅｎｔ ＰＬ－ＳＡＸ、ＰＬ１２５１－３１０２、１０００Å、２５×１５０ｍｍ、１０μｍ）上で溶離液として過塩素酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓ４９０－５００）（０．１Ｍ）を使用する陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。

Ａｇｉｌｅｎｔ １１００装置または１２６０装置のいずれかを使用してＨＰＬＣを実施した。次いで、塩を含んだオリゴヌクレオチドを凍結乾固し、水中に再懸濁させ、塩を除去するためにＳｅｐｈａｄｅｘ（ＧＥ、Ｇ２５、Ｆｉｎｅ、５０×２５０ｍｍまたは２５×２５０カラム中）サイズ排除カラムに通した。最後に、オリゴヌクレオチドを凍結乾固し、定量化し、それらの相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｓ）との二重鎖にし、０．２２μｍフィルターに通した。各オリゴヌクレオチドの純度および質量を検証するため、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０Ｂ Ｑ－ＴｏＦ装置を使用して液体クロマトグラフィー結合質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によりオリゴヌクレオチドを確認した。（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅカラム、２．１×１５０ｍｍ、２．７μｍ、緩衝液として１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（０．１Ｍ）／トリエチルアミン（９ｍＭ）（ＨＦＩＰ／ＴＥＡ）を、溶離液としてメタノールを使用。）表３中のハンチンチン遺伝子を標的にするｔｔ－ｓｉＲＮＡサンプルを参照されたい。

本発明のｔｔ－ｓｉＲＮＡ中のホスホロチオエート分は、ＲｐおよびＳｐ立体異性体のラセミ混合物でできている可能性があり、または安定性および有効性を向上させるために一方または他方を使用して特異的に合成することができる。加えて、ホスホロチオエート立体選択性の位置特異的な変化を使用することができる。疎水性およびタンパク質会合を向上させるために、ホスホロジチオエート結合もまた、選ばれた位置において使用することができる（構造については図１０を参照されたい）。

ガイド鎖上の１８番目またはパッセンジャー鎖の３’末端から始まる一本鎖ホスホロチオエートテイルの代わりに、炭素またはテトラエチレングリコールリンカーにより結合された脱塩基ヌクレオチドならびにホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅｓ）もまた使用することができる。

オリゴヌクレオチド骨格は、リン酸、ホスホロチオエート（ラセミ混合物または立体特異性）、ジホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ペプチド核酸、ボラノホスフェート、２’－５’ホスホジエステル、アミド結合、ホスホノアセテートもしくはモルホリノまたはそれらの組合せでできている可能性がある（構造については図１１を参照されたい）。

糖修飾には、２’Ｏ－メチル、２’フルオロ、２’リボ、２’デオキシリボ、２’Ｆ－ＡＮＡ、ＭＯＥ、４’Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮＥｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡまたはそれらの組合せが含まれ得る（構造については図１２を参照されたい）。

実施例２：ＨｅＬａ細胞内の２テイルｓｉＲＮＡ有効性
１テイルｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）および一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）と比べて２テイルｓｉＲＮＡ（ｔｔ－ｓｉＲＮＡ）のＲＩＳＣ侵入およびサイレンシングの効率を比較するため、ハンチンチンｍＲＮＡを標的にする、濃度が漸増する（１ｐｍ～１０ｎｍ）ｔｔ－ｓｉＲＮＡ、ｈｓｉＲＮＡまたはｓｓＲＮＡのいずれかと共にＨｅＬａ細胞を７２時間トランスフェクトした（ＲＮＡｉＭａｘを使用して）。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０を使用してハンチンチンｍＲＮＡサイレンシングを測定した。データをハウスキーピング遺伝子（ＰＰＩＢ）に対して規格化し、未処理対照のパーセントとしてグラフ化した。図１は、１つのホスホロチオエート化テイルの付加が、非修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖と比べて同様の遺伝子サイレンシング有効性を示したことを示す。図３は、４つの異なる２テイルｓｉＲＮＡが、１テイルｓｉＲＮＡと同様の有効性でハンチンチンｍＲＮＡをサイレンシングしたことを示し、これは、２テイル構造がＲＩＳＣ負荷およびサイレンシングを妨害しないことを示す。これらの結果は、本発明の化合物が、さらなるＲＮＡｉプロセシングのためにＲＩＳＣに効率的に侵入することを示す。

図１に示す通り、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞内の脂質媒介トランスフェクション後、１テイルｓｉＲＮＡ二重鎖と比べて同等の有効性を示し、これは、第２の一本鎖テイルの付加によりＲＩＳＣ負荷が妨げられなかったことを示す。２テイルｓｉＲＮＡは、トランスフェクションなしのＨｅＬａ細胞内で効果的ではなかったが、一次皮質ニューロン内では、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは約５０％のサイレンシングを促進し、これは、ホスホロチオエート化テイルの付加が、製剤を使用せずに（例えば、疎水性部分の付加なしで）ｓｉＲＮＡを一次ニューロンへデリバリーするための有効な方法であることを示す。

細胞取込みを定量するために、ハンチンチンｍＲＮＡを標的にする、濃度が漸増する（１ｎｍ～１μｍ）２テイルｓｉＲＮＡを使用して、ＨｅＬａ細胞を１週間、受動的に処理した（すなわち、トランスフェクション試薬を使用せずに）。図８の結果は、４つの異なる２テイルｓｉＲＮＡのいずれを使用してもハンチンチンｍＲＮＡの顕著なサイレンシングは存在しなかったことを示す。しかし、一次皮質ニューロン内では、ｔｔ－ｓｉＲＮＡの受動的取込みが、効率的な遺伝子サイレンシングをもたらした。以下の実施例３を参照されたい。このデータは、２つの一本鎖ホスホロチオエート化テイルのインターナリゼーションおよび有効性が細胞型特異的であったことを示した。ｍＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０を使用して測定した。データをハウスキーピング遺伝子（ＰＰＩＢ）に対して規格化し、未処理対照のパーセントとしてグラフ化した。

実施例３：一次皮質ニューロン内の２テイルｓｉＲＮＡ有効性
ｓｉＲＮＡの２テイルホスホロチオエート化は、トランスフェクション試薬または疎水性修飾を必要とせずに一次ニューロンへのデリバリーに効率的であることを確認した。追加の一本鎖テイルのホスホロチオエート化の増加は、１テイルｓｉＲＮＡから２テイル７－１３－７ ｓｉＲＮＡで処理後のハンチンチンｍＲＮＡ発現を比較することによって分かる通り、有効性の向上を支持した（図３Ｂ）。

科学的理論に拘束されることは望まないが、図３Ａの結果に示す通り、７－１３－７ ２テイルｓｉＲＮＡ中のより長いホスホロチオエート化一本鎖テイルは、インビボで優れた分布を与えたが、５－１５－５ ２テイルｓｉＲＮＡ中のより長い二重鎖領域は、効果的なサイレンシングにさらに寄与することができた。

実施例４：一次皮質ニューロン内の２テイルｓｉＲＮＡインターナリゼーション
細胞レベルにおける免疫蛍光分析は、注射後６時間および２４時間において、ｔｔ－ｓｉＲＮＡが一次皮質ニューロン内に蓄積したことを示した（図６）。これらの結果は、ニューロンに効率的に侵入するｔｔ－ｓｉＲＮＡの能力を示す。人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を陰性対照として使用した。

いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、トランスフェクション製剤を使用せずにニューロンを処理すると（すなわち、受動的取込みにより）、一次皮質ニューロン内で約５０％のサイレンシングを促進する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、トランスフェクション試薬を使用して細胞を処理すると、ＨｅＬａ細胞内で約７０％のサイレンシングを示す。

ｔｔ－ｓｉＲＮＡによる一次皮質ニューロンの処理は、頑強なｍＲＮＡサイレンシングを誘発する。このレベルの有効性は、１テイルｓｉＲＮＡについて、かつて示されたことはない。

実施例５：インビボでの２テイルｓｉＲＮＡの投与経路
ニューロン内のインビボでの２テイルｓｉＲＮＡのデリバリーの有効性を評価するために、ｔｔ－ｓｉＲＮＡを線条体内（ＩＳ）注射によりマウスにデリバリーした。ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、脳の注射された半球に局在し、その全体にわたって蓄積したが、１テイルｓｉＲＮＡは、脳の注射された半球内の著しく少ない蓄積を示した（図７）。

図７に示す通り、ｔｔ－ｓｉＲＮＡは、線条体内注射後、マウス脳の注射された半球全体にわたって分布した。１テイルｓｉＲＮＡは、一次ニューロン内のｍＲＮＡをサイレンシングすることができたが、ｔｔ－ｓｉＲＮＡ構造は、ｓｉＲＮＡの組織分布および組織保持の向上に極めて重要であった。２つの一本鎖ホスホロチオエート化テイルのわずかな疎水性が組織保持を支持した一方、注射された脳の同側半球全体にわたる広範で均一な分布も可能にする。

図７に示す通り、ｔｔ－ｓｉＲＮＡの単回注射は、注射部位の同側および対側の両方で検出され、これは、拡散が、注射された半球に限定されず、正中線を越えて非注射側へも起こることを示す。科学的理論に拘束されることは望まないが、脳内の脳室を含む注射の代替方法は、１回の注射で両側分布を容易にすることもできた。

本明細書において述べた、または引用した論文、特許および特許出願ならびに他のすべての文書および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示される場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。出願人らは、任意のそのような論文、特許、特許出願または他の物理的および電子的文書からあらゆるすべての資料および情報を本出願に物理的に組み込む権利を保有する。

本明細書に例示的に記載した方法は、本明細書に具体的に開示されていない何らかの１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限がない状態で適切に実行することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広くかつ制限なく読まれるものとする。加えて、本明細書において使用された用語および表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、図示および説明された特徴またはその一部の任意の均等物を除外する意図はない。特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であると理解される。したがって、例示的な実施形態および任意選択の特徴により本発明が具体的に開示されてきたが、本明細書に開示のそこで具体化される本発明の修正および変形が当業者により行われ得ること、ならびにそのような修正および変形は本発明の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。

本明細書において本発明を大まかに一般的に説明してきた。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属の分類のそれぞれも方法の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関わらず、属から任意の主題を排除する条件付きでまたは否定的な制限付きで、方法の一般的な説明が含まれる。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。さらに、本方法の特徴または態様がマーカッシュグループによって記載されている場合、本発明はまた、それによって、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによって記載されることを当業者は理解されよう。

Claims (40)

1. ａ）５’末端、３’末端、およびアンチセンス鎖との相補性領域を有するセンス鎖；
   ｂ）５’末端、３’末端、標的ＲＮＡとの相補性領域を有するアンチセンス鎖；
   ｃ）少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、前記センス鎖の前記３’末端にある第１のオーバーハング領域；ならびに
   ｄ）少なくとも３個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、前記アンチセンス鎖の前記３’末端にある第２のオーバーハング領域
   を含む二本鎖核酸化合物であって、ここで前記センス鎖およびアンチセンス鎖の前記５’末端から１番目および２番目にあるヌクレオチドが、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている、二本鎖核酸化合物。
2. 前記アンチセンス鎖が５’リン酸部分を含む、請求項１に記載の化合物。
3. 前記アンチセンス鎖が、前記５’末端にある部分Ｒを含み、Ｒが、
   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
4. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ独立して、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の化合物。
5. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ独立して、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の化合物。
6. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、化学修飾ヌクレオチドからなる、請求項１に記載の化合物。
7. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方が、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の化合物。
8. 前記センス鎖内の前記相補性領域内の前記ヌクレオチドが、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖内の前記相補性領域内の前記ヌクレオチドが、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドである、請求項６に記載の化合物。
9. 各相補的塩基対が、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドからなる、請求項８に記載の化合物。
10. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が独立して、２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の化合物。
11. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が独立して、少なくとも４個の連続する２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる、請求項１０に記載の化合物。
12. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる、請求項１０に記載の化合物。
13. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖の前記３’末端から１番目、２番目、３番目および４番目にあるヌクレオチドが２’－メトキシ－ヌクレオチドからなる、請求項１１に記載の化合物。
14. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が独立して、４個、５個、６個、７個または８個のホスホロチオエート化ヌクレオチドからなる、請求項１に記載の化合物。
15. 前記センス鎖の前記３’末端または前記アンチセンス鎖の前記３’末端から１～７番目または１～８番目にあるヌクレオチドが独立して、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して接続されている、請求項１４に記載の化合物。
16. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が、同じ数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、請求項１または１４に記載の化合物。
17. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の前記オーバーハング領域が、異なる数のホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、請求項１または１４に記載の化合物。
18. 前記オーバーハング領域が脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
19. 式（Ｉ～ＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩ）：
    （式中、
    Ｘは、出現する毎に、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
    Ｙは、出現する毎に、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
    －は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
    ＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；
    －－－は、個々に出現する毎に、塩基対相互作用またはミスマッチを表し；
    Ｒは、出現する毎に、５’リン酸を含むヌクレオチドであり、または
    からなる群から選択される）
    から選択される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
20. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の化合物。
21. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がそれぞれ、化学修飾ヌクレオチドからなる、請求項１９に記載の化合物。
22. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が独立して、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の化合物。
23. 前記アンチセンス鎖が、前記標的ＲＮＡに対して完全な相補性を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
24. 前記アンチセンス鎖が、前記標的ＲＮＡに対して８０％～９９％の間の相補性を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の二本鎖核酸化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
26. 疾患または障害の処置を必要とする対象において疾患または障害を処置することにおける使用のための請求項２５に記載の医薬組成物であって、治療的有効量の医薬組成物が該対象に投与される、医薬組成物。
27. 前記疾患または障害が神経性である、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記神経性疾患がハンチントン病である、請求項２７に記載の医薬組成物。
29. そのような処置を必要とする前記対象がヒトである、請求項２８に記載の医薬組成物。
30. 標的臓器、標的組織または標的細胞への選択的インビボデリバリーにおける使用のための請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物であって、前記化合物が対象に投与される、化合物。
31. 前記標的臓器が脳である、請求項３０に記載の化合物。
32. 前記標的細胞が一次皮質ニューロンである、請求項３０に記載の化合物。
33. 前記化合物の前記デリバリーが、脂質製剤によって媒介されない、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の化合物。
34. 前記化合物が、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射、線条体内注射または脳室内注射により投与される、請求項３０に記載の化合物。
35. 神経性疾患または障害の処置を必要とする対象において神経性疾患または障害を処置することにおける使用のための請求項２６に記載の医薬組成物であって、治療的有効量の医薬組成物が該対象に投与される、医薬組成物。
36. 前記二本鎖核酸化合物が、式（Ｉ）
    または式（ＶＩ）
    （式中、
    Ｘは、出現する毎に、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
    Ｙは、出現する毎に、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；
    －は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；
    ＝は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；
    －－－は、個々に出現する毎に、塩基対相互作用またはミスマッチを表し；
    Ｒは、出現する毎に、５’リン酸を含むヌクレオチドであり、または
    からなる群から選択される）
    の構造を有する、
    請求項３５に記載の医薬組成物。
37. 前記医薬組成物が、静脈内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射、線条体内注射または脳室内注射により投与される、請求項３６に記載の医薬組成物。
38. 前記医薬組成物が、脳室内注射により投与される、請求項３６に記載の医薬組成物。
39. 前記神経性疾患または障害がハンチントン病である、請求項３６に記載の医薬組成物。
40. ａ）前記センス鎖の前記３’末端にある第１のオーバーハング領域は、７個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する；ならびに
    ｂ）前記アンチセンス鎖の前記３’末端にある第２のオーバーハング領域は、７個の連続するホスホロチオエート化ヌクレオチドを有する、
    請求項１～２４および３０～３４のいずれか一項に記載の化合物。