DE69909041T2

DE69909041T2 - Verwendung von Magnesium (Mg2+) zur Erhöhung der Gen-Verabreichung bei Gentherapie

Info

Publication number: DE69909041T2
Application number: DE69909041T
Authority: DE
Inventors: Serge Braun
Original assignee: Transgene SA; Association Francaise Contre les Myopathies
Current assignee: Association Francaise Contre les Myopathies
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-10-01
Also published as: JP5172054B2; EP1004320B1; PT1004320E; US20020019357A1; AU767294B2; ATE243531T1; CA2284399A1; JP2000143549A; US20020156045A1; CA2284399C; ES2201611T3; DK1004320T3; DE69909041D1; EP0998945A1; EP1004320A1; AU5139799A; US6881724B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Magnesium (Mg²⁺) zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Verbesserung der Transfektion eines Polynucleotides in eine Zelle. Eine derartige Zusammensetzung ist nützlich bei Gentherapie, Impfung und jeder therapeutischen oder prophylaktischen Situation, bei der ein Produkt auf Genbasis Zellen in vivo verabreicht wird.
Im allgemeinen hält man Gentherapie für grundsätzlich anwendbar bei Erbkrankheiten (zystische Fibrose, Dystrophien, Hämophilien etc.), bei denen man durch das Einführen eines funktionalen Gens eine dauerhafte Heilung erreichen kann. Eine weitaus größere Gruppe von Krankheiten, vor allem erworbene Krankheiten (Krebs, AIDS, Multiple Sklerose etc.), könnte jedoch behandelbar werden, indem man vorübergehend Wirtszellen zur Produktion nützlicher Proteine anregt.
Verwendungen sind, zum Beispiel, die Behandlung von Muskeldystrophien oder von zystischer Fibrose. Die Gene der Duchenne/Becker-Muskeldystrophie und der zystischen Fibrose wurden identifiziert und codieren Polypeptide, die als Dystrophin – bzw. Cystic-Fibrosis-Transmembrane-Conductance-Regulator (CFTR) bezeichnet werden. Eine direkte Expression dieser Gene innerhalb der Muskel- bzw. Lungenzellen von Patienten sollte zu einer signifikanten Verbesserung der Symptome durch Expression des funktionellen Polypeptides in den Zielgeweben beitragen. Darüberhinaus lassen Studien an zystischer Fibrose die Vermutung zu, dass man die Expression des CFTR-Genproduktes nur in etwa 5% der epithelialen Lungenzellen erreichen muss, um die pulmonalen Symptome signifikant zu verbessern.
Eine andere Verwendung der Gentherapie ist die Impfung. Hierbei kann das immunogenetische Produkt, das von dem in die Zellen eines Vertebraten eingeführten Polynucleotid codiert wird, exprimiert und sezerniert oder von den Zellen im Zusammenhang mit den Haupthistokompatibilitätsantigenen präsentiert werden, wobei eine Immunantwort gegen das exprimierte Immunogen hervorgerufen wird. Man kann funktionelle Polynucleotide mit einer Vielfalt von Techniken in Zellen einführen, wobei es entweder zu einer vorübergehenden Expression des gewünschten Gens kommt, was als vorübergehende Transfektion bezeichnet wird, oder zu einer permanenten Transformation der Wirtszellen, die von der Aufnahme des Polynucleotides in das Wirtsgenom resultiert.
Erfolgreiche Gentherapie hängt davon ab, ob es zu einem wirkungsvollen Transfer und zur Expression der genetischen Information innerhalb der Zellen eines lebenden Organismus kommt. Die meisten Transfermechanismen, die bis heute verwendet werden, bedienen sich viraler Vektoren, besonders Adeno- und retroviraler Vektoren. Viren haben diverse und hochraffinierte Mechanismen entwickelt, um dieses Ziel zu erreichen, dazu gehören das Durchqueren der Zellmembran, das Umgehen eines lysosomalen Abbaus oder das Einbringen ihres Genoms in den Zellkern, und sie werden konsequenterweise in vielen Anwendungen mit Gentransfer benutzt, die zur Impfung oder Gentherapie des Menschen dienen. Die Verwendung von Viren leidet unter mehreren Nachteilen: retrovirale Vektoren können keine große DNA unterbringen (zum Beispiel hat das Dystrophin-Gen etwa 13 kb), das retrovirale Genom wird in die Wirtszell-DNA integriert und kann dadurch in der Empfängerzelle genetische Veränderungen auslösen, infektiöse Viruspartikel könnten sich im Organismus oder in der Umwelt ausbreiten und adenovirale Vektoren können in behandelten Patienten eine starke Immunantwort hervorrufen (Mc Coy et al., Human Gene Therapy 6 (1995), 1553–1560; Yang et al., Immunity 1 (1996), 433–442). Trotz dieser Rückschläge sind virale Vektoren aufgrund ihrer Effizienz zur Zeit die besten Transfersysteme.
Man hat nicht-virale Transfersysteme entwickelt, die auf Rezeptor-vermittelten Mechanismen beruhen (Perales et al., Eur. J. Biochem. 226 (1994), 255–266; Wagner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14 (1994), 113–135), auf Polymervermittelter Transfektion wie etwa Polyamidoamin (Haensler und Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372–379), dendritisches Polymer (W0 95/24221), Polyethylenimin oder Polypropylenimin (WO 96/02655), Polylysine (US-A-5 595 897 oder FR 2 719 316) oder auf Lipid-vermittelter Transfektion (Felgner et al., Nature 337 (1989), 387–388) wie etwa DOTMA (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413–7417), DOGS oder Transfectam^TM (Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982–6986), DMRIE oder DORIE (Felgner et al., Methods 5 (1993), 67–75), DC-CHOL (Gao und Huang, BBRC 179 (1991), 280–285), DOTAP^TM (McLachlan et al., Gene Therapy 2 (1995), 674–622) oder Lipofectamin^TM. Diese Systeme haben hinsichtlich einer großangelegten Produktion, Sicherheit, Erreichen transfektierbarer Zellen, niedriger Immunogenität und der Kapazität, große DNA-Fragmente zu transferieren, potenzielle Vorteile. Dennoch ist ihre Effektivität in vivo noch begrenzt.
Schließlich haben Wolff et al., (Science 247 (1990), 1465–1468) 1990 gezeigt, dass es bei der Injektion von nackter RNA oder DNA ohne ein spezielles Transfersystem direkt in den Skelettmuskel einer Maus, innerhalb der Muskelzellen zur Expression von Reporter-Genen kommt. Diese Technik zur Zell-Transfektion bietet den Vorteil der Einfachheit und man hat Experimente durchgeführt, die die Brauchbarkeit dieses Systems für den Transfer in die Lunge (Tsan et al., Am. J. Physiol. 268 (1995), L1052–L1056; Meyer et al., Gene Therapy 2 (1995), 450–460), ins Gehirn (Schwartz et al., Gene Therapy 3 (1996), 405–411), in die Gelenke (Evans und Roddins, Gene Therapy for arthritis; In Wolff (ed) Gene therapeutics: Methoden und Verwendungen des direkten Gentransfers. Birkhaiser. Boston (1990), 320–343), in die Schilddrüse (Sikes et al., Human Gen. Ther. 5 (1994), 837–844), unter die Haut (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9519–9523) und in die Leber (Hickman et al., Hum. Gene Ther. 5 (1994), 1477–1483) unterstützen.
Trotzdem beobachteten Davis et al. (Human Gene Therapy 4 (1993), 151–159 und Human MoLGenet. 4 (1993), 733–740) eine große Expressionsvariabilität von nackter DNA, die in vivo in den Skelettmuskel injiziert worden war, was zum Beispiel zur Behandlung der primären Myopathien nicht ausreichend wäre. Die Autoren schlagen zur Verbesserung der Effektivität des Gentransfers Lösungen vor, bei denen man die Muskeln mit einer relativ großen Menge hypertoner Saccharose oder mit Toxinen, zum Beispiel dem Cardiotoxin der Schlange, vorbehandelt, um die Muskelregeneration zu stimulieren. Dennoch wären diese Methoden, obwohl vielversprechend, nicht zur Behandlung des Menschen geeignet.
Somit sind die verfügbaren Transfermethoden hinsichtlich der Sicherheit oder Effektivität ihrer Durchführung bei einer in vivo-Gentherapie, nicht zufriedenstellend.
Daher ist das vorliegender Erfindung zu Grunde liegende technische Problem die Bereitstellung verbesserter Methoden und Mittel zum Transfer von Nukleinsäuremolekülen bei der Gentherapie.
Dieses technische Problem wird gelost durch die Bereitstellung der Ausführungsformen, wie in den Ansprüchen definiert.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Magnesium (Mg²⁺) zur Herstellung einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung zur in vivo -Transfektion eines Polynucleotides in eine Zelle bei Gentherapie oder Impfung, wobei Magnesium in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 10 mM vorhanden ist. Man fand überraschenderweise heraus, dass die spezifische Zugabe von Magnesium bei der Transfektion eines Polynucleotides in Vertebratengewebe zu einer dramatischen Verbesserung der Transfektions-Effektivität führt. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Magnesium (Mg²+) zur Herstellung eines Arzneimittels zur verbesserten Transfektion eines Polynucleotides in eine Zelle. Diesbezüglich meint der Begriff "verbesserte Transfektion" im Umfang der vorliegenden Erfindung, eine effizientere Aufnahme eines Polynucleotides durch Zellen, wenn Magnesium (Mg²⁺) anwesend ist, im Vergleich mit einer Aufnahme ohne Magnesium. Dies kann bestimmt werden, indem man die ohne die Verwendung von Magnesium aufgenommene Polynucleotidmenge, mit derjenigen Menge vergleicht, die von den Zellen aufgenommen wurde, wenn man unter gleichen experimentellen Bedingungen Magnesium verwendet hat. Vorzugsweise kann man die verbesserte Transfektion durch eine erhöhte Expression des in die Zellen transferierten Polynucleotides bei Verwendung von Magnesium (Mg²⁺), im Vergleich zu einer Situation ohne Magnesium (Mg²⁺), bestimmen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind besonders geeignet für den Transfer von Polynucleotiden in Zellen oder Gewebe eines Individuums im Umfang eines gentherapeutischen Verfahrens, sind aber nicht darauf begrenzt. Der Begriff "Gentherapie-Verfahren" wird bevorzugt verstanden als ein Verfahren zur Transfektion eines Polynucleotides in Zellen in vivo . "Gentherapie" im besonderen bezieht sich auf den Fall, dass das Genprodukt in einem Zielgewebe exprimiert wird, sowie auf den Fall, dass das Genprodukt ausgeschieden wird, besonders in die Blutbahn.
Im Umfang der vorliegenden Erfindung meint der Begriff "Transfektion" den Transfer eines Polynucleotides in eine Zelle, wobei das Polynucleotid nicht mit Viruspartikeln assoziiert ist. Somit muß Transfektion unterschieden werden von Infektion, die sich auf Polynucleotide bezieht, die mit Viruspartikeln assoziiert sind.
Es wurde gezeit, dass Magnesium Mg²⁺.

– die Interaktion des Virus mit Wasser reduziert, was zu einem Rückgang der Wasseraufnahme in das Viruscapsid führt (Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 342 (1997), 108–116);
– an Nukleinsäuren bindet (Rowatt und Williams, J. Inorg. Biochem. 46 (1992), 87–97);
– bei HitzeVerwendung die DNase-l-Inaktivierung beeinflusst (Bickler et al., Biotechniques 13 (1992), 64–6);
– an Stoffwechselfunktionen wie der Glykolyse, der RNA/DNA-Synthese oder der Proteinsynthese beteiligt ist (Günther, Magnesium 5 (1986), 53–9);
– bei der Bindung des C-Proteins (De et al., Biochemistry 37 (1998), 3831–8) oder der EcoRV-Restriktionsendonuklease (Thielking et al., Biochemistry 31 (1992), 3727–32) an ihre spezifische DNA-Bindestelle als Cofaktor agiert.

Die Zusammenfassung einer japanischen Patentanmeldung (J08308573) offenbart ein in vitro -Verfahren, bei dem ein Gen unter Verwendung eines Virus als Vektor, der in einem Virus-Infektions-Medium hergestellt wird, das serumfreie Bestandteile oder zweiwertige Metallionen, ausgewählt aus Mg, Ca und Zn, enthält, kombiniert mit einem Zeltkultur-Medium, das auf Aminosäuren basiert, in Zellen eingebracht wird.
Der Begriff "Magnesium (Mg²⁺)" wie er hier verwendet wird, bedeutet das zweiwertige Magnesium-Kation. Ein derartiges Produkt ist im Handel assoziiert mit einem oder mehreren biologisch akzeptablen Anionen, wie etwa Bisulfit, Chromat, Fluorid, Gluconsäure, Azetat, Hydroxid, lodid, Methoxid, Oxid, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid etc. (siehe zum Beispiel Aldrich Katalog, 1994/1995) erhältlich. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist Magnesium (Mg²⁺) mit Chlorid assoziiert (MgCl₂).
Die Magnesium-Menge in den hergestellten Zusammensetzungen bewegt sich, gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung, zwischen etwa 0,1 bis etwa 10 mM Magnesium, noch besser sind 0,5 mM. Diese Konzentration kann in bestimmten Fällen mit beeinflussbarer Magnesium-Konzentration auch vom Fachmann angeglichen werden. Enthält die therapeutische Zusammensetzung zum Beispiel zusätzlich Chelate, wie EDTA, wäre es zu bevorzugen, die Magnesium-Konzentration zu steigern, um einen durch die Chelation bedingten Magnesium-Verlust zu kompensieren. Dies kommt vor, wenn das Polynucleotid zuvor in einem Puffer wie TE (Tris-EDTA) aufbereitet worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die therapeutische Zusammensetzung, welche gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, in einer Form zur Verabreichung in Vertebraten-Gewebe. Diese Gewebe schließen Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe, Knochen, Knorpel, Pankreas, Niere, Gallenblase, Magen, Eingeweide, Hoden, Eierstock, Uterus, Enddarm, Nervensystem, Auge, Drüse, Bindegewebe, Blut, Tumor, etc., ein. Zellen, bei denen die verbesserte Transfektion eines fremden Polynucleotides möglich wäre, gehören zu jedem der aufgelisteten Zielgewebe (Muskelzellen, Atemwegszellen, hämatopoetische Zellen etc.). Die Verabreichung kann durch intradermale, subdermale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, intracerebrale, intratracheale, intraarterielle, intraperitoneale, intravesicale, intrapleurale, intracoronare oder intratumorale Injektion mit einer Spritze oder anderen Hilfsmitteln erfolgen. Eine transdermale Verabreichung wird ebenso in Erwägung gezogen, wie eine Inhalation oder Aerosol-Verabreichung.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient die therapeutische Zusammensetzung, die der Verwendung gemäß hergestellt wurde, zur Einführung in Muskelgewebe, am bevorzugsten durch intramuskuläre Injektionswege.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von Magnesium zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für eine verbesserte Transfektion eines Polynucleotides in eine Zelle bereit, wobei diese therapeutische Zusammensetzung unabhängig von einer zweiten Verabreichung, die aus der Verabreichung einer mindestens ein Polynucleotid enthaltenden Zusammensetzung besteht, verabreicht wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die erste Verabreichung vor, gleichzeitig mit oder auf die zweite Verabreichung folgend, und umgekehrt, erfolgen. Die Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung und die zweite Verabreichung können mit verschiedenen oder identischen Transferwegen (systemischer und gezielter Transfer, oder zum Beispiel gezielte Transfers) erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte jede in das gleiche Zielgewebe und – besonders bevorzugt – durch Injektion erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, umfasst die therapeutische Zusammensetzung weiterhin mindestens ein Polynucleotid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das in der Zusammensetzung enthaltene Polynucleotid ein Gen und ist zu dessen funktioneller Expression in der Zelle befähigt. Das Polynucleotid kann eine DNA oder RNA sein, ein- oder doppelsträngig, linear oder kreisförmig, natürlich oder synthetisch, modifiziert oder nicht (siehe US 5525711 , US 4711955 oder EP-A 302 175 für modifizierte Beispiele). Es kann, inter alia, eine genomische DNA, eine cDNA, eine mRNA, eine Antisense-RNA, eine ribosomale RNA, ein Ribozym, eine Transfer-RNA oder DNA, die solche RNAs codiert, sein. "Polynucleotide" und "Nukleinsäuren" sind hinsichtlich der vorliegenden Erfindung Synonyme. Das Polynucleotid kann auch in Plasmidform vorliegen oder als lineares Polynucleotid, das mindestens eine exprimierbare Sequenz einer Nukleinsäure enthält, die ein Polypeptid, ein Ribozym, eine Antisense-RNA oder ein anderes gewünschtes Molekül für den Transfer in eine Zelle erzeugen kann. Das Polynucleotid kann auch ein Oligonucleotid sein, das in die Zelle geliefert werden soll, z. B. für Antisense- oder Ribozym-Funktionen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polynucleotid nackt (Wolff et al., Science 247 (1990), 1465–1468) oder es ist mit einem Polypeptid assoziiert oder verknüpft, mit der Maßgabe, dass wenn das Polypeptid viral ist, das Polynucleotid in Kombination mit dem viralen Polypeptid oder mit einer kationischen Verbindung oder mit jeder Verbindung, die teilhaben kann am Schutz und an der Aufnahme des Polynucleotides in die Zellen, keine infektiösen Viruspartikel bildet (siehe Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129–1144 als Überblick). Kationische Verbindungen an die das Polynucleotid gebunden ist, sind vorzugsweise kationische Lipide, besonders die in WO 98/34910 offenbarten. Sowohl DNA als auch RNA können in Zellen transferiert werden, um dort ein gewünschtes Polypeptid zu bilden. Das Polynucleotid in der therapeutischen Zusammensetzung hat vorzugsweise die Form einer Plasmid-DNA. Wenn das Polynucleotid die richtige genetische Information enthält, wird es die Synthese von relativ großen Mengen der codierten Polypeptide lenken. Codiert das an die Zellen gelieferte Polynucleotid ein immunisierendes Polypeptid, kann die Verwendung gemäß der Erfindung benutzt werden, um eine verbesserte und effektive Immunität gegen infektiöse Substanzen einschließlich intrazellulärer Viren, sowie auch gegen Tumorzellen, zu erreichen. Die für die Expression durch eine Zielzelle benötigten genetischen Informationen umfassen sämtliche Elemente zur Transkription von DNA in mRNA und zur Translation von mRNA in ein Polypeptid. Transkriptionale Promotoren, die zur Verwendung in verschiedenen Vertebraten-Systemen geeignet sind, sind gut bekannt. Geeignete Promotoren schließen zum Beispiel virale Promotoren wie RSV, MPSV, SV40, CMV oder 7,5k, Vaccinia-Promotor, induzierbare Promotoren etc., ein. Das Polynucleotid kann auch Intronsequenzen, Ziel-Sequenzen, Transport-Sequenzen oder an der Replikation oder Integration beteiligte Sequenzen einschließen. Diese Sequenzen sind in der Literatur beschrieben worden und können vom Fachmann leicht erworben werden. Man kann das Polynucleotid, um es zu stabilisieren, auch mit spezifischen Komponenten wie Spermin modifizieren.
Im allgemeinen beträgt die Konzentration des Polynucleotides in der Zusammensetzung etwa 0,1 μg/ml bis etwa 20 mg/ml. Gemäß der Erfindung kann das Polynucleotid zu den Zielzellen, in die es eingeführt wird, homolog oder heterolog sein. Es ist vorteilhaft, wenn das Polynucleotid das Ganze oder einen Teil des Polypeptides, besonders eines therapeutischen oder prophylaktischen Polypeptids, codiert. Unter einem Polypeptid versteht man unabhängig von der Größe, ob glykosyliert oder nicht, jedes translationale Produkt eines Polynucleotides, einschließlich Peptide und Proteine. Therapeutische Polypeptide schließen als Paradebeispiel diejenigen Polypeptide ein, die fehlen- oder mangelhafte Proteine in einem Tier oder einem menschlichen Organismus kompensieren können, oder solche, die durch toxische Wirkungen schädliche Zellen begrenzen oder aus dem Körper entfernen. Sie können auch Immunität verleihende Polypeptide sein, die als endogene Immunogene wirken, um eine humorale oder zelluläre Antwort, oder beides, zu provozieren. Beispiele für Polypeptide, die von dem Polynucleotid codiert werden, sind Enzyme, Hormone, Cytokine, Membranrezeptoren, strukturelle Polypeptide, Transport-Polypeptide, Adhäsine, Liganden, Transkriptions-Faktoren, Transduktions-Faktoren, Replikations-Faktoren, Stabilisations-Faktoren, Antikörper, ganz besonders CFTR, Dystrophin, die Faktoren VIII oder IX, E6 oder E7 von HPV, MUC1, BRCA1, Interferone, Interleukin (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12), GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), das tk-Gen des Herpes- Simplex-Typ-1-Virus (HSV-1), p53 oder VEGF. Das Polynucleotid kann auch einen Antikörper codieren. Diesbezüglich umfasst ein Antikörper ganze Immunglobuline jeder Klasse, chimerische Antikörper und Hybrid-Antikörper mit doppelten oder multiplen Antigen- oder Epitop-Spezifitäten und Fragmente wie etwa F(ab)₂, Fab', Fab-enthaltende Hybrid-Fragmente und Anti-Idiotypen ( US 4.699.880 ).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung des weiteren mindestens eine Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Chloroquin, protischen Verbindungen, wie Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon, oder Derivate davon, aprotische Verbindungen, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-Propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder Derivaten. Die Zusammensetzung kann mindestens eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytokinen, besonders Interleukin-10 (IL-10) und Nukleaseinhibitoren, wie zum Beispiel Actin G, umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann man die, gemäß der Verwendung der Erfindung hergestellte Zusammensetzung, in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Menschen oder Tieren, verwenden. In diesem speziellen Fall kann die Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten (Beispiele siehe in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^tn ed. 1980, Mack Publishing Co). Der Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und hat relativ geringe lonenstärke, wie etwa eine Saccharose-Lösung. Des weiteren kann er jedes relevante Lösungsmittel, wässrige oder teilweise wässrige Lipidträger umfassend steriles, pyrogenfreies Wasser, Dispersionsmittel, Überzüge und Äquvalente oder Verdünner (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), Emulgatoren, Solubilisierer oder Hilfsmittel enthalten. Der pH der pharmazeutischen Zubereitung wird passend eingestellt und gepuffert, um für in vivo-Applikationen geeignet zu sein.
Die gemäß der Verwendung der Erfindung hergestellten Zusammensetzungen kann man in einem Verfahren zur Transfektion eines Polynucleotides in Zellen verwenden, wobei das Verfahren den Kontakt dieser Zellen mit einer, zuvor gemäß der Verwendung der Erfindung hergestellten Zusammensetzung, gleichzeitig mit dem Kontakt oder nach dem Kontakt mit dem Polynucleotid, umfasst. Dieses Verfahren kann durch direkte Verabreichung der Zusammensetzung in Zellen des Tieres in vivo angewendet werden. Gemäß der Verfahrensweise der Erfindung, werden Ziel"Zellen" und "in vivo-Verabreichungsweg" wie oben beschrieben definiert.
Bei vielen therapeutischen Anwendungen verwendet man vorzugsweise Muskeln als Transferstelle und Expressionsort eines Polynucleotides, weil Tiere eine proportional große Muskelmasse haben, die üblicherweise durch direkte Injektion durch die Haut zugänglich ist. Dementsprechend kann in einem bevorzugten Fall, die gemäß der Verwendung der Erfindung hergestellte Zusammensetzung, in einem Verfahren zur Einführung eines vorzugsweise nackten Polynucleotides in Muskelzellen in vivo verwendet werden, wobei die Schritte der vorzugsweise intramuskulären Verabreichung in vivo mindestens ein Polynucleotid und Magnesium umfassen und das Polynucleotid in die Muskelzellen des Gewebes eingeführt wird. Das Polynucleotid kann ein therapeutisches Polypeptid codieren, das von den Muskelzellen expimiert und nach der Kontaktaufnahme schließlich in die Blutbahn sezerniert wird, um den Vertebraten zu therapieren. In ähnlicher Weise kann es ein immunogenetisches Polypeptid codieren, das von den Muskelzellen nach der Kontaktaufnahme exprimiert wird und eine Immunantwort auslöst, wodurch der Vertebrat immunisiert wird. Ein wichtiger Aspekt in diesem Zusammenhang ist ein Verfahren zur Behandlung von muskulärer Dystrophie, wobei das Polynucleotid wirksam Dystrophin codiert. Die Zusammensetzung wird in einem derartigen Verfahren vorzugsweise ins Muskelgewebe eingebracht.
Die Erfindung wurde anschaulich beschrieben und es versteht sich, dass die verwendete Terminologie eher beschreibender Natur als limitierend gedacht ist. Es sind im Hinblick auf das oben gesagte offensichtlich viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Verständlicherweise kann die Erfindung deshalb, innerhalb des Umfangs der Ansprüche, anders als spezifisch beschrieben, benutzt werden.
1: zeigt die gegensätzlichen Effekte von CaCl₂ und MgCl₂ auf die intramuskuläre Transfektion von pTG11033. Die Luciferase-Aktivität der rechten und linken vorderen Tibialis-Muskeln der Maus wurde 7 Tage nach Injektion mit 25 μg Plasmid, dem man 0.9% NaCl-Puffer (Kontrolle, NaCl) oder entweder 0,1 bis 100 mM CaCl₂ oder 100 mM MgCl₂ hinzugefügt hatte, gemessen. Die Balken sind die Mittelwerte der RLU (Relative Light Unit) pro Minute pro mg Protein +/- s. e. m. aus 6 Bestimmungen.
2 und 3: zeigen den MgCl₂-Dosiseffekt auf den intramuskulären Transfer des Luciferase-Plasmids (pTG11033). Die Balken sind die Mittelwerte der RLU pro Minute pro mg Protein +/- s. e. m aus 6 Meßwerten. Die Luciferase-Aktivität wurde 7 Tage nach Injektion von 25 μg Plasmid, dem entweder 0,9% NaCl (leere Balken) oder verschiedene Konzentrationen von MgCl₂ (schwarze Balken) hinzugefügt wurden, in C57BL/10-Mäuse (4 Mäuse pro Gruppe) gemessen.
Folgende Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
MATERIAL UND METHODEN
Folgende Materialien und Methoden werden in den Beispielen verwendet.
1. Intramuskuläre Verabreichung einer aus einem Plasmid und einem zweiwertigen lon bestehenden Zusammensetzung
Plasmid-DNA (pTG11033: CMV-Promotor, (3-Globin-Intron, Luciferase-Kassette – WO 98/34910) wurde gemäß Bischoff et al., Analytical Biochemistry 254 (1997), 69–81 aufbereitet. Vor der intramuskulären Injektion wurden die getesteten Moleküle mit der Plasmid-DNA-Herstellung gemischt. Pro Muskel wurden 25 μg der Plasmid-DNA in 5 bis 10 Wochen alte C57BL/10-Mäuse injiziert. Die 2 tibialis anterior-Muskeln (rechts und links) wurden injiziert (jeder Muskel wurde als eine Probe betrachtet). Des weiteren wurde für jeden Versuch sowohl der niedrigste als auch der höchste Wert der Luciferase-Aktivität ermittelt, was bedeutet, dass pro Versuch die Probenanzahl = (2 × Anzahl der Mäuse pro Versuch) – 2 gilt.
2. Muskelbiopsien und Luciferase-Messungen
Eine Woche nach der Injektion der Zusammensetzung wurden die Mäuse getötet und die vorderen Tibialis-Muskeln wurden entfernt und eingefroren.
Die Luciferase-Aktivität wurde mit einem herkömmlichen Meß-Kit (Luciferase Assay System, Promega) an ganzen Muskelextrakten quantifiziert. Kurz gesagt wurden die Muskeln getrennt bearbeitet und in 200 μl Reporter-Lysepufter (Promega) aufgelöst. 10 μl-Proben wurden in 96-Loch-Platten eingebracht und mit 100 μl des Substrates gemischt. Die Luciferase-Aktivität wurde als Anzahl der RLU pro Minute, pro mg Protein ausgedrückt.
3. Protein-Bestimmung
Mittels eines VCA-Protein-Assay-Kit (Pierce) wurde bei 10 μl-Proben der Proteingehalt gemessen.
BEISPIEL 1
Im Gegensatz zu Calcium (Ca²⁺) erhöht Magnesium (Mg²+) den Gentransfer eines Plasmids, das das Luciferase-Gen enthält
Bei diesem Beispiel wurde die Stammlösung des Plasmids pTG11033 in TE-Puffer (Tris 10 mM – EDTA 1 mM) bei einer Nukleinsäurekonzentration von 1 μg/μl hergestellt.
Stammlösungen von CaCl₂ und MgCl₂ wurden in Wasser in einer 1 M-Konzentration hergestellt. Pro Versuch wurde vier C57Bl/10-Mäusen in den rechten und linken vorderen Tibialis-Muskel verschiedene Zusammensetzungen, umfassend pTG11033 (25 μg/Muskel) und verschiedene Konzentrationen von Calciumchlorid (CaCl₂; 100, 10, 1, 0,1 mM) oder Magnesiumchlorid (MgCl₂; 100 mM), injiziert. Der Kontrollversuch wird unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, außer dass kein zweiwertiges lon, sondern 5 μl 0,9% NaCl hinzugefügt wird. Es wurden 30 μl injiziert. Die Ergebnisse werden in 1 dargestellt. Sie zeigen, dass die Zugabe von CaCl₂ zu einer dramatischen Inhibition der Luciferase-Aktivität in den injizierten Muskeln führt (abhängig von der Endkonzentration von CaCl₂ ein 3- bis 100-faches Absinken), auch bei der niedrigsten getesteten Konzentration (0,1 mM). Umgekehrt führte MgCl₂ zu einer erhöhten Luciferase-Aktivität in den injizierten Muskeln (ungefähr 3 mal höher im vorliegenden Beispiel).
BEISPIEL 2
Serienverdünnung von MgCl₂
In diesem Beispiel wurde das Plasmid pTG11033 in 0,9% NaCl aufbereitet und auf 1 μg/μl aufgefüllt. Die Serienverdünnung von MgCl₂ wurde in 0,9% NaCl hergestellt und zu der Stammlösung pTG11033 mit einem Endvolumen von 3O μl hinzugefügt. Die Kontrolle enthielt die gleiche Plasmidmenge mit 5 μl 0,9% NaCl. Die lonenstärke der MgCl₂-Lösungen wurde gemäß der dem Fachmann gut bekannten Verfahren, mit geeigneten Wassermengen ausgeglichen.
Wie bereits beschrieben, wurden pro Versuch vier Mäuse injiziert.
Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Sie zeigen, dass MgCl₂ einen Einfluss auf die Luciferase-Aktivität der injizierten Muskeln hat. Die niedrigste MgCl₂-Dosis (0,1 mM) hatte keine Wirkung auf die Luciferase-Aktivität des injizierten Muskels, während die Luciferase-Aktivität in Muskeln, die mit 1 mM MgCl₂ injiziert waren, höher war, ähnlich der Kontrolle mit 10 mM MgCl₂ und bei höheren Konzentrationen stark inhibiert war.
Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2 beschrieben, wurde ein genauerer Konzentrationsbereich von MgCl₂ (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 mM) ausgewertet. Man fand heraus, dass die optimale Konzentration bei 0,5 mM lag, wenn ein in 0,9% NaCl aufbereitetes Plasmid pTG11033 verwendet wurde.

Claims

Verwendung von Magnesium (Mg²⁺) zur Herstellung einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung zur in vivo-Transfektion eines Polynucleotids in eine Zelle bei Gentherapie oder Impfung, wobei Magnesium in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 bis etwa 10 mM vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Magnesium Magnesiumchlorid (MgCl₂) ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die therapeutische Zusammensetzung für eine Verabreichung in ein Vertebraten-Zielgewebe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verabreichung durch intradermale, subdermale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, intracerebrale, intratracheale, intraarterielle, intraperitoneale, intravesicale, intrapleurale, intracoronare oder intratumorale Injektion erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verabreichung in die Lunge durch Inhalation oder Aerosol-Verabreichung erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Zielgewebe Muskel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Verabreichung von Magnesium (Mg²⁺) unabhängig von einer zweiten Verabreichung erfolgt, die aus der Verabreichung einer mindestens ein Polynucleotid enthaltenden Zusammensetzung in das gleiche Zielgewebe besteht.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verabreichung von Magnesium (Mg²⁺) vor der zweiten Verabreichung erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polynucleotid ein Gen enthält und zur funktionellen Expression des Gens in der Zelle befähigt ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Polynucleotid nackt ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Polynucleotid mit kationischen Komponenten komplexiert ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die kationischen Komponenten kationische Lipide sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Polynucleotidkonzentration im Bereich von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 20 mg/ml liegt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Gen alle oder einen Teil der Dystrophin- oder Cystic-Fibrosis-Transmembrane-Conductance-Regulator- (CFTR)-Polypeptide codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Zusammensetzung weiterhin mindestens eine weitere Komponente umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Chloroquin, protischen Verbindungen wie Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder Derivaten, aprotischen Verbindungen wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-Propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder Derivaten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Zusammensetzung ferner mindestens eine weitere Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytokinen oder Aktin-G, umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen, injizierbaren Träger umfaßt.