JP2016171815A - 非対称性干渉rnaの組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、配列特異的な遺伝子サインレンシングを実施することが可能な、非対称性二重鎖RNA分子を提供する。該RNA分子は、第1鎖および第2鎖を含む。該第1鎖は該第2鎖よりも長い。該RNA分子は、該第1鎖および該第2鎖により形成される二本鎖領域と、5’突出、3’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される2つの末端とを含む。本発明のRNA分子は、研究用ツールおよび/または治療薬として用いることができる。
【選択図】図1
Description
本願は、2007年8月27日に出願された米国仮特許出願第60/968,257号、2008年2月19日に出願された米国仮特許出願第61/029,753号、および2008年3月24日に出願された米国仮特許出願第61/038,954号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
該第1鎖が
該第2鎖が最長で17ヌクレオチドの長さを有するか、または該第1鎖との少なくとも1つのミスマッチを含有するか、または少なくとも1つの修飾を含有するとの条件つきで、該第1鎖は19〜25ヌクレオチドの長さを有し、該第2鎖は18〜24ヌクレオチドの長さを有する。
からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
18〜23ヌクレオチドの長さを有する第1鎖と12〜17ヌクレオチドの長さを有する第2鎖とを含み、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二本鎖領域を形成し、
前記第1鎖が1〜9ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能な二重鎖RNA分子。
(項目2)
前記第1鎖が、標的mRNA配列と少なくとも70%相補的な配列を含む、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目3)
前記5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、A、U、およびdTからなる群から選択される、項目1に記載のRNA分子。
(項目4)
前記二本鎖領域のGC含量が30%〜70%である、項目1に記載のRNA分子。
(項目5)
前記第1鎖が19〜23ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目6)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目7)
前記第2鎖が14〜16ヌクレオチドの長さを有する、項目6に記載の二重鎖RNA分子。
(項目8)
前記第2鎖が15ヌクレオチドの長さを有する、項目6に記載の二重鎖RNA分子。
(項目9)
前記第1鎖が2〜4ヌクレオチドの3’突出を有する、項目8に記載の二重鎖RNA分子。
(項目10)
前記第1鎖が3ヌクレオチドの3’突出を有する、項目8に記載の二重鎖RNA分子。
(項目11)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目12)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および/または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目13)
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目12に記載の二重鎖RNA分子。
(項目14)
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも1つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目13に記載の二重鎖RNA分子。
(項目15)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基である、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目16)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目17)
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その2’−OH基がH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基により置換され、各Rが独立にC1〜C6のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがF、Cl、Br、またはIである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目18)
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目19)
前記第1鎖が、少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目20)
前記少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが、3’突出、5’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される1つまたは複数の領域内にある、項目19に記載の二重鎖RNA分子。
(項目21)
前記第2鎖が、少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目22)
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目1に記載のRNA分子。
(項目23)
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目1に記載の二重鎖RNA分子と接触させるステップと、
前記二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子、核酸に対して前記二重鎖RNA分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む方法。
(項目24)
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖RNA分子を導入するステップを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、または局所(regional)投与からなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目24に記載の方法。
(項目27)
細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するための、項目23に記載の方法の使用。
(項目28)
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目23に記載の方法の使用。
(項目29)
前記標的遺伝子が、哺乳動物における疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する、項目23に記載の使用。
(項目30)
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目31)
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目32)
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目33)
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目34)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む試薬。
(項目35)
18〜23ヌクレオチドの長さを有する第1のRNA鎖と12〜17ヌクレオチドの長さを有する第2のRNA鎖とを含み、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二重鎖RNA分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖RNA分子が1〜9ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有し、
前記二重鎖RNA分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
(項目36)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を調製する方法であって、
前記第1鎖および前記第2鎖を合成するステップと、
前記二重鎖RNA分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
(項目37)
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖RNA分子内に少なくとも1種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記RNA鎖が、化学合成されるか、または生物学的に合成される、項目36に記載の方法。
(項目39)
少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された項目1に記載の二重鎖RNA分子をコードする1つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
(項目40)
第1の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第1鎖をコードする第1の核酸と、第2の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第2鎖をコードする第2の核酸とを含む、項目39に記載の発現ベクター。
(項目41)
項目39に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
(項目42)
項目39に記載のベクターを含む細胞。
(項目43)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む細胞。
(項目44)
哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である、項目43に記載の細胞。
(項目45)
第1鎖および第2鎖を含み、
前記第1鎖が前記第2鎖よりも長く、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二本鎖領域を形成し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である、二重鎖RNA分子。
(項目46)
前記二重鎖RNA分子の2つの末端が、1〜10ヌクレオチドの3’突出、0〜10ヌクレオチドの5’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目47)
前記第1鎖が標的mRNA配列と実質的に相補的である、項目45に記載のRNA分子。
(項目48)
前記第1鎖が、1〜8ヌクレオチドの3’突出と1〜8ヌクレオチドの5’突出とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目49)
前記第1鎖が、1〜10ヌクレオチドの3’突出と平滑末端とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目50)
前記第1鎖が、1〜10ヌクレオチドの5’突出と平滑末端とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目51)
前記RNA二重鎖が、1〜8ヌクレオチドの2つの5’突出を有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目52)
前記RNA二重鎖が、1〜10ヌクレオチドの2つの3’突出を有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目53)
前記第1鎖が12〜100ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目54)
前記第1鎖が12〜30ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目55)
前記第1鎖が18〜23ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目56)
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目57)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目58)
前記第2鎖が5〜30ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目59)
前記第2鎖が12〜22ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目60)
前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目61)
前記第2鎖が15ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目62)
前記二本鎖領域が27bpである場合、前記RNA分子の両末端における突出が独立に3’突出または5’突出であるとの条件つきで、前記第1鎖が12〜30ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が10〜29ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目63)
前記第1鎖が18〜23ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目64)
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目65)
前記第1鎖が
(化4)
であり、
前記第2鎖が最長で17ヌクレオチドの長さを有するか、または前記第1鎖との少なくとも1つのミスマッチを含有するか、または少なくとも1つの修飾を含有するとの条件つきで、
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が18〜24ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目66)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目67)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が14〜16ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目68)
前記第1鎖が前記第2鎖よりも1〜10ヌクレオチド長い、項目45に記載のRNA分子。
(項目69)
前記3’突出が2〜6ヌクレオチドの長さを有する、項目46に記載のRNA分子。
(項目70)
前記5’突出が0〜5ヌクレオチドの長さを有する、項目46に記載のRNA分子。
(項目71)
前記遺伝子サイレンシングが、RNA干渉、翻訳の調節、およびDNAのエピジェネティック調節の1もしくは2つ、または全てを含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目72)
前記第1鎖および前記第2鎖の少なくとも1つにおいてニックをさらに含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目73)
前記二本鎖領域が1つまたは複数のヌクレオチドのギャップを含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目74)
5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、前記標的mRNA配列と相補的ではない、項目47に記載のRNA分子。
(項目75)
5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、A、U、およびdTからなる群から選択される、項目45に記載のRNA分子。
(項目76)
ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートしている、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目77)
マッチしないかまたはミスマッチする少なくとも1つのヌクレオチドをさらに含む、項目45に記載のRNA分子。
(項目78)
前記二本鎖領域のGC含量が20〜70%である、項目45に記載のRNA分子。
(項目79)
3’突出および/または5’突出が、分解に対して安定化される、項目45に記載のRNA分子。
(項目80)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目81)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および/または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目82)
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目81に記載の二重鎖RNA分子。
(項目83)
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも1つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目82に記載の二重鎖RNA分子。
(項目84)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基を含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目85)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目86)
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その2’−OH基がH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基により置換され、各Rが独立にC1〜C6のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがF、Cl、Br、またはIである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目87)
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目88)
前記第1鎖が少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目89)
前記少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが、3’突出、5’突出、および前記第1鎖の5’端に近接する二本鎖領域からなる群から選択される1つまたは複数の領域内にある、項目88に記載の二重鎖RNA分子。
(項目90)
前記第2鎖が少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目91)
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目92)
前記二重鎖RNA分子が単離二重鎖RNA分子である、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目93)
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目1に記載の二重鎖RNA分子と接触させるステップと、
前記二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子または核酸に対して前記二本鎖RNA分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップと
を含む方法。
(項目94)
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖RNA分子を導入するステップを含む、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、および局所(regional)投与からなる群から選択される、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目93に記載の方法。
(項目97)
細胞または生物における遺伝子の発現を調節するための、項目93に記載の方法の使用。
(項目98)
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目93に記載の方法の使用。
(項目100)
前記標的遺伝子がヒトの疾患または動物の疾患と関連する遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目101)
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目102)
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目103)
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目104)
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目105)
in vitroまたはin vivoにおける薬剤標的の研究のための、項目93に記載の方法の使用。
(項目106)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む試薬。
(項目107)
第1のRNA鎖および第2のRNA鎖を含み、
前記第1鎖が前記第2鎖よりも長く、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二重鎖RNA分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖RNA分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
(項目108)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を調製する方法であって、
前記第1鎖および前記第2鎖を合成するステップと、
前記二重鎖RNA分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
(項目109)
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖RNA分子内に少なくとも1種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記RNA鎖が化学的に合成されるか、または生物学的に合成される、項目108に記載の方法。
(項目111)
前記第1鎖および前記第2鎖が、個々にまたは同時に合成される、項目108に記載の方法。
(項目112)
活性作用物質としての、少なくとも1種の項目1に記載の二重鎖RNA分子と、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、コレステロール、脂質、およびリポイドからなる群から選択される1種または複数種の担体とを含む医薬組成物。
(項目113)
有効量の項目112に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む治療法。
(項目114)
前記医薬組成物が、静脈内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、吸入投与、局所投与、および局所(regional)投与からなる群から選択される経路を介して投与される、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記第1鎖が、発生遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および酵素遺伝子、ならびに接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカインまたはその受容体、成長/分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体、キナーゼ、シグナル伝達物質の遺伝子、ウイルス遺伝子、感染性疾患の遺伝子、ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、およびYES、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53、WT1、ACPデサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼ、ADP−グルコースピロホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼもしくはペプチダーゼ(peptidease)、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、k−RAS、β−カテニン、Rsk1、PCNA、p70S6K、サバイビン、mTOR、PTEN、Parp1、またはp21からなる群から選択される遺伝子の標的mRNA配列と実質的に相補的な配列を含む、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目116)
からなる群から選択される、二重鎖RNA分子。
(項目117)
二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を有する第1の二重鎖RNA分子を修飾する方法であって、前記アンチセンス鎖が1〜8ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有するように、前記センス鎖の長さを短くするステップと、第2の二重鎖RNA分子を形成するステップとを含み、
前記第1の二重鎖RNA分子の少なくとも1つの特性が改善される方法。
(項目118)
前記第2の二重鎖RNA分子が形成される条件下で、前記アンチセンス鎖とその短くしたセンス鎖とを組み合わせるステップをさらに含む、項目117に記載の方法。
(項目119)
前記第1の二重鎖RNA分子がsiRNAであるか、またはdicer基質siRNAであるか、またはsiRNA前駆体である、項目117に記載の方法。
(項目120)
少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された項目1に記載の二重鎖RNA分子をコードする1つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
(項目121)
第1の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第1鎖をコードする第1の核酸と、第2の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第2鎖をコードする第2の核酸とを含む、項目120に記載の発現ベクター。
(項目122)
項目120に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
(項目123)
項目120に記載の発現ベクターを含む細胞。
(項目124)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む細胞。
(項目125)
項目124に記載の細胞は、哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である。
RNA干渉(RNAiと省略される)は、二本鎖RNA(dsRNA)によって誘導される一本鎖RNA(ssRNA)の標的破壊に関する細胞プロセスである。ssRNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)などの遺伝子転写物である。RNAiは、dsRNAが、dsRNAに相補的である配列を有する遺伝子の発現に特異的に干渉することができる転写後の遺伝子サイレンシングの形態である。dsRNA標的のアンチセンスRNA鎖は、リボヌクレアーゼによる切断に関するメッセンジャーRNA(mRNA)などの相補的遺伝子転写物を標的にする。
Elbashirらは、いくつかの非対称性二重鎖RNA分子、ならびに対称性siRNA分子を試験した(Elbashirら、2001c)。非対称性二重鎖RNA分子は、対応するsiRNA分子とともに表1に列挙される。
図1Aを参照すると、本発明の一実施形態において、二本鎖RNA分子は、第1鎖上に5’突出および3’突出の両方を有する。RNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、実質的に相補性の配列を有する少なくとも1つの二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。第1鎖上で、二本鎖領域に隣接して、5’末端および3’末端の両方上に非対応の突出が存在する。
一実施形態において、二重鎖RNA分子は、二本鎖領域、平滑末端、および5’突出または3’突出を含む(例えば、図2Aおよび2Bを参照されたい)。このRNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。
一実施形態において、二重鎖RNA分子は、二本鎖領域、および2つの3’突出、または2つの5’突出を含む(例えば、図2Cおよび2Dを参照されたい)。RNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。
siRNAおよびmiRNAは、研究手段として広く使用され、薬剤候補として開発される。(例えば、Dykxhoorn、Novina & Sharp. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4巻:457〜467頁(2003年);Kim & Rossi、Nature Rev. Genet. 8巻:173〜184頁(2007年);de Fougerollesら Nature Rev. Drug Discov. 6巻:443〜453頁(2007年);Czech、NEJM 354巻:1194〜1195頁(2006年);およびMack、Nature Biotech. 25巻:631〜638頁(2007年)を参照されたい)。本発明の二重鎖RNA分子、すなわち、aiRNAは、当分野で既知のsiRNAおよびmiRNAから導出することができる。
aiRNA二重鎖の2つの一本鎖は、例えば、1つまたは複数のミスマッチを含む、少なくとも1つの非対応の領域、または不完全に対応した領域を有することができる。一実施形態において、非対応の、または不完全に対応した領域は、平滑末端を有する末端領域、3’−凹部または5’突出を有する末端領域、および5’凹部または3’突出を有する末端領域を含めた、RNA分子の少なくとも1つの末端領域である。本明細書で使用する場合、末端領域は、1つの末端および隣接する範囲を含む、RNA分子の領域である。
本発明のaiRNA分子の設計において、総GC含量は変化し得る。一実施形態において、二本鎖領域のGC含量は、20〜70%である。さらなる実施形態において、G−C対形成は、A−U対形成より強いので、鎖の分離をより容易にするために、二本鎖領域のGC含量は、50%未満、または好ましくは30〜50%である。
本発明のRNA分子内のヌクレオチドの1つまたは複数は、デオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と置換することができる。置換は、RNA分子内のどこにおいても、例えば、一方もしくは両方の突出領域、および/または二本鎖領域で起こり得る。場合によっては、置換により、RNA分子の物理的特性、例えば、鎖親和性、溶解度、およびRNase劣化に対する抵抗力、または別の方法で増強された安定性が増強される。
また、本発明は、細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法を提供する(サイレンシング法)。この方法は、選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下で前記細胞または生物を二重鎖RNA分子と接触させるステップ、二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対して、前記二重鎖RNA分子により実施される選択的遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む。
本発明のRNA分子は、遺伝子機能を発見するための遺伝子操作されたノックアウトモデルとは対照的に、動物モデルにおける遺伝子の「ノックダウン」を作るために用いることができる。また、この方法は、in vitroにおいて遺伝子をサイレンシングするために用いることができる。例えば、aiRNAを細胞にトランスフェクトすることができる。aiRNAは、薬剤研究および開発における、薬物標的/経路同定および検証、ならびに他の生物医学研究における研究ツールとして1に用いることができる。
本発明のRNA分子は、(Czech、2006年;de Fougerollesら、2007年;Dykxhoornら、2003年;KimおよびRossi、2007年;Mack、2007年)に要約された疾患を含む様々な疾患または望ましくない状態の治療およびまたは予防のために用いることができる。
4.3.1 RNA分子の修飾
裸のRNA分子は、相対的に不安定であり、in vivoでは相対的に速やかに分解され得る。化学的修飾は、本発明のRNA分子に導入され、RNA分子の半減期を改善し、さらには、RNA分子の生物活性を低下させずに遺伝子標的化の非特異的な作用のリスクを低下させることができる。
RNAiの治療用途にとっての1つの主な障害は、標的細胞へのsiRNAの送達である(ZamoreおよびAronin(2003年))。様々な手法が、RNA分子、特にsiRNA分子の送達のために開発された(例えば、(de Fougerolles
et al.,2007;Dykxhoorn et al.,2003年;Kim and Rossi,2007年)。当業者に既知の任意の送達手法を、本発明のRNA分子の送達のために使用することができる。
本発明は、医薬組成物をさらに提供した。医薬組成物は、活性薬剤として、少なくとも1つの非対称性二重鎖RNA分子と、医薬的担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノ乳剤、脂質、およびリポイドからなる群から選択される1つまたは複数の担体とを含む。一実施形態において、この組成物は、診断的適用、または治療的適用のためのものである。
細胞培養および試薬
Hela、SW480、DLD1、HT29、およびH1299細胞をATCCから入手し、10%のウシ胎児血清(FBS)、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのL−グルタミン(Invitrogen)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)はAllCells LLCから得て、10%FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI−1640培地(Invitrogen)中に維持した。この試験中に記載する小RNAはDharmacon、Qiagen、またはIntegrated DNA技術(表2)によって合成され、製造者の説明書に従いアニーリングした(図3a)。ヒトAgo2を標的とするsiRNA、およびDicer(Ambion)は100nMで使用した。RNAのトランスフェクションは示した濃度でDharmaFECT1(Dharmacon)を使用して実施した。ヒトArgonaute2(Ago2)発現ベクター(OriGene)は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。血清中安定性は、示した時間量のaiRNA二重鎖またはsiRNA二重鎖を10%ヒト血清(Sigma)とともにインキュベーション、次に非変性TBE−アクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって決定した。
in vitroでのAgo2−RISCローディング。
示したaiRNA、siRNAでトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後に示した時間時点で採取した。RNAはTRIZOLで単離し、qRT−PCRを、TaqManワンステップRT−PCR試薬および示したmRNA用のプライマープローブセット(Applied Biosystems)を使用して実施した。データは対照トランスフェクト細胞に対して表し、それぞれの試料はアクチンmRNAレベルに正規化する。図14d中の実験用に、HindIII−Xho1部位でのpcDNA3.1+またはpcDNA3.1−のいずれかへのStat3c DNA(Origene)のクローニングによってStat3構築物を作製した。次いでStat3順方向または逆方向発現ベクターを、24時間aiStat3またはsiStat3を用いてHela細胞にコトランスフェクトした。次いで細胞を採取し、TRIZOLによってRNAを単離し、TaqManワンステップRT−PCR試薬およびStat3またはアクチン用のプライマープローブセット(Applied Biosystems)を使用してqRT−PCRを実施した。RT−PCRは、Superscript ワンステップ RT−PCRキット(Invitrogen)およびStat3順方向(5’−GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC−3’(配列番号73))およびStat3逆方向(5’−TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG−3’(配列番号74))プライマーおよびアクチン順方向(5’−CCATGGATGATGATATCGCC−3’(配列番号75))およびアクチン逆方向(5’−TAGAAGCATTTGCGGTGGAC−3’(配列番号76))プライマーを使用して同じRNA試料で実施した。
全RNAはTRIZOLを使用して調製し、cDNAはランダムプライマーおよびThermoscript RT−PCR System(Invitrogen)を使用して合成した。PCRはPfxポリメラーゼを使用して20サイクルで実施した。プライマー:アクチン−1、5’CCATGGATGATGATATCGCC−3’(配列番号75);アクチン−2、5’−TAGAAGCATTTGCGGTGGAC−3’(配列番号76);β−カテニン−1、5’−GACAATGGCTACTCAAGCTG−3’(配列番号77);β−カテニン−2、5’−CAGGTCAGTATCAAACCAGG−3’(配列番号78)。
細胞を氷冷リン酸塩緩衝化食塩水で二回洗浄し、溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、0.5%のNonidet P−40、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、1mMのNaF、2mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および10μg/mlのそれぞれのペプスタチン、リューペプチン、およびアプロチニン)中で溶解した。20μgの可溶性タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、PVDF膜に移した。β−カテニン、Nbs1、サバイビン、p21、Rsk1、k−Ras、Stat3、PCNA、NQO1、アクチン(Santa Cruz)、EF2、p70S6K、mTOR、PTEN(Cell Signaling Technology)、Ago2(Wako)、Dicer(Novus)、およびParp1(EMD Biosciences)に対する一次抗体をこの試験中で使用した。抗原−抗体複合体は増強化学発光(GE Biosciences)によって目に見える状態にした。
非サイレンシングaiRNAまたはaiRNAで処理したHela細胞由来の全RNA(5μg)を、任意の事前処理なしでGeneRacer(商標)RNAアダプター(Invitrogen、5’−CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA−3’(配列番号79))と連結させた。連結RNAはランダムプライマーを使用してcDNAに逆転写した。切断産物を検出するために、RNAアダプターと相補的なプライマー(GeneRacer(商標)5’ネステッドプライマー:5’−GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA−3’(配列番号80))およびβ−カテニン特異的プライマー(GSP:5’−CGCATGATAGCGTGTCTGGAAGCTT−3’(配列番号81))を使用してPCRを実施した。増幅断片は1.4%アガロースゲルで分けて、1−kbのPlus DNAラダー(Invitrogen)を使用して分子量を決めた。特異的切断部位をDNA配列決定によってさらに確認した。
aiRNA二重鎖およびsiRNA二重鎖の配列および構造を表2中に挙げる。点突然変異の位置をk−Ras aiRNAにおいて枠で囲む。
それぞれの動物の健康状態の毎日の検査も実施した。体重を3日毎に調べた。食餌および水は動物飼育施設の手順に従い毎日供給した。20%を超える死亡率およびまたは20%を超える正味体重の減少をもたらした治療は毒性であると考えた。結果は平均腫瘍体積(mm3)±SEとして表す。0.05未満のP値は統計上関連があると考える。
オスまたはメスの無胸腺ヌードマウス4〜5週齢(Charles River Laboratories、Wilmington、MA.)を、試験開始前に少なくとも1週間動物飼育施設に順応させた。使用した全ての実験手順はAmerican Physiology SocietyおよびGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsによって概説されたガイドラインと一致し、これらはInstitutional Animal Care and Use Committee of Boston Biomedical Inc.によっても承認された。動物は制御温度(68°F〜72°F)、光(12時間明−暗サイクル)、および湿度(45〜55%)を有する室内で、木材チップを敷き詰めたケージにおいて4群で飼育した。実験中、動物は水および食餌に自由にアクセスさせた。
非対称性干渉RNA(aiRNA)は、哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こす。
aiRNAによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズム。
aiRNAは、siRNAより迅速、強力、有効、および持続的な遺伝子サイレンシングを媒介する。
aiRNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性
次に本発明者らは、aiRNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性を調べた。本発明者らは最初に、野生型k−Ras対立遺伝子を標的化するaiRNAを分析した。DLD1細胞は野生型k−Rasを含有し、一方SW480細胞は1つの塩基対置換を有する突然変異体k−Rasを含有する(図14d)。野生型k−Rasを標的化するaiRNAでのDLD1細胞のトランスフェクションは有効なサイレンシングを示したが、SW480細胞において突然変異体k−Rasのサイレンシングは観察しなかった。これらのデータは、aiRNAが対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを媒介することを実証する。
aiRNAはin vivoにおいてsiRNAより有効である
aiRNAがin vivoにおいて有効であるかどうか調べるため、およびそれをsiRNAと比較するため、本発明者らは、ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるaiRNAおよびsiRNAの影響を試験した。
本願は、2007年8月27日に出願された米国仮特許出願第60/968,257号、2008年2月19日に出願された米国仮特許出願第61/029,753号、および2008年3月24日に出願された米国仮特許出願第61/038,954号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
該第1鎖が
該第2鎖が最長で17ヌクレオチドの長さを有するか、または該第1鎖との少なくとも1つのミスマッチを含有するか、または少なくとも1つの修飾を含有するとの条件つきで、該第1鎖は19〜25ヌクレオチドの長さを有し、該第2鎖は18〜24ヌクレオチドの長さを有する。
からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
18〜23ヌクレオチドの長さを有する第1鎖と12〜17ヌクレオチドの長さを有する第2鎖とを含み、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二本鎖領域を形成し、
前記第1鎖が1〜9ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能な二重鎖RNA分子。
(項目2)
前記第1鎖が、標的mRNA配列と少なくとも70%相補的な配列を含む、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目3)
前記5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、A、U、およびdTからなる群から選択される、項目1に記載のRNA分子。
(項目4)
前記二本鎖領域のGC含量が30%〜70%である、項目1に記載のRNA分子。
(項目5)
前記第1鎖が19〜23ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目6)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目7)
前記第2鎖が14〜16ヌクレオチドの長さを有する、項目6に記載の二重鎖RNA分子。
(項目8)
前記第2鎖が15ヌクレオチドの長さを有する、項目6に記載の二重鎖RNA分子。
(項目9)
前記第1鎖が2〜4ヌクレオチドの3’突出を有する、項目8に記載の二重鎖RNA分子。
(項目10)
前記第1鎖が3ヌクレオチドの3’突出を有する、項目8に記載の二重鎖RNA分子。
(項目11)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目12)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および/または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目13)
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目12に記載の二重鎖RNA分子。
(項目14)
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも1つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目13に記載の二重鎖RNA分子。
(項目15)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基である、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目16)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目17)
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その2’−OH基がH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基により置換され、各Rが独立にC1〜C6のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがF、Cl、Br、またはIである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目18)
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目19)
前記第1鎖が、少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目20)
前記少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが、3’突出、5’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される1つまたは複数の領域内にある、項目19に記載の二重鎖RNA分子。
(項目21)
前記第2鎖が、少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目11に記載の二重鎖RNA分子。
(項目22)
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目1に記載のRNA分子。
(項目23)
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目1に記載の二重鎖RNA分子と接触させるステップと、
前記二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子、核酸に対して前記二重鎖RNA分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む方法。
(項目24)
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖RNA分子を導入するステップを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、または局所(regional)投与からなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目24に記載の方法。
(項目27)
細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するための、項目23に記載の方法の使用。
(項目28)
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目23に記載の方法の使用。
(項目29)
前記標的遺伝子が、哺乳動物における疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する、項目23に記載の使用。
(項目30)
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目31)
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目32)
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目33)
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目23に記載の使用。
(項目34)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む試薬。
(項目35)
18〜23ヌクレオチドの長さを有する第1のRNA鎖と12〜17ヌクレオチドの長さを有する第2のRNA鎖とを含み、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二重鎖RNA分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖RNA分子が1〜9ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有し、
前記二重鎖RNA分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
(項目36)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を調製する方法であって、
前記第1鎖および前記第2鎖を合成するステップと、
前記二重鎖RNA分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
(項目37)
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖RNA分子内に少なくとも1種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記RNA鎖が、化学合成されるか、または生物学的に合成される、項目36に記載の方法。
(項目39)
少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された項目1に記載の二重鎖RNA分子をコードする1つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
(項目40)
第1の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第1鎖をコードする第1の核酸と、第2の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第2鎖をコードする第2の核酸とを含む、項目39に記載の発現ベクター。
(項目41)
項目39に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
(項目42)
項目39に記載のベクターを含む細胞。
(項目43)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む細胞。
(項目44)
哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である、項目43に記載の細胞。
(項目45)
第1鎖および第2鎖を含み、
前記第1鎖が前記第2鎖よりも長く、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二本鎖領域を形成し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である、二重鎖RNA分子。
(項目46)
前記二重鎖RNA分子の2つの末端が、1〜10ヌクレオチドの3’突出、0〜10ヌクレオチドの5’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目47)
前記第1鎖が標的mRNA配列と実質的に相補的である、項目45に記載のRNA分子。
(項目48)
前記第1鎖が、1〜8ヌクレオチドの3’突出と1〜8ヌクレオチドの5’突出とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目49)
前記第1鎖が、1〜10ヌクレオチドの3’突出と平滑末端とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目50)
前記第1鎖が、1〜10ヌクレオチドの5’突出と平滑末端とを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目51)
前記RNA二重鎖が、1〜8ヌクレオチドの2つの5’突出を有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目52)
前記RNA二重鎖が、1〜10ヌクレオチドの2つの3’突出を有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目53)
前記第1鎖が12〜100ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目54)
前記第1鎖が12〜30ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目55)
前記第1鎖が18〜23ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目56)
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目57)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目58)
前記第2鎖が5〜30ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目59)
前記第2鎖が12〜22ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目60)
前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目61)
前記第2鎖が15ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目62)
前記二本鎖領域が27bpである場合、前記RNA分子の両末端における突出が独立に3’突出または5’突出であるとの条件つきで、前記第1鎖が12〜30ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が10〜29ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目63)
前記第1鎖が18〜23ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目64)
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目65)
前記第1鎖が
(化4)
であり、
前記第2鎖が最長で17ヌクレオチドの長さを有するか、または前記第1鎖との少なくとも1つのミスマッチを含有するか、または少なくとも1つの修飾を含有するとの条件つきで、
前記第1鎖が19〜25ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が18〜24ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目66)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が12〜17ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目67)
前記第1鎖が21ヌクレオチドの長さを有し、前記第2鎖が14〜16ヌクレオチドの長さを有する、項目45に記載のRNA分子。
(項目68)
前記第1鎖が前記第2鎖よりも1〜10ヌクレオチド長い、項目45に記載のRNA分子。
(項目69)
前記3’突出が2〜6ヌクレオチドの長さを有する、項目46に記載のRNA分子。
(項目70)
前記5’突出が0〜5ヌクレオチドの長さを有する、項目46に記載のRNA分子。
(項目71)
前記遺伝子サイレンシングが、RNA干渉、翻訳の調節、およびDNAのエピジェネティック調節の1もしくは2つ、または全てを含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目72)
前記第1鎖および前記第2鎖の少なくとも1つにおいてニックをさらに含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目73)
前記二本鎖領域が1つまたは複数のヌクレオチドのギャップを含む、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目74)
5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、前記標的mRNA配列と相補的ではない、項目47に記載のRNA分子。
(項目75)
5’突出の少なくとも1つのヌクレオチドが、A、U、およびdTからなる群から選択される、項目45に記載のRNA分子。
(項目76)
ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートしている、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目77)
マッチしないかまたはミスマッチする少なくとも1つのヌクレオチドをさらに含む、項目45に記載のRNA分子。
(項目78)
前記二本鎖領域のGC含量が20〜70%である、項目45に記載のRNA分子。
(項目79)
3’突出および/または5’突出が、分解に対して安定化される、項目45に記載のRNA分子。
(項目80)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目81)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および/または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目82)
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目81に記載の二重鎖RNA分子。
(項目83)
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも1つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目82に記載の二重鎖RNA分子。
(項目84)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基を含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目85)
前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目86)
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その2’−OH基がH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基により置換され、各Rが独立にC1〜C6のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがF、Cl、Br、またはIである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目87)
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目88)
前記第1鎖が少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目89)
前記少なくとも1つのデオキシヌクレオチドが、3’突出、5’突出、および前記第1鎖の5’端に近接する二本鎖領域からなる群から選択される1つまたは複数の領域内にある、項目88に記載の二重鎖RNA分子。
(項目90)
前記第2鎖が少なくとも1つのデオキシヌクレオチドを含む、項目80に記載の二重鎖RNA分子。
(項目91)
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目92)
前記二重鎖RNA分子が単離二重鎖RNA分子である、項目45に記載の二重鎖RNA分子。
(項目93)
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目1に記載の二重鎖RNA分子と接触させるステップと、
前記二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子または核酸に対して前記二本鎖RNA分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップと
を含む方法。
(項目94)
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖RNA分子を導入するステップを含む、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、および局所(regional)投与からなる群から選択される、項目94に記載の方法。
(項目96)
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目93に記載の方法。
(項目97)
細胞または生物における遺伝子の発現を調節するための、項目93に記載の方法の使用。
(項目98)
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目93に記載の方法の使用。
(項目100)
前記標的遺伝子がヒトの疾患または動物の疾患と関連する遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目101)
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目102)
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目103)
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目104)
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目93に記載の使用。
(項目105)
in vitroまたはin vivoにおける薬剤標的の研究のための、項目93に記載の方法の使用。
(項目106)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む試薬。
(項目107)
第1のRNA鎖および第2のRNA鎖を含み、
前記第1鎖が前記第2鎖よりも長く、
前記第2鎖が前記第1鎖と実質的に相補的であり、前記第1鎖と二重鎖RNA分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖RNA分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
(項目108)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を調製する方法であって、
前記第1鎖および前記第2鎖を合成するステップと、
前記二重鎖RNA分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
(項目109)
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖RNA分子内に少なくとも1種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記RNA鎖が化学的に合成されるか、または生物学的に合成される、項目108に記載の方法。
(項目111)
前記第1鎖および前記第2鎖が、個々にまたは同時に合成される、項目108に記載の方法。
(項目112)
活性作用物質としての、少なくとも1種の項目1に記載の二重鎖RNA分子と、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、コレステロール、脂質、およびリポイドからなる群から選択される1種または複数種の担体とを含む医薬組成物。
(項目113)
有効量の項目112に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む治療法。
(項目114)
前記医薬組成物が、静脈内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、吸入投与、局所投与、および局所(regional)投与からなる群から選択される経路を介して投与される、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記第1鎖が、発生遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および酵素遺伝子、ならびに接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカインまたはその受容体、成長/分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体、キナーゼ、シグナル伝達物質の遺伝子、ウイルス遺伝子、感染性疾患の遺伝子、ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、およびYES、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53、WT1、ACPデサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼ、ADP−グルコースピロホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼもしくはペプチダーゼ(peptidease)、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、k−RAS、β−カテニン、Rsk1、PCNA、p70S6K、サバイビン、mTOR、PTEN、Parp1、またはp21からなる群から選択される遺伝子の標的mRNA配列と実質的に相補的な配列を含む、項目1に記載の二重鎖RNA分子。
(項目116)
からなる群から選択される、二重鎖RNA分子。
(項目117)
二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を有する第1の二重鎖RNA分子を修飾する方法であって、前記アンチセンス鎖が1〜8ヌクレオチドの3’突出と0〜8ヌクレオチドの5’突出とを有するように、前記センス鎖の長さを短くするステップと、第2の二重鎖RNA分子を形成するステップとを含み、
前記第1の二重鎖RNA分子の少なくとも1つの特性が改善される方法。
(項目118)
前記第2の二重鎖RNA分子が形成される条件下で、前記アンチセンス鎖とその短くしたセンス鎖とを組み合わせるステップをさらに含む、項目117に記載の方法。
(項目119)
前記第1の二重鎖RNA分子がsiRNAであるか、またはdicer基質siRNAであるか、またはsiRNA前駆体である、項目117に記載の方法。
(項目120)
少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された項目1に記載の二重鎖RNA分子をコードする1つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
(項目121)
第1の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第1鎖をコードする第1の核酸と、第2の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第2鎖をコードする第2の核酸とを含む、項目120に記載の発現ベクター。
(項目122)
項目120に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
(項目123)
項目120に記載の発現ベクターを含む細胞。
(項目124)
項目1に記載の二重鎖RNA分子を含む細胞。
(項目125)
項目124に記載の細胞は、哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である。
RNA干渉(RNAiと省略される)は、二本鎖RNA(dsRNA)によって誘導される一本鎖RNA(ssRNA)の標的破壊に関する細胞プロセスである。ssRNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)などの遺伝子転写物である。RNAiは、dsRNAが、dsRNAに相補的である配列を有する遺伝子の発現に特異的に干渉することができる転写後の遺伝子サイレンシングの形態である。dsRNA標的のアンチセンスRNA鎖は、リボヌクレアーゼによる切断に関するメッセンジャーRNA(mRNA)などの相補的遺伝子転写物を標的にする。
Elbashirらは、いくつかの非対称性二重鎖RNA分子、ならびに対称性siRNA分子を試験した(Elbashirら、2001c)。非対称性二重鎖RNA分子は、対応するsiRNA分子とともに表1に列挙される。
図1Aを参照すると、本発明の一実施形態において、二本鎖RNA分子は、第1鎖上に5’突出および3’突出の両方を有する。RNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、実質的に相補性の配列を有する少なくとも1つの二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。第1鎖上で、二本鎖領域に隣接して、5’末端および3’末端の両方上に非対応の突出が存在する。
一実施形態において、二重鎖RNA分子は、二本鎖領域、平滑末端、および5’突出または3’突出を含む(例えば、図2Aおよび2Bを参照されたい)。このRNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。
一実施形態において、二重鎖RNA分子は、二本鎖領域、および2つの3’突出、または2つの5’突出を含む(例えば、図2Cおよび2Dを参照されたい)。RNA分子は、第1鎖および第2鎖を含み、第1鎖と第2鎖は、二本鎖領域を形成し、第1鎖は、第2鎖より長い。
siRNAおよびmiRNAは、研究手段として広く使用され、薬剤候補として開発される。(例えば、Dykxhoorn、Novina & Sharp. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4巻:457〜467頁(2003年);Kim & Rossi、Nature Rev. Genet. 8巻:173〜184頁(2007年);de Fougerollesら Nature Rev. Drug Discov. 6巻:443〜453頁(2007年);Czech、NEJM 354巻:1194〜1195頁(2006年);およびMack、Nature Biotech. 25巻:631〜638頁(2007年)を参照されたい)。本発明の二重鎖RNA分子、すなわち、aiRNAは、当分野で既知のsiRNAおよびmiRNAから導出することができる。
aiRNA二重鎖の2つの一本鎖は、例えば、1つまたは複数のミスマッチを含む、少なくとも1つの非対応の領域、または不完全に対応した領域を有することができる。一実施形態において、非対応の、または不完全に対応した領域は、平滑末端を有する末端領域、3’−凹部または5’突出を有する末端領域、および5’凹部または3’突出を有する末端領域を含めた、RNA分子の少なくとも1つの末端領域である。本明細書で使用する場合、末端領域は、1つの末端および隣接する範囲を含む、RNA分子の領域である。
本発明のaiRNA分子の設計において、総GC含量は変化し得る。一実施形態において、二本鎖領域のGC含量は、20〜70%である。さらなる実施形態において、G−C対形成は、A−U対形成より強いので、鎖の分離をより容易にするために、二本鎖領域のGC含量は、50%未満、または好ましくは30〜50%である。
本発明のRNA分子内のヌクレオチドの1つまたは複数は、デオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と置換することができる。置換は、RNA分子内のどこにおいても、例えば、一方もしくは両方の突出領域、および/または二本鎖領域で起こり得る。場合によっては、置換により、RNA分子の物理的特性、例えば、鎖親和性、溶解度、およびRNase劣化に対する抵抗力、または別の方法で増強された安定性が増強される。
また、本発明は、細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法を提供する(サイレンシング法)。この方法は、選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下で前記細胞または生物を二重鎖RNA分子と接触させるステップ、二本鎖RNAに実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対して、前記二重鎖RNA分子により実施される選択的遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む。
本発明のRNA分子は、遺伝子機能を発見するための遺伝子操作されたノックアウトモデルとは対照的に、動物モデルにおける遺伝子の「ノックダウン」を作るために用いることができる。また、この方法は、in vitroにおいて遺伝子をサイレンシングするために用いることができる。例えば、aiRNAを細胞にトランスフェクトすることができる。aiRNAは、薬剤研究および開発における、薬物標的/経路同定および検証、ならびに他の生物医学研究における研究ツールとして1に用いることができる。
本発明のRNA分子は、(Czech、2006年;de Fougerollesら、2007年;Dykxhoornら、2003年;KimおよびRossi、2007年;Mack、2007年)に要約された疾患を含む様々な疾患または望ましくない状態の治療およびまたは予防のために用いることができる。
4.3.1 RNA分子の修飾
裸のRNA分子は、相対的に不安定であり、in vivoでは相対的に速やかに分解され得る。化学的修飾は、本発明のRNA分子に導入され、RNA分子の半減期を改善し、さらには、RNA分子の生物活性を低下させずに遺伝子標的化の非特異的な作用のリスクを低下させることができる。
RNAiの治療用途にとっての1つの主な障害は、標的細胞へのsiRNAの送達である(ZamoreおよびAronin(2003年))。様々な手法が、RNA分子、特にsiRNA分子の送達のために開発された(例えば、(de Fougerolles et al.,2007;Dykxhoorn et al.,2003年;Kim and Rossi,2007年)。当業者に既知の任意の送達手法を、本発明のRNA分子の送達のために使用することができる。
本発明は、医薬組成物をさらに提供した。医薬組成物は、活性薬剤として、少なくとも1つの非対称性二重鎖RNA分子と、医薬的担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノ乳剤、脂質、およびリポイドからなる群から選択される1つまたは複数の担体とを含む。一実施形態において、この組成物は、診断的適用、または治療的適用のためのものである。
細胞培養および試薬
Hela、SW480、DLD1、HT29、およびH1299細胞をATCCから入手し、10%のウシ胎児血清(FBS)、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのL−グルタミン(Invitrogen)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)はAllCells LLCから得て、10%FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI−1640培地(Invitrogen)中に維持した。この試験中に記載する小RNAはDharmacon、Qiagen、またはIntegrated DNA技術(表2)によって合成され、製造者の説明書に従いアニーリングした(図3a)。ヒトAgo2を標的とするsiRNA、およびDicer(Ambion)は100nMで使用した。RNAのトランスフェクションは示した濃度でDharmaFECT1(Dharmacon)を使用して実施した。ヒトArgonaute2(Ago2)発現ベクター(OriGene)は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。血清中安定性は、示した時間量のaiRNA二重鎖またはsiRNA二重鎖を10%ヒト血清(Sigma)とともにインキュベーション、次に非変性TBE−アクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって決定した。
in vitroでのAgo2−RISCローディング。
示したaiRNA、siRNAでトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後に示した時間時点で採取した。RNAはTRIZOLで単離し、qRT−PCRを、TaqManワンステップRT−PCR試薬および示したmRNA用のプライマープローブセット(Applied Biosystems)を使用して実施した。データは対照トランスフェクト細胞に対して表し、それぞれの試料はアクチンmRNAレベルに正規化する。図14d中の実験用に、HindIII−Xho1部位でのpcDNA3.1+またはpcDNA3.1−のいずれかへのStat3c DNA(Origene)のクローニングによってStat3構築物を作製した。次いでStat3順方向または逆方向発現ベクターを、24時間aiStat3またはsiStat3を用いてHela細胞にコトランスフェクトした。次いで細胞を採取し、TRIZOLによってRNAを単離し、TaqManワンステップRT−PCR試薬およびStat3またはアクチン用のプライマープローブセット(Applied Biosystems)を使用してqRT−PCRを実施した。RT−PCRは、Superscript ワンステップ RT−PCRキット(Invitrogen)およびStat3順方向(5’−GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC−3’(配列番号73))およびStat3逆方向(5’−TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG−3’(配列番号74))プライマーおよびアクチン順方向(5’−CCATGGATGATGATATCGCC−3’(配列番号75))およびアクチン逆方向(5’−TAGAAGCATTTGCGGTGGAC−3’(配列番号76))プライマーを使用して同じRNA試料で実施した。
全RNAはTRIZOLを使用して調製し、cDNAはランダムプライマーおよびThermoscript RT−PCR System(Invitrogen)を使用して合成した。PCRはPfxポリメラーゼを使用して20サイクルで実施した。プライマー:アクチン−1、5’CCATGGATGATGATATCGCC−3’(配列番号75);アクチン−2、5’−TAGAAGCATTTGCGGTGGAC−3’(配列番号76);β−カテニン−1、5’−GACAATGGCTACTCAAGCTG−3’(配列番号77);β−カテニン−2、5’−CAGGTCAGTATCAAACCAGG−3’(配列番号78)。
細胞を氷冷リン酸塩緩衝化食塩水で二回洗浄し、溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、0.5%のNonidet P−40、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、1mMのNaF、2mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および10μg/mlのそれぞれのペプスタチン、リューペプチン、およびアプロチニン)中で溶解した。20μgの可溶性タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、PVDF膜に移した。β−カテニン、Nbs1、サバイビン、p21、Rsk1、k−Ras、Stat3、PCNA、NQO1、アクチン(Santa Cruz)、EF2、p70S6K、mTOR、PTEN(Cell Signaling Technology)、Ago2(Wako)、Dicer(Novus)、およびParp1(EMD Biosciences)に対する一次抗体をこの試験中で使用した。抗原−抗体複合体は増強化学発光(GE Biosciences)によって目に見える状態にした。
非サイレンシングaiRNAまたはaiRNAで処理したHela細胞由来の全RNA(5μg)を、任意の事前処理なしでGeneRacer(商標)RNAアダプター(Invitrogen、5’−CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA−3’(配列番号79))と連結させた。連結RNAはランダムプライマーを使用してcDNAに逆転写した。切断産物を検出するために、RNAアダプターと相補的なプライマー(GeneRacer(商標)5’ネステッドプライマー:5’−GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA−3’(配列番号80))およびβ−カテニン特異的プライマー(GSP:5’−CGCATGATAGCGTGTCTGGAAGCTT−3’(配列番号81))を使用してPCRを実施した。増幅断片は1.4%アガロースゲルで分けて、1−kbのPlus DNAラダー(Invitrogen)を使用して分子量を決めた。特異的切断部位をDNA配列決定によってさらに確認した。
aiRNA二重鎖およびsiRNA二重鎖の配列および構造を表2中に挙げる。点突然変異の位置をk−Ras aiRNAにおいて枠で囲む。
それぞれの動物の健康状態の毎日の検査も実施した。体重を3日毎に調べた。食餌および水は動物飼育施設の手順に従い毎日供給した。20%を超える死亡率およびまたは20%を超える正味体重の減少をもたらした治療は毒性であると考えた。結果は平均腫瘍体積(mm3)±SEとして表す。0.05未満のP値は統計上関連があると考える。
オスまたはメスの無胸腺ヌードマウス4〜5週齢(Charles River Laboratories、Wilmington、MA.)を、試験開始前に少なくとも1週間動物飼育施設に順応させた。使用した全ての実験手順はAmerican Physiology SocietyおよびGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsによって概説されたガイドラインと一致し、これらはInstitutional Animal Care and Use Committee of Boston Biomedical Inc.によっても承認された。動物は制御温度(68°F〜72°F)、光(12時間明−暗サイクル)、および湿度(45〜55%)を有する室内で、木材チップを敷き詰めたケージにおいて4群で飼育した。実験中、動物は水および食餌に自由にアクセスさせた。
非対称性干渉RNA(aiRNA)は、哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こす。
aiRNAによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズム。
aiRNAは、siRNAより迅速、強力、有効、および持続的な遺伝子サイレンシングを媒介する。
aiRNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性
次に本発明者らは、aiRNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性を調べた。本発明者らは最初に、野生型k−Ras対立遺伝子を標的化するaiRNAを分析した。DLD1細胞は野生型k−Rasを含有し、一方SW480細胞は1つの塩基対置換を有する突然変異体k−Rasを含有する(図14d)。野生型k−Rasを標的化するaiRNAでのDLD1細胞のトランスフェクションは有効なサイレンシングを示したが、SW480細胞において突然変異体k−Rasのサイレンシングは観察しなかった。これらのデータは、aiRNAが対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを媒介することを実証する。
aiRNAはin vivoにおいてsiRNAより有効である
aiRNAがin vivoにおいて有効であるかどうか調べるため、およびそれをsiRNAと比較するため、本発明者らは、ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるaiRNAおよびsiRNAの影響を試験した。
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