ES2270880T3 - Sistema de reparacion del infarto de miocardio. - Google Patents

Abstract

Un sistema implantable que comprende: a) una fuente de repoblación celular aislada capaz de formar nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado; y b) un dispositivo de estimulación eléctrica para estimular eléctricamente el nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado, en el que la fuente de repoblación celular está recubierta sobre o incorporada en un vehículo, siendo dicho vehículo el dispositivo de estimulación eléctrica.

Description

Método y sistema para reparar el infarto de miocardio.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas implantables para invertir el daño del músculo cardiaco después de un infarto de miocardio, y más en general en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado. Específicamente, esto implica la repoblación del miocardio dañado o lesionado con células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas, que adicionalmente se pueden formar in situ mediante el uso de técnicas de ingeniería genética, y el aumento con estimulación eléctrica.

Antecedentes de la invención

La Enfermedad Arterial Coronaria (CAD) afecta anualmente a 1,5 millones de personas en los Estados Unidos. Aproximadamente el 10% de estos pacientes muere en el primer año y aproximadamente 900.000 sufren infarto de miocardio agudo. Durante la CAD, la formación de placas bajo el tejido endotelial estrecha la luz de la arteria coronaria y aumenta su resistencia al flujo sanguíneo, reduciendo de este modo el suministro de O_{2}. La lesión del miocardio (es decir, la capa media y la más gruesa de la pared cardiaca, compuesta por músculo cardiaco) alimentado por la arteria coronaria comienza a ser irreversible en 0,5-1,5 horas y es completa después de 6-12 horas, provocando una afección denominada infarto de miocardio agudo (AMI) o simplemente infarto de miocardio (MI).

El infarto de miocardio es un estado de necrosis irreversible del músculo cardiaco provocado por isquemia prolongada. Las regiones dañadas o lesionadas del miocardio se infiltran con células emigrantes no contráctiles y finalmente se remplazan por tejido cicatricial. Esta cicatriz fibrosa no contribuye significativamente a la contracción del corazón y puede, de hecho, crear anormalidades eléctricas.

Los que sobreviven al AMI tienen un riesgo 4-6 veces mayor de desarrollar un fallo cardiaco. Los tratamientos actuales y propuestos para los que sobreviven a un AMI se centran en planteamientos farmacológicos y en intervenciones quirúrgicas. Por ejemplo, la angioplastia, con y sin endoprótesis, es una técnica bien conocida para reducir la estenosis. La mayoría de los tratamientos se diseñan para lograr la reperfusión y minimizar el daño ventricular. Sin embargo, ninguna de las terapias actuales o propuestas abordan la necrosis miocárdica (es decir, degradación y muerte de la células del músculo cardiaco). Debido a que las células cardiacas no se dividen para repoblar la región dañada o lesionada, esta región se rellenará con tejido conectivo producido por fibroblastos invasores. Los fibroblastos producen componentes de matriz extracelular, de los que el colágeno es el más abundante. Ni los fibroblastos por sí mismos ni el tejido conectivo que forman son contráctiles. Por tanto, la investigación en cardiomioplastia molecular y celular ha evolucionado para abordar directamente la necrosis miocárdica.

La cardiomioplastia celular implica el transplante de células, en lugar de órganos, dentro del miocardio dañado o lesionado con el objetivo de restablecer su función contráctil. La investigación en el área de la cardiomioplastia celular se revisa en Cellular Cardiomyoplasty: Myocardial Repair with Cell Implantation, ed. Kao and Chiu, Landes Bioscience (1997), en particular los Capítulos 5 y 8. Por ejemplo, Koh et al., J. Clinical Invest., 96, 2034-2042 (1995), injertaron células de una línea celular de tumor cardiaco AT-1 en cánidos, pero encontraron un crecimiento incontrolado. Robinson et al., Cell Transplantation, 5, 77-91 (1996), injertaron células de la línea celular de músculo esquelético C_{2}C_{12} a ventrículos de ratón. Aunque estos planteamientos produjeron estudios de investigación fascinantes, las células de líneas celulares establecidas típicamente el receptor humano las rechaza. Li et al., Annals of Thoracic Surgery, 62, 654-661 (1996), suministraron cardiomiocitos fetales a corazones de ratones adultos. Encontraron presiones sistólicas mejoradas y observaron que la presencia de estas células evitaba la remodelación después del infarto. Aunque sus resultados mostraron la eficacia de la tecnología de células transplantadas, este planteamiento probablemente no sería eficaz en medicina clínica ya que el tejido cardiaco fetal singneico no estaría disponible para pacientes humanos. Chiu et al., Ann. Thorac. Surg., 60, 12-18 (1995) realizaron una inyección directa de mioblastos esqueléticos cultivados a ventrículos caninos y descubrieron que se podía observarse tejido muscular bien desarrollado. Este método, sin embargo, es altamente invasivo, lo que compromete su viabilidad en pacientes MI humanos.

La cardiomioplastia molecular se ha desarrollado porque los fibroblastos se pueden manipular genéticamente. Esto es porque los fibroblastos, que no están totalmente diferenciados, surgen del mismo tipo celular embrionario como el músculo esquelético, su fenotipo se puede modificar, y posiblemente convertirse en células satélite de músculo esquelético. Esto se puede hacer activando los miembros de una familia de genes (genes de determinación miogénica o "MDGS") específicos para músculo esquelético. Se puede suministrar un adenovirus modificado por ingeniería genética que lleve el gen de la miogenina, a la zona MI por inyección directa. El virus atraviesa la membrana celular y usa la maquinaria propia de la célula para producir la proteína miogenina. La introducción de la proteína miogenina en una célula activa la expresión del gen de la miogenina, que es un gen de músculo esquelético, y que, a su vez, activa los demás miembros de MDGS y puede transformar el fibroblasto en un mioblasto esquelético. Para conseguir esta cascada de genes en un fibroblasto, se puede usar un adenovirus que lleve el gen de la miogenina y que sea deficiente en la replicación para suministrar el gen exógeno al interior de las células hospedadoras. Una vez que el virus infecta el fibroblasto, la proteína miogenina producida por los genes víricos activa los genes endógenos, comenzando el efecto de cascada, y convirtiendo el fibroblasto en un mioblasto. Sin una envuelta nuclear, el virus se degrada, pero los genes propios de la célula mantienen el fenotipo celular como una célula de músculo esquelético.

Este concepto se ha desarrollado bien in vitro. Por ejemplo, Tam et al., J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 918-924 (1995) usaron retrovirus que expresaban MyoD in vitro para la conversión de fibroblasto en mioblasto. Sin embargo, no se ha demostrado su viabilidad in vivo. Por ejemplo, Klug et al., J. Amer. Physiol. Society, 1913-1921 (1995), usaron SV40 in vivo y tuvieron éxito replicando el núcleo y el ADN, pero no los cardiomiocitos en sí mismos. Además, Leor et al., J. Molecular and Cellular Cardiology, 28, 2057-2067 (1996), informaron de la generación in situ de nuevo tejido contráctil usando técnicas de suministro de genes.

El uso de marcapasos para corregir o aumentar la función del corazón está bien establecido en las técnicas médicas, incluyendo su uso en rutinas más especializadas de retención de tejido de músculo esquelético injertado. El documento EP0487429A1 y el documento US5306293 describen un dispositivo para controlar los parámetros cardiacos para prevenir la taquicardia. En la descripción se incluye en análisis del uso de dichos marcapasos en el control activo y permanente de los corazones tratados o reparados con tejido injertado de tejido de músculo esquelético. De forma similar, el documento US5632716A describe un aparato de entrenamiento de músculo para entrenar o aumentar de otra manera el músculo cardiaco, incluyendo el entrenamiento de los injertos de músculo esquelético que rodean al tejido cardiaco. El documento EP054733 además describe principalmente un marcapasos antiarrítmico para estimular los injertos de músculo cardiaco y esquelético del paciente para aumentar el rendimiento del corazón. El dispositivo descrito detecta y clasifica estados anormales del corazón y usa el estimulador para enviar series de pulsos a electrodos en contacto con el músculo. Para apoyar el procedimiento para usar injertos de tejido de músculo esquelético en el corazón, el documento US4791911 describe un método de cirugía cardiaca reconstructiva que implica el diseccionar algún colgajo de tejido muscular para pasar al tórax usado en un procedimiento de injerto.

Se han suministrado diversos agentes extraños al corazón para aumentar el rendimiento o tratar una enfermedad. Por ejemplo, el documento EP0547733 describe la expresión de productos génicos en tejido muscular cardiaco y vascular suministrando vectores de adenovirus recombinantes para su uso en terapia genética, incluyendo la distrofia muscular o la isquemia miocárdica. Algunas descripciones, tales como el documento WO9421237A, describen un sistema para controlar ritmos cardiacos comprendiendo un dispositivo de marcapasos implantable y un dispositivo para la liberación controlada de agentes antiarrítmicos.

Se conocen bien en la técnica otras descripciones de la construcción y diseño de marcapasos específicos. Por ejemplo, el documento EP 0627237A describe un marcapasos para estimular tejido epicárdico y miocárdico con una cubierta libre de suturas. La cubierta alberga el generador de impulsos que está conectado a un extremo del electrodo que forma parte de la superficie externa de la cubierta. El extremo del electrodo está en contacto directamente con el epicardio. De forma similar, el documento US4256115 describe un marcapasos cardiaco que funciona con una batería sin cables y que está acoplado en un pequeño disco unido directamente al músculo cardiaco.

Por tanto, hay una necesidad de un sistema y método eficaces para un suministro menos invasivo de una fuente de agentes repobladores, tales como células o vectores, al lugar de la zona de infarto del miocardio y más generalmente en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado.

La siguiente lista de documentos patentados y no patentados describe información antecedente.

TABLA 1a Patentes

1

2

TABLA 1b Documentos de patentes extranjeras

3

TABLA 1c Documentos no patentados

4

5

6

Sumario de la invención

La presente invención también proporciona sistemas implantables que invierten el daño del músculo cardiaco necrótico después de un infarto de miocardio o en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado. Específicamente, esto implica el combinar un sistema para suministrar una fuente de un agente repoblador con un mecanismo de estimulación. Más específicamente, esto implica la repoblación del miocardio dañado o lesionado con células contráctiles indiferenciadas y diferenciadas y el aumento del tejido recién formado con estimulación eléctrica para provocar que el tejido recién formado se contraiga de forma sincrónica con el corazón para mejorar la función cardiaca.

La invención proporciona un sistema implantable que comprende:

a) una fuente de repoblación de células aisladas capaz de formar nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado; y

b) un dispositivo de estimulación eléctrica para estimular eléctricamente el nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado, donde la fuente de repoblación celular está recubriendo o está incorporada en un vehículo, siendo dicho vehículo el dispositivo de estimulación eléctrica.

El sistema que incorpora la fuente de repoblación celular se puede implantar en el miocardio de un paciente, preferiblemente donde el miocardio está dañado o lesionado, tal como después de un infarto de miocardio. La fuente de repoblación se puede suministrar directamente al tejido miocárdico, tal como en un área de tejido infartado, mediante un catéter o de forma más manual con una jeringa.

La fuente de repoblación celular puede comprender células contráctiles indiferenciadas, tales como las células satélite de músculo esquelético, mioblastos, células madre o mesenquimáticas y similares, o células cardiacas o esqueléticas diferenciadas, tales como cardiomiocitos, miotubos y células de fibra muscular y similares. Las células implantadas pueden ser células de musculares autólogas, células musculares alogénicas o células musculares xenogénicas.

La fuente de repoblación celular puede comprender material genético opcionalmente contenido en un vehículo de suministro, donde el vehículo de suministro puede comprender una molécula de ácido nucleico, tal como un ADN plasmídico. Además, el ADN plasmídico puede opcionalmente contener al menos un gen. La molécula de ácido nucleico puede codificar un gen tal como el gen de determinación miogénica. El vehículo de suministro se puede suministrar en liposomas o por cualquier fuente adecuada.

La fuente de repoblación celular puede comprender adicionalmente una matriz polimérica, que puede además comprender un vehículo o se puede revestir la fuente de repoblación celular sobre un vehículo.

El dispositivo de estimulación eléctrica puede comprender un estimulador muscular; que opcionalmente tiene dos electrodos conectados en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado, y que es el vehículo para la fuente de repoblación celular. En una modalidad, el dispositivo de estimulación eléctrica puede proporcionar estimulación en ráfagas o estimulación en pulsos, o combinaciones de las mismas.

La repoblación del miocardio dañado o lesionado con células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas se puede realizar usando un planteamiento celular o molecular. Los planteamientos celulares implican la inyección, directamente o mediante infusión coronaria, por ejemplo, de células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas, preferiblemente células esqueléticas autólogas cultivadas, en la zona de infarto (es decir, la región dañada o lesionada del miocardio). Los planteamientos moleculares implican la inyección, directamente o mediante infusión coronaria, por ejemplo, de ácido nucleico, esté en forma de ADN desnudo, plasmídico, opcionalmente incorporado a liposomas u otros vehículos de suministro similares, o de un vector modificado por ingeniería genética en la zona de infarto para convertir fibroblastos, por ejemplo, que invaden la zona de infarto, en mioblastos. El vector modificado por ingeniería genética puede incluir un vector de expresión viral tal como un retrovirus, adenovirus, o un vector viral adenoasociado,
por ejemplo.

Diversas realizaciones de la presente invención proporcionan una o más de las siguientes ventajas: restauración de la elasticidad y contractilidad del tejido; función aumentada del ventrículo izquierdo; reducción de la cantidad de remodelación (es decir, la conversión del tejido elástico y contráctil en tejido inelástico y no contráctil); y morbilidad y mortalidad disminuidas.

En una realización, la presente invención proporciona un sistema implantable que incluye las características de la reivindicación 1 y que comprende en particular: una fuente de repoblación celular que comprende material genético, células contráctiles indiferenciadas, células contráctiles diferenciadas, o una combinación de las mismas capaz de formar nuevo tejido contráctil en y/o cerca de una zona de infarto del miocardio de un paciente y más generalmente en y/o cerca de tejido miocárdico dañado o lesionado; y un dispositivo de estimulación eléctrica para estimular eléctricamente el nuevo tejido contráctil en y/o cerca de la zona de infarto del miocardio del paciente. Un especialista en la técnica puede determinar una zona de infarto de un miocardio o un tejido miocárdico dañado o lesionado. Cerca de la zona infartada o del tejido miocárdico dañado o lesionado significa lo suficientemente cerca para que se haya producido ese daño al músculo cardiaco necrótico. Típicamente, esto significa dentro de aproximadamente 1 centímetro (cm) del margen de la zona de infarto o del área del tejido dañado o lesionado.

En otra realización, la presente invención proporciona un sistema implantable que incluye las características de la reivindicación 1 y que comprende en particular: una fuente de repoblación celular que comprende un tipo celular adecuado, tal como células satélite de músculo esquelético, capaces de formar tejido contráctil nuevo en y/o cerca de una zona de infarto o un área de tejido miocárdico dañado o lesionado del miocardio de un paciente; y un dispositivo de estimulación eléctrica para estimular eléctricamente el nuevo tejido contráctil en y/o cerca de la zona de infarto del miocardio del paciente, donde el dispositivo de estimulación eléctrica proporciona estimulación en ráfagas.

Ahora se describirán realizaciones preferidas sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos.

La Figura 1 es una ilustración de un sistema implantable de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 es una ilustración de una serie de pulsos que un dispositivo de estimulación eléctrica proporciona durante las contracciones ventriculares.

La Figura 3 es un de un diagrama de bloques que ilustra diversos componentes de un generador de pulsos implantable (IPG) que puede usarse en la presente invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención comprende un sistema que incorpora una fuente de repoblación celular capaz de formar tejido contráctil nuevo en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado. El sistema que incorpora la fuente de repoblación celular se puede implantar en el miocardio de un paciente, preferiblemente donde se ha dañado o lesionado el miocardio, tal como después de un infarto de miocardio. La fuente de repoblación celular se puede suministrar directamente al tejido miocárdico, tal como en un área de tejido infartado, mediante un catéter o de manera más manual mediante una jeringa.

La fuente de repoblación celular puede comprender células contráctiles indiferenciadas y diferenciadas, tal como células satélite de músculo esquelético, mioblastos, células madre o mesenquimáticas. Las células implantadas pueden ser células musculares autólogas, células musculares alogénicas o células musculares xenogénicas.

La fuente de repoblación celular puede comprender material genético opcionalmente contenido en un vehículo de suministro donde el vehículo de suministro puede comprender una molécula de ácido nucleico, tal como ADN plasmídico. Además, el ADN plasmídico puede contener opcionalmente al menos un gen. La molécula de ácido nucleico puede codificar un gen como el gen de determinación miogénica. El vehículo de suministro se puede suministrar en liposomas o cualquier otra fuente adecuada.

La fuente de repoblación celular puede comprender adicionalmente una matriz polimérica, que además puede comprender un vehículo, o la fuente de repoblación celular se puede recubrir sobre un vehículo.

El dispositivo de estimulación eléctrica puede comprender un estimulador muscular; que opcionalmente tiene dos electrodos conectados en y/o cerca al tejido miocárdico dañado o lesionado y que es el vehículo para la fuente de repoblación celular. En una modalidad, el dispositivo de estimulación eléctrica puede proporcionar estimulación en ráfagas o estimulación por pulsos, o combinaciones de los mismos.

La presente invención también proporciona sistemas implantables que invierten el daño al músculo cardiaco necrótico después de un infarto de miocardio repoblando el miocardio dañado o lesionado con células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas. Esta repoblación se aumenta con estimulación eléctrica para asegurar la sincronización de la contracción del tejido recién infundido con la contracción cardiaca.

La repoblación del miocardio dañado o lesionado con células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas se puede realizar usando una diversidad de planteamientos celulares o moleculares. Típicamente, se puede usar cualquiera de una diversidad de técnicas en las que células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas repueblan la zona de infarto del miocardio. En una aplicación específica, puede implicar suministrar células contráctiles indiferenciadas a la zona de infarto o transformar células y hacer crecer células contráctiles indiferenciadas in situ, por ejemplo.

Los planteamientos celulares implican la inyección, directamente o mediante infusión coronaria, por ejemplo, de células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas, preferiblemente mioblastos cultivados (es decir, células musculares), y más preferiblemente, mioblastos esqueléticos o cardiacos, a la zona de infarto (es decir, la región dañada o lesionada del miocardio) del corazón. Preferiblemente, las células son autólogas para reducir y/o eliminar la respuesta inmune y el rechazo del tejido. Típicamente, después de la inyección, los mioblastos esqueléticos se diferencian en fibras musculares cardiacas.

Los planteamientos moleculares implican la inyección, directamente o mediante infusión coronaria, por ejemplo, de ácido nucleico, esté en forma de ADN desnudo, plasmídico, opcionalmente incorporado en liposomas o vehículos similares, o de un vector modificado por ingeniería genética, a la zona de infarto, para convertir células blastulares, indiferenciadas (por ejemplo, fibroblastos o células madre) que invaden la zona de infarto, en mioblastos El vector puede ser un vector viral, preferiblemente, un vector adenoviral, que exprese miogenina o MyoD, por ejemplo, que son miembros de la familia de genes musculares cuyos productos génicos inducen la conversión fenotípica de fibroblastos en mioblastos.

Estas regiones de células repobladas proporcionan una función cardiaca diastólica mejorada. Es significativo observar que el aumento de las regiones repobladas con estimulación eléctrica proporciona una función mejorada tanto sistólica como diastólica. Como resultado, la presente invención proporciona sistemas que incluyen una fuente de repoblación celular (es decir, un agente de repoblación celular) y un dispositivo de estimulación eléctrica (es decir, una fuente de estimulación). La fuente de repoblación celular puede incluir células contráctiles indiferenciadas tales como células musculares autólogas, o ácido nucleico para la conversión de fibroblastos, por ejemplo, en mioblastos. La fuente de repoblación celular puede incluir células diferenciadas cardiacas o esqueléticas, tales como los cardiomiocitos, miotubos y células de fibras musculares y similares. La fuente de repoblación celular se puede suministrar por inyección directa en el miocardio o a través de la vasculatura coronaria. La repoblación celular se puede realizar usando una jeringa, o como alternativa, se puede usar un dispositivo de suministro tal como un catéter. Las células o el material genético se pueden suministrar simultáneamente con el dispositivo de estimulación eléctrica. El dispositivo de estimulación eléctrica es el vehículo de las células o del material genético. El dispositivo de estimulación eléctrica típicamente incluye un estimulador muscular y electrodos implantables. Es significativo observar que no incluye cables que lo conecten con cualquier otro dispositivo.

La fuente de repoblación celular (es decir, agente de repoblación celular) puede incluir medicamentos, productos químicos potenciadores, proteínas y similares, para estimular la angiogénesis local, la contractilidad celular, el crecimiento celular, y la migración, por ejemplo. Estos pueden incluir, por ejemplo, FGFa (factor de crecimiento de fibroblastos ácido), VEGF (factores de crecimiento del endotelio vascular), tPA (activador de plasminógeno tisular), BARK (quinasa de receptor \beta-adrenérgico), \beta-bloqueantes, etc. También se pueden incorporar heparina u otros anticoagulantes tales como óxido de polietileno, hirudina, y activador de plasminógeno tisular a la fuente de repoblación celular antes del implante en una cantidad eficaz para prevenir o limitar la trombosis.

En referencia a la Figura 1, un sistema implantable de la presente invención incluye un dispositivo de suministro 10 que comprende un vehículo 22 para células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas, y puede incluir separada o adicionalmente material genético (es decir, ácido nucleico en una diversidad de formas) o células contráctiles diferenciadas, que están en forma de una cápsula de un estimulador eléctrico. Si se desea, se pueden diseñar otros vehículos dependiendo de si se usa la inyección directa o infusión coronaria. Como se muestra en la Figura 1, el vehículo 22 se suministra a una zona de infarto del miocardio del paciente usando un catéter 19. En la Figura 1, la fuente de repoblación celular es un vector 14 de conversión de fibroblastos en mioblastos. La fuente de repoblación celular (es decir, el agente de repoblación celular) típicamente se libera desde el vehículo 22 por difusión pasiva a la zona de infarto 16 del miocardio 18 del corazón de un paciente.

Células contráctiles indiferenciadas y diferenciadas

Las células adecuadas para el implante en la presente invención incluyen una amplia diversidad de células contráctiles indiferenciadas. Típicamente, éstas se diferencian para formar células musculares, sin embargo, pueden ser fibroblastos que se han convertido en mioblastos ex vivo, o cualquiera de una amplia diversidad de células inmunológicamente neutras que se han programado para actuar como células contráctiles indiferenciadas. Las células adecuadas para su uso en la presente invención típicamente incluyen células umbilicales, células satélite de músculo esquelético.

Las células adecuadas para el implante también incluyen células cardiacas o esqueléticas diferenciadas, tales como cardiomiocitos, miotubos y células de fibra muscular y similares, sean autólogas, alogénicas o xenogénicas, modificadas o no por ingeniería genética. También se pueden usar mezclas de estas células. Las células autólogas son particularmente deseables. Las células son capaces de repoblar la zona de infarto del miocardio o capaces de establecer tejido sano en las áreas miocárdicas dañadas o lesionadas.

Las células satélite de músculo esquelético son particularmente adecuadas para su uso en la presente invención porque se pueden diferenciar en células musculares que son capaces de contraerse en respuesta a estimulación eléctrica. También son particularmente adecuadas para su uso en la presente invención porque se pueden obtener de cultivos celulares obtenidos de las muestras de biopsia del mismo paciente. Las muestras de biopsia contienen fibras esqueléticas maduras junto con células de reserva que rodean a las fibras maduras. Una vez puestas en cultivo, las células de reserva proliferan y su número aumenta rápidamente. Estas células recién cultivadas se pueden reinyectar de nuevo en el corazón en y/o cerca de la zona de infarto. Una vez en el músculo cardiaco, los mioblastos esqueléticos se fusionan para formar miotubos multinucleados con características contráctiles.

Aunque las células musculares esqueléticas son capaces de contraerse, son diferentes de las células cardiacas. Las características mecánicas y eléctricas del músculo esquelético son bastante diferentes a las del músculo cardiaco. Las células satélite de músculo esquelético se contraen y se relajan mecánicamente de forma muy rápida. Por lo tanto, para generar contracciones sostenidas, las células esqueléticas se someten a pulsos bastante rápidamente, pero esto provoca una leve privación de reservas de energía y el desarrollo de fatiga muscular. Sin embargo, el músculo esquelético puede acondicionarse para contraerse a ritmos similar o junto con el músculo cardiaco.

Las células esqueléticas también difieren de las células cardiacas en sus características eléctricas. Cada fibra de músculo esquelético se estimula por acetilcolina liberada por la neurona motora que inerva al músculo. Sin embargo, las células cardiacas están interconectadas mediante discos intercalados que contienen canales para el paso de iones entre el citoplasma de las células. Este tipo de interconexión eléctrica no existe entre las células satélite de músculo esquelético. El uso de estimulación eléctrica evita este problema y condiciona a las células para contraerse a ritmos similares o junto con el músculo cardiaco.

Sin embargo, cualquier tipo celular diferenciado o indiferenciado que se implante en el miocardio podría beneficiar teniendo estimulación eléctrica para coordinar las contracciones en sincronía con los ritmos contráctiles fisiológicos normales.

Las células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas se pueden suministrar en combinación con un vehículo de suministro, tales como liposomas o una matriz polimérica, como se describe a continuación con mayor detalle.

Una vez que las células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas han formado tejido contráctil, su función puede mejorarse adicionalmente alterándolas metabólicamente, por ejemplo, inhibiendo la formación de miostatina. Esto aumenta el número de fibras musculares.

Material Genético

Se puede usar ácido nucleico en vez de, o además de las células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas. El ácido nucleico puede estar en forma de ADN desnudo, plasmídico, que puede o no incorporarse en liposomas u otros vehículos similares, o de vectores que incorporen el ADN deseado. El ácido nucleico es capaz de convertir células no contráctiles en y/o cerca de la zona de infarto o de tejido dañado o lesionado del miocardio de un paciente en células que se contraen (es decir, contráctiles). Si se desea, sin embargo, se pueden convertir células contráctiles no indiferenciadas en células contráctiles indiferenciadas usando técnicas de ingeniería genética ex vivo y después suministrarse a la zona de infarto.

Hay una amplia diversidad de métodos que pueden usarse para suministrar ácido nucleico a células contráctiles no indiferenciadas o diferenciadas. Por ejemplo, las células fibroblastos, pueden convertir su fenotipo de conectivo a contráctil. Dichos métodos son bien conocidos por los especialistas en la técnica de ingeniería genética. Por ejemplo, el ácido nucleico deseado se puede insertar en un vehículo de suministro apropiado, tal como, por ejemplo, un plásmido de expresión, un cósmido, un vector YAC y similares, para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. Hay varios virus, vivos o inactivos, incluyendo virus recombinantes, que también se pueden usar. Un retrovirus se puede modificar por ingeniería genética para que suministre cualquiera de una diversidad de genes. Los adenovirus también se pueden usar para suministrar ácido nucleico capaz de convertir células contráctiles no indiferenciadas en células contráctiles indiferenciadas, preferiblemente células musculares. Una "molécula de ácido nucleico recombinante" como la usada en este documento, está compuesta por una secuencia aislada de nucleótidos insertada en un vehículo de suministro. Los elementos reguladores, tales como el promotor y la señal de poliadenilación, se unen de forma operativa a la secuencia de nucleótidos según se desee.

Las moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de ácido nucleico recombinante, se pueden preparar sintéticamente o, preferiblemente, a partir de moléculas de ácido nucleico aislado, como se describe a continuación. Un ácido nucleico está "aislado" cuando se purifica de otros constituyentes celulares, tales como, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica. La región codificante de la molécula de ácido nucleico puede codificar un producto génico de longitud completa o un fragmento del mismo, o una secuencia nueva mutada o de fusión. La secuencia codificante puede ser una secuencia endógena para la célula diana, o exógena para la célula diana. El promotor, con el que está asociada de forma operativa la secuencia codificante, puede o puede no ser una que esté normalmente asociada con la secuencia codificante.

Puede usarse casi cualquier vehículo de suministro para introducir los ácidos nucleicos en el sistema cardiovascular, incluyendo, por ejemplo, vectores recombinantes, tales como los basados en el serotipo 5 de adenovirus, Ad5, como se expone en French et al., Circulation, 90, 2414-2424 (1994). Un protocolo adicional para la transferencia de genes mediada por adenovirus a células cardiacas se expone en el documento WO 94/11506, Johns, J. Clin. Invest., 96, 1152-1158 (1995), y en Barr, et al., Gene Ther., 1, 51-58 (1994). Otros vectores recombinantes incluyen, por ejemplo, vectores de ADN plasmídico, tales como los derivados de pGEM3 o pBR322, como se expone en Acsadi, et al., The New Biol., 3, 71-81, (1991), y Gal, et al., Lab. Invest., 68, 18-25 (1993), liposomas que contienen ADNc, virus artificiales, nanopartículas, y similares.

Los elementos reguladores de las moléculas de ácido nucleico recombinantes son capaces de dirigir la expresión en células de mamífero, específicamente en células humanas. Los elementos reguladores incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, otros elementos, tales como una región Kozak, también se pueden incluir en la molécula de ácido nucleico recombinante. Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para la práctica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación LTR. En particular, puede usarse la señal de poliadenilación de SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), mencionado como la señal de poliadenilación de SV40.

Los promotores útiles para construir las moléculas de ácido nucleico recombinante pueden ser constitutivos o inducibles. Un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones de crecimiento celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores de los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, \beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, y otros. Además, muchos promotores virales funcionan constitutivamente en células eucariotas, e incluyen, pero sin limitación, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor del Virus del Tumor Mamario del Ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Maloney, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), el promotor temprano inmediato de Citomegalovirus (CMV), el Virus de Epstein-Barr (EBV), Virus del Sarcoma de Rous (RSV), y otros retrovirus, y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Los especialistas en la técnica conocen otros promotores.

Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de la metalotioneína se induce para promover (aumentar) la transcripción en presencia de ciertos iones metálicos. Los especialistas en la técnica conocen otros promotores inducibles.

Los promotores y las señales de poliadenilación usados son preferiblemente funcionales en las células del paciente. Para maximizar la producción de proteínas, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que son adecuadas para la expresión génica en las células cardiacas a las que se administra la molécula de ácido nucleico recombinante. Por ejemplo, el promotor es preferiblemente un promotor-potenciador específico de tejido cardiaco, tal como, por ejemplo, el promotor de la isoforma cardiaca de la troponina (cTNC). Parmacek, et al., J. Biol. Chem., 265, 15970-15976 (1990), y Parmacek, y col., Mol. Cell Biol., 12, 1967-1976 (1992). Además, se pueden seleccionar los codones que se transcriben en la célula de forma más eficaz. Los especialistas en la técnica pueden producir moléculas de ácido nucleico recombinante que sean funcionales en las células cardiacas.

El material genético puede introducirse en una célula o "ponerse en contacto" a través de una célula mediante, por ejemplo, procedimientos de transfección o de transducción. La transfección se refiere a la adquisición de material genético nuevo por una célula mediante la incorporación de moléculas de ácido nucleico añadidas. La transfección puede suceder mediante métodos físicos o químicos. Muchas técnicas de transfección son conocidas para los especialistas en la técnica incluyendo: co-precipitación de ADN y fosfato cálcico; transfección de ADN con DEAE-dextrano; electroporación; adsorción de plásmido desnudo, y transfección mediada por liposomas catiónicos. La transducción se refiere al proceso de transferir ácido nucleico a una célula usando un virus de ADN o ARN. Vectores virales adecuados para su uso como agentes transductores incluyen, pero sin limitación, vectores retrovirales, vectores virales adenoasociados, virus vaccinia, y vectores del virus Semliki Forest.

El tratamiento de las células, o el contacto de las células, con moléculas de ácido nucleico recombinante puede tener lugar in vivo o ex vivo. Para tratamientos ex vivo, las células se aíslan de un animal (preferiblemente un ser humano), se transforman (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vehículo de suministro que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de canal iónico, y luego se administran a un destinatario.

En un tratamiento in vivo preferido, las células de un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano, se transforman in vivo con una molécula de ácido nucleico recombinante. El tratamiento in vivo incluye típicamente un tratamiento interno local con una molécula de ácido nucleico recombinante. Cuando se realiza la administración in vivo de la molécula de ácido nucleico recombinante, los vehículos de suministro preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que genes no esenciales o que tiene complementarios se han remplazado por la secuencia de ácido nucleico de interés. Estos virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida incluye la transcripción inversa de ARN genómico viral a ADN con la posterior integración proviral en el ADN de la célula hospedadora. Los más útiles son los retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Estos vectores de expresión retroviral genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Los protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de empaquetamiento con un plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de empaquetamiento, recogida de las partículas virales del medio de cultivo tisular, e infección de las células diana con partículas virales) son bien conocidos para los especialistas en la técnica.

Un virus preferido para poner en contacto las células en algunas aplicaciones, tales como las aplicaciones in vivo, es el virus adenoasociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adenoasociado se puede modificar por ingeniería para que sea deficiente en la replicación y sea capaz de infectar un amplio rango de tipos y especies celulares. Además tiene ventajas tales como estabilidad con calor y disolventes lipídicos, alta frecuencia de transducción en células de diversas líneas, incluyendo células hematopoyéticas, y la ausencia de inhibición de superinfección que permite múltiples series de transducción.

Los ejemplos de ácidos nucleicos que funcionarían como ácido nucleico para la incorporación en células incluyen, pero sin limitación, ácido nucleico que codifica una proteína miogénica o proteína MyoD. El ácido nucleico puede incluir un gen entero o una parte de un gen. Los ejemplos de genes incluyen, pero sin limitación, las formas activas del gen de miogenina o el gen de MyoD.

La secuencia génica del ácido nucleico suministrado por el vehículo de suministro (preferiblemente, virus), que incluye un ácido nucleico que codifica proteínas, polipéptidos o péptidos está disponible de una diversidad de fuentes incluyendo GenBank (Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico), bases de datos EMBL (Heidelberg, Alemania), y la University of Wisconsin Biotechnology Center, (Madison, WI), revistas publicadas, patentes y publicaciones de patente. Todas estas fuentes son recursos fácilmente accesibles para los especialistas en la técnica. La secuencia génica se puede obtener de células que contienen el fragmento de ácido nucleico (generalmente, ADN) cuando se conoce una secuencia génica. El ácido nucleico se puede obtener por digestión con endonucleasa de restricción y aislamiento de un fragmento génico, o por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando oligonucleótidos como cebadores para amplificar copias de ADNc de ARNm de células que expresan el gen de interés o para amplificar las copias de ADNc de un gen a partir de bibliotecas de expresión génica que están disponibles en el mercado. Se pueden preparar oligonucleótidos o fragmentos de ADN más cortos por técnicas de síntesis de ácido nucleico conocidas y de proveedores comerciales de oligonucleótidos personalizados tales como Amitof Biotech Inc. (Boston, MA), o similares. Los especialistas en la técnica reconocerán que está disponible una diversidad de kits comerciales para obtener ADNc de ARNm (incluyendo, pero sin limitación Stratagene, La Jolla, CA e Invitrogen, San Diego, CA). De forma similar, hay una variedad de bibliotecas de expresión génica comerciales disponibles para los especialistas en la técnica incluyendo bibliotecas disponibles en Stratagene, y similares. Están disponibles métodos generales para la clonación, reacción en cadena de la polimerasa y ensamblaje de vectores en Sambrook et al. eds. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) e Innis, et al. eds. (PCR Strategies, 1995, Academic Press, New York, New York).

Dependiendo del tamaño máximo del genoma que puede alojar un genoma viral o que se puede asociar con una partícula viral, el virus que suministra ácido nucleico a la célula puede incluir un ácido nucleico que codifica una o más proteínas, polipéptidos o péptidos. Los oligonucleótidos se pueden suministrar mediante un virus a través de la incorporación de oligonucleótidos dentro de los virus o asociados a la superficie externa del virus usando métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica.

Vehículos y medios de suministro

Además de los vehículos de suministro de vector viral, el agente de repoblación celular, sea material genético o células contráctiles indiferenciadas, puede incluir liposomas o una matriz polimérica. Estos se pueden recubrir o incorporarse de otro modo sobre un vehículo, que es el dispositivo de estimulación eléctrica.

Las células y/o el material genético se pueden suministrar en liposomas, que son partículas esféricas en un medio acuoso, formadas por una bicapa lipídica que encierra un compartimiento acuoso. Los liposomas para el suministro de material genético, por ejemplo, están disponibles en el mercado en Clontech Laboratories UK Ltd., Basingstoke, Hampshire, Reino Unido.

Las células y/o el material genético se pueden suministrar en una matriz polimérica que los encapsula. La matriz polimérica de esta invención se puede preparar a partir de un homopolímero, un copolímero (es decir, un polímero de dos o más monómeros diferentes), o una composición (es decir, una mezcla) que comprende fibrina, por ejemplo, con uno o más polímeros o copolímeros, por ejemplo. La composición forma preferiblemente un polímero viscoelástico, resistente al desgarro, biocompatible. El término "viscoelástico" se refiere a las características "de memoria" prescritas de una molécula que permiten que la molécula responda a la tensión como si la molécula fuera una combinación de sólidos elásticos y fluidos viscosos. El término "resistente al desgarro" indica que cuando el polímero se expone a tensión por expansión, el material no se desgarra sustancialmente. Desgarrarse se refiere a la propagación de una hendidura o un corte en el material cuando está bajo tensión. El término "biocompatible" se usa en este documento para referirse a un material que no tiene efectos tóxicos ni dañinos sobre sistemas biológicos

Preferiblemente, la matriz polimérica minimiza o no exacerba la irritación a la pared cardiaca cuando las células y el material genético están en su posición. La matriz polimérica es preferiblemente no trombogénica cuando se aplica sola o alternativamente cuando se usa con agentes antitrombóticos tales como heparina y similares, o con agentes anti-inflamatorios tales como dexametasona y similares. La matriz polimérica puede ser un polímero bioestable o bioabsorbible dependiendo de la tasa de liberación deseada o el grado deseado de estabilidad del polímero.

La matriz polimérica de esta invención puede incluir uno o más polímeros naturales o sintéticos. Los polímeros adecuados incluyen los que son compatibles con las células o el material genético. Pueden ser bioestables o biodegradables. Estos incluyen, pero sin limitación, fibrinas, colágenos, alginatos, ácidos poliacrílicos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, celulosas, ácidos hialurónicos, poliuretanos, siliconas, policarbonatos, y una amplia diversidad de otros típicamente descritos como útiles en sistemas médicos implantables. Los polímeros son preferiblemente hidrófilos.

Preferiblemente, cuando se suministra material genético, tal como un vector modificado por ingeniería genética, se puede incorporar en un polímero de ácido poliacrílico hidrófilo reticulado. Este formará un hidrogel de elevado peso molecular que se podría usar como recubrimiento en un vehículo, tal como el dispositivo de estimulación eléctrica. El material genético preferiblemente se incorpora al hidrogel justo antes del suministro hinchando primero el hidrogel.

Preferiblemente, cuando se suministran células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas, éstas se pueden incorporar en un gel de colágeno de tipo I. Las células se pueden incorporar inicialmente en un medio que incluye una solución de colágeno de tipo I. Este material después se puede verter en un molde que contiene un vehículo, como el dispositivo de estimulación eléctrica. Después de la incubación a una temperatura (por ejemplo, 37ºC) y durante un tiempo (por ejemplo, 30 minutos) suficientes para reticular el colágeno, el dispositivo recubierto puede retirarse. Si se necesita, se puede cultivar el gel/estimulador resultante en un medio durante un tiempo (por ejemplo, 14 días) suficiente para permitir crecer a las células.

Dependiendo del tiempo de integración y proliferación celular, la matriz polimérica puede estar en forma de un armazón poroso. Éste se puede rellenar de poliuretano usando una sal disolvible, como se conoce en la técnica de recubrimiento de endoprótesis. La matriz polimérica porosa se puede recubrir con componentes de matriz extracelular, tales como fibronectina, sulfato de heparina, etc., y después se puede sembrar con las células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas que opcionalmente pueden incluir componentes genéticos añadidos. Las células pueden después crecer hacia fuera del armazón.

Si se desea, se puede usar una matriz de fibrina. Se puede preparar, por ejemplo, usando una solución de fibrinógeno y una solución de proteína coagulante de fibrinógeno. La fibrina se coagula poniendo en contacto el fibrinógeno con una proteína coagulante de fibrinógeno tal como trombina. El fibrinógeno preferiblemente se usa en una solución con una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/ml con un pH de aproximadamente 5,89 a aproximadamente 9,0 y con una fuerza iónica de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,45. La solución de fibrinógeno típicamente contiene proteínas y enzimas tales como albúmina, fibronectina, Factor XIII, plasminógeno, antiplasmina, y Antitrombina III. La solución de trombina añadida para hacer la fibrina está típicamente a una concentración de hasta aproximadamente 120 unidades NIH/ml con una concentración preferida de iones calcio entre aproximadamente 0,02 M y 0,2 M. También preferiblemente, el fibrinógeno y la trombina usados para hacer fibrina en la presente invención son de la misma especie animal, o ser humano en las que las células o el material genético de la presente invención se implantarán para evitar reacciones inmunes entre especies. La fibrina resultante se puede también someter a tratamiento térmico a aproximadamente 150ºC, durante aproximadamente 2 horas para reducir o eliminar la antigenicidad.

El vehículo para el suministro de las células y/o el material genético incluye el dispositivo de estimulación eléctrica y, por ejemplo, las células y/o material genético se inyectan directamente en la zona de infarto del miocardio.

Las células y/o el material genético se pueden asociar con el vehículo como un recubrimiento o una película preformada, por ejemplo. Si se desea, el vehículo se puede recubrir inicialmente con un adhesivo, tal como el disponible con el nombre comercial CELLTAK BIOCOAT Cell Environments disponible en Stratech Scientific Ltd., Luton, Bedfordshire, Reino Unido, para potenciar la adhesión de la matriz polimérica que contiene las células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas y/o el material genético.

El material genético y/o las células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas también se pueden suministrar en una composición farmacológica usando un catéter, por ejemplo. Dichas composiciones farmacológicas pueden incluir, por ejemplo, el ácido nucleico, en la forma deseada, y/o células en un volumen de solución salina tamponada con fosfato con 5% de sacarosa. En otras realizaciones de la invención, la molécula de ácido nucleico y/o las células se suministran con vehículos farmacéuticos adecuados, tales como los descritos en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia patrón en este campo.

Si el material genético, las células indiferenciadas, o las células contráctiles diferenciadas se inyectan por separado o en cualquier combinación juntos en un paciente de forma separada del dispositivo de estimulación eléctrica, y están en una forma de fluido, se avanza un catéter hasta el sitio deseado para el tratamiento, por ejemplo, adyacente al sitio donde hay que posicionar el dispositivo de estimulación eléctrica. El extremo distal exterior del catéter es abierto o poroso, permitiendo de este modo dispensar el material genético y/o las células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas en forma de fluido desde el extremo. Un depósito conectado al catéter contiene un suministro del material genético seleccionado y/o de células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas. Se usan elementos de control para ajustar la presión y el caudal, y se pueden controlar mecánicamente o eléctricamente. Se hace referencia a la Publicación Internacional Nº WO 95/05781, para una descripción más detallada de dicha combinación de depósito y catéter. Este dispositivo de suministro puede o puede no incluir una bomba, tal como una bomba osmótica, para suministrar la fuente de repoblación celular.

Dispositivos de estimulación eléctrica

La presente invención también incluye un dispositivo de estimulación eléctrica 22. Este proporciona los pulsos eléctricos necesarios en el momento correcto para hacer que el tejido contráctil recién formado lata en sincronía con el resto del músculo cardiaco.

El dispositivo de estimulación eléctrica puede incluir un estimulador muscular y electrodos diferentes. Como alternativa, los electrodos se pueden incorporar en el estimulador muscular. Además, el estimulador muscular debe, por supuesto, incluir una batería para proporcionar corriente eléctrica al circuito eléctrico y electrónico.

El dispositivo de estimulación eléctrica puede proporcionar estimulación en ráfagas, que se usa típicamente para estimular células de músculo esquelético, o puede proporcionar estimulación de un único pulso sincrónico, que se usa típicamente para estimular las células de músculo cardiaco. Como alternativa, el dispositivo de estimulación eléctrica puede proporcionar estimulación tanto en ráfagas como de un único pulso sincrónico. Esto es particularmente deseable si el nuevo tejido contráctil formado incluye células tanto de músculo esquelético como cardiaco y/o si se forman inicialmente células de músculo esquelético y luego se convierten en células de músculo cardiaco. Se puede usar un medidor de presión u otros medios de controlar una afección fisiológica tal como estrés de la pared cardiaca o presión intraventricular para determinar cuando hay que pasar del modo en ráfagas al modo de estimulación de fase única de estimulación Si se desea, se pueden usar dos dispositivos de estimulación eléctrica, uno que proporcione estimulación en ráfagas y otro que proporcione estimulación de un único pulso sincrónico.

Por tanto, se pueden modificar los generadores de impulsos implantables convencionales (IPG) de acuerdo con los contenidos de la presente invención para proporcionar un dispositivo de estimulación eléctrica 22, aunque típicamente no son deseables para estimular el tejido muscular cardiaco que se ha infundido con células y/o material genético porque el tejido contráctil recién formado típicamente necesita una estimulación en ráfagas para crear una contracción sostenida durante largo tiempo. Los sistemas preferidos de la presente invención incluyen un estimulador implantable (22 en la Figura 1) y dos electrodos (cátodo 30 y ánodo 32 en la Figura 1). Dicho estimulador 22 así puede que no incluya cables físicos que lo conecte a cualquier otro dispositivo. Sin embargo, es posible el proporcionar una estimulación eléctrica a partir de un estimulador implantado en el cuerpo en un sitio remoto y conectado con la zona de infarto usando cables. Aunque esto hará que la aplicación clínica de carácter más invasivo, reduciría las complicaciones de la cápsula estimuladora.

El estimulador preferido 22 mostrado en la Figura 1 está en forma de una cápsula que tiene electrodos 30 y 32 en cada extremo. Estos electrodos proporcionan contactos eléctricos para el circuito interno para detectar el paso del frente de onda de activación así como para suministrar una serie de pulsos de estimulación necesarios para producir la contracción sostenida del tejido contráctil recién formado, por ejemplo, tejido de músculo esquelético. El estimulador 22 también incluye preferentemente dos circuitos electrónicos, un circuito amplificador de detección, y un circuito generador de ráfagas.

El circuito amplificador de detección está asociado con un filtro para formar un amplificador de detección. Esto se usa para detector el frente de onda de despolarización eléctrica cuando pasa por la zona de infarto. Aunque el amplificador aumenta la obtención de esta débil señal por el circuito de detección, el filtro ayuda a desechar las señales de ruido de músculos cercanos y cualquier otro aparato eléctrico.

El circuito generador de ráfagas proporciona una serie de pulsos como se muestra en la Figura 2 durante las contracciones ventriculares para mantener contraído el tejido de músculo esquelético recién formado. Esto es necesario para proporcionar una contracción sostenida durante la sístole ya que el músculo esquelético se relaja mucho más rápido que el músculo cardiaco. El estimulador 22 también incluye un suministro de energía que proporciona energía eléctrica al amplificador de detección y el generador de ráfagas.

El estimulador 22 puede estar en forma de un cilindro, u otra forma adecuada para el implante, y de un tamaño lo suficientemente pequeño para el implante. Por ejemplo, puede ser de aproximadamente 5 mm de diámetro y 20 mm de longitud. Los materiales preferidos incluyen titanio, pero se pueden usar otros materiales biocompatibles. El estimulador 22 puede contener una batería u otra fuente de energía, componentes electrónicos para detectar los latidos cardiacos y producir estimulaciones en ráfaga, y circuitos de telemetría para desencadenar estimulaciones a demanda. Los especialistas en la técnica pueden desarrollar dicho sistema de circuitos, en particular en vista de los contenidos de las Patentes de Estados Unidos Nº 5.697.884 (Francischelli et al.), 5.658.237 (Francischelli), 5.207.218 (Carpentier et al.), 5.205.810 (Guiraudon et al.), 5.069.680 (Grandjean), y 4.411.268 (Cox).

Como el estimulador preferido 22 no incluye cables físicos que lo conecten a cualquier otro dispositivo, el estimulador 22 necesita generar su propia energía eléctrica. Si se asume que el corazón está a una carga de 500 \Omega, y se necesitan 10 pulsos a 10 voltios durante 1 milisegundo, entonces cada estimulación requerirá 0,2 mJ. Si la conversión de energía tiene una eficacia del 20%, entonces se necesitará 1 mJ de energía para estimular el corazón en cada latido. Como el corazón bombea alrededor de 50 ml de sangre contra 120 mmHg (16 kPa), realiza un trabajo de aproximadamente 800 mJ. Por lo tanto, el estimulador recoge aproximadamente un ocho por ciento del trabajo mecánico realizado por el corazón. Esto se puede hacer mediante cualquiera de una diversidad de mecanismos que pueden convertir la presión hidrostática en energía eléctrica.

Una vez implantado, típicamente, el estimulador 22 preferiblemente no se activa durante las primeras semanas, para permitir que crezca el tejido contráctil. Después se activa con una baja proporción de sincronización (por ejemplo, 3:1) entre los latidos intrínsecos del corazón y los pulsos generados por el dispositivo y se aumentan progresivamente (por ejemplo, a 1:1).

La Figura 3 es un diagrama de bloques que ilustra diversos componentes de un estimulador 22 que se puede programar mediante una unidad externa de programación (no mostrada). Uno de dichos programadores adaptables para el propósito de la presente invención es el programador disponibles en el mercado Medtronic Modelo 9790. El programador es un dispositivo microprocesador que proporciona una serie de señales codificadas al estimulador 22 mediante una cabeza de programación que transmite señales de radiofrecuencia codificadas a IPG 51 de acuerdo con un sistema de telemetría, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.312.453 (Wyborny et al.), por ejemplo.

El estimulador 22, que se muestra ilustrativamente en la Figura 3, está unido eléctricamente al corazón del paciente 56 mediante el cable 54. El cable 54, que incluye dos hilos conductores, está unido a un nudo 62 en el circuito del estimulador 22 a través del capacitador de entrada 60. En la realización actualmente descrita, un detector de actividad 63 proporciona una salida del detector a un circuito de procesamiento/amplificación de actividad 65 del circuito de entrada/salida 68.

El circuito de entrada/salida 68 también contiene circuitos para interconectar con el corazón 56, una antena 66, y un circuito 74 para la aplicación de impulsos estimuladores al corazón 56 para moderar su frecuencia bajo el control de algoritmos aplicados por un software en la unidad de microordenador 78.

La unidad de microordenador 78 comprende una placa de circuito "on" 80 que incluye un reloj de sistema 82, un microprocesador 83, y una placa "on" RAM 84 y ROM 86. En esta realización ilustrativa, el circuito de placa "off" 88 comprende una unidad RAM/ROM. El circuito de placa "on" 80 y el circuito de placa "off" 88 están cada uno unidos mediante un enlace de comunicación de datos 90 a un circuito controlador/temporizador digital 92. Los componentes eléctricos mostrados en la Figura 3 funcionan mediante una fuente de energía de batería implantable apropiada 94 de acuerdo con la práctica común en la técnica. Para propósitos de claridad, la unión de la batería a los diversos componentes del estimulador 22 no se muestra en las figuras.

La antena 66 se conecta al circuito de entrada/salida 68 para permitir la telemetría de conexión de subida/bajada a través de la unidad de transmisión y recepción RF 55. La unidad 55 puede corresponder al circuito lógico de telemetría y programación descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.556.063 (Thompson et al.), o a la descrita en la Patente de Wyborny et al. mencionada anteriormente. La referencia de voltaje (V_{REF}) y el circuito de voltaje de polarización 61 generan una referencia de voltaje y corriente de voltaje estables para los circuitos análogos de los circuitos de entrada/salida 68. La unidad de conversión de analógico a digital (ADC) y multiplexora 58 digitaliza las señales análogas y voltajes para proporcionar señales de telemetría intracardiaca "en tiempo real" y funciones de remplazo de batería "final de vida" (EOL).

Los comandos de funcionamiento para controlar la coordinación del estimulador 22 se unen mediante el enlace de datos 90 al circuito de control/temporizador digital 92, donde los temporizadores y contadores digitales establecen el intervalo de escape global del IPG así como diversas ventanas de refracción, de parpadeo y otras coordinaciones para controlar el funcionamiento de los componentes periféricos dispuestos en el circuito de entrada/salida 68. El circuito controlador/temporizador digital 92 está preferiblemente unido al circuito de detección 52, incluyendo el amplificador de detección 53, la unidad de detección de picos y medida del valor umbral 57, y el comparador/detector del valor umbral 59.

El amplificador de detección 53 amplifica las señales electrocardiacas detectadas y proporciona una señal amplificada al circuito de detección de picos y medida del valor umbral 57. El circuito 57, a su vez, proporciona una indicación de los voltajes máximos detectados y voltajes umbral del amplificador de detección medidos en el paso 64 al circuito controlador/temporizador digital 92. Se proporciona entonces una señal del amplificador de detección amplificada al comparador/detector del valor umbral 59. El amplificador de detección 53 puede corresponder al descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.379.459 (Stein).

El circuito 92 además está unido preferiblemente al amplificador de electrograma (EGM) 76 para recibir señales amplificadas y procesadas detectadas por un electrodo dispuesto sobre el cable 54. La señal de electrograma proporcionada por el amplificador de EGM 76 se emplea cuando el dispositivo implantado se consulta por un programador externo (no mostrado) para transmitir mediante telemetría de conexión de subida una representación de un electrograma análogo de la actividad eléctrica del corazón del paciente. Esta funcionalidad se muestra, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.556.063 previamente mencionada.

El generador de pulsos de salida 74 proporciona estímulos eléctricos al corazón del paciente 56 u otras localizaciones apropiadas a través de la unión de un capacitador 65 en respuesta a la señal de desencadenamiento de la estimulación proporcionada por el circuito controlador/temporizador digital 92. El amplificador de salida 74, por ejemplo, puede corresponder generalmente al amplificador de salida descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.476.868 (Thompson).

Se entiende que la Figura 3 es una ilustración de un tipo ejemplar de dispositivo que puede encontrar aplicación en la presente invención, o que se puede modificar para su uso en la presente invención por los especialistas en la técnica, y que no pretende limitar el alcance de la presente invención.

Métodos y mecanismos de suministro

Las células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas y/o el material genético descrito anteriormente se pueden suministrar en la zona de infarto del miocardio o al tejido miocárdico dañado o lesionado usando una diversidad de métodos. Preferentemente, la células contráctiles indiferenciadas y/o diferenciadas y/o el material genético se inyectan directamente en la región deseada.

Para la inyección directa, se puede cargar un bolo pequeño de material genético y/o células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas seleccionados en una microjeringa, por ejemplo, una jeringa Hamilton de 100 \mul, y aplicarse directamente desde el exterior del corazón.

Sin embargo, preferiblemente, se usa un catéter para la inyección directa tanto del dispositivo de estimulación eléctrica como de la fuente de repoblación celular. Por ejemplo, se puede introducir un catéter desde la arteria femoral y dirigirlo al ventrículo izquierdo, lo que se puede confirmar por fluoroscopia. Como alternativa, el catéter se puede dirigir al ventrículo derecho.

El catéter incluye un cuerpo de catéter alargado, adecuadamente un revestimiento externo aislante que puede estar hecho de poliuretano, politetrafluoroetileno, silicona, o cualquier otro polímero biocompatible aceptable, y una luz convencional que se extiende a su través a lo largo del mismo, que comunica mediante un elemento de aguja hueco. El catéter se puede guiar a la localización indicada pasándose por un catéter dirigible o guiable que tiene una luz que lo aloja, por ejemplo como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.030.204 (Badger et al.); o mediante un catéter guía de configuración fijada como se ilustra en la patente de Estados Unidos Nº 5.104.393 (Isner et al.). como alternativa, se puede avanzar el catéter a la localización deseada en el corazón mediante una sonda desviable, como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 93/04724, publicada el 18 de marzo de 1993, o por un cable de guía desviable como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.060.660 (Gambale et al.). En otra realización más, se puede retirar el elemento de aguja comúnmente en una cubierta al tiempo que se guía el catéter al corazón
del paciente.

Una vez en el ventrículo izquierdo (o derecho), la punta del catéter se puede mover por la pared del ventrículo izquierdo como prueba para medir el electrograma y para determinar la localización y la extensión de la zona de infarto. Esto es un procedimiento conocido para los especialistas en la técnica. Una vez identificada la zona de infarto, la guía de dirección se retirará dejando la cubierta en el sitio del infarto. La fuente de repoblación celular y/o el dispositivo de estimulación eléctrica se pueden enviar entonces por la luz del catéter y se pueden introducir en el miocardio. Entonces se puede retirar el catéter del paciente.

El dispositivo de estimulación eléctrica puede incluir una diversidad de mecanismos para mantenerlo en su sitio en el miocardio. Por ejemplo, puede incluir ganchos o garras extensibles. Como alternativa, se puede tratar la parte del dispositivo que contacta con el tejido para conseguir una textura de microsuperficial (como se describe por Andreas F. von Recumin en: Biomaterials, 12, 385-389, "Texturing of Polymer Surfaces at the Cellular Level" (1991); Biomaterials, 13, 1059-1069, "Macrophage Response to Microtextured Silicone" (1992); y Journal of Biomedical Materials Research, 27, 1553-1557, "Fibroblast Anchorage to Microtextures Surfaces" (1993)). En una realización alternativa, el estimulador puede estar en forma de un tornillo que se empuja dentro de la pared muscular girándolo.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos están pretendidos solamente para propósitos de ilustración.

Ejemplo 1

Transformación de Fibroblastos in situ y Estimulación Eléctrica

Se inyectaron adenovirus que expresan miogenina (Adenovirus de miogenina/ADNc, que se pueden producir de acuerdo con el método descrito por Murry et al., J. Clin. Invest., 98, 2209-2217 (1196)) directamente en el miocardio usando una jeringa de 100 microlitros. Se diluyeron 10^{9} pfu (pfu -unidades formadoras de placas- una pfu es aproximadamente 50 partículas de adenovirus) con solución salina para formar una solución de 100 microlitros. Esta solución se mantuvo sobre hielo seco hasta la inyección, y se suministró en cuatro partes iguales en el perímetro de la zona de infarto, separados 90 grados.

Se realizó una evaluación histopatológica del tejido tratado para evaluar la extensión de la transformación de los fibroblastos. El tejido se procesó para histología y se tiñó con H&E y Tricrómico de Masson de acuerdo con métodos convencionales.

También se realizó la tinción inmunohistoquímica para determinar si había expresión de miogenina en el tejido tratado. Se cortaron ocho secciones congeladas del tejido, se fijaron, y se incubaron con una IgG policlonal de conejo que se había provocado contra miogenina de rata (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat. Nº sc-576). Las muestras se aclararon, se incubaron con un anticuerpo secundario marcado y se visualizaron mediante microscopía epifluores-
cente.

El suministro de adenovirus que expresa miogenina al tejido infartado in vivo produjo la aparición de múltiples pequeños parches de mioblastos esqueléticos. Estas células musculares aisladas tenían núcleos periféricos, indicando que era más probable que fueran células de músculo esquelético que células de músculo cardiaco cuando se analizaron histológicamente. Típicamente, las células convertidas genéticamente representaron una forma más inmadura de músculo esquelético que los miotubos observados en los tejidos en los que se había inyectado mioblastos (es decir, antes de la fusión). No había presencia de inmunorreactividad de miogenina en estas células en el momento del sacrificio. Por lo tanto, se concluyó que la miogenina creada por el adenovirus no estaba ya presente en el momento de la recogida del tejido (como se esperaba dos semanas después del suministro del virus, ya que la expresión del adenovirus no prosigue durante más de una semana a 10 días in vivo).

En corazones sometidos a crioablación, a los que se ha inyectado beta-galactosidasa de adenovirus, sólo se detectaron fibroblastos e infiltrado linfocítico junto con pequeños capilares en el infarto, similar a los resultados obtenidos en animales que habían recibido crioablación, pero no inyecciones virales (control). Por lo tanto, en este grupo de control, no se detectaron células musculares ni tinciones positivas a miogenina. Esto comprendió el grupo de placebo del brazo molecular del estudio.

Ejemplo 2

Inyección de Células Contráctiles y Estimulación Eléctrica en Cánidos Información de Crecimiento y Pasaje para Células de Mioblasto Esquelético

1. Formulación del Medio de Crecimiento:

81,6% M199 (Sigma, M-4530)

7,4% MEM (Sigma, M-4655)

10% Suero Fetal Bovino (Hyclone, Cat. Nº A-1115-L)

1x (1%) Penicilina/Estreptomicina (Concentración Final 100.000 U/l de Penicilina/10 mg/l de Estreptomicina, Sigma, P-0781).

2. Información de Pase Celular:

A.

Densidades de siembra de 1 x 10^{4} células/cm^{2} producirán una monocapa del 80% de confluencia en aproximadamente 96 horas.

B.

Proporciones de división 1:4-1:6 producirán una monocapa confluyente en 96 horas.

C.

No permitir que las células confluyan. El contacto célula a célula causará la diferenciación de las células en miotubos.

3. Información de Pase:

7

A.

Retirar el medio de cultivo del Matraz T.

B.

Añadir de nuevo la cantidad apropiada de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS).

C.

Incubar durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente.

D.

Retirar HBSS y remplazar con la solución de Tripsina.

E.

Incubar durante un máximo de 5 minutos a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. Las células se separarán del sustrato de cultivo celular antes de 5 minutos.

F.

No tratar con tripsina durante un periodo más largo de lo necesario. Las células sufrirán un shock si se permite que permanezcan en la tripsina durante más de 5 minutos.

G.

Agitar el matraz suavemente para retirar las células.

H.

Añadir de nuevo un volumen igual de medio de crecimiento para neutralizar la tripsina.

I.

Retirar una muestra para recuento de células.

J.

Centrifugar las células a 1000 RPM durante 10 minutos.

K.

Contar las células y calcular el número de células.

L.

Resuspender en el medio de cultivo celular y sembrar en matraces apropiados.

M.

Para mantener un cultivo sano, cambiar el medio cada 2-3 días.

4. Recuento celular:

A.

Diluir las células en el diluyente apropiado (Azul de Tripano o HBSS). Sin diluir o una dilución de 1:2 funciona bien para un matraz T confluyente.

B.

Contar las células usando un hemocitómetro. El intervalo más preciso para el hemocitómetro es entre 20-50 células/cuadrado.

C.

Cálculo:

Células contadas (dividido por) cuadrados contados (multiplicado por) factor de dilución (multiplicado por) 1 x 10^{4} = células/ml en la suspensión celular original.

Aislado enzimático de mioblastos

El músculo esquelético, a diferencia del músculo cardiaco, mantiene la capacidad de repararse a sí mismo si está dañado o lesionado. La razón para esto es la presencia de mioblastos indiferenciados (también mencionados como células satélite) localizados en el músculo maduro.

Los miotubos del músculo maduro no pueden crecer en cultivo, porque en el proceso de diferenciación de mioblastos en miotubos las células pierden la capacidad de proliferación. Para dirigir una investigación in vitro sobre los miotubos de músculo esquelético primero es necesario aislar los mioblastos del músculo. El siguiente procedimiento es para aislar mioblastos primarios del músculo de biopsias de músculo esquelético y subcultivar las células resultantes.

1. Materiales:

A.

Medio de Aislamiento: 80,6% M199 (Sigma, M-4530), 7,4% MEM (Sigma, M-4655), 10% de Suero Fetal Bovino (Hyclone, Cat. Nº A-1115-L), 2x (2%)Penicilina/Estreptomicina (Concentración Final 200.000 U/l de Penicilina/20 mg/l de Estreptomicina, Sigma, P-0781).

B.

Medio de Crecimiento de Mioblastos: 81,6% M199 (Sigma, M-4530), 7,4% MEM (Sigma, M-4655), 10% de Suero Fetal Bovino (Hyclone, Cat. Nº A-1115-L), 1x (1%) Penicilina/Estreptomicina (Concentración Final 100.000 U/l de Penicilina/10 mg/l de Estreptomicina, Sigma, P-0781).

C.

Solución de Lavado: M199, 2x Penicilina/Estreptomicina.

D.

Colagenasa (Cruda: Tipo IA, Sigma, C-2674).

E.

Hialuronidasa (Tipo I-S, Sigma H-3506).

F.

Proteasa, de Streptomyces griseus, (Sigma, P-8811).

G.

Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS), libre de Ca^{2+} y Mg^{2+} (Sigma, H-6648).

H.

EtOH al 70% (filtrado de manera estéril).

I.

Percoll (Sigma, P-4937).

J.

0,5 g/l de Solución de Tripsina (Sigma, T-3924).

K.

Tubos de Centrífuga Estériles de 15 ml y 50 ml.

L.

Placas Petri Estériles de 100 mm.

M.

Tijeras Estériles y Fórceps Estériles (Fine Scientific Tools).

N.

Pipetas Estériles de 5 ml, 10 ml, 25 ml (Falcon).

O.

BIOCOAT Laminin Cellware (matraces de 25 cm^{2} y de 75 cm^{2}, Becton Dickinson, Cat. Nº 40533, 40522)

P.

Matraces de Cultivo Tisular T-75, con orificio en el tapón de 0,22 \mum (Corning).

Q.

Filtro, 0,22 \mum y 0,45 \mum, de acetato de celulosa (Corning).

R.

Tubos de Centrífuga de Policarbonato.

S.

Centrífuga Beckman, GS-6.

T.

Incubadora con Agitación.

2. Método:

Todas las etapas de este procedimiento se deben realizar de manera aséptica.

A.

Preparar el Medio de Aislamiento:

\bullet Añadir aproximadamente 30 ml a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril (10 g o menos de biopsia).

\bullet Añadir aproximadamente 50 ml a un frasco de medio de 125 ml estéril (hasta 25 g de biopsia).

B.

Poner en Medio de Aislamiento sobre hielo o paquetes de hielo para mantenerlo frío (aproximadamente 4ºC).

C.

Preparar la solución enzimática el mismo día que se usará añadiendo 1,0 g de colagenasa y 0,2 g hialuronidasa a 100 ml de M199 (100 ml de solución enzimática/de rotura es suficiente para digerir 40-50 g de músculo esquelético).

D.

Esterilizar la solución enzimática filtrándola primero a través de un filtro de 45 \mum y luego un filtro de 0,22 \mum y mantenerla a 4ºC hasta que esté lista para su uso.

E.

Preparar la solución de rotura, el mismo día que se usará, añadiendo 1 g de la proteasa a 100 ml de M199.

F.

Esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 \mum y mantenerla a 4ºC hasta que esté lista para su uso.

G.

En condiciones semi-estériles retirar la biopsia de músculo esquelético, preferiblemente del vientre del músculo, y ponerlo en la solución de aislamiento.

H.

Sellar el recipiente y almacenarlo a aproximadamente 4ºC hasta que esté listo para picarlo.

I.

Retirar el tejido y ponerlo en una placa Petri estéril.

J.

Quitar cualquier tejido conectivo y medir el peso final.

K.

Lavar el tejido con EtOH al 70% estéril durante 30 segundos.

L.

Aspirar el EtOH y lavar el tejido 2x con HBSS.

M.

Finalmente picar la biopsia usando tijeras y pinzas.

N.

Transferir la biopsia picada a tubos de centrífuga estériles de 50 ml. No más de 20 g/tubo para permitir una digestión enzimática eficaz.

O.

Aclarar el tejido añadiendo aproximadamente un de 25 ml/tubo de HBSS, mezclar y sedimentar el tejido centrifugando a 2000 RPM (permitir que la centrífuga alcance 2000 RPM y apagarla).

P.

Decantar HBSS y repetir el aclarado y centrifugar dos veces adicionales.

Q.

Añadir solución enzimática a los tubos (aproximadamente 25 ml/15 g-20 g de la biopsia original).

R.

Incubar los tubos en la incubadora con agitación durante 20 minutos (Punto de Referencia-37ºC, 300 RPM).

S.

Centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.

T.

Añadir solución de rotura a los tubos (aproximadamente 25 ml/15 g-20 g de la biopsia original).

U.

Incubar los tubos en la incubadora con agitación durante 15 minutos (Punto de Referencia-37ºC, 300 RPM).

V.

Centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos.

W.

Recoger el sobrenadante, inactivar las enzimas añadiendo FBS a concentración final del 10%, y almacenar a 4ºC.

X.

Añadir solución de rotura a los tubos para una segunda digestión enzimática (aproximadamente 25 ml/15 g-20 g de la biopsia original).

Y.

Incubar los tubos en la incubadora con agitación durante 15 minutos (Punto de Referencia - 37ºC, 300 RPM).

Z.

Centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos.

AA.

Recoger el sobrenadante e inactivar las enzimas añadiendo FBS a una concentración final del 10%.

BB.

Centrifugar la suspensión celular de las etapas de digestión de rotura (remítase a W y a AA) a 2400 RPM durante 10 minutos.

CC.

Retirar y desechar el sobrenadante.

DD.

Resuspender los sedimentos celulares en un volumen mínimo de Solución de Lavado.

EE.

Combinar los sedimentos en un tubo de centrífuga de 50 ml, aumentar el volumen a 40 ml usando Solución de Lavado.

FF.

Centrifugar a 2400 RPM durante 10 minutos.

GG.

Retirar el sobrenadante y repetir el lavado de las células otras dos veces.

HH.

En el aclarado final resuspender el sedimento en 2 ml de MEM. Si la biopsia inicial era cerca de o mayor que 25 g, resuspender en 4 ml de MEM.

II.

Preparar Percoll al 20% y Percoll al 60% en MEM.

JJ.

Hacer el gradiente de densidad estratificando 10 ml de Percoll al 20%/MEM sobre 5 ml de Percoll al 60%/MEM (remítase a la Figura 1).

KK.

Añadir 2 ml de la suspensión celular en la parte superior de la banda de Percoll al 20%.

LL.

Usar una escala para preparar un segundo tubo como contra-equilibro para la centrifugación.

MM.

Centrifugar a 11947 RPM (15000xg) durante 5 minutos a 8ºC (ajustar la aceleración a 5 y el freno a 0).

NN.

Aislar la banda de células que se desarrolla entre las capas de Percoll al 20% y al 60%. Esta banda contiene las células mioblastos.

OO.

Determinar el volumen de la banda y diluir con 5 volúmenes del medio de crecimiento.

Nota: Si el Percoll no está diluido con suficiente medio de crecimiento será muy difícil sedimentar los mioblastos de la solución.

PP.

Centrifugar a 3000 RPM durante 10 minutos.

QQ.

Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio de cultivo.

RR.

Contar las células en suspensión.

SS.

Sembrar las células en los matraces T recubiertos con BIOCOAT Laminin a aproximadamente 1x10^{4} células/cm^{2}. La primera siembra debe hacerse sobre una superficie recubierta de laminina para ayudar a la adhesión celular.

TT.

Cultivar las células hasta una confluencia del 60%-80%. Si se permite que las células confluyan finalmente se diferenciarán en miotubos.

UU.

Procedimiento de Tratamiento con Tripsina:

Lavar la monocapa con HBSS

Añadir tripsina (0,5 g/l de tripsina)

8

Incubar a 37ºC durante no más de 5 minutos

Neutralizar la tripsina con medio que sólo contiene suero

Retirar las células

Centrifugar a 800 rpm durante 10 minutos

Resuspender en Medio de Crecimiento de Mioblastos

Sembrar los matraces T tratados para cultivo celular a aproximadamente 1 x 10^{4} células/cm^{2}.

Una proporción de división de 1:4 a 1:6 funciona bien para un cultivo confluyente al 60-80%.

Desarrollo del Modelo de Infarto Canino e Inyección de Células

El infarto de miocardio se creó en el corazón canino mediante crioablación de una región circular de la pared libre del ventrículo izquierdo, de aproximadamente 3,5 cm de diámetro. Esto se consiguió realizando primero una toracotomía izquierda en el cuarto o quinto espacio intercostal para tener acceso al corazón canino. El corazón se reposicionó para tener acceso a la pared libre del VI. Se identificó una región relativamente libre de vasculatura coronaria para la crioablación.

El miocardio se infartó aplicando un instrumento normal de crioablación con una placa metálica de 3,5 cm de diámetro a la superficie epicárdica durante hasta 10 minutos. Aunque la sonda se enfrió con nitrógeno líquido, su temperatura era tan fría como menos 180ºC antes de aplicarse sobre la superficie del corazón. Como el volumen de sangre que fluye en el ventrículo izquierdo del perro es suficiente para calentar la superficie endocárdica, no se pudo conseguir una ablación transmural real. No obstante, se hizo la ablación de 13,5 gramos de la pared libre del VI, constituyendo el 15 por ciento de la masa de la pared libre del VI. Esto también es un tamaño típico de infarto en pacientes humanos.

Para un perro se obtuvieron 1,79 x 10^{8} (ciento setenta y nueve millones) mioblastos en 11 días de 2,5 gramos de biopsia de músculo esquelético. Estas células se reinyectaron en el miocardio canino en diez posiciones alrededor del lugar de la ablación, usando una jeringa con una aguja de calibre 22 e inyectando 0,5 ml por localización (1,79 x 10^{8} células/5 ml de solución salina).

Estimulación Eléctrica in vivo

Dos semanas después de la introducción del infarto del MI, se abrió otra vez el tórax, y el animal se instrumentalizó como antes. Además, se unió un electrodo al ápex ventricular para tener un marcapasos VVI unipolar. Se unieron dos electrodos más a ambos lados del área infartada para estimular la región de cardiomioplastia celular.

Se observó en este momento que la presión del VI y el volumen sistólico del animal no mejoraron significativamente. De hecho, los picos de presión sistólica solamente estaban ligeramente sobre 80 mmHg, y el volumen sistólico estaba de nuevo alrededor de 22 ml cuando al animal se le puso el marcapasos VVI. Esto sugiere que la sola colocación de las células no mejora apreciablemente la función sistólica.

Cuando se activó el estimulador de músculo esquelético, las presiones sistólicas alcanzaron 100 mmHg, y los volúmenes sistólicos aumentaron a 40 ml. Debido a problemas de sincronización entre el marcapasos ventricular y el estimulador de músculo esquelético, no se pudo obtener una señal estable durante el estudio. No obstante, este experimento dio una indicación acerca de que la presencia únicamente de las células esqueléticas puede no ser suficiente para mejorar la función sistólica, y que puede haber una necesidad de estimulación del músculo esquelético para mejorar la función cardiaca junto con la cardiomioplastia celular.

Con la aplicación de la estimulación del músculo esquelético también se observaron cambios en el movimiento de la pared en la región de tratamiento. Con únicamente un marcapasos ventricular tradicional (señal superior), la longitud de la zona del infarto solamente se acortó en 0,5 mm. Sin embargo, cuando se aplicó la estimulación del músculo esquelético además de marcapasos ventricular, el acortamiento era de aproximadamente 1,00 mm, indicando que el movimiento de la pared, o contractilidad, se aumentó estimulando eléctricamente la región de cardiomioplastia esquelética.

Métodos Histopatológicos y Resultados

Para asegurar que las células esqueléticas transplantadas estaban presentes al final del periodo de dos semanas, se analizaron secciones de tejido conservadas con inmunohistoquímica usando un anticuerpo anti-miosina (esquelético, rápido, MY-323). La tinción positiva (verde) en dos regiones diferentes de la zona de ablación indicó la presencia de células de músculo esquelético inyectadas en la región de ablación del miocardio dos semanas después de su introducción. Este estudio de inmuno-tinción proporcionó la evidencia definitiva de la presencia de células de músculo esquelético en el miocardio. El protocolo de tinción inmunohistoquímica usado se describe a continuación:

Protocolo de tinción inmunohistológica

Materiales:

Anticuerpo Monoclonal Anti-Miosina Esquelética (Rápido), Clon MY-32, Sigma, Cat. Nº M-4276.

Anticuerpo Policlonal de Conejo Anti-conexina 43, Zymed, Cat. Nº 71-0700.

Anticuerpo de cabra Anti-IgG de ratón-FITC, Sigma, Cat. Nº F-0257.

Anticuerpo de cabra Anti-IgG de conejo (Molécula Completa)-TRITC, Sigma, Cat. Nº T-6778.

PBS, Sigma, Cat. Nº 1000-3.

Suero de Cabra, Sigma.

Acetona, Sigma, Cat. Nº A-4206.

Medio de Montaje, Sigma Cat. Nº 1000-4.

Microscopio, Nikon, Labophot-2.

Muestras:

Músculo Esquelético (Control)

Lesión Posterior

Lesión Media

Lesión Anterior

J (L) Pared Libre del Ventrículo (Control)

Método:

A.

Limpiar los portaobjetos con EtOH al 95% y tratar con poli-L-lisina o comprar portaobjetos pre-tratados.

B.

Obtener muestras tisulares y congelar en el criostato.

C.

Cortar secciones criostáticas de 8 \mum de grosor del bloque de tejido congelado, colocarlas sobre el portaobjetos tratado, y almacenar a \leq-70ºC.

D.

Permitir a las secciones tisulares alcanzar la temperatura ambiente antes de comenzar la tinción (aproximadamente 15-30 minutos).

E.

Fijar las muestras con acetona fría (\leq-10ºC) durante 10 minutos a 4ºC.

F.

Lavar las muestras con PBS tres veces (tener cuidado para evitar eliminar por lavado la muestra del portaobjetos).

G.

Bloquear las muestras con suero de cabra al 10%/PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente, usando una cámara humidificada.

H.

Diluir el anticuerpo primario, Conexina-43, 1:100 en PBS que contiene suero de cabra al 10%. Diluir suficiente anticuerpo para cubrir las muestras (aproximadamente 150 \mul), añadir a las secciones tisulares, e incubar en una cámara humidificada durante 1 hora a temperatura ambiente.

I.

Lavar la muestra tres veces en suero de cabra al 10%/PBS (5 minutos/lavado).

J.

Diluir el anticuerpo secundario, My-32, 1:200 en PBS que contiene suero de cabra al 10%. Diluir suficiente anticuerpo para cubrir las muestras (aproximadamente 150 \mul), añadir a las secciones de tejido, e incubar en una cámara humidificada durante 1 hora a temperatura ambiente.

K.

Lavar la muestra tres veces en suero de cabra al 10%/PBS (5 minutos/lavado).

L.

Diluir los anticuerpos secundarios, mezclar las soluciones de anticuerpo, y añadir a las secciones de tejido.

Anticuerpo Anti-IgG de Conejo (Molécula Completa)-TRITC, 1:50 en PBS.

Anticuerpo Anti-IgG-de Ratón-FITC, 1:100 en PBS.

M.

Incubar en una cámara humidificada oscura durante 45 minutos a temperatura ambiente.

N.

Lavar las muestras en PBS tres veces (5 minutos/lavado).

O.

Añadir medio de montaje y un cubreobjetos.

P.

Observar al microscopio usando el filtro FITC, el filtro TRITC, y la fuente de luz UV.

Q.

Almacenar las muestras en una cámara oscura a \leq 4ºC.

Claims (17)

1. Un sistema implantable que comprende:

a) una fuente de repoblación celular aislada capaz de formar nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado; y

b) un dispositivo de estimulación eléctrica para estimular eléctricamente el nuevo tejido contráctil en y/o cerca del tejido miocárdico dañado o lesionado, en el que la fuente de repoblación celular está recubierta sobre o incorporada en un vehículo, siendo dicho vehículo el dispositivo de estimulación eléctrica.

2. El sistema implantable de la reivindicación 1, en el que la fuente de repoblación celular comprende células contráctiles indiferenciadas o diferenciadas.

3. El sistema implantable de la reivindicación 2, en el que las células contráctiles indiferenciadas comprenden células satélite de músculo esquelético.

4. El sistema implantable de la reivindicación 2, en el que las células contráctiles indiferenciadas comprenden células autólogas.

5. El sistema implantable de la reivindicación 1, en el que la fuente de repoblación celular comprende material genético.

6. El sistema implantable de la reivindicación 5, en el que el material genético comprende un vehículo de suministro que comprende una molécula de ácido nucleico.

7. El sistema implantable de la reivindicación 6, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un gen de determinación miogénica.

8. El sistema implantable de la reivindicación 6, en el que el vehículo de suministro comprende un vector de expresión viral.

9. El sistema implantable de la reivindicación 6, en el que el vehículo de suministro comprende liposomas.

10. El sistema implantable de la reivindicación 5, en el que el material genético comprende ADN plasmídico.

11. El sistema implantable de cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente de repoblación celular además comprende una matriz polimérica.

12. El sistema implantable de cualquier reivindicación precedente, en el que el dispositivo de estimulación eléctrica comprende un estimulador muscular teniendo dos electrodos unidos al mismo.

13. El sistema implantable de la reivindicación 12, en el que el estimulador muscular es implantable y está en forma de una cápsula que tiene electrodos incorporados al mismo.

14. El sistema implantable de la reivindicación 13, en el que el estimulador muscular es un vehículo para la fuente de repoblación celular.

15. El sistema implantable de cualquier reivindicación precedente, en el que el dispositivo de estimulación eléctrica proporciona estimulación en ráfagas.

16. El sistema implantable de cualquier reivindicación precedente, en el que el dispositivo de estimulación eléctrica proporciona estimulación por pulsos.

17. El sistema implantable de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo de estimulación eléctrica está en forma de una cápsula.