DE69800659T2

DE69800659T2 - Zusammensetzungen die verwendbar sind zur Verabreichung von therapeutisch wirksamer Polynukleotiden in eine Zielzelle und ihre Verwendung in Gentherapie

Info

Publication number: DE69800659T2
Application number: DE69800659T
Authority: DE
Inventors: Rainer Bischoff; Hanno Kolbe; Klaus Schughart
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2001-10-18
Anticipated expiration: 2018-07-02
Also published as: DE69800659D1; JP3499137B2; GR3035797T3; ES2156421T3; PT890362E; US6656734B1; EP0890362A1; DK0890362T3; JPH11106355A; ATE200226T1; CA2242035A1; CN1212890A; AU7394298A; EP0890362B1; AU707186B2; CA2242035C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die zur Einführung einer therapeutisch wirksamen Substanz in eine Zielzelle, insbesondere in eine Vertebratenzelle, noch genauer in eine Säugerzelle, verwendet werden kann. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Zusammensetzung zur Herstellung eines Vektors zur Übertragung eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in eine Zielzelle.
Erbkrankheiten sind insbesondere durch eine Funktionsstörung bei der Expression spezifischer Gene oder durch die Expression nichtfunktioneller mutierter Polypeptide bedingt. Die Mukoviszidose zum Beispiel wird als die am häufigsten vorkommende, tödlich verlaufende Erbkrankheit (1/2000) mit einer mittleren Lebenserwartung von 25 bis 30 Jahren angesehen und ist charakterisiert durch eine erhebliche Verdickung der von den Schleimhautmembranen stammenden Sekrete, durch chronische Angriffe auf die Lunge und durch eine Insuffizienz der exokrinen Pankreas. Diese Krankheit ist begleitet von Störungen beim Transport von Elektrolyten, insbesondere Chlorid, durch die Epithelmembran, wobei die Störungen die Folge von Mutationen im CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)-Gen sind (Rommens, Science 245 (1989), 1059-1066; Rosenfeld, Chest 109, (1996), 241-252). Die therapeutische Lösung, die für diesen Typ einer Störung am geeignetsten erscheint, ist die Übertragung eines das funktionelle CFTR-Polypeptid codierenden Gens in die Zielzellen, um die beobachtete zelluläre Funktionsstörung zu korrigieren. Im Zusammenhang mit diesem Lösungsweg, auch als Gentherapie bezeichnet, zeigen verschiedene Autoren, dass die Zellen des respiratorischen Flimmerepithels insbesondere als Ergebnis von deren Zugänglichkeit mittels insbesondere intrapulmonaler Freisetzung, zum Beispiel durch Instillation in die Lungen, das Ziel der Wahl sind. Es ist gezeigt worden, dass in den Zielzellen ein Expressionsniveau von annähernd 5 bis 7% von dem des normalen CFTR-Gens erhalten werden muss, damit eine Wiederherstellung des Elektrolyttransports beobachtet werden kann. In ähnlicher Weise beschreiben verschiedene Veröffentlichungen die Möglichkeit, Tumore zu eliminieren, oder wenn dies misslingt, ihr Vordringen durch Anwenden eines Verfahrens zu verzögern, bei dem Gene in die von Krebs befallenen Zielzellen übertragen werden. Verschiedene Lösungswege sind in Betracht gezogen worden, insbesondere die Übertragung immunstimulierender Gene (Immuntherapie), die dazu befähigt sind, eine zeilvermittelte Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren oder zu aktivieren; als Beispiele für therapeutische Anwendungen solcher Gene können erwähnt werden: Die Verabreichung von Genen, die Cytokine codieren; die Übertragung cytotoxischer Gene, die die Toxizität auf Zellen übertragen, die sie exprimieren, zum Beispiel das tk-Gen des Typ 1 Herpes simplex-Virus (HSV-1); oder die Übertragung von anti- Onkogenen, d. h. Tumorsupressorgene, wie das Retinoblastom-Gen oder das p53-Gen, oder Polynucleotiden, die zur Hemmung der Aktivität eines Onkogens fähig sind, wie Antisense- Moleküle oder Ribozyme, die fähig sind, die spezifischen Boten-RNAs der Onkogene abzub auen.
Im Verlauf der letzten 30 Jahre ist eine große Zahl von Hilfsmitteln zur Einführung verschiedener heterologer Gene in Zellen, insbesondere Säugerzellen, entwickelt worden. Diese verschiedenen Verfahren können in zwei Kategorien eingeteilt werden. Die erste Kategorie betrifft physikalische Methoden, wie Mikroinjektion, Elektroporation oder Partikel- Bombardierung, die, obwohl sie effektiv sind, größtenteils auf in vitro-Anwendungen beschränkt sind, deren Verwirklichung mühsam und heikel ist. Die zweite Kategorie betrifft molekular- und zellbiologische Verfahren, wobei das zu übertragende Gen mit einem biologischen oder synthetischen Vektor kombiniert wird, der die Einführung des genannten Materials erleichtert.
Die zur Zeit wirksamsten Vektoren sind Virusvektoren, insbesondere Adenovirus- oder Retrovirus-Vektoren. Die Verfahren, die entwickelt wurden, beruhen auf den natürlichen Eigenschaften, die diese Viren besitzen, um Zellmembranen zu durchqueren, einen Abbau ihres genetischen Materials zu vermeiden und ihr Genom in den Zellkern einzuschleusen. Diese Viren sind bereits Gegenstand zahlreicher Studien gewesen, und einige von ihnen sind schon experimentell als Genvektoren bei Menschen eingesetzt worden, zum Beispiel mit der Absicht einer Impfung, Immuntherapie oder einer Therapie, die das Ziel hat, genetische Mängel zu kompensieren. Dennoch leidet dieser virale Lösungsweg unter zahlreichen Einschränkungen, insbesondere wegen der beschränkten Clonierungskapazität innerhalb des Virusgenoms, der Risiken durch die infektiösen Viruspartikel, die sich bei der Herstellung im Wirtsorganismus und in der Umgebung ausbreiten, dem Risiko eines Mutageneseartefakts, der sich im Fall von Retrovirusvektoren beim Einfügen in die Wirtszelle ergibt und wegen der Tatsache, dass während der therapeutischen Behandlung in vivo starke Immun- und Entzündungsreaktionen hervorgerufen werden, wodurch die Zahl der vorstellbaren Verabreichungen wesentlich eingeschränkt wird (Mc Coy, Human Gene Therapy 6 (1995), 1553-1560; Yang, Immunity 1 (1996), 433-442). Diese vielen Nachteile, insbesondere im Zusammenhang mit einer Anwendung von Virusvektoren beim Menschen, führten verschiedene Gruppen dazu, ein alternatives System für eine Übertragung von Polynucleotiden zu entwickeln.
Verschiedene nicht-virale Verfahren sind zur Zeit verfügbar. Erwähnt werden kann zum Beispiel die gemeinsame Fällung mit Calciumphosphat, die Verwendung kationischer Lipide, wie DOTMA (Felgner PNAS 84 (1987), 7413-7417), DOGS oder Transfectam (Behr, PNAS 86 (1989), 6982-6986, DMRIE und DORFE (Felgner, Methods 5 (1993), 67-75), DC-CHOL (Gao, BBRC 179 (1991), 280-285), DOTAP (McLachlan, Gene Therapy 2 (1995), 674-622) oder Lipofectamine; die Verwendung von Rezeptoren, die virale Systeme nachahmen (zum Überblick siehe Cotten, Current Opinion in Biotechnology 4 (1993), 705-710); die Verwendung von Polymeren, wie Polyamidoamin (Haensler, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372-379). Obwohl sie vielversprechend sind, leiden diese Verfahren jedoch an einer Reihe von Einschränkungen, insbesondere der niedrigen in vivo-Wirksamkeit, die ihre Anwendbarkeit im Zusammenhang mit einer Gentherapie wesentlich einschränkt. Desweiteren sind einige dieser Verfahren entweder auf in vitro-Anwendungen beschränkt, insbesondere auf Grund des toxischen Charakters des eingesetzten Moleküls (als Beispiel kann Polybrene genannt werden) oder auf Grund von Entzündungsreaktionen als Reaktion auf die Einführung dieser Verbindungen (im Fall kationischer Lipide, siehe zum Beispiel Scheule, Human Gene Therapy 8 (1997), 689-707) oder sind schwer zu kontrollieren, wie im Fall von Rezeptoren, wo eine große Menge Nucleinsäurematerial während der Endocytose in den Vesikeln eingeschlossen ist und daher für eine Therapie nicht länger verfügbar sind. Schließlich reagieren diese Verfahren auf Umweltfaktoren relativ empfindlich, und eine lange und schwierige Entwicklung ist erforderlich, um sie der Zielzelle und an die gewählte Form der Verabreichung anzupassen und ganz besonders, um sie vom in vitro-Modell auf eine in vivo-Anwendung zu übertragen.
Wolff (Science 2478 (1990), 1465-1468) hat ein attraktives und einfaches System zur Einführung eines Polynucleotids in Muskelzellen beschrieben, das einfach darin besteht, das gereinigte Polynucleotid, das mit keiner anderen Verbindung verbunden ist, die die Einführung in die Zielzelle erleichtert, auf intramuskulärem Weg zu injizieren. Die Ergebnisse, die erst kürzlich durch intratracheale Injektion (Meyer, Gene Therapy 2 (1995), 450-460) oder durch Injektion in die Arterien (Riessen, Human Gene Therapy 4 (1993), 749- 758) erzielt wurden, bestätigen das Interesse, das einem solchen System entgegengebracht wird. Dennoch ist das Expressionsniveau der in das Gewebe eingeführten Gene noch zu begrenzt, um dieses Verfahren im Rahmen einer effizienten Gentherapie zu verwirklichen, insbesondere in Verbindung mit Erkrankungen der Lunge. Einige Studien schlagen alternative Verfahren vor, um die Einführung dieses Polynucleotidtyps in Zellen zu verbessern. Die Patentanmeldung WO95/26718 betrifft zum Beispiel Verfahren zur Einführung genetischen Materials in Zellen, die die Stufen Inkontaktbringen der Zellen mit einem genetischen Vakzine-fördernden Mittel und einem Nucleinsäuremolekül umfassen. Entsprechend einer speziellen darin beschriebenen Ausführungsform kann das genetische Vakzine fördernde Mittel aus DMSO bestehen. Die Patentanmeldung liefert jedoch keine experimentellen Daten, und von Aubin (Somatic Cell Mol. Genet. 14 (1988) 155-167) oder Rhim (Oncogene 4 (1989), 1403-1409) durchgeführte Versuche haben die Notwendigkeit unterstrichen, die Verwendung von DMSO mit der Verwendung elektrostatischer Brückenmoleküle, wie Polybrene, zu kombinieren. Genauer beschreibt Aubin ein Zweistufenverfahren. Gemäß einer ersten obligatorischen Stufe wird die zu transfizierende DNA mit einem elektrostatischen Brückenmolekül, d. h. mit Polybrene, in Kontakt gebracht, um zu ermöglichen, dass diese DNA an der Zelloberfläche adsorbiert wird, und gemäß einer zweiten Stufe wird die so adsorbierte DNA mit DMSO in Kontakt gebracht, um das Einführen der DNA in die Zelle zu verbessern. Diese Studien ermöglichen jedoch nicht, ein Protokoll festzulegen, das für eine beabsichtigte wirksame in vivo-Einführung eines Polynucleotids, speziell eines Polynucleotids, das frei von allen Verbindungen ist, die die Transfektion erleichtern, in verschiedene Zelltypen geeignet ist und das das Expressionsniveau der Nucleinsäure in den Zielzellen verbessert. Außerdem zeigt Oudhiri (PNAS 94 (1997), 1651-1656), dass auf die intratracheale Injektion eines Plasmids, ohne jede Verbindung, die dessen Einführung in die Zellen fördert, in Lungenzellen keine Expression des Luciferasegens erhalten wurde.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren für eine effektive Übertragung therapeutisch wirksamer Polynucleotide in eine Zielzelle zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Die Anmelderin hat nämlich gegenwärtig eine spezielle Zusammensetzung zur Übertragung eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in das Innere einer Zielzelle entwickelt, eine Zusammensetzung, von der man sich vorstellen kann, dass sie insbesondere im Zusammenhang mit einer Gentherapie in vivo besonders wegen der Ungefährlichkeit ihrer Bestandteile verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in erster Linie eine Zusammensetzung, die dadurch charakterisiert ist, dass sie ein Gemisch aus mindestens einem therapeutisch wirksamen Polynucleotid und mindestens einer polaren Verbindung umfasst, die aus einer speziellen Gruppe aprotischer polarer Verbindungen ausgewählt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist "aprotische polare Verbindung" so zu verstehen, dass sie sich auf eine Verbindung bezieht, die keine positiv polarisierten Wasserstoffatome umfasst (aprotisch). Die Eigenschaften derartiger Verbindungen sind in der Literatur weitgehend beschrieben (siehe zum Beispiel Vollhardt und Schore, 1994, Traite de Chimie Organique [Treatise on Organic Chemistry] 2. Ausg., Hrsg. De Boeck University). Derartige Verbindungen können im besonderen Fall auf natürlichem oder synthetischem Weg oder durch chemische Modifizierung einer ersten Verbindung, die die vorstehend erwähnten Eigenschaften anfangs nicht aufweist, erhalten werden. Der Fachmann besitzt die erforderlichen Kenntnisse, um solche Verbindungen zu identifizieren. Die aprotischen polaren Verbindungen, die in den Zusammensetzungen eingesetzt werden, Verfahren und Anwendungen der vorliegenden Erfindung, wie die nachfolgend beschriebenen, können aus verschiedenen Quellen im Handel bezogen oder wie im Stand der Technik beschrieben, hergestellt werden. Im Zusammenhang mit der Erfindung kann eine große Zahl von polaren Verbindungen für eine Verwendung in Betracht gezogen werden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung steht die Erwähnung der aprotischen polaren Verbindungen im Vordergrund, wie sie definiert sind durch
a) Formel I:
wobei R1 und R2 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Fluoroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls wiederholt sind, die linear oder verzweigt sind und die gegebenenfalls substituiert sind,
mit der Maßgabe, dass, wenn R1 oder R2 ein Rest mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist, R2 beziehungsweise R1 ein Rest mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen ist, so dass es für R1 und R2 möglich ist verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren;
b) Formel II:
wobei R3 und R4 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Fluoroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkykeste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls wiederholt sind, die linear oder verzweigt sind und die gegebenenfalls substituiert sind,
so dass es für R3 und R4 möglich ist, verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren;
c) Formel III:
wobei R3 und R4 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Fluoroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls wiederholt sind, die linear oder verzweigt sind und die gegebenenfalls substituiert sind,
R5 unabhängig voneinander in jeder [R5-S]n-Wiederholung (CH&sub2;)x ist, wobei x = 1 bis 6, mit R5, der gegebenenfalls substituiert ist,
n = 1 bis 50,
so dass es für R3 und R4 möglich ist, verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren; oder
d) Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff
oder ein Derivat davon.
Vorzugsweise umfassen die Reste R1, R2, R3 und/oder R4 2 bis 6 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome und besonders bevorzugt 2 oder 3 Kohlenstoffatome. Der Ausdruck "Alkenyl" ist so zu verstehen, dass damit eine Kohlenstoffkette gemeint ist, die entlang der Kette eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten kann.
Gemäß der Erfindung können die R1-, R2-, R3-, R4- und/oder R5-Gruppen der polaren Verbindungen substituiert sein. Derartige Substitutionen können insbesondere aus einem Markierungsmolekül (siehe die Markierungsmoleküle in U. S. 4711955), das zum Beispiel ermöglicht, dass nach der in vitro- oder in vivo-Behandlung die Verteilung der Verbindungen oder der Komplexe, die diese enthalten, sichtbar wird; einem Zielmolekül für die Zelle (Ligand) oder einem Verankerungsmolekül bestehen. Diese Elemente, die in wissenschaftlichen Veröffentlichungen eingehend beschrieben sind, erlauben die Zielerfassung spezieller Zelltypen, erleichtern das Eindringen in die Zelle, die Lyse von Endosomen oder sogar den intrazellulären Transport zum Kern. Diese Elemente können ganz oder teilweise zusammengesetzt sein aus Zuckern, Glykol, Peptiden (z. B. GPR, Gastrin- Freisetzungs-Peptide), Oligonucleotiden, Lipiden, Hormonen, Vitaminen, Antigenen, Antikörpern (oder deren Fragmente), spezifischen Membranrezeptor-Liganden, Liganden, die zur Reaktion mit einem Anti-Liganden befähigt sind, Fusogenpeptiden, Kernlokalisierungspeptiden oder einer Kombination der genannten Verbindungen; zum Beispiel Galaktosylreste zum Zielen auf den Asialoglycoprotein-Rezeptor auf der Oberfläche der Hepatocyten, das INF-7-Fusogenpeptid, abgeleitet von der HA-2-Untereinheit des lnfluenzavirus-Hämagglutinins (Plank, J. Biol. Chem. 269 (1994), 12918-12924), für die Membranfusion oder eine Kernsignalsequenz, abgeleitet vom T-Antigen des SV40-Virus (Lanford, Cell 37 (1984) 801-813) oder vom EBNA-1-Protein des Epstein Barr-Virus (Ambinder, J. Virol. 65 (1991) 1466-1478).
Gemäß der Erfindung wird die aprotische polare Verbindung besonders aus der aus Di-npropylsulfoxid (DPSO), Dimethylsulfon, Sulfolan, Tetramethylensulfoxid (TEMSO), 1- Methyl-2-pyrrolidon, Methyl-di-methylsulfoxid, Methyl-di-ethylsulfoxid und ihren Derivaten bestehenden Gruppe ausgewählt. Entsprechend einer vorteilhaften Form der Erfindung wird die aprotische polare Verbindung ausgewählt aus der aus Di-n-propylsulfoxid (DPSO) und ihren Derivaten bestehenden Gruppe. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben, wurde gefunden, dass DPSO die Aufnahme der DNA durch die Zellen signifikant erleichtert, wenn sie als Beimischung der DNA verabreicht wird. Enantiomere Formen der genannten Moleküle sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingeschlossen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "Derivat" einer vorher erwähnten Verbindung ein Molekül, dessen chemische Struktur auf der der oben beschriebenen Verbindungen basiert und die zur Übertragung einer Substanz in eine Zielzelle verwendet werden kann. Die Fähigkeit, die Aufnahme einer Substanz durch Zellen während der Transfektion der Substanz zu erleichtern, kann mit den so abgeleiteten Verbindungen, verglichen mit den natürlich vorkommenden und den vorstehend erwähnten aprotischen Organic Chemistry, Springer-Ausgabe, New York Inc., 175 Fith Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Die genannten Derivate können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren oder wie zum Beispiel in den angefügten Beispielen beschrieben, auf ihre Brauchbarkeit für die Transfektion geprüft werden. Desweiteren kann die computergestützte Entwicklung geeigneter Derivate oder Analoge verwendet werden, zum Beispiel entsprechend den dem Fachmann bekannten Verfahren. Desweiteren kann die dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur von DPSO und anderer verwandter aprotischer polarer Verbindungen benutzt werden, um Verbindungen zu entwickeln, die die DNA-Aufnahme erleichtern können (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorgan. Med. Chem. 4 (1996), 1545- 1558).
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die aprotische polare Verbindung aus der aus Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff (TMU) und ihren Derivaten bestehenden Gruppe ausgewählt.
Der Wirkstoff der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Polynucleotid, das dann zusammen mit der aprotischen polaren Verbindung eine Verbesserung der Fähigkeit zur Transfektion des Polynucleotids in eine Zelle ermöglicht. "Polynucleotid" ist in der Bedeutung eines natürlichen isolierten oder synthetischen, linearen oder ringförmigen, doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA- und/oder RNA-Fragments zu verstehen, wobei der Ausdruck eine präzise Sequenz von markierten oder nicht markierten (siehe zum Beipiel US 4711955 oder EP-3021175), modifizierten oder nicht modifizierten (siehe als Beispiel US 5525711) Nucleotiden bezeichnet und es ermöglicht, ein Fragment oder eine Region einer Nucleinsäure zu definieren, ohne dessen Größe zu begrenzen. Polynucleotid ist so zu verstehen, dass es sich insbesondere bezieht auf eine cDNA; auf eine genomische DNA; auf eine Plasmid-DNA; auf ein Polynucleotid, das frei von jeder die Einführung in Zellen erleichternden Verbindung ist; auf ein Polynucleotid, das mit mindestens einem Polypeptid von insbesondere viralen Ursprungs, spezifischer adenoviralen oder retroviralen Ursprungs, oder mit einem synthetischen Polypeptid assoziiert ist; auf ein Polypeptid, das mit einem Liganden assoziiert ist; auf ein Polypeptid, das mit mindestens einem kationischen amphiphilen Molekül, insbesondere Lipiden, assoziiert ist; auf ein amphiphilen Molekül, insbesondere Lipiden, assoziiert ist; auf ein Polypeptid, das mit mindestens einem kationischen oder neutralen Polymer assoziiert ist; auf eine Boten-RNA; auf eine Antisense-RNA; auf ein Ribozym; auf eine Transfer-RNA; auf eine ribosomale RNA oder eine DNA, die solche RNAs codiert.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynucleotid ein Gen von Interesse und Elemente, die die Expression des Gens von Interesse ermöglichen. Bei dieser Ausführungsform liegt das Polynucleotid vorteilhafterweise in Form eines Plasmids vor. Die Elemente, die es ermöglichen, dass die Expression stattfindet, sind die gesamten Elemente, die es dem DNA-Fragment ermöglichen, in die RNA (Antisense-RNA oder mRNA) transkribiert zu werden, und der mRNA, in das Polypeptid translatiert zu werden. Diese Elemente sind insbesondere Promotorsequenzen und/oder Regulatorsequenzen, die in der genannten Zelle wirksam sind, und gegebenenfalls Sequenzen, die erforderlich sind, damit das Polypeptid fähig ist, sezerniert oder auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert zu werden. Als Beispiel können die Promotoren der RSV-, MPSV-, SV40-, CMV- oder 7,5 k- Viren oder des Vaccinia-Virus oder die Promotoren der Gene, die Muskelkreatin-Kinase, Actin und puhnonalen Oberflächenfaktor codieren, erwähnt werden. Es ist weiterhin möglich, eine Promotorsequenz auszuwählen, die für einen gegebenen Zelltyp spezifisch ist oder die unter definierten Bedingungen aktiviert werden kann. Die Literatur liefert eine große Menge an Information, die sich auf solche Promotorsequenzen bezieht. Weiterhin kann das Polynucleotid mindestens zwei identische oder verschiedene Sequenzen, die transkriptionale Promotoraktivität zeigen, und/oder mindestens zwei identische oder verschiedene DNAcodierende Sequenzen umfassen, die benachbart oder mit einem Abstand und in der gleichen Richtung oder in gegengesetzter Richtung zueinander lokalisiert sind, ohne dass die Funktion des Promotors der Transkription oder die Transkription der genannten Sequenzen beeinflusst wird. Ähnlich ist es möglich, in diesen Typ von Nucleinsäurekonstrukt "neutrale" Nucleinsäuresequenzen oder Introns einzuführen, welche die Transkription nicht beeinflussen und welche vor dem Stadium der Translation gespleißt werden. Sequenzen dieser Art und ihre Verwendungen sind in der Literatur beschrieben. Das genannte Polynucleotid kann auch Sequenzen umfassen, die für den intrazellulären Transport, für die Replikation und/oder für die Integration benötigt werden. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann gut bekannt. Darüberhinaus können die Polynucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung auch Polynucleotide sein, die so modifiziert sind, dass sie nicht fähig sind, in das Genom der Zielzelle integriert zu werden, oder Polynucleotide, die mit Mitteln, wie zum Beispiel Spermin, stabilisiert sind.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann ferner ein selektierbares Markergen umfassen, entweder verbunden mit den vorstehend erwähnten Polynucleotiden oder als getrennte Nucleinsäuremoleküle, z. B. in einem rekombinanten Plasmid. Diese Ausführungsform ist besonders für die ex vivo-Behandlung von Gewebe, Zellen und Organen geeignet. Nach der Einführung der Fremd-DNA lässt man die konstruierten Zellen 1-2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, und dann werden sie in ein selektives Medium überführt. Der selektierbare Marker im rekombinanten Plasmid überträgt Resistenz zur Selektion und erlaubt die Selektion von Zellen, die das Plasmid in ihren Chromosomen stabil integriert haben und unter Bildung von Foci wachsen, die wiederum cloniert werden können und zu Zelllinien expandieren. Es kann eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, eingeschlossen, aber nicht darauf begrenzt, Herpes simplex Virus-Thymidinkinase (Wigler, Cell 11 (1977), 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) in tlC-, hgprC- beziehungsweise apr17- Zellen. Anti-Metabolit-Resistenz kann auch als Grundlage der Selektion für dhfr verwendet werden, wodurch die Resistenz auf Methotrexat übertragen wird (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), für gpt, wodurch Resistenz auf Mycophenolsäure übertragen wird (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); für neo, wodurch Resistenz auf das Aminoglycosid G-418 übertragen wird (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); für hygro, wodurch Resistenz auf Hygromycin übertragen wird (Santerre, Gene 30 (1984), 147); oder für Puromycin (pat, Puromycin-N-Acetyltransferase). Zusätzliche selektierbare Gene sind beschrieben worden, zum Beispiel trpB, das den Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu nutzen; hisD, das den Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu nutzen (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); und ODC (Ornithindecarboxylase), das Resistenz gegen den Ornithin-Decarboxylaseinhibitor 2- (Difluormethyl)-DL-ornithin DFMO überträgt (McConlogue, 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.).
Geeignete Vektoren und Plasmide, deren Einsatz in der Zusammensetzung der Erfindung für eine in vitro- oder in vivo-Gentherapie nützlich ist, sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann bekannt; siehe z. B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539, Schaper, Circ.
Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO97/00957; oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 und die darin zitierten Referenzen. Der genannte Vektor ist vorzugsweise ein Gen-Übertragungs- oder ein Gen-Zielvektor. Um die vorstehend erwähnten Polynucleotide, Plasmide und rekombinanten Vektoren zu konstruieren, können die dem Fachmann bekannten Verfahren verwendet werden; siehe zum Beispiel die Methoden, die beschrieben sind in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann das Polynucleotid zur Zielzelle homolog oder heterolog sein. Es kann von Vorteil sein, ein Polynucleotid zu verwenden, das ein ganzes oder einen Teil eines Polypeptids codiert, insbesondere ein Polypeptid, das therapeutische oder prophylaktische Wirkung zeigt, noch genauer eine immunogene Wirkung vom zellulären oder humoralen Typ. Der Ausdruck Polypeptid ist so zu verstehen, dass keine Einschränkung im Hinblick auf die Größe des Polypeptids oder den Grad, zu dem es modifiziert ist (zum Beispiel durch Glycosylierung), vorliegt. Als Beispiel zu erwähnen sind Gene, die codieren: ein Enzym, ein Hormon, ein Cytokin, einen Membranrezeptor, ein strukturelles Polypeptid, ein Polypeptid, das einen Membrankanal bildet, ein Transportpolypeptid, ein Adhäsionsmolekül, einen Ligand, einen Faktor zur Regulierung der Transkription, Translation, Replikation oder zur Stabilisierung des Transkripts oder einen Antikörper, wie zum Beispiel das Gen, das codiert: CFTR-Protein, Dystrophin, Faktor VIII oder Faktor DC, HPV E6/E7, MUC1, BRAC1, Interferon, die Interleukine (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7 und IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF) alpha oder GM-CSF (Granulocyten- Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) oder das tk-Gen des Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1), das Retinoblastomgen oder das Gene für p513 oder vollständige oder Teile von Immunglobulinen, wie F(ab)&sub2;-, Fab'- und Fab-Fragmente oder die Anti-Idiotyp- Immunglobuline (U. S. -4,699,880). Es ist natürlich verständlich, dass diese Liste nicht einschränkend ist und dass andere Gene auch eingesetzt werden können.
gegebenenfalls das kleinstmögliche Volumen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreichen zu können. Der Fachmann verfügt über die entsprechenden Kenntnisse, die es ihm ermöglichen, diese Konzentration in Übereinstimmung mit dem Sublimierungsvermögen des Mediums einzustellen, in dem das Polynucleotid gelöst wird.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform liegt die aprotische polare Verbindung in wässriger Lösung vor, das heißt sie liegt verdünnt in wässriger Lösung vor, die, wo es passend ist, salzhaltig und gepuffert ist. Der Fachmann verfügt über die entsprechenden Kenntnisse, die es ihm ermöglichen, die wässrige Lösung auszuwählen, die für den Typ von Zielzellen am besten geeignet ist. Genauer gesagt liegt die genannte polare Verbindung in Wasser oder in einem Puffer, zum Beispiel 20 mM Hepes, pH 7,5, gelöst vor. Das Volumen der aprotischen polaren Verbindung kann 0,1 bis 100% des Gesamtvolumens der Zusammensetzung, genauer 5 bis 50%, vorteilhafterweise 15 bis 20% darstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, das eine der vorher erwähnten Zusammensetzungen der Erfindung und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exipienten umfasst. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in der einschlägigen Technik bekannt und schließen phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Netzmitteltypen, sterile Lösungen usw. ein. Arzneimittel, die derartige Träger umfassen, können mit den wohlbekannten herkömmlichen Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem Individuum mit einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung geeigneter Arzneimittel kann auf verschiedene Wege erfolgen, z. B. intravenös, intratracheal, intrapulmonal, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, durch topische oder intradermale Verabreichung. Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt und andere klinische Faktoren bestimmt. Wie in der Medizin bekannt, hängen die Dosierungen bei jedem Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, der speziellen zu verabreichenden Substanz, dem Geschlecht, der Zeit und dem Verabreichungsweg, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen gleichzeitig verabreichten Arzneistoffen. Im Allgemeinen sollte das Schema bei regelmäßiger Verabreichung des Arzneimittels im Bereich von 1 ug bis 10 mg bioaktive Verbindung pro Tag liegen. Wenn das Schema eine kontinuierliche Infusion ist, sollte sie ebenfalls im Bereich von 1 ug bis 10 mg bioaktive Verbindung pro kg Körpergewicht pro Minute liegen. Der Fortgang kann durch periodische Bewertung überwacht werden. Die Dosierungen werden schwanken, eine bevorzugte Dosierung für die intravenöse Verabreichung der Polynucleotide, z. B. DNA, reicht von annähernd 10&sup6; bis 10¹&sup6; Kopien des DNA-Moleküls. Die Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Im Allgemeinen wird die Verabreichung parenteral, z. B. intravenös, erfolgen; die DNA kann auch direkt an der Zielstelle, z. B. mittels Katheter an einer Stelle in die Arterie erfolgen. Weiterhin können die Zusammensetzungen der Erfindung vor der Injektion an Mikrokapseln oder Mikrokugeln gebunden werden. Man kann entweder als Lösungsweg einen in vivo- Gentransfer, für den Mehrfachvorrichtungen, wie Doppelballon- oder andere Katheder, entwickelt worden sind, oder eine direkten Injektion in das Zielgewebe verwenden, wie vorstehend beschrieben. Alternativ ist es möglich, einen ex vivo-Lösungsweg zu verwenden, bei dem Zellen, von denen bekannt ist, dass sie in den Körpergeweben vorhanden sind, aus dem Körper isoliert werden und die dann unter Verwendung von einer der vorstehend erwähnten Zusammensetzungen transfiziert und reinjiziert werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Vakzine, die eine der vorstehend erwähnten Zusammensetzungen umfasst. Bei dieser Ausführungsform codiert das therapeutisch wirksame Polynucleotid ein Antigen, das zur Erzeugung einer schützenden Immunantwort auf eine Erkrankung bei Menschen und Tieren, die für so ein Erkrankung empfänglich sind, befähigt ist. Die Vakzine der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung dem Fachmann bekannter Verfahren hergestellt werden. Die Immunogenität der für die Impfung verwendeten Antigene kann verstärkt werden, zum Beispiel durch Programmieren entweder einer Th1- oder Th2-gerichteten Immunantwort z. B. durch Co-Transduzieren einer cDNA, die sezernierte Cytokine oder Chemokine oder Membranmoleküle codiert. Diese Vakzine können z. B. injiziert werden, entweder intradermal, subkutan, intramuskulär oder besonders im Fall einer Anti-Tumor-Impfung in Bereiche des Tumorwachstums oder in lymphatische Gefäße oder Lymphknoten zur Ableitung der Tumor-Wachstumsbereiche.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die eine der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen der In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die eine der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen der Erfindung umfasst, und gegebenenfalls geeignete Mittel für den Nachweis. Bei dieser Ausführungsform liegt das therapeutisch wirksame Polynucleotid vorzugsweise markiert vor. Es gibt viele verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele für Markierungsarten, die bei der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, schließen Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, fluoreszierende Verbindungen, chemolumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen ein. Zusätzlich oder alternativ umfasst das therapeutisch wirksame Polynucleotid ein Markergen, das direkt oder indirekt nachweisbare Proteine, wie β-Galaktosidase, grün fluoreszierendes Protein oder Luciferase codiert; siehe auch die beigefügten Beispiele. Die diagnostische Zusammensetzung der Erfindung kann mit Vorteil zur Zielerfassung, z. B. durch Lichtemission zu ausgewählten Bereichen, ebenso wie für eine Verfolgung von Einheiten innerhalb des Individuums verwendet werden. Zusätzlich können durch Verwendung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen Tiermodelle für Krankheitszustände geschaffen werden, wie auch Verfahren zur Lokalisierung und Verfolgung des Fortschreitens einer Krankheit oder eines Pathogens im Tier und zum Test vermutlicher therapeutischer Verbindungen, die die Krankheit oder das Pathogen wirksam hemmen. Methoden zum Nachweis und zur Lokalisierung von Licht, das von Säugern erzeugt wird, sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. WO 97/18841 und die darin zitierten Referenzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Übertragung mindestens eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in Zielzellen in vitro, ex vivo oder in vivo, ganz besonders in vivo.
Der Einführungs- oder Übertragungsvorgang selbst ist gut bekannt. "Übertragen" oder "Übertragung" bedeutet, dass das therapeutisch wirksame Polynucleotid in die Zelle übertragen und am Ende des Vorganges im Inneren der Zelle oder innerhalb oder auf der Membran lokalisiert wird. Wenn der Wirkstoff eine Nucleinsäure ist, wird dies als "Transfektion" bezeichnet. Die Transfektion kann mit einem beliebigen geeigneten Verfahren überprüft werden, zum Beispiel durch Messung der Expression des Gens oder durch Messung der Konzentration des exprimierten Proteins.
werden. In vivo kann die Erfindung angewendet werden innerhalb des Interstitial- oder Luminalraumes von Geweben, wie der Lunge, der Luftröhre, der Haut, Muskeln, dem Gehirn, der Leber, dem Herz, der Milz, dem Knochenmark, dem Thymus, der Blase, den Lymphen, dem Blut, den Blutgefäßen, der Bauchspeicheldrüse, dem Magen, der Niere, den Ovarien, den Testikeln, dem Rectum, dem peripheren oder zentralen Nervensystem, den Augen, den lymphatischen Organen, den Knorpeln oder dem Endothel. Gemäß einer vorteilhaften Auswahl der Erfindung ist die Zielzelle eine Muskelzelle, eine hämatopoetische Stammzelle oder eine Atemwegszelle, genauer eine Luftröhrenzelle oder Lungenzelle, vorteilhafterweise eine Zelle des respiratorischen Flimmerepithels. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Übertragung eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in eine Zielzelle, gemäß dem die Zelle mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird. Vorteilhafterweise schließt dieses Verfahren eine zusätzliche Stufe ein, die in der Erwärmung der Zusammensetzung besteht, bevor sie mit der Zelle in Kontakt gebracht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung soll "Zusammensetzung" bedeuten, dass das therapeutisch wirksame Polynucleotid und die darin eingeschlossene polare Verbindung so zusammen assoziiert oder kombiniert sind, dass das wirksame Polynucleotid nicht als frei vom erleichternden Mittel betrachtet werden kann. Zum Beispiel hat der Anmelder in dem speziellen Fall, bei dem das wirksame Polynucleotid Plasmid-DNA ist, gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften der DNA in Gegenwart von DPSO modifiziert sind. Deshalb kann sich der Fachmann leicht vorstellen, dass diese Zusammensetzung, die das wirksame Polynucleotid und die polare Verbindung enthält, in vitro, aber auch in vivo nach getrennter Verabreichung der Verbindungen an das Zielorgan oder -gewebe erhalten werden kann, sofern die erste Verbindung zur Bildung der beanspruchten Zusammensetzung in situ nach der späteren Verabreichung der zweiten Verbindung verfügbar bleibt. Diese Art einer voneinander unabhängigen Verabreichung sollte als gleichwertige Durchführung der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
Wie vorstehend erwähnt, können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Medikamente für diagnostische, therapeutische, prophylaktische oder Impfzwecke verwendet werden. Aus diesem Grund betrifft die Erfindung auch Zusammensetzungen der Erfindung als Medikamente für therapeutische, prophylaktische oder Impfzwecke.
Insbesondere können die Zusammensetzungen der Erfindung auch zur Durchführung einer therapeutischen Behandlung verwendet werden, die in der Übertragung mindestens eines werden. Aus diesem Grund betrifft die Erfindung auch Zusammensetzungen der Erfindung als Medikamente für therapeutische, prophylaktische oder Impfzwecke.
Insbesondere können die Zusammensetzungen der Erfindung auch zur Durchführung einer therapeutischen Behandlung verwendet werden, die in der Übertragung mindestens eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in Zielzellen besteht. Vorzugsweise sind diese Zielzellen Säugerzellen. Diese Säugerzellen sind insbesondere Lungenzellen, Muskelzellen oder hämatopoetische Stammzellen.
Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann auf intramuskulärem, intratrachealem, intranasalem, intracerebralem, intrapleuralem, intratumoralem, epidermalem, intravenösem oder intraarteriellem Weg unter Verwendung einer Spritze oder irgendeinem anderen gleichwertigen Hilfsmittel einschließlich Systemen verabreicht werden, die für die Behandlung der Atemwege oder der Schleimhautmembranen, wie Inhalieren, Instillation oder Aerosolisierung, geeignet sind. Erwähnt werden kann auch eine Verabreichung durch Aufbringen einer Creme oder mittels oraler Applikation oder auf anderem Wege, der dem Fachmann genauestens bekannt ist und bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und im Zusammenhang mit einer in vivo-Gentherapie ist es möglich, die vorgeschlagenen Verfahren bei einem bestimmten Patienten mehrmals zu wiederholen, ohne dass eine signifikante Immunreaktion gegen eine der verabreichten Verbindungen ausgelöst wird. Die Verabreichung kann mit einer Einzeldosis oder in Dosierungen, die einmal oder mehrmals in bestimmten Abständen wiederholt werden, erfolgen. Der passende Weg der Verabreichung und die Dosierung variieren gemäß einer Vielzahl von Parametern, zum Beispiel dem Individuum oder der zu behandelnden Krankheit oder dem zu übertragenden Polynucleotid.
Noch genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für therapeutische, prophylaktische oder Impfzwecke, wobei das Medikament zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels Gentherapie vorgesehen ist. Entsprechend einer ersten Möglichkeit kann das Medikament direkt in vivo (z. B. in einen Muskel, in die Lungen unter Verwendung eines Aerosols usw.) verabreicht werden. Es ist auch möglich, den ex vivo- Zuführungsweg zu nehmen, der darin besteht, Zellen des Patienten (Stammzellen des Knochenmarks, Lymphocyten von peripherem Blut, Muskelzellen usw.) zu entnehmen, sie in vitro gemäß der vorliegenden Erfindung zu transfizieren und sie dann dem Patienten erneut zuzuführen.
Schließlich betrifft die Erfindung eine Zelle, die mit einer Zusammensetzung, wie sie vorher definiert wurde, transfiziert wurde, besonders eine prokaryontische Zelle, eine Hefe- oder eukaryontische Zelle, insbesondere eine Tierzelle, besonders eine Säugerzelle, noch spezieller eine Krebszelle. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle eine Atemwegszelle, noch spezieller eine Luftröhren- oder Lungenzelle, vorzugsweise eine Zelle des respiratorischen Flimmerepithels. Im Fall der Freisetzung an die Atemwege kann eine vorausgehende Verabreichung von Bronchodilatator-Verbindungen (zum Beispiel Theophyllin) vorteilhaft sein. Der Anmelder hat gezeigt, dass eine orale Verabreichung von 0,3 mg Theophyllin (Dilatrane) etwa 30 Minuten vor der Inkubation mit einer DPSO enthaltenden Zusammensetzung bei der Maus zu einer leichten Verbesserung des Expressionsniveaus führen kann, verglichen mit einer Verabreichung ohne diese Vorbehandlung.
Diese und andere Ausführungsformen sind offenbart oder ergeben sich offensichtlich aus der Beschreibung und den Beispielen der vorliegenden Erfindung und sind durch sie umfasst. Weitere Literatur, die Verwendungen und Verbindungen, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzen sind, betrifft, kann aus öffentlichen Büchereien unter Verwendung von zum Beispiel elektronischen Vorrichtungen bezogen werden. Es kann zum Beispiel die öffentliche Datenbank "Medline" benutzt werden, die im Internet zugänglich ist, z. B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen, wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http://www.tigr.org/, sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls, zum Beispiel unter Verwendung von http://www.lycos.com, verwendet werden. Ein Überblick über Patentinformationen in der Biotechnologie und ein Überblick über relevante Quellen der Patentinformation, die für eine rückblickende Suche und laufende Unterrichtung nützlich sind, wird in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.
Die Zusammensetzungen und Verwendungen der Erfindung können zur Behandlung aller Arten von Krankheiten verwendet werden, wobei die Behandlung und/oder Diagnose mit dem Transfer therapeutischer Substanzen in Zellen in Beziehung stehen oder davon abhängen. Die Arzneimittel und Verwendungen der vorliegenden Erfindung können wunschgemäß bei Menschen eingesetzt werden, obwohl durch die hierin beschriebene Verwendung eine Behandlung von Tieren ebenfalls umfasst ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele 1 bis 7 unter Bezugnahme auf die Abb. 1 bis 5 veranschaulicht.
Die Abbildungen zeigen:
Abb. 1: Karte des Plasmids pTG11033
Abb. 2: Expressionsniveaus (RLU/mg Protein) des Luciferase-codierenden Gens in den Lungen nach Injektion einer Zusammensetzung, die 50 ug DNA und 15% (Vol./Vol.) DESO oder DPSO in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,5 enthält.
Abb. 3: Expressionsniveaus (RLU/mg Protein) des Luciferase-codierenden Gens in den Lungen nach Injektion einer Zusammensetzung, die 50 ug DNA und gegebenenfalls 10 oder 15% (Vol./Vol.) verschiedener polarer Verbindungen in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,5 enthält. Die gezeigten Werte sind in jedem Fall aus dem Mittelwert der bei Mäusen beobachteten Ergebnisse berechnet, denen die gleiche Zusammensetzung injiziert wurde.
Abb. 4: Expressionsniveaus (RLU/mg Protein) des Luciferase-codierenden Gens in den Lungen nach Injektion einer Zusammensetzung, die 50 ug DNA und gegebenenfalls 10 oder 15% (Vol./Vol.) TMU oder DPSO in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, enthält. Die gezeigten Werte sind in jedem Fall aus dem Mittelwert der bei n Mäusen beobachteten Ergebnisse berechnet, denen die gleiche Zusammensetzung injiziert wurde. SEM: Standart-Fehler des Mittelwerts (siehe Burke, Scientific data management 9 (1997), 32-38).
Abb. 5: PLASMID-DNA-SCHMELZKURVEN +/- DPSO. 50 ug/ml Plasmid- DNA (pTG11033) in 20 mM Hepes, pH 7,5 oder in 20 mM Hepes, pH 7,5, der 5, 10, 15 oder 20% DPSO enthielt, wurden erhitzt (4ºC/min).
Die Absorptionsänderung wurde aufgezeichnet und zur Anfangsabsorption bei 35ºC normalisiert.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und von deren vielen Vorteilen wird man aus den folgenden Beispielen erhalten, die zur Veranschaulichung dienen.

Beispiel 1: Herstellung von Zusammensetzungen, in denen die polare Verbindung DESO oder DPSO ist

Das gewählte Polynucleotid, d. h. das Plasmid pTG11033 (Abb. 1) umfasst das Luciferase-codierende Gen, unter der Kontrolle des CMV-Promotors plaziert, Intron 1 des HMG-Gens und das SV40-polyA-Terminationssignal. Die in 250 ul einer 1 mg/ml-Lösung des gereinigten Plasmids (durch Zentrifugation in einem Caesiumchloridgradienten gereinigt) enthaltene Plasmid-DNA wurde mit Ethanol gefällt. Nachdem es zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet wurde, wurde das Nucleinsäurepellet in einem gegebenen Volumen DESO oder DPSO und 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,5 aufgenommen, um die folgenden in der nachstehenden Tabelle I gezeigten Zusammensetzungen zu ergeben.

Beispiel 2: Verabreichung der Zusammensetzungen mittels intratrachealer Injektion

Die 8 Wochen alten weiblichen Mäuse (B6/SJLF1, Iffa Credo) wurden mittels intraperitonealer Injektion (physiologische Kochsalzlösung, IMALGENE 1000, Xylazin/ROMPUN) narkotisiert. Nach der Desinfektion der Haut mit 70% Ethanol wurde ein Schnitt ausgeführt, um die Luftröhre freizulegen, in die 50 ul der Zusammensetzung des Beispiels 1 unter Verwendung einer Spritze injiziert werden konnte. Jede Zusammensetzung wurde in mindestens 3 verschiedene Mäuse injiziert. Die Expressionsniveaus wurden mit denjenigen verglichen, die erhalten wurden, nachdem 50 ug DNA in 50 ul 20 mM Hepes, pH 7,5 ohne Zusatz einer polaren Verbindung injiziert wurden. Eine Kontrolle, bei der bei den Mäusen keine Injektion durchgeführt wurde, ist im Protokoll ebenfalls eingeschlossen.

Beispiel 3: Messung der Luciferaseaktivität in den Geweben der injizierten Mäuse

Die Mäuse wurden zwei Tage nach den Injektionen geopfert. Die Lungen und die Luftröhre wurden unabhängig voneinander behandelt. Die Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Um die Luciferaseaktivität zu messen, wurden die Gewebe in einer Reibschale, die auf Trockeneis stand, mechanisch unter Verwendung eines Pistills zerneben. Den aus den Lungen beziehungsweise der Luftröhre erhaltenen Gewebefragmenten wurden 500 ul oder 200 ul eines Lysepuffers (Promega) zugesetzt, und die Lösung wurde drei Schritten von Einfrieren/Auftauen unterworfen. Die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt, und die Luciferaseaktivität (in RLU/min. relative Lichteinheit pro Minute) von 20 ul des Überstands entsprechend den Instruktionen des Lieferanten (Promega) durch Zusatz von 100 ul Reagens und Messen der Aktivität mittels Lumineszenz gemessen. Die gemessene Luciferaseaktivität wurde, bezogen auf die Proteinmenge, mit Hilfe einer Standardskala, die unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Luciferase (Promega) erzeugt wurde, standardisiert. Die Gesamtmenge an Protein wurde ebenfalls mittels des Bicinchoninsäure (BCA) kolorimetrischen Verfahrens (Smith, Anal. Biochem. 150 (1985), 76-85) unter Verwendung eines Aliquots des Überstands bestimmt. Dadurch ist es möglich, die Luciferaseaktivität in RLU pro Milligramm aus den Geweben extrahierten Protein auszudrücken. Für eine gegebene Zusammensetzung entspricht die Aktivität von Interesse dem Mittelwert der aus den drei injizierten Mäusen erhaltenen Werten.

Beispiel 4: Erhaltene Ergebnisse

Die Ergebnisse der aus den Lungen gewonnenen Extrakte sind in den Abb. 2 und 4 graphisch gezeigt. Die Ergebnisse demonstrieren, dass während keine Expression des Luciferasegens im Lungengewebe beobachtet wird, wenn das Polynucleotid (50 ug) alleine injiziert wird, ein Zusatz von DPSO zur injizierten Zusammensetzung die Expression erhöht.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass DPSO alleine eine wirksame Verbindung ist, um die Fähigkeit eines Polynucleotids zu verbessern, in eine Zelle transfiziert zu werden, nachdem die genannten Zusammensetzungen intratracheal injiziert wurden, wobei die Expressionsniveaus deutlich verbessert waren im Vergleich zu der Injektion des Polynucleotids alleine.

Beispiel 5: Andere aprotische polare Verbindungen, die getestet wurden

Wir demonstrierten auf identische Weise, dass es möglich ist, andere aprotische polare Verbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung einzusetzen. Um dies auszuführen, wurden entsprechend den in den Beispielen 1 und 4 beschriebenen Protokollen verschiedene Zusammensetzungen hergestellt. Genauer gesagt umfassen diese Zusammensetzungen: 50 ug des Plasmids pTG11033/50 ul und variable Prozentanteile (10 oder 15%) einer Substanz, ausgewählt aus: DPSO, Tetramethylensulfoxid (TEMSO), (siehe Johnson and Keiser, 1973, Organic Synthesis Coll. 5 (1973), 791), DMSO, Tetramethylharnstoff oder Sulfolan. Jede der resultierenden Zusammensetzungen wurde dann intratracheal 8 bis 12 Wochen alten Mäuse (C57BL/6, Iffa Credo) unter Anwendung des vorher in Beispiel 2 beschriebenen Protokolls injiziert.
Die Ergebnisse, die erhalten wurden (Abb. 3 und 4) demonstrieren, dass die Erfindung unter Verwendung verschiedener aprotischer polarer Verbindungen ausgeführt werden kann. So ermöglichen die verschiedenen getesteten Zusammensetzungen, die ein Polynucleotid und eine aprotische polare Verbindung umfassen, wie die oben aufgelisteten, eine deutlich verbesserte Transfektion der Lungenzellen im Anschluß an die intratracheale Injektion, verglichen mit der Injektion des Polynucleotids alleine unter Bedingungen, die insbesondere in Bezug auf die Konzentration identisch waren.
Die besten Ergebnisse wurden mit den Zusammensetzungen beobachtet, die DPSO oder TMU umfassten. Es wurde auch für jede dieser polaren Verbindungen gezeigt, dass es für die getestete DNA-Menge (50 ug) möglich war, das gemessene Expressionsniveau des Luciferase-codierenden Gens zu verbessern (Abb. 4), indem der Prozentanteil der genannten Verbindung erhöht wurde.

Beispiel 7: Aufzeichnung der Schmelzkurven der Plasmid-DNA

Plasmid-DNA-Schmelzkurven wurden mit einem Thermostat-gesteuerten UV/ Visible- CARY/VARIAN-Spektrophotometer (Software-Version: 3.04) unter Verwendung von 2 Quarzküvetten (L = 1 cm) mit Teflonstopfen aufgezeichnet. Gesamtvolumen der Probe: 1 ml (50 ug/ml Plasmid-DNA (pTG11033) in 20 mM Hepes, pH 7,5 mit unterschiedlichen Prozentanteilen (0, 5, 10, 15, 20%) Di-n-propylsulfoxid (DPSO). Der Temperaturgradient war 4ºC/min und wurde von 35ºC bis 100ºC bei 260 nm durchgeführt (Skala: 0,9-1,2 OD; 50 ug ~ 1 OD). Über die DNA-Schmelzkurven-Tests (Abb. 5) ist gezeigt worden, dass sich DNA alleine ("nackte DNA") oder DNA in Anwesenheit von DPSO ("Solvoplexe") unterschiedlich verhält. Bei Anwesenheit einer Sulfoxidverbindung ist die Absorptionsänderung geringer und tritt bei höherer Temperatur auf. Dies kann als DNAstabilisierender Effekt des DPSO interpretiert werden (eine höhere Temperatur ist erforderlich, um den DNA-Doppelstrang zu dissoziieren).

Beispiel 8: Aerosolisierung der Liposolvoplexe

Der grundlegende Weg, an das respiratorische Flimmerepithel Vektoren freizusetzen, wird in Form eines Aerosols sein. DNA alleine wird jedoch schnell abgebaut, wenn sie aerolisiert wird. Dieser Effekt kann durch Komplexieren der DNA als Lipoplexe umgangen werden (DNA gebunden an ein kationisches Amphiphil, wie diejenigen, die in der Patentanmeldung Nr. FR 97/15805 beschrieben sind, zum Beispiel pTG90). Kürzlich wurde beobachtet, dass Lipoplexe allein nur geringe oder keine Expression in den Lungen ergeben. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde versucht, die günstigen Eigenschaften der Solvoplexe (Komplexe der vorliegenden Erfindung) und der Lipoplexe zu kombinieren. Zu diesem Zweck wurden Liposolvoplexe (DNA zusammen mit kationischen Lipiden und DPSO) hergestellt, aerolisiert, in einer Kühlfalle gesammelt und anschließend intratracheal in Mäuse injiziert. Lipoplexe mit pTG90/DOPE alleine führten nicht zur Luciferasegenexpression nach intratrachealer Injektion; bei Anwesenheit von DPSO wurde jedoch für pTG90/DOPE-Liposolvoplexe eine Expression beobachtet. Die Expressionsniveaus JUr die getesteten Liposolvoplexe waren im allgemeinen nach der Aerolisierung niedriger; jedoch immer noch 86% der Aktivität, die für die gleichen Komplexe vor der Aerolisierung beobachtet wurde, konnten bei den pTG90/DOPE/DPSO- Liposolvoplexen erhalten werden.

Beispiel 9: Synthese der Disulfoxide

9.1 Methyl-di-methylsulfoxid (Bis(methylsulfinyl)methan, BiMSuM) (=CH&sub3;-SO-CH&sub2;-SO- CH&sub3;)

10,5 ml CH&sub3;SOCH&sub2;SCH&sub3; (12,5 g, 100 mmol; Aldrich 17.795) wurden bei Raumtemperatur in 125 ml Methanol verdünnt. Die Lösung wurde gerührt und bei 0ºC gehalten. 21,4 g NaIO&sub4; (100 mmol) in 280 ml Wasser wurden tropfenweise über 90 min zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 15 h bei 0ºC gehalten. Das Fortschreiten der Reaktion wurde mit Dünnschichtchromatographie kontrolliert (DC, Lösungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 95/5, Nachweis über 12, KMnO&sub4;; CH&sub3;SOCH&sub2;SCH&sub3;, Rf = 0,9; CH&sub3;SOCH&sub2;SOCH&sub3;, Rf = 0,33). Das Reaktionsgemisch würde über Celite filtriert, das mit 300 ml Wasser, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; und dann mit 200 ml Methanol gespült wurde. Die angereicherten organischen Fraktionen wurden vereinigt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft.
Das Produkt wurde gereinigt, und die Fraktionen, die die beiden Enantiomere enthielten, wurden mit 3 Durchläufen durch ein Silicasäule angereichert (11) 4 cm, 100 g Siliciumdioxid in CH&sub2;Cl&sub2;) und mit 550 ml CH&sub2;Cl&sub2;, 250 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 97/3, 1000 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 95/5 und 1000 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 90/10 eluiert. Beide Enantiomere von BiMSuM wurden in der Fraktion 95/5 eluiert. Die Fraktionen wurden über HPLC analysiert (NH&sub2;-Säule, die fähig ist, die beiden Enantiomere zu trennen). Die angereicherten Fraktionen des einen oder des anderen Enantiomers wurden vereinigt und eingedampft. Die Analyse wurde über NH&sub2;-HPLC und ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;) ausgeführt:
R,S-BiMSuM/R,R-BiMSuM einer Enantiomerenreinheit 87/13 : 4,5 g
R,S-BiMSuMIR,R-BiMSuM einer Enantiomerenreinheit 05/95 : 0,6 g

9.2 Methyl-di-ethylsulfoxid (Bis ethylsulfinyl)methan, BiESuM) (=CH&sub3;-CH&sub2;-SO-CH&sub2;-SO- CH&sub2;-CH&sub3;)

4 ml CH&sub3;CH&sub2;SOCH&sub2;SCH&sub2;CH&sub3; (4,45 g, 29 mmol; Fluka 02845) wurden bei Raumtemperatur in 25 ml Methanol verdünnt. Die Lösung wurde gerührt und bei 0ºC gehalten. 7 g NaIO&sub4; (33 mmol) in 50 ml Wasser wurden tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 15 h bei 0ºC gehalten. Das Fortschreiten der Reaktion wurde über Dünnschichtchromatographie kontrolliert (DC, Lösungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 90/10, Nachweis über 12, KMnO&sub4;; CH&sub3;CH&sub2;SOCH&sub2;SCH&sub2;CH&sub3;, Rf = 0,95; CH&sub3;CH&sub2;SOCH&sub2;SOCH&sub2;CH&sub3;, Rf = 0,7). Das Reaktionsgemisch würde über Celite filtriert, das mit 300 ml Wasser, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; und dann mit 200 ml Methanol gespült wurde. Die wässrige Phase wurde dreimal mit CH&sub2;Cl&sub2; und dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde gereinigt, und die Fraktionen, die die beiden Enantiomere enthielten, wurden über 3 Durchläufe durch ein Silicasäule angereichert (ID 2 cm, 38 g Siliciumdioxid m CH&sub2;Cl&sub2;) und mit 100 ml CH&sub2;Cl&sub2;, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 99/1, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 97/3, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 95/05, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 92,5/7,5, 200 ml CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH: 90/10 eluiert. Beide Enantiomere von BiESuM eluierten in der Fraktion 95/5. Die Fraktionen wurden über HPLC analysiert (Silicasäule, die fähig ist, die beiden Enatiomere zu trennen). Die angereicherten Fraktionen des einen oder des anderen Enantiomers wurden vereinigt und eingedampft. Die Analyse wurde über Siliciumdioxid- HPLC und 'H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,89 (quint., 2H, -SO-CH&sub2;-SO-), 3,1 (quad., 4H, -CH&sub2;-), 1,40 (t, 6H, -CH&sub3;), ausgeführt.
Fraktion 1: R,S-BiESuM/R,R-BiESuM einer Enantiomerenreinheit 84/16 : 1,9 g
Fraktion 2: R,S-BiESuM/R,R-BiESuM einer Enantiomerenreinheit 16/84 : 0,075 g

Claims

1. Zusammensetzung umfassend eine Mischung von mindestens einem therapeutisch wirksamen Polynucleotid und mindestens einer aprotischen, polaren Verbindung, die ausgewählt ist aus den Verbindungen wie definiert durch:

(a) Formell:

wobei R1 und R2 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Fluoroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls substituiert sind, mit der Maßgabe, daß, wenn R1 oder R2 ein Rest mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen ist, R2 beziehungsweise R1 ein Rest mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen ist,

so daß es für R1 und R2 möglich ist, verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren;

(b) Formel II:

wobei R3 und R4 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Flouroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkylreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls wiederholt sind, die linear oder verzweigt sind und die gegebenenfalls substituiert sind,

so daß es für R3 und R4 möglich ist, verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren;

(c) Formel III:

wobei R3 und R4 identisch oder unterschiedlich sind und Aryl-, Alkyl-, Cycloalkyl-, Flouroalkyl-, Alkenyl- oder Oxyalkylreste von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenfalls wiederholt sind, die linear oder verzweigt sind und die gegebenenfalls substituiert sind, R5 unabhängig voneinander in jeder [R5-S]n-Wiederholung (CH&sub2;)x ist, wobei x = 1 bis 6, mit R5, der gegebenenfalls substituiert ist,

n = 1 bis 50,

so daß es für R3 und R4 möglich ist, verbunden zu sein, um das Molekül zu zyklisieren; oder

(d) Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, oder ein Derivat davon.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die aprotische, polare Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Di-n-Propylsulphoxid (DPSO), Tetramethylensulphoxid (TEMSO), Dimethylsulphon, Sulpholan, 1-Methyl-2- Pyrrolidon und ihre Derivate.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid ein Polynucleotid ist, das frei ist von einer Verbindung, die die Einführung in eine Zielzelle erleichtert.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid ein Polynucleotid ist, das mit mindestens einem viralen Polypeptid assoziiert ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid ein Polynucleotid ist, das mit mindestens einem kationischen Amphiphil assoziiert ist, insbesondere mit einem Lipid.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid ein Polynucleotid ist, das mit mindestens einem kationischen oder neutralen Polymer assoziiert ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polynucleotid ein Antisense- Polynucleotid ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polynucleotid ein Ribozym ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polynucleotid ein Gen von Interesse umfaßt und Elemente, die es ermöglichen, daß das Gen von Interesse exprimiert wird.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Polynucleotid ein vollständiges Polypeptid oder einen Teil davon codiert.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine therapeutische Wirkung aufweist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine prophylaktische Wirkung aufweist, insbesondere eine immunogene Wirkung.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid ein Enzym, ein Hormon, ein Zytokin, ein Membranrezeptor, ein Antikörper, ein Faktor, der die Transkription, Translation oder Replikation reguliert und der an der Transkriptstabilität beteiligt ist, ein Strukturpolypeptid, ein Polypeptid, das einen Membrankanal ausbildet, ein Transportpolypeptid, ein Adhäsionsmolekül oder ein Ligand ist.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die aprotische, polare Verbindung in wässriger Lösung ist.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Volumen der polaren Verbindung zwischen 15 und 20% des Gesamtvolumens der Zusammensetzung darstellt.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die aprotische polare Verbindung in Wasser in Lösung ist.

17. Arzneimittel umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

18. Arzneimittel nach Anspruch 17 zur Einführung von mindestens einer therapeutisch wirksamen Substanz in das Innere einer Zielzelle.

19. Arzneimittel nach Anspruch 17 oder 18, das ausgelegt ist zur Verabreichung über die intramuskuläre Route oder durch Inhalation, intratracheale Injektion, Instillation oder als Aerosol.

20. Vakzin umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

21. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 17 bis 19 oder das Vakzin nach Anspruch 20 zur Verwendung in Gentherapie.

22. Diagnostische Zusammensetzung umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.

23. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Einführung von mindestens einem therapeutisch wirksamen Polynucleotid in Zielzellen in vitro oder in vivo.

24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Zielzelle eine Säugerzelle ist.

25. Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Zielzelle eine Muskelzelle ist.

26. Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Zielzelle eine Zelle der Atemwege ist.

27. Verfahren zur Einführung eines therapeutisch wirksamen Polynucleotids in eine Zielzelle in vitro, wobei die Zeile mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche von 1 bis 16 in Kontakt gebracht wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, das einen zusätzlichen Schritt beinhaltet, der daraus besteht, die Zusammensetzung anzuwärmen, bevor sie in Kontakt gebracht wird mit der Zelle.