ES2285785T3

ES2285785T3 - Estimulacion de celulas hematopoyeticas in vitro.

Info

Publication number: ES2285785T3
Application number: ES98949595T
Authority: ES
Inventors: William Bachovchin; Barbara Wallner
Original assignee: Point Therapeutics Inc
Current assignee: Point Therapeutics Inc
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: JP4102403B2; AU9588798A; US20040152192A1; DE69837393D1; CA2304206A1; US20010018210A1; JP2001518290A; NO20001583L; NZ503359A; DE69837393T2; KR20010030775A; ATE357509T1; NO20001583D0; WO1999016864A1; AU743996B2; BR9813233A; US6258597B1; IL135068A0; TR200000815T2; US7276371B2

Abstract

Un método para estimular células hematopoyéticas in vitro que comprende: (1) poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un inhibidor de una dipeptidil peptidasa tipo IV para incrementar el número de dichas células hematopoyéticas y/o el estado de diferenciación de dichas células hematopoyéticas respecto del número y de la diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el inhibidor, pero que se somete por lo demás a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del inhibidor; y (2) cultivar las células hematopoyéticas en presencia del inhibidor y en ausencia de citocina exógena en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control.

Description

Estimulación de células hematopoyéticas in vitro.

Esta solicitud reivindica prioridad bajo el Título 35, Código de Estados Unidos, \NAK119(e), de la solicitud provisional de Estados Unidos nº 60/060.306, presentada el 29 de septiembre de 1997, y titulada “Estimulación de células hematopoyéticas in vitro”, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia.

Esta invención se refiere al uso de agentes que se unen a dipeptidil peptidasa IV (DPIV, también conocida como CD26) para la estimulación de células hematopoyéticas in vitro.

El trasplante de médula ósea se usa de forma generalizada con pacientes que se someten a quimioterapia o radioterapia de dosis elevadas. Los efectos secundarios limitantes de la dosis de la quimioterapia y la radioterapia son sus efectos nocivos sobre las células hematopoyéticas a través de la destrucción de las células de la médula ósea, que son las células precursoras de todas las células hematopoyéticas. Esta alteración de la médula da como resultado la mielosupresión o mieloablación, lo que deja a los pacientes susceptibles a infecciones oportunistas durante un periodo de tiempo prolongado. El trasplante de médula ósea implica la infusión de células progenitoras tempranas de médula ósea que tienen la capacidad de restablecer el sistema hematopoyético de los pacientes, que incluye el sistema inmunitario. El trasplante disminuye el tiempo necesario normalmente para la restauración del sistema inmunitario después de quimioterapia o radioterapia y, así, el periodo de tiempo en riesgo de infecciones oportunistas.

Las células de médula ósea contienen células troncales totipotentes que dan lugar a células hematopoyéticas de todas las estirpes, que incluyen las estirpes linfoide, mieloide y eritroide. Las células troncales tienen la capacidad de renovarse a sí mismas, así como de diferenciarse a células progenitoras de todas las estirpes hematopoyéticas. Las células progenitoras mantienen la capacidad de proliferar y dar lugar a células diferenciadas de todas las estirpes. Las células diferenciadas pierden la capacidad de proliferar, y exhiben las características morfológicas específicas de sus estirpes (tales como macrófagos, granulocitos, plaquetas, eritrocitos, células T y B). Las células troncales y las células progenitoras expresan CD34 en su superficie, mientras las células diferenciadas no lo hacen. La médula ósea incluye células troncales así como células progenitoras de las estirpes linfoide (células T y B), mieloide (granulocitos, macrófagos) y eritroide (eritrocitos).

Para el uso en trasplantes de médula ósea, las células precursoras hematopoyéticas pueden derivarse del paciente de cáncer (trasplante autólogo) o de un donante histocompatible (donante alogénico). Estas células se pueden aislar de médula ósea, sangre periférica o sangre de cordón umbilical. En todos los casos, las células se recogen antes de la quimioterapia o la radioterapia. El número de células progenitoras que se puede recoger de una vez es pequeño y, en muchos casos, no es suficiente para un trasplante satisfactorio. Por lo tanto, se han desarrollado varios métodos para propagar in vitro células de médula ósea o células progenitoras obtenidas de aféresis sanguíneas o de sangre de cordón umbilical.

La capacidad de propagar estas células ha ayudado al avance de la técnica de trasplante de médula ósea como terapia adyuvante viable para los tratamientos del cáncer que implican dosis elevadas de quimioterapia y/o irradiación. Sin embargo, los métodos existentes para la propagación de células hematopoyéticas requieren la adición de citocinas apropiadas para permitir la propagación in vitro de las células troncales hematopoyéticas. El elevado coste de tales factores de crecimiento ha afectado de forma adversa a la capacidad de los expertos en la técnica para propagar células hematopoyéticas in vitro para trasplante u otros propósitos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos nuevos para propagar células hematopoyéticas in vitro que no requieran citocinas añadidas de forma exógena para mantener el crecimiento y la diferenciación celular.

La presente invención proporciona métodos y composiciones para estimular el crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas in vitro. De forma ventajosa, los métodos de la invención no requieren la adición de citocinas añadidas de forma exógena para mantener la estimulación de las células hematopoyéticas in vitro. Por lo tanto, los métodos y las composiciones de la invención son útiles para incrementar el número de células hematopoyéticas in vitro y/o para provocar la diferenciación de las células progenitoras tempranas. El incrementar el número y/o provocar la diferenciación de las células hematopoyéticas en cultivo permite la caracterización de tales células en cultivo en una diversidad de situaciones, así como el uso de tales células cultivadas para la producción in vitro de moléculas recombinantes o naturales a partir de ellas. Además, las células hematopoyéticas estimuladas de la invención son útiles para el tratamiento in vivo de trastornos que se caracterizan por un número reducido de células hematopoyéticas o de sus precursores. Tales situaciones se dan con frecuencia en pacientes que están inmunodeprimidos, por ejemplo, como consecuencia de quimioterapia y/o radioterapia para el cáncer.

La novedad de la invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inhibidores de la dipeptidil peptidasa tipo IV ("DPIV") son útiles para estimular el crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena o de otros factores de crecimiento o células estromales. Este descubrimiento contradice el dogma del campo de la estimulación de células hematopoyéticas, que estipula que la adición de citocinas o de células que producen citocinas (células estromales) es un elemento esencial para mantener y estimular el crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas en cultivo. (Véase, p.ej., la solicitud int. PCT nº PCT/US93/017173, publicada como W094/03055).

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para estimular células hematopoyéticas para que crezcan y se diferencien in vitro. El método implica: (1) poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un inhibidor de una dipeptidil peptidasa tipo IV para incrementar el número y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas cuando las células se cultivan en presencia del inhibidor respecto del número y de la diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el inhibidor, pero que se somete por lo demás a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del inhibidor; (2) cultivar las células hematopoyéticas en presencia del inhibidor y en ausencia de citocina añadida de forma exógena en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de tales células respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control.

En general, el incrementar el número de células hematopoyéticas se refiere a incrementar el número de células al menos aproximadamente 2 veces respecto del número de células hematopoyéticas que están presentes cuando las células se ponen en contacto inicialmente con el inhibidor. En general, el número de células que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el inhibidor, pero que por lo demás se trata de forma idéntica, es aproximadamente el mismo que el número inicial de células en el cultivo antes de ponerlo en contacto con el inhibidor. Preferiblemente, el número de células hematopoyéticas se incrementa al menos aproximadamente 4 veces, 10 veces, 20 veces o, lo más preferiblemente, al menos 100 veces respecto del número de células hematopoyéticas que están presentes cuando las células hematopoyéticas se ponen en contacto inicialmente con el inhibidor.

Como se usa aquí, células hematopoyéticas incluye células troncales hematopoyéticas, células troncales primordiales, células progenitoras tempranas, células CD34+, células tempranas de las estirpes mesenquimatosa, mieloide, linfoide y eritroide, células de médula ósea, células sanguíneas, células de sangre de cordón umbilical, células estromales, y otras células precursoras hematopoyéticas que conocen las personas de experiencia habitual en la técnica.

Como se usa aquí, un inhibidor de dipeptidil peptidasa tipo IV ("DPIV") se refiere en general a una molécula que inhibe la actividad funcional de DPIV. Por lo tanto, los inhibidores de la invención incluyen los inhibidores de la actividad enzimática de la dipeptidil peptidasa tipo IV. Preferiblemente, los inhibidores de la actividad enzimática de DPIV se asocian al sitio activo de DPIV uniéndose de forma covalente a él o formando una interacción iónica con él. Tales inhibidores incluyen inhibidores competitivos de DPIV, tales como análogos del estado de transición de DPIV, e inhibidores no competitivos de DPIV, tales como fluoroalquilcetonas. Los inhibidores de DPIV también incluyen inhibidores no competitivos de DPIV que se unen selectivamente a DPIV (de forma covalente o mediante interacciones iónicas) en un sitio de la proteína de DPIV distinto del sitio activo y, por ello, inhiben la actividad enzimática de DPIV. Tales inhibidores no competitivos son una categoría de moléculas de unión que se unen selectivamente a DPIV, y tienen la capacidad de estimular las células hematopoyéticas o timocitos in vitro. Otras moléculas de unión que se unen selectivamente a DPIV y que tienen la capacidad de estimular las células hematopoyéticas incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de los anteriores, que son capaces de: (1) unirse a DPIV, y (2) estimular las células hematopoyéticas y/o timocitos in vitro. Los inhibidores de DPIV que son útiles en el contexto de la presente invención pueden estar en forma inmovilizada o insoluble. En general, los anteriores inhibidores pueden ser monovalentes, bivalentes o multivalentes. (Véase, p.ej., los documentos de EE.UU. de nºs de serie 08/671.756 y 08/837.305, titulados "Multivalent Compounds for Crosslinking Receptors and Uses Thereof" para una descripción de los dímeros y otros conjugados de inhibidores de DPIV). El inhibidor de DPIV inmovilizado puede estar inmovilizado con una diversidad de estructuras de inmovilización, que incluyen recipientes de cultivo convencionales, p.ej., matraces de agitación, reactores de tanque agitado, reactores de burbujeo, reactores de células en suspensión, reactores de adsorción de células y reactores de atrapamiento de células, placas de Petri, placas de múltiples pocillos, placas de microtitulación, tubos de ensayo, matraces de cultivo, bolsas y dispositivos de fibra hueca, y espuma celular. Tales estructuras de inmovilización están formadas preferiblemente por materiales que incluyen, por ejemplo, poliestireno, polipropileno, polímeros de acrilato, nailon, tela, nitrocelulosa, agarosa, sefarosa, etc.

Según este método de la invención, las células hematopoyéticas en una estructura de inmovilización o en un dispositivo de cultivo celular alternativo que contiene el inhibidor de DPIV soluble se ponen en contacto con una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV, para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o para provocar la diferenciación de tales células cuando las células se cultivan en presencia del inhibidor. En general, la determinación de un incremento en el número de células hematopoyéticas y/o de su estado de diferenciación se realiza mediante el uso de métodos convencionales conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. Una ventaja importante de la presente invención es que se puede hacer que las células hematopoyéticas cultivadas se diferencien y/o incrementen su número en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena. Al proporcionar un método para estimular células hematopoyéticas en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena, la invención proporciona un ahorro sustancial para el cultivo de tales células, así como una reducción ventajosa de la probabilidad de contaminación de tales cultivos celulares, eliminando lo que los solicitantes han descubierto que ya no es un agente esencial para estimular células hematopoyéticas en cultivo.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro. Se describen tres realizaciones de este método más adelante para ilustrarlo. En general, las realizaciones difieren entre sí en la selección de las células hematopoyéticas que se estimulan in vitro. En cada método, al menos una de la(s) etapa(s) de cultivo se realiza(n) en ausencia de citocina exógena. Los heteroconjugados preferidos que se usan en cada realización contienen un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de patógeno conjugado con un inhibidor de DPIV de la invención.

La primera realización del método para obtener células T específicas de antígeno implica estimular células de médula ósea en cultivo. Las células de médula ósea en cultivo pueden incluir una mezcla de células; sin embargo, preferiblemente, las células de médula ósea en cultivo son células CD34+ aisladas o células troncales aisladas. Según esta realización, el método implica: (1) cultivar las células de médula ósea en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV (p.ej., un monómero y/o homoconjugado de inhibidor de DPIV) para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en cultivo; y (2) cultivar las células de estirpe T tempranas con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej., un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo. La etapa (2) se puede realizar en presencia o ausencia de antígeno específico. Las etapas (1) y (2) se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. En general, el número de células T específicas de antígeno se compara con un cultivo de control de células de médula ósea que se trata como se describió en las etapas (1) y (2), con la excepción de que el cultivo de control no se pone en contacto con el heteroconjugado. En cada etapa, las células se cultivan en presencia del inhibidor de DPIV o heteroconjugado durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células de estirpe T tempranas y para incrementar el número de células T específicas de antígeno, respectivamente, respecto del número de tales células que están presentes en el cultivo de control.

La segunda realización se dirige a estimular células de sangre de cordón umbilical en cultivo. Esta realización implica: (1) cultivar las células de sangre de cordón umbilical en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV (p.ej., un monómero y/o homoconjugado de inhibidor de DPIV) para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en cultivo; y (2) cultivar las células de estirpe T tempranas con un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej., un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno que están presentes en el cultivo. La etapa (2) se puede realizar en presencia o ausencia del antígeno específico. Las etapas (1) y (2) se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. En general, el número de células T específicas de antígeno se compara con un cultivo de control de células de sangre de cordón umbilical que se trata como se describió en las etapas (1) y (2), con la excepción de que el cultivo de control no se pone en contacto con el heteroconjugado. En cada etapa, las células se cultivan en presencia del inhibidor de DPIV o heteroconjugado durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células de estirpe T tempranas y para incrementar el número de células T específicas de antígeno, respectivamente, respecto del número de tales células que están presentes en el cultivo de control.

La tercera realización se dirige a estimular células troncales de sangre periférica en cultivo. Esta realización implica: (1) cultivar las células troncales de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV (p.ej., un monómero y/o homoconjugado de inhibidor de DPIV) para incrementar el número de células T en cultivo; y (2) cultivar las células T con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej., un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo. La etapa (2) se puede realizar en presencia o ausencia del antígeno específico. Las etapas (1) y (2) se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. En general, el número de células T específicas de antígeno se compara con un cultivo de control de células troncales de sangre periférica que se trata como se describió en las etapas (1) y (2), con la excepción de que el cultivo de control no se pone en contacto con el heteroconjugado. En cada etapa, las células se cultivan en presencia del inhibidor de DPIV o heteroconjugado durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células T y para incrementar el número de células T específicas de antígeno, respectivamente, respecto del número de tales células que están presentes en el cultivo de control. De forma alternativa, debido a que se sabe que la sangre periférica contiene células T, es posible incrementar el número de células T específicas de antígeno en cultivo sin la etapa de estimulación (1), es decir, el método para incrementar el número de células T específicas de antígeno implica cultivar las células de sangre periférica con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej., un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo. Esta etapa se puede realizar en presencia o ausencia del antígeno específico.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para estimular células hematopoyéticas in vitro que comprende:

(1) poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un compuesto para incrementar el número de dichas células hematopoyéticas y/o el estado de diferenciación de dichas células hematopoyéticas respecto del número y diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el compuesto, pero que por lo demás se somete a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del compuesto; y

(2) cultivar las células hematopoyéticas en presencia del compuesto y en ausencia de citocina exógena en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control,

en el que el compuesto tiene la estructura

1

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en la que B es boro, cada uno de Y1 e Y2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un resto hidroxilo y un resto reactivo que se convierte en un resto hidroxilo en condiciones fisiológicas; -A3-A4- tiene la estructura

2

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y D1-A1-A2- es un aminoácido que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:

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3

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y,

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4

en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de médula ósea o células de sangre de cordón umbilical en presencia de una cantidad suficiente de un compuesto para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en el cultivo; y

(2): cultivar las células de estirpe T tempranas en presencia de una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene el compuesto unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que al menos una de las etapas de cultivo anteriores se realiza en ausencia de citocina exógena, y

en el que el compuesto tiene la estructura

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5

6

7

y,

8

en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un compuesto para incrementar el número de células T en el cultivo; y

(2): cultivar las células T con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene el compuesto unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que el compuesto tiene la estructura

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9

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10

11

y,

12

en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro, que comprende cultivar células de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un compuesto unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que al menos una de las etapas de cultivo anteriores se realiza en ausencia de una citocina exógena, y

en el que el compuesto tiene la estructura

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13

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14

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15

y,

16

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en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

Las realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus diversos aspectos son como se describe más adelante, o como se define en las sub-reivindicaciones.

Estos y otros aspectos de la invención, así como diversas ventajas y utilidades, serán más aparentes con referencia a los dibujos y a la descripción detallada de la invención.

Figura 1

Se aislaron células de médula ósea y se incubaron 10.000 células por pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) de CellGro y con o sin (control) las concentraciones indicadas de Pro-boroPro durante 4 días. Al final de este periodo de incubación se contaron las células al microscopio. Los cultivos sin Pro-boroPro contuvieron 10.000 células al final de los 4 días. Los cultivos que contenían Pro-boroPro tuvieron 53.000 células a 10^{-6} M, 38.000 células a 10^{-8} M y 42.000 células a 10^{-10} M. Los cultivos que contenían una mezcla de factores de crecimiento (FC) contuvieron 82.000 células. Los factores de crecimiento se proporcionaron en OPITEN® Giant Cell Tumor Conditioned Medium (IGEN).

Figura 2

Se incubaron células de sangre de cordón umbilical esencialmente en las mismas condiciones que se describieron en la leyenda para la Figura 1, excepto en que se usó Val-boroPro como estimulante a las concentraciones indicadas. Después de una incubación de 4 días:

A: Sangre de cordón umbilical total; recuentos de células totales. Cultivo de control: 0,2 x 10^{6} células; factores de crecimiento 5 x 10^{6} células; Val-boroPro: 3x10^{6} (10^{-6} M); 3x10^{6} (10^{-8} M); 4x10^{6} (10^{-10} M).

B: Células CD34+ aisladas: Las células CD34+ se aislaron mediante el uso de esferas unidas a CD34mAb para la selección positiva. La preparación de células contenía un 98% de células CD34+. Después de 4 días de incubación, el cultivo que contenía Val-boroPro 10^{-10} M contuvo 8,5x10^{6} células, comparado con 0,6x10^{6} células en el control y 4x10^{6} células en la incubación con factores de crecimiento.

C: Porcentaje de células CD34+ restantes después de cultivo de 4 días: Los cultivos incubados con Val-boroPro contuvieron entre un 10 y un 15% de células CD34+ después de cultivos de 4 días. Los cultivos incubados con factores de crecimiento tuvieron solamente un 4% de células CD34+ (panel b). Esto indicó que Val-boroPro tiene un efecto estimulador del crecimiento sobre las células CD34+, además de un efecto sobre la diferenciación de las células CD34+ a células maduras de sangre periférica. Esto está apoyado por la observación de que al cultivar estas células CD34+ en presencia de Val-boroPro y factores de crecimiento no cambia el % de células CD34+ en el cultivo del porcentaje observado con Val-boroPro solamente, aunque el número total de células en este cultivo combinado se incrementó a 55 x 10^{6} células comparado con 8,5 x 10^{6} células en la incubación con Val-boroPro solamente (panel a).

Figura 3

La dimerización de Lys-boroPro (homoconjugado) incrementa drásticamente la estimulación del crecimiento de células de médula ósea cuando se compara con el efecto de la forma monomérica de Lys-boroPro. Los cultivos se establecieron como se describió en la leyenda de la Figura 1, excepto en que se usó Lys-boroPro y el homoconjugado, y se incubaron durante 4 días.

Figura 4

Se incubaron células de médula ósea como se describió en la Figura 1, excepto en que Val-boroPro y el homoconjugado se usaron en un cultivo de 4 días.

A: Val-boroPro dio una propagación de células de médula ósea similar a la de la mezcla de factores de crecimiento (FC), mientras el dímero superó el doble del efecto.

B: (panel a): Las células CD34+ aisladas (98% de pureza) incubadas con Val-boroPro dieron lugar a un incremento de 20 veces en la estimulación del crecimiento celular comparado con un incremento de 18 veces con factores de crecimiento sobre el de los cultivos de control. El homoconjugado incrementó la actividad de crecimiento 125 veces a una concentración de 10^{-6} M y 96 veces a 10^{-6} M.

(panel b): Porcentaje de células CD34+ que quedaron en cultivo después de un periodo de incubación de 4 días: control 63%; FC 5%; Val-boroPro 43%; homodímero 10%.

La presente invención proporciona un método mejorado para estimular células hematopoyéticas en cultivo y, en particular, un método para estimular células hematopoyéticas in vitro en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena. La invención de los solicitantes se refiere al descubrimiento de que la adición de citocinas o de células que expresan citocinas (células estromales) a las células hematopoyéticas en cultivo no es un elemento esencial para el mantenimiento o la estimulación de las células hematopoyéticas cuando se añade un inhibidor de DPIV. Por lo tanto, el descubrimiento de los solicitantes da como resultado un ahorro significativo al eliminar la necesidad de proporcionar citocinas a los cultivos celulares, así como al eliminar de forma ventajosa una fuente potencial de contaminación para tales células en cultivo.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un método para estimular células hematopoyéticas in vitro. El método implica (1) poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un inhibidor de una dipeptidil peptidasa tipo IV ("DPIV") in vitro, para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de tales células hematopoyéticas respecto del número y la diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el inhibidor, pero que se somete por lo demás a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del inhibidor; y (2) cultivar las células hematopoyéticas en presencia del inhibidor y en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena, en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o su diferenciación respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control. Estimular las células hematopoyéticas, como se usa aquí, se refiere a inducir a las células hematopoyéticas a crecer y/o diferenciarse. Así, los métodos y composiciones y dispositivos de la invención son útiles para incrementar el número de células, así como para provocar la diferenciación de las células progenitoras tempranas.

Como se usa aquí, células hematopoyéticas se refiere a las células que están relacionadas con la producción de células sanguíneas. Las células hematopoyéticas ejemplares incluyen células troncales hematopoyéticas, células troncales primordiales, células progenitoras tempranas, células CD34+, células tempranas de las estirpes mesenquimatosa, mieloide, linfoide y eritroide, células de médula ósea, células sanguíneas, células de sangre de cordón umbilical, células estromales, y otras células precursoras hematopoyéticas que son conocidas para las personas de experiencia habitual en la técnica.

De acuerdo con la convención en la técnica, la definición de células hematopoyéticas excluye a los timocitos. Los timocitos del timo no se consideran células "progenitoras hematopoyéticas", ya que tales células se obtienen del timo y ya están comprometidas. Los solicitantes han descubierto que ciertos métodos de la invención son útiles en relación con las células hematopoyéticas, así como con los timocitos. Por lo tanto, se debe entender que los métodos de la invención se pueden poner en práctica con células hematopoyéticas solamente, timocitos solamente, o células hematopoyéticas en combinación con timocitos.

Las células de la médula ósea contienen células troncales totipotentes que dan lugar a células hematopoyéticas de todas las estirpes, que incluyen las estirpes linfoide, mieloide y eritroide. Las células troncales tienen la capacidad de renovarse a sí mismas, así como de diferenciarse a células progenitoras de todas las estirpes hematopoyéticas. Las células progenitoras mantienen la capacidad de proliferar y dar lugar a células diferenciadas de todas las estirpes. Las células diferenciadas pierden la capacidad de proliferar, y exhiben características morfológicas específicas de sus estirpes (tales como macrófagos, granulocitos, plaquetas, eritrocitos, células T y células B). La médula ósea incluye células troncales así como células progenitoras de las estirpes linfoide (células T y B), mieloide (p.ej. granulocitos, macrófagos) y eritroide (eritrocitos). Las células troncales y las células progenitoras expresan CD34 en su superficie, mientras las células diferenciadas no lo hacen. Por lo tanto, la detección de CD34 se puede usar para distinguir las células diferenciadas de las indiferenciadas.

Para el uso en trasplantes de médula ósea, las células precursoras hematopoyéticas pueden derivarse del paciente de cáncer (trasplante autólogo) o de un donante histocompatible (donante alogénico). Estas células se pueden aislar de médula ósea, sangre periférica o de sangre de cordón umbilical. En general, las células se recogen antes de la quimioterapia o radioterapia. La médula ósea se aspira típicamente de la cresta ilíaca, y es un procedimiento largo y doloroso. La médula ósea es rica en células CD34+; típicamente, del 1 al 2% de las células de la médula son células precursoras. La sangre periférica contiene típicamente menos del 1% de células CD34+. Para enriquecer las células CD34+, las células progenitoras sanguíneas se movilizan desde la médula ósea a la periferia mediante pretratamiento con una dosis baja de quimioterapia o con ciertas citocinas, tales como G-CSF o SCF. La sangre de cordón umbilical es muy rica en células progenitoras tempranas, y es muy prometedora como fuente de células para trasplante de células hematopoyéticas.

El número de células progenitoras que se puede recoger de una vez de cada fuente es pequeño y, en muchos casos, no es suficiente para un trasplante eficaz. Se han desarrollado varios métodos para propagar células de médula ósea o células progenitoras obtenidas de aféresis sanguíneas o de sangre de cordón umbilical en cultivos in vitro. La capacidad de propagar estas células ha ayudado al avance de la técnica de trasplante de médula ósea como terapia adyuvante viable para los tratamientos del cáncer que implican dosis elevadas de quimioterapia y/o irradiación. La propagación in vitro de las células troncales hematopoyéticas requiere la adición de factores de crecimiento apropiados, así como de ciertas condiciones de crecimiento proporcionadas por las denominadas células estromales. Las células estromales proporcionan soporte físico a las células progenitoras hematopoyéticas, así como ciertos factores de crecimiento necesarios para el incremento del número de células troncales.

La separación de células CD34+ (células diferenciadas) a partir de células indiferenciadas se puede conseguir mediante varios métodos diferentes. El más usado es una selección inmunológica positiva basada en la unión de estas células a anticuerpos anti-CD34 inmovilizados en un soporte sólido (Cellpro, Baxter). Otros métodos de selección incluyen la selección negativa, en la que todas las células que no expresan CD34 se aíslan de las células CD34+ basándose en su expresión de antígenos de superficie celular específicos de estirpe.

En ciertas realizaciones de la invención, las células hematopoyéticas se estimulan con los monómeros en ausencia de citocinas añadidas, células estromales o timocitos. En otras realizaciones, las células hematopoyéticas o timocitos se estimulan con los compuestos de la invención (preferiblemente, se excluyen los monómeros) en ausencia de citocinas añadidas o células estromales. Los solicitantes han usado monómeros y conjugados representativos de la invención para estimular células CD34+ aisladas (p.ej., se han eliminado las células estromales) en ausencia de citocinas añadidas y/o células estromales. Los solicitantes también han demostrado que tales células se pueden estimular para que crezcan y se diferencien en cultivo líquido. Así, una ventaja importante de la presente invención es que los métodos descritos aquí no requieren células estromales para la estimulación de células hematopoyéticas o timocitos. Otra ventaja importante de la invención es que los compuestos y métodos descritos aquí son útiles para estimular células troncales humanas (CD34+). Tales células de interés son objetivos importantes para la propagación debido a su capacidad de diferenciarse a tipos celulares maduros que tienen aplicaciones terapéuticas importantes. La estimulación de las células troncales en ausencia de citocinas añadidas o de células estromales no se ha informado previamente.

La propagación de células progenitoras se puede llevar a cabo en una diversidad de diferentes recipientes de cultivo y en diferentes condiciones de cultivo. En general, se usan aquí las mismas condiciones de cultivo que se usan para cultivar células hematopoyéticas mediante el uso de los métodos de la técnica anterior, con la excepción de que los inhibidores de DPIV se sustituyen por citocinas en los métodos de cultivo de la técnica anterior. Más adelante se proporciona un protocolo ejemplar de la técnica anterior para cultivar células. Por lo tanto, este protocolo se modifica para el uso de acuerdo con los métodos de la invención cultivando las células en presencia de inhibidores de DPIV y en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena.

Después de la separación, las células precursoras se incuban en medio de cultivo tal como RPMI, DMEM de Iscove, TC 199, X-VIVO-10, preferiblemente con la adición de suero humano o de suero bovino fetal y una mezcla de factores de crecimiento. Se puede añadir suero o plasma a una concentración del 5 al 50%. Los factores de crecimiento incluyen todas o cualquiera de las interleucinas (IL-1 a IL-16), interferones (IFN-\alpha, \beta y \gamma), eritropoyetina (EPO), factor de célula troncal (SCF), factores de crecimiento similares a insulina, factores de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento tumoral \beta, factor de necrosis tumoral \alpha, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), ligando de tirosina quinasa 3 similar a fms (ligando Flt-3), y ligando cKIT (cKL). Muchos de estos factores de crecimiento están disponibles comercialmente. La mezcla de factores de crecimiento usada más comúnmente incluye G-CSF, GM-CSF, SCF, IL-1, IL-3 e IL-6. La mayoría de los factores de crecimiento usados se producen mediante métodos de ADN recombinante y se purifican en diversos grados. Algunos factores de crecimiento se purifican a partir de medios de cultivo de líneas de células tumorales mediante métodos bioquímicos estándar. Un factor de crecimiento muy utilizado es PIXY 321, que se produce mediante técnicas recombinantes y exhibe actividad tanto de GM-CSF como de IL-3. La cantidad de factores de crecimiento usados en los cultivos depende de la actividad de la preparación de factores y de la combinación de factores de crecimiento usados. Típicamente, las concentraciones oscilan de 0,5 a 500 ng/ml. La concentración óptima de cada factor de crecimiento se tiene que determinar para las condiciones de cultivo individuales, ya que algunos factores de crecimiento actúan de forma sinérgica con otros factores de crecimiento. Como se anotó anteriormente, los métodos de la invención excluyen las citocinas añadidas de forma exógena y, en su lugar, utilizan inhibidores de DPIV para estimular las células hematopoyéticas en cultivo.

Incrementar el número de células hematopoyéticas, como se usa aquí, significa incrementar el número de células al menos aproximadamente 2 veces respecto del número de células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control paralelo de células que se someten a las mismas condiciones que los cultivos tratados con inhibidor de DPIV, con la excepción de que tales cultivos de control no se ponen en contacto con los inhibidores de DPIV. Preferiblemente, el número de células hematopoyéticas se incrementa al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente 10 veces y, lo más preferiblemente, al menos 20 veces respecto del número de células hematopoyéticas que están presentes en el cultivo de control paralelo.

El periodo de tiempo en el que se incrementa el número de células hematopoyéticas es, al menos en parte, una función del tipo de células y del recipiente de cultivo específico usado. En general, este periodo de tiempo oscila de alrededor de 2-3 días (para la propagación a corto plazo) a varias semanas para la propagación de células adecuadas para el injerto a largo plazo. Se pueden usar procedimientos de rutina conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica para determinar el número de células en cultivo en función del tiempo de incubación creciente de las células cultivadas con el inhibidor de DPIV. Típicamente, la propagación (incremento en el número de células) se mide contando el número de células, por ejemplo, midiendo la incorporación de una tinción específica o determinando el hematocrito, mediante el uso de un hemocitómetro o de un contador de células. Así, la optimización de las condiciones de crecimiento particulares y la selección de las cantidades de inhibidores de DPIV que son necesarias para conseguir los incrementos anteriormente indicados del número de células se determinan mediante el uso nada más que de la experimentación de rutina. Tal experimentación de rutina implica, por ejemplo, (i) variar la cantidad del inhibidor de DPIV a un tiempo de incubación constante; (ii) variar el tiempo de incubación a cantidades constantes de inhibidor de DPIV; (iii) aplicar los experimentos de optimización anteriores para determinar las condiciones particulares necesarias para conseguir un incremento preseleccionado del número de células para un tipo celular preseleccionado; y (iv) variar otros factores que incluyen, por ejemplo, la identidad, valencia (p.ej., monovalente o bivalente), o el estado del inhibidor de DPIV (soluble o inmovilizado), para optimizar las condiciones de cultivo para conseguir los resultados deseados. Así, la duración del periodo de incubación del cultivo celular varía y depende del grado de la propagación deseada. Para la mayoría de aplicaciones, este periodo oscila de alrededor de 4 a 14 días. En general, la propagación en cultivos líquidos se determina mediante el incremento del número total de células desde el inicio de la incubación y/o determinando el % de células CD34+ en el cultivo y/o determinando el incremento de células totales respecto de un cultivo de control que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de DPIV. El número de CFU-GM se determina cuando las células se inoculan en medio de metilcelulosa de Iscove, que contiene factores de crecimiento apropiados, en placas de Petri de 35 mm durante 10 a 14 días. La densidad inicial típica es 1000 células/ml. Al final del periodo de incubación, se cuenta el número de colonias que contienen más de 50 células de origen mieloide (CFU-GM) o eritroide (BFU-E) mediante el uso de un microscopio invertido.

Después de la propagación, las células se recogen y se lavan con medio de cultivo fresco antes de la infusión al paciente.

Como se usa aquí, poner en contacto las células hematopoyéticas con el inhibidor de DPIV significa introducir los inhibidores de DPIV en los cultivos de una manera que permite que los inhibidores de DPIV estén en contacto físico directo con las células. En general, los inhibidores de DPIV solubles se ponen en contacto con las células en cultivo de la misma manera que las citocinas solubles u otros factores de crecimiento solubles se introducen en los cultivos celulares, con la excepción de que los inhibidores de DPIV solubles se sustituyen por los factores de citocina más convencionales de la técnica anterior. Así, por ejemplo, los inhibidores de DPIV solubles se pueden añadir en forma de disolución acuosa al cultivo celular o en forma de polvo (p.ej. liofilizados) para dar como resultado una disolución acuosa en la matriz de cultivo celular. Se proporciona un procedimiento ejemplar para poner en contacto varios inhibidores de DPIV representativos en los ejemplos.

En general, los inhibidores de DPIV insolubles se ponen en contacto con las células en cultivo de una manera que viene dictada por la forma física de los inhibidores de DPIV insolubles. Un inhibidor de DPIV insoluble se refiere a un inhibidor de DPIV que no está, y que no se puede colocar, en disolución. Por lo tanto, los inhibidores de DPIV insolubles se refieren a inhibidores de DPIV que están unidos a un soporte insoluble. El soporte insoluble puede ser un recipiente de cultivo celular, en cuyo caso los inhibidores están unidos a la superficie en contacto con el cultivo del recipiente de cultivo o, de forma alternativa, el soporte insoluble puede estar en forma particulada (p.ej. partículas magnéticas, sefarosa), en cuyo caso los inhibidores están unidos a la superficie de las partículas. Por lo tanto, el poner en contacto los inhibidores de DPIV insolubles que están unidos a la superficie del recipiente de cultivo implica colocar las células en los recipientes de cultivo, junto con los nutrientes apropiados que se conocen para el crecimiento de células hematopoyéticas, pero con la exclusión de citocinas añadidas de forma exógena. El poner en contacto los inhibidores de DPIV insolubles que están unidos a las partículas implica introducir las partículas (secas o suspendidas) en un recipiente de cultivo que contiene las células hematopoyéticas. De forma alternativa, las células hematopoyéticas se pueden añadir a un recipiente de cultivo que ya contiene los inhibidores de DPIV solubles o insolubles. Independientemente del estado físico de los inhibidores de DPIV (solubles o insolubles), la puesta en contacto de las células hematopoyéticas con los inhibidores se realiza en ausencia de citocinas añadidas de forma exógena.

Los inhibidores de DPIV de la invención son moléculas que se unen a DPIV. En general, hay dos categorías de inhibidores de DPIV: (1) inhibidores del sitio activo y (2) agentes de unión a un sitio no activo. Los inhibidores del sitio activo se refieren a agentes que se unen (de forma covalente o por medio de interacciones iónicas) al sitio activo catalítico de DPIV y, por lo tanto, inhiben la actividad enzimática de DPIV. Los inhibidores ejemplares del sitio activo incluyen inhibidores enzimáticos competitivos de DPIV, tales como análogos del estado de transición de los sustratos naturales de DPIV (descritos más adelante). Los agentes de unión a un sitio no activo se refieren a agentes que se unen (de forma covalente o por medio de interacciones iónicas) a un sitio en la proteína DPIV distinto del sitio activo, y que tienen la capacidad de estimular las células hematopoyéticas o los timocitos en las condiciones descritas aquí. La unión de ciertos agentes de unión a un sitio no activo de DPIV (p.ej. inhibidores de DPIV no competitivos) se puede detectar de forma alternativa observando una reducción de la actividad enzimática de DPIV después de la exposición al agente de unión al sitio no activo. Los agentes de unión al sitio no activo ejemplares incluyen anticuerpos para DPIV y sus fragmentos, que se unen selectivamente a DPIV de una manera que da como resultado la capacidad del agente de unión para estimular las células hematopoyéticas y/o timocitos cuando se cultivan con tales células en las condiciones descritas aquí.

Se han descrito análisis para medir la actividad enzimática de DPIV (W.G. Gutheil y W.W. Bachovchin, Biochemistry 32, 8723-8731 (1993); Gutheil, W.G., y W., B.W. Kinlsq, Analytical Biochemistry 223, 13-20 (1994); y Gutheil, W.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 6594-6598 (1994)). Estos métodos usan el sustrato cromógeno Ala-Pro-p-nitroanilida (AppNA) y el sustrato fluorescente Ala-Pro-7-amino-4-trifluorometil cumarina (AP-AFC). AppNA y AP-AFC están disponibles comercialmente (p.ej., Enzyme Systems Products, Dublin, CA). Tales métodos se pueden usar como análisis de cribado para determinar si un inhibidor de DPIV inhibe la función enzimática de DPIV in vitro.

DPIV es un miembro de la familia de serín-proteasas que exhibe una actividad de escisión de postprolilo. Por lo tanto, el sustrato natural de DPIV es un péptido que contiene, como extremo aminoterminal, el dipéptido Xaa-Pro, en el que Xaa representa cualquier aminoácido y Pro representa prolina, de acuerdo con la nomenclatura estándar de aminoácidos. Los inhibidores del sitio activo de la invención inhiben la unión y/o la reacción de escisión por DPIV de su sustrato natural.

Los inhibidores monoméricos de la unión al sitio activo de la invención se representan mediante la fórmula I:

(I)Superficie-(L)_{q}-P^{1}R^{1}

en la que

P^{1} representa un primer resto selectivo, preferiblemente un péptido, que imita el sitio de unión del sustrato de DPIV;

R^{1} representa un grupo reactivo que reacciona con un grupo funcional en el centro reactivo de DPIV;

L representa una molécula espaciadora opcionalmente presente (i) que tiene un peso molecular que oscila de alrededor de 100 daltons a alrededor de 2000 daltons, (ii) que tiene una longitud que oscila de alrededor de 20 \ring{A} a alrededor de 300 \ring{A}; (iii) que contiene una cadena de átomos seleccionados del grupo que consiste en C, O, N, S y átomos de fósforo, conectados mediante enlaces simples, dobles o triples; y, (iv) si está unida a una superficie, que tiene una densidad superficial que oscila de alrededor de 20 \ring{A} a alrededor de 300 \ring{A}, es decir, la distancia entre una unión covalente de la molécula espaciadora a la superficie y la siguiente unión covalente de la molécula espaciadora a la superficie; y

q es 0 ó 1, es decir, cuando q = 0, el espaciador está ausente y el inhibidor monomérico de unión al sitio activo no está unido por medio del espaciador a una superficie (p.ej., la superficie del recipiente de cultivo tisular o de la partícula magnética), y cuando q = 1, el espaciador está presente y el inhibidor monomérico del sitio activo está unido por medio del espaciador a una superficie. En tales realizaciones, L se denomina espaciador bivalente porque sirve para unir de forma covalente un único resto de unión a una superficie. Las personas de experiencia habitual en la técnica conocen tales espaciadores bivalentes, y se describen con más detalle más adelante.

Los péptidos P^{1} que imitan el sitio de unión del sustrato de DPIV incluyen inhibidores competitivos de DPIV, tales como análogos del estado de transición de DPIV e inhibidores no competitivos de DPIV, tales como fluoroalquilcetonas. Cada uno de estos tipos de inhibidores se discute más adelante. En las realizaciones importantes de la invención, P^{1} es un péptido o un compuesto peptidomimético.

Los inhibidores multivalentes del sitio activo de la invención se representan mediante la fórmula II:

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en la que

P^{1}, R^{1}, L se definen como anteriormente y q = 1;

P^{2} representa un segundo resto selectivo, preferiblemente un péptido, que puede ser igual o diferente que el primer resto selectivo;

R^{2} representa un segundo grupo reactivo que puede ser igual o diferente que el primer grupo reactivo;

m = 0 ó 1;

n es un número entero de 0 a 10;

r = 0 ó 1; y

A es un brazo del espaciador que puede estar unido a una superficie, es decir, cuando r = 0, el espaciador, L, no está unido a una superficie, y cuando r = 1, el espaciador está unido a una superficie.

En ciertas realizaciones de la invención, si P^{2}=P^{1}, entonces R^{2} puede estar ausente, ser igual o ser diferente de R^{1}. En general, n es 1 y los compuestos de la invención se denominan homoconjugados (es decir, P^{2}=P^{1}) o heteroconjugados (es decir, P^{2}\neqP^{1}).

En ciertas realizaciones, L está unido además por medio de una superficie (p.ej., un recipiente de cultivo tisular o una partícula magnética). En tales realizaciones, L se denomina espaciador multivalente porque sirve para unir de forma covalente dos o más restos de unión entre sí, así como a una superficie. Tales espaciadores multivalentes son conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica.

Los restos de unión ejemplares R^{1} que son péptidos y que supuestamente tienen utilidad para inhibir las enzimas que escinden postprolilo y que, si se unen a un grupo reactivo, forman un complejo covalente con un grupo funcional del sitio reactivo de una enzima que escinde postprolilo se describen en la patente de EE.UU. nº 4.935.493, "Protease Inhibitors", expedida a Bachovchin et al. ("Bachovchin '493"); el documento de EE.UU. nº 5.462.928, "Inhibitors of Dipeptidyl-aminopeptidase Type IV", expedido a Bachovchin et al. ("Bachovchin '928"); el documento de EE.UU. nº 5.543.396, "Proline Phosphonate Derivatives", expedido a Powers et al., ("Powers '396"); el documento de EE.UU. nº 5,296,604, "Proline Derivatives and Compositions for Their Use as Inhibitors of HIV Protease", expedido a Hanko et al., ("Hanko '604"); el documento PCT/US92/09845, "Method for Making a Prolineboronate Ester", y sus solicitudes de prioridad de EE.UU. (USSN 07/796.148 y 07/936.198), solicitante Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. ("Boehringer"); y el documento PCT/GB94/02615, "DPIV-Serine Protease Inhibitors", solicitante Ferring V.V. ("Ferring"). Los ejemplos representativos de los anteriores inhibidores se describen más adelante, e incluyen los inhibidores basados en análogos del estado de transición Xaa-boroPro, que incluyen Lys-BoroPro, Pro-BoroPro y Ala-BoroPro, en los que "boroPro" se refiere al análogo de prolina en el que el grupo carboxilato (COOH) se sustituye con un grupo boronilo [B(OH)_{2}]. Los inhibidores alternativos del sitio activo de la invención tienen una estructura análoga, en la que el grupo boronilo está sustituido por un fosfonato o una fluoroalquilcetona (descritos más adelante). Los expertos en la técnica reconocerán que hay otros cambios que se pueden hacer sin afectar significativamente a la unión y al carácter de formación de complejos de estos compuestos.

El desarrollo de bibliotecas de presentación en fagos y de bibliotecas combinatorias químicas a partir de las cuales se pueden seleccionar compuestos sintéticos que imitan el sitio de unión del sustrato de DPIV permite la identificación de restos selectivos P^{1} adicionales, a los que se puede unir de forma covalente un grupo reactivo R^{1} para formar un resto de unión que imita el sitio de unión del sustrato de la proteasa y que forma un complejo con un grupo funcional en el sitio reactivo de la proteasa. Tales bibliotecas se pueden cribar para identificar restos selectivos putativos que no se dan de forma natural analizando la actividad de escisión de la proteasa en presencia y ausencia de la molécula putativa de la biblioteca de presentación en fagos o de la molécula de la biblioteca combinatoria, y determinando si la molécula inhibe la escisión por la proteasa de su sustrato natural o de un análogo de sustrato (p.ej. un análogo de sustrato cromógeno que es fácilmente detectable en un análisis espectrofotométrico). Las moléculas de bibliotecas de fagos y/o de bibliotecas combinatorias que exhiben inhibición de la proteasa se pueden unir de forma covalente después a los grupos reactivos R^{1} descritos aquí, y analizar otra vez para determinar si estas moléculas nuevas se unen selectivamente a la proteasa (p.ej., repitiendo el análisis de cribado anteriormente indicado). De esta manera, se proporciona un análisis de cribado simple y de elevado rendimiento para identificar restos selectivos de la invención que no se dan de forma natural.

En general, los primeros restos de unión, P^{1}, de la invención se unen de forma covalente por medio de un grupo carboxilo en su aminoácido carboxiterminal a un primer grupo reactivo, R^{1}. Como se usa aquí, R^{1} se refiere a un grupo reactivo que es capaz de reaccionar con un grupo funcional en un centro reactivo de DPIV. Por reaccionar con un centro reactivo de esta proteasa de interés, se quiere decir que R^{1} forma un enlace covalente o una interacción iónica fuerte con un grupo funcional que está localizado en el sitio activo. Los grupos reactivos R^{1} que están abarcados en la invención incluyen los grupos reactivos denominados grupo "T" en el documento de EE.UU. nº 4.935.493, "Protease Inhibitors", expedido a Bachovchin, et al. Estos incluyen grupos boronato, grupos fosfonato y grupos fluoroalquilcetona. Los grupos boronato ejemplares se describen más adelante y en los ejemplos. Los grupos fosfonato y fluoroalquilcetona se describen más adelante. En general, se prefiere que el enlace entre el extremo carboxilo del resto selectivo y el grupo reactivo esté en configuración L. También se prefiere que el grupo reactivo forme un enlace covalente con un grupo funcional en el sitio activo; sin embargo, no hay necesidad de formación de enlace covalente para formar un complejo entre el resto de unión y el sitio activo.

A lo largo de esta solicitud, se usa la terminología convencional para designar los isómeros descritos más adelante y en libros de texto apropiados conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. (Véase, p.ej., Principles in Biochemistry, editor A.L. Lehninger, páginas 99-100, Worth Publishers, Inc. (1982) Nueva York, NY; Organic Chemistry, Morrison y Boyd, 3ª edición, cap. 4, Allyn y Bacon, Inc., Boston, MA (1978); véase también la solicitud publicada en el Tratado de Cooperación en materia de Patentes WO93/10127, solicitud nº PCT/US92/09845).

Todos los aminoácidos, con la excepción de glicocola, contienen un carbono asimétrico o quiral, y pueden contener más de un átomo de carbono quiral. El carbono \alpha asimétrico del aminoácido se denomina centro quiral, y puede darse en dos formas isoméricas diferentes. Estas formas son idénticas en todas las propiedades químicas y físicas con una excepción, la dirección en la que provocan la rotación de la luz polarizada plana. Estos aminoácidos se denominan "ópticamente activos", es decir, los aminoácidos pueden girar la luz polarizada plana en una dirección o en la
otra.

Los cuatro grupos sustituyentes diferentes unidos al carbono \alpha pueden ocupar dos disposiciones diferentes en el espacio. Estas disposiciones son imágenes especulares no superponibles entre sí, y se denominan isómeros ópticos, enantiómeros o estereoisómeros. Una disolución de un estereoisómero de un aminoácido dado girará la luz polarizada plana a la izquierda, y se denomina isómero levorrotatorio (designado (-)); el otro estereoisómero para el aminoácido girará la luz polarizada plana en la misma medida pero a la derecha, y se denomina isómero dextrorrotatorio (designado (+)).

Un método más sistemático para clasificar y nombrar los estereoisómeros es la configuración absoluta de los cuatro sustituyentes diferentes en el tetraedro alrededor del átomo de carbono asimétrico (p.ej., el átomo de carbono \alpha). Para establecer este sistema, se seleccionó un compuesto de referencia (gliceraldehído), que es el hidrato de carbono más pequeño que tiene un átomo de carbono asimétrico. Por convención en la técnica, los dos estereoisómeros de gliceraldehído se designan L y D. Sus configuraciones absolutas se han establecido mediante análisis de rayos X. Las designaciones, L y D, se han asignado también a los aminoácidos mediante referencia a la configuración absoluta de gliceraldehído. Así, los estereoisómeros de los compuestos quirales que tienen una configuración relacionada con la de L-gliceraldehído se designan L, y los estereoisómeros que tienen una configuración relacionada con D-gliceraldehído se designan D, independientemente de la dirección en la que giren la luz polarizada plana. Así, los símbolos L y D se refieren a la configuración absoluta de los cuatro sustituyentes alrededor del carbono quiral.

En general, los compuestos naturales que contienen un centro quiral están solamente en una forma estereoisomérica, D o L. Los aminoácidos naturales son los estereoisómeros L; sin embargo, la invención abarca aminoácidos que pueden estar en la configuración estereoisomérica D.

La mayoría de los aminoácidos que se encuentran en las proteínas se pueden nombrar de modo inequívoco mediante el uso del sistema D L. Sin embargo, los compuestos que tienen dos o más centros quirales pueden estar en 2^{n} configuraciones estereoisoméricas posibles, en donde n es el número de centros quirales. Estos estereoisómeros a veces se designan mediante el uso del sistema R S para especificar más claramente las configuraciones de los aminoácidos que contienen dos o más centros quirales. Por ejemplo, los compuestos tales como treonina o isoleucina contienen dos átomos de carbono asimétricos, y por lo tanto tienen cuatro configuraciones estereoisoméricas. Los isómeros de los compuestos que tienen dos centros quirales se conocen como diastereoisómeros. Se proporciona una discusión completa del sistema R S para designar isómeros ópticos para aminoácidos en Principles in Biochemistry, editor A.L. Lehninger, páginas 99-100, anteriormente mencionado. A continuación se ofrece un breve resumen de este sistema.

El sistema R S se inventó para evitar ambigüedades cuando un compuesto contiene dos o más centros quirales. En general, el sistema está diseñado para clasificar los cuatro átomos sustituyentes diferentes alrededor de un átomo de carbono asimétrico por orden de número atómico decreciente o por orden de densidad de valencia decreciente cuando el grupo más pequeño o de menor rango apunta directamente en dirección opuesta al observador. Las diferentes clasificaciones se conocen en la técnica y se describen en la página 99 de Lehninger. Si se observa que el orden de clasificación decreciente es en el sentido de las agujas del reloj, la configuración alrededor del centro quiral se denomina R; si el orden de clasificación decreciente es en contra del sentido de las agujas del reloj, la configuración se denomina S. Cada centro quiral se nombra, por lo tanto, mediante el uso de este sistema. Al aplicar este sistema a treonina, un experto en la técnica determinaría que la designación, L-treonina, se refiere a (2S,3R)-treonina en el sistema R S. Las designaciones más tradicionales de L-, D-, L-alo y D-alo para treonina han sido de uso habitual durante algún tiempo y continúan siendo usadas por los expertos en esta técnica. Sin embargo, cada vez se usa más el sistema R S para designar los aminoácidos, particularmente los que contienen más de un centro quiral.

En una realización particularmente preferida de la invención, el compuesto de boroProlina es un compuesto de Val-boroProlina. Un "compuesto de Val-boroProlina" se refiere a un compuesto en el que la boroProlina carboxiterminal está unida de forma covalente por medio de un enlace peptídico de acuerdo con la química de péptidos estándar a un residuo de aminoácido de valina. El aminoácido de valina, opcionalmente, está unido adicionalmente por medio de un enlace peptídico a residuos de aminoácidos adicionales, con tal de que los residuos de aminoácidos adicionales no inhiban la capacidad del compuesto de Val-boroProlina para unirse a CD26. En una realización sumamente preferida, el compuesto de la invención es Val-boroPro (también denominado "PT-100"). Debido a los átomos de carbono quirales presentes en los residuos de aminoácidos y en el carbono unido al átomo de boro, Val-boroPro puede existir en múltiples formas isoméricas: (a) L-Val-S-boroPro, (b) L-Val-R-boroPro, (c) D-Val-S-boroPro y (d) D-Val-R-boroPro. Más preferiblemente, el compuesto es L-Val-S-boroPro o L-Val-R-boroPro. De forma análoga, los otros compuestos de boroProlina de la invención pueden existir en múltiples formas isoméricas; sin embargo, en general, las formas en las que cada centro quiral del aminoácido tiene una configuración "L-" y la boroPro está en la configuración R o S son las formas preferidas de los compuestos.

Se puede considerar que los primeros restos selectivos con un primer grupo reactivo P^{1}R^{1} de la invención que son péptidos de boroprolina tienen la estructura:

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(a): en la que B es boro,

(b): en la que cada uno de Y1 e Y2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un resto hidroxilo y un resto reactivo que se convierte en un resto hidroxilo en condiciones fisiológicas,

(c): en la que -A3-A4- tiene la estructura

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(d): en la que D1-A1-A2- es un aminoácido que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:

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20

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: y

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21

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en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

Estos péptidos de boroprolina se unen por medio de enlaces aminopeptídicos y/o agentes espaciadores químicos al segundo resto selectivo, P^{2}, por medio de la cadena lateral R del aminoácido, p.ej., a la cadena lateral de un péptido antigénico, para formar los compuestos descritos anteriormente, [P^{2}(R^{2})_{m}]_{n}-(L)_{q}-P^{1}R^{1}]. Los péptidos ejemplares incluyen un péptido antigénico de enfermedad autoinmune, un péptido antigénico de enfermedad infecciosa y un péptido antigénico de enfermedad alérgica. Los péptidos antigénicos preferidos son péptidos que se unen a un receptor de superficie de células T o a un receptor de superficie de células B, p.ej., TCR/CD3, CD2, CD4, CD8, CD10, CD26, CD28, CD40, CD45, B7.1 y B7.2.

De forma alternativa, el resto reactivo puede ser una fluoroalquilcetona o un grupo fosfonato. Los grupos reactivos de la invención que son grupos reactivos fluoroalquilcetona tienen la fórmula:

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22

\newpage

en la que G es H, F o un grupo alquilo que contiene de 1 a alrededor de 20 átomos de carbono y heteroátomos opcionales que pueden ser N, S o O. Como se usa aquí, los grupos reactivos de la invención que son grupos fosfonato tienen la fórmula:

23

en la que cada J, independientemente, es O-alquilo, N-alquilo o alquilo (y cada uno contiene alrededor de 1-20 átomos de carbono) y, opcionalmente, heteroátomos que pueden ser n=N, S o O. Los derivados ejemplares adicionales de fosfonato de prolina que contienen un grupo perfluoroalquilo, un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido y que se pueden usar de acuerdo con los métodos de la invención son los descritos en el documento de EE.UU. nº 5.543.396 (Powers '396). Otras cetoamidas, cetoácidos y cetoésteres que son grupos reactivos útiles para hacerlos reaccionar con el centro reactivo de una proteasa (p.ej. una serín-proteasa o una cisteín-proteasa) se describen en el documento PCT/US91/09801, "Peptides, Ketoamides, Ketoacids, and Ketoesters", solicitante: Georgia Tech Research Corp. ("GA Tech") que reivindica prioridad del documento de EE.UU. nº 635.287, presentado el 28 de dic. de 1990.

En ciertas realizaciones, los grupos reactivos se seleccionan de los grupos que tienen las fórmulas

24, una \alpha-cetoamida;

25 , en la que R es un grupo alquilo o arilo y puede estar sustituido o sin sustituir, un \alpha-cetoéster; y

250 , un \alpha-cetoácido.

Los grupos reactivos de la invención también incluyen los grupos reactivos descritos en el documento PCT/GB94/
02615, "DPIV-Serine Protease Inhibitors" (Ferring). Estos incluyen los grupos boronilo [B(OH)_{2}] anteriormente indicados, así como pirrolidinas y los siguientes grupos reactivos, cualquiera de los cuales puede estar sustituido o sin sustituir, con tal de que la sustitución no afecte de forma adversa a la actividad funcional del grupo reactivo o del resto de unión al que está unido: CN, C\equivC, CHO y CH=NPh, en la que Ph se refiere a fenilo. Estos ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención. Como se indicó en Ferring, los compuestos que contienen estos grupos reactivos representativos se pueden preparar mediante una adaptación de la ruta general descrita por E. Schon et al., Biol, Chem. Hoppe-Seyler:372:305-311 (1991) y por W.W. Bachovchin et al., J. Biol. Chem. 265:3738-3743 (1990). (Véase, además, las patentes de Estados Unidos de Bachovchin anteriormente mencionadas).

El segundo resto selectivo, P^{2}, se une a una molécula que está presente en la superficie de la misma célula o de una célula diferente a la que se une el primer resto selectivo. Preferiblemente, el segundo resto selectivo se une a una molécula (p.ej. un receptor, una molécula del complejo de histocompatibilidad principal (MHC)) que está presente en la superficie de una célula T o en la superficie de una célula B. En ciertas realizaciones, el segundo resto selectivo tiene una estructura que imita el sitio de unión del sustrato de una proteasa que está presente en una célula que está implicada en la modulación del sistema inmunitario. Así, el segundo resto selectivo puede ser igual que el primer resto selectivo, y los compuestos de la invención son útiles para entrecruzar moléculas de DPIV en la misma célula o en células diferentes. Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden usar para entrecruzar una primera proteasa (p.ej. una enzima que escinde postprolilo) en una primera célula y una proteasa diferente (p.ej. una tripsina, quimotripsina, elastasa u otra serín-proteasa o cisteín-proteasa) que se expresa en la superficie de la misma célula o en una segunda célula diferente. En ciertas realizaciones preferidas, el primer y segundo resto selectivo son idénticos (es decir, P^{2}=P^{1}) y el segundo grupo reactivo R^{2} puede estar ausente (es decir, m=0), puede ser igual o diferente del primer grupo reactivo R^{1} (es decir, R^{1}\neqR^{2}). Los compuestos que incluyen grupos P^{1} y P^{2} idénticos y grupos R^{1} y R^{2} idénticos se denominan "homoconjugados". Aún en otras realizaciones, el primer y segundo resto selectivo son diferentes, y estos compuestos se denominan "heteroconjugados".

Aún en otras realizaciones, el segundo resto selectivo es un antígeno que se une selectivamente a una molécula de MHC en la superficie de una célula presentadora de antígenos. Tales realizaciones de la invención son útiles para la propagación de células T específicas de antígeno (p.ej. de tumores). Así, según un aspecto relacionado de la invención, los inhibidores de DPIV anteriormente descritos que incluyen un segundo resto selectivo, P^{2}, que es un antígeno (p.ej. un antígeno específico de tumor) se pueden usar para estimular en general células progenitoras hematopoyéticas (por medio del primer resto selectivo, P^{1}) de la línea de células T, así como para propagar de forma específica un subgrupo de la población de células T de sangre periférica para obtener células T específicas de antígeno. En particular, tales compuestos son útiles para propagar tales subgrupos de la población de células T para enriquecer las células T específicas de antígeno. Así, la invención proporciona un método mejorado que combina de forma sinérgica la estimulación de células hematopoyéticas con la propagación de células T específicas de antígeno ex vivo. Esto sería terapéutico para provocar respuestas inmunitarias contra células tumorales residuales, células metastásicas o para aumentar la actividad de las células T antitumorales en trasplantes alogénicos. También se debe usar para la propagación ex vivo de células T de memoria periféricas específicas de antígenos tumorales, antígenos de patógenos y otros antígenos asociados con un estado médico adverso. Así, los antígenos que se pueden usar de acuerdo con los métodos anteriores incluyen los antígenos característicos de patógenos y los antígenos de cáncer.

Los anteriores métodos y composiciones también son útiles para la propagación ex vivo de células troncales después de la transfección con vectores retrovirales o de otro tipo que contienen un ácido nucleico heterólogo (p.ej. un oligonucleótido antisentido, un ácido nucleico que codifica una proteína o péptido terapéutico) para aplicaciones en terapia génica. Las células troncales a las que se les ha introducido un ácido nucleico heterólogo ex vivo se pueden introducir en el individuo mediante el uso de los métodos conocidos para implantar células transfectadas en un humano para la terapia génica. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº 5.399.346 ("Gene Therapy") expedida a Anderson et al.; la solicitud internacional PCT nº PCT/US92/01890 (publicación nº WO 92/15676, "Somatic Cell Gene Therapy", que reivindica prioridad del documento de EE.UU. de nº de serie 667.169, presentada el 8 de marzo de 1991, inventor I.M. Verma); la solicitud internacional PCT nº PCT/US89/05575 (publicación nº WO 90/06997, "Genetically Engineered Endothelial Cells and Use Thereof", que reivindica prioridad del documento de EE.UU. de nº de serie 283.586, presentado el 8 de diciembre de 1989, inventores Anderson, W.F. et al.).

Los antígenos que son característicos de los antígenos tumorales derivarán típicamente de la superficie celular, citoplasma, núcleo, orgánulos y similares de las células del tejido tumoral. Los ejemplos incluyen antígenos característicos de proteínas de tumores, que incluyen las proteínas codificadas por oncogenes mutados; las proteínas virales asociadas a tumores; y mucinas y glicolípidos tumorales. Los tumores incluyen, pero no se limitan a, aquellos de las siguientes localizaciones de cáncer y tipos de cáncer: labio, nasofaringe, faringe y cavidad oral, esófago, estómago, colon, recto, hígado, vesícula biliar, árbol biliar, páncreas, laringe, pulmón y bronquio, melanoma de piel, mama, cuello uterino, útero, ovario, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, próstata, testículos, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. Las proteínas virales asociadas a tumores serían las de las clases de virus indicadas anteriormente. Los antígenos característicos de tumores pueden ser proteínas que no se expresan normalmente en una célula precursora de tumor, o pueden ser una proteína que se expresa normalmente en una célula precursora de tumor, pero que tiene una mutación característica de un tumor. Un antígeno característico de un tumor puede ser una variante mutante de la proteína normal que tiene una actividad o distribución subcelular alterada. Las mutaciones de genes que dan lugar a antígenos tumorales, además de las especificadas anteriormente, pueden estar en la región codificante, en las regiones no codificantes de 5' o de 3', o en los intrones de un gen, y pueden ser el resultado de mutaciones puntuales, desplazamientos del marco de lectura, deleciones, adiciones, duplicaciones, reordenamientos cromosómicos y similares. Alguien de experiencia habitual en la técnica está familiarizado con la amplia diversidad de alteraciones de la estructura génica normal y de la expresión que dan lugar a antígenos tumorales. Los ejemplos específicos de antígenos tumorales incluyen: proteínas tales como Ig-idiotipo de linfoma de células B, quinasa 4 dependiente de ciclina mutante de melanoma, Pmel-17 (gp100) de melanoma, MART-1 (Melan-A) de melanoma, proteína p15 de melanoma, tirosinasa de melanoma, MAGE 1, 2 y 3 de melanoma, cáncer medular de tiroides, de pulmón de células pequeñas, cáncer de colon y/o epidermoide bronquial, BAGE de vejiga, melanoma, carcinoma de mama, y epidermoide, gp75 de melanoma, antígeno oncofetal de melanoma; carbohidratos/lípidos tales como mucina muc1 de mama, páncreas y cáncer ovárico, gangliósidos GM2 y GD2 de melanoma; oncogenes tales como p53 mutante de carcinoma, ras mutante de cáncer de colon y proto-oncogén HER-2/neu de carcinoma de mama; productos virales tales como proteínas de papilomavirus humano de tumores epidermoides de cuello de útero y esófago. También se contempla que los antígenos tumorales proteicos pueden ser presentados por moléculas de HLA como péptidos específicos derivados de la proteína completa. El procesamiento metabólico de proteínas para producir péptidos antigénicos se conoce en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.342.774 (Boon et al.).

Los antígenos tumorales preferidos de la invención incluyen los antígenos tumorales de melanoma (p.ej., la familia de proteínas MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3); MART-1 (péptido 27-35); y gp100); y los antígenos de carcinoma de colon (p.ej., péptidos del producto del gen APC mutado). Las secuencias de antígenos tumorales de melanoma particularmente preferidas son las informadas por Slingluff et al., en Curr. Opin. in Immunol. 6:733-740 (1994):

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La familia de proteínas MAGE también se ha asociado supuestamente con más de un tipo de carcinoma: MAGE-1 (melanoma, carcinoma medular de tiroides y de pulmón de células pequeñas), MAGE-2 (melanoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, de colon, epidermoide bronquial y medular de tiroides), y MAGE-3 (melanoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, de colon, epidermoide bronquial y medular de tiroides). Véase, además, Morioka, et al., "A Decapeptide (Gln-Asp-Leu-Thr-Met-Lys-Tyr-Gln-lle-Phe) from Human Melanoma Is Recognized by CTL in Melanoma Patients", J. Immunol. 153:5650 (1994), para antígenos tumorales adicionales (p.ej., P1A, conexina 37, MAGE-1, MAGE-3, MART 1/Aa, gp100, tirosinasa) y/o información relacionada con la distribución tisular de los antígenos tumorales seleccionados.

Los antígenos tumorales particularmente preferidos que son péptidos del producto del gen APC mutado son los informados por Townsend et al., en Nature 371:662 (1994)):

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En las realizaciones alternativas, el segundo resto selectivo es un ligando que se une selectivamente a un receptor que se expresa en la superficie de una célula (preferiblemente una célula T o una célula B). Los receptores ejemplares que tienen ligandos naturales que pueden ser imitados por los segundos restos selectivos de la invención incluyen los receptores seleccionados del siguiente grupo: CD2, TCR/C3, CD4, CD8, CD10, CD26, CD28, CD40, CD44, CD45, B7.1 y B7.2. Según otras realizaciones, el segundo resto selectivo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une selectivamente a un epítopo expresado en la superficie celular. El epítopo puede ser una porción de cualquiera de los receptores anteriores.

Independientemente de la naturaleza del objetivo del segundo resto selectivo (p.ej. proteasa, receptor, complejo de MHC, epítopo), se pueden cribar bibliotecas de presentación en fagos y otros tipos de bibliotecas combinatorias de una manera análoga a la descrita anteriormente para identificar restos selectivos que no se dan de forma natural que son útiles para formar los compuestos de la invención.

Los agentes de unión a DPIV en un sitio no activo son agentes que: (i) se unen selectivamente a DPIV en un lugar distinto del sitio activo y (ii) son capaces de estimular células hematopoyéticas y/o timocitos en las condiciones descritas aquí. Ciertos agentes de unión a DPIV en un sitio no activo (p.ej. inhibidores de DPIV no competitivos) también inhiben la actividad enzimática de DPIV. La inhibición de la actividad enzimática de DPIV se puede determinar, por ejemplo, midiendo la actividad enzimática de escisión proteolítica de DPIV en presencia y ausencia de un inhibidor de DPIV putativo y determinando si el inhibidor inhibe la actividad enzimática de DPIV. Preferiblemente, tales agentes de unión son polipéptidos aislados que se unen selectivamente a DPIV. Los polipéptidos de unión aislados incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (p.ej. Fab, F(ab)_{2}, Fd y fragmentos de anticuerpos que incluyen una región CDR3 que se une selectivamente a DPIV). Los polipéptidos de unión aislados preferidos son aquellos que se unen a un epítopo que está en el sitio catalítico de DPIV o cerca de él.

La invención, por lo tanto, implica el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de unirse selectivamente a DPIV y estimular células hematopoyéticas y/o timocitos en las condiciones descritas aquí. Los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales preparados según la metodología convencional.

De forma significativa, como se conoce en la técnica, solamente una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento pero no están implicadas en la unión del antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que se ha producido sin la región pFc', designado fragmento F(ab')_{2}, mantiene ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. De forma similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, designado fragmento Fab, mantiene uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula intacta de anticuerpo. Los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo, denotada como Fd. Los fragmentos Fd son los determinantes principales de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede estar asociado hasta con 10 cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo), y los fragmentos Fd mantienen la capacidad de unión al epítopo de forma aislada.

En la porción de unión al antígeno de un anticuerpo, como se conoce en la técnica, hay regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que interaccionan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones estructurales (FRs) que mantienen la estructura terciaria del paratopo (véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de la cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3). Las CDRs, y en particular las regiones CDR3, y más particularmente la CDR3 de la cadena pesada, son responsables en gran parte de la especificidad del anticuerpo.

Actualmente está establecido en la técnica que las regiones que no son CDR de un anticuerpo de mamífero se pueden sustituir por regiones similares de anticuerpos coespecíficos o heteroespecíficos, y a la vez mantener la especificidad por el epítopo del anticuerpo original. Esto se manifiesta más claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados", en los que se unen de forma covalente CDRs no humanos a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional. Así, por ejemplo, la publicación internacional PCT número WO 92/04381 enseña la producción y el uso de anticuerpos de VSR murinos humanizados en los que al menos una porción de las regiones FR murinas se han sustituido por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, que incluyen fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígenos, se denominan a menudo anticuerpos "quiméricos".

Así, como será aparente para alguien de experiencia habitual en la técnica, la presente invención también proporciona fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos F(ab')_{2} quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas; y anticuerpos de fragmento Fd quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por secuencias homólogas humanas o no humanas. La presente invención también incluye los denominados anticuerpos de cadena única. Así, la invención implica polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen de forma específica a DPIV e inhiben su actividad funcional. Estos polipéptidos pueden derivarse también de fuentes distintas de la tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, tales agentes de unión polipeptídicos se pueden proporcionar mediante bibliotecas de péptidos degenerados que se pueden preparar fácilmente en disolución, en forma inmovilizada o como bibliotecas de presentación en fagos. Las bibliotecas combinatorias también se pueden sintetizar de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Las bibliotecas se pueden sintetizar además de restos sintéticos peptídicos y no peptídicos.

La presentación en fagos puede ser particularmente eficaz para identificar péptidos de unión útiles según la invención. Brevemente, se prepara una biblioteca de fagos (mediante el uso, p.ej., de m13, fd o fago \lambda), que exponen insertos de 4 a alrededor de 80 residuos de aminoácidos mediante el uso de procedimientos convencionales. Los insertos pueden representar una serie completamente degenerada o parcial. Después se puede seleccionar los insertos que albergan los fagos que se unen a DPIV. Este proceso se puede repetir en varios ciclos de reselección del fago que se une a DPIV. Las rondas repetidas conducen al enriquecimiento de fagos que albergan secuencias particulares. Se puede llevar a cabo análisis de la secuencia de ADN para identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Se puede determinar la porción lineal mínima de la secuencia que se une a DPIV. Se puede repetir el procedimiento mediante el uso de una biblioteca parcial que contiene insertos que contienen parte o toda la porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales antes o después de ella. Así, se puede usar DPIV, un dominio extracelular suyo, o similar, para cribar bibliotecas peptídicas, que incluyen bibliotecas de presentación en fagos, para identificar y seleccionar las moléculas peptídicas de unión a la porción extracelular de DPIV. Tales moléculas seleccionadas se pueden analizar después en análisis de cribado que miden la capacidad de los agentes de unión para inhibir la actividad funcional de DPIV, p.ej. la actividad enzimática funcional de DPIV, o para estimular el crecimiento y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas.

Los agentes de unión anteriormente descritos que se unen selectivamente a DPIV se unen directa o indirectamente (por medio de un espaciador) a un recipiente de cultivo o a otra superficie mediante el uso de los mismos tipos de reacciones químicas descritos anteriormente con respecto a la unión de los inhibidores del sitio activo de DPIV a tales superficies.

Se une de forma covalente un espaciador al primer y (opcionalmente) al segundo resto selectivo, P^{1} y (opcionalmente) P^{2}, de una manera que no afecta adversamente a la capacidad de estos restos para unirse a sus respectivas moléculas de unión seleccionadas. Preferiblemente, tales espaciadores incluyen además un grupo funcional para unir los restos selectivos a un recipiente de cultivo, otra superficie, y/o restos selectivos adicionales. El espaciador preferido, L, tiene una longitud tal que cuando se coloca entre un resto de unión y un segundo resto de unión o superficie da como resultado una longitud mínima de alrededor de 20 angstroms entre los restos o entre el resto y la superficie. Preferiblemente, la distancia es de 20 a 60 angstroms, más preferiblemente de 30 a 50 angstroms. Más adelante se proporcionan espaciadores ejemplares, y se incluye una descripción de la composición, tamaño del espaciador y procedimientos para unir el espaciador a los restos selectivos. En general, tales espaciadores están disponibles comercialmente (véase, p.ej., Pierce Catalog and Handbook, Rockford, Ill.) y se unen a los restos selectivos mediante el uso de procedimientos de unión convencionales que son conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica.

En general, los espaciadores, L, contienen al menos dos grupos reactivos. Los espaciadores homobivalentes pueden contener dos grupos reactivos idénticos, y los espaciadores heterobivalentes contienen dos grupos reactivos diferentes. Hay disponibles espaciadores multivalentes adicionales que contienen más de dos grupos reactivos que pueden ser iguales (homomultivalentes) o diferentes (heteromultivalentes). Típicamente, los espaciadores unen de forma covalente el resto selectivo, P^{1}, por medio de un grupo amino o sulfhidrilo al segundo resto selectivo o superficie, porque tales grupos funcionales se hallan habitualmente en las proteínas y polímeros que se usan para formar los materiales de soporte para inmovilizar proteínas. Los grupos amino reactivos incluyen imido ésteres y ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS). Los grupos reactivos sulfhidrilo incluyen maleimidas, haluros de alquilo y arilo, \alpha-haloacetilos y disulfuros de piridilo. La mayoría de espaciadores heterobivalentes disponibles comercialmente contienen un grupo funcional reactivo amino. Los espaciadores que son amino-reactivos en un extremo y sulfhidrilo-reactivos en el otro extremo son bastante comunes. Otros espaciadores que están disponibles comercialmente unen de forma covalente el resto selectivo P^{1} a otro resto selectivo, superficie, o resto selectivo adicional por medio de grupos reactivos distintos de grupos amino o sulfhidrilo, por ejemplo, por medio de grupos hidroxilo, carboxilo, fenol o carbohidrato. Las carbodiimidas también se pueden usar para unir carboxilos a aminas primarias o hidrazidas, lo que da como resultado la formación de enlaces amida o hidrazona.

Las proteínas, péptidos y otras moléculas se pueden inmovilizar en matrices de fase sólida para el uso de acuerdo con los métodos de la invención. Las matrices pueden ser agarosa, polímeros en forma de esferas, placas o bolas de poliestireno, portaobjetos de vidrio o vidrio poroso, y nitrocelulosa u otros materiales membranosos. Algunos soportes se pueden activar para la unión directa a un ligando. Otros soportes se hacen con nucleófilos u otros grupos funcionales que se pueden unir a proteínas u otros ligandos mediante el uso de espaciadores.

La inmovilización de los inhibidores de DPIV de la invención a soportes sólidos se puede llevar a cabo mediante el uso de procedimientos químicos de unión rutinarios. En general, los compuestos de la invención se inmovilizan incluyendo en los compuestos un primer grupo funcional accesible (p.ej. un grupo alcohol) y poniendo en contacto el compuesto con un soporte sólido que contiene un segundo grupo funcional complementario (p.ej. grupos carboxilo) en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el primer y segundo grupo funcional reaccionen entre sí para formar un enlace covalente (p.ej. enlace éster). Por "accesible", en referencia a un grupo funcional, se quiere decir que el grupo funcional está en una forma que es reactiva y no está impedido estéricamente para reaccionar con el soporte sólido. La unión puede ser directa o indirecta (es decir, por medio de un espaciador, L).

Los grupos funcionales para inmovilizar los compuestos de la invención a un soporte sólido se pueden introducir en los restos de unión peptídicos o en las porciones del espaciador de estos compuestos. Por ejemplo, se pueden incorporar aminoácidos que incluyen grupos funcionales en sus cadenas laterales (p.ej. residuos de aspartato, glutamato, cisteína) en el resto de unión peptídico durante la síntesis, y colocados a una distancia suficiente del grupo reactivo que se une a la proteína de interés para evitar el impedimento estérico indeseado provocado por el soporte sólido en la reacción entre el compuesto y la proteína de interés. De forma alternativa, los compuestos de la invención se pueden inmovilizar por medio de un grupo funcional de la molécula espaciadora a un soporte sólido. Así, por ejemplo, los espaciadores que se usan pueden incluir, además del primer y segundo grupo reactivo del espaciador para unirse al primer y segundo resto de unión peptídico, un grupo funcional adicional para unirse al soporte sólido. Un espaciador multivalente (trivalente) ejemplar de este tipo se ilustra a continuación. Tales espaciadores multivalentes están disponibles comercialmente, y pueden ser sintetizados por alguien de experiencia habitual en la técnica mediante el uso solamente de experimentación rutinaria:

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Para evitar reacciones secundarias, se prefiere que los grupos reactivos del espaciador que se usan para unir la molécula de espaciador a los restos de unión peptídicos sean diferentes de los grupos funcionales que se usan para unir el espaciador al soporte sólido. Tales grupos funcionales se pueden introducir en las moléculas de espaciador en cualquier momento durante o después de la síntesis de estas moléculas. Así, en general, se pueden usar los mismos tipos de grupos funcionales, reacciones y reactivos de protección/desprotección, y condiciones de reacción que están establecidas en la técnica para el uso de moléculas espaciadoras para unir, p.ej., proteínas o péptidos entre sí o a soportes sólidos, para inmovilizar los compuestos de la invención a un soporte sólido.

Al final de la descripción detallada se incluyen tablas que exponen una muestra representativa de espaciadores disponibles comercialmente, p.ej. de Pierce Catalog and Handbook, Rockford, Ill. La tabla también identifica hacia qué grupo es reactivo el espaciador, p.ej., sulfhidrilos, carboxilos.

Se puede usar una diversidad de recipientes de cultivo. Los recipientes de incubación disponibles comercialmente incluyen matraces con agitación (Corning, Inc., Corning, NY), reactores de tanque agitado (Verax, Lebanon, NH), reactores de burbujeo, reactores de células en suspensión, reactores de adsorción de células y reactores de atrapamiento de células, placas de Petri, placas de múltiples pocillos, matraces, bolsas y dispositivos de fibra hueca, espuma celular (Cytomatrix), placas Maxisorb (NUNC), y sistemas de cultivo de células (p.ej., Aastrom Cell Production System, véase además la patente de EE.UU. nº 5.635.386, titulada "Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture", expedida a Palsson et al., y la patente de EE.UU. nº 5.646.043, titulada "Methods for the ex vivo replication of human stem cells and/or expansion of human progenitor cells", expedida a Emerson, et al.). El dispositivo de cultivo de Aastrom es una cámara de incubación para la propagación de células troncales humanas ex vivo mediante el uso de un sistema de cultivo de intercambio de medio específico. El dispositivo supuestamente es útil para propagar todos los tipos de células hematopoyéticas, que incluyen, p.ej., células troncales, células progenitoras, células estromales, pero se excluyen las células linfoides. En general, los cultivos celulares que usan los recipientes de cultivo anteriormente mencionados se mantienen en suspensión mediante una diversidad de métodos, que incluyen agitación o suspensión por medio de esferas. En general, tales recipientes están formados de uno o más de los siguientes componentes: poliestireno, polipropileno, acrílico, nailon y vidrio. Para las realizaciones en las que el primer resto selectivo P^{1} está unido a una superficie del recipiente, se usan métodos convencionales de inmovilización para unir el resto a la superficie, directamente o por medio de un espaciador, L.

Las matrices insolubles enumeradas anteriormente no poseen por sí mismas grupos funcionales para la unión de los compuestos de la invención, y por lo tanto se deben modificar químicamente, mediante un proceso conocido como activación. Por ejemplo, el poliestireno se puede activar mediante la clorometilación de los residuos fenilo (Pierce Chemical Company Catalog and Handbook; Combinatorial Peptide & Nonpeptide Libraries. A Handbook VCH
Weinheim Ed. Giuntha Jung - 1996, capítulos 16 y 17) para producir clorometil poliestireno. Se puede aprovechar la ventaja del grupo funcional reactivo cloruro bencílico para introducir grupos funcionales carboxilato, amino, hidroxilo, maleimida, sulfhidrilo, N-succinimidilo, y muchos otros. La introducción de los grupos funcionales permite entonces que se lleven a cabo procedimientos químicos que permiten la unión covalente de los compuestos de la invención directamente o a través de una unidad espaciadora. Las reacciones de unión requieren grupos funcionales compatibles en la matriz y en el ligando o grupo espaciador que está unido o que se unirá al compuesto de la invención. Por ejemplo, la introducción de un grupo carboxilato en la matriz permite la unión covalente a grupos amino libres. Un poliestireno modificado para portar grupos carboxilato se puede unir de forma covalente directamente a Lys-boroPro por medio de la unión al grupo \varepsilon-amino libre de la cadena lateral de Lys, o por medio de un espaciador que tiene un grupo amino libre. De forma alternativa, un poliestireno modificado para portar un grupo amino se puede unir a, por ejemplo, Lys-boroPro por medio de la unión a través de un espaciador que contiene dos grupos carboxilato, uno para unirse al grupo \varepsilon-amino de Lys-boroPro, y el otro para el grupo amino del poliestireno modificado con amino.

Los procedimientos químicos que conducen a tales uniones son conocidos y se describen en muchas fuentes, que incluyen los catálogos de empresas tales como Pierce Chemical, que vende tanto las matrices, activadas e inactivadas, como las moléculas espaciadoras. Otros suministradores incluyen Sigma, Novabiochem, entre otros. Los métodos para unir ligandos como se describió anteriormente para poliestireno, pero específicos para las otras matrices enumeradas anteriormente, están disponibles y son conocidos, y se describen en fuentes tales como las descritas anteriormente y en Immobilized Affinity Ligand Techniques. "All the ``recipes'' for successful affinity matrix preparation"; Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, de Shan S. Wong.

Las matrices están disponibles en diversas formas que incluyen esferas, y esferas magnéticas que proporcionan una extracción especialmente fácil del ligando unido a la matriz.

La química de avidina-biotina proporciona otra forma de conseguir el mismo resultado final, la unión de los compuestos de la invención a matrices insolubles. Se puede unir fácilmente biotina al grupo \varepsilon-amino de Lys-boroPro, por ejemplo, y el conjugado resultante se adherirá con una afinidad elevada a avidina o estreptavidina. Hay disponibles comercialmente un amplio surtido de derivados insolubilizados de avidina y estreptavidina (Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook - desarrollado por expertos de Pierce Technical Assistance).

De forma alternativa, el resto selectivo, P^{1}, se puede unir a una forma particulada (p.ej. una partícula o una membrana) que tiene una superficie a la que el resto selectivo se puede unir directa o indirectamente. Los materiales ejemplares que se pueden usar para formar tales particulados incluyen nitrocelulosa, agarosa, sefarosa y otros tipos de materiales de soporte a los que se unen de forma rutinaria ligandos, p.ej., materiales de cromatografía de afinidad. En las realizaciones preferidas, el particulado es una partícula magnética tal como la descrita en las patentes de EE.UU. nº 4.554.088, expedida a Whitehead et al., titulada "Magnetic particles for use in separations"; 5.382.468, expedida a Chagnon et al., titulada "Biodegradable magnetic microclusters and methods for making them"; 4.454.234, expedida a Czerlinkski, titulada "Coated magnetizable microparticles, reversible suspensions thereof, and processes related thereto"; 4.795.698, expedida a Owen et al, titulada "Magnetic-polymer particles"; y 4,582,622, expedida a Ikeda et al, titulada "Magnetic particulate for immobilization of biological protein and process of producing the same".

Se proporciona un aparato para poner en práctica el método descrito anteriormente. El aparato incluye un recipiente; y un inhibidor de DPIV contenido en él o unido a él. Preferiblemente, el recipiente es un recipiente estéril. El inhibidor de DPIV puede estar en forma soluble o insoluble como se describió anteriormente. Así, por ejemplo, el inhibidor de DPIV puede estar presente en el recipiente en estado seco (p.ej. liofilizado), sin unir o unido a la superficie del recipiente, y vendido al usuario final en forma estéril para minimizar la probabilidad de contaminación por el usuario final (p.ej. cuando se introduce el inhibidor al recipiente) y para minimizar además la probabilidad de pérdida de actividad del inhibidor (p.ej. proporcionando el inhibidor en estado seco, ya que es menos probable que pierda actividad en el almacenamiento). De forma alternativa, el inhibidor de DPIV puede estar unido a una partícula, tal como una partícula magnética, la cual se puede vender en estado seco en un recipiente separado, o proporcionarla en el recipiente de cultivo celular.

Se proporciona un equipo para estimular el crecimiento y/o la diferenciación de células hematopoyéticas in vitro. El equipo incluye el aparato anteriormente descrito, junto con instrucciones para el uso del aparato para estimular el crecimiento y/o la diferenciación de células hematopoyéticas in vitro. Opcionalmente, el equipo contiene además los nutrientes para el crecimiento apropiados adicionales para cultivar las células hematopoyéticas. Tales nutrientes se pueden proporcionar en estado líquido o seco en el envase del aparato o en un envase separado, y cuyo contenido se puede añadir al recipiente del aparato en el momento de cultivar las células.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro.

Las tres realizaciones de este método se describen más adelante para ilustrar este método. En general, las realizaciones difieren entre sí en la selección de las células hematopoyéticas que se estimulan in vitro. En cada método, al menos una de la(s) etapa(s) de cultivo se realiza(n) en ausencia de citocinas añadidas o células estromales. Los heteroconjugados preferidos que se usan en cada realización contienen un antígeno específico de tumor o un antígeno específico de patógeno.

La segunda realización se dirige a estimular células de sangre de cordón umbilical en cultivo. Esta realización implica: (1) cultivar las células de sangre de cordón umbilical en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV (p.ej., un monómero y/o homoconjugado de inhibidor de DPIV) para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en cultivo; y (2) cultivar las células de estirpe T tempranas con un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej. un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno que están presentes en el cultivo. La etapa (2) se puede realizar en presencia o ausencia de antígeno específico. Las etapas (1) y (2) se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. En general, el número de células T específicas de antígeno se compara con un cultivo de control de células de sangre de cordón umbilical que se trata como se describió en las etapas (1) y (2), con la excepción de que el cultivo de control no se pone en contacto con el heteroconjugado. En cada etapa, las células se cultivan en presencia del inhibidor de DPIV o heteroconjugado durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células de estirpe T tempranas y para incrementar el número de células T específicas de antígeno, respectivamente, respecto del número de tales células que están presentes en el cultivo de control.

La tercera realización se dirige a estimular células troncales de sangre periférica en cultivo. Esta realización implica: (1) cultivar las células troncales de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV (p.ej. un monómero y/o homoconjugado de inhibidor de DPIV) para incrementar el número de células de estirpe T en cultivo; y (2) cultivar las células de estirpe T con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej. un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo. La etapa (2) se puede realizar en presencia o ausencia del antígeno específico. Las etapas (1) y (2) se pueden realizar de forma concurrente o secuencial. En general, el número de células T específicas de antígeno se compara con un cultivo de control de células troncales de sangre periférica que se trata como se describió en las etapas (1) y (2), con la excepción de que el cultivo de control no se pone en contacto con el heteroconjugado. En cada etapa, las células se cultivan en presencia del inhibidor de DPIV o heteroconjugado durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células T y para incrementar el número de células T específicas de antígeno, respectivamente, respecto del número de tales células que están presentes en el cultivo de control. De forma alternativa, debido a que se sabe que la sangre periférica contiene células T, es posible incrementar el número de células T específicas de antígeno en cultivo sin la etapa de estimulación (1), es decir, el método para incrementar el número de células T específicas de antígeno implica cultivar las células de sangre periférica con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico (p.ej. un antígeno específico de tumor o de patógeno) para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo. Esta etapa se puede realizar en presencia o ausencia del antígeno específico.

A continuación se proporciona un procedimiento ejemplar para poner en contacto diversos inhibidores de DPIV representativos.

1.: Obtener médula ósea o sangre de cordón umbilical en un tubo heparinizado (tapón verde). Se puede almacenar a temperatura ambiente hasta su uso en un plazo de 48 horas.

2.: Mezclar médula/sangre 1:1 con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS) que se ha almacenado a 4ºC.

3.: Aplicar cuidadosamente una capa de la mezcla sangre-PBS en una cantidad de 2x volúmenes de Histopaque (Sigma) que se ha almacenado a 4ºC.

4.: Centrifugar a 400 g x 20 minutos a 37ºC.

5.: Recoger cuidadosamente las células en la interfase y lavar x2 en PBS frío.

6.: Contar las células viables mediante el uso de azul trypan.

7.: Colocar las células en cultivos de 1 ml en tubos de cultivo de plástico (o placas de microtitulación de 96 pocillos o de 24 pocillos) a 104 células/ml en medio de Dulbecco modificado por Iscove de CellGro (Meditech) que contiene kanamicina (5 \mug/ml), la concentración deseada de Xaa-boroPro u otro compuesto de la invención, y en ausencia o presencia de Giant Cell Tumor Conditioned Medium (GCT-CM, Origen) como fuente de factores de crecimiento. Xaa-boroPro o los otros compuestos de la invención se deberían diluir en el medio y añadir al cultivo solamente después de que las células estén en el tubo de cultivo.

8.: Las células se cultivan a 37ºC en un incubador de aire húmedo que contiene un 5% de CO_{2}.

9.: En el momento deseado, se extrae una alícuota de las células y se realiza un recuento.

10.: El recuento se puede realizar en un microscopio (directo) o mediante el uso del análisis MTT (análisis colorimétrico).

Los resultados de los experimentos que emplean este protocolo se ilustran en las figuras adjuntas y se describen en la descripción breve de los dibujos.

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<110> Bachovchin, William

\hskip1cm Wallner, Barbara

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<120> ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS IN VITRO

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<130> I0248/7005

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<150> US 60/060.306

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<151> 29-09-1997

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<160> 20

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<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 1

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: 31

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 3

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: 33

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 5

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: 35

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 6

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: 36

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<210> 7

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 7

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: 37

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 8

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: 38

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<210> 9

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<211> 31

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 55

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 15

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<210> 16

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 16

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<210> 17

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<210> 18

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 20

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<213> homo sapiens

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 20

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Claims

1. Un método para estimular células hematopoyéticas in vitro que comprende:

(1): poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un inhibidor de una dipeptidil peptidasa tipo IV para incrementar el número de dichas células hematopoyéticas y/o el estado de diferenciación de dichas células hematopoyéticas respecto del número y de la diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el inhibidor, pero que se somete por lo demás a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del inhibidor; y

(2): cultivar las células hematopoyéticas en presencia del inhibidor y en ausencia de citocina exógena en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control.

2. El método de la reivindicación 1, en el que incrementar el número de células hematopoyéticas comprende incrementar el número de células al menos 2 veces respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes cuando las células hematopoyéticas se pusieron en contacto inicialmente con el inhibidor.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las células hematopoyéticas se seleccionan del grupo que consiste en células troncales hematopoyéticas, células troncales primordiales, células progenitoras tempranas, células CD34+, células tempranas de las estirpes mesenquimatosa, mieloide, linfoide y eritroide, células de médula ósea, células sanguíneas, células de sangre de cordón umbilical, células estromales, y las células precursoras hematopoyéticas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el inhibidor de una dipeptidil peptidasa tipo IV (DPIV) se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor soluble de DPIV y un inhibidor inmovilizado de DPIV.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el inhibidor de DPIV se selecciona del grupo que consiste en un monómero de Lys-boroPro, un monómero de Pro-boroPro, un monómero de Val-boroPro y un conjugado de Lys-boroPro.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el inhibidor es un inhibidor inmovilizado.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el inhibidor inmovilizado comprende el inhibidor unido a una estructura de inmovilización que es un recipiente de cultivo de tejidos.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el inhibidor inmovilizado comprende el inhibidor unido a una estructura de inmovilización que es una partícula.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad suficiente de inhibidor es aquella cantidad necesaria para incrementar el número de células hematopoyéticas al menos dos veces.

10. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de médula ósea en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en el cultivo; y

(2): cultivar las células de estirpe T tempranas en presencia de una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que al menos una de las etapas de cultivo anteriores se realiza en ausencia de citocina exógena.

11. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de sangre de cordón umbilical en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV para incrementar el número de células de estirpe T tempranas en el cultivo; y

12. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un inhibidor de DPIV para incrementar el número de células T en el cultivo; y

(2): cultivar las células T con una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el culti- vo;

13. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

(1): cultivar células de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un inhibidor de DPIV unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que el cultivo se realiza en ausencia de citocina exógena.

14. El método de las reivindicaciones 10, 11, 12 ó 13, en el que el inhibidor de DPIV es un monómero de inhibidor de DPIV, un homoconjugado de inhibidor de DPIV, y una combinación de los anteriores.

15. El método de las reivindicaciones 10, 11, 12 ó 13, en el que el heteroconjugado contiene un antígeno específico de tumor.

16. El método de las reivindicaciones 10, 11, 12 ó 13, en el que el heteroconjugado contiene un antígeno específico de patógeno.

17. El método de las reivindicaciones 10, 11 ó 12, en el que una etapa de cultivo se realiza en presencia de citocinas añadidas o células estromales.

18. El método de las reivindicaciones 10, 11 ó 12, en el que la etapa (1) se realiza en ausencia de citocina exógena.

19. El método de las reivindicaciones 10, 11 ó 12, en el que la etapa (2) se realiza en presencia del péptido antigénico.

20. El método de la reivindicación 13, en el que la etapa (1) se realiza en presencia del péptido antigénico.

21. El método de las reivindicaciones 10, 11 ó 12, en el que la etapa (1) y la etapa (2) se realizan simultáneamente en ausencia de citocina exógena.

22. El método de la reivindicación 10, en el que las células de médula ósea se seleccionan del grupo que consiste en células CD34+ aisladas y células troncales aisladas.

23. Un método para estimular células hematopoyéticas in vitro que comprende:

(1): poner en contacto las células hematopoyéticas con una cantidad suficiente de un compuesto para incrementar el número de dichas células hematopoyéticas y/o el estado de diferenciación de dichas células hematopoyéticas respecto del número y de la diferenciación de las células hematopoyéticas que están presentes en un cultivo de control que no se pone en contacto con el compuesto, pero que se somete por lo demás a las mismas condiciones de cultivo que las células hematopoyéticas que se cultivan en presencia del compuesto; y

(2): cultivar las células hematopoyéticas en presencia del compuesto y en ausencia de citocina exógena en condiciones y durante un tiempo suficiente para incrementar el número de células hematopoyéticas y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas respecto del número de células hematopoyéticas que estaban presentes en el cultivo de control,

: en el que el compuesto tiene la estructura

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y,

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en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

24. Un método para estimular células hematopoyéticas in vitro que comprende:

: cultivar las células hematopoyéticas en ausencia de citocinas exógenas y en presencia de una cantidad de un inhibidor de dipeptidil peptidasa tipo IV (DPIV) suficiente para estimular las células hematopoyéticas.

25. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

en la que el compuesto tiene la estructura

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y,

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en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

26. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro que comprende:

en el que el compuesto tiene la estructura

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60

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y,

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en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

27. Un método para propagar células T específicas de antígeno in vitro, que comprende cultivar células de sangre periférica en presencia de una cantidad suficiente de un heteroconjugado que contiene un compuesto unido a un péptido antigénico para incrementar el número de células T específicas de antígeno en el cultivo;

en el que el cultivo se realiza en ausencia de citocina exógena, y

en el que el compuesto tiene la estructura

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y,

66

en la que R representa la cadena lateral del aminoácido.

28. El método de las reivindicaciones 1, 10, 11, 12, 13, 23, 25 ó 26, en el que el compuesto es Val-boroPro, Lys-boroPro, Pro-boroPro o Ala-boroPro.

29. El método de la reivindicación 1, 3, 5, 10 a 13, 23 y 25 a 27, en el que la ausencia de citocina exógena se debe a la ausencia de células estromales.