JP4860893B2 - 心筋梗塞修復のための方法およびシステム - Google Patents
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Description
[発明の分野]
本発明は、心筋梗塞後の、より一般的には損傷または疾患心筋組織中および/または付近の心筋に対する損傷を元に戻すための方法および移植可能なシステムに関する。特にこれは、遺伝子操作技術の使用および電気刺激による増大によりin situで添加的に形成され得る未分化または分化収縮細胞を用いた損傷または疾患心筋層の再増殖を含む。
【0002】
[発明の背景]
冠動脈疾患(CAD)は、毎年米国において1500万人に影響を及ぼしている。これらの患者のうち、約10%が一年以内に死亡し、約900,000人が急性心筋梗塞に罹患している。CAD中、内皮組織下のプラークの形成が冠動脈の管腔を狭め、血流に対するその抵抗を増大して、それによりO2供給を低減する。冠動脈により養われる心筋層(すなわち、心筋からなる心壁の中間および最厚層)に対する損傷は、0.5〜1.5時間以内に非可逆的になり始め、6〜12時間後に完了して、急性心筋梗塞(AMI)または単純心筋梗塞(MI)と呼ばれる症状を生じる。
【0003】
心筋梗塞は、長期虚血に起因する心臓筋肉の非可逆的壊死の症状である。心筋層の損害または疾患領域は、非収縮性スカベンジャー細胞で浸潤され、最終的には瘢痕組織に取って代わられる。この繊維性瘢痕は、心臓の収縮に有意に寄与せず、実際、電気的異常を生じ得る。
【0004】
AMIを生き延びたものは、心不全を発症する危険性が4〜6倍高い。AMIを生き延びたものに対する現在のかつ提唱された治療は、薬理学的アプローチおよび外科的介入に集中している。たとえばステントを用いた場合と用いない場合の血管形成術は、狭窄を低減するための既知の技法である。ほとんどの治療が、再灌流を成し遂げ、心室損傷を最小限にするよう意図される。しかしながら、現在のまたは提供された療法で、心筋壊死(すなわち、心臓筋肉の細胞の分解および死)を取り扱うものはない。心臓細胞は損傷または疾患領域を再増殖する(repopulate)ために分裂しないため、この領域は、侵入繊維芽細胞により生成された結合組織で充填される。繊維芽細胞は、コラーゲンがもっとも豊富である細胞外マトリックス構成成分を産生する。繊維芽細胞それ自体もそれらが形成する結合組織も、収縮性でない。したがって、心筋壊死を直接取り扱うために、分子および細胞的心筋形成術調査が進展した。
【0005】
細胞的心筋形成術は、その収縮性機能を回復するという目標を有して、損傷または疾患心筋層中に、器官というよりむしろ細胞を移植することを含む。細胞的心筋形成術の領域の調査は、Cellular Cardiomyoplasty: Myocardial Repair with Cell Implantation, ed. Kao and Chiu, Landes Bioscience (1997)(特に5〜8章)で検討されている。たとえば、Koh et al., J. Clinical Invest., 96, 2034-2042 (1995)は、AT−1心臓腫瘍細胞株からの細胞をイヌに移植し、非制御化成長を見出した。Robinson et al., Cell Transplantation, 5, 77-91 (1996)は、C2C12骨格筋細胞株からの細胞を、マウス心室に移植した。これらのアプローチは興味を引く調査研究を生じたが、確立された細胞株からの細胞は、通常ヒトレシピエントから拒絶される。Li et al., Annals of Thoracic Surgery, 62, 654-661(1996)は、胎仔心筋細胞を成体マウス心臓に送達した。彼等は、収縮期圧改善を見出し、これらの細胞の存在が梗塞後のリモデリングを阻止することに気づいた。彼等の結果は移植細胞技術の効力を示したが、このアプローチは、同系胎仔心臓組織がヒト患者に利用可能でないため、臨床医学において有効であるとは思われない。Chiu et al., Ann. Thorac. Surg., 60, 12-18(1995)は、イヌ心室への培養骨格筋筋芽細胞の直接注入を実施し、十分に発達した筋組織が観察されたことを見出した。しかしながら、この方法は高侵襲性であり、ヒトMI患者におけるその実行可能性を危うくする。
【0006】
分子的心筋形成術は、繊維芽細胞が遺伝子操作され得るために、開発された。すなわち、終端的に分化されない繊維芽細胞は骨格筋と同一の胚細胞型から生じるため、それらの表現型は修正され得るし、おそらくは骨格筋衛星細胞に変換され得る。これは、骨格筋に特異的な遺伝子ファミリー(筋原性決定遺伝子または「MDGS」)の成員を作動させることによりなされ得る。ミオゲニン遺伝子を保有する遺伝子操作したアデノウイルスは、直接注入によりMI域に送達され得る。ウイルスは細胞膜を貫通し、細胞自体の機構を用いて、ミオゲニンタンパク質を産生する。細胞中へのミオゲニンタンパク質の導入は、骨格筋遺伝子であるミオゲニン遺伝子の発現を作動し、これが次に、MDGSの他の成員を作用をオンにして、繊維芽細胞を骨格筋筋芽細胞に変換し得る。繊維芽細胞におけるこの遺伝子カスケードを達成するために、ミオゲニン遺伝子を保有する複製欠陥アデノウイルスを用いて、宿主細胞中に外因性遺伝子を送達し得る。いったんウイルスが繊維芽細胞に感染すれば、ウイルス遺伝子から産生されるミオゲニンタンパク質は内因性遺伝子を作動して、カスケード作用を開始し、繊維芽細胞を筋芽細胞に変換させ得る。核エンベロープがない場合、ウイルスは分解されるが、細胞自身の遺伝子が、骨格筋細胞としての細胞の表現型を保持する。
【0007】
この概念は、in vitroで十分発展された。たとえばTam et al., J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 918-924(1995)は、繊維芽細胞を筋芽細胞に変換するためにin vitroでMyoD発現レトロウイルスを用いた。しかしながら、その生存能力は、in vivoでは実証されていない。たとえばKlug et al., J. Amer. Physiol. Society, 1913-1921(1995)は、in vivoでSV40を用いて、核およびDNAの複製に成功したが、心筋細胞それ自体では成功しなかった。さらにLeor et al., J. Molecular and Cellular Cardiology, 28, 2057-2067(1996)は、遺伝子送達技法を用いた新規収縮組織のin situ生成を報告した。
心臓の機能を矯正するかまたは増大するためのペースメーカーの使用は、移植骨格筋組織の再訓練のより特殊化されたルーチンにおけるそれらの使用を含めて、医療業界で十分に確立されている。EP0487429A1およびUS5306293は、頻脈を防止するための心臓パラメターのモニタリングのための装置を記載する。開示内容に含まれるのは、骨格筋組織からの移植組織により処置されたまたは修復された心臓の活発な恒久的なモニタリングにおけるこのようなペースメーカーの使用についての考察である。同様に、US5632716Aは、心筋を訓練するための、またはそうでなければ増大するための、たとえば心臓組織周囲の骨格筋移植片の訓練のための筋肉訓練装置を記載する。EP054733も、心臓性能を増大するために患者の心臓および骨格筋移植片を刺激するための抗不整脈ペースメーカーを主に記載する。記載された装置は、異常心臓症状を検出して分類し、刺激体を用いて筋肉に接触する電極にパルス列を送達する。それは、心臓とともに骨格筋細胞移植片を用いる手法を支持する。米国特許第4,791,911号は、移植手法に用いるために胸郭に通すための一定の筋肉フラップ組織を切除することを含む心臓再構築手術の一方法を記載する。
種々の外来作用物質が心臓に送達されて、性能を増大し、疾患を治療してきた。たとえば欧州特許第0547733号は、筋ジストロフィーまたは心筋虚血を含めた遺伝子療法に用いるための組換えアデノウイルスベクターを送達することによる心臓および血管筋肉組織中の遺伝子産物の発現を記載する。ある種の開示、たとえば国際公開第9421237A号は、移植可能整調装置および抗不整脈剤の制御放出のための装置を含む心臓律動を制御するためのシステムを記載する。
特定のペースメーカーの構築および設計のさらなる説明は、当業界で既知である。たとえば欧州特許第0627237A号は、無縫合ケーシングを有する心外膜および心筋組織を刺激するためのペースメーカーを記載する。ケーシングは、ケーシングの外部表面の一部を構成する電極先端に接続されるパルス発生器を収納する。電極先端は心外膜と直接接触する。同様に米国特許第4256115号は、心筋に直接取り付けられた小円板に適合される無導線バッテリー作動心臓ペースメーカーを記載する。
【0008】
したがって、心筋層の梗塞域の位置への、より一般的には損傷または疾患心筋組織中および/または付近への、細胞またはベクターのような再増殖作用物質の源の低侵襲性送達のための有効なシステムおよび方法が必要とされている。
【0009】
特許および非特許文書の以下の一覧表のうちの多くは、分子および細胞的心筋形成術技法に関連した情報を開示する。その他は、たとえば心筋梗塞に関する背景情報に向けられる。
【0010】
【表1】
【0011】
【表2】
【0012】
【表3】
【0013】
【表4】
表1に列挙したすべての特許および非特許文書はこれにより、それらのそれぞれの記載内容が、参照により本明細書中に含まれる。発明の概要、好ましい実施形態の詳細な説明および併記の特許請求項を読めば当業者が理解するように、これらの文書中に開示されたシステム、装置および方法の多くは、本発明の教示を用いることにより、有益に修正され得る。
【0014】
[発明の概要]
本発明は、心筋梗塞後のあるいは損傷または疾患心筋組織中および/または付近への壊死性心臓筋肉に対する損傷を元に戻す方法および移植可能なシステムも提供する。具体的には、再増殖作用物質の供給源を供給する方法を刺激装置と組合せることを含む。より具体的には、未分化または分化収縮細胞を用いた損傷または疾患心筋の再増殖、ならびに心臓機能を改善するために心臓と同期的に新規生成組織を収縮させるための電気刺激による新規生成組織の増大を含む。
【0015】
本発明は、(a)損傷または疾患心筋組織中および/または付近に新規収縮組織を生成することができる細胞再増殖源を含む。細胞再増殖源は、患者の心筋層中に移植され、好ましくはこの場合、心筋層は損傷されまたは罹患しており、たとえば組織は心筋梗塞後である。再増殖源は、カテーテルにより、あるいはより手動的に注射器により、心筋組織に、たとえば梗塞化組織領域に直接送達され得る。
【0016】
細胞再増殖源は、未分化収縮細胞、たとえば骨格筋衛星細胞、筋芽細胞、幹または間充織細胞等、あるいは分化心臓または骨格細胞、たとえば心筋細胞、筋管および筋繊維細胞等を含み得る。移植細胞は、自系筋細胞、同種異系筋細胞または異種筋細胞であり得る。
【0017】
細胞再増殖源は、任意に送達ビヒクル中に含入される遺伝物質を含み得るが、この場合、送達ビヒクルは核酸分子、たとえばプラスミドDNAを含み得る。さらにプラスミドDNAは、任意に少なくとも1つの遺伝子を含有し得る。核酸分子は、筋原性決定遺伝子のような遺伝子をコードし得る。送達ビヒクルは、リポソーム中で、または任意の適切な供給源により送達され得る。
【0018】
細胞再増殖源は、高分子マトリックスを添加的に含み、これはさらに担体を含み得るか、あるいは細胞再増殖源は担体上に被覆され得る。
電気刺激装置は、任意に損傷または疾患心筋組織中および/または付近に接続される2つの電極を有し、任意に細胞再増殖源のための担体であり得る筋肉刺激体を含み得る。一様式において、電気刺激装置は、バースト刺激またはパルス刺激またはそれらの組合せを提供し得る。
【0019】
未分化または分化収縮細胞による損傷または疾患心筋層の再増殖は、細胞的または分子的アプローチを用いて実行され得る。細胞的アプローチは、たとえば未分化または分化収縮細胞の、好ましくは培養自系骨格細胞の、梗塞域(すなわち心筋層の損傷または疾患領域)への、直接的または冠動脈注入による注入を含む。分子的アプローチは、たとえば梗塞域を襲う繊維芽細胞を筋芽細胞に変換するために、たとえば、任意にリポソームまたはその他のこのような送達ビヒクル、あるいは遺伝子操作したベクター中に組み込まれた核酸(裸DNAであれプラスミドDNAの形態であれ)の、梗塞域への、直接的または冠動脈注入を介した注入を含む。遺伝子操作したベクターとしては、たとえばウイルス発現ベクター、たとえばレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【0020】
本発明の種々の実施形態は、1つまたはそれ以上の以下の利点を提供する。組織の弾性および収縮性の修復、左心室機能増大、リモデリング量の低減(すなわち、弾性および収縮性組織の非弾性および非収縮性組織への変換)、ならびに罹患率および死亡率低減。
【0021】
一実施形態では、本発明は、以下の:患者の心筋層の梗塞域中および/または付近に、より一般的には損傷または疾患心筋組織中および/または付近に新規収縮組織を生成することができる遺伝物質、未分化収縮細胞、分化収縮細胞またはそれらの組合せを含む細胞再増殖源と、患者の心筋層の梗塞域中および/または付近の新規収縮組織を電気的に刺激するための電気刺激装置とを含む移植可能なシステムを提供する。心筋層あるいは損傷または疾患心筋組織の梗塞域は、当業者により確定され得る。梗塞域あるいは損傷または疾患心筋組織付近とは、壊死性心筋に対する損傷が実感されるほど十分に近いことを意味する。通常これは、梗塞域あるいは損傷または疾患組織領域の縁の約1センチメートル(cm)以内を意味する。
【0022】
別の実施形態では、本発明は、以下の:患者の心筋層の梗塞域あるいは損傷または疾患心筋組織中および/または付近に新規収縮組織を生成することができる適切な細胞型、たとえば骨格筋衛星細胞を含む細胞再増殖源と、患者の心筋層の梗塞域中および/または付近の新規収縮組織を電気的に刺激するための電気刺激装置であって、バースト刺激を提供する装置とを含む移植可能なシステムを提供する。
【0023】
本発明は、患者の心筋層の修復方法であって、上記の移植可能なシステムを提供することと、患者の心筋層の梗塞域中および/または付近に細胞再増殖源を移植することと、細胞再増殖源から新規収縮組織を十分な時間生成させることと、新規収縮組織を電気刺激することとを含む方法も提供する。通常、新規収縮組織は約15日以内に生成するが、電気刺激は、収縮組織が生成された後さらに約14日までの間は有効でない。
【0024】
[好ましい実施形態の詳細な説明]
本発明は、(a)損傷または疾患心筋組織中および/または付近に新規収縮組織を生成することができる細胞再増殖源を含む。細胞再増殖源は、患者の心筋層中に移植され得るが、好ましくはこの場合、心筋層は損傷または疾患を受けており、たとえば組織は心筋梗塞後である。細胞再増殖源は、カテーテルにより、またはより手動的には注射器により、心筋組織中に、たとえば梗塞化組織域中に、直接送達され得る。
【0025】
細胞再増殖源は、未分化または分化収縮細胞、たとえば骨格筋衛星細胞、筋芽細胞、幹または間充織細胞を包含し得る。移植化細胞は、自系筋細胞、同種異系筋細胞または異種筋細胞であり得る。
【0026】
細胞再増殖源は、任意に送達ビヒクル中に含入される遺伝物質を含み得るが、この場合、送達ビヒクルは核酸分子、たとえばプラスミドDNAを含み得る。さらにプラスミドDNAは、任意に少なくとも1つの遺伝子を含有し得る。核酸分子は、筋原性決定遺伝子のような遺伝子をコードし得る。送達ビヒクルは、リポソーム中で、または任意の適切な源により送達され得る。
【0027】
細胞再増殖源は高分子マトリックスを添加的に含み、これはさらに担体を含み得るか、あるいは細胞再増殖源は担体上に被覆され得る。
電気刺激装置は、任意に損傷または疾患心筋組織中および/または付近に接続される2つの電極を有し、任意に細胞再増殖源のための担体であり得る筋肉刺激体を含み得る。一様式において、電気刺激装置は、バースト刺激またはパルス刺激またはそれらの組合せを提供し得る。
【0028】
本発明は、未分化または分化収縮細胞を用いた損傷または疾患心筋層の再増殖による、心筋梗塞後の壊死性心筋に対する損傷を元に戻す方法および移植可能なシステムも提供する。この再増殖は、新規注入組織の収縮と心臓収縮との同期性を保証するために、電気刺激により増大される。
【0029】
未分化または分化収縮細胞による損傷または疾患心筋層の再増殖は、種々の細胞的または分子的アプローチを用いて実行され得る。通常、未分化または分化収縮細胞が心筋層の梗塞域を再増殖する種々の技法のいずれかが用いられ得る。特定の一用途において、それらは、未分化収縮細胞を梗塞域に送達し、または細胞を形質転換し、たとえばin situで未分化収縮細胞を成長させることを包含し得る。
【0030】
細胞的アプローチは、たとえば未分化または分化収縮細胞の、好ましくは培養筋芽細胞(すなわち筋細胞)、より好ましくは骨格または心臓筋芽細胞の、心臓の梗塞域(すなわち、心筋層の損傷または疾患領域)への、直接的または冠動脈注入による注入を含む。好ましくは細胞は、免疫応答および組織拒絶を低減および/または排除するために、自系である。通常、注入時に、骨格筋芽細胞は心筋繊維に分化する。
【0031】
分子的アプローチは、たとえば梗塞域を襲う胞胚性未分化細胞(たとえば繊維芽細胞または幹細胞)を筋芽細胞に変換するために、たとえば任意にリポソームまたは同様のビヒクル、あるいは遺伝子操作したベクター中に組み込まれた核酸(裸DNAであれプラスミドDNAの形態であれ)の、梗塞域への、直接的または冠動脈注入を介した注入を含む。ベクターは、好ましくは、たとえばその遺伝子産物が繊維芽細胞を筋芽細胞表現型変換に誘導する筋肉ファミリーの遺伝子の成員であるミオゲニンまたはMyoDを発現するウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターであり得る。
【0032】
再増殖細胞のこれらの領域は、拡張期心臓機能改善を提供する。有意には、電気刺激による再増殖領域の増大は、収縮期ならびに拡張期機能改良を提供する。その結果、本発明は、細胞再増殖源(すなわち細胞再増殖作用物質)および電気刺激装置(すなわち刺激源)を含むシステムおよび方法を提供する。細胞再増殖源は、未分化収縮細胞、たとえば自系筋細胞、あるいは繊維芽細胞のたとえば筋芽細胞への変換のための核酸を包含し得る。再増殖源は、分化心臓または骨格細胞、たとえば心筋細胞、筋管、筋繊維等を含み得る。細胞再増殖源は、心筋層中への直接注入により、または冠動脈血管系を介して送達され得る。細胞再増殖は、注射器を用いて実行され得るか、または代替的には送達装置、たとえばカテーテルが用いられ得る。細胞または遺伝物質は電気刺激装置と同時に送達され得るか、あるいはそれらは別々に送達され得る。好ましくは電気刺激装置は、細胞または遺伝物質の担体である。電気刺激装置は通常、移植可能筋肉刺激体および電極を含む。有意には、電気刺激装置は、任意の他の装置と接続する導線を包含しない。
【0033】
細胞再増殖源(すなわち細胞再増殖作用物質)としては、たとえば局所新脈管形成、細胞収縮性、細胞成長および移動を刺激するための薬剤、強化化学物質、タンパク質等が挙げられ得る。これらの例としては、たとえばaFGF(酸性繊維芽細胞成長因子)、VEGF(血管内皮成長因子)、tPA(組織プラスミノーゲン活性剤)、BARK(β−アドレナリン作動性受容体キナーゼ)、β−遮断薬等が挙げられ得る。ヘパリンまたはその他の抗凝固剤、たとえばポリエチレンオキシド、ヒルジン、および組織プラスミノーゲン活性剤も、血栓症を防止または制限するために有効な量で移植前に細胞再増殖源中に組み入れられる。
【0034】
図1を参照すると、本発明の移植可能なシステムは、未分化収縮細胞および/または分化細胞のための担体22を含む送達装置10を包含し、別個にまたは添加的に、遺伝物質(すなわち種々の形態の核酸)または分化収縮細胞を含入し得る。これは電気刺激体カプセルの形態である。所望により、その他の担体は、直接注入かまたは冠動脈注入が用いられることによって設計され得る。図1に示したように、担体22は、カテーテル19を用いて患者の心筋層の梗塞域に送達される。任意に、細胞および/または遺伝物質は全身注射され得る場合のように、細胞および/または遺伝物質の送達のために担体は必要でない。図1において、細胞再増殖源は繊維芽細胞−筋芽細胞変換ベクター14である。細胞再増殖源(すなわち細胞再増殖作用物質)は、通常患者の心臓の心筋層18の梗塞域16中への受動的拡散により担体22から放出される。
【0035】
未分化および分化収縮細胞
本発明における移植に適した細胞としては、広範な種々の未分化収縮細胞が挙げられる。通常これらは分化して筋肉細胞を形成するが、しかしながら、それらはex vivoで筋芽細胞に変換された繊維芽細胞であり得るか、あるいは未分化収縮細胞として機能するようプログラムされた広範な種々の免疫学的中性細胞のいずれかであり得る。本発明に用いるための適切な細胞は、通常臍帯細胞、骨格筋衛星細胞を含む。
【0036】
移植のための適切な細胞としては、分化心臓または骨格細胞、たとえば心筋細胞、筋管および筋繊維細胞等も挙げられる。それらは自系、同系異種または異系であり得るし、遺伝子操作されている場合もされていない場合もある。このような細胞の混合物も用いられ得る。自系細胞が特に望ましい。細胞は、心筋層の梗塞域を再増殖することができるか、あるいは損傷または疾患心筋領域に健常組織を確立することができる。
【0037】
骨格筋衛星細胞は、電気刺激に応答して収縮することができる筋細胞に分化し得るため、本発明に用いるのに特に適している。それらはまた、同一患者の生検試料由来の細胞培養から得られるため、本発明に用いるのに特に適している。生検試料は、成熟骨格繊維を、成熟繊維周囲の貯蔵細胞とともに含有する。いったん培養中に置かれると、貯蔵細胞は増殖し、それらの数は急速に増大する。これらの新規培養細胞は、梗塞域中および/または付近の心臓中に注入し戻される。心筋中に入ると、骨格筋芽細胞は融合して、収縮特性を有する多核化筋管を形成する。
【0038】
骨格筋細胞は収縮することができるが、それらは心臓細胞とは異なる。骨格筋の機械的および電気的特性は、心筋の場合とまったく異なる。骨格筋衛星細胞は、機械的に収縮し、非常に迅速に弛緩する。したがって、持続性収縮を生じるために、骨格細胞はかなり迅速に律動されるが、これはエネルギー貯蔵の急速欠乏および筋肉疲労発症を引き起こす。しかしながら、骨格筋は、心筋と同様の速度でまたはそれと協力して収縮するよう状態調節され得る。
【0039】
骨格細胞は、それらの電気的特性においても心臓細胞と異なる。各骨格筋繊維は、筋肉を神経支配する運動ニューロンから放出されるアセチルコリンにより刺激される。しかしながら、心臓細胞は、細胞の細胞質間のイオン通過のためのチャンネルを含有する介在板を介して相互連結される。この型の電気的相互連結は、骨格筋衛星細胞間に存在する。電気刺激の使用はこの問題を回避し、心筋と同様の速度でまたは心筋と協力して収縮するよう細胞を状態調節する。
【0040】
しかしながら、心筋層中に移植される任意の分化または未分化細胞型は、正常生理学的収縮リズムと同期的に収縮を調和させるための電気刺激を有することにより、利益を得る。
【0041】
未分化および/または分化収縮細胞は、以下でさらに詳細に説明されるように、送達ビヒクル、たとえばリポソームまたは高分子マトリックスと組合せて送達され得る。
【0042】
いったん未分化および/または分化細胞が収縮組織を生成すれば、それらの機能は、それらを代謝的に変更することにより、たとえばミオスタチンの生成を抑制することにより、さらに強化され得る。これは、筋繊維の数を増大する。
【0043】
遺伝物質
核酸は、未分化および分化収縮細胞の代わりに、またはそれに加えて、用いられ得る。核酸は、裸、プラスミドDNA形態であり得るし、これらはリポソームまたはその他のこのようなビヒクル、あるいは所望のDNAを組入れるベクター中に組み込まれ得るか、そうでない場合もある。核酸は、患者の心筋層の梗塞域あるいは損傷または疾患組織内および/または付近の非収縮細胞を収縮(すなわち収縮性)細胞に変換することができる。しかしながら、所望により、非未分化収縮性細胞は、ex vivo遺伝子操作技法を用いて未分化収縮性細胞に変換され、次に梗塞域に送達され得る。
【0044】
非未分化または分化収縮性細胞に核酸を送達するために用いられ得る広範な種々の方法がある。たとえば繊維芽細胞は、結合性から収縮性にそれらの表現型を変換され得る。このような方法は、遺伝子操作業界の当業者に既知である。たとえば所望の核酸が適切な送達ビヒクル、たとえば発現プラスミド、コスミド、YACベクター等に挿入されて、組換え核酸分子を産生する。生のまたは不活性な多数のウイルス、たとえば組換えウイルスが存在し、これも用いられ得る。レトロウイルスは、種々の遺伝子のいずれかを送達するために遺伝子修飾され得る。アデノウイルスも、非分化収縮性細胞を未分化収縮性細胞、好ましくは筋細胞に変換することができる核酸を送達するために用いられ得る。「組換え核酸分子」は、本明細書中で用いる場合、送達ビヒクル中に挿入される単離ヌクレオチド配列からなる。調節素子、たとえばプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、所望により、ヌクレオチド配列と操作可能なように連結される。
【0045】
核酸分子、好ましくは組換え核酸分子は、以下で説明するように、合成的に、または好ましくは単離核酸分子から調製され得る。核酸は、当業者に既知の標準技法により、他の細胞構成分、たとえばその他の細胞性核酸またはタンパク質などから離れて精製される場合、「単離」される。核酸分子のコード領域は、全長遺伝子産物またはその断片、あるいは新規の突然変異化または融合配列をコードし得る。コード配列は、標的細胞に対して内因性の、あるいは標的細胞に対して外因性の配列であり得る。コード配列が操作可能なように連結されるプロモーターは、通常コード配列と連結しているものであり得るか、そうでない場合もある。
【0046】
心臓血管系に核酸を導入するために、ほとんどの任意の送達ビヒクル、たとえば組換えベクター、たとえばFrench, et al., Circulation, 90, 2414-2424 (1994)に記載されたようなアデノウイルス血清型5、Ad5に基づいたものが用いられ得る。心臓細胞へのアデノウイルス媒介性遺伝子移入に関する添加的プロトコールは、国際公開第94/11506号、Johns, J. Clin. Invest., 96, 1152-1158(1995)およびBarr, et al., Gene Ther., 1, 51-58(1994)に記載されている。その他の組換えベクターとしては、たとえばプラスミドDNAベクター、たとえばAcsadi, et al., The New Biol., 3, 71-81, (1991)およびGal, et al., Lab. Invest., 68, 18-25(1993)に記載されているようなpGEM3またはpBR322から得られるもの、cDNA含有リポソーム、人工ウイルス、ナノ粒子等が挙げられる。
【0047】
組換え核酸分子の調節素子は、哺乳類細胞、特にヒト細胞中での発現を指図することができる。調節素子としては、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらにその他の素子、たとえばKozak領域も、組換え核酸分子中に含まれ得る。本発明を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特にSV40ポリアデニル化シグナルとして言及されるpCEP4プラスミド(Invitrogen, San Diego, CA)中に存在するSV40ポリアデニル化シグナルが用いられ得る。
【0048】
組換え核酸分子を構築するのに有用なプロモーターは、構成的または誘導可能であり得る。構成的プロモーターは、細胞成長の全条件下で発現される。構成的プロモーターの例としては、以下の遺伝子に関するプロモーターが挙げられる。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等。さらに、多数のウイルスプロモーターが真核生物細胞中で構成的に機能し、その例としては、SV40の初期および後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、マロネイ白血病ウイルスの長末端反復(LTR)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サイトメガロウイルス(CMV)極初期プロモーター、エプスタインバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)およびその他のレトロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。その他のプロモーターも当業者に既知である。
【0049】
誘導可能プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。たとえばメタロチオネインプロモーターは、ある種の金属イオンの存在下での転写を促進するために誘導(増大)される。その他の誘導可能プロモーターは、当業者に既知である。
【0050】
用いられるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは患者の細胞内で機能的する。タンパク質産生を最大限にするために、組換え核酸分子が投与される心臓細胞中での遺伝子発現によく適している調節配列が選択され得る。たとえばプロモーターは、好ましくは心臓組織特異的プロモーター−エンハンサー、たとえば心臓アイソフォームトロポニンC(cTNC)プロモーターなどである(Parmacek, et al., J. Biol. Chem., 265, 15970-15976 (1990)およびParmacek et al., Mol. Cell Biol., 12, 1967-1976(1992))。さらに、細胞中で最も効率的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は、心臓細胞中で機能的である組換え核酸分子を製造し得る。
【0051】
遺伝物質は、たとえばトランスフェクションまたは形質導入手法により、細胞中に導入され得るか、あるいは細胞により「接触され」得る。トランスフェクションとは、添加核酸分子の組込みによる新規の遺伝物質の細胞による獲得を指す。トランスフェクションは、物理的または化学的方法により起こり得る。多数のトランスフェクション技法が当業者に既知であり、その例としては、リン酸カルシウムDNA同時沈降法、DEAE−デキストランDNAトランスフェクション、電気穿孔、裸プラスミド吸着および陽イオン性リポソーム媒介性トランスフェクションが挙げられる。形質導入とは、DNAまたはRNAウイルスを用いて細胞中に核酸を移入する工程をさす。形質導入因子として用いるための適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスおよびセムリキ森林ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0052】
組換え核酸分子による細胞の処理または接触は、in vivoまたはex vivoで起こり得る。Ex vivo処理に関しては、細胞は動物(好ましくはヒト)から単離され、イオンチャンネルタンパク質をコードする核酸分子を含有する送達ビヒクルを用いて形質転換され(すなわちin vitroで形質導入されるかまたはトランスフェクトされ)、次にレシピエントに投与される。
【0053】
in vivo処理の好ましい一実施形態では、動物、好ましくは哺乳類、もっとも好ましくはヒトの細胞が、本発明の組換え核酸分子を用いてin vivoで形質転換される。in vivo処理は、通常組換え核酸分子を用いた局所内部処理を含む。組換え核酸分子のin vivo投与を実施する場合、好ましい送達ビヒクルは、非必須または補足可能な遺伝子が当該核酸に置き換えられた非細胞変性真核生物ウイルスを基礎にする。このような非細胞変性ウイルスとしては、その生活環がゲノムウイルスRNAのDNAへの逆転写を包含し、その後の宿主細胞DNA中へのプロウイルス組込みを伴うレトロウイルスが挙げられる。もっとも有用なのは、複製欠陥性である(すなわち、所望のタンパク質の合成を指図することができるが、感染性粒子を製造することができない)レトロウイルスである。このような遺伝的変更レトロウイルス発現ベクターは、in vivoでの遺伝子の高効率な形質導入のための一般的実用性を有する。複製欠陥性レトロウイルスを産生するための標準プロトコール(プラスミド中への外因性遺伝物質の組入れ、プラスミドを用いた包装細胞株のトランスフェクション、包装細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培地からのウイルス粒子の収集、ならびにウイルス粒子による標的細胞の感染の工程を含む)は、当業者に既知である。
【0054】
ある種の用途において、たとえばin vivo用途において細胞を接触させるための好ましいウイルスは、二本鎖DNAウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠陥性であるよう操作され、広範囲の細胞型および種を感染することができる。さらにそれは、熱および脂質溶媒安定性、多様な系統の細胞、たとえば造血細胞における高形質導入頻度、ならびに超感染抑制の欠如といった利点を有し、したがって多重シリーズの形質導入を可能にする。
【0055】
細胞中への組入れのための核酸として機能する核酸の例としては、筋原性タンパク質またはMyoDタンパク質を操作可能なようにコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は、全遺伝子または遺伝子の一部分を含み得る。遺伝子の例としては、活性形態のミオゲニン遺伝子またはMyoD遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を含めた送達ビヒクル(好ましくはウイルス)により送達される核酸の遺伝子配列は、種々の供給源、たとえばGenBank(Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico)、EMBLデータベース(Heidelberg, Germany)およびウイスコンシン大学バイオテクノロジーセンター(University of Wisconsin Biotechnology Center)(Madison, WI)、発行済み季刊誌、特許および特許公開から入手可能である。これらの供給元はすべて、当業者が容易にアクセスできる供給源である。遺伝子配列は、遺伝子配列が既知である場合、核酸断片(一般的にはDNA)を含有する細胞から得られる。核酸は、遺伝子断片の制限エンドヌクレアーゼ消化および単離により、あるいは、当該遺伝子を発現する細胞からのmRNAのcDNAコピーを増幅するための、または市販の遺伝子発現ライブラリーからの遺伝子のcDNAコピーを増幅するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られる。オリゴヌクレオチドまたはより短いDNA断片は、既知の核酸合成技法により、注文オリゴヌクレオチドの商業的供給元から、たとえばAmitof Biotech Inc. (Boston, MA)等から調製され得る。mRNAからcDNAを生成するために利用可能な種々の市販キットが存在する(その例としては、Stratagene, La Jolla, CAおよびInvitrogen, San Diego, CAが挙げられるが、これらに限定されない)、と当業者は認識する。同様に、Stratagene等から入手可能なライブラリーを含む、当業者に入手可能な種々の市販遺伝子発現ライブラリーが存在する。クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応およびベクターアセンブリーに関する一般的方法は、Sambrook et al. eds.( Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)およびInnis, et al. eds.(PCR Strategies, 1995, Academic Press, New York, New York)から利用可能である。
【0057】
特定のウイルスゲノムが収容し得るか、またはウイルス粒子と会合され得る最大ゲノムサイズによって、細胞に核酸を送達するウイルスは、1つまたはそれ以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を含み得る。オリゴヌクレオチドは、当業者に既知の方法を用いて、ウイルス内のまたはウイルスの外表面と会合されるオリゴヌクレオチドの組入れを介してウイルスにより送達され得る。
【0058】
送達ビヒクルおよび担体
ウイルスベクター送達ビヒクルのほかに、細胞再増殖作用物質は、それが遺伝物質であれ、未分化収縮性細胞であれ、リポソームまたは高分子マトリックスを含み得る。これらは、電気刺激装置であり得る担体上に被覆されるか、またはそうでなければ担体中に組み込まれ得る。
【0059】
細胞および/または遺伝物質は、水性区画を取り囲む脂質二重層により形成される、水性媒質中の球状粒子であるリポソーム中で送達され得る。たとえば遺伝物質の送達のためのリポソームは、Clontech Laboratories UK Ltd., Basingstoke, Hampshire, United Kingdomから市販されている。
【0060】
細胞および/または遺伝物質は、それらを封入する高分子マトリックス中で送達され得る。本発明の高分子マトリックスは、ホモポリマー、コポリマー(すなわち、2つまたはそれ以上の異なるモノマーのポリマー)、あるいはたとえばフィブリンをたとえば1つまたはそれ以上のポリマーまたはコポリマーとともに含む組成物(たとえば配合物)から調製され得る。組成物は、好ましくは粘弾性、引裂抵抗性、生体適合性ポリマーを形成する。「粘弾性」という用語は、分子が弾性固体と粘性流体の組合せであったかのように、分子を応力に応答させる分子の規定「復元」特性を指す。「引裂抵抗性」という用語は、ポリマーは膨張応力に曝された場合、物質は実質的に裂けないことを示す。引裂きとは、応力下での物質における切込みまたは切れ目の拡大を指す。「生体適合性」という用語は、生物学的系に毒性または損傷性作用を及ぼさない物質を指すために本明細書中で用いられる。
【0061】
好ましくは高分子マトリックスは、細胞および遺伝物質が正しい位置にある場合に、心臓壁に対する刺激を最小限にするかまたは悪化させない。高分子マトリックスは好ましくは、単独で適用された場合、あるいは抗トロンボゲン剤、たとえばヘパリン等とともに、または抗炎症剤、たとえばデキサメタソン等とともに用いられる場合、非トロンボゲン性である。高分子マトリックスは、所望の放出速度または所望のポリマー安定度によって、生体安定性または生体吸収性ポリマーであり得る。
【0062】
本発明の高分子マトリックスは、1つまたはそれ以上のその他の合成または天然ポリマーを含み得る。適切なポリマーとしては、細胞または遺伝物質に適合性であるものを含む。それらは、生体安定性または生分解性であり得る。これらの例としては、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、セルロース、ヒアルロン酸、ポリウレタン、シリコーン、ポリカルボネート、ならびに通常移植可能医療用具中で有用であると開示された広範な種々のその他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
好ましくは、遺伝物質、たとえば遺伝子操作したベクターが送達される場合、それは架橋親水性ポリアクリル酸ポリマー中に組み込まれ得る。これは、担体、たとえば電気刺激装置の上のコーティングとして用いられ得る高分子量ヒドロゲルを形成する。遺伝物質は好ましくは、ヒドロゲルを先ず膨潤させることにより、送達直前にヒドロゲル中に組み込まれる。
【0064】
好ましくは、未分化および/または分化収縮性細胞が送達される場合、それらはI型コラーゲンのゲル中に組み込まれ得る。細胞は最初に、I型コラーゲン溶液を含む培地中に組み込まれ得る。この物質は次に、担体、たとえば電気刺激装置を含有する金型中に注入され得る。コラーゲンを架橋するのに十分な温度(たとえば37℃)および時間(たとえば30分間)でのインキュベーション後、被覆装置が取り出される。必要な場合には、その結果生じたゲル/刺激体は、細胞成長を可能にするのに十分な時間(たとえば14日間)、培地中で培養され得る。
【0065】
細胞組入れおよび増殖の時間によって、高分子マトリックスは多孔質足場の形態であり得る。これは、ステントコーティングの業界で既知であるように、溶解可能塩を用いてポリウレタンから作製され得る。多孔質高分子マトリックスは、細胞外マトリックス構成成分、たとえばフィブロネクチン、硫酸ヘパリン等で被覆され、次に任意に添加遺伝子構成成分を含む未分化または分化収縮性細胞を植付けられる。細胞は次に足場から外に成長し得る。
【0066】
所望により、フィブリンマトリックスが用いられ得る。それは、たとえばフィブリノーゲン溶液およびフィブリノーゲン−凝固タンパク質の溶液の使用により、調製され得る。フィブリンは、フィブリノーゲンをフィブリノーゲン−凝固タンパク質、たとえばトロンビンと接触することにより凝固される。フィブリノーゲンは、好ましくは、約10〜約50mg/mlの濃度、約5.89〜約9.0のpH、および約0.05〜約0.45のイオン強度の溶液中で用いられる。フィブリノーゲン溶液は通常、タンパク質および酵素、たとえばアルブミン、フィブロネクチン、XIII因子、プラスミノーゲン、抗プラスミンおよび抗トロンビンIIIを含有する。フィブリンを生成するために添加されるトロンビン溶液は、通常約120NIH単位/mlまでの濃度であり、約0.02M〜0.2Mの好ましい濃度のカルシウムイオンを含有する。さらに好ましくは、本発明においてフィブリンを生成するために用いられるフィブリノーゲンおよびトロンビンは、本発明の細胞または遺伝物質が交差種免疫反応を回避するために移植される場合と同一の動物またはヒト種からである。その結果生じるフィブリンは、約150℃で約2時間の熱処理を施されて、抗原性を低減または排除する。
【0067】
たとえば細胞および/または遺伝物質が心筋層の梗塞域に直接注入される場合、細胞および/または遺伝物質の送達のための任意の担体としては、電気刺激装置が挙げられ得る。あるいは、たとえば細胞および/または遺伝物質が冠動脈注入を介して注入される場合、細胞および/または遺伝物質の送達のための担体としてはカテーテルが挙げられる。
【0068】
細胞および/または遺伝物質は、たとえばコーティングまたは予備成形皮膜として担体と会合され得る。所望により、担体は、最初に接着剤、たとえばCELLTAK BIOCOAT Cell Environmentsの商品名でStratech Scientific Ltd., Luton, Bedfordshire, United Kingdomから入手可能なもので被覆されて、未分化および/または分化収縮性細胞および/または遺伝物質を含有する高分子マトリックスの接着を強化する。
【0069】
遺伝物質および/または未分化および/または分化収縮性細胞は、たとえばカテーテルを用いて製剤組成物中でも送達され得る。このような製剤組成物としては、たとえば所望の形態の核酸、および/または5%スクロースを含有する多量のリン酸塩緩衝化食塩水中の細胞が挙げられる。本発明のその他の実施形態では、核酸分子および/または細胞は、適切な製剤担体、たとえばこの分野における標準参照テキストであるRemington's Pharmaceutical Science, A. Osolの最新版に記載されているものとともに送達される。
【0070】
遺伝物質、未分化細胞または分化収縮性細胞が別々に、または一緒に任意の組合せで、電気刺激装置から別個に患者に注入される場合、かつ流体形態である場合、治療のための所望の部位に、たとえば電気刺激装置が配置される部位に隣接して、カテーテルを進めさせる。カテーテルの外方遠位端は開放しているかまたは多孔性であり、したがって遺伝物質および/または未分化および/または分化収縮性細胞を流体形態で末端から分散させる。カテーテルに連結された貯蔵所は、選定遺伝物質および/または未分化および/または分化収縮細胞の供給を保持する。圧力および流量の調整のために制御素子が用いられ、機械的または電気的に制御され得る。このような貯蔵所およびカテーテルの組合せのさらに詳細な説明に関して、国際公開第WO95/05781号が参照される。この送達装置は、細胞再増殖源を送達するために、ポンプ、たとえば浸透圧ポンプを含むかまたは含まない場合がある。
【0071】
電気刺激装置
本発明は、電気刺激装置22も含む。これは、心筋の静止と同期的に新規生成収縮性組織を拍動させるために正確な時間に必要な電気的パルスを提供する。
【0072】
電気刺激装置は、筋肉刺激体および分離電極を含み得る。あるいは電極は、筋肉刺激体中に組み込まれ得る。さらに筋肉刺激体は、もちろん、電気および電子回路部品に電流を供給するためのバッテリーを含むべきである。
【0073】
電気刺激装置は、通常骨格筋細胞を刺激するために用いられるバースト刺激を提供か、あるいは通常心筋細胞を刺激するために用いられる同期的単一パルス刺激を提供し得る。あるいは電気刺激装置は、バーストおよび同期的単一パルス刺激の両方を提供し得る。これは、形成された新規の収縮性組織が骨格筋細胞および心筋細胞の両方を含む場合に、および/または骨格筋細胞が最初に形成されて、次に心筋細胞に変換される場合に、特に望ましい。加圧導線または生理学的条件、たとえば壁加速または心室内圧をモニタリングするその他の手段を用いて、刺激のバーストモードから単相モードに切り替えるときを確定し得る。所望により、2つの電気刺激装置が用いられ、その1つはバースト刺激を提供し、もう1つは同期的単一パルス刺激を提供する。
【0074】
したがって慣用的な移植可能パルス発生器(IPG)は、本発明の教示にしたがって変更されて電気刺激装置22を提供し得るが、それらは、新規生成収縮性組織が長期持続性収縮を生じるために通常バースト刺激を必要とするため、細胞および/または遺伝物質を注入された心筋組織を刺激するためには、通常望ましくない。本発明の好ましいシステムは、移植可能刺激体(図1の22)および2つの電極(図1の陰極30および陽極32)を含む。このような刺激体22は、それを任意の他の装置と接続する物理的導線を含まない場合がある。しかしながら、遠隔部位で身体中に移植され、導線を用いて梗塞域に接続された刺激体から電気刺激を提供することが可能である。これは臨床的実行をより侵襲性にさせるが、それは刺激体カプセルの合併症を低減する。
【0075】
図1に示した好ましい刺激体22は、両末端に電極30および32を有するカプセルの形態である。これらの電極は、活性化波頭の通過を感知するために、ならびに新規生成組織、たとえば骨格筋組織の持続性収縮を生じるのに必要な一連の刺激パルスを送達するために内部回路部品に電気的接触を提供する。刺激体22は、好ましくは2つの電気回路、すなわち感度増幅器回路およびバースト発生器回路も含む。
【0076】
感度増幅器回路は、フィルターと連携して感度増幅器を形成する。これは、それが梗塞域を通過するときに、電気的脱分極波形を感知するために用いられる。増幅器は検出回路に対するこの弱いシグナルの利得を増大するが、一方、フィルターは、近くの筋肉および任意のその他の電気的装置からのノイズシグナルを拒絶するのに役立つ。
【0077】
バースト発生器回路は、接触された新規生成骨格筋組織を維持するために心室収縮中に図2に示したような一連のパルスを提供する。これは、骨格筋弛緩が心筋よりはるかに速いため、収縮中に持続性収縮を提供する必要がある。刺激体22は、感度増幅器およびバースト発生器に電力を提供する電源も含む。
【0078】
刺激体22は、円筒形の形状であるか、または移植に適したその他の適切な形状であり、移植のために十分に小さいサイズを有し得る。たとえばそれは直径約5mm、長さ20mmであり得る。好ましい物質としてはチタンが挙げられるが、その他の生体適合性物質も用いられ得る。刺激体22は、バッテリーまたはその他の電源、心拍を検出し、バースト刺激を生じるためのエレクトロニクス、ならびに要求に応じて刺激を誘発するための遠隔計測回路を含有し得る。このような回路は、特に米国特許第5,697,884号(Francischelli他)、第5,658,237号(Francischelli)、第5,207,218号(Carpentier他)、第5,205,810号(Guiraudon他)、第5,069,680号(Grandjean)および第4,411,268号(Cox)の教示を顧慮して、当業者により開発され得る。
【0079】
好ましい刺激体22はそれを任意の他の装置に接続する物理的導線を含まないため、刺激体22はそれ自体の電力を発電する必要がある。心臓が500Ω負荷であり、1ミリ秒間に10ボルトで10パルスが必要であると仮定すると、各刺激は0.2mJを要する。エネルギー変換が20%の効率を有する場合には、1mJのエネルギーが毎拍動で心臓を刺激するのに必要である。心臓は、120mmHg(16kPa)に対して約50mLの血液をポンプ輸送するため、それは約800mJの仕事を実行する。したがって刺激体は、心臓により実行される機械的仕事のパーセントの約1/8を取り入れる。これは、静水圧を電気エネルギーに変換し得る種々のメカニズムのいずれかにより実行され得る。
【0080】
いったん移植されれば、通常刺激体22は、好ましくは収縮性組織成長を可能にするために最初の2〜3週間、活性化されない。それは次に、固有の心拍と装置生成バーストとの間の低同期化比(たとえば、3:1)で作動され、漸進的に増大される(たとえば、1:1に)。
【0081】
図3は、外部プログラミングユニット(図示せず)によりプログラム可能である刺激体22の種々の構成成分を示すブロック図である。本発明の目的のために適応可能なこのような一プログラムは、市販のメドトロニック(Medtronic)モデル9790プログラマーである。当該プログラマーは、たとえば米国特許第5,312,453号(Wyborny他)に記載されているような遠隔計測(テレメトリー)システムによりIPG51に無線周波数コード化シグナルを送信するプログラミングヘッドにより刺激体22に一連のコード化シグナルを提供するマイクロプロセッサー装置である。
【0082】
図3に例示的に示した刺激体22は、導線54により患者の心臓56に電気的に結合される。2つの心線を含む導線54は、入力キャパシタ66を介して刺激体22の回路部品中のノード62に結合される。本発明に開示された実施形態では、活動センサー63は、入力/出力回路68のプロセシング/増幅活動回路65にセンサー出力を提供する。入力/出力回路68は、マイクロコンピュータ回路78中のソフトウエア実行アルゴリズムの制御下でその速度を調整するための心臓56への刺激パルスの適用のために、心臓56、アンテナ66および回路74とインターフェイスするための回路も含有する。
【0083】
マイクロコンピュータ回路78は、システムクロック82、マイクロプロセッサ83、ならびにオン・ボードRAM84およびROM86を含むオン・ボード回路80を含む。この例示的実施形態では、オフ・ボード回路88はRAM/ROMユニットを含む。オン・ボード回路80およびオフ・ボード回路88は各々、データ通信バス90によりデジタルコントローラ/タイマー回路92に結合される。図3に示した電気的構成成分は、当該技術分野における一般的実施にしたがって、適切な移植可能バッテリー電源94により電力が供給される。明快にするために、バッテリー電力と刺激体22の種々の構成成分との結合は、図に示されていない。
【0084】
アンテナ66は入力/出力回路68に接続されて、RF送信機および受信機ユニット55によりアップリンク/ダウンリンク遠隔計測を可能にする。ユニット55は、米国特許第4,556,063号(Thompson他)に開示された遠隔計測およびプログラムロジックに、あるいは上記で引用したWyborny他の特許に開示されたものに対応し得る。電圧基準(VREF)およびバイアス回路61は、入力/出力回路68のアナログ回路のために、安定電圧基準およびバイアス電流を生成する。アナログ−デジタル変換器(ADC)およびマルチプレクサ58は、アナログシグナルおよび電圧をデジタル化して、「リアルタイム」遠隔計測心臓内シグナルおよびバッテリー寿命完了(EOL)交換機能を提供する。
【0085】
刺激体22のタイミングを制御するためのオペレーティングコマンドは、データバス90によりデジタルコントローラ/タイマー回路92に結合され、ここでデジタルタイマーおよびカウンタはIPGの全体的エスケープ間隔、ならびに入力/出力回路68内に配置された周辺構成成分の操作を制御するための種々の不応、ブリンキングおよびその他のタイミングウインドウを確立する。デジタルコントローラ/タイマー回路92は、好ましくは感知回路部品52、たとえば感知増幅器53、ピーク感知および閾値測定ユニット57、ならびにコンパレータ/閾値検出器59に結合される。
【0086】
感知増幅器53は感知電気心臓シグナルを増幅して、ピーク感知および閾値測定回路部品57に増幅シグナルを提供する。回路部品57は次に、経路64上のピーク感知電圧および測定された感知増幅器閾値電圧の指標をデジタルコントローラ/タイマー回路92に提供する。次に増幅された感知増幅器ノ信号はコンパレータ/閾値検出器59に提供される。感知増幅器53は、米国特許第4,379,459号(Stein)に開示されたものに対応し得る。
【0087】
回路92はさらに、好ましくは導線54上に配置された電極により感知される増幅および処理信号を受信するためにエレクトログラム(EGM)増幅器76と結合される。EGM増幅器76により提供されるエレクトログラム信号は、移植された装置が外部プログラマー(図示せず)により質問されている場合に用いられて、患者の電気的心臓活性のアナログエレクトログラムの表示をアップリンク遠隔計測により伝送する。このような機能性は、たとえば前に参照した米国特許第4,556,063号に示されている。
【0088】
出力パルス発生器74は、デジタルコントローラ/タイマー回路92により提供される刺激トリガー信号に応答して、結合コンデンサ65を介して患者の心臓56またはその他の適切な位置に電気刺激を提供する。出力増幅器74は、たとえば米国特許第4,476,868号(Thompson)に開示された出力増幅器に一般的に対応し得る。
【0089】
図3は、本発明に用途を見出し得るか、または当業者により本発明における使用のために修正され得る装置の例示的型を示しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない、と理解される。
【0090】
送達方法および装置
上記の未分化および/または分化収縮性細胞および/または遺伝物質は、種々の方法を用いて心筋層の梗塞域にあるいは損傷または疾患心筋組織に送達され得る。好ましくは未分化および/または分化収縮性細胞および/または遺伝物質は、所望の領域に直接注入される。
【0091】
直接注入のためには、小ボーラスの選定遺伝物質および/または未分化および/または分化収縮性細胞が微小注射器、たとえば100μLハミルトン注射器中に投入されて、心臓の外側から直接適用され得る。
【0092】
しかしながら、好ましくは本発明の方法は、電気刺激装置および細胞再増殖源の両方の直接注入のためにカテーテルを用いる。たとえばカテーテルは、大腿動脈から導入されて、左心室中に向けられ、これは透視方法により確証され得る。あるいはカテーテルは、右心室に向けられ得る。
【0093】
カテーテルは、延長カテーテル本体、適切には、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーンまたは任意のその他の許容可能な生体適合性ポリマーから作製され得る絶縁外装、およびその長さのためにそれを通って延びる標準管腔(これは中空針素子と連絡する)を含む。カテーテルは、たとえば米国特許第5,030,204号(Badger他)に開示されたように、収容管腔を有する操縦可能なおよび誘導可能なカテーテルを移行させることにより、あるいは米国特許第5,104,393号(Isner他)に図示されたような固定形状ガイドカテーテルによって、指定位置に誘導され得る。あるいはカテーテルは、PCT特許出願の国際公開93/04724(1993年3月18日公開)に開示されたように偏向可能スタイレットにより、または米国特許第5,060,660号(Gambale他)に開示されたような偏向可能ガイドワイヤにより、心臓内の所望の位置に進行され得る。さらに別の実施形態では、針素子は普通は、患者の心臓中にカテーテルを誘導した時点で、外装内に引込められ得る。
【0094】
いったん左(または右)心室中に入ると、カテーテルの先端はプローブとして左心室壁周囲を移動して、エレクトログラムを測定し、梗塞域の位置および程度を確定する。これは、当業者に既知の手法である。いったん梗塞域が同定されれば、ステアリングガイドは引き抜かれて、梗塞の部位に外装を残す。細胞再増殖源および/または電気刺激装置は次に、カテーテルの管腔を下降し、心筋層中に押し出される。カテーテルは次に、患者から引き抜かれ得る。
【0095】
電気刺激装置は、心筋層中の適所にそれを保持するために、種々のメカニズムを含み得る。たとえばそれは、延長可能フックまたは柄元を含み得る。あるいは装置の組織接触部分は、微小表面テキスチャーを達成するよう処理され得る(Andreas F. von Recumin in: Biomaterials, 12, 385-389、「Texturing of Polymer Surfaces at the Cellular Level」(1991);Biomaterials, 13, 1059-1069、「Macrophage Response to Microtextured Silicone」(1992);およびJournal of Biomedical Materials Research, 27, 1553-1557、「Fibroblast Anchorage to Microtextured Surfaces」(1993)により開示されているように)。代替的実施形態では、刺激体は、回転により筋壁中に推進されるスクリューの形態であり得る。
【0096】
実施例
以下の実施例は、例示目的のみを意図する。
実施例1
in situ繊維芽細胞の形質転換および電気刺激
ミオゲニンを発現するアデノウイルス(ミオゲンアデノウイルス/cDNA、これはMurry et al., J. Clin. Invest., 98, 2209-2217(1196)により記載された方法にしたがって産生され得る)を、100μl注射器を用いて心筋層に直接注射した。109pfu(pfu−プラーク形成単位−1pfuは約50アデノウイルス粒子である)を生理食塩水で希釈して100μl溶液を生成した。この溶液を注射までの間ドライアイス上に保持し、4等量で、90度離して、梗塞域の周囲に送達した。
【0097】
処置組織の組織病理学的査定を実行して、繊維芽細胞形質転換の程度を査定した。組織を組織学用に処理し、標準方法にしたがってH&Eおよびマッソン三色染料で染色した。
【0098】
免疫組織学的染色も実行して、処置組織中にミオゲニン発現が存在するか否かを確定した。8μm凍結切片を組織から切断し、固定し、ラットミオゲニンに対して産生されたウサギポリクローナルIgGとともにインキュベートした(Santa Cruz Biotechnology, Inc. カタログ番号sc−576)。試料をすすぎ、標識化二次抗体とともにインキュベートし、エピ蛍光顕微鏡により可視化した。
【0099】
ミオゲニンを発現するアデノウイルスのin vivoでの梗塞域組織への送達は、骨格筋筋芽細胞の多小パッチの出現を生じた。これらの単離筋細胞は、周辺核を有し、このことは、それらが組織学的に分析した場合に心筋細胞より以上に骨格筋細胞であると思われたことを示す。通常、遺伝学上変換された細胞は、筋芽細胞注入組織で観察される(すなわち融合前)筋管より未熟な形態の骨格筋を表す。ミオゲニン免疫反応性は、屠殺時にはこれらの細胞中に認められなかった。したがって、アデノウイルスにより作られたミオゲニンは組織収穫時にはもはや存在しない、と結論した(アデノウイルス発現はin vivoで1週間〜10日以上続行しないため、ウイルス送達後2週間目に予測した)。
【0100】
低温切除アデノウイルスβ−ガラクトシダーゼ注入心臓においては、低温切除を施された動物を用いて得られた結果と同様に、小毛管に沿って浸潤した繊維芽細胞およびリンパ球のみを梗塞内で検出したが、ウイルス注入(対照)では検出しなかった。したがってこの対照群では、筋細胞またはミオゲニンに対する陽性染色を検出しなかった。これは、研究の分子部門のプラセボ群を構成した。
【0101】
実施例2
イヌにおける収縮性細胞の注入および電気刺激
骨格筋筋芽細胞に関する成長および継代情報
1.成長培地処方物:
81.6%M199(Sigma、M−4530)
7.4%MEM(Sigma、M−4655)
10%ウシ胎仔血清(Hyclone、カタログ番号A−1115−L)
1×(1%)ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度100,000U/L Pen./10mg/L Strep.、Sigma、P−0781)。
【0102】
2.細胞継代情報:
A.1×104細胞/cm2の接種密度は、約96時間で80%集密的細胞単層を生じる。
【0103】
B.1:4〜1:6のスプリット比は、96時間以内に集密的細胞単層を生じる。
C.細胞を集密的になるようにさせない。細胞−細胞接触は、細胞を筋管に分化させる。
【0104】
3.継代情報
【0105】
【表5】
A.T−フラスコから培地を取り出す。
【0106】
B.適量のハンクス平衡塩類溶液(HBSS)を添加し戻す。
C.室温で約5分間インキュベートする。
D.HBSSを除去し、トリプシン溶液を代わりに入れる。
【0107】
E.5%CO2インキュベーター中で37℃で最大5分間インキュベートする。細胞は、5分前に培養基質から分離する。
F.必要以上に長時間トリプシン処理しない。5分間より長くトリプシン中に残存させる場合、細胞にショックを与える。
【0108】
G.フラスコを静かに攪拌して、細胞を取り出す。
H.少なくとも同じ容量の成長培地を添加し戻して、トリプシンを中和する。
【0109】
I.細胞計数のために試料を取り出す。
J.1000RPMで10分間、細胞を遠心分離する。
K.細胞を計数し、細胞数を算定する。
【0110】
L.細胞培地中に再懸濁し、適切なフラスコ中に植付ける。
M.健常培養を維持するために、2〜3日ごとに培地を取り替える。
4.細胞計数:
A.細胞を適切な希釈剤(トリパンブルーまたはHBSS)中に希釈する。無希釈液または1:2希釈液は、集密的Tフラスコ用に良好に働く。
【0111】
B.血球計を用いて細胞を計数する。血球計に関する最も正確な範囲は20〜50細胞/平方である。
C.算定:
計数細胞÷計数平方×希釈因子×(1×104)=細胞/もとの細胞懸濁液1ml
酵素的筋芽細胞単離
骨格筋は、心筋とは違って、損傷または疾患を蒙った場合に、それ自体を修復する能力を保有する。この理由は、成熟筋肉中に存在する未分化筋芽細胞(衛星細胞と呼ばれる)が存在するためである。
【0112】
成熟筋肉筋管は、筋芽細胞から筋管への分化の工程で、細胞が増殖する能力を失うために、培養中で成長され得ない。骨格筋筋管に関するin vitro調査を実行するためには、先ず筋芽細胞を単離することが最初に必要である。以下の手法は、骨格筋生検から一次筋芽細胞を単離し、その結果生じた細胞を継代培養するためである。
【0113】
1.材料:
A.単離培地:80.6%M199(Sigma、M−4530)、7.4%MEM(Sigma、M−4655)、10%ウシ胎仔血清(Hyclone、カタログ番号A−1115−L)、2×(2%)ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度200,000U/L Pen./20mg/L Strep.、Sigma、P−0781)。
【0114】
B.筋芽細胞成長培地:81.6%M199(Sigma、M−4530)、7.4%MEM(Sigma、M−4655)、10%ウシ胎仔血清(Hyclone、カタログ番号A−1115−L)、1×(1%)ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度100,000U/L Pen./10mg/L Strep.、Sigma、P−0781)。
【0115】
C.洗浄溶液:M199、2×ペニシリン/ストレプトマイシン。
D.コラゲナーゼ(粗製:IA型、Sigma、C−2674)。
E.ヒアルロニダーゼ(I−S型、Sigma、H−3506)。
【0116】
F.プロテアーゼ(ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)から)(Sigma、P−8811)。
G.ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)、Ca2+およびMg2+無含有(Sigma、H−6648)。
【0117】
H.70%EtOH(滅菌濾過)。
I.パーコール(Sigma、P−4937)。
J.0.5g/Lトリプシン溶液(Sigma、T−3924)。
【0118】
K.15mlおよび50ml滅菌遠心分離管。
L.100mm滅菌ペトリ皿。
M.滅菌鋏および滅菌鉗子(Fine Scientific Tools)。
【0119】
N.5ml、10ml、25ml滅菌ピペット(Falcon)。
O.BIOCOATラミニンセルウエア(Laminin Cellware)(25cm2および75cm2フラスコ、Becton Dickinson、カタログ番号40533、40522)。
【0120】
P.T−75組織培養フラスコ、0.22μmベント式キャップ(Corning)。
Q.フィルター、0.22μmおよび0.45μm、酢酸セルロース(Corning)。
【0121】
R.ポリカルボネート遠心分離管。
S.Beckman遠心管、GS−6。
T.インキュベーター振盪器。
【0122】
2.方法:
この手法の工程はすべて、無菌的に実施されるべきである。
A.単離培地を調製する:
・50ml滅菌遠心管に約30mlを添加する(生検10gまたはそれ以下)。
【0123】
・125ml滅菌培地瓶に約50mlを添加する(生検25gまで)。
B.単離培地を氷または氷パック上に載せて保冷する(約4℃)。
C.酵素溶液を調製する。同日に、1.0gmのコラゲナーゼおよび0.2gmのヒアルロニダーゼを100mlのM199に添加する(100mlの酵素/分配溶液が、40〜50gmの骨格筋を消化するのに十分である)ことにより、それを使用する。
【0124】
D.先ず0.45μmフィルターに、次に0.22μmフィルター通して酵素溶液を濾過滅菌し、使用の準備ができるまで4℃で保持する。
E.分配溶液を調製する。同日に、100mlのM199に1gmのプロテアーゼを添加することにより、それを用いる。
【0125】
F.0.22μmフィルター通して濾過滅菌し、使用の準備ができるまで4℃で保持する。
G.半滅菌条件下で、好ましくは筋肉の筋腹から骨格筋生検を取り出し、単離培地中にそれを入れる。
【0126】
H.容器を密封し、細切の準備ができるまで約4℃で保存する。
I.組織を取り出して、滅菌ペトリ皿に入れる。
J.あらゆる結合組織を切り取って、最終重量を測定する。
【0127】
K.滅菌70%EtOHで30秒間、組織をすすぐ。
L.EtOHを吸引して、HBSSで2回、組織をすすぐ。
M.鋏およびピンセットを用いて生検を細かく切り刻む。
【0128】
N.細切生検を50ml滅菌遠心分離管に移す。有効酵素消化のために20gm/管以下とする。
O.約25ml/管のHBSSを添加することにより組織をすすぎ、混合して、2000RPMでの遠心分離により組織をペレット化する(遠心分離機を2000RPMに到達させて、オフにする)。
【0129】
P.HBSSをデカントし、すすぎおよび遠心分離をさらに2回以上反復する。
Q.管に酵素溶液を添加する(約25ml/15gm〜20gmオリジナル生検)。
【0130】
R.インキュベーター振盪器中で20分間、管をインキュベートする(設定点−37℃、300RPM)。
S.2000RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
【0131】
T.分配溶液を管に添加する(約25ml/15gm〜20gmオリジナル生検)。
U.インキュベーター振盪器中で15分間、管をインキュベートする(設定点−37℃、300RPM)。
【0132】
V.2000RPMで5分間遠心分離する。
W.上清を収穫し、FBSを添加して酵素を不活性化し、最終濃度10%として、4℃で保存する。
【0133】
X.第二酵素消化のために、分配溶液を管に添加する(約25ml/15gm〜20gmオリジナル生検)。
Y.インキュベーター振盪器中で15分間、管をインキュベートする(設定点−37℃、300RPM)。
【0134】
Z.2000RPMで5分間遠心分離する。
AA.上清を収穫し、FBSを添加して酵素を不活性化し、最終濃度10%とする。
【0135】
BB.分配消化工程(WおよびAAを指す)からの細胞スラリーを、2400RPMで10分間遠心分離する。
CC.上清を取り出して捨てる。
【0136】
DD.最小容量の洗浄溶液中に細胞ペレットを再懸濁する。
EE.50ml遠心管中でペレットを併合し、洗浄溶液を用いて容量を40mlとする。
【0137】
FF.2400RPMで10分間遠心分離する。
GG.上清を取り出して、細胞洗浄を2回以上反復する。
HH.最終すすぎ時に、2mlのMEM中にペレットを再懸濁する。初期生検がほぼ25gかまたはそれより多い場合には、4mlのMEM中に再懸濁する。
【0138】
II.MEM中に20%パーコールおよび60%パーコールを調製する。
JJ.5mlの60%パーコール/MEM上に10mlの20%パーコール/MEMを層化することにより、密度勾配を作る(図1に言及)。
【0139】
KK.20%パーコールの上に2mlの細胞懸濁液を添加する。
LL.スケールを用いて、遠心分離用の釣り合い用おもりとして第二の管を用意する。
【0140】
MM.8℃で5分間、11947RPM(15000xg)で遠心分離する(アクセルを5に、ブレーキを0に調整する)。
NN.20%および60%パーコール層間に発現する細胞の帯域を単離する。この帯域は筋芽細胞を含有する。
【0141】
OO.帯域の容量を確定し、それを5容量の成長培地で希釈する。
注:パーコールが十分な成長培地で希釈されない場合、溶液から筋芽細胞をペレット化するのは非常に難しい。
【0142】
PP.3000RPMで10分間遠心分離する。
QQ.上清を除去し、成長倍地中にペレットを再懸濁する。
RR.懸濁液中で細胞を計数する。
【0143】
SS.約1×104細胞/cm2で、BIOCOATラミニン被覆Tフラスコ中の細胞からプレート化する。一次プレート化は、細胞付着を助けるために、ラミニン被覆表面上で実行すべきである。
【0144】
TT.細胞を集密度60%〜80%に培養する。細胞が集密化される場合、それらは最終的に筋管に分化する。
UU.トリプシン処理法:
単層細胞をHBSSで洗浄する。
【0145】
トリプシン(0.5g/lトリプシン)を添加する。
【0146】
【表6】
37℃で5分以下の間インキュベートする。
【0147】
血清含有培地でトリプシンを中和する。
細胞を取り出す。
800rpmで10分間遠心分離する。
【0148】
筋芽細胞成長培地中に再懸濁する。
約1×104細胞/cm2で処理細胞培養をTフラスコに植付ける。
1:4〜1:6のスプリット比は、60〜80%集密培養に関して良好に作用する。
【0149】
イヌ梗塞モデルの開発および細胞注入
左心室遊離壁の円形領域である直径3.5cmを低温切除することにより、イヌ心臓において心筋梗塞を作製した。これは、第4または第5肋間隙での左開胸術を実施して、イヌ心臓へのアクセスを有することにより達成した。LV遊離壁へのアクセスを有するために、心臓を整復した。低温切除用に、冠動脈血管系を比較的に含有しない領域を同定した。
【0150】
心外膜表面に直径3.5cmの金属プレートを有する慣例的低温切除器具を10分までの時間適用することにより、心筋層に梗塞を起こさせた。液体窒素を用いてプローブを冷却したため、その温度は、それが心臓表面に適用される前は−180℃という冷たさであった。イヌの左心室を流れる血液の容量は心内膜表面を温めるのに十分であるため、真の経壁切除は達成され得なかった。それにもかかわらず、LV遊離壁塊の15%を構成する13.5gのLV遊離壁を切除した。これは同様にヒト患者に関する梗塞の典型的サイズである。
【0151】
1匹のイヌに関しては、2.5gの骨格筋生検から、11日以内に1.79×108(179,000,000)個の筋芽細胞を得た。22ゲージ針を有し、0.5mL/部位で注入する注射器を用いて、切除部位周囲の10箇所の位置のイヌ心筋層中に、これらの細胞を再注入した(1.79×108細胞/5mLの生理食塩水)。
【0152】
in vivo電気刺激
MI導入の2週間後に、再び胸郭を開いて、依然と同様に動物に器機を取り付けた。さらに、単極VVIペーシングのために電極を心室先端に取り付けた。2つまたはそれ以上の電極を梗塞域のいずれの側にも取り付けて、細胞性心筋形成術領域を刺激した。
【0153】
動物のLV圧および拍動容量は有意に改善されない、ということがこの時点で注目された。実際に、動物をVVI整調した場合、ピーク収縮期圧は80mmHgよりわずかに高いだけであり、拍動容量も約22mLであった。これは、細胞配置単独は、収縮期機能を評価できるほどに改善しなかった、ということを示唆する。
【0154】
骨格筋刺激体を作動すると、収縮期圧は100mmHgに達し、拍動容量は40mLに増大した。心室整調体と骨格筋刺激体との間の同期化問題のために、試験中に安定トレースは得られなかった。それにもかかわらず、この実験は、骨格細胞単独の存在は収縮期機能を改善するには十分でなく、細胞性心筋形成術とともに、心臓機能を改善するための骨格筋刺激に対する必要性があり得る、ということを示した。
【0155】
処置領域における壁の動きの変化も、骨格筋刺激の適用に伴って観察された。伝統的心室整調のみ(上トレース)を用いた場合、梗塞域の長さは0.5mmだけ短縮した。しかしながら、骨格筋刺激を心室整調に加えて適用した場合、短縮は約1.0mmで、これは、骨格筋性心筋形成術領域を電気刺激することにより、壁運動または収縮性が増大されたことを示す。
【0156】
組織病理学的方法および結果
移植骨格筋細胞が2週間の期間の終わりに存在することを保証するために、抗ミオシン抗体(骨格筋性、fast、MY−32)を用いた免疫組織化学により、保存組織切片を分析した。切除部位の2つの異なる領域での陽性(緑色)染色は、それらの導入の2週間後に、心筋層の切除領域中の注入骨格筋細胞の存在を示した。この免疫染色試験は、心筋層中の骨格筋細胞の存在に関する明確な証拠を提供した。用いた免疫組織化学染色プロトコールを以下に記載する。
【0157】
免疫組織学的染色プロトコール
材料:
モノクローナル抗骨格筋ミオシン(Fast)、クローンMY−32、Sigmaカタログ番号M−4276。
【0158】
ポリクローナルウサギ抗−コネキシン−43、Zymed、カタログ番号71−0700。
ヤギ抗マウスIgG−FITC、Sigmaカタログ番号F−0257。
【0159】
ヤギ抗ウサギIgG(全分子)−TRITC、Sigmaカタログ番号T−6778。
PBS、Sigmaカタログ番号1000−3。
【0160】
ヤギ血清、Sigma。
アセトン、Sigmaカタログ番号A−4206。
取付培地、Sigmaカタログ番号1000−4。
【0161】
顕微鏡、ニコンLabophot-2。
試料:
骨格筋(対照)
後病変部
中心病変部
前病変部
J(L)心室遊離壁(対照)
方法:
A.95%EtOHでスライドガラスを清浄にして、ポリリシンで処理するか、または前処理スライドを購入する。
【0162】
B.組織試料を得て、クリオスタットチャック(cyrostat chuck)上で凍結させる。
C.凍結組織ブロックの8μm厚クリオスタット切片を切断し、処理済スライドガラス上に載せて、≦−70℃で保存する。
【0163】
D.組織切片を室温にした後、染色を開始する(約15〜30分)。
E.冷アセトン(≦−10℃)中で、4℃で10分間、試料を固定する。
F.PBSで3回、試料を洗浄する(スライドから試料を洗い落とさないよう、注意深くしなければならない)。
【0164】
G.湿潤チャンバを用いて室温で20分間、10%ヤギ血清/PBSで試料をブロックする。
H.第一の一次抗体コネキシン−43を10%ヤギ血清を含有するPBS中で、1:100に希釈する。試料を被覆するのに十分な抗体(約150μl)を希釈し、組織切片に添加して、湿潤化したチャンバ中で室温で1時間、インキュベートする。
【0165】
I.10%ヤギ血清/PBS中で試料を3回洗浄する(5分/洗浄)。
J.第二の一次抗体My−32を10%ヤギ血清を含有するPBS中で、1:200に希釈する。試料を被覆するのに十分な抗体(約150μl)を希釈し、組織切片に添加して、湿潤化したチャンバ中で室温で1時間、インキュベートする。
【0166】
K.10%ヤギ血清/PBS中で試料を3回洗浄する(5分/洗浄)。
L.二次抗体を希釈し、抗体溶液を混合して、組織切片に添加する。
抗ウサギIgG(全分子)−TRITC、PBS中1:50。
【0167】
抗マウスIgG−FITC、PBS中1:100。
M.湿潤化した暗チャンバ中で室温で45分間、インキュベートする。
N.PBS中で試料を3回洗浄する(5分/洗浄)。
【0168】
O.取付培地およびカバーグラスを添加する。
P.FITCフィルター、TRITCフィルターおよびUV光源を用いて、顕微鏡で読み取る。
【0169】
Q.暗チャンバ中に≦4℃で試料を保存する。
本明細書中に列挙した特許、特許出願および出版物の完全な開示内容は、各々が個別に参照により援用されたように、参照により本明細書中に援用される。上記の実施例および開示内容は、例示的であって、網羅的でないことが意図される。これらの実施例および説明は、当業者に多数の変更および代替物を示唆するであろう。これらの代替物および変更はすべて、併記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。当業者は、本明細書中に記載した特定の実施形態に対するその他の等価物を認識し得るが、それらの等価物も併記の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明による移植可能なシステムの図解である。
【図2】 好ましい電気刺激装置が心室収縮中に提供する一連のパルスの図解である。
【図3】 本発明の方法により用いられ得る移植可能パルス発生器(IPG)の種々の構成成分を示すブロック図である。
Claims (2)
- (a)損傷または疾患心筋組織中および/または付近に新規収縮組織を形成することができる、2つの電極を有する筋肉刺激体である担体上に被覆されるかまたは担体中に組み込まれる細胞再増殖源と、
(b)損傷または疾患心筋組織中および/または付近の前記新規収縮組織を電気的に刺激するための2つの電極を有する筋肉刺激体と、
を含む移植可能なシステム。 - 前記筋肉刺激体は、移植可能であり、その中に組み込まれた電極を有するカプセルの形態である請求項1記載の移植可能なシステム。
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