JPH05506993A - ウイルスの複製を防止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルスの複製を防止する方法 発明の分野 本発明はウィルス性疾患の予防および治療に関する。

発明の背景 ウィルス感染の結果はウィルスと宿主の両方のいくつかの因子に依存する。病理 発生に影響を及ぼすこれらの因子には感染性ウィルス粒子の数、感受性細胞への それらの経路、ウィルスの増殖速度および蔓延速度、細胞機能に対するそのウィ ルスの効果、細胞損傷に対する宿主の二次的応答、およびその宿主の免疫学的お よび非特異的防御が含まれる。一般にウィルス感染の効果には急性の臨床的疾患 、無症候性感染、様々な癌の誘発、および慢性の進行性神経系障害が含まれる。

１細胞で生産されたウィルス粒子は他の細胞に侵入することができ、それによっ て蔓延する感染をもたらすので、ウィルスは強力な感染性の病原物質である。ウ ィルスは侵入した細胞に重要な機能的変化を引き起こし、これがしばしばその細 胞を死に至らしめる。

ウィルス感染は現在も世界中で主要な医学的課題となっている。例えば急性およ び慢性の肝炎ウィルス感染およびその続発症は主要な課題の一つである。実際、 世界中でおそらく４億人の人々が現在Ｂ型肝炎ウィルスに感染している。この設 定下では、急性および劇症肝炎、ならびにこのウィルスの慢性キャリアー（保有 者）のままである個体における硬変、慢性活動性肝炎および肝細胞癌腫の最終的 な発生を含む慢性肝臓疾患の危険が高い。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の劇的な効果はウィルス性疾患の結果のもう１ つの例である。現在米国ではＡＩＤＳの診断例が２７７００例以上あり、米国公 衆衛生局は１９９１年の終わりまでに１７９０００Å以上がこの疾患に罹るであ ろうと予測している。したがって、ＨＩＶ用の診断手段やワクチンの開発を目指 して活発な医学的研究が行われている。ＡＩＤＳと肝炎はウィルス感染力場１き 起こす様々な疾患の２例に過ぎない。

現在、ウィルスの複製を停止させ他の細胞へのウィルスの蔓延を防止するための 方法がめられている。しかしながら、この目的の達成にはかなりの困難が伴う。

主な課題の１つは宿主細胞を傷つけることなくウィルスを抑制するという課題で ある。ウィルス増殖の細胞遺伝子に対する依存性が弁別的な攻撃点を制限してい る。最も大きいウィルスでさえ、ウィルス自身が有する生化学的反応であって宿 主の細胞との関連で独自性のあるものはかなり少ない。さらに、ウィルス感染が 明らかになるのは大量のウィルス増殖と細胞変化が起こった後に限られる。

したがってほとんどの一般的制御法は予防である。治療はほとんどの場合、その 損傷が後に修復されるという条件下でいくらかの未感染細胞の殺傷が許容され得 る状況に限られる。

抗ウイルス療法のもう１つの重要な限界は耐性突然変異体の出現である。それら の選択を避けるためには、細菌に関して有効な原理（妥当な投与量、複数薬剤治 療および明確に示されない限り治療を避けること）をウィルスにも同等に適用す ることができる。したがって、ウィルス感染の危険な性質および感染性ウィルス の性質が提供する障害ゆえに、ウィルスの複製を制御する方法が差し迫って必要 とされている。ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスに適用可能な方法は広範囲 にわたる適用可能性を有するであろう。

関連する文献の説明 Ｂ型肝炎つイルスノ複製機序についての記述は、Ｓｅｅｇｅｒら、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３２：４７７−４８４（１９８６）　；　Ｋｈｕｄｙａｋｏｖら、ＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４３：１１５−１１８（１９８９）　；　Ｗｉｌｌら、 　ＪA　ｏｆ　Ｖｉｒｏ］、。

６に９０４−９１１（１９８７）；Ｂｉｒｓｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：５ ５２−５５５（１９９０）ｌ二認めることができる。

レトロウィルスおよびレトロウィルス組込みについては、Ｖａｒｍｕｓ、　Ｈ， 、５ｃｉｅｎｃｅ２４０：１４２７−１４３５（１９８８）　；　Ｇｒａｎｄｇ ｅｎｅｔｔら、Ｃｅ１１６０：３−４（１９９０）ｌ：議論されティる。

発明の要約 ウィルスのポリメラーゼ遺伝子の特定の領域に少なくとも１つの突然変異を導入 することによって、ウィルスポリメラーゼを含有するウィルスの複製の完全かつ 不可逆的な停止が達成される。この突然変異型遺伝子または突然変異型遺伝子産 物（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）をそのウィルスに供給することによって 欠陥のある複製をもたらすことができる。この方法はウィルス性疾患の予防と治 療に有効である。本発明の方法によって、ポリメラーゼ遺伝子産物を複製に利用 するＤＮＡウィルスおよびＲＮＡウィルスを共に抑制することができる。

図面の簡単な説明 図１：Ｈｕｈ７肝癌細肝癌細胞体変異型ＨＢＶゲノム５−１５が効率的に転写さ れる。

１０％ＦＢＳを補足したＭＥＭ培地中でＨｕｈ７細胞（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ 、　Ｈ，ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４２：３８５８−３８６３（１９８２ ））を生育させた。約９０％全面成長に達した時に、リン酸カルシウム法（Ｃｈ ｅｎ、　Ｃ，ら、１ｌｏｌ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：２７４５−２７５２ （１９８７））を用いて、この細胞をクローン化ＤＮＡ（２０μｇ／１００＋ｍ ディツシュ）でトランスフェクトした。使用したＨＢＶ　ＤＮＡは不完全ゲノム １−８（陰性対照　表１を参照のこと）、“野生型”ａｄｗの頭−元型二量体お よび突然変異型ウィルスゲノム５−１５の頭−元型二量体である。トランスフェ クションの４８時間後、グアニジンイソチオシアネート法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 　Ｊ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　ｍａｎｕａｌA第 ２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓi１９ｇ９））を用 いて全ＲＮＡを細胞から調製し、ホルムアルドヒト１．２５％アガロースゲル電 気泳動によって分画し、Ｎｙｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ ｅ１１．　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＵ）に移し、ニックトランスレーションによって３ ２Ｐラベルした全長ＨＢＶ　ＤＮＡプローブとハイブリッド形成（ハイブリダイ ズ）させた。オートラジオグラフィー暴露を一８０℃で１２時間行った。

図２＝突然変異型ＨＢＶゲノム５−１５は複製欠損性である。

図１の説明で記述したようにＨｕｈ７細胞を生育させ、これをトランスフェクト した。トランスフェクションの５日後に細胞培養培地を集め、ＮＰ４０中で細胞 を溶解した（Ｉｌｉｒｓｃｈ、　Ｒ，ら、ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１６７：１３６− １４２（１９８８））。この細胞溶解液を５００００ｘｇ（２０℃）で３０分間 遠心分離した。投入（インプット）ＤＮＡを消化するために、上清にＤ　Ｎ　ａ 　ｓ　ｅ　Ｉ　（１μｇ／ＩＩｌ　；　Ｙｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を加えた。こ の溶液をショ糖クッション（３０にショ糖、２０ＩＩＩＩＩＴ　ｒ　ｉ　５−Ｈ Ｃ１（ｐＨ７，４）、１００ｍＭ　ＮａＣＬ　Ｏ，１％２−メルカプトエタノー ル、０，１％ウシ血清アルブミン）に重層し、１７８０００ｘｇ（４℃）で１２ 時間遠心分離した。２０ｍＭＴｒｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍ１ｌ　ＥＤ ＴＡ、１％ＳＤＳの存在下でプロテイナーゼＫ（５００μｇ／ｍｌ）を用いてベ レットを５５℃で３時間消化した。フェノール抽出の後、核酸をエタノールで沈 殿させた。凍結乾燥の後、沈殿物を１０ｍＭＴｒｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，４） 、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１μｇ　ＤＮＡａｓｅ非含有ＲＮａｓｅ　Ａ／ｍｌに溶解 し、１．２５％アガロースゲル電気泳動で分画し、Ｎｙｔｒａｎ膜に移し、ニッ クトランスレーションで３２Ｐラベルした全長ＨＢＶ　ＤＮＡプローブにハイブ リダイズさせた。１００關デイツシユ１枚から得られる細胞質ＤＮＡを各レーン に適用した。オートラジオグラフィー暴露を一８０℃で４時間行った。

図３：ＨＢＶ突然変異体５−１５の複製欠損性の原因となるＤＮＡ配列はヌクレ オチド位置２６０６（Ａｐａｌ）と２８２３（Ｂ　ｓ　ｔ　ＥＩＩ）の間に位置 する。

“野生型″ａｄｗの頭−元型二量体（ａｄｗ　ＨＴＤｌｐＧＥＭ−７のＥｅｏＲ １部位中に部位−ニングしたもの）をＡａｔＩＩ（１４１９）およびＤｒａｌ（ ２１８６）断片としてサブクローニングすることにより、複製能を有する先端欠 失型構築物ａｄｗＲ９を得た。ａｄｗ　Ｒ９と突然変異型ＨＢＶゲノム５−１５ の特定の領域を交換することにより、表示のサブクローンを得た。黒（塗り潰し た領域はａｄｗ　ＲＱ中へのＨＢＶ５−１５挿入を表す。これらの構築物の複製 能力を図２の説明に記述したようにして分析した。

図４＝ヌクレオチド２７９８はＨＢＶ　ＤＮＡの複製能力にとって極めて重要で ある。

図１の説明に記述してようにＨｕｈ７細胞を生育させ、これをトランスフェクト した。感染の５日後に細胞培養培地を集め、細胞をＮＰ４０中で溶解した（Ｂｉ ｒｓｃｈら、ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１６７：１３６−１４２（１９８８））。培地 を５００００ｘｇ（２０℃）で３０分間遠心分離した。その上清を１０ｍ１ｌ　 ＭｇＣ１２にした。インプットＤＮＡを消化するためにＤＮ　ａ　ｓ　ｅ　Ｉ　 （１ｔｔ　ｇ／ｍｌ　；　Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を添加した後、その溶液を シ碧糖クッションに重層し、図２の説明に記述したように処理した。１００鳳Ｉ デイツシユ１枚から得られる細胞培養培地（１０ｍｌ）に相当する量を各レーン に適用した。オートラジオグラフィー暴露を一８０℃で１２時間行った。複製性 ＨＢＶＤＮＡに関して陰性を示す細胞培養培地はすべてそれぞれの細胞溶解液調 製物中でも陰性であった（非開示データ）。各構築物の構造とＤＮＡ配列をそれ ぞれ図３および表２に示す。

特定の態様の説明 ウィルスの複製を停止させるための方法および組成物を提供する。本法にはポリ メラーゼ反応の開始に必要な欠陥タンパク質が関与する。この必須タンパク質を コード化するポリメラーゼ遺伝子領域に特定の変化を導入することができる。

この突然変異はそのウィルスの複製の完全かつ不可逆的な停止をもたらす。さら に、この欠陥タンパク質をウィルスに供給することにより、正常なウィルス複製 を中断させることができる。

ポリメラーゼ遺伝子のある領域中に突然変異を導入または挿入することによって 、欠陥タンパク質の生産がもたらされる。この欠陥タンパク質は複製のためのプ ライマーとして作用するのでウィルスの複製にとって必須であるとの仮説を立て ているが、これに限定されるわけではない。しかし、この欠陥タンパク質はＲＮ ＡおよびＤＮＡポリメラーゼによる転写をプライムすることができない。あるい は、この欠陥タンパク質がブレゲノムＲＮＡの包膜化を許さないのかもしれない （Ｂｉｒｓｃｈら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：５５２−５５５（１９９０））。

本抑制法にはウィルス複製の他の側面も関与し得るので、その特許性は提案され るいかなる機構にも属さないことを注記しておく。

ウィルス複製の詳細な細部はウィルス間で異なるものの、その機構のある側面は 共通している。例えば、レトロウィルスについて最初に記述されたＲＮＡ依存性 ＤＮＡ合成は、現在では他の様々な設定下における遺伝情報の転移の手段であろ うと認識されている。これには肝炎ウィルスおよびカリフラワーモザイクウィル スの複製が含まれる。−重鎖ＲＮＡ鋳型から二本鎖ＤＮＡを合成するためには、 −ＲＮＡ鋳型から第１ＤＮＡ鎖を合成してその第１ＤＮＡ鎖から第２ＤＮＡ鎖を 合成するための酵素、これらの２本の鎖のそれぞれについてのプライマー、およ び第２ＤＮＡ鎖の合成を可能にすべく逆転写後にＲＮＡ鋳型を除去するための手 段が必要である。

本発明の目的のために、ウィルス複製におけるポリメラーゼ遺伝子産物の役割に 注目する。ポリメラーゼ遺伝子中に特定の変化を導入することによって、そのウ ィルスの複製を効果的に停止させることができる。したがってＲＮＡウィルスと ＤＮＡウィルスの両方、具体的にはＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼのために転 写をプライムするべくポリメラーゼ遺伝子産物を利用するウィルスに、本法を適 用することができる。本発明の方法の対象となるウィルスには、肝炎ウィルスな どのヘパドナウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス 、ピコルナウィルス、オルトミクンウイルス、バラミクソウィルス、コロナウィ ルス、ベスチウイルス、フラビウイルス、ＨＩＶなどのレトロウィルスが含まれ る。

本法にはポリメラーゼ遺伝子のある領域への突然変異の導入が含まれる。“突然 変異の導入“とは遺伝子中のヌクレオチドの置換、欠失、または付加（好ましく は置換）を意味する。突然変異を挿入するための領域を数種の方法で同定するこ とができる。様々なウィルス株のポリメラーゼ遺伝子またはポリメラーゼ遺伝子 産物間で保存されているアミノ酸位置を比較することによって、この領域を同定 することができる。例えば種々のＨＢＶ株のポリメラーゼ遺伝子を比較したとこ ろ、アミノ酸位置１６４が高度に保存されていることがわかった（表１を参照の こと）。残基１６４に対応するヌクレオチド２７９８に単一の点突然変異を導入 したところ、ウィルスの複製を中断させる欠陥タンパク質が生産された。

この方法で、他のウィルスのポリメラーゼ遺伝子領域を重要なアミノ酸位置につ いて精査することができる。これらの位置に突然変異を挿入し、得られた遺伝子 産物をウィルス複製に対する効果について試験することができる。

もう１つの方法は、ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスのポリメラーゼ遺伝子 中に無作為に突然変異を導入することである。次いで、このような変化によって 得られたタンパク質をウィルスＤＮＡ複製に対するそれらの効果について試験す る。

Ｂ型肝炎ウィルスを用いた研究から、ウィルス複製の停止機構にはブレゲノムＲ ＮＡの包膜化に必要なタンパク質あるいはポリメラーゼ反応の開始に必要な結合 性タンパク質の不完全な（欠陥のある）産出が関与すると思われる。このタンパ ク質は、ＨＢＶを含むすべてのヘパドナウィルスの複製生活環において重要な段 階であるＤＮＡの（−）鎖の逆転写のためのプライマーとして機能する。このこ とは、ポリメラーゼ反応の開始に必要なこのタンパク質中に突然変異を導入する ことによってウィルスの複製を抑制し得ることを示している。ヘパドナウィルス の場合、これには、ブレゲノムＲＮＡの包膜化および（−）鎖ＤＮＡの逆転写に 必要なタンパク質中に突然変異を導入することが含まれる。

レトロウィルスの場合、逆転写酵素に付随するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特 異的なりボヌクレアーゼ活性であるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａ　ｓｅ　Ｈ）に よってポリプリン領域から生産されるウィルスＲＮＡオリゴマーによって第２鎖 合成がプライムされる。リボヌク１ノアーゼＨはレトロウィルスポリメラーゼ遺 伝子のタンパク質産物である。したがって、部位特異的突然変異誘発法によって ＲＮａｓｅＨ遺伝子領域に突然変異を誘発し、次いでウィルス複製に対するその 欠陥タンパク質産物の効果を試験することができる。

突然変異誘発処理の方法は当該技術分野でよく知られている。とりわけ部位特異 的突然変異誘発法を用いれば、標的タンパク質中のほとんどすべてのアミノ酸位 置を意のままに操作することができる。Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、　、　Ａｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９：４２３（１９８５）（この文献は本明細書の一部 を構成する）を参照のこと。また、“ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｓｔｏｃ ｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９））の６１−７０頁のＢ ｉｇｕｃｈｉ、　Ｒ，、”Ｌｌｓｉｎｇ　ＰＣＲｔｏ@Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒ　ＤＮＡ”をも参照のこと。

ポリメラーゼ遺伝子中に突然変異を挿入するもう１つの手段は、ポリメラーゼ遺 伝子の核酸断片を構築することである。核酸合成法は知られている。一般的事項 については”５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　 ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ”（Ｎａｒａｎｇ、　Ｓ、　ｌｉA　Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８７））およびこの本に引用されている文献を参照 のこと。したがって、そのウィルスの核酸配列あるいは少なくともそのウィルス のポリメラーゼ遺伝子の核酸配列がわかっている場合には、合成構築物を作成す ることができる。

この合成構築物は天然の配列と比較して特定の部位に突然変異または変化を含有 するであろう。次に、発現したタンパク質をウィルス複製に対するその効果につ いて試験することができる。

数種のウィルスゲノムのヌクレオチド配列が公表されている。例えば、ＨＩＶの ヌクレオチド配列はＲａｔｎｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４ （１９８５）に認められる。肝炎ウィルスのヌクレオチド配列はＯｋａｗｏｔｏ ら、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９：２５７５−２５８３（１９８８） に認めることができ、ジエンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）を通して利用できる。

同定した標的ポリメラーゼ遺伝子領域の突然変異誘発処理後、ウィルスの複製に 対するその突然変異の効果を試験することができる。ウィルスの複製は、複製産 物またはウィルス転写物の存在を決定することによって検定できる。この方法で 、細胞溶解液と細胞培養培地をウィルス転写物、タンパク質、および複製型ウィ ルスＤＮＡの存在について分析することができる。ウィルスに特異的な転写物を 検出するために、固相放射線免疫検定法を用いて、ウィルスがコード化している タンパク質を細胞溶解液および培養培地の両方で同定することができる。具体的 には、突然変異型ウィルスで細胞をトランスフェクトした後、細胞質ＤＮＡのサ ザンプロットハイブリッド形成を用いて、突然変異型ウィルスゲノムの複製能力 を評価することができる。詳細については実験項を参照のこと。またハイブリッ ド形成の詳細については”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ取りｒｉｄｉｚａｔｆｏｎ 、＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｌａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５））にも認められる。

特定の突然変異型タンパク質が同定されたら、それを用いていくつかの方法でウ ィルスの複製を停止させることができる。この突然変異をＤＮＡ、ＲＮＡあるい はタンパク質レベルで供給することができる。

欠陥タンパク質との接触はウィルスの複製を中断させるので、欠損性の複製を達 成するためにこのタンパク質を投与することができる。より魅力的な方法は、ウ ィルスに感染した宿主細胞あるいはウィルス感染に対して感受性の宿主細胞中で このタンパク質を発現させることである。この方法として、その宿主細胞を形質 転換することができるベクター中に突然変異したポリメラーゼ遺伝子またはポリ メラーゼ遺伝子領域を入れることができる。組織特異的もしくは普遍的に発現さ せるのに適したプロモーターの下流にこの遺伝子を置く。肝炎の場合、ウィルス ＤＮＡを肝炎特異的プロモーターの下流に置くことによって肝炎中で発現させる 。他のウィルスについては、構成的プロモーターを使用することができる。

宿主細胞中で発現させる場合、突然変異型遺伝子を発現ベクター中に機能的に連 結し、これを宿主細胞中に導入することにより、その細胞による欠陥タンパク質 の発現を可能にすることができる。適当な調節領域を伴う遺伝子を適切な配向と 読み枠で提供することによって発現が可能になる。遺伝子構築法は当該技術分野 で知られている。具体的には、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　mＹ（１９８９） ）を参照のこと。

極めて多様な転写および翻訳調節配列を使用することができる。調節シグナルが 高レベルに発現する特定の遺伝子に付随しているアデノウィルス、ウシパピロー マウィルス、シミアンウィルスなどのウィルス供給源からこれらのシグナルを誘 導することができる。あるいは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの哺乳類 発現産物のプロモーターを使用することもできる。

真核宿主における突然変異型ウィルスＤＮＡの発現には真核性調節領域の使用が 要求される。一般にこのような領域にはＲＮＡ合成の開始を指示するに足るプロ モーター領域が含まれる。代表的なプロモーターにはマウス・メタロチオネイン Ｉ遺伝子のブ０（−一ター（Ｈａｍｍｅｒ、　Ｄ、ら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐ ｐｌ、　Ｇｅｎ、　１　：２７３−２８８（１９８２））Aヘ ルペスウィルスのＴｋプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　、　Ｃｅ１ｌ 　３１：３５５−３６５（１９８２））、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏ ｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０（１９８１））などが含まれ る。

他の有用なプロモーターにはアルブミン、アルファ・フェトプロティン、アルフ ァ・アンチトリプシン、レチノール結合性タンパク質などの肝臓特異的プロモー ターが含まれる（Ｆａｎｇ、　Ｘ、　Ｊ、ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１０ニア ８ｌ−７８７（１９８９））。

望ましい突然変異型ウィルスＤＮＡおよび機能的に連結されたプロモーターを受 容細胞中に、直線分子あるいはより好ましくは閉環共有結合環状分子でもあり得 る非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子として導入することができる。このような分子 は自律的に複製することができないので、目的のレセプター分子の発現は導入さ れた配列の一時的発現を介して起こり得る。あるいは、所望により、導入した配 列の宿主染色体への組込みを介して永続的な発現も起こり得る。

導入される配列を、受容宿主中で自律的に複製することができるプラスミドまた はウィルスベクター中に組込むこともできる。ｃＤＮＡ発現ベクターにはＯｋａ ｙａｍａ、　Ｈ，、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３：２８０（１９８３） などに記述されているものが含まれる。ウィルスベクターにはＷＯ３９１０７１ ３６およびその引用文献に開示されているレトロウィルスベクター（特に肝細胞 中での発現用）が含まれる。

この方法では、特定の突然変異をコード化している対応する核酸配列またはその 一部分をウィルス性疾患に罹っている宿主の細胞中に導入する。その核酸配列の 発現はそのウィルスの複製を妨害するタンパク質をもたらす。

ウィルスの複製を破壊するもう１つの手段は、宿主細胞にアンチセンスＲＮＡを 提供することである。アンチセンスＲＮＡをウィルスに提供することもまた、複 製を妨害する。アンチセンス調節については、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕ ｒｅ　３１３ニア０３−７０６（１９８５）　；　Ｐｒｅｉｓｓら、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３１３：２７−３２（１９８５）　；　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌOｃｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ ８２：１４４−１４８（１９８５）　；　Ｋ１１１ら、　Ｃｅ１ｌ　４２：１２ ９−１３８（１９８５）　；　Ｉｚａｎｔら、５ｃｉｅｎｃ■@２２９＋３４５ −３ ５２（１９８５）に記述されている。アンチセンスＲＮＡを供給することにより 、天然に存在するＲＮＡの作用が減少する。したがってアンチセンス調節は、転 写されるＤＮＡ配列がそのウィルスの目的のポリメラーゼ遺伝子またはポリメラ ーゼ遺伝子領域に対して少なくとも部分的には相補的であるような遺伝子からな るＤＮＡ配列を細胞中に導入することによって達成され得る。上述のように、導 入されるＤＮＡはその宿主細胞によって認識される転写開始領域の転写制御下に あるであろう。導入されたＤＮＡの転写はウィルスのＲＮＡと相補的なアンチセ ンスＲＮＡの複数コピーをもたらし、そして天然に存在するＲＮＡの作用の減少 をもたらすであろう。さらに、特定のウィルス遺伝子領域をまたぐリポザイムも 治療剤として機能し得る（Ｓａｒｖｅｒ、　Ｎ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７： １２２２−１２２５（１９９０））。

突然変異型ウィルスゲノムを構築し、それを用いて宿主細胞をトランスフェクト および感染させ得ることも理解される。この突然変異型ウィルスは欠陥タンパク 質を発現させることができる。したがって、この細胞はウィルスの攻撃を効果的 に撃退することができる。宿主が既に非改変型のウィルスに感染している場合に は、欠陥タンパク質を発現する突然変異型ウィルスに宿主を感染させることによ り、非改変型ウィルスの複製の停止を導（ことができる。

本発明の方法はウィルス感染に対処するためだけでなく、ウィルス感染を予防す るためにも利用できる。ウィルス感染を予防したり、あるいは宿主にウィルスが 侵入した途端にそのウィルスを撃退するために、欠陥タンパク質または欠陥タン パク質をコード化する核酸を含有するベクターからなる組成物を投与することが できる。

複製を抑制するために欠陥ポリメラーゼタンパク質を使用することを総論的に議 論しているが、欠陥タンパク質がそれ自身のウィルスに特異的であることは理解 される。すなわち、Ｂ型肝炎つィルスポリメラーゼ遺伝子中の突然変異はＢ型肝 炎ウィルスの複製を抑制もしくは停止させる欠陥タンパク質をもたらすであろう 。

上述のように、本発明の組成物および方法を用いることにより、極めて多様なＲ ＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスのウィルス複製を停止させることができる。

本発明の一態様として、肝炎ウィルス、具体的にはＢ型肝炎ウィルスの複製を停 止させるために本発明の方法および組成物を利用する。部位特異的突然変異誘発 法により、少なくとも１つの突然変異をこのウィルスのゲノム中に挿入すること ができる。ヌクレオチド２６０６付近からヌクレオチド２８２３付近までの範囲 、一般的にはヌクレオチド２７００付近からヌクレオチド２９００付近の範囲、 好ましくはヌクレオチド２７９８付近にあるヌクレオチド位置にこの突然変異を 導入することができる。位置２７９８に突然変異を挿入する場合、その突然変異 はＡからＣあるいはＴからＣへの変化を伴うであろう。この特定の突然変異はＴ ｈｒまたはＳｅｒからＰｒｏへの対応するアミノ酸変化をもたらすであろう（表 １を参照のこと）。これによって得られる突然変異は、Ｂ型肝炎ウィルスの複製 を完全かつ不可逆的に停止させる。

ＨＢＶ複製を停止させるためには、次いで、突然変異を有するＤＮＡ種が逆転写 酵素反応における欠陥３．５プレゲノムＲＮＡをプライムするために用いられる 。あるいは、欠陥タンパク質をコード化するウィルスＤＮＡの特定の断片を肝臓 特異的プロモーターの制御下で宿主細胞に供給することができる。さらに、肝臓 特異的プロモーターによって駆動される突然変異を含有するヒトＨＢＶゲノムを 、野生型肝炎ウィルスの複製の停止を導く感染性の妨害ウィルス粒子を生産する ように構築することができる。

もう１つの態様として、ＨＩＶ複製を抑制することができる。つまり、このウィ ルスのゲノム中に少な（とも１つの突然変異を挿入する。この突然変異をＨＩＶ ポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド領域中に導入する。一般的には、ヌクレオチ ド１２００付近からヌクレオチド５５００付近までの範囲、より一般的にはヌク レオチド１５００付近からヌクレオチド４７００付近までの範囲にあるヌクレオ チド位置に突然変異を導入する。得られた突然変異を、本明細書に開示する方法 を用いて、ウィルスの複製に対する効果について調べるであろう。

ウィルス複製停止の機構にはプレゲノムＲＮＡの包膜化に必要なタンパク質ある いはポリメラーゼ反応の開始に必要な結合性タンパク質の不完全な（欠陥のある ）産生が関与すると考えられる。このタンパク質は（−）鎖ＤＮＡの逆転写のた めのプライマーとして機能する。しかしこのウィルス複製の抑制が、ポリメラー ゼ遺伝子内に突然変異を挿入すること以外には、本明細書に開示する特定の方法 に依存しないことは理解される。したがって、実際には他の機構あるいは別個の 機構がウィルス複製の停止に関与していることもあり得る。

以下の実施例は例示のために提供するのであって、限定を意図するものではない 。

実験項 ＨＢＶ感染に対して血清学的に免疫性である個体の肝臓中のエビソーム）ＩＢＶ ＤＮＡが過去に同定されている（Ｂｌｕｍ、　Ｈ，Ｅ、ら、Ｌｉｖｅｒ　８：３ ０７−３１６（１９８ｇ））。この個体の肝臓から得たウィルスゲノムのクロー ニング、微細構造分析、および生物学的特性化が行われた。クローン化したゲノ ムは、最も密接に関連する血清型ａｄＷ２の感染性ＨＢ　Ｖ　（Ｂ、　Ｎ、　Ｆ ｉｅｌｄｓ、　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＣ，Ｆ、　Ｆｏｘ編、“Ａｎｉｍａｌ 　ｖｉｒｕｓ　ｇ■獅■ ｔｉｃｓ”　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ（１９８０））中５７−７０頁のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ、@Ｐ、ら、ゴｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ 　Ｂ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　１ｄｅ獅狽奄■奄モ≠■ ｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅｓ”）と比較して４ ８塩基変化を示した。これらの突然変異のうちの１つはウィルスゲノムの前核（ ｐｒｅ−ｃｏｒｅ）領域の末端に終止コドンを作っており、これが肝炎Ｂｅ抗原 （ＨＢｅＡｇ）の形成を妨げていた。Ｈｕｈ７肝癌細胞中へのトランスフェクシ ョンによるこのクローン化ＤＮＡの機能分析は、ウィルスＤＮＡ複製を遮断する 欠陥を除き、すべての主要なウィルス転写物、ウィルス核およびエンベロープタ ンパク質の合成能力を示した。ＤＮＡ合成に関するこの欠陥の遺伝的根拠が、ス レオニンまたはセリンのプロリンによる置換をもたらす位置２７９８の一つのミ スセンス突然変異であることがわかった。この発見はこのポリメラーゼ遺伝子領 域のくおそらく末端タンパク質かあるいはブレゲノムＲＮＡの包膜化に必要なタ ンパク質をコード化するという）ウィルスの生活環における重要な役割を示唆す ると共に、ウィルスの複製を停止させるための特定の治療戦略を示唆している。

この患者の肝臓中のエピソームＨＢＶ　ＤＮＡの微細構造を明らかにするため、 ３対のＨＢＶ特異的プライマー（表１）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　Ｃ Ｒ）によって全肝臓ＤＮＡからウィルスゲノムを増幅した。増幅したウィルスＤ ＮＡ断片をｐＧＥＭ−７中にクローン化することにより、予期される３種の重複 ＨＢＶクローン１−８，２−１３および３−１（表１）を得た。これらのクロー ンを用いてＨＢＶ　ＤＮＡ分子を再構築し、ｐＧＥＭ−７中にクローン化するこ とにより、全長ＨＢＶゲノム５−１５を得た。これらのクローンの直接配列決定 を行うことにより、ＨＢＶゲノム５−１５の完全なヌクレオチド配列を決定した （データはＧｅｎｂａｎｋに提出した）。このゲノムは３２２１塩基の長さを有 し、既知のＨＢＶ　ＤＮＡと同一の遺伝的構成である。公表されたＤＮＡ配列と の比較により、ＨＢｓＡｇＢｓＡｇサブタイプｗ　２　（Ｂ、　Ｎ、　Ｆｉｅｌ ｄｓ、　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＣ，Ｆ、　Ｆｏｘ編、　”Ａｎｉｍａｌ　ｖ ｉｒ浮刀@ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ（１９８０））中５７−７０頁のＶａｌｅｎｚｕｅｌａA　Ｐ、ら、ゴ ｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｐａｔｉ ｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　■р■獅狽奄■奄■ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　＋ａａｊｏｒ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅｓつと最も密 接な相同性を有することが明らかになった。このサブタイプと比較したところ、 ＨＢＶ５−１５中に合計６３個の突然変異が検出され、そのうち４８個はアミノ 酸置換をもたらすものであった。ＰＣＲ増幅によって誘発された突然変異を排除 するために、別個のＰＣＲ増幅産物のクローニングと配列決定を行うことにより 、アミノ酸変化を導く突然変異を確認した。突然変異はすべての読み取り枠中に 同定され、この突然変異体を除けば異なるＨＢＶ　ＤＮＡと他のヘパドナウィル スの間で最も高度な相同性を示す領域（参考文献３およびＧｅｎｂａｎｋから入 手できるデータ）であるブレＣ／Ｃ領域中に最も高い頻度（１０００塩基あたり ２６塩基）で同定された。これらの突然変異はプレＣ読み枠の末端に枠内終止コ ドンをもたらし、それゆえに肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）への前駆体であるブレ Ｃ／Ｃタンパク質をコード化することができな（なったのである。ブレＣ読み枠 の末端の終止コドンは患者の肝細胞性癌腫中に組み込まれたウィルスＤＮＡ中に は認められず（非開示データ）、このことはこの突然変異が感染性ウィルス中に 存在したのではなく、むしろウィルスＤＮＡの組込み後、非腫瘍性の肝臓におけ るウィルス複製の進行中に起こったことを示唆している。

上述した構造上の特徴からこのウィルスの生物学に関して直接的な結論を引き出 すことができなかったので、この突然変異ウィルスゲノムの機能的な能力をイン ビトロで分析した。Ｈｕｈ７肝癌細胞（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、　Ｆｉ、ら、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４２　：３８５８−３８６３（１９８２乃のトラン スフェクション後、細胞溶解液および細胞培養培地をウィルス転写物、タンパク 質および複製型ウィルスＤＮＡの存在について分析した。

図１に示すように、ＨＢＶ特異的プローブとのハイブリッド形成実験によって、 頭−星型（ＨＴＤ）ａｄｗ（“野生型”）でトランスフェクションした細胞およ びＨＴＤ５−１５（“突然変異型“）でトランスフェクションした細胞の両方に 、それぞれ２．２および３．６に頃の２つの主要な転写物が存在することが明ら かになった。

トランスフェクションしなかった細胞（非開示データ）中、あるいは不完全ＨＢ Ｖクローン１−８（表■）でトランスフェクションした細胞中にはウィルス転写 物が存在しなかった。メツセージのレベルはＨＴＤ５−１５でトランスフェクシ ョンした細胞中よりＨＴＤａｄｗでトランスフェクションした細胞中のほうが高 かったが、２．２ｋｂサブゲノムメツセージに対する３、６ｋｂブレゲノムメツ セージの比率は極めて類似しているようである。これらの発見は突然変異型ウィ ルスゲノムがすべての主要なＨＢＶ転写物を合成する能力を冑することを示して いる。

ＨＢＶがコード化しているタンパク質を、細胞溶解液および培養培地の両方で、 面相放射線免疫検定法によって同定した。ＨＴＤ　ａｄｗでトランスフェクショ ンしたＨｕｈ７細胞およびＨＴＤ　５−１５でトランスフェクションしたＨｕｈ ７細胞は共にかなりの量のＨＢｓＡｇおよびＨＢｃ／ｅＡｇを培地中に分泌し、 一方、不完全クローンＨＢＶ　１−８でトランスフエフシンした細胞はウィルス 抗原を生産しない（非開示データ）。位置１８９９の終止コドン突然変異から予 期されるように、代謝的ラベル化および免疫沈降研究により、ＨＴＤ　５−１５ でトランスフェクションした細胞が大きいブレＣ／Ｃタンパク質とその小さいプ ロセシングされた生成物（通常ＨＢｅＡｇとして細胞培養培地中に分泌される） を合成する能力を有さないことが明らかになった（非開示データ）。

突然変異型ゲノム５−１５の複製能力を評価するために、トランスフェクション 後のＨｈｕ７細胞から単離した細胞質ＤＮＡのサザンプロットハイブリッド形成 によってＨＢＶ　ＤＮＡ種を分析した。図２に示すように、複製性のＨＢＶ　Ｄ ＮＡ種がＨＴＤ　ａｄｗでトランスフェクションした細胞中にのみ検出され、不 完全クローンＨＢＶ　１−８（陰性対照）またはＨＴＤ　５−１５でトランスフ ェクションした細胞中にはウィルスＤＮＡが存在しなかった。ＨＴＤ　ａｄｗで トランスフェクションした細胞中のウィルスＤＮＡ配列は一本鎖で部分的に二本 鎖の複製型中間体ならびに完全な弛緩環状分子である（Ｂｌｕｍ、　Ｈ，Ｅ、ら 、Ｖｔｒｏｌｏｇｙ　１３９：８７−９６（１９８４）　）。

ＨＴＤ　ａｄｗ＊たはＨＴＤ　５−１５でトランスフェクションされた細胞の細 胞溶解液および培養培地中のウィルス抗原およびＤＮＡ種を、ＣｓＣ１密度勾配 遠心分離した後、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃ／ｅＡｇならびにＨＢＶ　ＤＮＡ配列 について個々の分画を分析することによってさらに特徴づけた。ＨＴＤ　ａｄｗ でトランスフェクションした細胞中ではウィルスＤＮＡがＨＢｃ／ｅＡｇ（核粒 子）に結合しており、培養培地中ではＨＢｓＡｇ（ウィルス粒子）およびＨＢｃ ／ｅＡｇ（核粒子）に結合している。予想どおり、ＨＴＤ　５−１５でトランス フェクションしたＨｕｈ７細胞から得られる細胞溶解液または培養培地のＣｓＣ １分画中では、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇについては陽性であったものの、ウ ィルスＤＮＡ種は検出不能であった。これらの発見は、Ｈｕｈ７細胞はウィルス 複製を支持するが、突然変異型ＨＢＶゲノム５−１５はこの系中で複製できない ということを立証している。

先端欠失型複製可能ａｄｗＨＴＤ構築物ａｄｗＲ９中にこの突然変異型ウィルス ゲノムの特定の領域をサブクローニングすることにより、この複製欠損性の分子 的根拠を決定した（図３）。特定のＤＮＡ断片を交換し、クローニングし、Ｈｕ ｈ７肝癌細胞をトランスフェクションすることにより、複製欠損性の原因である 突然変異の位置を突然変異型ウィルスゲノムマツピングの位置２６０６（Ａｐａ ｌ）と２８２３（ＢｓｔＥＩＩＨ図３および図４）の間の領域に特定することが できた。突然変異型ウィルスゲノムはこの領域内でａ　ｄ　ｗ　２　（Ｂ、　Ｎ 、　Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＣ，Ｆ、　Ｆｏｘ編、　”Ａｎ ｉｍａｌ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　 ］：ｎｃ、　、　Ｎ■浴@Ｙｏｒｋ（１９８ ０））中５７−７０頁のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、ら、ゴｈｅ　ｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔ奄狽奄■ Ｂ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅｓ”jと比較し てミスセンス突然変異を２つだけ有する（ヌクレオチド位置２７９８および２８ ２０）。ａｄｗＲ９またはＲ９ＲＢ　５−１５（図３）の部位特異的突然変異誘 発処理と上記２７９８または２８２０突然変異のいずれかを保持するプライマー によって、ＰＣＲ増幅で４種のクローンを作成した（表３）：位置２７９８にＡ からＣへの突然変異を有するａｄｗ　Ｒ９（クローン２−６）、位置２８２０に ＧからＣへの突然変異を有するａｄｗ　Ｒ９（クローン５−’３　）、位置２７ ９８にＣからＡへの突然変異を有するＡｖａ　Ｉａ（クローン６−６）、および 位置２８２０にＣがらＧへの突然変異を有するＡｖａ　Ｉａ（クローン３−３） 。Ｈｕｈ７肝癌細胞をこれらのクローンでトランスフェクションした後、クロー ンａｄｗ　Ｒ９の位置２７９８におけるＡからＣへの突然変異がウィルスＤＮＡ を複製欠損型にし、一方、同じ位置におけるＡｖａ　ｌａのＣからＡへの突然変 異が複製能力を回復させることを立証することができた（図Ａ）。対照的に、位 置２８２０における突然変異は親構築物（クローン３−３およびクローン６−６ ）の複製能力や複製欠損性に影響を与えなかった。これらの発見は、ウィルスゲ ノムの位置２７９８におけるＡからＣへの突然変異（これはＴｈｒからＰｒｏへ の置換を導く）が上記患者の肝臓から単離されたこの突然変異型ウィルスゲノム の複製欠損の分子的根拠であることを明確に立証している。

ヘパドナウィルスポリメラーゼの構造およびバイトロバシー比較分析（Ｔｈｕｄ ｙａｋｏｖ、　Ｙ、　Ｅ、ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４３：１１５−１ １８（１９８９））ならびに実験的研究（Ｂｏｓｃｈ、　Ｖ、ら、u ｉｒｏｌｏｇｙ　１６６：４７４−４８５（１９８８）　；　Ｂａｒｔｅｎｓｃ ｈｌａｇｅｒ、　１１．ら、ＥＭＢＯＪ、　７：４１８５−S１９２（１９８８ ） ；　５ｃｈｌｉｃｈｔ、　Ｈ，−Ｊ、ら、Ｃｅ１１５６：８５−９２（１９８９ ））は、ウィルスポリメラーゼ遺伝子の５′プライム領域が“末端タンパク質” （ＴＰ）をコード化していることを示唆している。このタンパク質は（−）鎖Ｄ ＮＡの５′末端に結合し、おそらくヘパドナウィルスの複製戦略の中心的な特徴 である逆転写のプライマーとして機能すると思われる（Ｓｅｅｇｅｒ、　Ｃ，ら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：４７７−４８４（１９８６）　；　ｆｉｌｌ、　Ｈ ，ら、　Ｊ、　ＶｉｒｏｌA　６１：９０４−９ １１（１９８７））。カモＢ型肝炎ウィルスポリメラーゼ遺伝子の突然変異分析 は、この遺伝子の５°領域への枠内挿入が活性ポリメラーゼの生産を実際に除去 することを立証した（！３ｃｈｌｉｃｈｔ、　Ｈ，−Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ　５６： ８５−９２（１９８９））。このデータは、ポリメラーゼ遺伝子のＴＰ領領域ウ ィルスの複製に重要であることを強く示唆している。

さらに、プレゲノムＲＮＡのパッケージング（ゲノム詰め込み）には機能的に無 傷のポリメラーゼ遺伝子が必要であると思われる。この解釈と合致して、筆者ら の突然変異体中のヌクレオチド位置２７９８に同定された突然変異、あるいは“ 野生型″ウィルスの突然変異誘発処理によって作成した突然変異は、ウィルスの 複製を停止させる。この突然変異の意義は、公表されたＨＢＶ　ＤＮＡ配列（Ｏ ｋａｍｏｔＯら、　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６９：２５７５−２５８３（ １９８８））およびＧｅｎｂａｎｋを通して利用できる配列との比較によって示 されるように、ポリメラーゼ遺伝子産物の位置１６４のアミノ酸がすべてのＨＢ Ｖ株において高度に保存されている（１１／　１４Ｔｈｒ、　３／　１４Ｓｅｒ ）という事実によって強調される。この停止の機構はおそら＜ＴＰまたはゲノム ＲＮＡの色原化に関与するタンパク質のＴｈｒまたはＳｅｒからＰｒｏへの置換 による立体配座の変化を介して媒介されると思われる。これらのタンパク質の機 能に対するこのポリメラーゼ遺伝子領域の寄与を明確にするための研究が現在行 われている。

野生型ＨＢＶ　ＤＮＡおよび突然変異型ＨＢＶ　ＤＮＡによるＨｕｈ７肝癌細胞 の同時トランスフェクションは、この突然変異体が野生型ＨＢＶの複製を停止さ せる能力を有することを立証した。表４を参照のこと。ＨＢＶおよび非関連ＤＮ ＡをＨｕｈ７細胞のトランスフェクションに使用した場合、ＨＢＶウィルスＤＮ Ａと全細胞ＤＮＡとのハイブリッド形成実験によって立証されるように、肝炎ウ ィルスの複製は妨害されなかった。突然変異型ウィルスＤＮＡと同時トランスフ ェクションした細胞中にはウィルスＤＮＡが検出されず、このことはこの突然変 異体が野生型肝炎ウィルスの複製を停止させ得ることを示している。

非突然変異型ウィルスの複製を停止させるという突然変異型ウィルスの能力は重 要な含意を有する。ウィルスに感染している個体または宿主において、この突然 変異型ウィルスは感染細胞におけるウィルスの複製を停止させることができ、ウ ィルスが他の細胞に蔓延することを防止することができる。

本明細書で言及したすべての特許出願および刊行物は本発明が関連する技術分野 の当業者の技術水準を示している。すべての刊行物と特許出願は本明細書の一部 を構成する旨を特に個別に示したかの如くに本明細書の一部を構成する。

明瞭な理解を目的として明示および例示のために上述の発明をいくらか詳細に記 述したが、添付の請求の範囲の範囲内でいくらかの改変および修飾を行い得るこ とは明らかであろう。

表　１・種々のＨＢＶ株のポリメラーゼ遺伝子におけるＡＡ位置１６４の保存の 比較 ＨＢＶ株　蔀ユ旦　肛−Ｕ胆 °　突然変異体（複製なし）　Ｐｒｏ　Ωｃｃ表　２：患者の肝臓から得たＨＢ Ｖ　ＤＮＡのＰＣＲ増幅とクローニングに用いたＨＢＶ特異的オリゴヌクレオチ ドブライマーの位置と配列ウィルス性肝炎の経歴を有する７３才の白人男性から 転移性肝細胞性癌腫（ＨＣＣ）が提供された。放射線免疫検定法で決定したとこ ろ、ＨＢＶ血清学はＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ１ｇＭに関して陰性であり、抗Ｈ Ｂ　ｃ　Ｉ　ｇＧ、抗ＨＢｅおよび抗ＨＢｓに関して陽性であった（Ａｂｂｏｔ ｔ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ）。スポット・プロット・ハイブリ ッド形成によれば、血清中にＨＢＶ　ＤＮＡは検出されなかった。検層解剖で得 た肝臓およびＨＣＣ組織を、使用するまで一８０℃で保存した。

Ｔａｑポリメラーゼならびに５“および３゛末端に制限酵素部位を保持するプラ イマー（表２）を用いて肝臓ＤＮＡを増幅した。５ａｉｋｉら（Ｓａｉｋｉ、　 Ｒ，ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４４９１（１９８ｇ））に従って ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。簡単に述べると、ＤＮＡ　５０ｎｇ １ＴａＱポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　２．５単位 、各ｄＮＴＰ　２００ｇＭ、各プライ７−１μＭ、５０＋ｌ／Ｉ　ＫＣｌ、１０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，３）、１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、および０．０ １％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチンを含有する５０μｍ反応体積中で標的配列を増幅 した。プログラマブルＤＮＡサーマルサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　 Ｃｅｔｕｓ）中で４０サイクルこの反応を行った。試料を１．５分間９４℃に加 熱しくＤＮＡの変性）、１５分間５０℃に冷却しくプライマーとのハイブリッド 形成）、７２℃で３分間インキュベートした（ポリメラーゼ反応）。ＰＣＲ後、 鎖の合成を完結させ、適当な制限エンドヌクレアーゼによる切断を保証するため に、クレノーポリメラーゼ５単位を添加した。このＰＣＲ混合物をエチジウムプ ロミドの存在下１．２５％アガロースゲルで分画した。標的配列を含有するバン ドを取り出し、ガラスピーズ（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ、 、Ｌａ　１ｏ１１ａ、　ＣＡ）によってＤＮＡを単離した。精製した断片をｐＧ ＥＭ−７Ｚｆ（＋ＸＰｒｏ＋ａｅｇａ　）中に連結し、ＤＨ５αＦ′細胞（ＢＲ Ｌ）中にクローン化した。クローン化したＤＮＡを標準的なプラスミド調製法に よって調製した。３種のクローン１−８．２−１３および３−１（表２）を用い て完全なサイズのウィルスゲノム（クローン５−１５）を再構築−した。トラン スフェクション実験のために、ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＨＢｓＡｇサブタイプａｄｗ（ “野生型゛）の頭−電型二量体とＨＢＶ　ＤＮ、Ａ　５−１５の頭−電型二量体 をｐ　ＧＥＭ−７Ｚ　ｆ　（＋）中に再構築し、上述のようにクローン化した。

Ｇｅｍ　Ｓｅｑ　ＲＴ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＴ７ポリメラーゼ系（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）を用いて記述されｉ”ｌ、Ｎるようにして（夏１ｅｒｅｎｄｏｒ ｆ、　Ｒ，Ｃ，ら、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｗｏｌ、　１５２：５５６−５６２ （１X８７） ）、ＤＮＡ配列分析を行った。

表２ プライマー対１−８゜ １：　３１１９−３１４２　５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＡ ＧＴＣＡＧＧＡＡＧ−３’２：　１４４９−１４２８　５’−ＣＧＡＴＣＧＡＴ ＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＣＧＴＡ−３’標標的列　：　Ｓ’−５ａｃ　Ｉ 　１５５２　ｂｐ　Ｃ１ａ　１−３’　（りＯ−：／１−８）プライマー対２− １３： ３：　１８６５−１８８９　５’−ＣＡＧＭｎＣＭＧＣＣＴＣＣＭＧＣＴＧＴＧ ＣＣｎＧＧ−３’４：　０２４Ｂ−０２２４５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＧ ＣＧＧＴＡＴｒＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＧ−３’標標的列　：　５’−Ｅｃａ 　Ｒ１１６０４ｂｐ　Ｘｂａ　１−３’　（りＯ−：／２−１３）プライマー対 ３−１＝ Ｓ：　１２８１−１３０７　ｓ′−ｃｃｃＡＧｃｙｃｃｎｃｃｃＧＣｎＧｍｖｃ ｃ丁ＣＧＣＡＧＣ−３’６：　２４３０−２４１０　５’−ＧＡＡＡＧＣＴｒＣ ＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴｒＧＡＧＡ−３’ｔｙｙ）配列＝　５’−５ａｃ 　Ｉ　１１５０　ｂｐ　Ｈｊｎｄ　ｌｌｌ−３’（りｏ−：／３−１）表　３： インビトロで突然変異誘発処理したＨＢＶ　ＤＮＡクローンおよびそれらの親構 築物のＤＮＡ配列 ２３１２から２３３３までの領域にまたがる属プライマー（ＣＣ−２２）と、位 置２７９８におけるＴからＧへの突然変異（ＡＴＣ−４０）または位置２８２０ におけるＣからＧへの突然変異（ＡＣＣ−４０）のいずれかを保持する２８３３ から２７９４までの領域にまたがるプライマーを用いて、クローンａｄｗＲ９お よびＲ９５−１５（図３参照）をＰＣＲで増幅したＣ表１参照）。増幅した断片 をアガロースゲル電気泳動およびＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ 、、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で精製した。

ＡｐａｌおよびＢｓｔＥＴＩで消化した後、その断片をａｄｗ　Ｒ９（図３参照 ）中にクローニングすることにより、期待通り単一の点突然変異を保持する４種 のクローン２−６．３−３．５−３および６−６を得た。

２−６　２７９１　−　Ｃ−２８２５−５−３２７９１−Ｃ−２８２５ ＾ｖａ　Ｉａ　２７９１　−ＧｋＧＧＧｋｋＣＣＣＡＣＡ（”ＧＴＡＧＣＧ　Ｃ ＡＴＣＡ？１１’ＴＴＣＣＧＧＧＴ−２８２５−６−６２７９１−　＾　−２８ ２５ コーコ　２）９１−　Ｇ　−２８２５−６．６− Ｆｉｇｕｒｅ　２ ＨＢ　Ｖ構築物 Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｌ２− Ｆｉｇｕｒｅ　４ 要約書 本発明はウィルスの複製を抑制するための方法および組成物に関する。具体的に は、ウィルスポリメラーゼ遺伝子の特定の領域に少なくとも１つの突然変異を導 入することにより、ウィルスの複製の完全かつ不可逆的な停止を達成する。本発 明の方法はウィルス感染を防止するためにも、あるいはウィルス感染を治療する ためにも使用できる。

国際調査報告 →瑠−１Ｉ１１１１＋１１＾””’＝’　＝　ＰＣ／ＩＪＳ９１　／　０２７＋ ｊｌＰＣＴ／ＬＪＳ９１／７２７９コ ＤＥＴＡＩＬＥＤ　ＲＥＡＳＯＮＳ　ＦＯＲ）ＩＯＬＤＩＩＩＧ　ＬＡＣＫ　Ｏ Ｆ　ＬＪＮＩＴＹ工ｈｅ　ｚｎｖｅｎｔＬｏｎｓ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉ−Ｖ 　ｄｏ　ｎｏｔ　１ｌｅｅｔ　ｔｈｅ　ｒｅｑｕｔｒｅｍｅｎｔｓｅｏｒ　１Ｊ ｎｉｔｙ　ｏｆ　：ｎｖ＊ｎｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　 ｒｅａｓｏｒ＋＊＋Ｇｒｏｕｐ　Ｉ　Ｌｌｌ　ｔｏ　ａ　ｆｉｒｓｔ　ｌ１ｅｔ ｈｏｄ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｖｘｒａｌ　ｒｅｐｉｉｃａｔ４ｏｎｂ ｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　＊　ｍｕｔａｔｘ口ｎ　ＬｌｌＬロ　ｔｈｅ　ｐ ｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｇｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅＧｒｏｕｐ　ＩＩ　ｉｓ　ａ　５ ｅｃｅＩｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｖｉｒａｉ　ｒｅ ｐｌｉｅａｔｉｏｎｂｙ　ｐｒｏｖｚｄｉｎｇ　ａ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｖｉ ｒａｌ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；　ｔｈｅ　５ｅｃｏｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｍａｙ 　ｂｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｚｎｄｅｐｅｎｄ＊ｎｔｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ。

Ｇｒｏｕｐ　ＩＩ工　ｉｌｌ　ＩＩ　ｆｉｒｓｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ、ａ　ｒｅｃ ｏｍｂｉｎｍｎｔ　ｇｏｎｅ　＋＋ｎｅｏｄｉｎｇ　ａｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｖ ｌｒａよ　ｐｏｌｙ＋＊ｅｒａ霞ｅ、　＾＊　ｒｅｃｉｔｅｄ、ｔｈｅ　ｒ＊ｃ ｏｍｂｉｎａｎｔｇ＃ｎｅ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｃａｒ ｒｙｉｎｇ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈＯｄ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ。

Ｇｒｏｕｐ　ｒＶ　Ｌｓ　ａ　−ｅｅ口ｒ＋ｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ、ａ　ｖｅｃｔ ｏｒ　ｃｏｎｔａｔｎｘｎｇ　ａ　ｇｅｎｅｅｒＩＣｏｄｉｎｇ　ａ　ｄｅｆｅ ｃｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｒｅｑｕｔｒ ＊ｄ　ｆｏｒｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　ｆ。

Ｇｒｏｕｐ　Ｖ　ｉｇ　ａ　ｔｈｉｒｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ、ａ　ｈｏｓｔ　ｃｅ ｌｌ　ｃ口ｍｐｒｉｓｉｎｇ　ａ　ｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈ　ａ　ｇｏｎｅ　ｅｎ ｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓｇｅ、ｗｈｉｃｈ　 ｉｓ　ｒ＋ｏｔｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｇｒ ｏｕｐ　Ｌ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルスの複製を抑制する方法であって、該ウイルスのゲノムのポリメラー ゼ遺伝子領域中に突然変異を導入することからなる方法。
2. ２．該ウイルスがヘパドナウイルスである第１項の方法。
3. ３．該ウイルスが肝炎ウイルスである第２項の方法。
4. ４．該肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである第３項の方法。
5. ５．該突然変異が該ウイルスゲノムのヌクレオチド２６０６付近からヌクレオチ ド２８２３付近までのヌクレオチド位置に導入される第４項の方法。
6. ６．該突然変異がヌクレオチド２７９８に導入される第４項の方法。
7. ７．該ウイルスがレトロウイルスである第１項の方法。
8. ８．該レトロウイルスがＨＩＶである第７項の方法。
9. ９．宿主細胞におけるウイルスの複製を防止または抑制する方法であって、該ウ イルスを複製を抑制するのに有効な欠陥ポリメラーゼ遺伝子産物と接触させるこ とからなる方法。
10. １０．該ウイルスがヘパドナウイルスである第９項の方法。
11. １１．該ヘパドナウイルスが肝炎ウイルスである第１０項の方法。
12. １２．該肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである第１１項の方法。
13. １３．該遺伝子産物が単一のアミノ酸置換を有する第９項の方法。
14. １４．該アミノ酸置換がアミノ酸１６４に存在する第１３項の方法。
15. １５．該接触が、該宿主細胞中に突然変異型ウイルスポリメラーゼ遺伝子を導入 し、欠陥ポリメラーゼ遺伝子産物を発現させることからなる第９項の方法。
16. １６．該ポリメラーゼ遺伝子が組織特異的プロモーターによって調節される第１ ５項の方法。
17. １７．該組織が肝臓である第１６項の方法。
18. １８．ウイルスの複製を抑制することができる欠陥ポリメラーゼタンパク質をコ ード化している組換えウイルスポリメラーゼ遺伝子。
19. １９．少なくとも１つの突然変異を含有する第１８項の遺伝子。
20. ２０．第１８項の遺伝子を含有するベクター。
21. ２１．第２０項のベクターで形質転換された宿主細胞。