JPH08308573A - 細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地 - Google Patents
細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地Info
- Publication number
- JPH08308573A JPH08308573A JP7121263A JP12126395A JPH08308573A JP H08308573 A JPH08308573 A JP H08308573A JP 7121263 A JP7121263 A JP 7121263A JP 12126395 A JP12126395 A JP 12126395A JP H08308573 A JPH08308573 A JP H08308573A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- virus
- cell
- serum
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ウィルスをベクターとして細胞に遺伝子を導
入する方法において、組換え遺伝子を有するウィルスと
宿主細胞とを、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地
に、無血清成分を添加するか、又は血清もしくは無血清
成分と共にＭｇ、Ｃａ及びＺｎから選ばれる２価金属イ
オンを添加したウィルス感染培地中で培養して、感染さ
せることを特徴とする、細胞中に遺伝子を導入する方法
及び上記ウイルス感染培地。 【効果】 上記ウイルス感染培地を用いることにより、
宿主細胞中へ遺伝子を効率よく導入することができ、ま
た宿主細胞の生存率の低下を最小限に抑えることができ
る。
入する方法において、組換え遺伝子を有するウィルスと
宿主細胞とを、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地
に、無血清成分を添加するか、又は血清もしくは無血清
成分と共にＭｇ、Ｃａ及びＺｎから選ばれる２価金属イ
オンを添加したウィルス感染培地中で培養して、感染さ
せることを特徴とする、細胞中に遺伝子を導入する方法
及び上記ウイルス感染培地。 【効果】 上記ウイルス感染培地を用いることにより、
宿主細胞中へ遺伝子を効率よく導入することができ、ま
た宿主細胞の生存率の低下を最小限に抑えることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、宿主細胞に組換え遺伝
子を有するウィルスを感染させることにより、細胞に遺
伝子を効率よく導入する方法に関する。さらに本発明
は、この方法に用いられるウィルス感染培地に関する。
本発明により、例えば欠陥遺伝子をもつ細胞にウィルス
をベクターとして正常遺伝子が導入された細胞は、遺伝
子疾患の治療剤として用いることができる。また、標的
細胞に治療上有用な生体物質を産生する遺伝子を効率よ
く導入することにより治療効果を上げることができる。
子を有するウィルスを感染させることにより、細胞に遺
伝子を効率よく導入する方法に関する。さらに本発明
は、この方法に用いられるウィルス感染培地に関する。
本発明により、例えば欠陥遺伝子をもつ細胞にウィルス
をベクターとして正常遺伝子が導入された細胞は、遺伝
子疾患の治療剤として用いることができる。また、標的
細胞に治療上有用な生体物質を産生する遺伝子を効率よ
く導入することにより治療効果を上げることができる。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞に遺伝子を導入する方法とし
て、ウィルスをベクターとして用いる方法が知られてい
る。即ち、一般にウィルスが細胞に感染すると、自分の
遺伝子を宿主細胞の核内にもぐり込ませて自己増殖を行
うことができる性質を利用して、有用な遺伝子だけを取
り出して遺伝子組換え技術等により人工的にウィルスの
遺伝子中に予め組み込んでおいて、このウィルスを宿主
細胞に感染させると、有用な遺伝子を宿主細胞内に導入
することができる。そして、この遺伝子が導入された細
胞は有用な生体物質を産生するので、例えば治療剤とし
て動物やヒトに用いることもできる。
て、ウィルスをベクターとして用いる方法が知られてい
る。即ち、一般にウィルスが細胞に感染すると、自分の
遺伝子を宿主細胞の核内にもぐり込ませて自己増殖を行
うことができる性質を利用して、有用な遺伝子だけを取
り出して遺伝子組換え技術等により人工的にウィルスの
遺伝子中に予め組み込んでおいて、このウィルスを宿主
細胞に感染させると、有用な遺伝子を宿主細胞内に導入
することができる。そして、この遺伝子が導入された細
胞は有用な生体物質を産生するので、例えば治療剤とし
て動物やヒトに用いることもできる。
【０００３】例えば、HUMAN GENE THERAPY vol.6 p145-
153 (1995)には、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスベクターを用いて、抗生物質及び２
％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）培地中で、ヒト気管上皮細胞に感染処理
を行い、この遺伝子が組み込まれた細胞を培養すること
が記載されている。また、BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICA
L COMMUNICATIONS vol.195 p1174-1183 (1993)には、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだアデノウィルス
ベクターを用いて、ＲＰＭＩ培地中でヒト単核細胞に感
染処理を行い、この遺伝子を組み込んだ細胞を培養する
ことが記載されている。
153 (1995)には、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスベクターを用いて、抗生物質及び２
％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）培地中で、ヒト気管上皮細胞に感染処理
を行い、この遺伝子が組み込まれた細胞を培養すること
が記載されている。また、BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICA
L COMMUNICATIONS vol.195 p1174-1183 (1993)には、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだアデノウィルス
ベクターを用いて、ＲＰＭＩ培地中でヒト単核細胞に感
染処理を行い、この遺伝子を組み込んだ細胞を培養する
ことが記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし従来の方法で
は、細胞の種類によって細胞内への遺伝子の導入率が低
く、例えば大部分の血球系の細胞には導入率が非常に低
く適用できないという問題があった。また、導入率を高
めるために感染処理時間を長くすると、細胞に障害が生
じて宿主細胞の生存率が低下するという問題があった。
従って、従来の方法では、対象となる細胞が限られるた
めに治療の対象が特定されたり、遺伝子導入率が低いた
めに、遺伝子導入を行った細胞の治療剤としての効果が
十分に期待できない場合があった。
は、細胞の種類によって細胞内への遺伝子の導入率が低
く、例えば大部分の血球系の細胞には導入率が非常に低
く適用できないという問題があった。また、導入率を高
めるために感染処理時間を長くすると、細胞に障害が生
じて宿主細胞の生存率が低下するという問題があった。
従って、従来の方法では、対象となる細胞が限られるた
めに治療の対象が特定されたり、遺伝子導入率が低いた
めに、遺伝子導入を行った細胞の治療剤としての効果が
十分に期待できない場合があった。
【０００５】本発明は、種々の細胞に高い導入率で遺伝
子を導入することが可能で、且つ宿主細胞の生存率の低
下を最小限に抑えて、細胞に遺伝子を導入する方法を提
供することを目的とする。また本発明は、この遺伝子導
入方法において用いられるウィルス感染培地を提供する
ことにある。
子を導入することが可能で、且つ宿主細胞の生存率の低
下を最小限に抑えて、細胞に遺伝子を導入する方法を提
供することを目的とする。また本発明は、この遺伝子導
入方法において用いられるウィルス感染培地を提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウィルスをベ
クターとして細胞に遺伝子を導入する方法において、組
換え遺伝子を有するウィルスと宿主細胞とを、下記のウ
ィルス感染培地中で感染させることを特徴とする、細胞
中に遺伝子を導入する方法に関する。
クターとして細胞に遺伝子を導入する方法において、組
換え遺伝子を有するウィルスと宿主細胞とを、下記のウ
ィルス感染培地中で感染させることを特徴とする、細胞
中に遺伝子を導入する方法に関する。
【０００７】本発明の方法に用いられるウイルス感染培
地は、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地に、無血清
成分を添加するか、又は血清もしくは無血清成分と共
に、２価金属イオンを添加したウィルス感染培地であ
る。本発明の最も好ましいウィルス感染培地は、細胞培
養培地に無血清成分と２価金属イオンを添加した培地で
ある。前記の２価金属イオンとしては、マグネシウムイ
オン、カルシウムイオン及び亜鉛イオンから選ばれたも
のが用いられるが、マグネシウムイオンが好ましい。
地は、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地に、無血清
成分を添加するか、又は血清もしくは無血清成分と共
に、２価金属イオンを添加したウィルス感染培地であ
る。本発明の最も好ましいウィルス感染培地は、細胞培
養培地に無血清成分と２価金属イオンを添加した培地で
ある。前記の２価金属イオンとしては、マグネシウムイ
オン、カルシウムイオン及び亜鉛イオンから選ばれたも
のが用いられるが、マグネシウムイオンが好ましい。
【０００８】細胞培養培地は、アミノ酸を０．０１〜
１，０００mmol/l、好ましくは０．１〜１００mmol/l含
むものであり、アミノ酸としては、宿主細胞に合わせて
適宜選択することができる。例えばヒトの細胞にウィル
スを感染させる場合には、必須アミノ酸２１種の中から
数種を適宜選択して水に溶解し培地とする。この培地
は、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium：アルギニン、
システイン、グルタミン、アラニン、ロイシン、メチオ
ニン等のアミノ酸を含む）、ＩＭＤＭ（Iscove's Modif
ied Dulbecco's Medium ：グルタミン、リシン、ロイシ
ン、アルギニン、ヒスチジン、セリン等のアミノ酸を含
む）、ＲＰＭＩ１６４０（アルギニン、グルタミン、ア
スパラギン、シスチン等のアミノ酸を含む）等として一
般的に知られ、また販売されているものが使用される。
１，０００mmol/l、好ましくは０．１〜１００mmol/l含
むものであり、アミノ酸としては、宿主細胞に合わせて
適宜選択することができる。例えばヒトの細胞にウィル
スを感染させる場合には、必須アミノ酸２１種の中から
数種を適宜選択して水に溶解し培地とする。この培地
は、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium：アルギニン、
システイン、グルタミン、アラニン、ロイシン、メチオ
ニン等のアミノ酸を含む）、ＩＭＤＭ（Iscove's Modif
ied Dulbecco's Medium ：グルタミン、リシン、ロイシ
ン、アルギニン、ヒスチジン、セリン等のアミノ酸を含
む）、ＲＰＭＩ１６４０（アルギニン、グルタミン、ア
スパラギン、シスチン等のアミノ酸を含む）等として一
般的に知られ、また販売されているものが使用される。
【０００９】無血清成分としては、血清以外の細胞の生
存を可能にする成分であればよく、例えば次の物質から
選ばれる数種を含有する。 （１）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）：０．５〜３０重
量％、好ましくは２〜５重量％ （２）インシュリン：０．１〜５０μg/ml、好ましくは
５〜２０μg/ml （３）ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）：１〜５００μ
g/ml、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌ （４）トランスフェリン：１〜１０００μｇ／ｍｌ、好
ましくは１００〜５００μg/ml （５）２−メルカプトエタノール：１×１０-6〜１×１
０-4mol/l 、好ましくは１×１０-5〜５×１０-5mol/l （６）ピルビン酸ナトリウム：０．１〜１，０００mg/
l、好ましくは１〜１０mg/l （７）リノール酸：０．１〜１，０００mg/l、好ましく
は１〜１０mg/l （８）コレステロール：０．１〜１，０００mg/l、好ま
しくは１〜１０mg/l （９）大豆脂質：０．１〜１，０００mg/l、好ましくは
１０〜５０mg/l さらに必要に応じて、ペニシリン：０．１〜１，０００
mg/l、好ましくは１０〜５０mg/l、ストレプトマイシ
ン：０．１〜１，０００mg/l、好ましくは１０〜５０mg
/lを含んでもよい。
存を可能にする成分であればよく、例えば次の物質から
選ばれる数種を含有する。 （１）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）：０．５〜３０重
量％、好ましくは２〜５重量％ （２）インシュリン：０．１〜５０μg/ml、好ましくは
５〜２０μg/ml （３）ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）：１〜５００μ
g/ml、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌ （４）トランスフェリン：１〜１０００μｇ／ｍｌ、好
ましくは１００〜５００μg/ml （５）２−メルカプトエタノール：１×１０-6〜１×１
０-4mol/l 、好ましくは１×１０-5〜５×１０-5mol/l （６）ピルビン酸ナトリウム：０．１〜１，０００mg/
l、好ましくは１〜１０mg/l （７）リノール酸：０．１〜１，０００mg/l、好ましく
は１〜１０mg/l （８）コレステロール：０．１〜１，０００mg/l、好ま
しくは１〜１０mg/l （９）大豆脂質：０．１〜１，０００mg/l、好ましくは
１０〜５０mg/l さらに必要に応じて、ペニシリン：０．１〜１，０００
mg/l、好ましくは１０〜５０mg/l、ストレプトマイシ
ン：０．１〜１，０００mg/l、好ましくは１０〜５０mg
/lを含んでもよい。
【００１０】なお、従来より知られている細胞培養培地
は、アミノ酸を主成分とする培地にヒトや動物の血清を
１〜２０％程度添加して調製される（血清含有培地）
が、ヒトや動物の血清中には、抗ウィルス抗体やその他
のウィルス阻害物質が含まれていることが多く、このた
めに遺伝子の導入率が低くなるので、無血清成分を添加
したものを用いる方がよい。
は、アミノ酸を主成分とする培地にヒトや動物の血清を
１〜２０％程度添加して調製される（血清含有培地）
が、ヒトや動物の血清中には、抗ウィルス抗体やその他
のウィルス阻害物質が含まれていることが多く、このた
めに遺伝子の導入率が低くなるので、無血清成分を添加
したものを用いる方がよい。
【００１１】２価金属イオンの原料としては、塩化物、
硫酸塩、硝酸塩等の水溶性の塩を用いる。２価金属イオ
ンの濃度は、１〜１００mmol/l、好ましくは５〜２０mm
ol/lである。
硫酸塩、硝酸塩等の水溶性の塩を用いる。２価金属イオ
ンの濃度は、１〜１００mmol/l、好ましくは５〜２０mm
ol/lである。
【００１２】本発明の最も好ましいウィルス感染培地
は、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地に、前記無血
清成分及びマグネシウムイオンを添加したものである。
は、アミノ酸を主成分とする細胞培養培地に、前記無血
清成分及びマグネシウムイオンを添加したものである。
【００１３】本発明のウィルス感染培地には、必要に応
じて、培地のｐＨを調節するための緩衝剤、細胞の種類
によってはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子）等の増殖因子、その他の添加剤を含ませて
もよい。
じて、培地のｐＨを調節するための緩衝剤、細胞の種類
によってはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子）等の増殖因子、その他の添加剤を含ませて
もよい。
【００１４】次に、本発明の細胞中に遺伝子を導入する
方法について説明する。本発明でベクターとして用いら
れるウィルスは、宿主細胞に感染し得るものであって、
目的とする遺伝子を組み込むことができるものの中から
選ばれるが、特に多種類の細胞に感染可能で、培養し易
く、組換え遺伝子を有するウィルスの作製が容易である
ものが好ましい。例えば、アデノウィルス、レトロウィ
ルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）等のウィルスを挙
げることができる。中でもアデノウィルスは、感染力が
強く、非分裂細胞にも感染可能であるので特に好まし
い。
方法について説明する。本発明でベクターとして用いら
れるウィルスは、宿主細胞に感染し得るものであって、
目的とする遺伝子を組み込むことができるものの中から
選ばれるが、特に多種類の細胞に感染可能で、培養し易
く、組換え遺伝子を有するウィルスの作製が容易である
ものが好ましい。例えば、アデノウィルス、レトロウィ
ルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）等のウィルスを挙
げることができる。中でもアデノウィルスは、感染力が
強く、非分裂細胞にも感染可能であるので特に好まし
い。
【００１５】このウィルスに組み込む遺伝子は、そのサ
イズがウィルスベクターに組み込み可能な範囲内のもの
であり、動物やヒトにとって有用な遺伝子である。ウィ
ルス中への遺伝子の組み込みは、公知の方法に準じて行
うことができる。例えばアデノウィルスへの遺伝子の組
み込みは、「バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入
と発現・解析法（羊土社、１９９４年、鐘ヶ江裕美他
著）」４３〜５８頁に記載されており、レトロウィルス
については、「Short protcols in molecular biology.
Second edition （John Wiley & Sons, 1992, New Yor
k 、Ausbel F.M.他著）」に記載されており、アデノ関
連ウィルスについては、「Viruses as therapeutic gen
e transfer vectors（Nienhuis A.W. 他著、Marcell De
kker inc.1993（Viruses and Bone Marrow, Young N.S.
編））」３５３〜４１４頁に記載されている。これら
の方法では、酵素やＤＮＡ合成装置など遺伝子工学の分
野で一般的に用いられている技術によって、ウィルス遺
伝子の不要部分を切りとり、代わりに有用な遺伝子をは
め込むことでウィルスベクターを作製する。
イズがウィルスベクターに組み込み可能な範囲内のもの
であり、動物やヒトにとって有用な遺伝子である。ウィ
ルス中への遺伝子の組み込みは、公知の方法に準じて行
うことができる。例えばアデノウィルスへの遺伝子の組
み込みは、「バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入
と発現・解析法（羊土社、１９９４年、鐘ヶ江裕美他
著）」４３〜５８頁に記載されており、レトロウィルス
については、「Short protcols in molecular biology.
Second edition （John Wiley & Sons, 1992, New Yor
k 、Ausbel F.M.他著）」に記載されており、アデノ関
連ウィルスについては、「Viruses as therapeutic gen
e transfer vectors（Nienhuis A.W. 他著、Marcell De
kker inc.1993（Viruses and Bone Marrow, Young N.S.
編））」３５３〜４１４頁に記載されている。これら
の方法では、酵素やＤＮＡ合成装置など遺伝子工学の分
野で一般的に用いられている技術によって、ウィルス遺
伝子の不要部分を切りとり、代わりに有用な遺伝子をは
め込むことでウィルスベクターを作製する。
【００１６】本発明で用いる宿主細胞は、目的に合わせ
て適宜選択することができる。例えばヒトの治療剤とし
て用いる場合は、血球系細胞等のヒト生体細胞が用いら
れる。本発明によれば、リンパ球、血球前駆細胞等の従
来の方法では遺伝子導入が困難であった細胞にも容易に
遺伝子を導入することができる。
て適宜選択することができる。例えばヒトの治療剤とし
て用いる場合は、血球系細胞等のヒト生体細胞が用いら
れる。本発明によれば、リンパ球、血球前駆細胞等の従
来の方法では遺伝子導入が困難であった細胞にも容易に
遺伝子を導入することができる。
【００１７】感染処理は、ウィルスベクターと宿主細胞
とを、前記のウィルス感染培地中で共存させ、１〜５０
℃、好ましくは３０〜４３℃、最も好ましくは３５〜３
９℃にて、０．１〜４８時間、好ましくは１〜２４時
間、１〜１０％程度の炭酸ガスを含む空気中に保持する
ことによって行う。温度及び感染時間は、ウィルス及び
宿主細胞の種類により適宜決定される。使用するウィル
スの量は、１〜１，０００moi 、好ましくは、５〜２０
０moiである。少なすぎると十分に感染が起こらず、ま
た貴重なウィルスを多量に使用するのは実用的でないか
らである。なお、moi は次式で示される単位である。 moi ＝ＰＦＵ／細胞数 （但し、ＰＦＵは、Plaque forming unit 、即ちウィル
スの力価である。）
とを、前記のウィルス感染培地中で共存させ、１〜５０
℃、好ましくは３０〜４３℃、最も好ましくは３５〜３
９℃にて、０．１〜４８時間、好ましくは１〜２４時
間、１〜１０％程度の炭酸ガスを含む空気中に保持する
ことによって行う。温度及び感染時間は、ウィルス及び
宿主細胞の種類により適宜決定される。使用するウィル
スの量は、１〜１，０００moi 、好ましくは、５〜２０
０moiである。少なすぎると十分に感染が起こらず、ま
た貴重なウィルスを多量に使用するのは実用的でないか
らである。なお、moi は次式で示される単位である。 moi ＝ＰＦＵ／細胞数 （但し、ＰＦＵは、Plaque forming unit 、即ちウィル
スの力価である。）
【００１８】ウィルス感染処理後、宿主細胞を必要に応
じて同培地で培養することにより、遺伝子にコードされ
ているタンパク質を発現させることができる。またウィ
ルスによっては、遺伝子を導入した細胞を十分な数まで
さらに増殖させてもよい。
じて同培地で培養することにより、遺伝子にコードされ
ているタンパク質を発現させることができる。またウィ
ルスによっては、遺伝子を導入した細胞を十分な数まで
さらに増殖させてもよい。
【００１９】以上の一連の処理を行った細胞は、例えば
遺伝子疾患の治療剤として用いることができる。本発明
によれば遺伝子の導入率が高いので、治療上有用な遺伝
子を持った細胞を多数作製でき、これを用いて優れた治
療効果が期待できる。
遺伝子疾患の治療剤として用いることができる。本発明
によれば遺伝子の導入率が高いので、治療上有用な遺伝
子を持った細胞を多数作製でき、これを用いて優れた治
療効果が期待できる。
【００２０】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
【００２１】〔実施例１〕〔血清・マグネシウムイオン
含有培地〕 ＩＭＤＭ(Iscove's Modified Dulbecco's Media、 GIBCO
社）に、ＦＣＳ（fetal calf serum、牛胎児血清）を濃
度１ vol％となるように加え、さらにマグネシウムイオ
ン濃度が１０mmol/lとなるように硫酸マグネシウム（Ｍ
ｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）を添加して、血清・マグネシウム
イオン含有培地を調製した。
含有培地〕 ＩＭＤＭ(Iscove's Modified Dulbecco's Media、 GIBCO
社）に、ＦＣＳ（fetal calf serum、牛胎児血清）を濃
度１ vol％となるように加え、さらにマグネシウムイオ
ン濃度が１０mmol/lとなるように硫酸マグネシウム（Ｍ
ｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）を添加して、血清・マグネシウム
イオン含有培地を調製した。
【００２２】一方、Journal of Virology vol.54 (198
5) 、７１１〜７１９頁に記載された方法を用いて、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子をアデノウィルスベクターに
組み込んだ。このウィルスとヒト白血病細胞株ＴＦ−１
とを、２５moi で、上記ウィルス感染培地中に共存さ
せ、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２４時間保持
して感染処理を行った。ついで、遠心分離操作により１
０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄してウ
ィルスを除去した。さらに、１０ vol％のＦＣＳ及び５
ng/ml のＧＭ−ＣＳＦを含むＩＭＤＭ培地中で、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃にて２日間培養した。その
結果、遺伝子導入率は３５％で、細胞の生存率は２６％
であった。
5) 、７１１〜７１９頁に記載された方法を用いて、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子をアデノウィルスベクターに
組み込んだ。このウィルスとヒト白血病細胞株ＴＦ−１
とを、２５moi で、上記ウィルス感染培地中に共存さ
せ、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２４時間保持
して感染処理を行った。ついで、遠心分離操作により１
０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄してウ
ィルスを除去した。さらに、１０ vol％のＦＣＳ及び５
ng/ml のＧＭ−ＣＳＦを含むＩＭＤＭ培地中で、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃にて２日間培養した。その
結果、遺伝子導入率は３５％で、細胞の生存率は２６％
であった。
【００２３】ここで、導入率および生存率の測定は次の
ように行った。 導入率： Ｂｌｕｏ−ｇａｌ染色法；Journal of Neuroscience Re
search vol.36 p88に記載の Friedrichらの方法に準じ
て、０．５％のグルタルアルデヒドで固定後、１mmol/l
のＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳ（Phosphate buffered salin
e)で３回洗浄後、１mg/ml のｂｌｕｏ−ｇａｌ、０．０
０５mol/l のＫ3 Ｆｅ（ＣＮ)6、１mmol/lのＭｇＣｌ2
を含むＰＢＳ中で３７℃、２４時間反応させ、血球計算
盤上で染色された細胞（導入細胞）と非染色細胞（非導
入細胞）をカウントして測定する。
ように行った。 導入率： Ｂｌｕｏ−ｇａｌ染色法；Journal of Neuroscience Re
search vol.36 p88に記載の Friedrichらの方法に準じ
て、０．５％のグルタルアルデヒドで固定後、１mmol/l
のＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳ（Phosphate buffered salin
e)で３回洗浄後、１mg/ml のｂｌｕｏ−ｇａｌ、０．０
０５mol/l のＫ3 Ｆｅ（ＣＮ)6、１mmol/lのＭｇＣｌ2
を含むＰＢＳ中で３７℃、２４時間反応させ、血球計算
盤上で染色された細胞（導入細胞）と非染色細胞（非導
入細胞）をカウントして測定する。
【００２４】生存率： トリパンブルー染色法；０．０４％トリパンブルー含有
生理食塩水溶液と細胞浮遊液を等量混和し、３分以内に
血球計算盤上で染色された細胞（死亡細胞）と非染色細
胞（生存細胞）をカウントして測定した。
生理食塩水溶液と細胞浮遊液を等量混和し、３分以内に
血球計算盤上で染色された細胞（死亡細胞）と非染色細
胞（生存細胞）をカウントして測定した。
【００２５】〔実施例２〕〔無血清成分含有培地〕 ＩＭＤＭ培地に無血清成分としてインシュリン１０μg/
ml、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２重量％、トランスフ
ェリン２００μg/ml及びＬＤＬ４０μg/mlとなるように
加えることにより、無血清成分含有培地を調製した。そ
の後、実施例１と同様に操作した。遺伝子導入率は３５
％で、細胞の生存率は６５．５％であった。
ml、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）２重量％、トランスフ
ェリン２００μg/ml及びＬＤＬ４０μg/mlとなるように
加えることにより、無血清成分含有培地を調製した。そ
の後、実施例１と同様に操作した。遺伝子導入率は３５
％で、細胞の生存率は６５．５％であった。
【００２６】〔実施例３〕〔無血清成分・マグネシウム
イオン含有培地〕 ＩＭＤＭ培地にインシュリン１０μg/ml、ＢＳＡ（牛血
清アルブミン）２％、トランスフェリン２００μg/ml及
びＬＤＬ４０μg/mlとなるようにそれぞれの物質を加
え、さらにマグネシウムイオン濃度が１０mmol/lとなる
ように硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）を添
加して、無血清成分・マグネシウムイオン含有培地を調
製した。その後は実施例１と同様に操作した結果、遺伝
子導入率は５３．５％で、細胞の生存率は６６％であっ
た。
イオン含有培地〕 ＩＭＤＭ培地にインシュリン１０μg/ml、ＢＳＡ（牛血
清アルブミン）２％、トランスフェリン２００μg/ml及
びＬＤＬ４０μg/mlとなるようにそれぞれの物質を加
え、さらにマグネシウムイオン濃度が１０mmol/lとなる
ように硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）を添
加して、無血清成分・マグネシウムイオン含有培地を調
製した。その後は実施例１と同様に操作した結果、遺伝
子導入率は５３．５％で、細胞の生存率は６６％であっ
た。
【００２７】〔比較例１〕〔血清含有培地〕 ＩＭＤＭ培地に、ＦＣＳを濃度１ vol％となるように加
え、血清含有培地を調製した。その後、実施例１と同様
に操作した。その結果、遺伝子導入率は２６．５％で、
細胞の生存率は２１％であった。
え、血清含有培地を調製した。その後、実施例１と同様
に操作した。その結果、遺伝子導入率は２６．５％で、
細胞の生存率は２１％であった。
【００２８】〔実施例４〕〔無血清成分・マグネシウム
イオン含有培地〕 ＩＭＤＭ培地に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）２unit/m
l 、インターロイキン３（ＩＬ−３）１０ng/ml 及びＳ
ＣＦ（stem cell factor）１０ng/ml となるようにそれ
ぞれの物質を加え、さらにマグネシウムイオン濃度が１
０mmol/lとなるように硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ）を添加して、無血清成分・マグネシウムイオ
ン含有培地を調製した。宿主細胞として造血前駆細胞Ｃ
Ｄ３４と、実施例１で作製したβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子組み込みアデノウィルスベクターとを、５０moi の
割合で上記培地中で共存させた。そして、１２時間、２
４時間、３６時間後にそれぞれ５０moi相当量のウィル
スを追加して添加し、４８時間まで５％炭酸ガスを含む
空気中、３７℃で感染処理した。４８時間後に、遠心分
離操作により１０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で
３回洗浄してウィルスを除去した。さらに、ＦＣＳ１０
vol％、エリスロポエチン２unit/ml 、インターロイキ
ン３１０ng/ml 及びＳＣＦ１０ng/ml を含むＩＭＤＭ培
地中で、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２４時間
培養した。実施例１と同様に操作した。その結果、遺伝
子導入率は２６％であった。即ち、ＣＤ３４のような遺
伝子の導入が極めて困難な細胞を用いても、本発明によ
れば遺伝子導入が可能であることが明らかになった。
イオン含有培地〕 ＩＭＤＭ培地に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）２unit/m
l 、インターロイキン３（ＩＬ−３）１０ng/ml 及びＳ
ＣＦ（stem cell factor）１０ng/ml となるようにそれ
ぞれの物質を加え、さらにマグネシウムイオン濃度が１
０mmol/lとなるように硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ）を添加して、無血清成分・マグネシウムイオ
ン含有培地を調製した。宿主細胞として造血前駆細胞Ｃ
Ｄ３４と、実施例１で作製したβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子組み込みアデノウィルスベクターとを、５０moi の
割合で上記培地中で共存させた。そして、１２時間、２
４時間、３６時間後にそれぞれ５０moi相当量のウィル
スを追加して添加し、４８時間まで５％炭酸ガスを含む
空気中、３７℃で感染処理した。４８時間後に、遠心分
離操作により１０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で
３回洗浄してウィルスを除去した。さらに、ＦＣＳ１０
vol％、エリスロポエチン２unit/ml 、インターロイキ
ン３１０ng/ml 及びＳＣＦ１０ng/ml を含むＩＭＤＭ培
地中で、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２４時間
培養した。実施例１と同様に操作した。その結果、遺伝
子導入率は２６％であった。即ち、ＣＤ３４のような遺
伝子の導入が極めて困難な細胞を用いても、本発明によ
れば遺伝子導入が可能であることが明らかになった。
【００２９】
【発明の効果】本発明のウィルス感染培地を用いること
により、ウィルスをベクターとして用いて、宿主細胞中
へ遺伝子を効率よく導入することができる。その結果、
宿主細胞の生存率の低下を最小限に抑えることができ、
医療上有用な遺伝子を効率よく導入した細胞は、治療剤
として高い治療効果を期待することができる。
により、ウィルスをベクターとして用いて、宿主細胞中
へ遺伝子を効率よく導入することができる。その結果、
宿主細胞の生存率の低下を最小限に抑えることができ、
医療上有用な遺伝子を効率よく導入した細胞は、治療剤
として高い治療効果を期待することができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 ウィルスをベクターとして細胞に遺伝子
を導入する方法において、組換え遺伝子を有するウィル
スと宿主細胞とを、アミノ酸を主成分とする細胞培養培
地に、無血清成分を添加するか、又は血清もしくは無血
清成分と共にＭｇ、Ｃａ及びＺｎから選ばれる２価金属
イオンを添加したウィルス感染培地中で感染させること
を特徴とする、細胞中に遺伝子を導入する方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法に用いられる、アミノ酸
を主成分とする細胞培養培地に、無血清成分を添加する
か、又は血清もしくは無血清成分と共にＭｇ、Ｃａ及び
Ｚｎから選ばれる２価金属イオンを添加したウィルス感
染培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7121263A JPH08308573A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7121263A JPH08308573A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308573A true JPH08308573A (ja) | 1996-11-26 |
Family
ID=14806930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7121263A Pending JPH08308573A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08308573A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0998945A1 (en) * | 1998-09-30 | 2000-05-10 | Transgene S.A. | Use of magnesium (Mg2+) for the enhancement of gene delivery in gene therapy |
| US9228202B2 (en) | 2009-10-01 | 2016-01-05 | Postech Academy-Industry Foundation | Intracellular viral vector delivery method employing iron ion/viral vector composite |
-
1995
- 1995-05-19 JP JP7121263A patent/JPH08308573A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0998945A1 (en) * | 1998-09-30 | 2000-05-10 | Transgene S.A. | Use of magnesium (Mg2+) for the enhancement of gene delivery in gene therapy |
| EP1004320A1 (en) * | 1998-09-30 | 2000-05-31 | Transgene S.A. | Use of magnesium (Mg2+) for the enhancement of gene delivery in gene therapy |
| US9228202B2 (en) | 2009-10-01 | 2016-01-05 | Postech Academy-Industry Foundation | Intracellular viral vector delivery method employing iron ion/viral vector composite |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2174846C2 (ru) | Опосредованный вирусом усиленный перенос днк | |
| JP4012688B2 (ja) | 遺伝子修飾したｃｄ３４−陰性付着成長性幹細胞および遺伝子療法におけるそれらの使用 | |
| US5911983A (en) | Gene therapy for Gaucher disease using retroviral vectors | |
| US6475481B2 (en) | Purging of stem cell products | |
| Watanabe et al. | Gene transfer into human bone marrow hematopoietic cells mediated by adenovirus vectors [see comments] | |
| Naffakh et al. | Sustained delivery of erythropoietin in mice by genetically modified skin fibroblasts. | |
| US9155749B2 (en) | Long lasting drug formulations | |
| US20090155229A1 (en) | Chondrocyte-based implant for the delivery of therapeutic agents | |
| EA010434B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
| JP2007511219A5 (ja) | ||
| Schuening et al. | Improved retroviral transfer of genes into canine hematopoietic progenitor cells kept in long-term marrow culture | |
| JPH06343477A (ja) | 医薬的および診断的使用のための組み換えフオーミーウイルスベクター、および組み換えフオーミーウイルスベクターの作製方法 | |
| EA012520B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
| CN114480505A (zh) | 间充质干细胞及其抗炎应用 | |
| CN112888777A (zh) | 用于造血细胞的基因修饰的方法 | |
| CN109504709A (zh) | 白蛋白启动子驱动的白蛋白表达载体 | |
| Valtieri et al. | Efficient transfer of selectable and membrane reporter genes in hematopoietic progenitor and stem cells purified from human peripheral blood | |
| WO2018207808A1 (ja) | 脳腫瘍治療用細胞製剤 | |
| JPH08308573A (ja) | 細胞への遺伝子導入方法及びそれに用いられるウィルス感染培地 | |
| WO2023230405A1 (en) | Methods for producing red blood cells | |
| Grinev et al. | Highly efficient transfer and stable expression of two genes upon lentivirus transduction of mesenchymal stem cells from human bone marrow | |
| JPH08308574A (ja) | 細胞への遺伝子導入方法 | |
| AU717974B2 (en) | Transduced human hematopoietic stem cells | |
| JP2003500336A (ja) | （自己）免疫疾患の治療におけるアポトーシス誘発剤の使用 | |
| WO2024003718A1 (en) | Methods and kits for the improved fermentative production of a recombinant virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040309 |