JP2007511219A5

JP2007511219A5 -

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Publication number: JP2007511219A5
Application number: JP2006539071A
Authority: JP
Filing date: 2004-11-08
Publication date: 2011-01-27

Description

本発明のさらなる実施態様において、幹細胞の回収は、幹細胞動員手法の後、および／または手術手法の後に実行する。

本発明の他のさらなる実施態様において、移植には自家細胞の動員を伴う。

本発明の他のさらなる実施態様において、移植は動員した幹細胞で実施される。

細胞治療の利用が急速に広がっており、徐々に種々の疾病の治療における重要な治療手法になりつつある。造血幹細胞（ＨＳＣ）（たとえば、脊髄、臍帯血または動員末梢血由来）移植は、日常的に実施される保険補償細胞治療の１つの例である。しかしながら、がんおよび感染疾患のための免疫治療、軟骨欠損のためのコンドロサイト治療、神経変性疾患のための神経細胞治療、および多数の適用のための幹細胞治療を含む多くの他の細胞治療が同様に発展している［Forbes(2002) Clinical Science 103:355-369］。

本明細書で使用するように、「高度にストリンジェントな条件（highly stringent conditions）」は、上記式によって計算されたか、または実際測定したかのいずれかで、標的配列を有する完全な二本鎖に対して存在するＴｍよりも１０Ｃ以上低くはないＴｍを供するものである。「中程度にストリンジェントな条件」は、上記式によって計算されたか、または実際測定したかいずれかで、標的配列を有する完全な二本鎖に対して存在するＴｍよりも２０Ｃ以上低くはないＴｍを供するものである。限定はしないが、高度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算された、または測定されたＴｍよりも５〜１０Ｃ低い）および中程度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算された、または測定されたＴｍより１５〜２０Ｃ低い）の例では、ハイブリッドの計算されたＴｍより低い適切な温度で、２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）および０．５％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）の洗浄溶液を使用する。該条件の究極のストリンジェンシーは主に洗浄条件によるものであり、とりわけ、使用したハイブリッド形成条件は、安定性の低いハイブリッドを安定なハイブリッドにしたがって形成させるものである。ついで、より高度にストリンジェントな洗浄条件によって、安定性の低いハイブリッドを取り除く。上述した高度なストリンジェンシーから中程度の洗浄条件まで使用可能な一般的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍよりもおよそ２０〜２５Ｃ低い温度での、６× ＳＳＣ（または６× ＳＳＰＥ（標準リン酸食塩水−ＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、０．５％ＳＤＳ、１００＆マイクロ；ｇ／ｍｌ変性し、断片化サケ精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を利用することが好ましい（Ausubel,1987,1999）。成体幹細胞は、骨髄吸引のような外科的手法を用いて入手可能であるか、またはＮｅｘｅｌｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡより入手できるもののような市販システムを用いて得られる。本発明で利用する幹細胞は、好ましくは、幹細胞動員手法を用いて回収（すなわち収穫）し、この方法ではＨＳＣｓを対象の循環系へ放出するために、化学治療またはサイトカイン刺激を用いる。動員が、脊髄手術よりも、より多くのＨＳＣｓおよび前駆細胞を産出することが知られているので、幹細胞は好ましくはこの手法を用いて回収する。

幹細胞動員は、多数の分子によって誘導可能である。実施例には、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンドのようなサイトカイン、ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１α、Ｇｒｏβ、またはＳＤＦ−１のようなケモカイン、化学治療薬剤シクロホスファミド（Ｃｙ）およびパクリタキセルが含まれるが、限定されるものではない。しかしながら、これらの分子は、速度論および効果が異なることが認められるが、しかしながら、現在公知の実施態様にしたがって、Ｇ−ＣＳＦが単独でまたはシクロホスファミドとのような組み合わせで、幹細胞を動員するために、好ましく使用される。典型的には、Ｇ−ＣＳＦは５〜１０μｇ／ｋｇの用量で５〜１０日間、毎日投与する。幹細胞を動員する方法は、米国特許第６，４４７，７６６号および第６，１６２，４２７号で開示されている。ヒト胚幹細胞はヒト胚盤胞より単離可能である。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒトのインビボでの未着床胚から、またはインビトロでの受精（ＩＶＦ）胚から得る。あるいは、単一細胞ヒト胚を胚盤胞期に広げることが可能である。ヒトＥＳ細胞の単離のために、透明帯を胚盤胞から取り除き、内部細胞塊（ＩＣＭ）を免疫手術によって単離し、そこでは、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかにピペッティングすることによって無損傷のＩＣＭより除去する。ついでＩＣＭを、その増殖を可能にする適切な培養を含む組織培養フラスコ中にプレートする。９〜１５日後、機械的分解によって、または酵素的分解によってのいずれかで、増殖を誘導したＩＣＭをクランプ内に分離させ、ついで細胞を、新しい組織培地上に再プレートする。未分化形態を示しているコロニーをマイクロピペットによって個々に選別し、クランプ内に機械的に分離し、再プレートする。ついで、得られたＥＳ細胞を１〜２週間ごと定期的に分割する。ヒトＥＳ細胞の製造方法における、さらなる詳細に関しては、Thomson et al.,［米国特許第５，８４３，７８０号、Science 282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]、Bongso et al.,[Hum Reprod 4:706,1989]、Gardner et al.,[Fertil.Steril.69:84,1998]を参照のこと。

ＣＸＣＲ４過剰発現系のさらなる拡大は、遺伝子治療プロトコールに続く、損なわれたホーミングおよび生着を改善するために効果的なツールとして働き得る^8、9。さらに、ヒトＣＤ３４⁺細胞のＣＸＣＲ４過剰発現は、両方ともが低い細胞収率によって限定され得る化学治療処置に続く臨床ＣＢＣＤ３４⁺移植の改善、ならびに自家動員ＰＢＬＣＤ３４⁺移植を促進しうる⁶。さらに、間葉性幹細胞のような他の細胞型は、種々の器官へ遊走する能力を有するが、しかしながら、それらの生着のレベルは特に低い。したがって、標的器官内でのＳＤＦ−１の発現または投与の誘導とともに、細胞表面の構造性または一過性ＣＸＣＲ４発現を促進する系の発展が、インビボでの指向性遊走ならびに器官回復の一部として患者の対象の器官の種々の細胞型の長期再増殖および発達のために有益であり得る。したがって、本発明者らは、多くの臨床プロトコールの結果を改善できる幹細胞の機能および発達を調節するための普遍的な系として、ＣＸＣＲ４の過剰発現を提案する。

材料および実験手法
ヒト細胞−臍帯血（ＣＢ）細胞および成人動員末梢血（ＭＰＢ）細胞を、インフォームドコンセントの後に得た。ＣＤ３４⁺細胞濃縮を、先に記述された［Kollet(2001)Blood 97:3283-3291］ように、磁気ビーズ分離を用いて実施した。ＣＸＣＲ４発現を、精製した抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン１２Ｇ５、Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ＭＮ）およびヤギ抗マウスＩｇＧＦＩＴＣの二次Ｆ（ａｂ’）２断片（ジャクソン（Jackson）、ウエストグローブ、ＰＡ）を用いた、フローサイトメトリーによって促進した。

本発明を、添付の図面を参照しながら、例示のためのみで本明細書において記載する。図面に対する詳細な以下の具体的な言及により、示される特定の内容は、例示のため、および本発明の好ましい実施形態の実例の検討を目的とするにすぎず、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される記載と考えられるものを提供する過程において示されたことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面と合わせると、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となる。
レンチウイルスベクター構築物の略図的表示を示す。統合プロウイルスの相当する部分のみを描写している。ＥＦ１−αプロモーターを利用して、対照ベクターにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡ（上パネル）または実験ベクターのＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰバイシストロン性カセット（下パネル）のいずれかの発現を駆動する。ＳＤ＝スプライスドナー、ＳＡ＝スプライスアクセプター、ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル、ＳＩＮ＝自己−不活性化ベクター。レンチウイルス−形質導入ヒトＣＤ３４⁺細胞における、細胞表面ＣＸＣＲ４発現を示す。モック−またはレンチウイルス感染に続いて、臍帯血（ＣＢ）および動員末梢血（ＭＰＢ）ＣＤ３４⁺細胞を、ＧＦＰ発現のみ、または抗−ｈＣＸＣＲ４−ＰＥ抗体を用いたＣＸＣＲ４発現に付随するＧＦＰのいずれかに関して、フローサイトメトリーによって解析した。Ａ．データは、ＣＢＣＤ３４⁺細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示す。数字は総ＣＤ３４⁺細胞の割合を示す。フォワードスカッタード（ＦＳＣ）は細胞サイズの指標である。Ｂ．結果は、ＣＸＣＲ４を発現しているＣＢおよびＭＰＢＣＤ３４⁺細胞の割合を示し、７回の独立した実験の平均値±ＳＥを示している。対照ＧＦＰ−感染細胞と比較して、＊ｐ＜０．０１。Ｃ．ＧＦＰ形質導入（ＧＦＰ）、ＣＸＣＲ４形質導入（ＣＸＣＲ４）またはアイソタイプ対照細胞の細胞表面（上パネル）および細胞内（下パネル）ＣＸＣＲ４発現の免疫蛍光検出。形質導入ＣＢＣＤ３４＋細胞のコロニー形成前駆細胞含量を示す。レンチウイルス形質導入ＣＢＣＤ３４⁺細胞を、半固体メチルセルロース培地中に播種した。Ａ．ＧＦＰ⁺コロニー形成細胞（ＣＦＣ）コロニーを、１４日目に位相差顕微鏡によって解析した。上パネルは対照ベクター形質導入細胞から得たＢＦＵ−Ｅ（ａ）およびＣＦＵ−ＧＭ（ｂ）を示す。下パネルはＣＸＣＲ４形質導入細胞から得たＢＦＵ−Ｅ（ｃ）およびＣＦＵ−ＧＭ（ｄ）を示す。代表的な実験を示す。Ｂ．データは、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅコロニーの総数を示す。棒の上の数字は、総コロニーに対するＧＦＰ⁺コロニーの割合を示す。棒は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥを示す。ＧＦＰ−形質導入細胞のＢＦＵ−Ｅコロニーと比較して＊ｐ＝０．００４。Ｃ．ＣＢおよびＭＰＢＣＤ３４＋細胞を、ヒト抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８ｍＡｂによって標識化した。数字は、全集団から得た陽性細胞の割合を示す。３回のうち、代表的な実験を示す。形質導入ＣＤ３４＋細胞において発現したＣＸＣＲ４の機能を示す。Ａ．ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢＣＤ３４⁺細胞を、示した時間ＳＤＦ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、細胞内Ｆ−アクチン含量をＦＡＣＳによって測定した。データは、未刺激細胞と比較して、ＳＤＦ−１での刺激後にＦ−アクチン含量が倍増加したことを示唆している。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。Ｂ．示したようにＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢおよびＭＰＢＣＤ３４＋細胞を異なるＳＤＦ−１濃度に向かうそれらの遊走に関して、トランスウェル遊走アッセイにて試験した。データはＳＤＦ−１への遊走細胞の割合を示す。棒は５回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。１２５ｎｇ／ｍｌＳＤＦ−１での対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、＊ｐ＜０．０４（ＣＢ）、＊ｐ＝０．０３（ＭＰＢ）。１０ｎｇ／ｍｌＳＤＦ−１での対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５（ＣＢ）、＊ｐ＜０．０５（ＭＰＢ）。異なるＳＤＦ−１濃度に対するＣＸＣＲ４−過剰発現ＣＢＣＤ３４＋細胞の応答を示す。Ａ．レンチウイルス形質導入ＣＢＣＤ３４⁺細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ−３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで、ＳＤＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む血清不含条件中で７日間インキュベートした。結果は、ＳＤＦ−１の存在しない状態でインキュベートした細胞と比較して、生細胞の数の倍増加として表している。結果は、二重で実施した３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。Ｂ．レンチウイルス形質導入ＣＢＣＤ３４⁺細胞を、１μｇ／ｍｌＳＤＦ−１とともに一晩インキュベートし、（ｉ）免疫染色によってＣＸＣＲ４発現を、および（ii）トランスウェル遊走系を用いてＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）誘導インビトロ中の遊走を試験した。棒は、二重で実施した２回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。未処理細胞と比較して＊ｐ＜０．０５（黒棒）。ＣＸＣＲ４過剰発現ＳＣＩＤ再生細胞（ＳＲＣ）のインビボでの多系統分化再構築およびＧＦＰ発現を示す。ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢＣＤ３４＋細胞を、亜致死的放射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。移植の５週間後のマウスを、対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、ヒト再増殖細胞の存在に関して試験した。Ａ．マウスＢＭ（ｉ）、脾臓（ii）および末梢血（ＰＢ）（iii）を、ヒトＣＤ４５＋細胞の％を検出するＦＡＣＳ解析によって、ヒト細胞生着に関して解析した。棒は、二重または三重で実施した９回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して＊ｐ＜０．００５。Ｂ．代表的なＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植レシピエントにおけるヒトＳＲＣのリンパおよび骨髄分化を、それぞれＣＤ１９およびＣＤ３３抗体染色によって示す。数字は、総生集団に対する陽性細胞の割合を表す。Ｃ．ＢＭ細胞を、ヒト特異的パン白血球マーカーＣＤ４５およびＢ細胞系統分化マーカーＣＤ１９で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。数字は、総ＣＤ４５集団から計算したＣＤ１９細胞の割合を示す。データは代表的な実験を示す。Ｄ／生着マウスＢＭ細胞をヒト特異的抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８ｍＡｂｓで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。数字は、始原、未分化ＣＤ３４＋／３８−／ｌｏｗ細胞の割合を示す。データは代表的な実験を示す。Ｅ．濃縮、未熟ＣＤ３４＋細胞の、脾臓へのホーミングを、ヒト特異的抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８ｍＡｂｓでの染色によって、移植１６時間（ＭＰＣ）後または２時間（ＣＢ）後に決定した。棒は二重で実施した３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。対照細胞と比較して＊ｐ＜０．０５。ＣＸＣＲ４の略図的実例を示す。ＣＢＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４過剰発現がインビボで６Ｈ８エピトープの変質を防止することを示す。Ａ．形質導入ＣＤ３４＋細胞を亜致死的（３７５Ｒ）放射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。移植の５週間後、マウスＢＭを回収し、ＣＸＣＲ４の１２Ｇ５または６Ｈ８エピトープに対して陽性に染色されたヒト細胞の存在を解析した。数字は平均ＣＸＣＲ４蛍光を表す。Ｂ．ＧＦＰ（対照）およびＣＸＣＲ４過剰発現細胞の１２Ｇ５および６Ｈ８ｍＡｂｓでの染色に続く、Ａのような平均ＣＸＣＲ４蛍光の代表的なヒストグラムＦＡＣＳ解析。

Claims

多量のＣＤ３４ ⁺ ／ＣＤ３８ ^-/low 系統の未熟な初期前駆細胞を有する幹細胞を含む細胞の集団を製造するための方法であって、回収された動員末梢血ＣＤ３４ ⁺ 濃縮造血幹細胞内に、ＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することを含む方法。
細胞の集団が、低濃度のＳＤＦ−１に応答してＣＸＣＲ４シグナル伝達の改善を示す請求項１記載の方法。
細胞の集団が、高濃度のＳＤＦ−１に応答してＣＸＣＲ４シグナル伝達の改善を示す請求項１記載の方法。
所定の閾値以上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞をＦＡＣＳにより単離することをさらに含む請求項１記載の方法。
幹細胞が、脊髄および赤血球系統へ分化可能である請求項１記載の方法。
ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-/low系統の未熟な初期前駆細胞の量が、集団の約１〜５％である請求項１記載の方法。
ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-/low系統の未熟な初期前駆細胞が、集団の約３％以上の量である請求項１記載の方法。
低濃度のＳＤＦ−１が、約５０ｎｇ／ｍｌ以下である請求項２記載の方法。
改善されたシグナル伝達が、低濃度のＳＤＦ−１によって仲介される細胞遊走の増強として現れる請求項２または８記載の方法。
改善されたシグナル伝達が、低濃度のＳＤＦ−１によって仲介される細胞増殖の増強として現れる請求項２または８記載の方法。
高濃度のＳＤＦ−１が、約１マイクログラム／ｍｌ以上である請求項３記載の方法。
改善されたシグナル伝達が、ＳＤＦ−１による脱感作の減少によって現れる請求項３または１１記載の方法。
動員末梢血ＣＤ３４ ⁺ 造血幹細胞内にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することによって製造され、多量のＣＤ３４ ⁺ ／ＣＤ３８ ^-/low 系統の未熟な初期前駆細胞を発現し、低濃度および／または高濃度のＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達能力を示す幹細胞を含む集団。
脊髄および赤血球系統へ分化可能である請求項１３記載の細胞の集団。
多量のＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-/lowが、集団の約１〜５％である請求項１３記載の細胞の集団。
多量のＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-/lowが、集団の約３％以上である請求項１３記載の細胞の集団。
低濃度のＳＤＦ−１が、約５０ｎｇ／ｍｌ以下である請求項１３記載の細胞の集団。
高濃度のＳＤＦ−１が、約１マイクログラム／ｍｌ以上である請求項１３記載の細胞の集団。
必要とする対象の標的組織に対する幹細胞のホーミングを増加させるための医薬の製造における請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の細胞の集団の使用。
必要とする対象の標的組織の再増殖を増加させるための医薬の製造における請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の細胞の集団の使用。
前記標的組織が、骨髄、血管、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経系、皮膚、骨および骨格筋からなる群より選択される請求項１９または２０記載の細胞の集団の使用。
移植を促進するための請求項１９または２０記載の細胞の集団の使用。
移植が化学治療プロトコールにしたがう請求項２２記載の細胞の集団の使用。
移植が自家移植である請求項２２記載の細胞の集団の使用。
移植が、自家細胞の動員を伴う請求項２４記載の細胞の集団の使用。
移植が異種移植である請求項２２記載の細胞の集団の使用。
移植が動員幹細胞で実施される請求項２２に記載の細胞の集団の使用。
細胞または組織置換が必要な対象における疾患を治療するための医薬組成物であって、治療的に有効量の請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の細胞の集団を含む医薬組成物。
インタクトな６Ｈ８エピトープを含むＣＸＣＲ４を発現している幹細胞を含む、細胞の集団を製造する方法であって、回収された動員末梢血ＣＤ３４ ⁺ 造血幹細胞にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することを含む方法。
動員末梢血ＣＤ３４ ⁺ 造血幹細胞にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することによって製造される、インタクトなＣＸＣＲ４６Ｈ８エピトープを含む幹細胞を含む細胞の集団。
必要とする対象における移植のための医薬の製造における請求項３０記載の細胞の集団の使用。
ＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を動員末梢血ＣＤ３４ ⁺ 造血幹細胞に導入することによって製造されるインタクトなＣＸＣＲ４６Ｈ８エピトープを示している幹細胞を含む幹細胞の集団を含む医薬組成物。
細胞または組織置換を必要とする疾病を治療するための請求項３２記載の医薬組成物。