DE69736862T2

DE69736862T2 - Abgabesystem zur Abgabe von genetischem Material an Herzgewebe

Info

Publication number: DE69736862T2
Application number: DE69736862T
Authority: DE
Inventors: B. Kenneth Anoka STOKES; Josee Blaine MORISSETTE
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2017-04-05
Also published as: US7094201B1; EP0957902A4; EP0957902B1; US7731653B2; EP0957902A1; WO1998002150A1; AU2458597A; DE69736862D1; US20080008688A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Abgabe von genetischem Material an Herzgewebe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Leitungssystem des menschlichen Herzens ist normalerweise ein automatisches System, das die Kontraktion der Vorhöfe und Herzkammern mit Hilfe elektrischer Impulse bewirkt, die im Herzgewebe erzeugt werden. Der Herzzyklus teilt sich auf in die Kontraktionsphase (Systole) und die Relaxationsphase (Diastole). Obwohl der Rhythmus des Herzzyklus spezifisch ist, verändert sich die Frequenz dieses Rhythmus durch vegetative Nerven und Hormone wie Adrenalin. Das vegetative Nervensystem besteht aus parasympathischen und sympathischen Nerven, die Neurotransmitter, wie Acetylcholin bzw. Noradrenalin, freisetzen.
Der natürliche Schrittmacher des menschlichen Herzens befindet sich in der Hinterwand des rechten Vorhofs in einem kleinen Bereich von ungefähr 2 mal 5 mal 15 mm, der als Sinusknoten (SA-Knoten) bezeichnet wird. Der Herzzyklus aus den Phasen Systole und Diastole wird vom SA-Knoten ausgelöst, indem er einen elektrischen Impuls erzeugt, der sich über den rechten und linken Vorhof ausbreitet, wodurch sie sich beinahe gleichzeitig zusammenziehen. Dieser elektrische Impuls, der als Schrittmacherpotenzial bezeichnet wird, entsteht durch die Depolarisation der Myokardzellen des SA-Knoten, die durch Veränderungen der Durchlässigkeit der Membran für Kationen zustande kommt. Wenn die Zellmembran auf etwa –30 mV depolarisiert ist, entsteht ein Aktionspotenzial. Dieser Impuls wird dann an den Atrioventrikularknoten (AV-Knoten) weitergeleitet, der sich am unteren Abschnitt der Herzvorhofscheidewand befindet. Der Impuls setzt sich anschließend durch das Atrioventrikularbündel fort, das als His-Bündel bezeichnet wird und sich oben an der Herzkammerscheidewand befindet. Das His-Bündel teilt sich in einen rechten und linken Schenkel auf, der zur rechten bzw. linken Herzkammer führt. Beide Schenkel des His-Bündels gehen in die Purkinje-Fasern über, die in den Herzkammerwänden enden. Durch die Stimulation dieser Fasern ziehen sich die Herzkammern beinahe gleichzeitig zusammen und fördern Blut in den Lungen- und Körperkreislauf.
Abnorme Muster der elektrischen Leitung im Herzen können zu Anomalien des Herzzyklus führen und die Herzfunktion ernsthaft beeinträchtigen, was manchmal tödlich sein kann. Beispielsweise können Patienten mit derartigen Herzreizleitungsstörungen an dem Sick-Sinus-Syndrom (SSS), dem Bradykardie-Tachykardie-Syndrom, einer Bradykardie, Tachykardie und einem AV-Block leiden. Künstliche Herzschrittmacher werden häufig bei Patienten eingesetzt, die an diesen Herzreizleitungsstörungen leiden.
Bei SSS bezieht sich das Leitungsproblem unter anderem auf den intermittierend auftretenden Wiedereintritt des elektrischen Impulses in Gewebe des Knotens, wodurch die Herzschläge gelegentlich schneller werden. Zur Wahrnehmung der Vorhofaktivität und zur Steuerung des Vorhofs mit der geeigneten Frequenz wird häufig ein Zweikammerschrittmacher verwendet.
Bei einigen angeborenen Erkrankungen, wie das "Bradykardie-Tachykardie-Syndrom", treten zeitweilig Bradykardie, eine geringe Impulsfrequenz, und Tachykardie, eine hohe Impulsfrequenz, auf. Die Erkrankung kann zum Tod führen, wenn durch lange Pausen mehrfach ventrikuläre Extrasystolen (VES) auftreten können, wodurch eine Tachykardie ausgelöst wird. Ein Herzschrittmacher und/oder Kardioverter kann zur Bekämpfung von Episoden einer Tachykardie eingesetzt werden, und herkömmliche Bedarfsschrittmacher sind seit langem bei der Behandlung der Bradykardie wirksam.
Eine zu starke Verzögerung oder nicht vorhandene Erregungsübertragung bei einer abnorm langsamen Reizleitung ist als AV-Block bekannt. Ein AV-Block wird häufig durch Narbengewebe verursacht, das das Leitungssystem unterbricht. Es wird vermutet, dass sich die Herzerregung normalerweise innerhalb von 0,20 Sekunden vom SA-Knoten aus entlang Leitungsbahnen zwischen den Knoten zum AV-Knoten und zu den Herzkammern ausbreitet. Ein AV-Block tritt in drei zunehmend gefährlicheren Stufen auf. Bei einem AV-Block ersten Grades ist, obwohl alle Impulse durch den Übergang vom Vorhof zur Kammer geleitet werden, die Dauer der Leitung zu den Herzkammern abnorm lang. Bei einem AV-Block zweiten Grades werden einige Impulse an die Herzkammern weitergeleitet, einige jedoch nicht. Bei einem AV-Block dritten Grades werden keine Impulse mehr vom natürlichen Schrittmacher an die Herzkammern weitergeleitet. Dies führt zu einer geringeren Frequenz der Kammerkontraktion. Die Kontraktionsfrequenz wird in diesem Fall üblicherweise von der Frequenz der am schnellsten depolarisierenden His-Purkinje-Zelle distal von der Stelle des Blocks bestimmt. Üblicherweise liegt die Herzfrequenz bei einem AV-Block dritten Grades im Bereich zwischen 20 und 60 Schlägen pro Minute, kann in einigen Fällen jedoch auch null sein.
Rhythmusstörungen, die sich aus Herzreizleitungsstörungen ergeben, können mit verschiedenen Medikamenten behandelt werden, die bestimmte Aspekte der Herzaktionspotenziale und die Erregungsbildung oder -leitung entlang abnormer Leitungsbahnen hemmen. Medikamente, die zur Behandlung dieser Rhythmusstörungen eingesetzt werden, blockieren die schnellen Na⁺-Kanäle (Quinidin, Procainamid, Lidokain), die langsamen Ca²⁺-Kanäle (Verapamil) oder β-adrenerge Receptoren (Propranolol).
Das Cardioleitungssystem, oder die elektrische Aktivierung des Herzens, umfasst den Stromtransport in Form von chemischen Ionengradienten von einer Myokardzelle zu einer anderen. Leitungsproteine in Herzzellen erleichtern diesen Stromtransport. Einzelne Herzzellen exprimieren eine Vielzahl von Gap-junction-Kanal-Proteinen, durch die Ionen hindurchwandern. Die interzellulären Kanäle der gap junctions sind aus einzelnen Transmembran-Connexinproteinen aufgebaut, von denen verschiedene bei Säugetieren kloniert und sequenziert wurden. Diese Proteine erleichtern den Ionentransport von Zelle zu Zelle und sind für die elektrische Kopplung von Zellen verantwortlich. Saffitz et al., J. Card. Electrophys., 1995, 6, 498–510.
Connexinproteine umfassen eine Familie von verwandten Proteinen und umfassen beispielsweise Cx43 (Fishman et al., J. Cell Biol., 1990, 111, 589–598) und Cx40 und Cx45 (Kanter et al., J. Mol. Cell Cardiol., 1994, 26, 861–868). Cx43 scheint das am reichlichsten vorhandene Connexin im Herzen zu sein und wird in der Herzkammer, dem Vorhofmyokard, dem distalen His-Bündel und den Purkinje-Fasern exprimiert, wohingegen es nicht im SA-Knoten, im AV-Knoten und im proximalen His-Bündel vorkommt. Gourdie et al., J. Cell Sci., 1993, 105, 985–991, und Davis et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1994, 24, 1124–1132. Cx40 wird am stärksten im Vorhofmyokard und im distalen His-Bündel und den Purkinje-Fasern exprimiert, wohingegen es in geringerem Maße im Kammermyokard und den Knoten vorkommt. Gourdie et al., J.
Cell Sci., 1993, 105, 985–991 und Davis et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1994, 24, 1124–1132. Cx45 wird mäßig in der Kammer und dem Vorhofmyokard, dem distalen His-Bündel und den Purkinje-Fasern exprimiert, wohingegen es in geringerem Maße im SA-Knoten, AV-Knoten und dem proximalen His-Bündel vorkommt. Gourdie et al., J. Cell Sci., 1993, 105, 985–991 und Davis et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1994, 24; 1124–1132. Die Connexine Cx43 und Cx40 sind verhältnismäßig schnell leitende Proteine, während Cx45 ein verhältnismäßig langsam leitendes Protein ist.
Die Gentherapie ist in letzter Zeit als leistungsstarkes Verfahren zur Behandlung verschiedener Erkrankungen von Säugetieren in Erscheinung getreten. Unlängst wurde nachgewiesen, dass die direkte Übertragung von genetischem Material in das Myokardgewebe in vivo ein wirksames Verfahren zur Expression eines gewünschten Proteins ist. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die direkte Transfektion des Myokards mit Plasmid-DNA durch Direktinjektion in das Herz von Kaninchen und Schweinen (Gal et al., Lab. invest., 1993, 68, 18–25) sowie von Ratten (Ascadi et al., The NewBiol., 1991, 3, 71–81) zur Expression bestimmter Reportergenprodukte führt. Zusätzlich wurde die direkte in vivo Genübertragung in Myokardzellen auch durch Direktinjektion von adenoviralen Vektoren in das Myokard erreicht. French et al., Circulation, 1994, 90, 2415–2424 und die PCT-Veröffentlichung WO 94/11506.
Ferner ist in WO 94/11506 die Injektion von genetischem Material in das Herz unter Verwendung von Wachstumsfaktoren wie FGF oder PDGF, Dystropin oder FGF-Rezeptoren oder I-CAM oder V-CAM offenbart.
Es ist seit langem erwünscht, Anomalien der Leitungsbahnen wirksam zu behandeln. Zu diesem Zweck wurden herkömmliche Verfahren einschließlich der medikamentösen Behandlung, der Herzschrittmachertechnologie oder eine Kombination daraus eingesetzt. Im Gegensatz zu diesen Behandlungsverfahren ist die Erfindung der Anmelder auf Abgabesysteme zur Behandlung und/oder Korrektur von Störungen der Leitungsbahnen des Herzens durch Abgabe von genetischem Leitungsproteinmaterial in das Myokardgewebe gerichtet. Bei Patienten mit Herzreizleitungsstörungen ist es wünschenswert, den problematischen Bereich im Herzen zu lokalisieren und entweder die problematischen Zellen zu behandeln, damit die ordnungsgemäße Leitung wiederhergestellt wird, oder die Leitung normaler Zellen zu verbessern, die den problematischen Bereich umgeben. Zum Beispiel wird bei einem Patienten mit einem AV-Block ein Gefüge normaler, gesunder Zellen identifiziert, die die Narbe in der Herzkammer umgeben, durch die der AV-Block verursacht wird, und mit dem Abgabesystem der Anmelder durch Expression kardialer Leitungsproteine, beispielsweise von Gap-junction-Proteinen, behandelt, um das Leitungssystem schneller zu machen oder anderweitig zu verbessern. In diesem Fall kann der Block wirksam überbrückt oder umgangen werden, wodurch ein QRS-Komplex mit einer Breite zwischen einem normal weitergeleiteten Herzschlag und einer VES entsteht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß dem Vorstehenden ist das Hauptziel der von den Anwendern beanspruchten Erfindung die Bereitstellung von Abgabesystemen zur Abgabe von genetischem Material an Herzgewebe. Nach der Identifizierung eines problematischen Bereichs im Herzen wird ein genetisches Leitungsproteinmaterial ausgewählt, sodass durch die Expression eines ausgewählten verbessert wird. Alternativ kann durch die Expression eines ausgewählten Leitungsproteins die Cardioleitung normaler, gesunder Zellen verbessert werden, die die problematischen Zellen umgeben. Die Verbesserung der Herzreizleitung kann sich im Ersatz, der Beschleunigung oder der Verlangsamung der bestehenden Leitungsbahn äußern. Das genetische Leitungsproteinmaterial umfasst rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das das Leitungsprotein kodiert und in ein Transportvehikel wie zum Beispiel Plasmiden oder adenovirale Vektoren eingesetzt ist, und die entsprechenden Regulatorelemente. Alternativ umfasst das genetische Leitungsproteinmaterial das Leitungsprotein selbst. Die Expression des gewünschten Leitungsproteins mit rekombinanten Nukleinsäuremolekülen wird von Promotoren gesteuert, vorzugsweise herzgewebespezifische Promotor-Enhancern, die funktionsfähig mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden sind, das das Leitungsprotein kodiert. Das Leitungsprotein ist vorzugsweise ein Gap-junction-Protein, beispielsweise die Connexine Cx40, Cx43 und Cx45, das zur Korrektur oder Verbesserung der Cardioleitung von Zellen im problematischen Bereich verwendet wird. Wenn die Störung der Leitungsbahnen des Herzens beispielsweise ein AV-Block oder eine Bradykardie ist, wird vorzugsweise Cx43 oder Cx40 verwendet. Wenn die Störung der Leitungsbahnen des Herzens jedoch eine Tachykardie ist, wird vorzugsweise Cx45 verwendet. Das genetische Herzreizleitungsmaterial wird durch Perfusion oder Injektion einer therapeutisch wirksamen Menge an bestimmte Orte im Herzen abgegeben, was die Menge ist, die die Cardioleitung der Myokardzellen berichtigt oder verbessert. Die therapeutisch wirksame Menge kann wie gewünscht als eine einzige Dosis oder mehrere Dosen an der entsprechenden Stelle im Herzen abgegeben werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Abgabesystem zur Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge eines zuvor festgelegten genetischen Leitungsproteinmaterials an einer identifizierten Stelle im Herzen bereit, wobei das genetische Material ausgewählt wird, um die Leitfähigkeit der Herzzellen zu verändern, an die es abgegeben wird. Das Abgabesystem weist das ausgewählte genetische Material auf, das in einem Reservoir enthalten ist, und ein Katheterteilsystem, das einen Mappingkatheter und eine Abgabeeinrichtung umfasst, zur Abgabe des genetischen Materials aus dem Reservoir an der identifizierten Stelle im Herzen, um eine Vielzahl von Zellen in der Nähe des ausgewählten Orts im Herzen zu kontaktieren.
Bei dem Abgabesystem kann ein externes Reservoir zur Bereitstellung des genetischen Materials oder alternativ ein implantierbares Reservoir verwendet werden. Bei beiden Ausführungsformen ist für den Transport therapeutischer Dosen des genetischen Materials aus dem Reservoir, durch einen Katheter und zu der ausgewählten Stelle im Herzen ein steuerbarer Pumpenmechanismus vorgesehen. Das Katheterteilsystem, das einen Mappingkatheter und eine Abgabeeinrichtung umfasst, kann ein endokardialer Katheter mit einem distalen Spitzenabschnitt sein, der dazu ausgelegt ist, das genetische Material zu positionieren und aus einer Herzkammer heraus in das Myokard zu injizieren. Das Abgabesystem ist derart mit dem Mappingkatheter kombiniert, dass, sobald die gewählte Stelle identifiziert wurde, das Abgabesystem aktiviert wird, das sich in dem Mappingkatheter befindet, ohne dass der Mappingkatheter entfernt wird. Das Abgabesystem kann für eine Behandlung verwendet und dann entfernt werden oder für spätere Behandlungen implantiert werden, wobei es in letzterem Fall von einer externen Programmiervorrichtung gesteuert werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm, in dem die wichtigsten Schritte dargestellt sind, die an der Durchführung der Erfindung beteiligt sind, einschließlich des Mappings des Leitungssystem des Patienten zur Ermittlung des problematischen Orts, der Auswahl eines geeigneten genetischen Materials und dem Hinausdrücken des genetischen Materials in einer geeigneten Dosis an der identifizierten Stelle.
2 ist eine vereinfachte Darstellung eines Abgabesystems, in der die Abgabe von genetischem Material in das Herz eines Patienten an der gewählten Stelle dargestellt ist.
3 ist eine vereinfachte Zeichnung des distalen Abschnitts eines Katheters, der hinausschiebbar und zurückziehbar sein kann, zum Einspritzen einer Lösung, die ausgewähltes genetisches Material enthält, in das Herz eines Patienten verwendet wird.
4 veranschaulicht das distale Ende eines Katheters, der einen distalen Abschnitt aufweist, der eine osmotische Pumpe umgibt.
5 veranschaulicht ein Abgabesystem gemäß dieser Erfindung, bei dem die Abgabeeinrichtung einen Mappingkatheter umfasst, der mit einem Abgabesystem zur Injektion einer Lösung in das Herz eines Patienten kombiniert ist, die ausgewähltes genetisches Material enthält.
6A ist eine vereinfachte Darstellung eines Abgabesystems mit einer separaten Pumpe, das eine Kombination aus einem Katheter und einer Schrittmacherelektrode aufweist;
6B ist eine Kombination aus einer Schrittmacherelektrode und einem Abgabekatheter, die ein Reservoir am distalen Ende des Katheters aufweist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung der Anmelder stellt Abgabesysteme zur Behandlung von Störungen der Cardioleitungsbahnen des Herzens bereit. Ein problematischer Bereich im Herzen, der beispielsweise SSS, das Bradykardie-Tachykardie-Syndrom, eine Bradykardie, Tachykardie oder einen AV-Block aufweist, wird mit üblichen und herkömmlichen Verfahren identifiziert, die dem Fachmann bekannt sind. Sobald das entsprechende Problem identifiziert wurde, wird ein genetisches Leitungsproteinmaterial so gewählt, dass die Expression eines ausgewählten Leitungsproteins die Cardioleitung der problematischen Zellen korrigiert oder verbessert oder die Cardioleitung von normalen Zellen verbessert, die die Problemzellen umgeben. Das genetische Leitungsproteinmaterial umfasst entweder das Leitungsprotein selbst oder rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das das Leitungsprotein kodiert und in ein Transportvehikel eingesetzt ist, beispielsweise ein Plasmid, Cosmid, YAC-Vektor, virale Vektoren und Ähnliches, und die entsprechenden Regulatorelemente. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, das das Leitungsprotein kodiert, die cDNA eines Leitungsproteins mit der vollständigen codierenden Sequenz, und ist in ein Plasmid oder einen adenoviralen Vektor, beispielsweise pGEM3 oder pBR322 bzw. Ad5, inseriert. Die Regulatorelemente können die Expression in Säugetierzellen steuern, insbesondere in menschlichen Zellen. Die Regulatorelemente weisen einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal auf. Die Expression des gewünschten Leitungsproteins wird vorzugsweise von herzgewebespezifischen Promotor-Enhancern gesteuert, die mit dem Nukleinsäuremolekül operabel verknüpft sind, das das Leitungsprotein kodiert. Das Leitungsprotein ist vorzugsweise ein Gap-junction-Protein, beispielsweise die Connexine Cx40, Cx43 und Cx45, das zur Korrektur oder Verbesserung der Cardioleitung von Zellen im problematischen Bereich verwendet wird. Das jeweilige gewählte Gap-junction-Protein ist von der Art des identifizierten Problems abhängig. Ist die Leitung beispielsweise langsam oder nicht vorhanden, wie bei einem AV-Block oder einer Bradykardie, würde das Einbringen von Cx40 oder Cx43 die Leitung verbessern. Im Gegensatz dazu würde das Einbringen des langsamer leitenden Cx45 in den AV-Knoten und das His-Gewebe zur Verhinderung des Bradykardie-Tachykardie-Syndroms und einer Tachykardie führen. Das genetische Leitungsproteinmaterial wird vorzugsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung abgegeben, die beispielsweise das genetische Leitungsproteinmaterial in einem Volumen Phosphatpuffer mit 5 % Saccharose umfasst. Das genetische Herzreizleitungsmaterial wird durch Perfusion oder Injektion einer therapeutisch wirksamen Menge an bestimmte Orte im Herzen abgegeben, was die Menge ist, die die Leitung der Myokardzellen berichtigt oder verbessert. Die therapeutisch wirksame Menge kann unter Verwendung der Abgabesysteme der Erfindung wie gewünscht als eine einzige oder mehrere Dosen an der entsprechenden Stelle im Herzen abgegeben werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Abgabesystem zur Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge eines genetischen Leitungsproteinmaterials an einer durch Mapping identifizierten Stelle im Herzen, sodass die effektive Leitung der Myokardzellen um den Bereich der Störung herum verbessert wird. Bei einer ersten Ausführungsform umfasst das Abgabesystem im Grunde ein Reservoirteilsystem zum Halten des genetischen Materials und ein Katheterteilsystem, das einen Mappingkatheter und eine Abgabeeinrichtung umfasst, wobei dieses Teilsystem mit dem Reservoirteilsystem in Verbindung steht und das genetische Material in und um die identifizierten Stelle im Herzen herum einbringt. Wie aus der folgen den Erörterung verschiedener stärker bevorzugt Ausführungsformen ersichtlich ist, können das Reservoirteilsystem und das Katheterteilsystem getrennt vorliegen oder kombiniert sein. Vorzugsweise enthält das Reservoir bis zu 25 ml eines genetischen Materials zur Abgabe an das Myokard. Bei einigen Anwendungen wird lediglich ein Bolus von etwa 0,1 bis 10 ml oder stärker bevorzugt von 1 bis 5 ml an die Zielbereiche abgegeben. Bei anderen Anwendungen, beispielsweise wenn das Leitungsprotein in wiederholten Dosen abgegeben wird, können 25 ml oder mehr verwendet werden. Das genetische Material kann auch in einer Kochsalzlösung verdünnt werden, beispielsweise in physiologischem Phosphatpuffer (PBS), wobei die verdünnte Lösung zur kontrollierten Abgabe im Reservoir enthalten ist. Ferner versteht es sich, dass das Reservoir und die zugehörigen Steuervorrichtungen je nach Sachlage, z.B. ob dem Patienten über einen Zeitraum abgemessene Dosen zu verabreichen sind oder ob die Abgabe des genetischen Materials im Wesentlichen eine Einmalbehandlung ist, entweder implantierbar sein oder sich außerhalb des Körpers befinden können.
Mit Bezug auf 1 sind in dem Flussdiagramm die wichtigsten Schritte dargestellt, die die Anwendung dieser Erfindung beinhaltet. Wie bei 30 dargestellt ist, besteht der erste Schritt in der Ermittlung der Art der Herzreizleitungsstörung, die sich in der Eigenschaft einer unwirksamen oder schädlichen Leitung äußern kann. Dieser Schritt kann die Diagnose SSS, Bradykardie-Tachykardie-Syndrom, Bradykardie, Tachykardie, AV-Block usw. bedeuten. Der nächste Schritt, der bei 32 veranschaulicht ist, besteht im Mapping des Herzens des Patienten zur Ermittlung des Orts, der Größe und des Ausmaßes der Störung des problematischen Bereichs. Mit intrakardialen elektrokardiographischen Verfahren, oder elektrophysiologischen Untersuchungen (EPU), können die Vorgänge der Erregungsbildung und -leitung im Herzen eingehend untersucht werden. Das verwendete Prüf- und Mappingprotokoll und die Orte, die für die Aufzeichnung ausgewählt werden, hängen von den Symptomen ab, die bei der Person auftreten. Einem Fachmann sind kardiale Mappingverfahren gut bekannt, beispielsweise die, die in der US-Patentschrift 4,699,147, der US-Patentschrift 5,297,549 und der US-Patentschrift 5,397,339 beschrieben sind. Mit den Mappingverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, werden problemlos die Orte im Herzen identifiziert, die Herzzellen mit abnormen Leitungseigenschaften umfassen. Wie bei 33 dargestellt ist, besteht der nächste Schritt in der Auswahl des entsprechenden genetischen Leitungsproteinmaterials. Diese Auswahl, die das "vorgewählte genetische Material" liefert, ist von der Art der Herzreizleitungsstörung abhängig, wie nachfolgend erörtert wird. Wie bei 34 dargestellt ist, erfolgt die Herstellung des genetischen Leitungsproteinmaterials entweder, im Fall eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, durch Einsetzen der Nukleinsäuremoleküle, die das entsprechende Leitungsprotein kodieren, in ein Transportvehikel mit den entsprechenden Regulatorelementen, oder, im Fall des Leitungsproteins selbst, durch Expression des Leitungsproteins mit einem Expressionsvektor. Wie bei 35 dargestellt ist, besteht der nächste Schritt darin, eine therapeutisch wirksame Menge des genetischen Leitungsproteinmaterials herzustellen und das Abgabesystem damit zu befüllen. Wie bei 37 dargestellt ist, umfasst der nächste Schritt die Verabreichung der therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten, indem unter Verwendung des hier beschriebenen Abgabesystems die entsprechende Stelle im Herzen kontaktiert wird, der zuvor bestimmt wurde. Ein alternatives Verfahren der Verabreichung der therapeutisch wirksamen Menge des genetischen Leitungsproteinmaterials besteht in der Direktinjektion in das Herz des Patienten. Der letzte Schritt, der bei 38 dargestellt ist, besteht in der Evaluierung der Reaktion des Patienten auf die Behandlung.
Mit Bezug auf 2 ist ein Abgabesystem dargestellt, das für einige Anwendungen dieser Erfindung verwendbar ist, z.B. wenn größere Mengen genetischen Materials allein oder in Lösung verwendet werden. Ein Katheter 38, vorzugsweise ein transvenöser Katheter, weist einen gestreckten Katheterkörper 40 auf, zweckmäßigerweise eine isolierende Außenhülle, die aus Polyurethan, Teflon, Silikon oder jedem beliebigen anderen verträglichen biokompatiblen Kunststoff bestehen kann. Der Katheter weist eine gängige Röhre (in 3 veranschaulicht) auf, die über dessen Länge dort hindurch verläuft und bis zu einem hohlen schraubenförmigen Nadelelement 44 verläuft, das dazu ausgelegt ist, in das Myokard des Patienten geschraubt zu werden. Das äußere distale Ende des schraubenförmigen Elements 44 ist offen, sodass genetisches Material in flüssiger Form aus dem Ende abgegeben werden kann, wie nachstehend in Verbindung mit 3 ausführlicher erörtert ist. Am proximalen Ende des Katheters befindet sich ein Verbindungsstück 46, mit dem ein Luer-Lock 48 verbunden ist. Der Luer-Lock 48 ist mit dem proximalen Ende des gestreckten Katheterkörpers 40 verbunden und nimmt die Röhre auf. Am Luer-Lock 48 ist eine drehbare Aufnahme 50 befestigt, durch die sich der Katheter relativ zum Luer-Lock 52 drehen kann. Der Luer-Lock 52 wiederum ist über das Steuerelement 54 mit einer Röhre 58 verbunden, die zweckmäßigerweise über die Durchflusssteuerung 57 und Filter 56 mit dem Reservoir 55 in Verbindung steht. Das Reservoir 55 enthält einen Vorrat an dem ausgewählten genetischen Materials. Die Steuerelemente 57 und 54 werden für die Einstellung von Druck und Durchflussgeschwindigkeit verwendet und können mechanisch oder elektronisch gesteuert werden. Somit kann die Einheit 54 oder 57 entweder zur Steuerung der Abgabegeschwindigkeit oder der Dosierung oder von beidem verwendet werden. Die Steuereinheit 54 kann so programmiert sein, dass sie zeitgesteuert automatisch zuvor festgelegte Dosen freisetzt. Ferner kann die Steuereinheit 54 bei einem implantierten System von einem externen Programmiergerät aus aktiviert werden, wie bei 53 dargestellt ist. Hinsichtlich einer ausführlicheren Beschreibung einer derartigen Kombination aus Reservoir und Katheter wird auf die internationale Anmeldung Bezug genommen, die als internationale PCT-Veröffentlichung WO 95/05781 veröffentlicht wurde. Es versteht sich, dass ein derartiges System für diese Erfindung nur bei Anwendungen verwendbar ist, wobei größere Flüssigkeitsmengen herausgepresst werden sollen, z.B. wenn eine verdünnte Kochsalzlösung zum Spülen oder zur Perfusion eines ausgewählten Bereichs verwendet wird.
Mit Bezug auf 3 ist als vergrößertes Detail eine vereinfachte Darstellung des distalen Endes des Katheters von 2 gezeigt, in der die Verbindung zwischen dem schraubenförmigen Element 44 und dem Innenraum des Katheters dargestellt ist. Wie dargestellt, ist die schraubenförmge Nadel 44 mit einer inneren Röhre 59 versehen, die mit der inneren Röhre 63L des Anschlusses in Verbindung steht, der von der Röhre 63 gebildet wird. Bei dieser Ausführungsform kann das schraubenförmige Element 44 auch eine Schrittmacherelektrode sein, wobei es in diesem Fall aus einem leitfähigen Werkstoff besteht und durch Schweißen, Crimpen, Aufquetschen oder andere Mittel mit dem Spitzenelement 61 verbunden ist, um die Flüssigkeitsströmung nicht zu verhindern. Das Spitzenelement 61 wiederum ist elektrisch leitend mit einem gewickelten Leiter oder den gewickelten Leitern 64, 65 verbunden, die entlang der Länge des Anschlusses verlaufen und mit einem Herzschrittmacher verbunden sind. Eine äußere Membran 60 bildet die Außenwand des gestreckten Katheterkörpers 40, der in 2 dargestellt ist. Weiterhin unter Bezugnahme auf 3 weist das Element 44 eine Auslassöffnung 75 auf, an der das genetische Material herausgepresst werden kann, und es können auch die Löcher oder Öffnungen 76, 77 und 78 verwendet werden, um dem genetischen Material als Austrittsöffnungen zu dienen, das mit einem Druck von bis zu etwa 1 Atmosphäre aus dem Reservoir 55 und von den Steuerelementen durch die Röhre 59 hindurch zugeführt wird.
In der Praxis wird ein Katheter 38 der in 2 und 3 dargestellten Form bis zur gewünschten Behandlungsstelle vorgeschoben, wobei die Stelle oder der Ort zuvor mit Hilfe des kardialen Mappings, wie zuvor erörtert, identifiziert wurde. Der Katheter kann zu der angegebenen Stelle geführt werden, indem er in einen steuerbaren oder führbaren Katheter mit einer aufnehmenden Röhre eingesetzt wird, wie er beispielsweise in der US-Patentschrift 5,030,204 offenbart ist; oder mit Hilfe eines Führungskatheters mit fester Ausführung, wie er in der US-Patentschrift 5,104,393 dargestellt ist. Alternativ kann der Katheter mit Hilfe einer biegsamen Sonde, wie in der PCT-Patentanmeldung WO 93/04724 offenbart ist, die am 18. März 1993 veröffentlicht wurde, oder mit einem biegsamen Führungsdraht, wie in der US-Patentschrift 5,060,660 offenbart, zu der gewünschten Stelle im Herzen vorgeschoben werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das schraubenförmige Element 44 gewöhnlich in einer Hülle zurückgezogen sein, wenn der Katheters in das Herz des Patienten geführt wird, und mit einer Sonde herausgeschoben werden, damit es ins. Herz geschraubt werden kann. Derartige herausschiebbare schraubenförmige Anordnungen sind im Handel erhältlich und auf dem Fachgebiet der Herzschrittmacher bekannt.
Es versteht sich, dass andere Formen der Reservoirteilsysteme und Katheterteilsysteme in den Umfang dieser Erfindung fallen. Ausführungsformen des Reservoirs umfassen beispielsweise Medikamente abgebende, spülbare Elektroden, wie die in der US-Patentschrift 4,360,031 beschriebenen; ein elektrisch steuerbares, sich nicht verschließendes, in den Körper implantierbares Medikamentenabgabesystem, wie die in der US-Patentschrift 5,041,107 beschriebenen; ein implantierbares Medikamenteninfusionsreservoir, wie die in der US-Patentschrift 5,176,641 beschriebenen; Medikamentenabgabevorrichtungen, wie die in der US-Patentschrift 5,443,450 beschriebenen, und Infusionspumpen, wie SYNCHROMED^® von Medtronic, Inc., sowie osmotische Pumpen, wie die von Alza.
Mit Bezug auf 4 ist zur Veranschaulichung ein Abgabesystem mit einer Kombination aus Katheter und Reservoir dargestellt, das bei Anwendungen verwendbar ist, die die Abgabe eines verhältnismäßig kleinen Bolus genetischen Materials, z.B. 1 bis 5 ml, umfassen. 4 zeigt das distale Ende eines Katheters mit einem distalen Abschnitt 70, der eine osmotische Pumpe umgibt. Siehe die Medtronic, Inc. erteilte US-Patentschrift 4,711,251. Die Pumpe weist eine innere Kammer 68 und eine äußere Kammer 66 auf, wobei die Kammern durch eine undurchlässige Membran 67 getrennt sind. Eine halbdurchlässige äußere Membran 72 bildet die Außenwand der Kammer 66. Der röhrenförmige Abschnitt 74 des schraubenförmigen Elements steht mit der Röhre 74L in der inneren Kammer 68 in Verbindung. Ein Stromleiter 80, der entlang der Länge des Katheters verläuft, erstreckt sich bis in die innere Kammer 68 und steht mit der Verlängerung 74E in Verbindung, wie bei 74C dargestellt ist, um bei einer Anwendung, bei der das Element 44 als Schrittmacherelektrode verwendet wird, bis zum Element 44 den elektrischen Kontakt bereitzustellen. An dem Punkt, an dem der Stromleiter durch die äußere Membran 72 und die innere Membran 67 hindurchgeht, ist eine Dichtung 79 vorgesehen. Ein Isoliermantel 86 umgibt den Stromleiter 80 ab dem Berührungspunkt mit der Dichtung 79. Eine Endkappe 73, die mit der äußeren Membran 72 eine Einheit bilden kann, verschließt die Kammer. Alternativ kann die Endkappe 73 so aufgebaut sein, dass sie ein zuvor festgelegtes Medikament freisetzt, beispielsweise Steroide. Steroide wie Dexamethasonnatriumphosphat, Beclametason und Ähnliches, werden zur Kontrolle von Entzündungsprozessen verwendet.
Bei dieser Anordnung wird vor dem Einführen des distalen Katheterendes in das Herz des Patienten die innere Kammer 68 mit dem genetischen Material gefüllt, das in das Myokard abgegeben werden soll. Dies kann beispielsweise erfolgen, indem einfach eine Mikronadel durch die Endkappe 73 geführt und der gewünschte Bolus aus genetischem Material in die Kammer 68 eingebracht wird. Nachdem die Kammer 68 gefüllt und der Katheter implantiert ist, gelangen Körperflüssigkeiten durch die Membran 72 in die Kammer 66, um über die undurchlässige Membran 67 auf die innere Kammer 68 Druck auszuüben. Dies führt zur Abgabe des genetischen Materials, das sich in der Kammer 68 befindet, durch die Röhre 74L der Verlängerung 74E und das schraubenförmige Element 44. Obwohl die bevorzugte Nadel oder das bevorzugte Element 44 schraubenförmig ist, können auch weitere Ausgestaltungen von Nadeln oder Elementen verwendet werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
Weiterhin mit Bezug auf 4 ist eine weitere Ausführungsform einer Katheterspitze dargestellt, die für die Abgabe eines kleinen Bolus des ausgewählten genetischen Materials verwendbar ist. Bei dieser Ausführungsform wird der Materialbolus im hohlen Innenraum des schraubenförmigen Elements 44 aufbewahrt, d.h. der Innenraum ist das Reservoir. Der Innenraum bleibt dicht durch die Verwendung eines löslichen Materials, das normalerweise fest ist, sich jedoch auflöst, wenn es über einen Zeitraum mit Körperflüssigkeiten in Berührung kommt. Ein Beispiel für ein derartiges Material ist Mannit, der verwendet werden kann, wenn das Abgabesystem nicht zuvor mit dem genetischen Leitungsproteinmaterial befüllt wurde. Die Stopfen oder Kügelchen 81 bis 85 aus Mannit sind (mit Strichlinien) so angeordnet dargestellt, dass sie die beiden Enden des Elements 44 sowie die Öffnungen 76, 77, 78 blockieren. In den Fällen, wobei das genetische Leitungsproteinmaterial zuvor in das Abgabesystem eingefüllt wurde, kann statt Mannit ein Formgedächtnismetall verwendet werden. Derartige Metalle sind dem Fachmann bekannt. Jedes dieser Merkmale kann mit einer osmotischen Pumpe kombiniert werden, wie in Verbindung mit 3 beschrieben ist, wobei die äußere Kammer mit einer Kochsalzlösung gefüllt ist, die das genetische Material aus den Öffnungen des Elements 44 herauspresst. Alternativ kann die äußere Kammer mit dem genetischen Material gefüllt sein, das dann aus den Öffnungen des Elements 44 herausgepresst wird. Eine weitere, nicht dargestellte alternative Ausführungsform besteht in der Verwendung einer Sonde, die bis zum distalen Ende des Katheters hindurchgeführt wird, um einen Kolben zu bewegen, der das Herauspressen des genetischen Materials in die Myokardzellen unterstützt.
Mit Bezug auf 5 ist zur Veranschaulichung ein Abgabesystem mit einer Kombination aus einem Mappingkatheter und einer Abgabeeinrichtung gezeigt. Das Abgabesystem umfasst einen Katheter 90 mit einem distalen Ende 91 mit einer Öffnung am distalen Ende. Der Katheter 90 umfasst ferner die Mappingelektrodeneinrichtung 92 am distalen Ende 91. Mit der Mappingelektrodeneinrichtung wird das Mapping des Herzens des Patienten durchgeführt. Die Stromleitereinrichtung 93 verbindet die Mappingelektrodeneinrichtung 92 elektrisch leitend mit dem proximalen Ende 94 des Katheters 90. Das Abgabesystem umfasst ferner eine Abgabeeinrichtung im Katheter. Die Ausführungsform der Abgabeeinrichtung, die in 5 veranschaulicht ist, ist die Abgabeeinrichtung, die in 3 dargestellt ist. Es kann jedoch jede der hier beschriebenen Abgabeeinrichtungen in Kombination mit dem in 5 dargestellten Mappingkatheter verwendet werden. Katheter 90 wird in das Herz des Patienten und in die Stelle eingeführt, die mit üblichen Mappingverfahren lokalisiert wurde. Sobald eine Stelle im Herzen identifiziert wurde, bleibt der Mappingkatheter 90 an seinem Platz, und anschließend wird die Abgabeeinrichtung durch das distale Ende 91 des Katheters 90 hinausgeschoben und das Herzgewebe oder Zellen werden mit dem genetischen Leitungsproteinmaterial kontaktiert. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Katheter 90 eine abziehbare Einführhülse mit den beiden Stromleitereinrichtungen 93, die die Einführhülse, die zum kardialen Mapping dient, und die Elektrodeneinrichtung 92 elektrisch leitend verbinden. Sobald das Mapping des Orts im Herzen erfolgt ist, wird die Abgabeeinrichtung mit dem Herzgewebe kontaktiert und die Einführeinrichtung entfernt und abgezogen.
Mit Bezug auf 6A ist zur Veranschaulichung ein implantierbares Abgabesystem dargestellt, das eine Kombination aus einer Schrittmacherelektrode und einem Abgabekatheter umfasst, die nachfolgend einfach als Katheter bezeichnet wird. Der Katheter 90 ist mit einem Herzschrittmacher oder einem Impulsgenerator (nicht dargestellt) und einer Quelle für genetisches Material kombiniert, wie beispielsweise durch die Pumpe 100 dargestellt, die auf geeignete Weise in der Nähe des Herzschrittmachers implantiert ist. Das proximale Ende 101 des Katheters ist auf gängige Weise mit dem Herzschrittmacher verbunden. Das genetische Material wird durch die Verbindungsröhre 102 an einen proximalen Abschnitt 88 des Katheters abgegeben, der mit der Längsröhre des Katheters in Verbindung steht, die bei 89 dargestellt ist. Alternativ kann der obere Teil des Herzschrittmachers ein Reservoir und eine Mikropumpe enthalten, um das genetische Material direkt an die Röhre 89 abzugeben. Die Hauptlänge des Katheters weist eine Außenhülle aus einem biokompatiblen Isolierstoff 96 und mindestens einem gewickelten Leiter 95 auf, der die elektrisch leitende Verbindung vom Schrittmacher zur Elektrode 97 an der distalen Spitze des Katheters darstellt. Der Katheter umfasst ferner eine axial angeordnete Polymerkanüle 103, die die Röhre 87 aufweist, durch zumindest einen Abschnitt der Katheterlänge hindurch verläuft, innerhalb der Spule 95 angeordnet ist und eine Innenfläche für die Katheterröhre darstellt. Die Kanüle endet am distalen Ende des Katheters, genau proximal zum Spitzenabschnitt der Elektrode 97, die mit einer porösen Außenfläche dargestellt ist. Die Elektrode 97 weist eine mittige Öffnung auf, die mit dem porösen Elektrodenmaterial bedeckt dargestellt ist und durch die genetisches Material gelangen kann, wenn der Katheter im Patienten angeordnet ist. Wie dargestellt, ist der gewickelte Leiter 95 mit der Elektrode 97 elektrisch leitend verbunden und vermittelt zwischen dem Schrittmacher und der Elektrode Stimulationsimpulse und erfasste Herzsignale. Selbstverständlich weist die Elektrode/der Katheter 90 bei einer bipolaren Ausführungsform eine zweite Elektrode (nicht dargestellt) auf, zweckmäßigerweise eine Ringelektrode genau proximal zur Elektrode 97. Wie dargestellt, wird zur Befestigung oder Verankerung der distalen Spitze an der Herzwand des Patienten auch eine Befestigungsvorrichtung, wie die Zacken 98, verwendet.
Die Pumpe 100 kann zweckmäßigerweise eine osmotische Minipumpe sein, die die darin enthaltene Flüssigkeit durch die Röhre 102 in den Katheterabschnitt 88 und durch die Röhren 89, 87 bis zur Spitzenelektrode 97 pumpt. Wie zuvor erwähnt, können das Reservoir und die Pumpe alternativ in der Schrittmachervorrichtung selbst eingebaut sein. In jedem Fall wird das genetische Material mit sehr geringem Druck aus dem Reservoir heraus durch die Röhre des Katheters bis zur Elektrode befördert, wo es durch den mittigen Elektrodenkanal geleitet wird, um Myokardzellen zu kontaktieren. Der Röhrenabschnitt 87, der von der Kanüle bereitgestellt wird, kann als Reservoir verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform kann die Abgabe entweder passiv oder mit Hilfe einer Mikropumpe (nicht dargestellt) erfolgen.
Das genetische Material kann zuvor in die Kanüle eingefüllt oder mit einer Nadel eingebracht werden, kurz bevor der Katheter eingeführt und im Patienten positioniert wird.
Wie in 6B dargestellt, kann genau proximal zur freisetzenden Elektrode 97 eine Kammer 99 vorgesehen sein, die als Reservoir für das genetische Material dient. Das Isoliermaterial 96 besteht aus einem selbstabdichtenden Material, sodass es mit einer Nadel oder Ähnlichem durchstochen werden kann und sich selbst wieder abdichtet, wodurch das genetische Material vor der Implantation in die Kammer eingebracht werden kann. Alternativ kann das Isoliermaterial 96 eine Öffnung (nicht dargestellt) enthalten, durch die das genetische Material mit der Nadel eingebracht wird. Bei dieser Ausführungsform erfolgt die Abgabe des Materials ohne Pumpe, d.h. passiv, wobei das Material langsam durch den mikroporösen Abschnitt der Elektrode 97 abläuft.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Herzreizleitungsstörung" auf Störungen oder Unterbrechungen des normalen Herzreizleitungssystems bei einem Säugetier. Diese Störungen können die Folge angeborener Erscheinungen oder von Verletzungen sein und können als Erkrankungen wie beispielsweise das Sick-Sinus-Syndrom, das Bradykardie-Tachykardie-Syndrom, ein AV-Block, eine Bradykardie, Tachykardie und andere Rhythmusstörungen auftreten. Erscheinungsformen derartiger Herzreizleitungsstörungen wurden herkömmlich mit Arzneimitteln, künstlichen Leitungssystemen, wie Herzschrittmacher, der Ablationstherapie oder einer Kombination daraus behandelt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "genetisches Leitungsproteinmaterial" auf rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die die Leitungsproteine kodieren, oder alternativ auf die Leitungsproteine selbst, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Abgabesystemen verwendet werden. Bei Dauerbehandlungen oder Langzeitbehandlungen liegt das genetische Leitungsproteinmaterial in Form von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen vor, die das Leitungsprotein kodieren. Im Gegensatz dazu liegt das genetische Leitungsproteinmaterial bei akuten Behandlungen oder Kurzzeitbehandlungen in Form der Leitungsproteine selbst vor. Sobald das genetische Leitungsproteinmaterial ausgewählt wurde, wird es als "zuvor festgelegtes genetisches Material" bezeichnet.
Ein "rekombinantes Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, besteht aus einer isolierten Nukleotidsequenz, die das Leitungsprotein kodiert und in ein Transportvehikel eingesetzt wurde. Regulatorelemente wie der Promotor und das Polyadenylierungssignal sind mit der Nukleotidsequenz, die das Leitungsprotein kodiert, operabel verknüpft, wodurch das Protein produziert werden kann, wenn das rekombinante Nukleinsäuremolekül in eine Zelle eingebracht wird.
Die Nukleinsäuremoleküle, die die Leitungsproteine codieren, werden synthetisch oder vorzugsweise aus isolierten Nukleinsäuremolekülen, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Eine Nukleinsäure ist "isoliert", wenn sie von anderen Zellbestandteilen, wie beispielsweise andere zelluläre Nukleinsäuren oder Proteine, durch die den Fachleuten bekannten Standardtechniken gereinigt ist. Die codierende Region des Nukleinsäuremoleküls, das das Leitungsprotein codiert, kann ein Volllängen-Genprodukt oder ein Subfragment davon oder eine neue mutierte Sequenz oder eine Fusionssequenz codieren. Die Protein-codierende Sequenz kann eine zu der Zielzelle endogene Sequenz oder exogene Sequenz sein. Der Promotor, mit dem die codierende Sequenz operabel verknüpft ist, kann ein Promotor sein, der normalerweise mit der codierenden Sequenz verknüpft ist oder nicht.
Das Nukleinsäuremolekül, das das Leitungsprotein codiert, wird in ein entsprechendes Abgabevehikel, wie beispielsweise ein Expressionsplasmid, Kosmid, YAC-Vektor und dergleichen, inseriert. Fast jedes Abgabevehikel kann zum Einbringen von Nukleinsäuren in das kardiovaskuläre System verwendet werden, einschließlich beispielsweise rekombinanter Vektoren, wie einer auf der Basis von Adenovirus, Serotyp 5, Ad5, wie bei French et al., Circulation, 1994, 90, 2414–2424 ausgeführt. Ein zusätzliches Protokoll für den Adenovirusvermittelten Gentransfer auf Herzzellen ist in WO 94/11506 und bei Barr, et al., Gene Ther., 1994, 1, 51–58 ausgeführt. Weitere rekombinante Vektoren umfassen beispielsweise DNA-Plasmidvektoren, wie einer, der sich von pGEM3 oder pBR322 ableitet, wie bei Ascadi, et al., The New Biol., 1991, 3, 71–81, und Gal, et al., Lab. Invest., 1993, 68, 18–25 ausgeführt, cDNA-enthaltende Liposome, künstliche Viren, Nanopartikel und dergleichen. Es wird auch davon ausgegangen, dass Leitungsproteine direkt in das Myokard injiziert werden.
Die regulatorischen Elemente der rekombinanten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind in der Lage, die Expression in Säugerzellen insbesondere in menschlichen Zellen zu steuern. Die regulatorischen Elemente umfassen einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal. Zusätzlich können auch andere Elemente, wie eine Kozak-Region in das rekombinante Nukleinsäuremolekül eingeschlossen sein. Beispiele von Polyadenylierungssignalen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen SV40-Polyadenylierungssignale und LTR-Polyadenylierungssignale. Insbesondere kann das SV40-Polyadenylierungssignal, das sich in dem pCEP4-Plasmid (Invitrogen, San Diego, CA) befindet, das als SV40-Polyadenylierungssignal bezeichnet wird, verwendet werden.
Die für die Konstruktion der erfindungsgemäßen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküle geeigneten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. Ein konstitutiver Promotor wird unter sämtlichen Bedingungen des Zellwachstums exprimiert. Beispielhafte konstitutive Promotoren umfassen die Promotoren für die folgenden Gene: Hypoxanthinphosphoribosyl-Transferase (HPRT), Adenosin-Deaminase, Pyruvat-Kinase, β-Actin, humanes Myosin, humanes Hämoglobin, humanes Muskelkreatin und andere. Zusätzlich funktionieren viele virale Promotoren in eukaryotischen Zellen konstitutiv und umfassen den frühen und späten SV40-Promotor, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor, die langen terminalen Wiederholungseinheiten (LTRs) des Moloney-Leukämie-Virus (Tippfehler im Original), das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), den unmittelbaren frühen Zytomegalovirus (CMV)-Promotor, das Epstein-Barr-Virus (EBV), Rous-Sarkoma-Virus (RSV) und andere Retroviren und den Thymidin-Kinase-Promotor des Herpes simplex-Virus. Weitere Promotoren sind den Fachleuten bekannt.
Die induzierbaren Promotoren werden in Gegenwart eines Induktionsmittels exprimiert. Beispielsweise wird der Metallothionein-Promotor zur Promotion (Steigerung) der Transkription in Gegenwart bestimmter Metallionen induziert. Weitere induzierbare Promotoren sind den Fachleuten bekannt.
Promotoren und Polyadenylierungssignale, die verwendet werden, müssen innerhalb der Zelle des Säugers funktionell sein. Um die Proteinproduktion zu maximieren, können regulatorische Sequenzen gewählt werden, die zur Genexpression in den Herzzellen, in die das rekombinante Nukleinsäuremolekül verabreicht wird, gut geeignet sind. Beispielsweise ist der Promotor vorzugsweise ein Herzgewebe-spezifischer Promotor-Enhancer, wie beispielsweise der kardiale Troponin-C-Isoform (cTNC)-Promotor. Parmacek, et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, 15970–15976, und Parmacek, et al., Mol. Cell. Biol., 1992 12, 1967–1976. Zusätzlich können Kodons gewählt werden, die in der Zelle besonders effizient transkribiert werden. Ein Fachmann kann rekombinante Nukleinsäuremoleküle herstellen, die in den Herzzellen funktionsfähig sind.
Genetisches Material kann in eine Zelle eingebracht oder von einer Zelle "kontaktiert" werden, beispielsweise durch Transfektions- oder Transduktionsvorgänge. Transfektion bedeutet die Akquisition von neuem genetischem Material durch eine Zelle durch Einarbeitung von zugefügten Nukleinsäuremolekülen. Eine Transfektion kann durch physikalische oder chemische Methoden erfolgen. Viele Transfektionstechniken sind den Fachleuten bekannt und schließen ein: Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation; DEAE-Dextran-DNA-Transfektion; Elektroporation; nackte Plasmidadsorption und kationische Liposomenvermittelte Transfektion. Transduktion bedeutet das Verfahren der Übertragung von Nukleinsäure in eine Zelle unter Verwendung eines DNA- oder RNA-Virus. Geeignete virale Vektoren zur Verwendung als Transduktionsmittel umfassen retrovirale Vektoren, Adenoassoziierte virale Vektoren, Vaccinia-Viren und Semliki-Forest-Virus-Vektoren.
Die Behandlung von Zellen oder das Kontaktieren von Zellen mit rekombinanten Nukleinsäuremolekülen kann in vivo oder ex vivo erfolgen. Zur ex vivo Behandlung werden die Zellen mit einem Abgabevehikel, das ein Nukleinsäuremolekül enthält, das ein Leitungsprotein codiert, aus einem Tier (vorzugsweise ein Mensch) isoliert, transformiert (d.h. in vitro transduziert oder transfiziert) und werden dann einem Empfänger verabreicht. Die Verfahrensweisen zur Entfernung von Zellen aus Säugern sind den Fachleuten gut bekannt. Zusätzlich zu Zellen kann Gewebe oder das gesamte oder Teile von Organen entfernt, ex vivo behandelt und sodann dem Patienten wieder zugeführt werden. Somit können Zellen, Gewebe oder Organe gezüchtet, gespült, perfundiert und dergleichen werden, mit der Maßgabe, die rekombinanten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in die gewünschten Zellen einzubringen.
Zur in vivo Behandlung werden Zellen eines Tiers, vorzugsweise eines Säugers und besonders bevorzugt eines Menschen, in vivo mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekül transformiert. Die in vivo Behandlung kann die systemische intravenöse Behandlung mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, wie lokale interne Behandlung mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül, wie durch lokalisierte Perfusion oder durch topische Behandlung, und dergleichen umfassen. Bei der Durchführung von in vivo Verabreichung des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls beruhen die bevorzugten Abgabevehikel auf nicht zytopathischen eukaryotischen Viren, in denen nicht essentielle oder komplementierbare Gene durch die Nukleinsäuresequenz von Interesse ersetzt wurden. Solche nicht zytopathi schen Viren umfassen Retroviren, deren Lebenszyklus die reverse Transkription genomischer viraler RNA in DNA mit anschließender proviraler Integration in Wirtszellen-DNA einschließt. Retroviren wurden unlängst zu humangenetischen Therapieversuchen zugelassen. Besonders geeignet sind diejenigen Retroviren, die replikationsdefizient sind (d.h. in der Lage sind, die Synthese der gewünschten Proteine zu steuern, allerdings nicht in der Lage sind, ein infektiöses Partikel herzustellen). Solche genetisch veränderte retrovirale Expressionsvektoren besitzen eine allgemeine Brauchbarkeit für die hoch effiziente Transduktion von Genen in vivo. Standardprotokolle zur Produktion von replikationsdefizienten Retroviren (einschließlich der Schritte der Einarbeitung von exogenem genetischem Material in ein Plasmid, Transfektion einer Verpackungszelllinie mit Plasmid, Produktion von rekombinanten Retroviren durch die Verpackungszelllinie, Sammlung von viralen Partikeln aus Gewebekulturmedien und Infektion der Zielzellen mit viralen Partikeln) sind bei Kriegler, M. "Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual", W.H. Freeman Co., New York (1990) und Murry, E.J., Hrsg. "Methods in Molecular Biology", Bd. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991) bereitgestellt.
Ein bevorzugtes Virus zum Kontaktieren von Zellen bei bestimmten Anwendungen, wie bei in vivo Anwendungen, ist das Adeno-assoziierte Virus, ein doppelsträngiges DNA-Virus. Das Adeno-assoziierte Virus kann gentechnisch so hergestellt werden, dass es replikationsdefizient und in der Lage ist, einen breiten Bereich von Zelltypen und Spezies zu infizieren. Es hat weiterhin Vorteile, wie Wärme- und Lipid-Lösungsmittel-Stabilität, hohe Transduktionsfrequenzen in Zellen verschiedener Abstammungslinien, einschließlich hämopoietischer Zellen, und fehlende superinfektiöse Inhibition, was somit mehrere Serien von Transduktionen ermöglicht. Neuere Berichte zeigen an, dass das Adeno-assoziierte Virus auch extrachromosomal funktionieren kann.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuremoleküle umfassen, die die Leitungsproteine codieren, oder als Alternative die Leitungsproteine an die Herzzellen der festgelegten Stelle im Herzen abgegeben, wie durch vorstehend ausgeführte Mapping-Verfahren, unter Anwendung der vorstehend ausgeführten Abgabesysteme, bestimmt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Nukleinsäuremoleküle, die die Leitungsproteine codieren, die Volllängen-codierende cDNA-Sequenz eines Leitungsproteins. Vorzugsweise sind die Leitungsproteine die Gap-junction-Proteine; stärker bevorzugt sind sie die Connexin-Proteine. Solche Nukleinsäuremoleküle sind in den Druckschriften von Fishman, et al., J. Cell. Biol., 1990, 111, 589–598, und von Kanter, et al., J. Mol. Cell Cardiol., 1994, 26, 861–868 beschrieben, die die Vollängen-codierende cDNA-Sequenz der Konnexin-gap-junction-Proteine Cx43, bzw. Cx40 bzw. Cx45 enthalten.
Der Einbau der gap-junction-codierenden Nukleinsäuremoleküle oder der Gap-junction-Proteine in normale Herzzellen, die eine zu einem Herzstillstand führende Narbe umgeben, ergibt eine normale oder verstärkte Leitung. Alternativ wird vorgeschlagen, dass der Einbau der gap-junction-codierenden Nukleinsäuremoleküle oder der Gap-junction-Proteine in anormale Herzzellen, diejenigen Zellen, die Cardioleitungsstörungen aufweisen, normale oder verstärkte Leitungseigenschaften ergibt. Die Bestimmung des entsprechenden genetischen Leitungsproteinmaterials, d.h. die Bestimmung, welches Konnexin-Protein geeignet ist, hängt von der bestimmten diagnostizierten Cardioleitungsstörung ab. Wenn beispielsweise die Cardioleitungsstörung ein Herzstillstand oder eine Bradykardie ist, wobei die Leitung verlangsamt oder nicht existent ist, werden vorzugsweise Cx43 oder Cx40, die schnelleren Konnexine, verwendet. Wenn jedoch die Cardioleitungsstörung eine Tachykardie ist, wobei die Leitung zu schnell ist, wird vorzugsweise Cx45 verwendet.
Nukleinsäuremoleküle, die Nukleotidsequenzen umfassen, die die Konnexin-Proteine Cx40, Cx43 und Cx45 codieren, werden nach den bei Fishman, et al., J. Cell. Biol., 1990, 111, 589–598 und Kanter, et al., J. Mol. Cell Cardiol., 1994, 26, 861–868 ausgeführten Verfahren isoliert und gereinigt. Die Nukleinsäure- und Protein-Sequenzen von Cx40 sind in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 ausgeführt. Die Nukleinsäure- und Protein-Sequenzen von Cx43 sind in SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 ausgeführt. Die Nukleinsäure- und Protein-Sequenz von CX45 sind in SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 6 ausgeführt. Es wird davon ausgegangen, dass die Nukleinsäuremoleküle, die Nukleotidsequenzen einschließen, die vorzugsweise zu mindestens 70 %, stärker bevorzugt zu mindestens 80 % und besonders bevorzugt zu mindestens 90 % homolog sind mit den in SEQ ID NOs: 1, 3 und 5 beschriebenen Konnexin-Nukleotidsequenzen sind, ebenfalls verwendet werden können.
Es ist selbstverständlich, dass geringfügige Modifikationen der Nukleotidsequenz oder der primären Aminosäuresequenz zu Proteinen führen können, die entsprechende oder verstärkte Aktivität im Vergleich zu den hier beispielhaft angegebenen Leitungsproteinen aufweisen.
Diese Modifikationen können beabsichtigt sein; wie durch ortsgerichtete Mutagenese, oder zufällig sein, wie durch Mutationen in Wirten, die die Leitungsgproteine produzieren. Eine "Mutation" in einem Protein verändert seine Primärstruktur (relativ zu dem üblicherweise auftretenden oder speziell beschriebenen Protein) auf Grund von Änderungen in der Nukleotidsequenz der DNA, die es codiert. Diese Mutationen umfassen speziell allelische Varianten. Mutationsänderungen in der Primärstruktur eines Proteins können zu Deletionen, Additionen oder Substitutionen führen. Eine "Deletion" ist als Polypeptid definiert, in dem ein oder mehrere interne Aminosäurereste in Vergleich zu der nativen Sequenz fehlen. Eine "Addition" ist als Polypeptid definiert, das ein oder mehrere zusätzliche interne Aminosäurereste im Vergleich zu dem Wildtypprotein aufweist. Eine "Substitution" ergibt sich aus dem Ersatz von einem oder mehreren Aminosäureresten durch andere Reste. Ein Protein-"Fragment" ist ein Polypeptid, bestehend aus einer primären Aminosäuresequenz, die mit einem Teil der Primärsequenz des Proteins, mit dem das Polypeptid verwandt ist, identisch ist.
Bevorzugte "Substitutionen" sind diejenigen, die konservativ sind, d.h. wobei ein Rest durch einen anderen des gleichen allgemeinen Typs ersetzt ist. Wie es gut verstanden wird, können natürlich vorkommende Aminosäuren als sauer, basisch, neutral und polar oder als neutral und nicht polar und/oder aromatisch in Unterklassen aufgeteilt werden. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass codierte Peptide, die sich von der nativen Form ableiten, substituierte Kodons für Aminosäuren enthalten, die der gleichen Gruppe entstammen, wie diejenige der ersetzten Aminosäure. Somit sind im Allgemeinen die basischen Aminosäuren Lys, Arg und Histidin gegenseitig austauschbar; die sauren Aminosäuren Asp und Glu sind gegenseitig austauschbar; die neutralen polaren Aminosäuren Ser, Tyr, Cys, Gln und Asn sind gegenseitig austauschbar; die nicht polaren aliphatischen Aminosäuren Gly, Ala, Val, Ile und Leu sind bezüglich zueinander (jedoch auf Grund der Größe sind Gly und Ala enger verwandt und Val, Ile, und Leu sind enger verwandt) konservativ, und die aromatischen Aminosäuren Phe, Trp und Tyr sind gegenseitig austauschbar.
Obgleich Pro eine nicht polare neutrale Aminosäure ist, bereitet sie auf Grund ihrer Auswirkungen auf die Konformation Schwierigkeiten, und Substitutionen durch oder für Pro sind nicht bevorzugt, mit der Ausnahme, wenn die gleichen oder ähnliche konformative Ergebnisse erhalten werden können. Polare Aminosäuren, die konservative Änderungen darstellen, umfassen Ser, Tyr, Gln, Asn; und zu einem geringeren Ausmaß Met. Zusätzlich sind, obwohl in verschiedene Kategorien eingeteilt, Ala, Gly und Ser anscheinend gegenseitig austausch bar, und Cys passt zusätzlich in diese Gruppe oder kann mit den polaren neutralen Aminosäuren klassifiziert werden. Einige Substitutionen durch Kodons für Aminosäuren aus verschiedenen Klassen können ebenfalls geeignet sein.
Nachdem die Nukleinsäuremoleküle, die die Konnexin-Proteine codieren, isoliert und nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt sind, werden rekombinante Nukleinsäuremoleküle hergestellt, wobei das gewünschte Konnexin-Nukleinsäuremolekül in ein Abgabevehikel durch Verfahren eingebaut wird, die den Fachleuten bekannt sind, wie beispielsweise bei Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Press (1989) gelehrt. Bevorzugte Abgabevehikel umfassen beispielsweise Plasmide (Ascadi, et al., The New Biol., 1991, 3, 71–81, und Gal, et al., Lab. Invest., 1993, 68, 18–25) und Adenovirus (WO 94/11506 und bei Barr, et al., Gene Ther., 1994, 1, 51–58). Die Nukleinsäuremoleküle, die Konnexin-Proteine codieren, oder Konnexin-Proteine, die davon hergestellt wurden, werden durch die erfindungsgemäßen Abgabesysteme an Herzzellen an der festgelegten Herzstelle abgegeben. Somit werden solche erfindungsgemäßen Abgabesysteme dazu verwendet, die Herzzellen der identifizierten Herzstelle, die Herzzellen mit Cardioleitungsstörungen einschließt, mit rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die ein Konnexin-Protein codieren, oder mit Konnexin-Proteinen zu kontaktieren.
Wenn das genetische Leitungsproteinmaterial in Form von Leitungsproteinen vorliegt, können solche Proteine in größeren Mengen unter Verwendung von verschiedenen Expressionsstandardsystemen, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Maual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Press (1989), Ss. 16.1–16.55.
Die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle oder Konnexin-Proteine werden vorzugsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung abgegeben. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise das rekombinante Nukleinsäuremolekül oder Protein in einem Volumen von Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 5 % Saccharose einschließen. Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung wird das rekombinante Nukleinsäuremolekül oder Protein mit geeigneten pharmazeutischen Trägern abgegeben, wie diejenigen, die in der neuesten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ein Standard-Nachschlagezwerk auf diesem Gebiet, beschrieben sind. Das rekombinante Nukleinsäuremolekül oder Protein wird in einer therapeutisch wirksamen Menge abgegeben. Eine solche Menge wird experimentell bestimmt und ist diejenige Menge, die entweder die normale Leitung wieder herstellt oder die anormale Leitung von Herzzellen verbessert. Die Menge an rekombinantem Nukleinsäuremolekül oder Protein liegt vorzugsweise zwischen 0,01 μg und 100 mg, stärker bevorzugt zwischen 0,1 μg und 10 mg, stärker bevorzugt zwischen 1 μg und 1 mg und besonders bevorzugt zwischen 10 μg und 1 mg. Eine therapeutisch wirksame Einzelmenge wird als Bolus bezeichnet. Wo Adenovirusvektoren eingesetzt werden, liegt die Menge an rekombinantem Nukleinsäuremolekül vorzugsweise zwischen 10⁷ Plaquebildenden Einheiten (pfu) und 10¹⁵ pfu, stärker bevorzugt zwischen 10⁸ pfu und 10¹⁴ pfu und besonders bevorzugt zwischen 10⁹ pfu und 10¹² pfu. Eine therapeutisch wirksame Einzelmenge von genetischem Leitungsproteinmaterial wird als Bolus bezeichnet. Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Abgabe der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle oder Proteine mit Steroid-Elution kombiniert, wie mit Dexamethasonnatriumphosphat, Beclamethason und dergleichen, um die Entzündungsprozesse zu steuern.
Die folgenden Beispiele sollen beispielhaft für die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sein und sollen nicht einschränkend gedacht sein.
BEISPIELE
Beispiel 1: Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuremolekülen, die die Konnexin-Proteine codieren
Nukleinsäuremoleküle, die Cx43, Cx40 und Cx45 codieren, werden nach allgemeinen, den Fachleuten gut bekannten Verfahren isoliert und gereinigt. Kurz gesagt, wird zelluläre Gesamt-RNA aus Herzgewebe, Herztransplantationsspendern oder aus Zahnfleischgewebe isoliert und gereinigt (Chomczynsky, et al., Anal. Biochem., 1987, 162, 156–159) und auf Poly(A)-RNA selektiert (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Press (1989), Ss. 7.26–7.29). cDNA, entsprechend den Konnexin-Proteinen, wird aus der kardialen Poly(A)-RNA durch reverse Transkription unter Verwendung eines GENEAMP^TM-PCR-Testsatzes (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) oder dergleichen unter Verwendung von statistischen Hexameren nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die speziellen Konnexin-Nukleinsäuremoleküle werden durch die Polymerasekettenreaktion (PCR), ebenfalls unter Verwendung des GENEAMP^TM-PCR-Testsatzes oder dergleichen, unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern, die für jedes der verschiedenen Konnexin-Proteine spezifisch sind, nach den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Beispielsweise kann der Vorwärtsprimer für Cx43 5'- ATGCCTGACTGGACCGCCTTAGGC-3'(SEQ ID NO: 7) sein, und der Rückwärtsprimer kann 5'-GATCTCGAGGTCATCAGGCCGAGG-3' (SEQ ID NO: 8) sein. Beispielsweise kann der Vorwärtsprimer für Cx45 sein 5'-ATGAGTTGGAGCTTTCTGACTCGC-3' (SEQ ID NO: 9), und der Rückwärtsprimer kann 5'-AATCCAGACAGAGTTCTTCCCATC-3' (SEQ ID NO: 10) sein. Beispielsweise kann der Vorwärtsprimer für Cx40 5'-ATGGGCGATTGGAGCTTCCTGGGA-3' (SEQ ID NO: 11) sein und der Rückwärtsprimer kann 5'-CACTGATAGGTCATCTGACCTTGC-3' (SEQ ID NO: 12) sein. Es ist selbstverständlich, dass zusätzliche Primer zur Amplifikation verwendet werden können, wie durch die Fachleute bestimmt.
Diesen Primern können am 5'-Terminus Nukleotidsequenzen vorangehen, die Endonuklease-Restriktionsschnittstellen zur leichten Einarbeitung in Vektoren enthalten. Die speziellen Konnexin-Nukleinsäuremoleküle können auch durch PCR aus menschlicher genomischer DNA (Stratagene, San Diego, CA) amplifiziert werden. Nach Schneiden der PCR-Produkte mit den (der) entsprechenden Restriktionsendonuklease(n) werden die PCR-Produkte durch Phenol: Chloroform-Extraktionen oder unter Verwendung von handelsüblichen Reinigungs-Testsätzen, wie beispielsweise MAGIC^TM Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI), gereinigt. Die spezielle Nukleotidsequenz der PCR-Produkte wird durch herkömmliche DNA-Sequenzierungsvorgänge bestimmt, und die Identität der PCR-Produkte durch Vergleich mit den für die Konnexin-Proteine veröffentlichten Sequenzen bestätigt.
Beispiel 2: Insertion von Konnexin-cDNA in Abgabevehikel
Vorzugsweise wird Konnexin-cDNA in entweder Plasmid- oder adenovirale Vektoren inseriert. Plasmidvektoren umfassen beispielsweise pGEM3 oder pBR322, wie bei Acsadi, et al., The New Biol., 1991, 3, 71–81, und Gal, et al., Lab. Invest., 1993, 68, 18–25, ausgeführt. Adenovirale Vektoren umfassen beispielsweise Adenovirus Serotyp 5, Ad5, wie bei French, et al., Circulation, 1994, 90, 2414–2424 ausgeführt.
Vorzugsweise werden die zur Amplifikation der Konnexin-Nukleinsäuremoleküle verwendeten Primer mit einzigartigen Endonuklease-Restriktionsschnittstellen gestaltet, die am 5'-Ende angeordnet sind. In Abwesenheit einer solchen Anordnung können Polylinker-Abschnitte, die einzigartige Restriktionsschnittstellen enthalten, dazu ligiert werden. Nach Schneiden der gereinigten PCR-Produkte mit der (den) entsprechenden Restriktionsendonuklease(n) wird auch der Plasmidvektor, der einen Polylinker umfasst, mit den (der) gleichen Restriktionsen donuklease(n) geschnitten, wodurch das Konnexin-Nukleinsäuremolekül eine Stelle erhält, an der es ligiert wird. Auf ähnliche Weise wird rekombinantes Adenovirus (Gluzman, et al., in Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman, Hrsg., Cold Spring Harbor Press, 1982, Ss. 187–192, und French, et al., Circulation, 1994, 90, 2414–2424), das Konnexin-cDNA-Moleküle enthält, gemäß den Standardtechniken, die den Fachleuten gut bekannt sind, hergestellt.
Sequenzprotokoll

Claims

Abgabesystem zur Abgabe von genetischem Material an Herzgewebe mit einem Vorrat an rekombinierten Nukleinsäuremolekülen, die die Leitungsproteine kodieren, oder an Leitungsproteinen selbst, einem Reservoir für ein Halten des Vorrats an rekombinierten Nukleinsäuremolekülen, die die Leitungsproteine kodieren, oder an Leitungsproteinen selbst, einem Mappingkatheter, der einen Katheter und eine Mappingelektrode für ein Mapping des Herzgewebes zur Lokalisierung eines Ortes zur Abgabe des genetischen Materials in das Herzgewebe umfasst, und einer Abgabeeinrichtung zur Abgabe der rekombinierten Nukleinsäuremoleküle, die die Leitungsproteine kodieren, oder der Leitungsproteine selbst aus dem Reservoir zu dem Ort in dem Herzgewebe, um eine Vielzahl von Zellen in dem Herzgewebe zu kontaktieren.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem das genetische Material eine DNA oder eine RNA ist.
Abgabesystem nach Anspruch 2, bei dem die DNA oder die RNA kardiale Lückenverbindungsproteine kodiert.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem das genetische Material ein Protein ist.
Abgabesystem nach Anspruch 4, bei dem das Protein ein kardiales Lückenverbindungsprotein ist.
Abgabesystem nach Anspruch 3 oder 5, bei dem die kardiale Lückenverbindungsproteine Connexinproteine sind.
Abgabesystem nach Anspruch 6, bei dem die Connexinproteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Cx40, Cx43 und Cx45 besteht.
Abgabesystem nach Anspruch 3, bei dem das kodierte Lückenverbindungsprotein im wesentlichen durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 besteht.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Vorrat an genetischem Material einen Bolus aus genetischem Material mit Leitungsprotein umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem das Reservoir einen Vorrat von 0,1–10 ml des genetischen Materials enthält.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Mappingkatheter eine Mappingektrodeneinrichtung umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Katheter einen distalen Endabschnitt aufweist und die Reservoireinrichtung in dem distalen Endabschnitt angeordnet ist.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Katheter ein distales Ende mit einer Öffnung an dem distalen Ende zur Abgabe des genetischen Materials aus dem Reservoir durch die Öffnung aufweist.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Katheter eine distale Spitze mit einem hohlen schraubenförmigen Element umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 12, bei dem der distale Endabschnitt ein hohles schraubenförmiges Element umfasst, das einen Innenraum bildet, und die Reservoireinrichtung den Innenraum umfasst, wobei sich der Vorrat an genetischem Material mit Leitungsprotein darin befindet.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Katheter eine Röhre, durch die das genetische Material mit Leitungsprotein abgegeben wird, und eine mit der Röhre in Verbindung stehende distale Spitze zur Kontaktierung der Vielzahl von Zellen mit dem genetischen Material mit Leitungsprotein umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem der Katheter ein transvenöser endokardialer Katheter ist.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem die Abgabeeinrichtung ein hohles schraubenförmiges Element umfasst, das mit einem Bolus genetischen Materials geladen ist.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem die Abgabeeinrichtung eine Sonde umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 14, bei dem das hohle schraubenförmige Element Öffnungen für einen Austritt des genetischen Materials in das Herzgewebe umfasst, wenn das Element in das Gewebe geschraubt wird, und außerdem Stopfen in den Öffnungen umfasst, um sie normalerweise geschlossen zu halten, die sich jedoch auflösen, wenn das Element in dem Herzgewebe positioniert wird.
Abgabesystem nach Anspruch 1, bei dem die Abgabeeinrichtung implantierbar ist.
System nach Anspruch 1, das außerdem eine Steuereinrichtung zur Steuerung des Betriebs der Abgabeeinrichtung zur Abgabe der Dosen umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 22, bei dem die Steuereinrichtung eine Automatikeinrichtung zur automatischen Auslösung der Abgabe des genetischen Materials umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 22, bei dem die Steuereinrichtung eine Auslöseeinrichtung zur Auslösung der Abgabe des genetischen Materials umfasst, wobei die Auslöseeinrichtung ein externes Programmiergerät umfasst.
Abgabesystem nach Anspruch 2, bei dem die DNA oder RNA ein Teil eines Expressionsvektors ist.
Abgabesystem nach Anspruch 25, bei dem der Expressionsvektor ein viraler Vektor ist.
Abgabesystem nach Anspruch 26, bei dem der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.