DE60030334T2

DE60030334T2 - Vorrichtung zur myokardwiederherstellung bei myokard-infarkt

Info

Publication number: DE60030334T2
Application number: DE60030334T
Authority: DE
Inventors: G. Maura St. Paul DONOVAN; Orhan Houghton SOYKAN
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-11-04
Also published as: ATE454186T1; AU1586001A; ES2270880T3; CA2421451A1; JP4860893B2; US20040253209A1; ATE337046T1; EP1728532A1; EP1315537A1; DE60043678D1; AU2001215860B2; DE60030334D1; JP2004508110A; US6775574B1; EP1315537B1; AU2001215860C1; EP1728532B1; DK1315537T3; WO2002020088A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft implantierbare Systeme, um Schäden an Herzmuskeln nach einem Myokardinfarkt und allgemeiner in und/oder nahe bei beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe zu beheben. Dies beinhaltet insbesondere die Repopulation des beschädigten oder erkrankten Myokards mit undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen, die außerdem in situ durch die Verwendung von genetischen Herstellungsverfahren und durch eine Vermehrung durch elektrische Stimulation gebildet werden.
Hintergrund der Erfindung
Erkrankungen der Herzkranzarterie (CAD) betreffen in den USA jährlich 1,5 Millionen Menschen. Etwa 10% dieser Patienten sterben innerhalb des ersten Jahres und etwa 900000 erleiden einen akuten Myokardinfarkt. Bei CAD verringert die Bildung von Drusen unter dem Endothelgewebe das Volumen der Herzkranzarterie und vergrößert ihren Widerstand gegen den Blutstrom, wodurch die Sauerstoffversorgung verringert wird. Die Schädigung des Myokard (d. h. die mittlere und dickste Schicht der Herzwand, die den Herzmuskel enthält), das durch die Herzkranzarterie versorgt wird, beginnt innerhalb von 0,5 bis 1,5 Stunden irreversibel zu werden und ist nach 6–12 Stunden vollständig, was einen Zustand zur Folge hat, der als akuter Myokardinfarkt (AMI) oder einfach Myokardinfarkt (MI) bezeichnet wird.
Der Myokardinfarkt ist ein Zustand der irreversiblen Nekrose des Herzmuskels, die aus einer längeren Ischämie resultiert. Beschädigte oder erkrankte Bereiche des Myokards werden mit nicht kontraktilen Phagozytzellen infiltriert und werden schließlich durch Narbengewebe ersetzt. Dieses faserartige Narbengewebe trägt nicht wesentlich zur Kontraktion des Herzens bei und kann tatsächlich elektrische Abnormalitäten bewirken.
Die Menschen, die AMI überleben, besitzen ein 4- bis 6-mal größeres Risiko der Entwicklung einer Herzinsuffizienz. Gegenwärtige und vorgeschlagene Behandlungen der Menschen, die AMI überleben, konzentrieren sich aus pharmakologische Lösungen und chirurgische Eingriffe. Die Angioplastie mit und ohne Stents ist z. B. eine wohlbekannte Technik zur Verringerung der Stenose. Die meisten Behandlungen sind vorgesehen, um eine erneute Durchblutung zu erreichen und ventrikuläre Schädigungen minimal zu machen. Keine der gegenwärtigen oder vorgeschlagenen Therapien ist jedoch auf die Myokardnekrose (d. h. die Verschlechterung und das Absterben der Zellen des Merzmuskels) gerichtet. Da sich Herzzellen nicht teilen, um den beschädigten oder erkrankten Bereich zu repopulieren, wird sich dieser Bereich mit Bindegewebe füllen, das durch eindringendes Fibroblast gebildet wird. Fibroblast erzeugt außerzelluläre Matrixkomponenten, wovon Collagen am reichlichsten vorhanden ist. Weder das eigentliche Fibroblast noch das Bindegewebe, das es bildet, sind kontraktil. Deswegen hat sich die Forschung der molekularen und zellularen Kardiomyoplastie dahingehend entwickelt, sich direkt der Myokardnekrose zu widmen.
Die zellulare Cardiomyoplastie beinhaltet das Transplantieren von Zellen anstelle von Organen in das beschädigte erkrankte Myokard mit dem Ziel der Wiederherstellung seiner kontraktilen Funktion. Ein Überblick über die For schung auf dem Gebiet der zellularen Cardiomyoplastie ist in Cellular Cardiomyoplasty: Myocardial repair with Cell Implantation, herausgegeben von Kao und Chiu, Landes Bioscience (1997), insbesondere in den Kapiteln 5 und 8 angegeben. Koh u. a., J. Clinical Invest., 96, 2034–2042 (1995) verpflanzten Zellen von AT-1-Herztumorzelllinien in Hunde, stellten jedoch ein unkontrolliertes Wachstum fest. Robinson u. a., Cell Transplantation, 5, 77–91 (1991), verpflanzten Zellen von C₂C₁₂-Skeletalmuskelzelllinien in die Herzkammern von Mäusen. Obwohl diese Forschungen verblüffende Forschungsergebnisse zeigten, werden Zellen von gebildeten Zelllinien typischerweise vom menschlichen Empfänger abgestoßen. Li u. a., Annals of Thoracic Surgery, 62, 654–661 (1996), verpflanzte fötale Cardiomyozyten an die Herzen ausgewachsener Mäuse. Sie registrierten einen verbesserten systolischen Druck und stellten fest, dass das Vorhandensein dieser Zellen eine Umgestaltung nach dem Infarkt verhinderte. Obwohl ihre Ergebnisse die Wirksamkeit der Technologie der Zelltransplantation zeigte, wäre diese Lösung in der klinischen Medizin wahrscheinlich nicht wirksam, da das gen-identische fötale Herzgewebe für menschliche Patienten nicht zur Verfügung steht. Chiu u. a., Ann. Thorac. Surg., 60, 12–18 (1995), führten eine Direktinjektion von gezüchtetem skelettalen Fibroblast an Hundeherzen aus und stellten fest, dass ein gut entwickeltes Muskelgewebe erkannt werden konnte. Dieses Verfahren ist jedoch stark invasiv, wodurch seine Anwendbarkeit bei menschlichen MI-Patienten eingeschränkt ist.
Die molekulare Kardiomyoplastie hat sich entwickelt, da Fibroblaste bzw. Fibroblast-Zellen genetisch manipuliert werden können. Das heißt, da Fibroblast-Zellen, die nicht endgültig differenziert sind, aus dem gleichen embryonalen Zelltyp entstehen wie skelettale Muskeln, kann ihr Phänotyp modifiziert werden und sie können möglicherweise in skelettale Muskelsatellitenzellen umgewandelt werden. Dies kann erfolgen, indem Mitglieder einer Genfamilie (myogenetische Determinationsgene oder "MDGS"), die für den skelettalen Muskel spezifisch sind, verwendet werden. Ein genetisch hergestelltes Adeno-Virus, das das Myogen-Gen trägt, kann durch Direktinjektion an die MI-Zone abgegeben werden. Das Virus durchdringt die Zellmembran und verwendet den eigenen Mechanismus der Zelle, um das Myogen-Protein zu erzeugen. Durch die Einführung des Myogen-Proteins in eine Zelle beginnt die Bildung des Myogen-Gens, das ein Gen des skelettalen Muskels ist und seinerseits die Bildung der anderen Mitglieder des MDGS anregt und die Fibroblast-Zellen in skelettale Myoblast-Zellen umwandeln kann. Um diese Gen-Kaskade in Fibroblast-Zellen zu erreichen, kann die Replikation des fehlenden Adeno-Virus, das das Myogen-Gen trägt, verwendet werden, um das exogene Gen in die Hostzellen zu transportieren. Nachdem das Virus die Fibroblast-Zellen infiziert hat, beginnt das Myogen-Protein, das von den Viral-Genen erzeugt wird, die Bildung der endogenen Gene, wodurch der Kaskadeneffekt ausgelöst wird, und das Fibroblast wird in ein Myoblast umgewandelt. Ohne Kernhülle geht das Virus zu Grunde, die zelleigenen Gene erhalten jedoch den Zell-Phenotyp als eine skelettale Muskelzelle.
Dieses Konzept wurde in vitro sehr gut entwickelt. Tam u. a., J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 918–924 (1995), verwendeten MyoD, das einen Retrovirus darstellt, in vitro für die Umwandlung von Fibroblast in Myoblast. Seine Lebensfähigkeit wurde jedoch in vivo nicht nachgewiesen. Klug u. a., J. Amer. Physiol. Society, 1913–1921 (1995), verwendeten z. B. SV40 in vivo und waren erfolgreich bei der Reproduktion des Kerns und der DNA, jedoch nicht bei den eigentlichen Kardiomyozyten. Außerdem beschrieben Leor u. a., J. Molecular and Cellular Cardio logy, 28, 2057–2067 (1996), die Erzeugung in situ von neuem kontraktilen Gewebe unter Verwendung von Techniken der Gen-Abgabe.
Die Verwendung von Herzschrittmachern, um die Funktion des Herzens zu korrigieren oder zu verbessern, ist in der medizinischen Kunst, einschließlich ihrer Verwendung in spezialisierteren Routinen, der Umtrainierung von eingepflanztem skelettalen Muskelgewebe gut eingeführt. Die Patente EP 0 487 429 A1 und US 5.306.293 beschreiben eine Vorrichtung zum Überwachen von Herzparametern, um Tachykardie zu verhindern. In der Offenbarung ist die Erläuterung der Verwendung von derartigen Herzschrittmachern bei der aktiven und permanenten Überwachung von Herzen, die durch verpflanztes skelettales Muskelgewebe behandelt oder wiederhergestellt wurden, enthalten. In ähnlicher Weise beschreibt das Patent US 5.632.716 A eine Vorrichtung zum Muskeltraining zum Trainieren oder zur anderweitigen Vergrößerung des Herzmuskels, einschließlich des Trainierens von skelettalen Muskelimplantaten, die das Herzgewebe umgeben. Das Patent EP 054 733 beschreibt außerdem prinzipiell einen Herzschrittmacher gegen Rhythmusstörungen zum Stimulieren des Herzens und der skelettalen Muskelimplantate des Patienten, um die Herzleistung zu verbessern. Die beschriebene Vorrichtung erfasst und klassifiziert abnormale Herzzustände und verwendet den Stimulator, um Impulsfolgen an Elektroden zu liefern, die mit dem Muskel in Kontakt sind. Zur Unterstützung der Prozedur der Verwendung von Implantaten des skelettalen Muskelgewebes am Herzen beschreibt das Patent US 4.791.911 ein Verfahren der Operation zur Herzrekonstruktion, die das Präparieren von bestimmtem Muskelklappengewebe enthält, um es zur Verwendung bei einer Implantationsprozedur in den Thorax einzusetzen.
Verschiedene fremde Mittel sind an das Herz abgegeben worden, um seine Leistung zu verbessern oder um Erkrankungen zu behandeln. Das Patent EP 0 547 733 beschreibt z. B. die Abgabe von Gen-Produkten in Herzmuskel- und Gefäßmuskelgewebe durch das Abgeben von Rekombinations-Adeno-Virusvektoren zur Verwendung in der Gen-Therapie, einschließlich der muskulären Dystrophie oder der Myokardinal-Ischämie. Bestimmte Offenbarungen, wie etwa WO 9 421 237 A, beschreiben ein System zur Kontrolle des Herzrhythmus mit einer implantierbaren Schrittmachervorrichtung und einer Vorrichtung zur gesteuerten Abgabe von Mitteln gegen Rhythmusstörungen.
Weitere Beschreibungen des Aufbaus und der Entwicklung von speziellen Herzschrittmachern sind in der Wissenschaft wohlbekannt. Das Patent EP 0 627 237 A beschreibt z. B. einen Herzschrittmacher zum Stimulieren von Epikard- und Myokardgewebe in einem Gehäuse ohne chirurgische Nähte. Das Gehäuse enthält einen Impulsgenerator, der mit einer Elektrodenspitze verbunden ist, die einen Teil der äußeren Oberfläche des Gehäuses bildet. Die Elektrodenspitze steht mit dem Epikard in direktem Kontakt. Das Patent US 4.256.115 beschreibt gleichfalls einen drahtlosen batteriebetriebenen Herzschrittmacher, der in eine kleine Scheibe eingepasst ist, die direkt am Herzmuskel befestigt ist.
Es besteht somit ein Bedarf an einem wirksamen System und einem Verfahren für eine in geringerem Maße invasive Abgabe von Repopulationsmitteln, wie etwa Zellen oder Vektoren, an die Stelle der Infarktzone des Myokards und allgemeiner in beschädigtes oder erkranktes Myokardgewebe und/oder in die Nähe von diesem.
Die folgenden Listen von Dokumenten von Patenten und Nichtpatenten offenbaren Hintergrundinformationen.
Tabelle 1a Patente
Tabelle 1b Ausländische Patentdokumente
Tabelle 1c Nichtpatent-Dokumente
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft implantierbare Systeme, die Beschädigungen an einem nektrotischen Herzmuskel nach einem Myokardinfarkt oder in und/oder nahe an beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe beheben. Dies beinhaltet insbesondere das Kombinieren eines Systems zum Bereitstellen einer Quelle eines Repopulationsmittels mit einer Stimulationsvorrichtung. Dies beinhaltet insbesondere die Repopulation des beschädigten oder erkrankten Myokards mit undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen und eine Vergrößerung des neu gebildeten Gewebes durch elektrische Stimulation, um zu bewirken, dass das neu gebildete Gewebe synchron mit dem Herzen kontrahiert, um die Herzfunktion zu verbessern.
Die Erfindung schafft ein implantierbares System, das umfasst:

a) eine isolierte Zellrepopulationsquelle, die in der Lage ist, neues kontraktiles Gewebe in und/oder nahe bei beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe zu bilden; und
b) eine elektrische Stimulationsvorrichtung zum elektrischen Stimulieren des neuen kontraktilen Gewebes in und/oder nahe bei dem beschädigten oder erkrankten oder Myokardgewebe, bei der die Zellrepopulationsquelle auf einen Träger bzw. Carrier beschichtet oder in diesem enthalten ist, wobei der Carrier die elektrische Stimulationsvorrichtung ist.

Das System, das die Zellrepopulationsquelle enthält, kann in das Myokard eines Patienten, vorzugsweise dort, wo das Myokard beschädigt oder erkrankt ist, z. B. dort, wo sich das Gewebe nach einem Myokardinfarkt befindet, implantiert sein. Die Zellrepopulationsquelle kann direkt an das Myokardgewebe, wie etwa in einen infarktbelasteten Gewebebereich, durch einen Katheter oder eher manuell durch eine Injektionsspritze abgegeben werden.
Die Zellrepopulationsquelle kann undifferenzierte kontraktile Zellen, wie etwa skelettale Muskelsatellitenzellen, Myoblast-Zellen, Stamm- oder Mesenchymalzellen und dergleichen oder differenzierte Herz- oder skelettale Zellen, wie etwa Cardiomyzyten, Myotube-Zellen und Muskelfaserzellen und dergleichen enthalten. Die implantierten Zellen können autologe Muskelzellen, allergene Muskelzellen oder xenogene Muskelzellen sein.
Die Zellrepopulationsquelle kann genetisches Material umfassen, das optional in einem Abgabemittel enthalten sein kann, wobei das Abgabemittel ein Nukleinsäuremolekül, wie etwa plasmide DNA bzw. DNS umfassen kann. Die plasmide DNS kann ferner optional wenigstens ein Gen enthalten. Das Nukleinsäuremolekül kann ein Gen codieren, wie etwa ein Myogen-Determinationsgen. Das Abgabemittel kann in Liposomen oder durch jede geeignete Quelle abgegeben werden.
Die Zellrepopulationsquelle kann zusätzlich eine polymere Matrix enthalten, die ferner einen Träger bzw. Carrier umfassen kann oder die Zellrepopulationsquelle kann auf einen Träger bzw. Carrier beschichtet sein.
Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann einen Muskelstimulator umfassen; kann optional zwei Elektroden umfassen, die mit dem beschädigten oder erkrankten Myokardgewebe verbunden ist und/oder nahe zu diesem angeschlossen ist und ist der Träger bzw. Carrier für die Zellrepopulationsquelle. In einer Betriebsart kann die elektrische Stimulationsvorrichtung eine Burst- bzw. Entladungsstimulation oder eine Pulsstimulation oder Kombinationen hiervon bereitstellen.
Die Repopulation des beschädigten oder erkrankten Myokards mit undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen kann unter Verwendung eines zellularen oder eines molekularen Lösungsansatzes ausgeführt werden. Zellulare Lösungsansätze beinhalten die Injektion entweder direkt oder über eine Koronarinfusion von z. B. undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen, vorzugsweise gezüchtete autologe skelettale Zellen, in die Infarktzone (d. h. den beschädigten oder erkrankten Bereich des Myokards). Molekulare Lösungsansätze beinhalten die Injektion entweder direkt oder über eine Koronarinfusion von z. B. Nukleinsäure, entweder in Form von reiner plasmider DNS, die wahlweise in Liposomen oder anderen derartigen Abgabemitteln enthalten ist, oder eines genetisch hergestellten Vektors in die Infarktzone, um Fibroblast-Zellen, die z. B. in die Infarktzone eindringen, in Myoblast-Zellen umzuwandeln. Der genetisch hergestellte Vektor kann einen viralen Expressionsvektor, wie z. B. einen Retrovirus, Adeno-Virus oder einen Adeno-Associated Viralvektor enthalten.
Verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schaffen einen oder mehrere der folgenden Vorteile: Wiederherstellung der Elastizität und Kontraktilität des Ge webes; verbesserte linke Ventrikularfunktion; Verringerung des Betrags der Remodellierung (d. h. Umwandlung des elastischen und kontraktilen Gewebes in unelastisches und nicht kontraktiles Gewebe); und verringerte Morbidität und Mortalität.
In einer Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung ein implantierbares System, das die Merkmale von Anspruch 1 sowie insbesondere umfasst: eine Zellrepopulationsquelle, die genetisches Material, undifferenzierte kontraktile Zellen, differenzierte kontraktile Zellen oder eine Kombination hiervon enthält, die in der Lage ist, neues kontraktiles Gewebe in und/oder nahe bei einer Infarktzone des Myokards eines Patienten und allgemeiner in und/oder nahe bei beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe zu bilden; und eine elektrische Stimulationsvorrichtung zum elektrischen Stimulieren des kontraktilen Gewebes in und/oder nahe bei einer Infarktzone des Myokards eines Patienten. Eine Infarktzone des Myokards oder beschädigtes oder erkranktes Myokardgewebe kann durch einen Fachmann bestimmt werden. Nahe bei einer Infarktzone oder beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe bedeutet ausreichend nahe, damit eine Beschädigung des nekrotischen Herzmuskels erkannt wird. Das bedeutet typischerweise innerhalb von etwa 1 Zentimeter (cm) vom Rand des Bereichs der Infarktzone oder des beschädigten oder erkrankten Gewebes.
In einer weiteren Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung ein implantierbares System, das die Merkmale von Anspruch 1 sowie insbesondere umfasst: eine Zellrepopulationsquelle mit einem geeigneten Zelltyp, wie etwa skelettale Muskelsatellitenzellen, der in der Lage ist, neues kontraktiles Gewebe in und/oder nahe bei einer Infarktzone des Bereichs von beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe des Myokards eines Patienten zu bilden; und eine elektrische Stimulationsvorrichtung zum elektrischen Stimulieren des neuen kontraktilen Gewebes in und/oder nahe bei einer Infarktzone des Myokards eines Patienten, wobei die elektrische Stimulationsvorrichtung eine Burst- bzw. Entladungsstimulation bereitstellt.
Bevorzugte Ausführungsformen werden nun lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
1 ist eine Darstellung eines implantierbaren Systems gemäß der vorliegenden Erfindung;
2 ist eine Darstellung einer Reihe von Impulsen einer bevorzugten elektrischen Stimulationsvorrichtung, die sie während ventrikulären Kontraktionen bereitstellt; und
3 ist ein Blockschaltplan, der verschiedenen Komponenten eines implantierbaren Impulsgenerators (IPG) veranschaulicht, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung umfasst ein System mit einer Zellrepopulationsquelle, das bzw. die in der Lage ist, neues kontraktiles Gewebe in und/oder nahe bei beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe zu bilden. Das System mit der Zellrepopulationsquelle kann in das Myokard eines Patienten implantiert werden, vorzugsweise dort, wo das Myokard beschädigt oder erkrankt ist, wie etwa in das Gewebe nach einem Myokardinfarkt. Die Zellrepopulationsquelle kann direkt an das Myokard, wie etwa einen vom Infarkt betroffenen Gewebebereich, durch einen Katheter oder eher manuell durch eine Injektionsspritze abgegeben werden.
Die Zellrepopulationsquelle kann undifferenzierte oder differenzierte kontraktile Zellen aufweisen, wie etwa skelettale Muskelsatellitenzellen, Myroblast-Zellen, Stamm- oder Mesenchymalzellen. Die implantierten Zellen können autologe Muskelzellen, allogene Muskelzellen oder xenogene Muskelzellen sein.
Die Zellrepopulationsquelle kann genetisches Material aufweisen, das optional in einem Abgabemittel enthalten ist, wobei das Abgabemittel ein Nukleinsäuremolekül, wie etwa plasmide DNA, enthalten kann. Die plasmide DNA kann optional wenigstens ein Gen enthalten. Das Nukleinsäuremolekül kann ein Gen codieren, wie etwa ein myogenes Determinationsgen. Das Abgabemittel kann in Liposomen oder in einer anderen geeigneten Quelle abgegeben werden.
Die Zellrepopulationsquelle kann zusätzlich eine polymere Matrix aufweisen, die einen Träger bzw. Carrier umfasst oder die Zellrepopulationsquelle kann auf einen Carrier beschichtet sein.
Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann einen Muskelstimulator aufweisen, der optional zwei Elektroden besitzt, die in oder nahe bei dem beschädigten oder erkrankten Myokardgewebe angeschlossen sind, und ist der Carrier für die Zellrepopulationsquelle. In einer Betriebsart kann die elektrische Stimulationsvorrichtung eine Burst- oder Entladungsstimulation oder eine Pulsstimulation oder Kombinationen hiervon bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem implantierbare Systeme, die die Schäden am nekrotischen Herzmuskel nach einem Myokardinfarkt durch Repopulation des beschädigten oder erkrankten Myokards mit undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen beheben. Diese Repopulation wird durch elektrische Stimulation verstärkt, um die Synchronität der Kontraktion des neu infundierten Gewebes mit der Herzkontraktion sicherzustellen.
Die Repopulation des beschädigten oder erkrankten Myokards mit undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen kann unter Verwendung von mehreren zellularen oder molekularen Lösungsansätzen ausgeführt werden. Typischerweise kann jede von mehreren Techniken, bei denen die undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen eine Repopulation der Infarktzone des Myokards ausführen, verwendet werden. In einer speziellen Anwendungsform können sie z. B. die Abgabe von undifferenzierten kontraktilen Zellen an die Infarktzone oder die Umwandlung von Zellen und das Züchten von undifferenzierten kontraktilen Zellen in situ beinhalten.
Zellulare Lösungsansätze beinhalten z. B. die Injektion, entweder direkt oder über eine Koronarinfusion, von undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen, die vorzugsweise gezüchtete Myoblast-Zellen (d. h. Muskelzellen) sind, wobei skelettale oder Herz-Myoblast-Zellen stärker bevorzugt sind, in die Infarktzone (d. h. der beschädigte oder erkrankte Bereich des Myokards) des Herzens. Die Zellen sind vorzugsweise autolog, um das Immunverhalten und die Gewebeabstoßung zu verringern und/oder zu eliminieren. Bei der Injektion werden typischerweise skelettale Myoblast-Zellen in Herzmuskelfasern differenziert.
Molekulare Lösungsansätze beinhalten z. B. die Injektion, entweder direkt oder über eine Koronarinfusion, von Nukleinsäure, entweder in der Form von reiner plasmider DNA, die optional in Liposomen oder ähnlichen Abgabemitteln enthalten ist, oder eines genetisch konstruierten Vektors, in die Infarktzone, um blastulare undifferenzierte Zellen (z. B. Fibroblast-Zellen oder Stammzellen), die in die Infarktzone eindringen, in Myoblast-Zellen umzuwandeln. Dieser Vektor kann ein Spiralvektor, vorzugsweise ein Andenoviral-Vektor sein, der Myogenin oder MyoD darstellt, die Elemente der Muskelfamilie der Gene sind, deren Genprodukte die phenotype Umwandlung von Fibroblast-Zellen in Myoblast-Zellen induzieren.
Diese Bereiche der repopulierten Zellen schaffen eine verbesserte diastolische Herzfunktion. Eine Vergrößerung der repopulierten Bereiche mit elektrischer Stimulation schafft in signifikanter Weise eine verbesserte systolische sowie eine verbesserte diastolische Funktion. Die vorliegende Erfindung schafft folglich Systeme, die eine Zellrepopulationsquelle (d. h. ein Zellrepopulationsmittel) und eine elektrische Stimulationsvorrichtung (d. h. eine Stimulationsquelle) enthalten. Die Zellrepopulationsquelle kann undifferenzierte kontraktile Zellen, wie etwa autologe Muskelzellen, oder Nukleinsäure für die Umwandlung von z. B. Fibroblast-Zellen in Myoblast-Zellen enthalten. Die Repopulationsquelle kann differenzierte Herz- oder skelettale Zellen, wie etwa Kardiomyozyten, Myotube-Zellen und Muskelfaserzellen und dergleichen, enthalten. Die Zellrepopulationsquelle kann durch direkte Injektion in das Myokard oder über die Koronargefäße abgegeben werden. Die Zellrepopulation kann unter Verwendung einer Injektionsspritze ausgeführt werden oder es kann alternativ eine Abgabevorrichtung, wie etwa ein Katheter, verwendet werden. Die Zellen oder das genetische Material kann gleichzeitig mit der Anwendung der elektrischen Stimulationsvorrichtung abgegeben werden. Die elektrische Stimulationsvorrichtung ist der Carrier der Zellen oder des genetischen Materials. Die elektrische Stimulations vorrichtung enthält typischerweise einen implantierbaren Muskelstimulator und Elektroden. Es ist wesentlich, dass sie keine Leitungen enthält, die sie mit anderen Vorrichtungen verbinden.
Die Zellrepopulationsquelle (d. h. das Zellrepopulationsmittel) kann Medikamente, leistungssteigende Mittel bzw. Chemikalien, Proteine und dergleichen enthalten, um z. B. eine lokale Angiogenese, die Zellenkontraktionsfähigkeit, das Zellwachstum und die Migration zu stimulieren. Diese können z. B. enthalten: aFGF (säurehaltiger Fibroblast-Wachstumsförderer), VEGF (Wachstumsförderer des vaskulären Endothels), tPA (Gewebe-Plasminogen-Aktivator), BARK (β-adrenergetische Rezeptorkinase), β-Blocker usw. Heparin und andere Antigerinnungsmittel, wie etwa Polyethylenoxid, Hirudin und ein Gewebe-Plasminogen-Aktivator können außerdem vor der Implantierung in der Zellrepopulationsquelle in einer Menge vorhanden sein, die wirksam ist, um Thrombose zu verhindern oder zu begrenzen.
In 1 enthält ein implantierbares System der vorliegenden Erfindung eine Abgabevorrichtung 10, die einen Carrier 22 für undifferenzierte kontraktile Zellen und/oder differenzierte Zellen aufweist, und kann getrennt oder zusätzlich genetisches Material (d. h. Nukleinsäure in einer Vielzahl von Formen) oder differenzierte kontraktile Zellen enthalten, die in Form einer elektrischen Stimulatorkapsel vorliegen. Bei Bedarf können andere Carrier in Abhängigkeit davon entworfen werden, ob eine direkte Injektion oder eine Koronarinfusion verwendet wird. Wie in 1 gezeigt ist, wird der Carrier 22 an die Infarktzone des Myokards eines Patienten unter Verwendung eines Katheters 19 abgegeben. In 1 ist die Zellrepopulationsquelle ein Umwandlungsvektor 14 von Fibroblast-Zellen in Myoblast-Zellen. Die Zellrepopulationsquelle (d. h. das Zellrepopulationsmittel) wird typischerweise von dem Carrier 22 durch passive Diffusion in die Infarktzone 16 eines Myokards 18 eines Patientenherzens freigegeben.
Undifferenzierte und differenzierte kontraktile Zellen
Zellen, die in der vorliegenden Erfindung für eine Implantierung geeignet sind, enthalten eine große Vielzahl von undifferenzierten kontraktilen Zellen. Diese werden typischerweise differenziert, um Muskelzellen zu bilden, sie können jedoch Fibroblast-Zellen, die ex vivo in Myoblast-Zellen umgewandelt wurden, oder eine große Vielzahl von immunologisch neutralen Zellen sein, die so programmiert wurden, dass sie als undifferenzierte kontraktile Zellen funktionieren. Geeignete Zellen für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthalten typischerweise Nabelzellen und skelettale Muskelsatellitenzellen.
Geeignete Zellen zur Implantation enthalten bzw. umfassen außerdem differenzierte Herz- oder skelettale Zellen, wie etwa Herz-Myozyt-Zellen, Myotube-Zellen und Muskelfaserzellen und dergleichen, wobei sie autologe, allogene oder xenogene, genetisch hergestellte und nicht hergestellte Zellen sind. Mischungen dieser Zellen können außerdem verwendet werden. Autologe Zellen sind besonders erwünscht. Die Zellen sind in der Lage, eine Repopulation der Infarktzone des Myokards auszuführen oder können gesundes Gewebe in beschädigten oder erkrankten Myokardbereichen einführen.
Skelettale Muskelsatellitenzellen sind für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, da sie sich zu Muskelzellen differenzieren können, die in der Lage sind, in Reaktion auf eine elektrische Stimula tion zu kontrahieren. Sie sind außerdem für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet, da sie aus Zellkulturen erhalten werden können, die aus den Biopsieproben des gleichen Patienten abgeleitet werden können. Biopsieproben enthalten vollentwickelte skelettale Fasern gemeinsam mit Reservezellen, die die vollentwickelten Fasern umgeben. Nachdem sie in einer Kultur angeordnet wurden, vermehren sich die Reservezellen und ihre Anzahl steigt rasch an. Die neu gezüchteten Zellen können wieder in das Herz in und/oder nahe bei der Infarktzone injiziert werden. Wenn sie sich in dem Herzmuskel befinden, verschmelzen die skelettalen Myoblast-Zellen, um Mehrkern-Myotube-Zellen zu bilden, die kontraktile Charakteristiken besitzen.
Obwohl skelettale Muskelzellen in der Lage sind zu kontrahieren, sind sie von Herzzellen verschieden. Die mechanischen und elektrischen Charakteristiken des skelettalen Muskels sind von denen des Herzmuskels recht verschieden. Skelettale Muskelsatellitenzellen kontrahieren mechanisch und entspannen sich sehr schnell. Um dauerhafte Kontraktionen zu erzeugen, werden deshalb skelettale Zellen ziemlich schnell gepulst, das bewirkt jedoch einen schwachen Entzug von Energiereserven und die Entwicklung von Muskelermüdung. Skelettale Muskeln können jedoch so konditioniert werden, dass sie bei Raten, die dem Herzmuskel ähnlich sind, oder gemeinsam mit diesem kontrahieren.
Skelettale Muskeln unterscheiden sich außerdem in ihren elektrischen Charakteristiken von Herzzellen. Jede skelettale Muskelfaser wird durch Acetylcholin stimuliert, das von dem motorischen Neuron, das den Muskel anregt, freigegeben wird. Herzzellen sind jedoch über eingeschaltete Scheiben miteinander verbunden, die Kanäle für den Durchgang von Ionen zwischen dem Cytoplasma der Zellen enthalten. Dieser Typ der elektrischen Verbindung ist zwischen skelettalen Muskelsatellitenzellen nicht vorhanden. Die Verwendung der elektrischen Stimulation umgeht dieses Problem und konditioniert die Zellen, dass sie sich bei Raten, die dem Herzmuskel ähnlich sind, oder gemeinsam mit diesem kontrahieren.
Jeder differenzierte oder undifferenzierte Zelltyp, der in das Myokard implantiert wird, könnte jedoch Nutzen aus dem Vorhandensein der elektrischen Stimulation ziehen, um die Kontraktionen synchron mit dem normalen physiologischen kontraktilen Rhythmus zu koordinieren.
Die undifferenzierten und/oder differenzierten Zellen können in Kombination mit einem Abgabemittel, wie etwa Liposome oder eine polymere Matrix, abgegeben werden, wie später genauer beschrieben wird.
Wenn die undifferenzierten und/oder differenzierten Zellen kontraktiles Gewebe bilden, kann ihre Funktion weiter verbessert werden, indem sie metabolisch verändert werden, indem z. B. die Bildung von Myostatin blockiert wird. Das vergrößert die Anzahl der Muskelfasern.
Genetisches Material
Nukleinsäure kann an Stelle von oder zusätzlich zu den undifferenzierten und differenzierten kontraktilen Zellen verwendet werden. Die Nukleinsäure kann in Form von reiner plasmider DNS, die in Liposomen oder anderen derartigen Abgabemitteln enthalten sein kann, oder von Vektoren, die die gewünschte DNS enthalten, vorliegen. Die Nukleinsäure ist in der Lage, nichtkontraktile Zellen in und/oder nahe bei der Infarktzone oder von beschädigtem oder erkranktem Gewebe des Myokards eines Patienten in kontrahierende (d. h. kontraktile) Zellen umzuwandeln. Bei Bedarf können jedoch nicht undifferenzierte kontrak tile Zellen, indem ex vivo genetische Konstruktionstechniken verwendet werden, in undifferenzierte kontraktile Zellen umgewandelt und anschließend an die Infarktzone abgegeben werden.
Es gibt eine große Vielzahl von Verfahren, die verwendet werden können, um Nukleinsäure an nicht undifferenzierte oder differenzierte kontraktile Zellen abzugeben. Fibroblast-Zellen können z. B. ihren Prototyp von verbindend in kontraktil umwandeln. Derartige Verfahren sind einem Fachmann auf dem Gebiet der genetischen Konstruktionstechnik wohlbekannt. Die gewünschte Nukleinsäure kann z. B. in ein geeignetes Abgabemittel, wie etwa eine Expressionsplasmid, ein Cosmid, einen YAC-Vektor und dergleichen, eingesetzt werden, um ein Rekombinations-Nukleinsäuremolekül zu erzeugen. Es gibt mehrere lebende oder inaktive Viren, einschließlich der Rekombinations-Viren, die außerdem verwendet werden können. Ein Retro-Virus kann genetisch modifiziert sein, um ein Gen aus einer Vielzahl von Genen abzugeben. Ein Adeno-Virus kann ebenfalls verwendet werden, um Nukleinsäure abzugeben, die in der Lage ist, nicht undifferenzierte kontraktile Zellen in undifferenzierte kontraktile Zellen, vorzugsweise Muskelzellen umzuwandeln. Ein "Rekombinations-Nukleinsäuremolekül", das hier verwendet wird, enthält eine isolierte Nukleotidsequenz, die in ein Abgabemittel eingesetzt ist. Regelungselemente, wie etwa das Promoter- und das Polyadenylationssignal, werden bei Bedarf funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz verknüpft.
Die Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise Rekombinations-Nukleinsäuremoleküle können synthetisch oder vorzugsweise aus isolierten Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden, wie später beschrieben wird. Eine Nukleinsäure ist "isoliert", wenn sie von anderen Zellbestandteilen, wie z. B. zellulare Nukleinsäuren oder Proteine, durch Standard techniken, die einem Fachmann bekannt sind, gereinigt ist. Der Codierbereich des Nukleinsäuremoleküls kann ein Genprodukt mit voller Länge und ein Teilstück davon oder eine neuartig mutierte oder Fusionssequenz codieren. Die Codiersequenz kann eine Sequenz sein, die für die Zielzelle endogen oder exogen ist. Der Promoter, dem die Codiersequenz funktionsfähig zugeordnet ist, kann ein Promoter sein, der normalerweise der Codiersequenz zugeordnet ist.
Nahezu alle Abgabemittel können verwendet werden, um Nukleinsäuren in das Herzgefäßsystem einzuleiten, einschließlich z. B. Rekombinationsvektoren, die z. B. auf dem Adeno-Virus Serotyp 5, Ad5 basieren, wie in French u. a., Circulation, 90, 2414–2424 (1994) dargestellt ist. Ein zusätzliches Protokoll für den durch einen Adeno-Virus vermittelten Gentransfer in Herzzellen ist in WO 94/11506, Johns, J. Clin. Invest., 96, 1152–1158 (1995) und in Barr u. a., Gene Ther., 1, 51–58 (1994) dargestellt. Andere Rekombinations-Vektoren enthalten z. B. plasmide DNA-Vektoren, wie etwa ein Vektor, der aus pGEM3 oder pBR322 abgeleitet ist, wie in Ascadi u. a., The New Biol., 3, 71–81 (1991) und Gal u. a., Lab. Invest., Lab. Invest., 68, 18–25 (1993) dargestellt ist, Liposome, die cDNA-enthalten, künstliche Viren, Nanopartikel und dergleichen.
Die Regelungselemente der Rekombinations-Nukleinsäuremoleküle sind in der Lage, die Expression in Säugetierzellen, insbesondere in menschliche Zellen zu steuern. Die Regelungselemente enthalten einen Promoter und ein Polyadenylationssignal. Außerdem können zusätzlich weitere Elemente, wie etwa ein Kozak-Bereich, in dem Rekombinations-Nukleinsäuremolekül eingeschlossen sein. Beispiele von Polyadenylationssignalen, die zum Realisieren der vorliegenden Erfindung praktisch sind, enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf SV40-Polyadenylationssignale und LTR-Polyadenylationssignale. Insbesondere das SV40-Polyadenylationssignal, das im Plasmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) vorhanden ist und als das SV40-Polyadenylationssignal bezeichnet wird, kann verwendet werden.
Die Promoter, die bei dem Aufbau von Rekombinations-Nukleinsäuremolekülen hilfreich sind, können konstitutiv oder induzierbar sein. Ein konstitutiver Promoter wird unter allen Bedingungen des Zellwachstums dargestellt. Beispielhafte konstitutive Promoter enthalten die Promoter für die folgenden Gene: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), Adenosin-Deaminase, Pyruvat-Kinase, β-Actin, menschliches Myosin, menschliches Hämoglobin, menschliches Muskelcreatin und andere. Außerdem wirken viele Viral-Promoter in eukaryotischen Zellen konstitutiv und enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die frühen und späten Promoter von SV40, den Promoter des Maus-Brusttumorvirus (MMTV), lange Endwiederholungen (LTRs) des Maloney-Leukämievirus, das Virus des menschlichen Immundefekts (HIV), den direkten frühen Promoter des Cytomegalovirus (CMV), das Epstein-Barr-Virus (EBV), das Rous-Sarcoma-Virus (RSV) und weitere Retroviren sowie den Thymidin-Kinase-Promoter des Herpes-Simplex-Virus. Weitere Promoter sind einem Fachmann bekannt.
Induzierbare Promoter werden in der Gegenwart eines Induziermittels dargestellt. Der Metallothionein-Promoter wird z. B. induziert, um die Umsetzung in der Gegenwart von bestimmten Metallionen zu unterstützen (zu verbessern). Weitere induzierbare Promoter sind einem Fachmann bekannt.
Promoter und Polyadenylationssignale, die verwendet werden, sind vorzugsweise in den Zellen des Patienten funk tionsfähig. Um die Proteinherstellung maximal zu machen, können Regelungsfolgen ausgewählt werden, die für eine Genexpression in den Herzzellen gut geeignet sind, in die das Rekombinations-Nukleinsäuremolekül verabreicht wird. Der Promoter ist z. B. ein herzgewebespezifischer Promoter-Verstärker, wie etwa der Herz-Isoform-Troponin-C-(cTNC) Promoter. Parmacek u. a., J. Biol. Chem., 265, 15970–15976 (1990) und Parmacek u. a., Mol. Cell Biol., 12, 1967–1976 (1992). Zusätzlich können Kodone ausgewählt werden, die in der Zelle am wirkungsvollsten umgesetzt werden. Ein Fachmann kann Rekombinations-Nukleinsäuremoleküle erzeugen, die in den Herzzellen funktionsfähig sind.
Genetisches Material kann in eine Zelle eingeführt werden und z. B. durch Transfektions- oder Transduktionsprozeduren mit einer Zelle "kontaktiert" (in Kontakt gebracht) werden. Die Transfektion bezeichnet die Erfassung durch eine Zelle des neuen genetischen Materials durch die Aufnahme von zugefügten Nukleinsäuremolekülen. Eine Transfektion kann durch physikalische oder chemische Verfahren erfolgen. Einem Fachmann sind viele Transfektionstechniken bekannt, einschließlich: Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation; DEAE-Deytran-DNA-Transfektion; Elektroporation; reine Plasmid-Adsorption, und kationische, durch Liposom vermittelte Transfektion. Transduktion bezeichnet den Prozess der Übertragung von Nukleinsäure in eine Zelle unter Verwendung eines DNA- oder RNA-Virus. Geeignete Viralvektoren zur Verwendung als Transduktionsmittel enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Retroviralvektoren, Adeno-Associated Viralvektoren, Vaccinia-Viren und Semliki-Forest-Virusvektoren.
Die Behandlung von Zellen oder das Kontaktieren von Zellen mit Rekombinations-Nukleinsäuremolekülen kann in vivo oder ex vivo erfolgen. Für eine ex vivo-Behandlung werden Zellen aus einem Tier (vorzugsweise einem Menschen) isoliert, mit einem Abgabemittel umgewandelt (d. h. in vitro einer Transduktion oder Transfektion unterzogen), das ein Nukleinsäuremolekül enthält, welches ein Ionenkanalprotein codiert, und anschließend einem Empfänger verabreicht.
Bei einer bevorzugten in vivo-Behandlung werden Zellen eines Tiers, wobei ein Säugetier bevorzugt und ein Mensch am stärksten bevorzugt ist, in vivo mit einem Rekombinations-Nukleinsäuremolekül umgewandelt. Die in vivo-Behandlung beinhaltet typischerweise eine lokale interne Behandlung mit einem Rekombinations-Nukleinsäuremolekül. Wenn die in vivo-Verabreichung des Rekombinations-Nukleinsäuremoleküls ausgeführt wird, basieren die bevorzugten Abgabemittel auf nichtzytophatischen eukaryotischen Viren, bei denen nichtwesentliche oder komplementierbare Gene mit der Nukleinsäuresequenz, die von Interesse ist, ersetzt wurden. Derartige nichtzytophatische Viren enthalten Retroviren, deren Lebenszyklus die umgekehrte Umwandlung der genomischen Viral-RNS in DNS mit der anschließenden proviralen Integration in zellulare Host-DNS beinhaltet. Am nützlichsten sind jene Retroviren, die einen Replikationsdefekt aufweisen (d. h., die eine Synthese der gewünschten Proteine ausführen können, jedoch nicht in der Lage sind, einen infektösen Partikel zu bilden). Derartige genetisch veränderte Retrovital-Expressionsvektoren besitzen im Allgemeinen eine Gebrauchsfähigkeit für die hochwirksame in vivo-Umwandlung von Genen. Standardprotokolle zum Herstellen von Retroviren, die einen Replikationsdefekt aufweisen (einschließlich der Schritte der Aufnahme von exogenem genetischen Material in ein Plasmid, der Transfektion einer Verpackungszelllinie mit Plasmid, der Produktion von Rekombinations-Retroviren durch die Verpackungszelllinie, der Sammlung von Viralpartikeln aus dem Gewebezuchtmedium und der In fektion der Zielzellen mit Viralpartikeln), sind einem Fachmann wohlbekannt.
Ein bevorzugtes Virus zum Kontaktieren von Zellen in bestimmten Anwendungen, wie etwa bei in vivo-Anwendungen, ist das Adeno-Associated Virus, ein doppelsträngiges DNS-Virus. Das Adeno-Associated Virus kann so hergestellt werden, dass es einen Replikationsdefekt aufweist und in der Lage ist, einen großen Bereich von Zelltypen und Zellarten zu infizieren. Es besitzt weitere Vorteile, wie etwa die Wärmestabilität und Stabilität gegen Lipidlösungsmittel, hohe Umwandlungsfrequenzen in Zellen mit verschiedenen Abstammungen, einschließlich hämopoietischer Zellen und das Fehlen einer Superinfektionssperre, wodurch mehrere Serien von Transduktionen möglich sind.
Die beispielhafte Nukleinsäure, die als Nukleinsäure zur Aufnahme in die Zellen wirken würde, enthält, ist jedoch nicht beschränkt auf Nukleinsäure, die ein myogenetisches Protein oder ein MyoD-Protein codiert. Die Nukleinsäure kann ein vollständiges Gen oder einen Abschnitt eines Gens enthalten. Beispielhafte Gene enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die aktiven Formen des Myogenin-Gens oder des MyoD-Gens.
Die Gensequenz der Nukleinsäure, die von dem Abgabemittel (vorzugsweise ein Virus) abgegeben wird, das Nukleinsäure-Codierproteine, Polypeptid oder Peptid enthält, steht von mehreren Quellen, einschließlich der GenBank (Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico), EMBL databases (Heidelberg, Germany) und University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, MI), aus veröffentlichten Zeitschriften, Patenten und Patentveröffentlichungen zur Verfügung. Alle diese Quellen stellen Ressourcen dar, auf die ein Fachmann einfach zugreifen kann. Die Gensequenz kann aus Zellen erhalten werden, die das Nukleinsäure-Fragment (allgemein DNS) enthält, wenn eine Gensequenz bekannt ist. Die Nukleinsäure kann erhalten werden entweder durch die Restriktion der Endonuklease-Digestion und die Isolation eines Genfragments oder durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonukleotiden als Primer, um entweder cDNS-Kopien der mRNS aus Zellen zu verstärken, die das Gen darstellen, das von Interesse ist, oder um cDNS-Kopien eines Gens aus Gen-Expressionsbibliotheken, die kommerziell zur Verfügung stehen, zu verstärken. Oligonukleotide oder kürzer DNS-Fragmente können durch bekannte Nukleinsäure-Synthesetechniken hergestellt oder von handelsüblichen Lieferanten von kundenspezifischen Oligonukleotiden, wie etwa Amitof Biotech Inc. (Boston, MA) oder dergleichen erhalten werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass eine Vielzahl von handelsüblichen Bausätzen zur Verfügung stehen, um cDNS aus mRNS zu erhalten (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Stratagene, La Jolla, CA und Invitrogen, San Diego, CA). Es gibt gleichfalls eine Vielzahl von handelsüblichen Gen-Expressionsbibliotheken, die für einen Fachmann zur Verfügung stehen, einschließlich der Bibliotheken, die von Stratagene und dergleichen zur Verfügung stehen. Allgemeine Verfahren zum Klonen, zur Polymerase-Kettenreaktion und der Vektorbildung stehen von Sambrook u. a. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) und Innis u. a. (PCR Strategies, 1995, Academic Press, New York, New York) zur Verfügung.
In Abhängigkeit von der maximalen Genomgröße, die ein bestimmtes Viralgenom aufnehmen kann oder die einem Viruspartikel zugeordnet werden kann, kann die das Virus an die Zelle abgebende Nukleinsäure eine Nukleinsäure enthalten, die ein oder mehrere Proteine, Polypeptide oder Peptide codiert. Oligonukleotide können durch Viren abgegeben werden, indem die Oligonukleotide in das Virus aufgenommen werden oder unter Verwendung von Verfahren, die einem Fachmann wohlbekannt sind, der äußeren Oberfläche des Virus zugeordnet werden.
Abgabemittel und Carrier
Zusätzlich zu den Viralvektor-Abgabemitteln kann das Zellrepopulationsmittel unabhängig davon, ob es genetisches Material ist oder undifferenzierte kontraktile Zellen enthält, Liposome oder eine polymere Matrix enthalten. Diese können auf den Carrier beschichtet oder auf andere Weise in dem Carrier enthalten sein, der die elektrische Stimulationsvorrichtung ist.
Die Zellen und/oder das genetische Material kann in Liposomen abgegeben werden, die kugelförmige Partikel in einem wässrigen Medium sind, das durch eine Lipid-Doppelschicht, die eine wasserhaltige Zelle umschließt, gebildet ist. Liposome für die Abgabe von genetischem Material stehen handelsüblich von Clontech Laboratories UK Ltd., Basingstoke, Hampshire, United Kingdom zur Verfügung.
Die Zellen und/oder das genetische Material kann in einer polymeren Matrix abgegeben werden, die sie einkapselt. Die polymere Matrix dieser Erfindung kann aus einem Homopolymer, einem Copolymer (d. h. ein Polymer aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Monomeren) oder eine Zusammensetzung (d. h. eine Mischung), die z. B. Fibrin mit beispielsweise einem oder mehreren Polymeren oder Copolymeren enthält, hergestellt sein. Die Zusammensetzung bildet vorzugsweise ein viskoelastisches, reißfestes, biologisch verträgliches Polymer. Der Ausdruck "viskoelastisch" beschreibt die vorgeschriebenen "Speicher"-Charakteristiken eines Moleküls, das eine Reaktion des Moleküls auf eine Belastung ermöglicht, wenn das Molekül eine Kombination aus elastischen Festkörpern und viskosen Fluiden ist. Der Ausdruck "reißfest" gibt an, dass dann, wenn das Polymer einer Zugbelastung ausgesetzt wird, das Material im Wesentlichen nicht reißt. Reißen bezieht sich auf die Ausbreitung einer Kerbe oder eines Einschnitts in dem unter Belastung befindlichen Material. Der hier verwendete Ausdruck "biologisch verträglich" bezeichnet ein Material, das keine toxischen oder verletzenden Wirkungen auf biologische Systeme besitzt.
Die polymere Matrix macht bevorzugt Reizungen der Herzwand minimal oder verstärkt diese nicht, wenn die Zellen oder das genetische Material an der Verwendungsstelle sind. Die polymere Matrix ist vorzugsweise nicht thrombogen, wenn sie allein oder abwechselnd angewendet wird, wenn sie mit antithrombogenen Mitteln, wie etwa Heparin und dergleichen, oder mit entzündungshemmenden Mitteln, wie etwa Dexamethason und dergleichen, verwendet wird. Die polymere Matrix kann in Abhängigkeit von der gewünschten Rate der Freigabe oder dem gewünschten Grad der Polymerstabilität ein biostabiles oder ein biologisch absorbierbares Polymer sein.
Die polymere Matrix dieser Erfindung kann ein oder mehrere andere synthetische oder natürliche Polymere enthalten. Geeignete Polymere enthalten jene, die mit den Zellen oder dem genetischen Material kompatibel sind. Sie können biostabil oder biologisch abbaubar sein. Sie enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Fibrine, Collagene, Alginate, Polyacrylsäuren, Polylactatsäuren, Polyglycolsäuren, Zellulosen, Hyaluronsäuren, Polyurethane, Silicone, Polycarbonate und eine große Vielzahl von anderen Stoffen, von denen bekannt ist, dass sie bei implantierbaren medizinischen Vorrichtungen nützlich sind. Die Polymere sind vorzugsweise hydrophil.
Wenn genetisches Material, wie etwa ein genetisch hergestellter Vektor, abgegeben wird, kann es vorzugsweise in einem vernetzten hydrophilen Polyacrylsäure-Polymer enthalten sein. Dies würde ein Hydrogel mit großem Molekulargewicht bilden, das als eine Beschichtung auf einem Carrier, wie etwa die elektrische Stimulationsvorrichtung, verwendet werden könnte. Das genetische Material wird vorzugsweise unmittelbar vor der Abgabe in dem Hydrogel aufgenommen, indem das Hydrogel erstmalig angequollen wird.
Wenn undifferenzierte und/oder differenzierte kontraktile Zellen abgegeben werden, können sie vorzugsweise in einem Gel des Collagens Typs I enthalten sein. Die Zellen können ursprünglich in einem Medium enthalten sein, das eine Lösung des Collagens vom Typ I enthält. Dieses Material kann dann in eine Form, die einen Carrier enthält, wie etwa die elektrische Stimulationsvorrichtung, gegossen werden. Nach der Inkubation bei einer Temperatur (z. B. 37°C) und für eine Zeitdauer (z. B. 30 Minuten), die zur Vernetzung des Collagens ausreichend ist, kann die beschichtete Vorrichtung entnommen werden. Bei Bedarf kann der resultierende Gen/Stimulator in dem Medium für eine Zeitdauer (z. B. 14 Tage), die für ein Zellwachstum ausreichend ist, gezüchtet werden.
In Abhängigkeit von der Zeitdauer der Zellintegration und Vermehrung kann die polymere Matrix in Form eines porösen Gerüsts vorliegen. Dies kann aus Polyurethan unter Verwendung eines lösbaren Salzes hergestellt werden, wie im Stand der Technik der Beschichtungsstents bekannt ist. Die poröse polymere Matrix kann mit extrazellularen Matrixkomponenten, wie etwa Fibronectin, Heparinsulfat usw., beschichtet sein und dann mit den undifferenzierten oder differenzierten Zellen geimpft werden, die optional zusätzliche genetische Komponenten enthalten können. Die Zellen können dann aus dem Gerüst wachsen.
Bei Bedarf kann eine Fibrinmatrix verwendet werden. Sie kann z. B. unter Verwendung einer Fibrinogen-Lösung und einer Lösung eines fibrinogen-koagulierenden Protein hergestellt werden. Fibrin gerinnt durch die Berührung des Fibrinogens mit einem fibrinogen-koagulierenden Protein, wie etwa Thrombin. Das Fibrinogen wird vorzugsweise in einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 mg/ml mit einem pH-Wert von etwa 5,89 bis etwa 9,0 und mit einer Ionenkonzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,45 verwendet. Die Fibrinogen-Lösung enthält typischerweise Proteine und Enzyme, wie etwa Albumin, Fibronectin, Faktor XIII, Plasminogen, Antiplasmin und Antithrombin III. Die Thrombin-Lösung, die zum Bilden des Fibrins hinzugefügt wird, ist typischerweise bei einer Konzentration von bis zu etwa 120 NIH-Einheiten/ml bei einer bevorzugten Konzentration der Calciumionen zwischen etwa 0,02 M und 0,2 M. Außerdem stammen das Fibrinogen und das Thrombin, die in der vorliegenden Erfindung zum Herstellen des Fibrins verwendet werden, vorzugsweise vom gleichen Tier oder vom gleichen menschlichen Wesen, wie jenes, in das die Zellen oder das genetische Material der vorliegenden Erfindung implantiert werden, um zwischen den Arten vorhandene Immunreaktionen zu vermeiden. Das resultierende Fibrin kann außerdem einer Wärmebehandlung bei etwa 150°C für etwa 2 Stunden unterzogen werden, um eine Antigenität zu verringern oder zu eliminieren.
Der Carrier zum Abgeben der Zellen und/oder des genetischen Materials enthält die elektrische Stimulationsvorrichtung und die Zellen und/oder das genetische Material werden z. B. in die Infarktzone des Myokards direkt injiziert.
Die Zellen und/oder das genetische Material können dem Carrier z. B. als eine Beschichtung oder eine vorgeformte Schicht zugeordnet sein. Bei Bedarf kann der Carrier ursprünglich mit einem Klebstoff beschichtet sein, wie etwa jener, der unter der Handelsbezeichnung CELLTRAK BIOCOAT Cell Environments zur Verfügung steht und von Stratech Scientific Ltd., Luton, Bedfordshire, United Kingdom verfügbar ist, um das Anhaften der polymeren Matrix, die die undifferenzierten und/oder differenzierten kontraktilen Zellen und/oder das genetische Material enthält, zu verbessern.
Das genetische Material und/oder die undifferenzierten und/oder differenzierten kontraktilen Zellen können außerdem in einer pharmazeutischen Zusammensetzung z. B. unter Verwendung eines Katheters abgegeben werden. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können z. B. die Nukleinsäure in der gewünschten Form und/oder Zellen in einem Volumen der phosphatgepufferten Salzlösung mit 5% Saccharose enthalten. In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden die Nukleinsäuremoleküle und/oder die Zellen mit geeigneten pharmazeutischen Carriern abgegeben, wie etwa jene, die in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, die ein Standard-Referenzdokument auf diesem Gebiet darstellt, beschrieben sind.
Wenn genetisches Material, undifferenzierte Zellen oder differenzierte kontraktile Zellen getrennt oder gemeinsam in einer Kombination getrennt von der elektrischen Stimulationsvorrichtung in einen Patienten injiziert werden und in Fluidform vorliegen, wird ein Katheter zu der gewünschten Behandlungsstelle vorgeschoben, z. B. benachbart zu der Stelle, an der die elektrische Stimulationsvorrichtung zu positionieren ist. Das äußere distale Ende des Katheters ist offen oder porös, wodurch das geneti sche Material und/oder undifferenzierte und/oder differenzierte kontraktile Zellen in Fluidform aus dem Ende abgegeben werden können. Ein Behälter, der mit dem Katheter verbunden ist, beinhaltet eine Versorgung des ausgewählten genetischen Materials und/oder der undifferenzierten und/oder der differenzierten kontraktilen Zellen. Steuerelemente werden zur Einstellung des Drucks und der Strömungsrate verwendet und können mechanisch oder elektronisch gesteuert werden. Es erfolgt ein Literaturhinweis auf die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/05781 für eine genauere Beschreibung einer derartigen Kombination aus Behälter und Katheter. Diese Abgabevorrichtung kann eine Pumpe enthalten, wie etwa eine osmotische Pumpe, um die Zellrepopulationsquelle abzugeben.
Elektrische Stimulationsvorrichtungen
Die vorliegende Erfindung enthält außerdem eine elektrische Stimulationsvorrichtung 22. Diese stellt die erforderlichen elektrischen Impulse zum richtigen Zeitpunkt bereit, um zu bewirken, dass das neu gebildete kontraktile Gewebe synchron mit dem restlichen Herzmuskel schlägt.
Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann einen Muskelstimulator und getrennte Elektroden enthalten. Die Elektroden können alternativ in dem Muskelstimulator enthalten sein. Der Muskelstimulator sollte ferner natürlich eine Batterie zum Liefern eines elektrischen Stroms an die elektrische und elektronische Schaltungsanordnung enthalten.
Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann eine Burst- bzw. Entladungsstimulation bereitstellen, die typischerweise zum Stimulieren von skelettalen Muskelzellen verwendet wird, oder kann eine Stimulation mit synchronen Einzelimpulsen bereitstellen, die typischerweise zum Sti mulieren von Herzmuskelzellen verwendet wird. Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann alternativ sowohl eine Burststimulation als auch eine Stimulation mit synchronen Einzelimpulsen bereitstellen. Dies ist insbesondere dann erwünscht, wenn das neue kontraktile Gewebe, das gebildet wurde, sowohl skelettale als auch Herzmuskelzellen enthält und/oder skelettale Muskelzellen ursprünglich gebildet werden und anschließend in Herzmuskelzellen umgewandelt werden. Eine Druckleitung oder andere Mittel zum Überwachen eines physiologischen Zustands, wie etwa die Wandbeschleunigung oder der Intraventrikulardruck, können verwendet werden, um zu bestimmen, wann von der Burst- bzw. Entladungsbetriebsart zu einer Einzelphasenbetriebsart der Stimulation umzuschalten ist. Bei Bedarf können zwei elektrische Stimulationsvorrichtungen verwendet werden, eine, die eine Burststimulation bereitstellt, und eine, die eine Stimulation mit synchronen Einzelimpulsen bereitstellt.
Dadurch können herkömmliche implantierbare Impulsgeneratoren (IPGs) gemäß den Erkenntnissen der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, um eine elektrische Stimulationsvorrichtung 22 zu schaffen, obwohl sie typischerweise nicht dafür gedacht ist, Herzmuskelgewebe zu stimulieren, das mit Zellen und/oder genetischem Material infundiert wurde, da das neu gebildete kontraktile Gewebe typischerweise eine Burststimulation benötigt, um eine lang anhaltende Kontraktion zu erzeugen. Bevorzugte Systeme der vorliegenden Erfindung enthalten einen implantierbaren Stimulator (22 in 1) und zwei Elektroden (Katode 30 und Anode 32 in 1). Ein derartiger Stimulator 22 enthält keine physikalischen Leitungen, um ihn mit irgendeiner anderen Vorrichtung zu verbinden. Es ist jedoch möglich, eine elektrische Stimulation von einem Stimulator bereitzustellen, der in dem Körper an einer entfernten Stelle angeordnet und mit der Infarktzone unter Verwendung von Leitungen verbunden ist. Obwohl dies die klinische Implementierung in stärkerem Maße invasiv macht, würde es die Komplikationen der Stimulatorkapsel verringern.
Der bevorzugte Stimulator 22, der in 1 gezeigt ist, besitzt die Form einer Kapsel, die an beiden Enden Elektroden 30 bzw. 32 aufweist. Dies Elektroden bilden elektrische Kontakte für die interne Schaltungsanordnung, um den Durchgang der Aktivierungswellenfront zu erfassen sowie um eine Reihe von Stimulationsimpulsen abzugeben, die erforderlich sind, um die anhaltende Kontraktion des neu gebildeten Gewebes, z. B. des skelettalen Muskelgewebes zu bewirken. Der Stimulator 22 enthält außerdem vorzugsweise zwei elektronische Schaltungen, eine Leseverstärkerschaltung und eine Entladungs- bzw. Burstgeneratorschaltung.
Die Leseverstärkerschaltung ist einem Filter zugeordnet, um einen Leseverstärker zu bilden. Dieser wird verwendet, um die Signalform der elektrischen Depolarisation zu erfassen, wenn sie sich durch die Infarktzone bewegt. Während der Verstärker die Verstärkung dieses schwachen Signals an die Erfassungsschaltung vergrößert, hilft das Filter, die Störsignale von nahe gelegenen Muskeln und anderen elektrischen Vorrichtungen zurückzuweisen.
Die Burstgeneratorschaltung stellt während der ventrikulären Kontraktionen eine Reihe von Impulsen bereit, wie in 2 gezeigt ist, um das neu gebildete skelettale Muskelgewebe im kontrahierten Zustand zu halten. Dies ist erforderlich, um eine anhaltende Kontraktion während der Systole bereitzustellen, da sich der skelettale Muskel viel schneller entspannt als der Herzmuskel. Der Stimulator 22 enthält außerdem eine Stromversorgung, die elektrische Energie an dem Leseverstärker und den Burstgenera tor liefert.
Der Stimulator 22 kann die Form eines Zylinders oder eine andere geeignete Form besitzen, die für eine Implantation geeignet ist, und eine Größe aufweisen, die ausreichend klein für eine Implantation ist. Er kann z. B. einen Durchmesser von etwa 5 mm und eine Länge von 20 mm besitzen. Bevorzugte Materialien enthalten Titan, es können jedoch außerdem andere bioverträgliche Materialien verwendet werden. Der Stimulator 22 kann eine Batterie oder eine andere Leistungsquelle, eine Elektronik zum Erfassen des Herzschlags und zum Erzeugen der Burststimulation und Telemetrieschaltungen zum Auslösen der Stimulation auf Anforderung enthalten. Eine derartige Schaltungsanordnung kann von einem Fachmann entwickelt werden, insbesondere im Hinblick auf die Erkenntisse der US-Patente Nr. 5.697.884 (Francischelli u. a.), 5.658.237 (Francischelli), 5.207.218 (Carpentier u. a.), 5.205.810 (Guiraudon u. a.), 5.069.680 (Grandjean) und 4.411.268 (Cox).
Da ein bevorzugter Stimulator 22 keine physikalischen Leitungen enthält, die ihn mit anderen Vorrichtungen verbinden, muss der Stimulator 22 seine eigene elektrische Energie erzeugen. Wenn angenommen wird, dass das Herz eine Last mit 500 Ω darstellt und 10 Impulse bei 10 Volt für 1 Millisekunde benötigt werden, benötigt jede Stimulation 0,2 mJ. Wenn die Energieumwandlung einen Wirkungsgrad von 20% besitzt, wird eine Energie von 1 mJ benötigt, um das Herz bei jedem Schlag zu stimulieren. Da das Herz etwa 50 ml Blut gegen 120 mm Hg (16 kPa) pumpt, leistet es eine Arbeit von etwa 800 mJ. Deswegen erntet der Stimulator etwa ein Achtelprozent der mechanischen Arbeit, die von dem Herzen geleistet wird. Dies kann durch irgendeinen aus einer Vielzahl von Mechanismen erfolgen, die hydrostatischen Druck in elektrische Energie umwandeln können.
Nachdem der Stimulator 22 implantiert wurde, wird er typischerweise während der ersten paar Wochen nicht aktiviert, um ein Wachstum des kontraktilen Gewebes zu ermöglichen. Er wird dann bei einem geringen Synchronisationsverhältnis (z. B. 3:1) zwischen dem eigentlichen Herzschlag und den von der Vorrichtung bereitgestellten Bursts bzw. Entladungen eingeschaltet, das dann zunehmend (z. B. auf 1:1) vergrößert wird.
3 ist ein Blockschaltplan, der verschiedene Komponenten eines Stimulators 22 erläutert, der mittels einer (nicht gezeigten) externen Programmiereinheit programmierbar ist. Eine derartige Programmiereinrichtung, die an die Zwecke der vorliegenden Erfindung angepasst werden kann, ist die handelsüblich verfügbare Programmiereinrichtung Medtronik Modell 9790. Die Programmiereinrichtung ist eine Mikroprozessor-Vorrichtung, die eine Reihe von codierten Signalen an den Stimulator 22 mittels eines Programmierkopfes bereitstellt, der hochfrequent codierte Signale an den IPG 51 in Übereinstimmung mit einem Telemetriesystem, wie etwa jenes, das z. B. im US-patent Nr. 5.312.453 (Wyborny u. a.) beschrieben ist, überträgt.
Der Stimulator 22, der in 3 veranschaulichend gezeigt ist, ist durch die Leitung 54 mit dem Herzen 56 des Patienten verbunden. Die Leitung 54, die zwei Adern enthält, ist über den Eingangskondensator 60 mit einem Knoten 62 in der Schaltungsanordnung des Stimulators 22 verbunden. In der gegenwärtig offenbarten Ausführungsform liefert ein Aktivitätssensor 63 einen Sensorausgang an eine Verarbeitungs/Verstärkungs-Aktivitätsschaltung 65 der Eingabe/Ausgabeschaltung 68. Die Eingabe/Ausgabeschaltung 68 enthält außerdem Schaltungen zum Verbinden mit dem Herzen 56, eine Antenne 66 und eine Schaltung 74 zum Anlegen von Stimulationsimpulsen an das Herz 56, um seine Rate unter der Steuerung von software-implementierten Algorithmen in der Mikrocomputereinheit 78 zu steuern.
Die Mikrocomputereinheit 78 umfasst eine platteninterne Schaltung 80, die den Systemtaktgeber 82, den Mikroprozessor 83 und platteninterne RAM 84 und ROM 86 enthält. In der veranschaulichenden Ausführungsform umfasst die plattenexterne Schaltung 88 eine RAM/ROM-Einheit. Die platteninterne Schaltung 80 und die plattenexterne Schaltung 88 sind jeweils durch einen Datenübertragungsbus 90 mit der digitalen Controller/Taktgeberschaltung 92 verbunden. Die elektrischen Komponenten, die in 3 gezeigt sind, werden durch eine geeignete implantierbare Batterie-Energiequelle 94 gemäß der üblichen technischen Praxis gespeist. Zur Einfachheit ist die Kopplung der Batterieleistung an die verschiedenen Komponenten des Stimulators 22 in den Figuren nicht gezeigt.
Die Antenne 66 ist mit der Eingabe/Ausgabeschaltung 68 verbunden, um eine Telemetrie in der Aufwärts/Abwärtsrichtung über die Sender- und Empfängereinheit 55 zu ermöglichen. Die Einheit 55 kann der Telemetrie- und Programmlogik, die im US-Patent Nr. 4.556.063 (Thompson u. a.) offenbart ist, oder jener, die im oben angegebenen Patent an Wyborny u. a. offenbart ist, entsprechen. Die Spannungsreferenz- (VREF) und Vorspannungsschaltung 61 erzeugt eine stabile Spannungsreferenz und einen Vorspannungsstrom für die analogen Schaltungen der Eingabe/Ausgabeschaltung 68. Die Analog/Digital-Umsetzer- (ADC) und Multiplexerschaltung 58 digitalisiert analoge Signale und Spannungen, um eine "Echtzeit"-Telemetrie herzinterner Signale und Batterieablauf- (EOL) Ersetzungsfunktionen bereitzustellen.
Betriebsbefehle zum Steuern der Taktversorgung des Stimu lators 22 sind durch den Datenbus 90 mit der digitalen Controller/Taktgeber-Schaltung 92 verbunden, in der digitale Taktgeber und Zähler das allgemeine Notlaufintervall des IPG sowie verschiedene Refraktär-, Blink- und andere Taktfenster zur Steuerung des Betriebs der peripheren Komponenten bereitstellt, die in der Eingabe/Ausgabeschaltung 68 enthalten sind. Die digitale Controller/-Taktgeberschaltung 92 ist vorzugsweise mit der Erfassungsschaltungsanordnung 52, die den Leseverstärker 53, die Spitzenwerterfassungs- und Schwellenwertmess-Schaltungsanordnung 57 und den Komparator/Schwellenwert-Detektor 59 enthält, verbunden.
Der Leseverstärker 53 verstärkt erfasste elektrische Herzsignale und liefert ein verstärktes Signal an die Spitzenwerterfassungs- und Schwellenwertmess-Schaltungsanordnung 57. Die Schaltungsanordnung 57 liefert ihrerseits eine Angabe der erfassten Spitzenspannungen und der gemessenen Leseverstärker-Schwellenwertspannungen 64 auf dem Pfad 64 an die digitale Controller/Taktgeberschaltung 92. Ein verstärktes Leseverstärkersignal wird dann an den Komparator/Schwellenwert-Detektor 59 geliefert. Der Leseverstärker 53 kann dem Leseverstärker entsprechen, der in dem US-Patent Nr. 4.379.459 (Stein) offenbart ist.
Die Schaltung 92 ist ferner vorzugsweise mit dem Elektrogramm- (EGM) Verstärker 76 verbunden, um verstärkte und verarbeitete Signale zu empfangen, die von einer Elektrode erfasst werden, die an der Leitung 54 angeordnet ist. Das Elektrogrammsignal, das durch den EGM-Verstärker 76 geliefert wird, wird verwendet, wenn die implantierte Vorrichtung durch eine (nicht gezeigte) externe Programmiereinrichtung abgefragt wird, um durch die Telemetrie der Aufwärtsverbindung eine Darstellung eines analogen Elektrogramms der elektrischen Herzaktivität eines Patienten zu übertragen. Eine derartige Funktionalität ist z. B. in dem oben angegebenen US-Patent Nr. 4.556.063 gezeigt.
Der Ausgangsimpulsgenerator 74 liefert elektrische Stimuli an das Herz 56 des Patienten oder an eine andere geeignete Stelle über den Koppelkondensator 65 in Reaktion auf ein Stimulationsauslösesignal, das von der digitalen Controller/Taktgeberschaltung 92 geliefert wird. Der Ausgangsverstärker 74 kann z. B. im Allgemeinen dem Ausgangsverstärker entsprechen, der im US-Patent Nr. 4.476.868 (Thompson) offenbart ist.
Es sei zu verstehen gegeben, dass 3 eine Darstellung eines beispielhaften Typs der Vorrichtung ist, die in der vorliegenden Erfindung eine Anwendung findet oder die durch einen Fachmann für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden kann, und den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken soll.
Verfahren und Vorrichtungen zur Abgabe
Die undifferenzierten und/oder differenzierten kontraktilen Zellen und/oder das genetische Material, die oben beschrieben wurden, können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren in die Infarktzone des Myokards oder an beschädigtes oder erkranktes Myokardgewebe abgegeben werden. Die undifferenzierten und/oder differenzierten kontraktilen Zellen und/oder das genetische Material werden vorzugsweise in den gewünschten Bereich direkt injiziert.
Für eine direkte Injektion kann ein kleiner Bolus des ausgewählten genetischen Materials und/oder der undifferenzierten oder differenzierten kontraktilen Zellen in eine Mikroinjektionsspritze, z. B. eine 100 μl-Hamilton-Injektionsspritze geladen werden und von außerhalb des Herzens direkt angewendet werden.
Vorzugsweise wird jedoch ein Katheter für die direkte Injektion sowohl der elektrischen Stimulationsvorrichtung als auch der Zellrepopulationsquelle verwendet. Ein Katheter kann z. B. von der Oberschenkelarterie eingeführt und in die linke Herzkammer gelenkt werden, was durch Radioskopie bestätigt werden kann. Der Katheter kann alternativ in die rechte Herzkammer gelenkt werden.
Der Katheter enthält einen lang gestreckten Katheterkörper, vorteilhaft eine isolierende äußere Hülle, die aus Polyurethan, Polytetrafluoroethylen, Silicon oder einem anderen annehmbaren bioverträglichen Polymer hergestellt sein kann, und ein Normlumen, das sich über einen Abschnitt durch ihn hindurch erstreckt und über ein hohles Nadelelement in Verbindung steht. Der Katheter kann zu dem angegebenen Ort geführt werden, indem er entlang einem lenkbaren und führbaren Katheter mit einem Aufnahmelumen bewegt wird, wie z. B. im US-Patent Nr. 5.030.204 (Badger u. a.) offenbart ist; oder mittels eines Führungskatheters mit fester Konfiguration, der im US-Patent Nr. 5.104.393 (Isner u. a.) dargestellt ist. Der Katheter kann alternativ in dem Herzen zu der gewünschten Stelle mittels einer biegsamen Nadel, wie in der PCT-Patentanmeldung WO 93/04724, die am 18. März 1993 veröffentlicht wurde, offenbart ist, oder durch einen biegsamen Führungsdraht, wie im US-Patent Nr. 5.060.660 (Gambale u. a.) offenbart ist, vorgeschoben werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das Nadelelement in einer Hülse zum Zeitpunkt der Führung des Katheters in das Herz des Patienten gewöhnlich zurückgezogen sein.
Nachdem sich die Spitze des Katheters in der linken (oder rechten) Herzkammer befindet, kann sie als ein Nachweismittel entlang der linken Herzkammerwand bewegt werden, um das Elektrogramm zu messen und um den Ort und das Ausmaß der Infarktzone zu bestimmen. Diese ist eine Prozedur, die einem Fachmann bekannt ist. Nachdem die Infarktzone identifiziert wurde, wird die Lenkführung herausgezogen, wobei die Hülle an der Stelle des Infarkts verbleibt. Die Zellrepopulationsquelle und/oder die elektrische Stimulationsvorrichtung können dann in dem Lumen des Katheters vorangeschickt und in das Myokard geschoben werden. Der Katheter kann dann aus dem Patienten herausgezogen werden.
Die elektrische Stimulationsvorrichtung kann eine Vielzahl von Mechanismen enthalten, um ihn in dem Myokard an der Verwendungsstelle zu halten. Sie kann z. B. ausfahrbare Haken oder Krallen enthalten. Der Gewebekontaktabschnitt der Vorrichtung kann alternativ so behandelt werden, um eine Mikrooberflächen-Textur zu erreichen (wie offenbart wurde durch Andreas F. von Recumin in : Biomaterials, 12, 385–389, "Texturing of Polymer Surfaces at the Cellular Level" (1991); Biomaterials, 13, 1059–1069, "Macrophage response to Microtextured Silicone" (1992); und Journal of Biomedical Materials Research, 27, 1553–1557, "Fibroplast Anchorage to Microtextured Surfaces" (1993)). In einer alternativen Ausführungsform kann der Stimulator in Form einer Schraube sein, die durch Drehen in die Muskelwand getrieben wird.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind lediglich für Erläuterungszwecke vorgesehen.
Beispiel 1
Umwandlung von Fibroblasten in situ und elektrische Stimulation
Adenovirus-Expressionsmyogenin (Myogen-Adenovirus/cDNA, die gemäß dem Verfahren hergestellt werden kann, das von Murry u. a., J. Clin. Invest., 98, 2209–2217 (1196) beschrieben ist) wurde unter Verwendung einer 100-μl-Injektionsspritze direkt in das Myokard gespritzt. 10⁶ pfu (pfu-Plaque bildende Einheiten, ein pfu sind etwa 50 Adenovirus-Partikel) wurde mit Salzlösung gelöst, um eine 100 Mikroliter-Lösung zu bilden. Diese Lösung wurde bis zur Injektion auf Trockeneis aufbewahrt und in vier gleichen Mengen an den Umfang der Infarktzone um 90 Grad beabstandet abgegeben.
Eine histopathologische Einschätzung des behandelten Gewebes wurde ausgeführt, um den Umfang der Fibroblast-Umwandlung einzuschätzen. Gewebe wurde zur Histologie verarbeitet und mit einer Einrichtung H&E and Masson's Trichrome gemäß Standardverfahren eingefärbt.
Die immunohistologische Einfärbung erfolgte außerdem, um festzustellen, ob es in dem behandelten Gewebe eine Myogenin-Expression gibt. Acht gefrorene Abschnitte wurden von Gewebe abgetrennt, fixiert und mit einem Kaninchen-Polygon-IgG inkubiert, das gegen Ratten-Myogenin gezüchtet wurde (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat. Nr. sc-576). Die Proben wurden abgespült, mit einem bezeichneten sekundären Antikörper inkubiert und durch Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie sichtbar gemacht.
Die Abgabe des Adenovirus-Expressionsmyogenins an Infarktgewebe in vivo hatte das Auftreten von mehreren kleinen Flicken aus skelettalen Myoblast-Zellen zur Folge. Diese isolierten Muskelzellen wiesen periphere Kerne auf, was ein Anzeichen dafür ist, dass sie skelettalen Muskelzellen ähnlicher sind als Herzmuskelzellen, wie histologisch analysiert wurde. Genetisch umgewandelte Zellen repräsentierten typischerweise eine unreifere Form des skelettalen Muskels als die Myotube-Zellen, die in mit Myoblast injizierten Geweben (d. h. vor der Fusion) beobachtet wurden. Keine Myogenin-Immunoreaktivität war zum Zeitpunkt der Opferung in diesen Zellen vorhanden. Deswegen wurde geschlussfolgert, dass das Myogenin, das durch das Adenovirus erzeugt wurde, zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme nicht mehr vorhanden war (was zwei Wochen nach Abgabe des Virus zu erwarten war, da eine Adenovirus-Expression in vivo nicht für mehr als zwei Wochen oder 10 Tage fortgesetzt werden kann).
In Herzen, die bei Kryoablation mit Adenovirus-Beta-Galactosidase injiziert wurden, wurde in dem Infarkt lediglich eine Fibroblast- und Lymphozyten-Infiltration längs kleiner Kapillaren erfasst, ähnlich wie die Ergebnisse, die mit Tieren erzielt wurden, die eine Kryoablation erhielten, jedoch keine Viralinjektionen (Kontrolle). Deswegen wurde in dieser Kontrollgruppe keine Muskelzellen oder eine positive Färbung für Myogenin erfasst. Dies benachteiligte die Plazebo-Gruppe des Molekularzweigs der Untersuchung.
Beispiel 2
Injektion von kontraktilen Zellen und die elektrische Stimulierung in Hunden
Wachstums- und Durchgangsinformationen für skelettale Myoblast-Zellen
1. Formel des Wachstumsmediums:

81,6% M199 (Sigma, M-4530)
7,4% MEM (Sigma, M-4655)
10% Fetal-Bovone-Serum (Hyclone, Cat.# A-1115-L)
1 × (1%) Penicillin/Streptomycin (endgültige Konzentration 100000 U/L Pen./10 mg/l Strep., Sigma, P-0781).

2. Zelldurchgangsinformationen:

A. Impfdichten von 1 × 10⁴ Zellen/cm² ergeben eine zu 80% konfluente Monoschicht in etwa 96 Stunden.
B. Teilungsverhältnisse von 1:4 bis 1:6 ergeben eine konfluente Monoschicht in 96 Stunden.
C. Nicht zulassen, dass die Zellen konfluent werden. Ein Zwischenzellenkontakt bewirkt, dass die Zellen zu Myotuben differenzieren.

3. Durchgangsinformationen

A. Entfernen des Zuchtmediums aus dem T-Kolben.
B. Hinzufügen der geeigneten Menge der ausgeglichenen Salzlösung nach Hank (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS).
C. Inkubieren für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur
D. Entfernen von HBSS und Ersetzen durch Trypsin-Lösung.
E. Inkubieren für maximal 5 Minuten bei 37°C in einem 5%-CO₂-Inkubator, Zellen lösen sich von dem Zellzucht.
F. Einwirkung der Trypsin-Lösung nicht länger als erforderlich. Die Zellen werden geschockt, wenn zugelassen wird, dass sie für länger als 5 Minuten in dm Trypsin bleiben.
G. Kolben vorsichtig umrühren, um Zellen zu entfernen.
H. Hinzufügen von wenigstens einem gleichen Volumen des Wachstumsmediums, um das Trypsin zu neutrali sieren.
I. Entnehmen einer Probe für eine Zellzählung.
J: Zentrifugieren der Zellen bei 1000 min^–1 für 10 Minuten.
K. Zählen der Zellen und Berechnen der Zellanzahl.
L. erneute Suspension in dem Zellzuchtmedium und Impfen in geeignete Kolben.
M. Um eine gesunde Kultur aufrechtzuerhalten, Wechseln des Mediums nach jeweils 2–3 Tagen.

4. Zellzählung

A. Lösen. bzw. Verdünnen der Zellen in das geeignete Verdünnungs- bzw. Lösungsmittel (Trypan Blue oder HBSS). Keine Verdünnung oder eine Verdünnung 1:2 funktioniert gut für einen konfluenten T-Kolben.
B. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers. Der genaueste Bereich für das Hämocytometer liegt zwischen 20 und 50 Zellen/Flächeneinheit.
C. Berechnung: Gezählte Zellen (dividiert durch) gezählte Flächeneinheiten (multipliziert mit) Lösungsfaktor (multipliziert mit) 1 × 10⁴ = Zellen/ml in der ursprünglichen Zellsuspension.

Enzymatische Myoblast-Isolierung
Skelettale Muskeln behalten im Unterschied zum Herzmuskel die Fähigkeit der Selbstreparatur, wenn sie beschädigt werden oder erkranken. Die Ursache dafür ist das Vorhandensein von undifferenzierten Myoblast-Zellen (die auch als Satellitenzellen bezeichnet werden), die sich im vollentwickelten Muskel befinden.
Vollentwickelte Muskel-Myotube-Zellen können nicht in einer Kultur gezüchtet werden, da die Zellen in dem Prozess der Differenzierung von Myoblast-Zellen in Myotube-Zellen ihre Fähigkeit zum Vermehren verlieren. Um in vitro eine Forschung an skelettalen Muskelmyotube-Zellen auszuführen, ist es zuerst erforderlich, zunächst die Muskel-Myoblast-Zellen zu isolieren. Die folgende Prozedur dient zum Isolieren primärer Muskel-Myoblast-Zellen aus skelettalen Muskelbiopsien und der Teilzüchtung der resultierenden Zellen.
1. Materialien

A. Isolationsmedium: 80,6% M199 (Sigma, M-4530), 7,4% MEM (Sigma, M-4655), 10% Fetal-Bovone-Serum (Hyclone, Cat.# A-1115-L), 2 × (2%) Penicillin/Streptomycin (endgültige Konzentration 200000 U/l Pen./20 mg/l Strep., Sigma, P-0781).
B. Myoblast-Zuchtmedium: 81,6% M199 (Sigma, M-4530), 7,4% MEM (Sigma, M-4655), 10% Fetal-Bovone-Serum (Hyclone, Cat.# A-1115-L), 1 × (1%) Penicillin/Streptomycin (endgültige Konzentration 100000 U/l Pen./10 mg/l Strep., Sigma, P-0781).
C. Waschlösung: M199, 2 × Penicillin/Streptomycin.
D. Collagenase (Rohstoff: Typ IM ALLGEMEINEN, Sigma, C-2674).
E. Hyaluronidase (Typ I-S, Sigma, H-3506).
F. Protease, aus Streptomyces griseus, (Sigma, P-8811).
G. Ausgeglichene Salzlösung nach Hank (BHSS), Ca²⁺- und Mg²⁺-frei (Sigma, H-6648).
H. 70% EtOH (steril gefiltert).
I. Percoll (Sigma, P-4937).
J. 0,5 g/l Trypsin-Lösung (Sigma, T-3924).
K. 15 ml und 50 ml sterile Zentrifugenschläuche
L. 100 mm sterile Petrischale
M. sterile Schere und strile Zangen (wissenschaftliche Feinwerkzeuge)
N. 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile Pipetten (Falcon)
O. BIOCOAT Laminin Cellware (25 cm² und 75 cm² Flicken, Becton Dickinson, Cat. Nr. 40533, 40522).
P. T-75 Gewebezuchtflecken, 0,22 μm belüftete Kappe (Corning).
Q. Filter, 0,22 μm und 0,45 μm, Zelluloseacetat (Corning).
R. Polycarbonat-Zentrifugenschläuche.
S. Beckman-Zentrifuge, GS-6.
T. Inkubator-Schüttelvorrichtung

2. Verfahren
Alle Schritte dieser Prozedur sollten aseptisch ausgeführt werden.

A. Herstellen des Isolationsmediums:
– Hinzufügen von etwa 30 ml in einen sterilen 50 ml-Zentrifugenschlauch (10 g Biopsie oder weniger).
– Hinzufügen von 50 ml in eine sterile 125 ml-Medienflsche (bis zu 25 mg Biopsie).
B. Anordnen des Isolationsmediums auf Eis oder auf Eispaketen, um es kühl zu halten (etwa 4°C).
C. Herstellen der Enzymlösung, die am gleichen Tag verwendet wird, durch Hinzufügen von 1,0 g Collagenase und 2,0 g Hyaluronidase in 100 ml M199 (100 ml der Enzym/Ausgabelösung ist ausreichend, um 40–50 g eines skelettalen Muskels biologisch abzubauen).
D. Steriles Filtern der Enzymlösung zuerst durch ein 0,45 μm-Filter und dann durch ein 0,22 μm-Filter sowie Halten der Temperatur auf 4°C bis zur Verwendung.
E. Herstellen der Ausgabelösung, die am gleichen Tag verwendet wird, durch Hinzufügen von 1 g der Protease zu 100 ml M199.
F. Steriles Filtern durch ein 0,22 μm-Filter sowie Halten der Temperatur auf 4°C bis zur Verwendung.
G. Unter quasi-sterilen Bedingungen Entnehmen der Biopsie des skelettalen Muskels, vorzugsweise aus den Weichteilen des Muskels und Anordnen in dem Isolationsmedium.
H. Abdichten des Behälters und Aufbewahren bei etwa 4°C bis zum Zerkleinern.
I. Entnehmen des Gewebes und Anordnen auf einer sterilen Petrischale.
J. Abschneiden von Bindegewebe und Messen des endgültigen Gewichts.
K. Abspülen des Gewebes mit sterilem 70% EtOH für 30 Sekunden.
L. Absaugen des EtOH und Abspülen des Gewebes 2× mit HBSS.
M. Abschließendes Zerkleinern des Gewebes unter Verwendung von Schere und Pinzette.
N. Übergeben der zerkleinerten Biopsie in sterile 50 ml-Zentrifugenschläuche. Nicht mehr als 50 g/Schlauch, um eine wirksame enzymatische Zersetzung zu ermöglichen.
O. Abspülen des Gewebes durch Hinzufügen von etwa 25 ml HBSS pro Schlauch, Mischen und Pellettieren des Gewebes durch Zentrifugieren bei 2000 min^–1 (Zulassen, dass die Zentrifuge 2000 min^–1 erreicht, und abschalten).
P. Dekantieren der HBSS und Wiederholen des Abspülens sowie zusätzliches Zentrifugieren zwei weitere Male.
Q. Hinzufügen von Enzymlösung in die Schläuche (etwa 25 ml/15 g–20 g der ursprünglichen Biopsie).
R. Inkubieren der Schläuche in der Inkubator-Schüttelvorrichtung für 20 Minuten (Einstellpunkt: 37°C, 300 min^–1).
S. Zentrifugieren bei 2000 min^–1 für 5 Minuten und Verwerfen der Aufschwemmung.
T. Hinzufügen von Abgabelösung in die Schläuche (etwa 25 ml/15 g–20 g der ursprünglichen Biopsie).
U. Inkubieren der Schläuche in der Inkubator-Schüttelvorrichtung für 20 Minuten (Einstellpunkt: 37°C, 300 min^–1).
V. Zentrifugieren bei 2000 min^–1 für 5 Minuten.
W. Abtrennen der Aufschwemmung, Deaktivieren des Enzyms durch Hinzufügen von FBS bis zu einer endgültigen Konzentration von 10% und Aufbewahren bei 4°C.
X. Hinzufügen von Abgabelösung in die Schläuche für eine zweite enzymatische Auflösung (etwa 25 ml/15 g–20 g der ursprünglichen Biopsie).
Y. Inkubieren der Schläuche in der Inkubator-Schüttelvorrichtung für 15 Minuten (Einstellpunkt: 37°C, 300 min^–1).
Z. Zentrifugieren bei 2000 min^–1 für 5 Minuten.
AA. Abtrennen der Aufschwemmung, Deaktivieren des Enzyms durch Hinzufügen von FBS bis zu einer endgültigen Konzentration von 10%.
BB. Zentrifugieren der Zellaufschlämmung von den Abgabeauslösungsschritten (siehe W und AA) bei 2400 min^–1 für 10 Minuten.
CC. Entfernen und Verwerfen der Aufschwemmung.
DD. Erneutes Bilden einer Suspension der Zellpellets in einem minimalen Volumen der Waschlösung.
EE. Kombinieren der Pellets in einem 50 ml-Zentrifugenschlauch, Vergrößern des Volumens auf 40 ml unter Verwendung von Waschlösung.
FF. Zentrifugieren bei 2400 min^–1 für 10 Minuten.
GG. Entfernen der Aufschwemmung und Wiederholen der Zellwaschung zwei weitere Male.
HH. Beim letzten Waschen, erneutes Bilden einer Suspension der Pellets in 2 ml MEM. Wenn die ursprüngliche Biopsie nahe bei 25 g oder größer war, erneutes Bilden einer Suspension in 4 ml MEM.
II. Herstellen von 20% Percoll und 60% Percoll in MEM.
JJ. Bilden des Dichtegradienten durch Schichtbildung von 10 ml der 20% Percoll/MEM über 5 ml der 60% Percoll/MEM (siehe 1).
KK. Hinzufügen von 2 ml der Zellsuspension auf die Oberseite des 20% Percoll.
LL. Verwenden einer Waage zum Herstellen eines zweiten Schlauchs als ein Gegengewicht zum Zentrifugieren.
MM. Zentrifugieren bei 11947 min^–1 (15000 × g) für 5 Minuten bei 8°C (Einstellen der Beschleunigung auf 5 und Bremsen auf 0).
NN. Isolieren des Bands aus Zellen, das sich zwischen der 20% und der 60% Percoll-Schicht bildet. Dieses Band enthält die Myoblast-Zellen.
OO: Bestimmen des Volumens des Bands und Auflösen des Bands mit 5 Volumeneinheiten des Zuchtmediums. Anmerkung. Wenn das Percoll nicht mit einer ausreichenden Menge Zuchtmedium gelöst ist, wird es sehr schwierig, die Myoblast-Zellen als Pellets aus der Lösung zu gewinnen.
PP. Zentrifugieren bei 3000 min^–1 für 10 Minuten.
QQ. Entfernen der Aufschwemmung und erneutes Bilden einer Suspension der Pellets im Zuchtmedium.
RR. Zählen der Zellen in der Suspension.
SS. Auslegen der Zellen in den mit BIOCOAT Laminin beschichteten T-Kolben bei etwa 1 × 10⁴ Zellen/cm². Die erste Lage sollte auf einer mit Laminin beschichteten Oberfläche erfolgen, um die Zellanhaftung zu unterstützen.
TT. Züchten der Zellen auf eine Konfluenz von 60% bis 80%. Wenn zugelassen wird, dass die Zellen konfluent werden, werden sie aufhören, sich in Myotube-Zellen zu differenzieren.
UU. Trypinisations-Prozedur: Waschen der Monoschichten mit HBSS Hinzufügen von Trypsin (0,5 g/l Trypsin)
Inkubieren bei 37°C für nicht länger als 5 Minuten Neutralisieren des Trysin mit Serum, das ein Medium enthält Entfernen der Zellen Zentrifugieren bei 800 min^–1 für 10 Minuten Erneutes Bilden einer Suspension im Myoblast-Zuchtmedium Impfen der mit Zellkulturen behandelten T-Kolben bei etwa 1 × 10⁴ Zellen/cm². Teilungsverhältnisse von 1:4 bis 1:6 funktionieren gut für eine zu 60% bis 80% konfluente Kultur.

Entwicklung des Hunde-Infarktmodells und Zellinjektion
Ein Myokard-Infarkt wurde in dem Hundeherz durch Kryoablation eines runden Bereichs in der linken freien Herzkammerwand mit einem Durchmesser von etwa 3,5 cm. Dies wurde erreicht, indem zunächst eine linke Thorakotomie am vierten oder fünften interkostalen Raum ausgeführt wurde, um einen Zugang zum Herz des Hunds zu schaffen. Das Herz wurde neu positioniert, um einen Zugang zur freien LV-Wand zu schaffen. Ein Bereich, der verhältnismäßig frei von Herzkranzgefäßen ist, wurde für die Kryoablation identifiziert.
Am Myokard wurde ein Infarkt ausgelöst durch Anwenden eines üblichen Kryoablationsinstruments mit einer Metallplatte mit einem Durchmesser von 3,5 cm an der Herzoberfläche für bis zu 10 Minuten. Da die Sonde mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, betrug ihre Temperatur –180°C, bevor sie auf die Oberfläche des Herzens angewendet wurde. Da das Volumen des Blutes, das in der linken Herzkammer fließt, ausreichend ist, die endocardiale Oberfläche zu erwärmen, konnte keine echte transmurale Ablation erreicht werden. Trotzdem wurden 13,5 g der freien LV-Wand, die 15% der Masse der freien LV-Wand darstellen, abgelöst. Dies ist für einen menschlichen Patienten ebenfalls eine typische Größe des Infarkts.
Für einen Hund wurden 1,79 × 10⁹ (einhundertneunundsiebzig Millionen) Myoblasten innerhalb von 11 Tagen aus 2,5 Gramm der Biopsie des skelettalen Muskels erhalten. Diese Zellen wurden in das Myokard des Hundes an zehn Stellen rund um die Ablationsstelle unter Verwendung einer Injektionsspritze mit einer Nadel des Kalibers 22 und bei einer Injektion von 0,5 ml pro Stelle (1,79 × 10⁸ Zellen/5 ml der Salzlösung) erneut injiziert.
Elektrische Stimulation in vivo
Zwei Wochen nach der Einführung des MI wurde der Brustkorb erneut geöffnet und das Tier wurde wie zuvor behandelt. Außerdem wurde eine Elektrode an der Ventrikularspitze für eine unipolare VVI-Schrittsteuerung befestigt. Zwei weitere Elektroden wurden an den beiden Seiten des Infarktbereichs befestigt, um den zellularen Cardiomyoplastie-Bereich zu stimulieren.
Es wurde zu diesem Zeitpunkt festgestellt, dass der LV-Druck des Tiers und das Hubvolumen nicht wesentlich verbessert waren. Tatsächlich lag der Spitzenwert des systolischen Drucks nur geringfügig über 80 mm Hg und das Hubvolumen betrug wieder 22 ml, wenn das Tier mit der VVI-Schrittsteuerung unterstützt wurde. Dies legt nahe, dass die Zelleinbringung allein die systolische Funktion nicht merklich verbessert.
Wenn der Stimulator des skelettalen Muskels eingeschaltet wurde, erreichte der systolische Druck 100 mm Hg und das Hubvolumen vergrößerte sich auf 40 ml. Auf Grund von Synchronisationsproblemen zwischen dem Ventricular-Schrittmacher und dem Stimulator des skelettalen Muskels konnte während der Untersuchung kein stabiler Ablauf erreicht werden. Dieses Experiment ergab trotzdem ein Anzeichen dafür, dass das Vorhandensein der skelettalen Zellen allein nicht ausreichend sein könnte, um die systolische Funktion zu verbessern, und dass die Notwendigkeit einer Stimulation des skelettalen Muskels bestehen könnte, um die Herzfunktion in Verbindung mit zellularer Cardiomyoplastie zu verbessern.
Änderungen in der Wandbewegung in dem Behandlungsbereich wurden außerdem bei der Anwendung der Stimulation des skelettalen Muskels beobachtet. Wenn lediglich die herkömmliche Ventrikular-Schrittsteuerung erfolgt (oberer Verlauf), verkürzte sich die Länge der Infarktzone lediglich um 0,5 mm. Wenn jedoch die Stimulation des skelettalen Muskels zusätzlich zur Ventrikular-Schrittsteuerung angewendet wurde, wurde die Verkürzung von etwa 1,0 mm, die eine Wandbewegung oder eine Kontraktionsfähigkeit angibt, durch die elektrische Stimulation des skelettalen Bereichs der Kardiomyoplastie vergrößert.
Histopathologische Verfahren und Ergebnisse
Um sicherzustellen, dass die transplantierten skelettalen Zellen am Ende der zweiwöchigen Periode vorhanden waren, wurden konservierte Gewebeabschnitte mit immuno-histochemischen Verfahren unter Verwendung eines Anti-Myosin-Antikörpers (skelettal, schnell, MY-32) analysiert. Eine positive (grüne) Einfärbung an zwei unterschiedlichen Bereichen der abgelösten Stelle zeigten das Vorhandensein der injizierten skelettalen Muskelzellen in dem abgelösten Bereich des Myokards zwei Wochen nach ihrer Einführung an. Diese Immuno-Einfärbungsuntersuchung lieferte den definitiven Beweis für das Vorhandensein von skelettalen Muskelzellen in dem Myokard. Das verwendete Protokoll der immuno-histochemikalischen Einfärbung wird im Folgenden beschrieben:
Protokoll der immuno-histologischen Einfärbung
Materialien:

Monoclones Anti-skelettal-Myosin (schnell), Clone MY-32, Sigma, Cat. Nr. M-4276.
Polyclonales Kaninchen-Anti-Connexin-43, Zymed, Cat. Nr. 71-0700.
Ziege-Anti-Maus-IgG-FITC, Sigma, Cat. Nr. F-0257.
Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Ganzmolekül)-TRITC, Sigma, Cat. Nr. T-6778.
PBS, Sigma, Cat. Nr. 1000-3.
Ziegen-Serum, Sigma.
Aceton, Sigma, Cat. Nr. A-4206.
Anbringungsmedium, Sigma, Cat. Nr. 1000-4.
Mikroskop, Nikon, Labophot-2.

Proben:

Skelettaler Muskel (Kontrolle)
Hintere Läsion
Mittlere Läsion
Ältere Läsion
J(L) freie Ventrikularwand (Kontrolle)

Verfahren

A. Reinigen von Objektträgern mit 95% EtOH und Behandeln mit Poly-Lysin oder Kaufen von vorbehandelten Objektträgern.
B. Erhalten von Gewebeproben und Einfrieren auf Kryostat-Spannvorrichtungen.
C. Schneiden von Kryostat-Abschnitten mit der Dicke von 8 μm aus dem gefrorene Gewebeblock, Anordnen auf behandelten Objektträgern und Aufbewahren bei einer Temperatur ≤ –70°C.
D. Zulassen, dass die Gewebeabschnitte auf Raumtemperatur kommen, bevor die Einfärbung begonnen wird (etwa 15 bis 30 Minuten).
E. Fixieren der Proben in kaltem Aceton (≤ –10°C) für 10 Minuten bei 4°C.
F. Waschen der Proben mit PBS drei Mal (Vorsicht walten lassen, um zu vermeiden, dass die Proben nicht vom Objektträger abgewaschen wird)
G. Blockieren der Proben mit 10% Ziegen-Serum/PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung einer befeuchteten Kammer.
H. Auslösen des ersten primären Antikörpers, Connexin-43, 1:100 in PBS, das 10% Ziegen-Serum enthält. Auflösen einer ausreichenden Menge Antikörper, um die Proben zu bedecken (etwa 150 μl), den Gewebeabschnitten hinzugeben und Inkubieren in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
I. Waschen der Probe in 10% Ziegen-Serum/PBS drei Mal (5 Minuten/Waschvorgang).
J. Auflösen des zweiten Antikörpers, My-32, 1:200 in PBS, das 10% Ziegen-Serum enthält, Auflösen einer ausreichenden Menge Antikörper, um die Proben zu bedecken (etwa 150 μl), den Gewebeabschnitten hinzuge ben und Inkubieren in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
K. Waschen der Probe in 10% Ziegen-Serum/PBS drei Mal (5 Minuten/Waschvorgang).
L. Auflösen der sekundären Antikörper, Mischer der Antikörper-Lösungen und den Gewebeabschnitten hinzugeben. Anti-Kaninchen-IgG (Ganzmolekül)-TRITC, 1:50 in PBS. Anti-Maus-IgG-FITC, 1:100 in PBS.
M. Inkubieren in einer dunklen befeuchteten Kammer für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
N. Waschen der Proben in PBS drei Mal (5 Minuten/Waschvorgang).
O. Hinzufügen des Anbringungsmediums und einer Abdeckung.
P. Messen am Mikroskop unter Verwendung der FITC-Filters, des TRITC-Filters und der UV-Lichtquelle.
Q. Aufbewahren der Proben in einer Dunkelkammer bei einer Temperatur ≤ 4°C.

Claims

Implantierbares System mit: a) einer isolierten Zellrepopulationsquelle, die in der Lage ist, neues kontraktiles Gewebe in und/oder nahe bei beschädigtem oder erkranktem Myokardgewebe zu bilden; und b) einer elektrischen Stimulationsvorrichtung zum elektrischen Stimulieren des neuen kontraktilen Gewebes in und/oder nahe bei dem beschädigten oder erkrankten oder Myokardgewebe, bei der die Zellrepopulationsquelle auf einen Träger bzw. Carrier beschichtet oder in diesem enthalten ist, wobei der Carrier die elektrische Stimulationsvorrichtung ist.
Implantierbares System nach Anspruch 1, bei dem die Zellrepopulationsquelle undifferenzierte oder differenzierte kontraktile Zellen aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 2, bei dem die undifferenzierten kontraktilen Zellen skelettale Muskelsatellitenzellen umfassen.
Implantierbares System nach Anspruch 2, bei dem die undifferenzierten kontraktilen Zellen autologe Zellen umfassen.
Implantierbares System nach Anspruch 1, bei dem die Zellrepopulationsquelle genetisches Material aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 5, bei dem das genetische Material ein Abgabemittel mit einem Nukleinsäuremolekül aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 6, bei dem das Nukleinsäuremolekül ein myogenes Determinationsgen kodiert.
Implantierbares System nach Anspruch 6, bei dem das Abgabemittel einen viralen Expressionsvektor aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 6, bei dem das Abgabemittel Liposome aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 5, bei dem das genetische Material plasmide DNS aufweist.
Implantierbares System nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Zellrepopulationsquelle ferner eine polymere Matrix aufweist.
Implantierbares System nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die elektrische Stimulationsvorrichtung einen Muskelstimulator mit zwei damit verbundenen Elektroden aufweist.
Implantierbares System nach Anspruch 12, bei dem der Muskelstimulator implantierbar und in Form einer Kapsel bzw. Kapsula mit darin enthaltenen Elektroden ausgebildet ist.
Implantierbares System nach Anspruch 13, bei dem der Muskelstimulator ein Carrier für die Zellrepopulationsquelle ist.
Implantierbares System nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die elektrische Stimulationsvorrichtung eine Burst- bzw. Entladungsstimmulation bereitstellt.
Implantierbares System nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die elektrische Stimulationsvorrichtung eine Pulsstimulation bereitstellt.
Implantierbares System nach Anspruch 1, bei dem die elektrische Stimulationsvorrichtung in Form einer Kapsel bzw. Kapsula ausgebildet ist.