ES2485848T3

ES2485848T3 - ARN de interferencia para el tratamiento de trastornos relacionados con la ganancia de función

Info

Publication number: ES2485848T3
Application number: ES04783980.8T
Authority: ES
Inventors: Neil Aronin; Phillip D. Zamore
Original assignee: University of Massachusetts Amherst
Current assignee: University of Massachusetts Amherst
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-13
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2024-09-13
Also published as: EP1670518B1; ES2808561T3; PT2821085T; EP2821085B1; WO2005027980A1; US20090118206A1; US7947658B2; EP2821085A2; EP3760234B1; CA2579638A1; CA2579638C; EP1670518A1; EP3760234A2; ES2969371T3; EP2821085A3; EP1670518A4; DK2821085T3; EP3760234A3

Abstract

Una cantidad efectiva de un agente de ARNi seleccionado de agentes de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington causada por una mutación en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función, dirigiendo un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad dentro del gen htt que codifica la proteína Huntingtina mutante, de tal manera que se presenta la interferencia específica de dicho gen, en donde el agente de ARNi se dirige a una región polimórfica en el gen que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.

Description

ARN de interferencia para el tratamiento de trastornos relacionados con la ganancia de función

Antecedentes de la invención

ARN de interferencia (ARNi) es el mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional específico de una secuencia, iniciado por los ARN bicatenarios (ARNbc) homólogos al gen que se suprime. Los ARNbc son procesados por Dicer, una ribonucleasa celular III, para generar dúplex de aproximadamente 21 nt con salientes 3' (ARN pequeño de interferencia, ARNpi) que median la degradación del ARNm específico de una secuencia. En células de mamíferos, las moléculas de ARNpi son capaces de silenciar específicamente la expresión génica sin inducción de la vía de respuesta inespecífica de interferón. Por lo tanto, los ARNpi se han convertido en una nueva y poderosa alternativa para otras herramientas genéticas tales como oligonucleótidos antisentido y ribozimas para analizar la función de los genes. Además, los ARNpi se están desarrollando con fines terapéuticos, con el fin de silenciar los genes causantes de enfermedades en los seres humanos.

Las enfermedades de repetición de trinucleótidos comprenden un grupo recientemente reconocido de trastornos hereditarios. La mutación genética común es un aumento en una serie de una repetición de trinucleótidos en particular. Hasta la fecha, la repetición de trinucleótidos más frecuente es CAG, que codifica para el aminoácido glutamina. Se conocen al menos 9 enfermedades de repetición de CAG y existen más de 20 variedades de estas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Kennedy y muchas enfermedades espinocerebelosas. Estos trastornos comparten un componente neurodegenerativo en el cerebro y / o la médula espinal. Cada enfermedad tiene un patrón específico de neurodegeneración en el cerebro y la mayoría tiene una herencia autosómica dominante.

El inicio de las enfermedades en general se produce alrededor de los 30 a 40 años de edad, pero en la enfermedad de Huntington repeticiones de CAG en el gen de la Huntingtina de > 60 presagiar un inicio juvenil.

La investigación reciente por parte de los presentes inventores ha demostrado que la mutación genética (aumento de la longitud de repeticiones de CAG desde normal <36 en el gen de la Huntingtina hasta > 36 en el caso de la enfermedad) se asocia con la síntesis de una proteína Huntingtina mutante, que tiene > 36 poliglutaminas (Aronin et al., 1995). También se ha demostrado que la proteína forma agregados citoplasmáticos e inclusiones nucleares (Difiglia et al., 1997) y se asocia con vesículas (Aronin et al., 1999). Las vías patógenas precisas no se conocen.

Se cree que la enfermedad de Huntington (y por implicación otras enfermedades de repetición de trinucleótidos) es causada, al menos en parte, por interacciones aberrantes de proteínas, que causan deterioro de procesos neuronales críticos, disfunción neuronal y en última instancia la muerte neuronal (neurodegeneración en áreas del cerebro llamadas el cuerpo estriado y corteza). En la búsqueda de un tratamiento efectivo para estas enfermedades, los investigadores en este campo destacaron la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y en un principio trataron de interceder al nivel de las presuntas interacciones de proteínas aberrantes. Sin embargo, no existe un tratamiento efectivo para la enfermedad de Huntington o de otras enfermedades causadas por repetición de trinucleótidos. Además, hoy en día se observa que múltiples procesos anormales pueden ser activos en estos tipos de enfermedad.

Resumen de la invención

La presente invención se define en y por medio de las reivindicaciones anexas.

Se han propuesto otros métodos basados en ARNi para la destrucción de genes mutantes en los que los ARNpi están dirigidos, por ejemplo, a una mutación puntual que se presenta en un solo alelo en el gen mutante (por ejemplo, la mutación puntual en el gen para la superóxido dismutasa (SOD) asociada con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)). Sin embargo, hay una diferencia clave entre la ELA y las enfermedades de repetición de trinucleótidos, tales como la enfermedad de Huntington. ELA tiene una mutación puntual en un alelo como el cambio genético, mientras que las enfermedades de repetición de trinucleótidos tienen una región de repetición de CAG expandida en un alelo como el cambio genético. El uso de ARNi contra la región de repetición expandida de CAG tiene complicaciones potenciales. Se sabe que existen más de 80 genes normales con regiones de repetición de CAG en las células. Por lo tanto, los ARNpi dirigidos a estas repeticiones de CAG no se pueden utilizar sin correr el riesgo de la destrucción generalizada de los ARNm que contiene la repetición de CAG normal. Del mismo modo, el enfoque en sitios no específicos de alelo daría lugar a la pérdida tanto de Huntingtina normal como mutante lo que provoca disfunción neuronal.

La invención utilizan la tecnología de ARN de interferencia (ARNi) contra regiones polimórficas seleccionadas (es decir, regiones que contienen polimorfismos específicos alélicos o específicos del alelo) que son distintos del sitio de mutación en los genes que codifican proteínas mutantes. La presente invención proporciona tratamientos efectivos para enfermedades por ganancia de función resultantes de mutaciones por supresión, mutaciones por inserción, mutaciones puntuales, y similares, siempre que el gen mutante codifique una proteína que tenga una función que

normalmente no esté asociada con una proteína de tipo silvestre.

La presente invención proporciona un tratamiento efectivo para la enfermedad de Huntington (HD). La invención también puede proporcionar tratamientos efectivos para otros trastornos por poliglutamina y / o una enfermedad por repetición de trinucleótidos, como se describe en detalle en la presente invención.

En una realización, la proteína mutante contiene una región de poliglutamina expandida. En otra realización, el gen que codifica la proteína mutante contiene una región de repetición de trinucleótidos expandida.

La invención puede utilizar agentes de ARNi homólogos a un polimorfismo alélico en el gen que codifica, por ejemplo, una proteína Huntingtina mutante para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. En una forma de realización preferida, el agente de ARNi puede dirigir un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P1-P5. En una forma de realización preferida adicional, el agente de ARNi puede dirigir un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P6-P43.

En una realización adicional, la invención proporciona agentes de ARNi que constan de una primera y una segunda cadena que contienen cada una 16 -25 nucleótidos. La primera cadena de la presente invención puede ser homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en la que la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda cadena incluye 16 -25 nucleótidos complementarios a la primera cadena. El agente de ARNi también puede tener una porción de bucle que comprende 4 -11, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conecta las dos secuencias de nucleótidos. La región objetivo de la secuencia de ARNm se puede localizar en una región 5' no traducida (UTR) o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

La invención proporcionar un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16 -25 nucleótidos homólogos a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína Huntingtina mutante. El constructo de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, un vector retroviral, un casete de expresión o un plásmido. El constructo de expresión puede tener también una secuencia del promotor de la ARN polimerasa II o una secuencia del promotor de la ARN Polimerasa II, tal como, el promotor de ARNpn U6 del promotor H1.

En aún otras formas de realización, la presente invención proporciona células huésped (por ejemplo, células de mamífero) que comprenden moléculas de ácido nucleico y constructos de expresión de la presente invención.

En incluso otras formas de realización, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1a -k: gen de la Huntingtina humana, secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) Figuras 2a -b: proteína Huntingtina humana, secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) Figura 3: Sentido (SEQ ID NO: 3) y antisentido (SEQ ID NO: 4) de la secuencia se ARN objetivo de la Huntingtina (htt) Figuras 4: Análisis termodinámico de los extremos 5’ de la cadena de ARNpi para el dúplex de ARNpi Figuras 5a -c: Reacciones de ARNi in vitro programadas con ARNpi que dirige un polimorfismo dentro del ARNm de la Huntingtina (htt). (a) ARNpi estándar. (b) ARNpi mejorado mediante la reducción de la fuerza de apareamiento de bases del extremo 5' de la cadena antisentido del dúplex de ARNpi. (c) ARNpi mejorado mediante la reducción del extremo 5' no emparejado de la cadena antisentido del dúplex de ARNpi. Figura 6a -b. ARNi de la proteína Htt endógena en células HeLa. (a) inmunotransferencia de la proteína Htt humana.

(b) Cuantificación de la misma.

Descripción detallada de la invención

La presente invención utiliza tecnología de interferencia de ARN (ARNi) contra los polimorfismos alélicos situados dentro de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función. El ARNi destruye el correspondiente ARNm mutante con especificidad y selectividad de nucleótidos. Agentes de ARN de la presente invención son dirigidos a las regiones polimórficas de un gen mutante, lo que resulta en la escisión del ARNm mutante. Estos agentes de ARN, actúan a través de una serie de interacciones proteína-nucleótido, para escindir los ARNm mutantes. Las células destruyen el ARNm escindido, impidiendo así la síntesis de la proteína mutante correspondiente por ejemplo, la proteína Huntingtina. La invención puede utilizar agentes de ARNi homólogos a un polimorfismo alélico en el gen que codifica, por ejemplo, una proteína Huntingtina mutante para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. El agente de ARNi

puede dirigir el polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P1-P5. El agente de ARNi puede dirigir un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P6-P43.

En una realización adicional, la invención proporciona agentes de ARNi que comprenden de una primera y una segunda cadenas cada una conteniendo 16-25 nucleótidos. La primera cadena de la presente invención es homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en donde la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda cadena incluye 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena. El agente de ARNi también puede tener una porción de bucle que comprende 4-11, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conectan las dos secuencias de nucleótidos. La región objetivo de la secuencia de ARNm se puede localizar en una región 5' no traducida (UTR) o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

La invención puede proporcionar un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homólogos a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína Huntingtina mutante. El constructo de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, un vector retroviral, un casete de expresión o un plásmido. El constructo de expresión también puede tener una secuencia del promotor de la ARN polimerasa II o una secuencia del promotor de la ARN Polimerasa II, tal como, el promotor de ARNpn U6 del promotor H1.

Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, se definen primero ciertos términos.

El término "nucleósido" se refiere a una molécula que tiene una base de purina o de pirimidina enlazada covalentemente a un azúcar de ribosa o de desoxirribosa. Los nucleósidos de ejemplo incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. Ejemplos adicionales de nucleósidos incluyen inosina, 1-metil inosina, seudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 2,2N,N-dimetilguanosina (también denominados como nucleósidos "raros"). El término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos en enlaces éster a la fracción de azúcar. Los ejemplos de nucleótidos incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósidos. Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan aquí de forma intercambiable y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos entre sí por un enlace fosfodiéster entre los átomos de carbono 5' y 3'.

El término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" se refiere a un polímero de ribonucleótidos. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. El ADN y el ARN se pueden sintetizar de forma natural (por ejemplo, por replicación del ADN o transcripción del ADN, respectivamente). El ARN puede ser post-transcripcionalmente modificado. El ADN y el ARN también se pueden sintetizar químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ADNmc y ARNmc, respectivamente) o multicatenarios (por ejemplo, bicatenarios, es decir, ADNbc y ARNbc, respectivamente). "ARNm" o "ARN mensajero" es ARN monocatenario que especifica la secuencia de aminoácidos de una o más cadenas polipeptídicas. Esta información se traduce durante la síntesis de proteína cuando los ribosomas se enlazan al ARNm.

Como se usa en la presente invención, el término "ARN pequeño de interferencia" ("ARNpi") (también denominado en la técnica como "ARN corto de interferencia") se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende entre aproximadamente 10-50 nucleótidos (o análogos de nucleótido) que es capaz de dirigir o mediar la interferencia de ARN. Preferiblemente, un ARNpi comprende entre aproximadamente 15-30 nucleótidos o análogos de nucleótido, más preferiblemente entre aproximadamente 16-25 nucleótidos (o análogos de nucleótido), aún más preferiblemente entre aproximadamente 18-23 nucleótidos (o análogos de nucleótido), y aún más preferiblemente entre aproximadamente 19-22 nucleótidos (o análogos de nucleótido) (por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nucleótido). El término ARNpi "corto" se refiere a un ARNpi que comprende ~21 nucleótidos (o análogos de nucleótido), por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos. El término ARNpi "largo" se refiere a un ARNpi que comprende ~24-25 nucleótidos, por ejemplo, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos. Los ARNpi cortos pueden, en algunos casos, incluir menos de 19 nucleótidos, por ejemplo, 16, 17 o 18 nucleótidos, siempre que el ARNpi más corto retenga la capacidad para mediar el ARNi. Del mismo modo, los ARNpi largos pueden, en algunos casos, incluir más de 26 nucleótidos, siempre que el ARNpi más largo retenga la capacidad para mediar el ARNi sin un procesamiento adicional, por ejemplo, un procesamiento enzimático, para un ARNpi corto.

El término "análogo de nucleótido" o "nucleótido alterado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no estándar, que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no son de origen natural. Los análogos de nucleótido preferidos se modifican en cualquier posición con el fin de alterar ciertas propiedades químicas del

nucleótido reteniendo aún la capacidad del análogo de nucleótido para llevar a cabo su función prevista. Ejemplos de las posiciones del nucleótido que puede ser sometidas a derivación incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2amino) propil uridina, 5-bromo uridina, 5-propino uridina, 5-propenil uridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2amino) propil uridina; la posición 8 para adenosina y / o guanosinas, por ejemplo, 8-bromo guanosina, 8-cloro guanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Los análogos de nucleótido también incluyen nucleótidos desaza, por ejemplo, 7desaza-adenosina; nucleótidos O-y N-modificados (por ejemplo, alquilados, por ejemplo, la N6-metil adenosina, o como también se conocen en el arte); y otros análogos de nucleótido modificados en forma heterocíclica tales como aquellos descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 agosto 10 (4): 297 -310.

Los análogos de nucleótido también pueden comprender modificaciones a la porción de azúcar de los nucleótidos. Por ejemplo, el grupo 2' OH puede ser reemplazado por un grupo seleccionado entre H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR, u OR, en donde R es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo C1-C6 sustituido o no sustituido, etc. Otras posibles modificaciones incluyen aquellas descritas en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.858.988, y

6.291.438.

El grupo fosfato del nucleótido también puede modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con azufre (por ejemplo, fosforotioatos), o haciendo otras sustituciones que permitan que el nucleótido lleve a cabo su función prevista, como se describe, por ejemplo, en Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 abril 10 (2): 117 -21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 octubre 10 (5): 333 45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 octubre 11 (5): 317 -25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 abril 11 (2): 77 -85, y la patente de los Estados Unidos No. 5.684.143. Algunas de las modificaciones anteriormente referenciadas (por ejemplo, modificaciones del grupo fosfato) disminuyen preferiblemente la velocidad de hidrólisis, por ejemplo, de polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polímero corto de nucleótidos y / o de análogos de nucleótido. El término "análogo de ARN" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido sintetizado químicamente) que tiene al menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN correspondiente no alterado o no modificado, pero que retiene la misma naturaleza o función o una similar que el correspondiente ARN inalterado o no modificado. Como se discutió anteriormente, los oligonucleótidos se pueden enlazar a través de los enlaces que dan como resultado una menor tasa de hidrólisis del análogo de ARN en comparación con una molécula de ARN con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, los nucleótidos del análogo pueden comprender enlaces metileno diol, etileno diol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarboniloxi, fosforodiamidato, fosforamidato, y / o fosforotioato. Los análogos de ARN preferidos incluyen ribonucleótidos y / o desoxirribonucleótidos modificados en su cadena principal y/o el azúcar. Tales alteraciones o modificaciones pueden incluir además de material no nucleotídico, tal como el(los) extremo(s) del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Un análogo de ARN sólo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tenga la capacidad para mediar la interferencia de ARN.

Como se usa aquí, el término "ARN de interferencia" ("ARNi") se refiere a una degradación intracelular selectiva del ARN. El ARNi se produce en las células de forma natural para remover los ARN foráneos (por ejemplo, ARN virales). El ARNi natural procede a través de fragmentos escindidos del ARNbc libre que dirige el mecanismo de degradación a otras secuencias de ARN similares. Alternativamente, el ARNi puede ser iniciado por la mano del hombre, por ejemplo, para silenciar la expresión de los genes objetivo.

Un agente de ARNi que tiene una cadena que es una "secuencia suficientemente complementaria con una secuencia de ARNm objetivo para dirigir la interferencia de ARN específica del objetivo (ARNi)" significa que la cadena tiene una secuencia suficiente para activar la destrucción del ARNm objetivo mediante la maquinaria o el proceso del ARNi.

Como se usa aquí, el término "ARN aislado" (por ejemplo, "ARNpi aislado" o "precursor de ARNpi aislado") se refiere a moléculas de ARN que están sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

El término "in vitro" tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, la participación de reactivos o extractos purificados, por ejemplo, extractos de células. El término "in vivo" también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, la participación de células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares, y / o células en un organismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, que se inserta por un medio artificial en una célula, y se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de la célula. Tal transgén puede incluir un gen que es parcial o totalmente heterólogo (es decir, foráneo) para el organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo. El término "transgén" también significa una molécula de ácido nucleico que incluye una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas, por ejemplo, los ADN que codifican uno o más precursores de ARN modificados por

ingeniería genética, para ser expresados en un organismo transgénico, por ejemplo, animal, que es en parte o enteramente heterólogo, es decir, foráneo, al animal transgénico, u homólogo a un gen endógeno del animal transgénico, pero que está diseñado para ser insertado en el genoma del animal en una ubicación que difiere de aquella del gen natural. Un transgén incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tal como intrones, necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionado, todos operativamente enlazados a la secuencia seleccionada, y pueden incluir una secuencia potenciadora.

Un gen "involucrado" en una enfermedad o trastorno incluye un gen, la expresión normal o aberrante o la función que afecta o causa la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma de dicha enfermedad o trastorno.

El término "mutación de ganancia de función" como se usa aquí, se refiere a cualquier mutación en un gen en el que la proteína codificada por dicho gen (i e., La proteína mutante) adquiere una función que normalmente no está asociada con la proteína (es decir, la proteína de tipo silvestre) lo que causa o contribuye a una enfermedad o trastorno. La mutación de ganancia de función puede ser una supresión, adición o sustitución de un nucleótido o nucleótidos en el gen que da lugar al cambio en la función de la proteína codificada. La mutación de ganancia de función cambia la función de la proteína mutante o causa interacciones con otras proteínas. La mutación de ganancia de función puede provocar una disminución o la remoción de la proteína de tipo silvestre normal, por ejemplo, por la interacción de la proteína mutante alterada, con dicha proteína de tipo silvestre normal.

El término "polimorfismo" como se usa aquí, se refiere a una variación (por ejemplo, una supresión, inserción, o sustitución) en una secuencia génica que se identifica o se detecta cuando se comparan la misma secuencia génica de diferentes fuentes de sujetos (pero del mismo organismo). Por ejemplo, un polimorfismo puede ser identificado cuando se comparan la misma secuencia del gen de diferentes sujetos (pero del mismo organismo). La identificación de tales polimorfismos es de rutina en la técnica, siendo similares las metodologías a aquellas utilizadas para detectar, por ejemplo, mutaciones puntuales de cáncer de mama. La identificación puede ser hecha, por ejemplo, a partir del ADN extraído de linfocitos de un sujeto, seguido de la amplificación de regiones polimórficas utilizando cebadores específicos para dicha región polimórfica. Alternativamente, el polimorfismo se puede identificar cuando se comparan dos alelos del mismo gen. Una variación en la secuencia entre dos alelos del mismo gen dentro de un organismo se denomina aquí como un "polimorfismo alélico". El polimorfismo puede estar en un nucleótido dentro de una región de codificación, pero, debido a la degeneración del código genético, no se codifica ningún cambio en la secuencia de aminoácidos. Alternativamente, las secuencias polimórficas pueden codificar un aminoácido diferente en una posición particular, pero el cambio en el aminoácido no afecta la función de la proteína. También se pueden encontrar regiones polimórficas en las regiones no codificantes del gen.

El término "dominio de poliglutamina," tal como se utiliza aquí, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que consiste de residuos de glutamina consecutivos enlazados a enlaces peptídicos. En una realización, la región consecutiva incluye al menos 5 residuos de glutamina.

El término "dominio expandido de poliglutamina" o "segmento expandido de poliglutamina", como se usa aquí, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que incluye al menos 35 residuos de glutamina consecutivos unidos por enlaces peptídicos. Tales segmentos expandidos se encuentran en sujetos afectados con un trastorno de poliglutamina, tal como se describe en el presente documento, ya sea que el sujeto haya demostrado o no que manifiesta síntomas.

El término "repetición de trinucleótidos" o "región de repetición de trinucleótidos" como se usa aquí, se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico por ejemplo, que consiste de repeticiones consecutivas de una secuencia particular de trinucleótidos. Las repeticiones de trinucleótidos pueden incluir al menos 5 secuencias consecutivas de trinucleótidos. Los ejemplos de secuencias de trinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, CAG, CGG, GCC, GAA, CTG, y / o CGG.

El término "enfermedades de repetición de trinucleótidos" como se utiliza aquí, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una región de repetición expandida de trinucleótidos situada dentro de un gen, siendo la región de repetición expandida de trinucleótidos la causante de la enfermedad o el trastorno. Los ejemplos de enfermedades de repetición de trinucleótidos incluyen, pero no se limitan a ataxia espinocerebelosa tipo 12, ataxia espinocerebelosa tipo 8, síndrome de X frágil, retardo mental de XE frágil, ataxia de Friedreich y la distrofia miotónica. Las enfermedades de repetición de trinucleótidos preferidas para el tratamiento de acuerdo con la presente invención son aquellas caracterizadas o causadas por una región de repetición expandida de trinucleótidos en el extremo 5' de la región de codificación de un gen, el gen que codifica una proteína mutante que causa o es la causante de la enfermedad o el trastorno. Ciertas enfermedades de trinucleótidos, por ejemplo, el síndrome de X frágil, donde la mutación no está asociada con una región de codificación pueden no ser adecuadas para el tratamiento de acuerdo con la presente invención, ya que no hay un ARNm adecuado para ser dirigido por el ARNi. En contraste, una enfermedad tal como la ataxia de Friedreich puede ser adecuada para el tratamiento de acuerdo con las metodologías de la invención porque, a pesar de que la mutación causante no está dentro de una región de codificación (es decir, se encuentra dentro de un intrón), la mutación puede estar dentro, por ejemplo, de un precursor de ARNm (por ejemplo, un precursor de ARNm empalme previamente).

El término "trastorno de poliglutaminas" como se usa aquí, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un expansión de las repeticiones (CAG)n en el extremo 5' de la región de codificación (que codifica por lo tanto una región expandida de poliglutamina en la proteína codificada). En una forma de realización, los trastornos de poliglutamina se caracterizan por una degeneración progresiva de las células nerviosas. Los ejemplos de trastornos de poliglutamina incluyen, pero no se limitan a: la enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa tipo 1, ataxia espinocerebelosa tipo 2, ataxia espinocerebelosa tipo 3 (también conocida como enfermedad de Machado-Joseph), y ataxia espinocerebelosa tipo 6, ataxia espinocerebelosa tipo 7 y atrofia dentato-rubro-pálido-Luisiana.

La frase "examen de la función de un gen en una célula u organismo" se refiere al examen o estudio de la expresión, actividad, función o fenotipo que surge de los mismos.

Diversas metodologías de la presente invención incluyen una etapa que implica la comparación de un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. para un "control adecuado", a que se hace referencia indistintamente en este documento como un "control adecuado". Un "control adecuado" o "control apropiado" es cualquier control o estándar familiar para alguien normalmente capacitado en la técnica útil para propósitos de comparación. Un "control adecuado" o "control apropiado" puede ser un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. determinado antes de la realización de una metodología de ARNi, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una tasa de transcripción, nivel de ARNm, tasa de traducción, nivel de proteína, actividad biológica, característica o propiedad celular, genotipo, fenotipo, etc. se pueden determinar antes de la introducción de un agente de ARNi de la invención en una célula u organismo. Un "control adecuado" o "control apropiado" puede ser un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc. determinado en una célula u organismo, por ejemplo, un control o una célula normal u organismo, que exhiba, por ejemplo, rasgos normales. Un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, función, característica, propiedad predefinida, etc.

Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Trastornos de poliglutamina

Los trastornos de poliglutamina son una clase de enfermedades o trastornos caracterizados por una mutación genética común. En particular, la enfermedad o los trastornos se caracterizan por una repetición expandida del trinucleótido CAG que da lugar, en la proteína codificada, a un tramo expandido de residuos de glutamina. Los trastornos de poliglutamina son similares en que las enfermedades se caracterizan por una degeneración progresiva de las células nerviosas. A pesar de sus similitudes, los trastornos de poliglutamina se presentan en diferentes cromosomas y por lo tanto se presentan en segmentos totalmente diferentes del ADN. Los ejemplos de trastornos de poliglutamina incluyen la enfermedad de Huntington, la atrofia dentato-rubro-pálido-Luisiana, atrofia espinobulbar muscular, ataxia espinocerebelosa tipo 1, ataxia espinocerebelosa tipo 2, ataxia espinocerebelosa tipo 3, ataxia espinocerebelosa tipo 6 y ataxia espinocerebelosa tipo 7 (Tabla 3).

Tabla 1. Trastornos poliglutamina

Enfermedad Gen: Locus Proteína Tamaño de la repetición CAG Normal Enfermedad

Atrofia espinobulbar muscular (enfermedad de Kennedy) AR Enfermedad de Huntington HD Atrofia dentato-rubro-pálido-Luisiana (síndrome de Haw-River) DRPLA Ataxia espinocerebelosa tipo 1 SCA1 Ataxia espinocerebelosa tipo 2 SCA2 Ataxia espinocerebelosa tipo 3 (enfermedad de Machado-Joseph) SCA3 (MJD1) Ataxia espinocerebelosa tipo 6 SCA6 Ataxia espinocerebelosa tipo 7 SCA7: Xq13-21 Receptor andrógeno (AR) 9-36 38-62 4p16.3 Huntingtina 6-35 36-121 12p13.31 Atrofina-1 6-35 49-88 6p23 Ataxina-1 6-44a 39-82 12q24.1 Ataxina-2 15-31 36-63 14q32.1 Ataxina-3 12-40 55-84 19p13 Subunidad del canal de calcio que depende del voltaje α1A 4-18 21-33 13p12-13 Ataxina-7 4-35 37-306

a Los alelos con 21 o más repeticiones son contienen tramos de CAG.: interrumpidos por 1-3 unidades CAT; los alelos de enfermedad

Los trastornos de poliglutamina de la invención se caracterizan por (por ejemplo, los dominios que tienen aproximadamente entre 30 a 35 residuos de glutamina, aproximadamente entre 35 a 40 residuos de glutamina, 45 aproximadamente entre 40 a 45 residuos de glutamina y tienen alrededor de 45 o más residuos de glutamina. El dominio de poliglutamina contiene típicamente residuos de glutamina consecutivos (Q n > 36).

II. Enfermedad de Huntington

La enfermedad de Huntington, hereda como una enfermedad autosómica dominante, provoca deterioro de la cognición y enfermedad motora. Los pacientes pueden vivir más de una década con una debilidad severa, antes de la muerte prematura por hambre o infección. La enfermedad comienza en la cuarta o quinta década de la mayoría de los casos, pero un subgrupo de pacientes manifiesta la enfermedad en la adolescencia. La mutación genética para la enfermedad de Huntington es una repetición de CAG alargada en el gen de la Huntingtina. La repetición de CAG varía en número de 8 a 35 en los individuos normales (Kremer et al., 1994). La mutación genética por ejemplo, un aumento de la longitud de la repeticiones de CAG desde normal hasta menos de 36 en el gen de la Huntingtina hasta más de 36 en la enfermedad se asocia con la síntesis de una proteína Huntingtina mutante, que tiene más de 36 poliglutamatos (Aronin et al., 1995). En general, los individuos con 36 o más repeticiones de CAG tendrán la enfermedad de Huntington. Prototípico de hasta veinte otras enfermedades con un CAG alargado como la mutación subyacente, la enfermedad de Huntington todavía no tiene ninguna terapia efectiva. Una variedad de intervenciones -tales como la interrupción de las rutas apoptóticas, la adición de reactivos para reforzar la eficiencia mitocondrial, y el bloqueo de los receptores NMDA -han demostrado ser prometedores en cultivos celulares y en el modelo de ratón de la enfermedad de Huntington. Sin embargo, en el mejor de estos enfoques se pone de manifiesto una corta prolongación de la supervivencia celular o animal.

La enfermedad de Huntington cumple con el dogma central de la genética: un gen mutante sirve como una plantilla para la producción de un ARNm mutante; el ARNm mutante entonces dirige la síntesis de una proteína mutante (Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997). La Huntingtina mutante (proteína) probablemente se acumula en neuronas selectivas en el cuerpo estriado y la corteza, interrumpe hasta aquí actividades celulares determinadas, y causa disfunción neuronal y la muerte (Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001). Debido a que una sola copia de un gen mutante es suficiente para causar la enfermedad de Huntington, el tratamiento más parsimonioso volvería al gen mutante ineficaz. Enfoques teóricos podrían incluir la detención de la transcripción del gen de la Huntingtina mutada, la destrucción del ARNm mutante, y el bloqueo de la traducción. Cada uno tiene el mismo resultado -la pérdida de la Huntingtina mutante.

III. Gen de la Huntingtina

El gen de la enfermedad relacionada con la enfermedad de Huntington se llama Huntington o (htt). El locus de la Huntingtina es grande, abarcando 180 kb y que consiste de 67 exones. El gen de la Huntingtina se expresa ampliamente y es necesario para el desarrollo normal. Se expresa como 2 formas alternativamente poliadeniladas que muestran diferente abundancia relativa en diversos tejidos fetales y adultos. El transcripto más grande es de aproximadamente 13,7 kb y se expresa predominantemente en el cerebro fetal y de adultos, mientras que el transcripto más pequeño de aproximadamente 10,3 kb es más ampliamente expresado. Los dos transcriptos difieren con respecto a sus regiones 3' no traducidas (Lin et al., 1993). Se predice que ambos mensajes codifican una proteína de 348 kilodaltons que contiene 3144 aminoácidos. Se cree que el defecto genético que conduce a la enfermedad de Huntington confiere una nueva propiedad en el ARNm o altera la función de la proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína Huntingtina humana se expone en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2).

Una secuencia de nucleótidos consenso del gen de Huntingtina humana (ADNc) se expone en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). La región de codificación consiste de los nucleótidos 316 -9750 de la SEQ ID NO: 1. Las dos señales de poliadenilación alternativas se encuentran en los nucleótidos 10.326 a 10.331 y los nucleótidos 13.644 a 13649, respectivamente. Los dos sitios de poliadenilación correspondientes se encuentran en los nucleótidos 10348 y 13672, respectivamente. La primera señal / sitio de poliadenilación es aquella del transcripto de 10,3 kb. La segunda señal / sitio de poliadenilación es aquella del transcripto de 13,7 kb, el transcripto predominante en el cerebro.

Se identificaron cinco (5) polimorfismos en el gen htt humano como se describe en el Ejemplo l. Se han identificado 38 polimorfismos adicionales en la secuencia del gen de la Huntingtina a través del análisis de SNP (polimorfismo de nucleótido único) (véase la Tabla 3). Los polimorfismos expuestos en las Tablas 2 y 3 representan los sitios preferidos para dirigir a través de un solo nucleótido específico de ARNi, como se describe en este documento.

Tabla 2. Sitios polimórficos (P) en el gen htt de líneas celulares humanas.

Línea celular: P1 (2886) P2 (4034) P3 (6912) P4 (7222) P5 (7246)

GFP-Htt (constructo de 9 kb): C G A T C

HeLa: t a A g C

HEK 293T: t a G g t

HepG2: t a G g t

FP-4: t a g, A g t, C

Tabla 3. Sitios polimórficos (P) en el gen htt humano identificados por el análisis de SNP.

consenso: polimorfismo db xref

complemento 103: G A P6 dbSNP:396875

complemento 432: T C P7 dbSNP:473915

complemento 474: C A P8 dbSNP:603765

1509: T C P9 dbSNP:1065745

complemento 1857: T C P10 dbSNP:2301367

3565: G C, A P11,P12 dbSNP:1065746

3594: T G P13 dbSNP:1143646

3665: G C P14 dbSNP:1065747

complemento 4122: G A P15 dbSNP:363099

complemento 4985: G A P16 dbSNP:363129

complemento 5480: T G P17 dbSNP:363125

6658: T G P18 dbSNP:1143648

complemento 6912: T C P19 dbSNP:362336

complemento 7753: G A P20 dbSNP:3025816

complemento 7849: G C P21 dbSNP:3025814

complemento 8478: T C P22 dbSNP:2276881

8574: T C P23 dbSNP:2229985

complemento 9154: C A P24 dbSNP:3025807

9498: T C P25 dbSNP:2229987

complemento 9699: G A P26 dbSNP:362308

complemento 9809: G A P27 dbSNP:362307

complemento 10064: T C P28 dbSNP:362306

complemento 10112: G C P29 dbSNP:362268

complemento 10124: G C P30 dbSNP:362305

complemento 10236: T G P31 dbSNP:362304

complemento 10271: G A P32 dbSNP:362303

complemento 10879: G A P33 dbSNP:1557210

complemento 10883: G A P34 dbSNP:362302

complemento 10971: C A P35 dbSNP:3025805

complemento 11181: G A P36 dbSNP:362267

complemento 11400: C A P37 dbSNP:362301

11756..11757: G - P38 dbSNP:5855774

12658: G A P39 dbSNP:2237008

complemento 12911: T C P40 dbSNP:362300

complemento 13040: G A P41 dbSNP:2530595

13482: G A P42 dbSNP:1803770

13563: G A P43 dbSNP:1803771

La presente invención está dirigida a la Huntingtina mutada utilizando ARN de interferencia (Hutvagner et al., 2002). Una cadena de ARN bicatenario (ARNbi) complementa una región polimórfica en el ARNm de la Huntingtina mutada. Después de la introducción del ARNpi en las neuronas, el ARNpi se desenrolla parcialmente, se enlaza a la región

5 polimórfica dentro del ARNm de la Huntingtina de una manera específica del sitio, y activa una ARNm nucleasa. Esta nucleasa escinde el ARNm de la Huntingtina, deteniendo de esta forma la traducción de la Huntingtina mutante. Las células mismas se deshacen del ARNm parcialmente digerido, lo que impide la traducción, o las células digieren proteínas parcialmente traducidas. Las neuronas sobreviven en la Huntingtina de tipo silvestre (a partir del alelo normal); este enfoque evita los estragos de la Huntingtina mutante mediante la eliminación de su producción.

IV. Diseño del ARNpi

Los ARNpi se diseñan de la siguiente manera. En primer lugar, se selecciona una porción del gen objetivo (por ejemplo, el gen htt) que incluye el polimorfismo. Los ejemplos de polimorfismos se seleccionan de la región 5' no 15 traducida de un gen objetivo. La escisión del ARNm en estos sitios debería eliminar la traducción de la proteína mutante correspondiente. Los polimorfismos de otras regiones del gen mutante también son adecuados para manipulación dirigida. Se diseña una cadena sentido con base en la secuencia de la porción seleccionada. Preferiblemente, la porción (y la cadena sentido correspondiente) incluye cerca de 19 a 25 nucleótidos, por ejemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. Más preferiblemente, la porción (y la correspondiente cadena sentido) 20 incluye 21, 22 o 23 nucleótidos. La persona capacitada en la técnica apreciará, sin embargo, que los ARNpi que tienen una longitud de menos de 19 nucleótidos o mayor a 25 nucleótidos también pueden funcionar para mediar ARNi. En consecuencia, los ARNpi de tal longitud están también dentro del alcance de la presente invención siempre que conserven la capacidad de mediar el ARNi. Se ha demostrado que agentes de ARNi más largos provocan una respuesta de interferón o de PKR en ciertas células de mamífero que pueden ser indeseables. 25 Preferiblemente, los agentes de ARNi de la invención no provocan una respuesta de PKR (es decir, son de una longitud suficientemente corta). Sin embargo, agentes de ARNi más largos pueden ser útiles, por ejemplo, en tipos

de células incapaces de generar una respuesta de PRK o en situaciones en las que la respuesta de PKR ha sido subregulada o moderada por medios alternativos.

La secuencia de cadena sentido se diseña de tal manera que el polimorfismo esté esencialmente en el medio de la cadena. Por ejemplo, si se elige un ARNpi de 21 nucleótidos, el polimorfismo se encuentra, por ejemplo, en los nucleótidos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 (es decir, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos del extremo 5' de la cadena sentido. Para un ARNpi de 22 nucleótidos, el polimorfismo se encuentra, por ejemplo, en los nucleótidos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNpi de 23 nucleótidos, el polimorfismo se encuentra, por ejemplo, en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNpi de 24 nucleótidos, el polimorfismo se encuentra, por ejemplo, en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 16. Para un ARNpi de 25 nucleótidos, el polimorfismo se encuentra, por ejemplo, en 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17. Moviendo el polimorfismo a una posición fuera del centro puede, en algunos casos, reducir la eficiencia de la escisión por el ARNpi. Tales composiciones, es decir, las composiciones menos eficientes, pueden ser deseables para ser usadas si se detecta apagado del silenciamiento del ARNm de tipo silvestre.

La cadena antisentido es habitualmente de la misma longitud que la cadena sentido e incluye nucleótidos complementarios. Las cadenas pueden ser totalmente complementarias, es decir, las cadenas son de extremos romos cuando se alinean o se hibridan. Las cadenas se pueden alinear o hibridar de tal manera que se generan salientes de 1, 2 o 3 nucleótidos, es decir, el extremo 3' de la cadena sentido se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más lejos que el extremo 5' de la cadena antisentido y / o el extremo 3' de la cadena antisentido se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más lejos que el extremo 5' de la cadena sentido. Los salientes pueden comprender (o consistir de) los nucleótidos correspondientes a la secuencia del gen objetivo (o complemento del mismo). Alternativamente, los salientes pueden comprender (o consistir de) desoxirribonucleótidos, por ejemplo los dT, o análogos de nucleótidos, u otro material no nucleótido adecuado.

Para facilitar la entrada de la cadena antisentido en RISC (y por lo tanto aumentar o mejorar la eficiencia de la escisión y el silenciamiento objetivo), la resistencia del par de bases entre el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido puede ser alterada, por ejemplo, disminuida o reducida, tal como se describe en detalle en las solicitudes de patente provisionales Nos. 60/475.386, titulada "Métodos y composiciones para controlar la eficacia del silenciamiento del ARN" (presentada el 2 de junio de 2003) y 60/475.331, titulada "Métodos y composiciones para mejorar la eficacia y especificidad del ARNi" (presentada el 2 de junio de 2003). La resistencia del par de bases puede ser menor debido a menos pares de bases G:C entre el extremo 5' de la primera cadena o la cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o la cadena sentido que entre el extremo 3' de la primera cadena o la cadena antisentido y el extremo 5' de la segunda cadena o la cadena sentido. La resistencia del par de bases puede ser menor debido a al menos un par de bases no coincidentes entre el extremo 5' de la primera cadena

o la cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o la cadena sentido. Preferiblemente, se selecciona el par de bases no coincidentes del grupo que consiste de G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U. La resistencia del par de bases puede ser menor debido a por lo menos un par de bases que oscila, por ejemplo, G:U, entre el extremo 5' de la primera cadena o la cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o la cadena sentido. La resistencia del par de bases es menor debido a por lo menos un par de bases que comprende un nucleótido raro, por ejemplo, inosina (I). Preferiblemente, el par de bases se selecciona del grupo que consiste de un I:A, I:U y I:C. La resistencia del par de bases es menor debido a por lo menos un par de bases que comprende un nucleótido modificado. El nucleótido modificado se puede seleccionar del grupo que consiste de 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6diamino-G, y 2, 6-diamino-A.

El diseño de los ARNpi adecuados para dirigir los polimorfismos htt expuestos en la Tabla 2 se describe en detalle a continuación

P1 ADN TGTGCTGACTCTGAGGAACAG sentido UGUGCUGACUCUGAGGAACAG antisentido ACACGACUGAGACUCCUUGUC (salientes de 2 nt) véase la Figura 5: (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (extremos romos, 21 mer) (SEQ ID NO: 7)

P2 ADN sentido antisentido: CATACCTCAAACTGCATGATG CAUACCUCAAACUGCAUGAUG GUAUGGAGUUUGACGUACUAC (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) (extremos romos, 21 mer) (SEQ ID NO: 10)

P3 ADN sentido antisentido: GCCTGCAGAGCCGGCGGCCTA GCCUGCAGAGCCGGCGGCCUA CGGACGUCUCGGCCGCCGGAU (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (extremos romos, 21 mer) (SEQ ID NO: 13)

P4 ADN sentido antisentido: ACAGAGTTTGTGACCCACGCC ACAGAGUUUGUGACCCACGCC UGUCUCAAACACUGGGUGCGG (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) (extremos romos, 21 mer) (SEQ ID NO: 16)

P5 ADN: TCCCTCATCTACTGTGTGCAC (SEQ ID NO: 17)

sentido: UCCCUCAUCUACUGUGUGCAC (SEQ ID NO: 18)

antisentido: AGGGAGUAGAUGACACACGUG (extremos romos, 21 mer) (SEQ ID NO: 19)

Los ARNpi se pueden diseñar de acuerdo con las enseñanzas de los ejemplos anteriores para cualquier otro de los polimorfismos encontrados en el gen htt. Además, la tecnología es aplicable para dirigir cualquier otro gen de la enfermedad que tenga polimorfismos asociados, es decir, polimorfismos que no causan enfermedad.

Para validar la efectividad con que los ARNpi destruyen los ARNm mutantes (por ejemplo, el ARNm de la Huntingtina mutante), el ARNpi se incuba con ADNc mutante (por ejemplo, ADNc de Huntingtina mutante) en un sistema de expresión de ARNm in vitro con base en Drosophila. Los ARNm mutantes sintetizados recientemente, marcados en forma radioactiva con 32P, (por ejemplo, ARNm de Huntingtina mutante) se detectan autorradiográficamente en un gel de agarosa. La presencia de ARNm mutante escindido indica la actividad de ARNm nucleasa. Los controles adecuados incluyen la omisión de ARNpi y el uso de ADNc de la Huntingtina de tipo silvestre. Alternativamente, se seleccionan los ARNpi de control que tengan la misma composición de nucleótidos que el ARNpi seleccionado, pero sin complementariedad de secuencia significativa con el gen objetivo apropiado. Dichos controles negativos pueden diseñarse mezclando en forma aleatoria la secuencia de nucleótidos del ARNpi seleccionado; puede llevarse a cabo una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carezca de homología con cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, los ARNpi de control negativo pueden ser diseñados mediante la introducción de uno o más faltas de correspondencia de bases en la secuencia.

Los sitios de complementación de ARNpi -ARNm se seleccionan de tal manera que den lugar a una especificidad óptima de ARNm y una escisión máxima del ARNm.

Aunque la presente invención ofrece principalmente el direccionamiento de regiones polimórficas en el gen mutante objetivo (por ejemplo, en htt mutante) distinto de la mutación de la región expandida de CAG, la persona capacitada en la técnica apreciará que el direccionamiento de la región mutante puede tener aplicabilidad como estrategia terapéutica en ciertas situaciones. El direccionamiento de la región mutante se puede lograr utilizando ARNpi que complemente CAG en serie. El ARNpicag se enlazaría a los ARNm con complementación de CAG, pero puede esperarse que tenga una mayor oportunidad de enlazarse a una serie extendida de CAG. Múltiples ARNpicag se enlazarían al ARNm de Huntingtina mutante (en contraposición con una menor cantidad para el ARNm de Huntingtina de tipo silvestre); por lo tanto, es más probable que se escinda el ARNm de la Huntingtina mutante. La inactivación exitosa de ARNm utilizando este enfoque también eliminaría el ARNm de la Huntingtina normal o de tipo silvestre. Otros genes normales también podrían ser inactivados, al menos en cierta medida (aproximadamente 70) que también tienen repeticiones de CAG, donde sus ARNm podrían interactuar con el ARNpi. Este enfoque contaría por lo tanto con una estrategia de desgaste -más del ARNm de la Huntingtina mutante sería destruido que del ARNm de la Huntingtina de tipo silvestre o los otros aproximadamente 69 ARNm que codifican para poliglutaminas.

V. Agentes de ARNi

La presente invención incluye moléculas de ARNpi diseñadas, por ejemplo, como se describió anteriormente. Las moléculas de ARNpi de la invención se pueden sintetizar químicamente, o pueden transcribirse in vitro a partir de una plantilla de ADN, o in vivo, por ejemplo, a partir de ARNph, o, mediante el uso de la enzima DICER humana recombinante, para escindir in vitro las plantillas de ARNbc transcrito en grupos de ARNi que median el ARN dúplex de 20, 21 o 23 pb. Las moléculas de ARNpi se pueden diseñar usando cualquier método conocido en la técnica.

En lugar del agente de ARNi que es un ácido ribonucleico de interferencia, por ejemplo, un ARNpi o ARNph como se describió anteriormente, el agente de ARNi puede codificar un ácido ribonucleico de interferencia, por ejemplo, un ARNph, como se describió anteriormente. En otras palabras, el agente de ARNi puede ser una plantilla transcripcional del ácido ribonucleico de interferencia. Por lo tanto, los agentes de ARNi de la presente invención también pueden incluir los ARN pequeños de horquilla (ARNph), y constructos de expresión modificados por ingeniería genética para expresar los ARNpi. La transcripción de los ARNph se inicia en el promotor de una polimerasa III (pol III), y se cree que se termina en la posición 2 de un sitio de terminación de la transcripción de 4-5timina. Tras la expresión, se cree que los ARNph se pliegan en una estructura de tallo-bucle con salientes de 3'UU; posteriormente, se procesan los extremos de estos ARNph, convirtiendo los ARNph en moléculas del tipo ARNpi de aproximadamente 21 -23 nucleótidos (Brummelkamp et al., 2002;... Lee et al., 2002, ver más arriba; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, ver más arriba; Paul et al., 2002, ver más arriba;. Sui et al., 2002, ver más arriba; Yu et al., 2002, ver más arriba. Más información sobre el diseño y el uso de ARNph se puede encontrar en Internet en las siguientes direcciones: Katahdin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRIBamHI_Strategy.pdf y Katahdin.cshl.org: 9331/ RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf.

Los constructos de expresión de la presente invención incluyen cualquier constructo adecuado para su uso en el sistema de expresión apropiado e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, casetes de expresión lineal, plásmidos y vectores virales o derivados de virus, tal como se conoce en la técnica. Tales constructos de expresión pueden incluir uno o más promotores inducibles, sistemas promotores de ARN Pol III tales como promotores de

ARNpn U6 o promotores de ARN polimerasa III H1, u otros promotores conocidos en la técnica. Los constructos pueden incluir una o ambas cadenas del ARNpi. Los constructos de expresión que expresan ambas cadenas también pueden incluir estructuras de bucle que unen las dos cadenas, o cada cadena puede ser transcrita por separado a partir de promotores separados dentro del mismo constructo. Cada cadena también puede transcribirse a partir de un constructo de expresión separado (Tuschl, T., 2002, ver más arriba).

Los ARNpi sintéticos pueden ser suministrados a células mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo la transfección de liposomas catiónicos y electroporación. Sin embargo, estos ARNpi exógeno en general, muestran la persistencia de corto plazo del efecto de silenciamiento (4-5 días en células cultivadas), que puede ser beneficioso en sólo ciertas formas de realización. Para obtener una supresión a largo plazo de los genes objetivo (es decir, genes mutantes) y para facilitar el suministro bajo ciertas circunstancias, se puede expresar uno o más ARNpi dentro de las células de constructos de ADN recombinante. Tales métodos para expresar dúplex de ARNpi dentro de las células de constructos de ADN recombinante para permitir la supresión del gen objetivo a más largo plazo en las células son conocidos en la técnica, incluyendo sistemas promotores Pol III de mamíferos (por ejemplo, sistemas promotores de U6/ARNpn (Tuschl, T., 2002, ver más arriba) capaces de expresar los ARNpi bicatenarios funcionales; (Bagella et al., 1998;. Lee et al., 2002, ver más arriba; Miyagishi et al., 2002, ver más arriba; Paul et al., 2002, ver más arriba; Yu et al., 2002), ver más arriba; Sui et al., 2002, ver más arriba). La terminación de la transcripción por la ARN Pol III se produce en corridas de cuatro residuos T consecutivos en la plantilla de ADN, proporcionando un mecanismo para poner fin a la transcripción de ARNpi en una secuencia específica. El ARNpi es complementario a la secuencia del gen objetivo en orientaciones 5’ -3' y 3' -5', y las dos cadenas del ARNpi se puede expresar en el mismo constructo o en constructos separados. Los ARNpi de horquilla, dirigidos por el promotor de ARNpn H1 o U6 y expresado en células, puede inhibir la expresión del gen objetivo (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, ver más arriba; Miyagishi et al., 2002, ver más arriba; Paul et al., 2002, ver más arriba; Yu et al., 2002), ver más arriba; Sui et al., 2002, ver más arriba). Los constructos que contienen la secuencia de ARNpi bajo el control del promotor de T7 también vuelven los ARNpi funcionales cuando se cotransfectan en las células con un vector que expresa ARN polimerasa de T7 (Jacque et al., 2002, ver más arriba). Un solo constructo puede contener múltiples secuencias que codifican para los ARNpi, tal como múltiples regiones del gen que codifica htt mutante, dirigiendo el mismo gen o genes múltiples, y puede ser dirigidos, por ejemplo, por sitios del promotor PolIII separado.

Las células animales expresan una serie de ARN no codificante de aproximadamente 22 nucleótidos llamado micro ARN (miARN) que puede regular la expresión génica a nivel post transcripcional o translacional durante el desarrollo animal. Una característica común de los miARN es que todos ellos son cortados de un tallo-bucle de ARN precursor de 70 nucleótidos, probablemente por Dicer, una enzima de tipo ARNasa III, o un homólogo de la misma. Mediante la sustitución de las secuencias madre del precursor de miARN con una secuencia complementaria al ARNm objetivo, se puede utilizar un constructo de vector que expresa el precursor modificado por ingeniería genética para producir los ARNpi para iniciar el ARNi contra objetivos de ARNm específicos en células de mamífero (Zeng et al., 2002, ver más arriba). Cuando se expresa por medio de vectores de ADN que contienen promotores de polimerasa III, los bucles diseñados de micro ARN pueden silenciar la expresión génica (McManus et al., 2002, ver más arriba). Los micro ARN que dirigen polimorfismos también pueden ser útiles para bloquear la traducción de proteínas mutantes, en ausencia de silenciamiento de genes mediado por ARNpi. Tales aplicaciones pueden ser útiles en situaciones, por ejemplo, donde un ARNpi diseñado causó silenciamiento fuera del objetivo de proteína de tipo silvestre.

Los mecanismos de suministro mediados por virus también se pueden utilizar para inducir el silenciamiento específico de genes objetivo a través de la expresión de ARNpi, por ejemplo, mediante la generación de adenovirus recombinantes que albergan ARNpi bajo el control de transcripción del promotor de ARN Pol II bajo (Xia et al., 2002, ver más arriba). La infección de células HeLa por estos adenovirus recombinantes permite una expresión disminuida del gen objetivo endógeno. La inyección de los vectores de adenovirus recombinantes en ratones transgénicos que expresan los genes objetivo de los ARNpi da como resultado la reducción in vivo de la expresión del gen objetivo. Id. En un modelo animal, la electroporación de todo el embrión puede suministrar eficientemente ARNpi sintético en embriones de ratón posteriores a la implantación (Calegari et al., 2002). En ratones adultos, el suministro eficiente de ARNpi se puede lograr mediante la técnica de suministro a "alta presión", una inyección rápida (en un lapso de 5 segundos) de un gran volumen de ARNpi que contiene solución en animales a través de la vena de la cola (Liu et al., 1999, ver más arriba; McCaffrey et al., 2002, ver más arriba; Lewis et al., 2002. También se pueden utilizar nanopartículas y liposomas para suministrar ARNpi en animales.

Las composiciones de ácido nucleico de la invención incluyen tanto los ARNpi modificados como los ARNpi no modificados como se conoce en la técnica, tales como los derivados de ARNpi entrecruzados o los derivados que tienen fracciones que no son de nucleótidos enlazadas, por ejemplo a sus extremos 5' o 3'. La modificación de los derivados de ARNpi de esta forma puede mejorar la captación celular o mejorar las actividades de direccionamiento celular de los derivados de ARNpi resultantes en comparación con el ARNpi correspondiente, son útiles para rastrear el derivado de ARNpi en la célula, o mejorar la estabilidad del derivado de ARNpi en comparación con el correspondiente ARNpi.

Los precursores de ARN modificados por ingeniería genética, introducidos en las células u organismos enteros tal como se describe en el presente documento, dará lugar a la producción de una molécula de ARNpi deseada. Tal molécula de ARNpi se asociará entonces con los componentes de proteína endógena de la ruta del ARNi para unirse y dirigir una secuencia de ARNm específica para la escisión y destrucción. De esta manera, el ARNm que es dirigido por el ARNpi generado a partir del precursor de ARN modificado por ingeniería genética se agotará en la célula u organismo, llevando a una disminución en la concentración de la proteína codificada por ese ARNm en la célula u organismo. Los precursores de ARN son típicamente moléculas de ácido nucleico que codifican de forma individual o bien una cadena de un ARNbc o codifican toda la secuencia de nucleótidos de una estructura de bucle en horquilla de ARN.

Las composiciones de ácido nucleico de la invención pueden ser no conjugadas o pueden conjugarse con otra fracción, tal como una nanopartícula, para mejorar una propiedad de las composiciones, por ejemplo, un parámetro farmacocinético tal como la absorción, la eficacia, la biodisponibilidad, y / o la vida media. La conjugación puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos de Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47 (1), 99 -112 (2001) (describe ácidos nucleicos cargados en nanopartículas de polialquilcianoacrilato (PACA)); . Fattal et al., J. Control Release 53 (1-3): 137 -43 (1998) (describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4: 55 -8 (1994) (describe ácidos nucleicos ligados a agentes de intercalación, grupos hidrófobos, policationes o nanopartículas de PACA); y Godard et al., Eur. J. Biochem. 232 (2): 404 -10 (1995) (describe ácidos nucleicos ligados a nanopartículas).

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden marcar usando cualquier método conocido en la técnica; por ejemplo, las composiciones de ácido nucleico pueden marcarse con un fluoróforo, por ejemplo, Cy3, fluoresceína, o rodamina. La marcación puede llevarse a cabo utilizando un kit, por ejemplo, el kit de marcación de ARNpi SILENCERMR (Ambion). Además, se puede marcar en forma radioactiva el ARNpi, por ejemplo, utilizando 3H, 32P, u otro isótopo apropiado.

Además, debido a que se cree que el ARNi progresa a través de al menos un producto intermedio de ARN monocatenario, la persona capacitada en la técnica apreciará que también se puede diseñar ARNpi-mc (por ejemplo, la cadena antisentido de un ARNpi-bc) (por ejemplo, mediante síntesis química), generar (por ejemplo, generar enzimáticamente) o expresar (por ejemplo, a partir de un vector o un plásmido) como se describe en el presente documento y utilizado de acuerdo a las metodologías reivindicadas. Además, en invertebrados, el ARNi puede ser activado de manera efectiva mediante los ARNbc largos (por ejemplo, los ARNbc de aproximadamente 100 -1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 200 -500, por ejemplo, de aproximadamente 250, 300, 350, 400 o 450 nucleótidos de longitud) que actúan como efectores de ARNi. (Brondani et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 2001, 4 de diciembre; 98 (25): 14428 -33. Epub 2001, 27 de noviembre).

VI. Métodos para introducir los ARN, vectores y células huésped

Los métodos físicos para la introducción de ácidos nucleicos incluyen la inyección de una solución que contiene el ARN, el bombardeo por partículas cubiertas por el ARN, remojar la célula o el organismo en una solución del ARN, o la electroporación de las membranas celulares en presencia del ARN. Un constructo viral empaquetado en una partícula viral conseguiría tanto introducción eficiente de un constructo de expresión en la célula como la transcripción del ARN codificado por el constructo de expresión. Se pueden utilizar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en las células, tales como el transporte por el portador mediado por lípidos, el transporte mediado por productos químicos, tal como fosfato de calcio, y similares. Por lo tanto, se puede introducir el ARN junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: mejorar la absorción de ARN por la célula, inhibir la hibridación de cadenas sencillas, estabilizar las cadenas sencillas, o bien aumentar la inhibición del gen objetivo.

El ARN puede ser introducido directamente en la célula (es decir, intracelularmente); o introducido extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducido oralmente, o puede ser introducido mediante el baño de una célula u organismo en una solución que contiene el ARN. La circulación vascular o extravascular, la sangre o el sistema linfático, y el líquido cefalorraquídeo son sitios en los que se puede introducir el ARN.

La célula que tiene el gen objetivo puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, de división o de no división, parénquima o epitelio, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que se diferencian incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, células sanguíneas, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, y células de las glándulas endocrinas o exocrinas.

Dependiendo del gen objetivo particular y de la dosis de material de ARN bicatenario suministrado, este proceso puede proporcionar una pérdida parcial o completa de la función para el gen objetivo. Una reducción o pérdida de la expresión génica en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más de las células objetivo es ejemplar. La

inhibición de la expresión génica se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de proteína y / o del producto de ARNm de un gen objetivo. La especificidad se refiere a la capacidad de inhibir el gen objetivo sin efectos evidentes sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar mediante el examen de las propiedades exteriores de la célula u organismo (como se presenta a continuación en los ejemplos) o por técnicas bioquímicas tales como hibridación de la solución de ARN, la protección de la nucleasa, hibridación tipo Northern, transcripción inversa, el seguimiento de la expresión génica con un microarreglo, enlazamiento de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), transferencia tipo Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos, y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS).

Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular o de todo el organismo, se ensaya convenientemente la expresión del gen mediante el uso de un gen reportero o de resistencia a fármacos cuyo producto proteico se ensaya fácilmente. Tales genes reporteros incluyen la acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta galactosidasa (LacZ), beta glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Múltiples marcadores seleccionables se encuentran disponibles que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición que es mayor al 10%, 33%, 50%, 90%, 95% o 99% en comparación con una célula no tratada de acuerdo con la presente invención. Las dosis más bajas de material inyectado y los tiempos más largos después de la administración del agente de ARNi pueden resultar en la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 90%, o 95% de las células objetivo). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición a nivel de la acumulación de ARNm objetivo o traducción de la proteína objetivo. Como ejemplo, la eficiencia de la inhibición puede determinarse mediante la evaluación de la cantidad de producto génico en la célula; el ARNm puede ser detectado con una sonda de hibridación que tenga una secuencia de nucleótidos fuera de la región usada para el ARN bicatenario inhibidor, o el polipéptido traducido puede ser detectado con un anticuerpo producido contra la secuencia de polipéptido de esa región.

El ARN se puede introducir en una cantidad que permite el suministro de al menos una copia por célula. Las dosis más altas (por ejemplo, por lo menos 5, 10, 100, 500 o 1.000 copias por célula) de material pueden producir una inhibición más efectiva; dosis más bajas también pueden ser útiles para aplicaciones específicas.

La eficacia de un agente de ARNi de la invención (por ejemplo, un ARNpi dirigido a un polimorfismo en un gen mutante) puede ser analizado por su capacidad para degradar específicamente ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de htt mutante y / o la producción de proteína Huntingtina mutante) en las células, en particular, en las neuronas (por ejemplo, líneas clonales neuronales corticales o de cuerpo estriado y / o de neuronas primarias). También son adecuados para ensayos de validación con base en células otras células fácilmente transfectables, por ejemplo, células HeLa o células COS. Las células se transfectan con los ADNc mutantes o de tipo silvestre humanos (por ejemplo, ADNc de Huntingtina mutante o de tipo silvestre humano). Se cotransfectan ARNpi estándar, ARNpi modificado o vectores capaces de producir ARNpi modificadas a partir de ARNm de bucle en forma de U. Se mide la reducción selectiva en ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de Huntingtina mutante) y / o la proteína mutante (por ejemplo, la Huntingtina mutante). La reducción de ARNm mutante o de proteína se puede ser comparar con los niveles de ARNm normal o de proteína. El ARNm normal o la proteína introducidos exógenamente (o el ARNm normal exógeno o la proteína) se pueden analizar para propósitos de comparación. Cuando se utilizan células neuronales, que se sabe que son algo resistentes a las técnicas de transfección estándar, puede ser deseable introducir agentes de ARNi (por ejemplo, los ARNpi) mediante absorción pasiva.

VII. Métodos de tratamiento:

La presente invención permite métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) una enfermedad o trastorno causado, en su totalidad o en parte, por una proteína mutante de ganancia de función. La enfermedad o el trastorno pueden ser una enfermedad o trastorno causados por repetición de trinucleótidos. La enfermedad o el trastorno puede ser un trastorno por poliglutaminas. La enfermedad o el trastorno puede ser un trastorno asociado con la expresión de Huntingtina y en el que la alteración de la Huntingtina, especialmente la amplificación del número de copias de repetición de CAG, conduce a un defecto en el gen de la Huntingtina (estructura o función) o proteína Huntingtina (estructura o función o expresión), de tal manera que las manifestaciones clínicas incluyen aquellas observadas en pacientes con enfermedad de Huntington.

"Tratamiento", o "tratar" como se usa en el presente documento, se definen como la aplicación o administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARN o vector o transgén que lo codifica) a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que padece la enfermedad o el trastorno, un síntoma de enfermedad o del trastorno o una predisposición hacia una enfermedad o trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, medrar o afectar la enfermedad

o el trastorno, los síntomas de la enfermedad o el trastorno, o la predisposición hacia la enfermedad.

La invención proporciona un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o trastorno como se describió anteriormente, mediante la administración al sujeto de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARNi o vector o transgén que lo codifique). Los sujetos con riesgo de padecer la enfermedad pueden ser identificados, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe aquí. La administración de un agente profiláctico puede presentarse antes de la manifestación de los síntomas característicos de la enfermedad o el trastorno, de manera que se evitan la enfermedad o el trastorno o, alternativamente, se retrasa su progreso.

La invención se refiere a métodos de tratamiento de sujetos terapéuticamente, es decir, la alteración del inicio de los síntomas de la enfermedad o el trastorno. La invención puede implicar poner en contacto una célula que expresa un mutante de ganancia de función con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARNi o un vector o transgén que codifica al mismo) que es específico para un polimorfismo en el gen, de tal manera que se consigue la interferencia específica de la secuencia con el gen. Estos métodos pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, mediante la administración del agente a un sujeto).

Con respecto tanto a los métodos profilácticos como a los terapéuticos de tratamiento, tales tratamientos pueden ser adaptados o modificados específicamente, con base en el conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. "Farmacogenómica", como se usa aquí, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como la secuenciación de genes, genética estadística, y análisis de expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un medicamento (por ejemplo, el "fenotipo de respuesta a los fármacos", o el "genotipo de respuesta al fármaco" de un paciente). Por lo tanto, la invención proporciona métodos para adaptar el tratamiento profiláctico o el tratamiento terapéutico de un individuo, ya sea con las moléculas del gen objetivo de la presente invención o los moduladores de genes objetivo de acuerdo con el genotipo de respuesta al fármaco de ese individuo. La farmacogenómica permite que un médico o especialista clínico dirija tratamientos profilácticos o terapéuticos a los pacientes que más se beneficiarán del tratamiento y para evitar el tratamiento de los pacientes que experimentan efectos secundarios relacionados con fármacos tóxicos.

Los agentes terapéuticos pueden ser probados en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, se puede utilizar un agente de ARNi (o vector de expresión o transgén que lo codifica) como se describe en la presente memoria en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede utilizar un agente terapéutico en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Por ejemplo, se puede utilizar un agente en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con tal agente. Alternativamente, se puede utilizar un agente en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente.

VIII. Composiciones farmacéuticas

La invención se refiere a los usos de los agentes descritos anteriormente para tratamientos profilácticos y / o terapéuticos como se describe más adelante. En consecuencia, los moduladores (por ejemplo, agentes de ARNi) de la presente invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína, anticuerpo, o compuesto modulador y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, su uso en las composiciones está contemplado. Compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de rutas de administración incluyen parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), y la administración transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede tenerse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua

bacteriostática, Cremóforo ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o amortiguador salino de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida de tal manera que permita ser inyectada fácilmente. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden colocar en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas, o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se hacen buches y se expectora o se traga. Agentes de enlazamiento farmacéuticamente compatibles, y / o se pueden incluir materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo, o aromatizante de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de un atomizador de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a ser permeada en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr a través del uso de atomizadores nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles, o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos capacitados en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente a través de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el

sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de formación de composiciones de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes. Aunque los compuestos que exhiben efectos tóxicos secundarios pueden utilizarse, se debe tener cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la EC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra la mitad de una respuesta máxima) tal como se determina en cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase, o dispensador junto con instrucciones para la administración.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

A diferencia de otros tipos de enfermedades autosómicas dominantes, la enfermedad de Huntington no contiene una mutación puntual, por ejemplo) el cambio de un solo nucleótido. Por lo tanto, la estrategia para diseñar un ARNpi dirigido contra una mutación puntual en el alelo de la enfermedad no se puede implementar. En lugar de ello, la presente invención dirige los ARNpi diseñados contra los polimorfismos en el gen de la Huntingtina, de los cuales hay unos 30 disponibles en el GenBank. La presente invención también identifica el polimorfismo en el alelo de la enfermedad de Huntington que difiere del alelo de tipo silvestre, de manera que el ARNpi destruye sólo el ARNm de la enfermedad y deja intacto el ARNm del alelo de tipo silvestre (normal). Por lo tanto, sólo se destruye la proteína Huntingtina mutante y la proteína normal queda intacta.

Ejemplo I: Pruebas de agentes de ARNi (por ejemplo, los ARNpi) contra htt mutante en lisados de Drosophila

Se diseñó un ARNpi dirigido a la posición 2886 en el ARNm de htt como se describió anteriormente. La secuencia del ARNpi se representa en la Figura 5a (SEQ ID NO: 24 sentido; 25 antisentido). Se desprotegió el ARN sintético (Dharmacon) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se hibridaron cadenas de ARNpi (Elbashir et al., 2001a).

Se prepararon los ARN objetivo como sigue. Se transcribieron los ARN objetivo con ARN polimerasa T7 recombinante, marcada con histidina, a partir de productos de PCR como se describe (Nykänen et al., 2001; Hutvágner et al., 2002). Las plantillas de PCR para htt sentido y antisentido se generaron por amplificación de 0,1 ng / ml (concentración final) de la plantilla de plásmido que codifica el ADNc de htt usando los siguientes pares de cebadores: objetivo sentido de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG TAT GTCTCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'-AAG UUCG UAU UCC GCG UAC GU-3' (SEQ ID NO: 31); objetivo anti-sentido de htt, 5'-GCG TAA TAC GAG TCA CTA TAG GAC AAG CCT AAT TAG TGA TGC-3' (SEQ ID NO: 32) y 5'-GAA CAG TAT GTC TCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO: 33).

Se analizó el ARNpi usando un ensayo in vitro de ARNi, con lisados de embriones de Drosophila. Las reacciones in vitro y el análisis de ARNi se llevaron a cabo como se describió anteriormente (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000; Haley et al., 2003). Se usaron los ARN objetivo en concentraciones de ~ 5 nM de modo que las reacciones se encuentran principalmente bajo condiciones de una sola rotación. La escisión del objetivo bajo estas condiciones es proporcional a la concentración de ARNpi. La figura 5a muestra la eficiencia del ARNpi dirigido contra la posición 2886 en el htt mutante. Los datos demuestran claramente que el ARNpi dirige la escisión del objetivo sentido hasta un mayor grado que el observado para el

objetivo antisentido. Sin embargo, se observa que este ARNpi diseñado primero no produjo una molécula muy activa, al menos en este ensayo in vitro. El análisis termodinámico de la resistencia del par de bases en los dos extremos del dúplex de ARNpi indicaron resistencias de las pares de bases más o menos equivalentes. La Figura 4 representa el análisis termodinámico de ARNpi sentido (SEQ ID NO: 20; 22, respectivamente) y antisentido (SEQ ID NO: 21; 23, respectivamente) de los extremos 5' de la cadena para el dúplex de ARNpi en 5a. Se calculó ∆G (kcal / mol)en NaCl1 Ma 37 ºC.

Para mejorar la eficacia del dúplex de ARNpi diseñado, se modificó el extremo 5' de la cadena sentido o la posición 19 de la cadena antisentido del ARNpi de htt probado en la Figura 5a para producir dúplex de ARNpi en los que el extremo 5’ de la cadena sentido estaba ya sea totalmente desapareada (Figura 5c; SEQ ID NO: 28 sentido, SEQ ID NO: 29 antisentido) o en un par de bases A:U (Figura 5b; SEQ ID NO: 26 sentido, SEQ ID NO: 27 antisentido). El desapareamiento del extremo 5' de una cadena de ARNpi -la cadena sentido -en este caso hace que la cadena funcione para la exclusión de la otra cadena. Cuando el extremo 5’ de la cadena sentido de htt estaba presente en un par de bases A:U y el extremo 5’ de la cadena antisentido de htt estaba en un par G:C, la cadena sentido dominó la reacción (Figura 5b-c), pero la cadena antisentido de htt retuvo una actividad similar a la observada para el ARNpi originalmente diseñado.

Ejemplo II: ARNi desactivado de la proteína htt en células cultivadas

En un primer experimento, se ensayaron los ARNpi que dirigen un polimorfismo en el ARNm de htt (es decir, el polimorfismo en la posición 2886 en el ARNm de htt) para determinar su capacidad para subregular la proteína htt endógena en células HeLa. Las células HeLa se cultivaron y transfectaron de la siguiente manera. Se mantuvieron células HeLa a 37 ºC en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades / ml de penicilina y 100 µg / ml de estreptomicina (Invitrogen). Se pasaron regularmente las células en subconfluencia y se sembraron hasta un 70% de confluencia 16 horas antes de la transfección. La transfección transitoria mediada por LipofectaminaMR (Invitrogen) de los ARNpi se realizó en placas de 6 pozos por duplicado (Falcon) como se describe para líneas de células adherentes por el fabricante. Se añadió una mezcla de transfección estándar que contenía ARNpi 100-150 nM y 9-10 µl de LipofectaminaMR en 1 ml de OPTI-MEM® (Invitrogen) reducido en suero a cada pozo. Se incubaron las células en mezcla de transfección a 37 ºC durante 6 horas y después se cultivaron en DMEM libre de antibióticos. Para el análisis de transferencias tipo Western en diferentes intervalos de tiempo, se recogieron las células transfectadas, se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Invitrogen), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80 ºC para el análisis.

Se ensayaron tres ARNpi contra a una secuencia objetivo común en el exón 1 y cuatro ARNpi se ensayaron para el polimorfismo de la posición 2886. Se realizó el análisis de transferencias tipo Western como sigue. Se recogieron las células tratadas con ARNpi como se describió anteriormente y se lisaron en amortiguador de lisis del reportero enfriado en hielo (Promega) que contenía inhibidor de proteasa (completo, libre de EDTA, 1 tableta/ 10 ml de amortiguador, Roche Molecular Biochemicals). Después del aclaramiento de los lisados resultantes por centrifugación, se cuantificó la proteína en los lisados claros mediante el kit de ensayo de proteína Dc (Bio-Rad). Se resolvieron las proteínas en 60 µg de lisado celular total mediante 10% de SDS -PAGE, se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Bio-Rad), y se inmunotransfirieron con anticuerpos contra CD80 (Santa Cruz). Se visualizó el contenido de proteína con un kit de transferencia de quimioluminiscencia BM (Roche Molecular Biochemicals). Se expusieron las transferencias a una película de rayos X (Kodak MR-1) durante diferentes tiempos (30 s hasta 5 min). La Figura 6a presenta los resultados del análisis Western. La tubulina sirvió como control de carga. Los datos se cuantificaron y normalizaron en la Figura 6b. De los ARNpi analizados, 2886-4, mostraron en forma reproducible una mayor eficacia en las células HeLa cultivadas (Figura 6). Este ARNpi también mostró en forma reproducible una eficacia mejorada in vitro (no se muestra). El ARNpi de GFP es un ARNpi de control que no comparte homología de secuencia con el ARNm de htt.

Se pueden analizar igualmente los ARNpi contra regiones polimórficas en el ARNm de htt en células transfectadas con ADNc de htt humano o en células transfectadas con constructos del reportero de htt. Cotransfecciones transitorias mediadas por LipofectaminaMR (Invitrogen) de los ADNc o plásmidos reporteros y los ARNpi se llevan a cabo como se describió anteriormente. Para analizar la capacidad de los ARNpi para dirigir los constructos reportados de htt, se utilizó ARNi para inhibir la expresión de GFP-htt en líneas de células HeLa humanas cultivadas. En resumen, se transfectaron las células HeLa con dúplex de ARNpi de GFP-htt, dirigiendo la secuencia de ARNm de GFP-htt. Para analizar los efectos de ARNi contra GFP-htt, se prepararon lisados de células tratadas con dúplex de ARNpi dúplex en diversos momentos después de la transfección. Se llevaron a cabo experimentos de transferencias tipo Western como se describió anteriormente. En resumen, se recogieron las células HeLa en diversos momentos después de la transfección, se resolvió su contenido de proteína en 10% de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, y se hicieron inmunotransferencias con anticuerpos apropiados. Los resultados de este estudio indicaron que el ARNpi contra GFP puede eliminar la expresión de la expresión de GFP-htt en las células HeLa transfectadas con el gen GFP-htt. Para los estudios dirigidos se introduce exógenamente htt, los procedimientos son como se describió, excepto que los anticuerpos anti-Htt se utilizan para inmunotransferencia.

El ARNi se puede utilizar para inhibir la expresión de htt en las células neuronales cultivadas también. Los ejemplos de células incluyen líneas de células PC12 (Scheitzer et al., Thompson et al.) y NT3293 (Tagle et al.) como se describió anteriormente. Los ejemplos de células adicionales incluyen células transfectadas de forma estable, por ejemplo, células neuronales o células derivadas neuronalmente. Las líneas de células PC12 que expresan el exón 1 del gen de la Huntingtina humana (Htt) se pueden usar aunque la expresión del exón 1 reduce la supervivencia de las células. Las células PC12 con GFP-Htt que tienen un gen GFP-Htt inducible también se pueden usar para analizar o validar la eficacia de ARNpi.

Ejemplo III: suministro de ARNpi de Htt en un entorno in vivo

Los modelos de ratones R6/2 (que expresan el producto de ADNc de htt humano htt de R6/2) son un modelo animal aceptado para estudiar la eficacia del suministro de ARNpi en un entorno in vivo. Se utilizaron ratones R6/2 modificados por ingeniería genética para probar la eficacia de ARNpi en el extremo 5' del ARNm de Huntingtina. Se inyectó ARNpi de Htt en el cuerpo estriado de ratones R6/2 a través de una bomba Alzet. Los ratones fueron tratados durante 14 días con el sistema de suministro de la bomba Alzet / ARNpi.

Los resultados de este estudio indicaron que dos ratones que recibieron el ARNpi con Trans-IT TKO (Mirus), ya sea como una solución de 20 o 200 nM a razón de 0,25 µl/hora no mostraron deterioro de la discapacidad motora desde el día 67 al día 74. En general, se espera que estos R6/2 tengan una reducción continua en una barra en rotación más allá del día 60.

Referencias

Aronin et al., Neuron, Nov; 15(5): 1193 -201 (1995) Aronin et al., Phil Trans Royal Society, June 29; 354 (1386): 995 -1003 (1999) Bagella et al., J. Cell. Physiol. 177: 206 -213 (1998) Brummelkamp et al., Science 296: 550 -553 (2002) Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(22): 14236 -40 (2002) Difiglia et al., Science, Sep 26;277(5334): 1990 -3 (1997) Elbashir et al., Genes Dev 15, 188 -200 (2001a) Haley et al., Methods 30, 330 -336 (2003) Hutvágner and Zamore, Science 297, 2056 -2060 (2002) Jacque et al., (2002) Kremer et al., (1994) Laforet et al., J. Neurosci., Dec 1; 21(23): 9112 -23 (2001) Lee et al., EMBO J. 21: 4663 -4670 (2002) Lewis et al., Nature Genetics 32: 107 -108 (2002) Lin et al., (1993) Liu et al., (1999) McCaffrey et al., Gene Ther. 2002 Dec; 9(23): 1563 (2002) McManus et al., RNA 8, 842 -850 (2002) Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20: 497 -500 (2002) Nykänen et al., Cell 107, 309 -321 (2001) Paddison et al., Genes Dev 16, 948 -958 (2002) Paul et al., Nat Biotechnol 20, 505 -508 (2002) Scheitzer et al. Sui et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 5515 -5520 (2002) Tagle et al. Thompson et al. Tuschl, T., Nat Biotechnol. 2002 May; 20(5): 446 -8 (2002) Tuschl et al., Genes Dev 13, 3191 -3197 (1999) Xia et al., (2002) Yohrling G.J. et al., Mol Cell Neurosci. May; 23(1): 28 -38 (2003) Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 6047 -6052 (2002) Zamore et al., Cell 101, 25 -33 (2000) Zamore et al., Nature Medicine, volumen 9 Número 3 páginas 266 -267 (2003) Zeng et al., (2002)

Listado de secuencias

<110> University of Massachusetts ARONIN, Neil ZAMORE, Phillip D.

<120> ARN DE INTERFERENCIA PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS RELACIONADOS CON LA GANANCIA DE FUNCIÓN

<130> UMY-083PC

<150> 60/502678

<151> 2003-09-12

<160> 33

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

10 <210> 1

<211> 13672

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 1

<210> 2

<211> 3144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

5: <210> 3 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> constructo sintético <400> 3 ugcagcugau caucgaugug cugacccuga ggaacaguuc 40

31

5: <210> 4 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> constructo sintético

<400> 4 gaacuguucc ucagggucag cacaucgaug aucagcugca: 40

15: <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 5 tgtgctgact ctgaggaaca g: 21

25: <210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 6 ugugcugacu cugaggaaca g: 21

35: <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 7 cuguuccuca gagucagcac a: 21

45: <210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

55: <400> 8 catacctcaa actgcatgat g <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial 21

<220> <223> constructo sintético

65: <400> 9 cauaccucaa acugcaugau g 21

5: <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> constructo sintético

<400> 10 caucaugcag uuugagguau g: 21

15: <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 11 gcctgcagag ccggcggcct a: 21

25: <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 12 gccugcagag ccggcggccu a: 21

35: <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 13 uaggccgccg gcucugcagg c: 21

45: <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

55: <400> 14 acagagtttg tgacccacgc c <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial 21

<220> <223> constructo sintético

65: <400> 15 acagaguuug ugacccacgc c 21

5: <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> constructo sintético

<400> 16 ggcguggguc acaaacucug u: 21

15: <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 17 tccctcatct actgtgtgca c: 21

25: <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 18 ucccucaucu acugugugca c: 21

35: <210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 19 gugcacacag uagaugaggg a: 21

45: <210> 20 <211> 5 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

55: <400> 20 ugugc 5 <210> 21 <211> 7 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

65: <400> 21 gcacauc 7

5: <210> 22 <211> 5 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> constructo sintético

<400> 22 guugc: 5

15: <210> 23 <211> 7 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 23 ggaagag: 7

25: <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 24 ugugcugacc cugaggaaca g: 21

35: <210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 25 guuccucagg gucagcacau c: 21

45: <210> 26 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

55: <400> 26 ugugcugacc cugaggaaaa g <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial 21

<220> <223> constructo sintético

65: <400> 27 uuuccucagg gucagcacau c 21

5: <210> 28 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> constructo sintético

<400> 28 ugugcugacc cugaggaaaa g: 21

15: <210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 29 guuccucagg gucagcacau c: 21

25: <210> 30 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 30 gcgtaatacg actcactata ggaacagtat gtctcagaca tc: 42

35: <210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

<400> 31 uucgaaguau uccgcguacg u: 21

45: <210> 32 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> constructo sintético

55: <400> 32 gcgtaatacg actcactata ggacaagcct aattagtgat gc <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial 42

<220> <223> constructo sintético

65: <400> 33 gaacagtatg tctcagacat c 21

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una cantidad efectiva de un agente de ARNi seleccionado de agentes de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington causada por una mutación en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función, dirigiendo un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad dentro del gen htt que codifica la proteína Huntingtina mutante, de tal manera que se presenta la interferencia específica de dicho gen, en donde el agente de ARNi se dirige a una región polimórfica en el gen que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.
2.

El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho gen comprende una región expandida de repetición de trinucleótidos.
3.

El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína mutante comprende un dominio expandido de poliglutamina.
4.

El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de ARNi comprende una primera cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos homóloga a una región del gen que comprende el polimorfismo y una segunda cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena.
5.

El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva es una cantidad efectiva para inhibir la expresión o actividad de la proteína mutante.
6.

Un agente de ARNi que comprende una primera cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos homólogos a una región de un gen que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función, comprendiendo dicha región un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad, y una segunda cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena, en donde el agente de ARNi dirige la escisión específica objetivo de un ARNm transcrito del gen que codifica la proteína Huntingtina mutante.
7.

El agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho polimorfismo se selecciona ya sea de entre el grupo que comprende PI-P5, o seleccionado de entre el grupo que comprende P6-P43.
8.

El agente de ARNi de la reivindicación 6 o 7, en donde la primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de la región que comprende el polimorfismo.
9.

El agente de ARNi de la reivindicación 6, 7 u 8, que comprende además una porción de bucle que comprende 4 11 nucleótidos que conectan las dos cadenas.
10.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 6 a
9.
11.

Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.
12.

El vector de la reivindicación 11, que es un vector viral, vector retroviral, casete de expresión, o plásmido; y en cuyo caso comprende además opcionalmente un promotor de ARN polimerasa III o ARN polimerasa II; y en cuyo caso opcionalmente además en donde el promotor de la ARN polimerasa III es el promotor U6 o HI.
13.

Una célula huésped que comprende el agente de ARNi, la molécula de ácido nucleico, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.
14.

La célula huésped de la reivindicación 13, que es una célula huésped de mamífero, en cuyo caso opcionalmente, en donde la célula huésped es una célula de mamífero no humano o una célula humana.
15.

Una composición que comprende el agente de ARNi, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16.

Un agente de ARNi seleccionado de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington mediante la identificación de un único polimorfismo de nucleótido en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función y la administración del agente de ARNi que dirige dicho polimorfismo de tal manera que se reduce la proteína mutante, en donde el polimorfismo es un polimorfismo de un solo nucleótido que no causa enfermedad situado en un sitio distinto de una mutación dentro de un región polimórfica que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.