ES2391573T3

ES2391573T3 - Método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno

Info

Publication number: ES2391573T3
Application number: ES06797441T
Authority: ES
Inventors: Mie Nieda; Manami Isogai; Masashi Takahara; Andrew Nicol
Original assignee: Medinet Co Ltd
Current assignee: Medinet Co Ltd
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2012-11-27
Anticipated expiration: 2026-09-05
Also published as: JPWO2007029689A1; DK1930414T3; CN101258238A; AU2006288348B2; EP1930414B1; US8609410B2; EP1930414A4; KR20080059166A; AU2006288348A1; EP1930414A1; CN101258238B; JP2013150609A; US20140073050A1; WO2007029689A1; JP5307944B2; KR101419711B1; JP5384827B2; US20090104161A1

Abstract

Un método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno, comprendiendo el método:someter la célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con un bisfosfonato y un antígeno de enfermedad.

Description

Método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a una célula presentadora de antígeno que se somete a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad. También la presente invención se refiere a una composición médica que comprende la célula presentadora de antígeno, un método de tratamiento y prevención que usa células dendríticas y

10 un método de inducción de un inmunocito que usa la célula presentadora de antígeno. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un inmunocito que se induce mediante el método de inducción, a una composición médica que comprende el inmunocito y a un método de tratamiento y prevención que usa el inmunocito.

Antecedentes de la técnica

15 Como métodos para tratar el cáncer, existían la resección quirúrgica, la radioterapia y la quimioterapia usando un agente antitumoral. En los últimos años, se han estudiado y puesto en práctica otros diversos métodos terapéuticos distintos de estos. Uno de ellos es una terapia con inmunocélulas que utiliza inmunocitos. Por ejemplo, se describe la activación de linfocitos T γδ por un aminobisfosfonato mediante una célula presentadora de antígeno por

20 Miyagawa et al. en The Journal of Immunology 2001, 166, 5508 y Kunzmann et al. en Blood, 2003, 102(11), 39b. Se describe también la activación directa de linfocitos T γδ y su uso potencial en el tratamiento del cáncer por Kato et al. en The Journal of Immunology, 2001, 167, 5092, Wilhelm et al. en Blood, 2003, 102(1), 200, Kunzmann et al. en Blood, 2000, 96, 384 y Tanaka et al. en Bio Clinica, 2004, 19(5), 439.

25 La terapia inmunocelular incluye una terapia con LAK (linfocitos citolíticos activados por linfocinas) en que los linfocitos se activan in vitro por linfocinas y se transfieren entonces al cuerpo, una terapia con CTL (linfocitos T citotóxicos, de aquí en adelante designados como CTL) que usa CTL que reconocen y atacan específicamente una lesión, una terapia con células dendríticas y similares.

30 En la terapia con células dendríticas, que usa células dendríticas obtenidas permitiendo que esté presente un antígeno de enfermedad en el MHC (complejo antigénico principal de histocompatibilidad) directamente o después del procesamiento intracelular, se inducen in vivo para tratamiento CTL específicos de antígeno de enfermedad que atacan selectivamente un patógeno. El antígeno de enfermedad a presentar puede ser, por ejemplo, una proteína o péptido antigénico de cáncer, una proteína o péptido antigénico de enfermedad infecciosa o una parte de los mismos

35 (véanse los documentos no de patente 1 y 2, por ejemplo).

Con el cultivo conjunto de las células dendríticas sometidas a pulsos con el antígeno de enfermedad y los linfocitos para estimular los linfocitos con las células dendríticas, es posible inducir CTL específicos de antígeno de enfermedad in vitro. Por ejemplo, en el caso de uso de células dendríticas sometidas a pulsos con la proteína o

40 péptido antigénico de cáncer o la proteína o péptido antigénico de enfermedad infecciosa, hay un aumento de los CTL específicos de antígeno de enfermedad inducidos en el cultivo conjunto de 5 a 20 veces del caso en que no se usen las células dendríticas anteriormente observadas.

En la terapia de células dendríticas que usa células dendríticas sometidas a pulsos con la proteína o péptido

45 antigénico de cáncer o la proteína o péptido antigénico de enfermedad infecciosa, la eficacia de la inducción de los CTL específicos de antígeno de enfermedad in vivo, a saber, la relación de CTL a todos los linfocitos, es conocida por aumentar por un factor de 2 a 14. La terapia con células dendríticas se da también a conocer en los documentos US 6.821.778, WO 2006/06638 y por Conti et al. en The Journal of Immunology, 2005, 174, 252-260.

50 Para potenciar la eficacia de la terapia de células dendríticas elevando la eficacia de la inducción de los CTL específicos de antígeno de enfermedad por células dendríticas, se realizan principalmente dos métodos actualmente.

En un método, además de someter a pulsos las células dendríticas con el antígeno de enfermedad, permitiendo a un

55 fármaco o similar que reaccione con un reactor de tipo Toll (de aquí en adelante designado como TLR) en las células dendríticas para que reaccione con las células dendríticas de modo que se potencie la capacidad presentadora de antígeno de las células dendríticas, aumenta directamente la eficacia de inducción de los CTL específicos de antígeno de enfermedad (un efecto coadyuvante por el TLR; véanse los documentos no de patente 3 y 4, por ejemplo). En el otro método, además de someter a pulsos las células dendríticas con el antígeno de enfermedad,

60 permitiendo al glucolípido o similar estar presente en moléculas presentadoras de antígeno distintas de moléculas de MHC, por ejemplo, moléculas CD1d (diferenciación de agrupamiento 1d) en las células dendríticas de modo que activen los inmunocitos, incluyendo iNKT (linfocitos T citolíticos naturales invariantes), etc., distintos de los CTL específicos de antígeno de enfermedad, aumenta indirectamente la eficacia de inducción de los CTL específicos de antígeno de enfermedad por estos inmunocitos activados (un efecto coadyuvante mediante inmunocitos distintos de

65 los CTL específicos de antígeno de enfermedad, véanse los documentos no de patente 5 y 6, por ejemplo).

Sin embargo, el aumento en la inducción de CTL específicos de antígeno de enfermedad mediante el efecto coadyuvante directo por TLR o el efecto coadyuvante indirecto por inmunocitos distintos de los CTL específicos de antígeno de enfermedad es de aproximadamente 4 a 6 veces que en el caso en que estos coadyuvantes no se usen (in vitro). Por consiguiente, se deseaba desarrollar una tecnología capaz de inducir CTL específicos de antígeno de

5 enfermedad más eficazmente.

Documento no de patente 1: Blood 2004, 103, 383-389

Documento no de patente 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 8809-8814

10 Documento no de patente 3: Nat. Rev. Immunol. 2004, 4, 449-511

Documento no de patente 4: Cancer Res. 2004, 64, 5461- 5470

15 Documento no de patente 5: J. Clin. Invest. 2004, 114, 1800-1811

Documento no de patente 6: J. Exp. Med. 2002, 195, 617-624

Divulgación de la invención

20 Problema a resolver por la invención

La presente invención se realizó considerando lo anterior y proporciona un método para un tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica o similar) para inducir eficazmente un 25 inmunocito que incluye de forma dominante un CTL CD8+ específico de antígeno de enfermedad y/o un linfocito T γδ in vivo y/o in vitro, una composición médica que comprende la célula presentadora de antígeno activada, un método de tratamiento y prevención que usa la célula presentadora de antígeno, un método de inducción de un inmunocito que incluye un CTL CD8+ específico de antígeno de enfermedad y/o un linfocito T γδ que usa la célula presentadora de antígeno activada, un inmunocito que es inducido por el método, una composición médica que comprende el

30 inmunocito y un método de tratamiento y prevención que usa el inmunocito.

Medios para resolver el problema

Para resolver el problema descrito anteriormente, los inventores de la presente invención realizaron estudios. Los

35 inventores encontraron entonces que, al someter células dendríticas a pulsos conjuntamente con bisfosfonato además del pulso con un antígeno de enfermedad, las relaciones de CTL específicos de antígeno de enfermedad y linfocitos T γδ a todos los linfocitos y los números de CTL específicos de antígeno de enfermedad y linfocitos T γδ aumentaban considerablemente en comparación con el caso de no añadir bisfosfonato, y completaron las presente invención. Por ejemplo, al añadir bisfosfonato, la relación de CTL específicos de antígeno de enfermedad a todos los

40 linfocitos puede aumentar por un factor de aproximadamente 100 y la relación de linfocitos T γδ a todos los linfocitos puede aumentar por un factor de aproximadamente 3 en comparación con aquellas en el caso de no añadir bisfosfonato, y el número de CTL específicos de antígeno de enfermedad puede aumentar por un factor de aproximadamente 90 y el número de linfocitos T γδ puede aumentar por un factor de aproximadamente 6 en comparación con aquellos en el caso de no añadir bisfosfonato. Sin embargo, la presente invención no está limitada

45 a estos valores numéricos. La presente invención promueve adicionalmente el desarrollo de una terapia inmunocelular que trata y previene cáncer y/o enfermedades infecciosas induciendo CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ.

Un objeto de la invención es: 50

(1): Un método para un tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno, incluyendo el método someter la célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad;

(2): el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según (1), en el que la célula

55 presentadora de antígeno es al menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial;

(3) el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según (1) o (2), en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (I), una sal del mismo o su hidrato:

60 Fórmula 1 en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo

5 hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2 forman parte de la misma estructura cíclica, y

un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior,

10 un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico;

(4) el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según cualquiera de (1) a (3), en el que el bisfosfonato es al menos uno seleccionado del grupo consistente en ácido zoledrónico, ácido

15 pamidrónico, ácido alendrónico, ácido risedrónico, ácido ibandrónico, ácido incadrónico, ácido etidrónico, una sal de los mismos o su hidrato;

(5) el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según cualquiera de (1) a (4),

en el que la concentración de bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 20 μM; 20

(6): el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según (5), en el que la concentración de bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 5 μM;

(7): el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según cualquiera de (1) a (6),

25 en el que el antígeno de enfermedad es al menos uno seleccionado del grupo consistente en una proteína antigénica de cáncer, un péptido antigénico de cáncer, una proteína antigénica de enfermedad infecciosa o un péptido antigénico de enfermedad infecciosa, una célula de cáncer lisada o una célula de enfermedad infecciosa lisada y una célula apoptótica y una célula necrótica de una célula de cáncer o una célula de enfermedad infecciosa, y un producto termotratado de los mismos;

(8) el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según cualquiera de (1) a (7), en el que la concentración de antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,01 a 20 μg/ml;

(9) el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según (8), en el que la 35 concentración de antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,1 a 2 μg/ml;

(10) un método de producción de una célula presentadora de antígeno, incluyendo el método tratar la célula presentadora de antígeno con el método para tratamiento de activación según cualquiera de (1) a (9);

40 (11) una célula presentadora de antígeno activada producida mediante el método de producción según (10);

(12) una composición médica para un cáncer y/o una enfermedad infecciosa, comprendiendo la composición médica la célula presentadora de antígeno activada según (11);

45 (13) la composición médica según (12), en la que la célula presentadora de antígeno es una célula presentadora de antígeno autóloga o una célula presentadora de antígeno alogénica que comparte el mismo HLA;

(14) un método de prevención y tratamiento de un cáncer y/o una enfermedad infecciosa, incluyendo el método

administrar la célula presentadora de antígeno activada según (11); y 50

(15) el método de prevención y tratamiento según (14), en el que la célula presentadora de antígeno es una célula presentadora de antígeno autóloga o una célula presentadora de antígeno alogénica que comparte el mismo HLA.

(16) Un método para inducir un inmunocito, incluyendo el método 55

(i): someter una célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de

enfermedad, y

(ii): cultivar conjuntamente la célula presentadora de antígeno y un linfocito simultáneamente a o después del pulso

conjunto; 5

(17): el método para inducir un inmunocito según (16), en el que el inmunocito a inducir incluye al menos uno de un CTL CD8+ específico de antígeno de enfermedad y un linfocito T γδ;

(18): el método para inducir un inmunocito según (16) o (17), en el que la célula presentadora de antígeno es al

10 menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial;

(19) el método para inducir un inmunocito según cualquiera de (16) a (18), en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (I), una sal del mismo o su hidrato:

15 Fórmula 1

en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno

20 independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2 forman parte de la misma estructura cíclica, y

25 un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico;

(20) el método para inducir un inmunocito según cualquiera de (16) a (19), en el que el bisfosfonato es al menos uno

30 seleccionado del grupo consistente en ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, ácido alendrónico, ácido risedrónico, ácido ibandrónico, ácido incadrónico, ácido etidrónico, una sal de los mismos y su hidrato;

(21) el método para inducir un inmunocito según cualquiera de (16) a (20), en el que la concentración de

bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 20 μM; 35

(22): el método para inducir un inmunocito según (21), en el que la concentración de bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 5 μM;

(23): el método para inducir un inmunocito según cualquiera de (16) a (22), en el que el antígeno de enfermedad es

40 al menos uno seleccionado del grupo consistente en una proteína antigénica de cáncer, un péptido antigénico de cáncer, una proteína antigénica de enfermedad infecciosa o un péptido antigénico de enfermedad infecciosa, una célula de cáncer lisada o una célula de enfermedad infecciosa lisada y una célula apoptótica y una célula necrótica de una célula de cáncer o una célula de enfermedad infecciosa, y un producto termotratado de los mismos;

45 (24) el método para inducir un inmunocito según cualquiera de (16) a (23), en el que la concentración de antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,01 a 20 μg/ml; y

(25) el método para inducir un inmunocito según (24), en el que la concentración del antígeno de enfermedad en el

pulso conjunto es de 0,1 a 2 μg/ml. 50

(26) Un método de producción de un inmunocito, incluyendo el método inducir el inmunocito mediante el método de inducción según cualquiera de (16) a (25);

(27) un inmunocito producido mediante el método de producción según (26); 55

(28): una composición médica para un cáncer y/o una enfermedad infecciosa, comprendiendo la composición médica

el inmunocito según (27);

(29): la composición médica para un cáncer y/o una enfermedad infecciosa según (28); en la que la célula

presentadora de antígeno es una célula presentadora de antígeno autóloga o una célula presentadora de antígeno 5 alogénica que comparte el mismo HLA;

(30) un método de prevención y tratamiento de un cáncer y/o una enfermedad infecciosa, incluyendo el método administrar el inmunocito según (27); y

10 (31) el método de prevención y tratamiento de un cáncer y/o una enfermedad infecciosa según (30), en el que la célula presentadora de antígeno es una célula presentadora de antígeno autóloga o una célula presentadora de antígeno alogénica que comparte el mismo HLA.

(32) Un acelerador de la activación de una célula presentadora de antígeno en el momento del pulso con un 15 antígeno de enfermedad, comprendiendo el acelerador de la activación bisfosfonato como componente eficaz;

(33) el acelerador de la activación de una célula presentadora de antígeno en el momento del pulso con un antígeno de enfermedad según (32), en el que la célula presentadora de antígeno es al menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial;

(34) el acelerador de la activación de una célula presentadora de antígeno en el momento del pulso con un antígeno de enfermedad según (32) o (33), en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (I), una sal del mismo o su hidrato:

25 Fórmula 1

en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo

30 hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2 forman parte de la misma estructura cíclica, y

un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, 35 un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico; y

(35) el acelerador de la activación de una célula presentadora de antígeno en el momento del pulso con un antígeno de enfermedad según cualquiera de (32) a (34), en el que el bisfosfonato es al menos uno seleccionado del grupo

40 consistente en ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, ácido alendrónico, ácido risedrónico, ácido ibandrónico, ácido incadrónico, ácido etidrónico, una sal de los mismos y su hidrato.

Breve descripción de los dibujos

45 [FIG. 1] La figura 1 es un gráfico que muestra un ejemplo del resultado de medir la relación de CTL CD8+ específicos de A27L.

Descripción de la invención

50 Realización 1: Producción de células presentadoras de antígeno activadas

En primer lugar, se detallarán las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención.

Las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención son células presentadoras de antígeno 55 que se someten a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad.

Las células presentadoras de antígeno anteriormente mencionadas usadas en la presente invención no están particularmente limitadas, sino que pueden ser cualquiera de células dendríticas inmaduras, células dendríticas maduras, otras células presentadoras de antígeno, células presentadoras de antígeno artificiales y una mezcla de las mismas, por ejemplo. Entre ellas, son preferibles las células dendríticas inmaduras y las células dendríticas 5 maduras, y son más preferibles las células dendríticas inmaduras. Esto es debido a que, cuando se someten a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad, las células dendríticas inmaduras pueden inducir más preferiblemente CTL específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ. También las células presentadoras de antígeno artificiales anteriormente observadas son células presentadoras de antígeno que se producen artificialmente y pueden ser, por ejemplo, células que se genomanipulan para expresar al menos 10 moléculas del antígeno de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD80, CD86), Adicionalmente, las células presentadoras de antígeno artificiales anteriormente observadas pueden obtenerse modificando una línea celular derivada de tumor de modo que las moléculas de MHC de clase I y moléculas coestimulantes se expresen como se describe anteriormente. Los ejemplos de línea celular anteriormente observada incluyen MDA-MB-231 derivada de cáncer de mama (antígeno HLA-A*0201 de clase I), TUHR10TKB

15 derivada de cáncer renal (antígeno HLA-A*0201/A*2402 de clase I), una línea JR-st derivada de cáncer de estómago (antígeno HLA-A*2402 de clase I) y similares. Estas líneas celulares están disponibles en ATCC, RlKEN BioResource Center, etc., por ejemplo. La producción de las células presentadoras de antígeno artificiales mencionadas anteriormente se da a conocer en la publicación de EE.UU. US-2005-004864-A1, y los contenidos completos de la misma se incorporan a la presente memoria como referencia.

20 En la presente invención, el bisfosfonato no está particularmente limitado, sino que designa un compuesto químico que es un análogo de ácido pirofosfórico y se obtiene sustituyendo C (un átomo de carbono) por O (un átomo de oxígeno) en el P-O-P de un esqueleto de ácido pirofosfórico. Los ejemplos de bisfosfonato usado en la presente invención pueden incluir un compuesto químico representado por la fórmula (I) siguiente, una sal del mismo y su

25 hidrato.

Fórmula 1

30 En la fórmula (I) anterior, R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo que puede estar sustituido, un grupo alquilo que puede estar sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, y R1 y R2 pueden formar parte de la misma estructura cíclica.

35 Los sustituyentes en R1 y R2 descritos anteriormente se seleccionan del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, por ejemplo.

40 En la presente invención, el átomo de halógeno es, por ejemplo, un átomo de flúor, un átomo de cloro o un átomo de bromo; el grupo alquilo es, por ejemplo, un grupo alquilo C1-C30 de cadena lineal o cadena ramificada tal como un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo isopropilo, un grupo butilo, un grupo pentilo, un grupo heptilo, un grupo octilo o un grupo pentadecanilo; el grupo alquilo inferior es, por ejemplo, un grupo alquilo C1-C10 de cadena lineal o cadena ramificada; el grupo arilo es, por ejemplo, un grupo fenilo o un grupo naftilo; el grupo aralquilo es, por

45 ejemplo, un grupo arilalquilo inferior; el grupo cicloalquilo es, por ejemplo, un grupo cicloalquilo C1-C10 tal como un grupo ciclooctilo o un grupo adamantilo y el grupo heterocíclico es, por ejemplo, un grupo piridilo, un grupo furilo, grupo pirrolidinilo, un grupo imidazolilo, un grupo quinolilo o un grupo isoquinolilo.

También en la presente invención el bisfosfonato es preferiblemente uno farmacéuticamente aceptado y, por

50 ejemplo, puede ser un bisfosfonato que tiene efecto inhibidor de la resorción ósea y que se usa generalmente como agente terapéutico para la osteoporosis. Los ejemplos del mismo incluyen un ácido zoledrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, zoledronato de sodio hidratado (ZOMETA™, Novartis Pharma AG)), un ácido pamidrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, pamidronato de disodio pentahidratado (AREDIA™, Novartis Pharma AG)), un ácido alendrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, alendronato de sodio

55 trihidratado (ONCLAST™, Banyu Pharmaceutical Co., Ltd)), un ácido risedrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, risedronato de sodio hidratado), un ácido ibandrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, ibandronato de sodio), un ácido incadrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, incadronato de disodio) y un ácido etidrónico, una sal del mismo y/o su hidrato (por ejemplo, etidronato de disodio). Entre ellos, se prefieren el ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, ácido alendrónico y sus sales y/o sus hidratos.

5 Con respecto al antígeno de enfermedad usado en la presente invención, la “enfermedad” mencionada anteriormente no está particularmente limitada, sino que es un cáncer o una enfermedad infecciosa, por ejemplo. El cáncer no está particularmente limitado, sino que puede ser cualquier cáncer, por ejemplo, un cáncer (incluyendo un precáncer) que sea difícil de tratar. La enfermedad infecciosa no está particularmente limitada sino que puede ser, por ejemplo, infecciones víricas tales como SIDA, hepatitis B y C, infecciones celulares, infecciones bacterianas,

10 micosis o protozoosis. No hay una limitación particular sobre la forma del antígeno de enfermedad usado en la presente invención que puede ser, por ejemplo, una proteína antigénica de cáncer, un péptido antigénico de cáncer, una proteína antigénica de enfermedad infecciosa o un péptido antigénico de enfermedad infecciosa. Adicionalmente, los ejemplos de antígeno de enfermedad observado anteriormente incluyen una célula de cáncer lisada o una célula de enfermedad infecciosa lisada, y una célula apoptótica y una célula necrótica de una célula de

15 cáncer o una célula de enfermedad infecciosa, y un producto termotratado de los mismos.

En el caso en que el antígeno de enfermedad anteriormente observado sea un antígeno de cáncer, puede usarse cualquier antígeno de cáncer. Por ejemplo, es posible usar un antígeno de cáncer de cualquiera de cáncer de próstata, hepatoma y cáncer pancreático. El antígeno de cáncer anteriormente observado puede ser, por ejemplo, 20 aquellos codificados por la familia de genes MAGE tales como MAGE1, MAGE3, GAGE, BAGE y RAGE. Los ejemplos de otros antígenos de cáncer incluyen un antígeno de cáncer que surge por mutaciones tales como p53, Kras, CDK4 y el producto del gen bcl-c-abl, un antígeno de cáncer que se sobreexpresa en células de cáncer tales como la proteína c-erb2 (neu) y un antígeno vírico oncogénico tal como la proteína E7 de HPV-16. Adicionalmente, es también posible usar un antígeno oncofetal tal como antígeno embriónico de carcinoma (CEA) o α-fetoproteína

25 (AFP), o un antígeno de diferenciación tal como un antígeno específico de próstata y CD-10 (antígeno CALLA), que se expresa en leucemias y linfomas de linfocitos B.

Las clases de enfermedades infecciosas para el antígeno de enfermedad infecciosa no están particularmente limitadas tampoco. Por ejemplo, la enfermedad infecciosa puede ser una enfermedad intratable entre las infecciones

30 víricas tales como SIDA, hepatitis B y C, infección por virus de Epstein-Barr (EBV) o infección por HPV. También puede emplearse un antígeno de parásitos tal como proteínas de circumsporozoito de Plasmodium.

Adicionalmente, en la presente invención, puede usarse un péptido sintético como el péptido antigénico de enfermedad descrito anteriormente. Esto reduce la carga sobre el paciente en comparación con el caso de usar un

35 antígeno de cáncer recogido a partir de los propios tejidos de cáncer del paciente. La proteína o péptido antigénico de cáncer anteriormente observado puede ser, por ejemplo, aquellos enumerados en las tablas 1 a 3 siguientes, que pueden procurarse o sintetizarse fácilmente por un especialista en la materia.

Tabla 1

Nombre: Clase Nombre Clase Nombre Clase

de antígeno: de cáncer de antígeno de cáncer de antígeno de cáncer

AARS: Placentoma BMS1L Mieloma DUSP12 Placentoma

ABL1: Fibroblastoma BMX Cáncer de próstata, etc. DYH1B Hepatoma

ACADVL: Placentoma BRD2 Linfoma T EBP Hepatoma

ACLT7B: Tumor cerebral BTG3 Cáncer de útero EBV-BMLF1 Linfoma B, etc.

ACP2: Linfoma C21ORF2 Cáncer de pulmón, etc. EBV-EBNA2,3,4,6 Linfoma B, etc.

ACVR2B: Tumor cerebral CALU Queratinocitoma EDF-1 Cáncer pancreático

ADPRTADSL AF6AFP: Fibroblastoma Tumor cerebral Mieloma Cáncer de pulmón CARHSP1 CASP-8 CCN1 CCT8 Placentoma Carcinoma espinocelular Tumor cerebral Mieloma EEF1G EEF2 EF1D EGLN1 Hepatoma, etc. Cáncer de ovario Cáncer de piel, etc. Cáncer tonsilar

Tumor cerebral,

AGPAT2: Cáncer renal CD43 Cáncer renal EIF3S6IP cáncer cervicouterino,

etc.

AIBP: Cáncer renal CDC27 Melanoma EIF4EBP3 Linfoma

AIM1: Hepatoma CDC2L5 Glioblastoma EIF4G2 Placentoma, etc.

Leucemia

AKAP9: Tumor cerebral CDIPT Carcinoma escirro ela2 linfoblástica

aguda

ALDA: Fibroblastoma CDK4 Melanoma EMS1 Cáncer de mama

ALDOA: Fibroblastoma CEA Cáncer de colon, etc. EPHB2 Cáncer de estómago, etc.

ALOX12B: Tumor cerebral, etc. CENF Cáncer de mama ETV6-AML1 Leucemia monocítica aguda

ALPHA NAC: Tumor cerebral CENPB Cáncer de útero FBLN1 Tumor cerebral

AMHR2: Carcinoma escirro CHD3 Timoma FBXO7 Cáncer pancreático

Tumor cerebral,

ANT3: cáncer de CKAP1 Mieloma FDFT1 Hepatoma

pulmón, etc.

ANXA11: Teratocarcinoma CLIC6 Cáncer digestivo FH Tumor cerebral

ANXA2: Diversos cánceres CLK3 Cáncer cervicouterino FKSG11 Cáncer de mama

APIG2: Hepatoma CLN6 Cáncer de pulmón FNBP3 Cáncer de piel

AP1M1: Hepatoma CNTF Cáncer de pulmón, etc. FXYD5 Mieloma

AP2M1: Mieloma COG8 Cáncer de útero GAGE3,4,5,6,7B Melanoma, diversos cánceres

AP3D1: Sarcoma, etc. COPB2 Cáncer de pulmón GCC2 Linfoma

APC: Cáncer de colon, etc. CORO1A Tumor cerebral, etc. GDF11 Tumor cerebral

APEXL2: Cáncer de pulmón, etc. COTL1 Placentoma, etc. GLIPR1 Glioma

ARL1: Cáncer de vejiga urinaria CSDA Placentoma GNB3 Tumor cerebral

ARL6IP: Mieloma CTAG1 Melanoma GNG4 Tumor cerebral

ARNTL1: Tumor cerebral CTAG2 Melanoma GOA4 Cáncer de estómago

Cáncer

ASNA1: Cáncer de útero CTAGE-1 Carcinoma escirro GOLGA1 cervicouterino,

carcinoma escirro

ATF3: Sarcoma CTNNA1 Cáncer de colon, etc. GOT1 Hepatoma

ATIC: Hepatoma CUL5 Carcinoma escirro gp100 Melanoma

ATP5B: Placentoma DAD1 Tumor cerebral GRB7 Cáncer de pulmón, etc.

ATRX: Diversos cánceres DCTN1 Tumor cerebral GTF2H2 Cáncer de piel, etc.

BAG5: Tumor cerebral DDX5 Sarcoma GTF2I Cáncer cervicouterino

BAGE: Melanoma, diversos cánceres DKFZP434N0735 Tumor cerebral GUCY2D Tumor de retina

BASP1: Tumor cerebral DKFZP434P112 Carcinoma escirro H2AFY Cáncer de pulmón, etc.

BAZ1A: Cáncer cervicouterino DKFZP564C236 Tumor cerebral HC58 Hepatoma

BAZ2A: Carcinoma escirro DLG5 Tumor cerebral HDAC5 Cánceres de colon, recto, etc.

bcr-abl: Leucemia mieloide crónica DNAJA1 Placentoma HER2/neu Cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago

BIRC2: Hepatoma DNAJA2 Cáncer de piel HKF1 Tumor cerebral

BIRC3: Hepatoma DNAJB1 Placentoma HMGA2 Hepatoma

BMAL2: Tumor cerebral DSP Cáncer de piel HMGN1 Mieloma

Tabla 2

Nombre de antígeno: Clase de cáncer Nombre de antígeno Clase de cáncer Nombre de antígeno Clase de cáncer

HMMR HNRPAB HPV16-E6 HPV16-E7 HPV18-E6 HPV18-E7 HRASLS3 HSP60 HSP90A HSPA4 HSPCA HSPE1 HSPH1: Cáncer de mama Placentoma, etc. Cáncer cervicouterino, etc. Cáncer cervicouterino, etc. Cáncer cervicouterino, etc. Cáncer cervicouterino, etc. Hepatoma, etc. Hepatoma, cáncer de útero Diversas clases Linfoma Placentoma Cáncer de útero Leucemia mieloide LDHB LGALS1 LGALS4 LIMS1 LMNA LRP130 LYST MAGE-1 MAGE-2 MAGE-3 MAGE-4 MAGE-6 MAGED2 Cáncer de vejiga urinaria, sarcoma, etc. Cáncer de pulmón Cáncer de estómago Mieloma Cáncer de pulmón, cáncer renal Hepatoma Cáncer de pulmón, etc. Melanoma, diversos cánceres Melanoma, diversos cánceres Melanoma, diversos cánceres Melanoma, diversos cánceres Melanoma, diversos cánceres Cáncer de mama, diversos cánceres NME1 NME2 NOTCH2 NRIP1 NUDT4NUPL1 NY-CO-10 NY-CO-33 NY-CO-7 NY-CO-8 NY-ESO-1 OCLN OGFR Cáncer de pulmón, etc. Tumor de retina Cáncer de mama, etc. Cáncer de mama Placentoma Tumor cerebral, placentoma Cánceres de colon y recto Cáncer de colon Cánceres de colon y recto Cánceres de colon y recto Carcinoma escirro Cáncer de colon Cáncer de piel, etc.

HTLV-1 tax: Leucemia de linfocitos T en adultos MAN2C1 Carcinoma escirro, etc. p53 Carcinoma espinocelular, etc.

ID4: Cáncer de útero MAP1B Tumor cerebral PAD3 Cáncer renal

IDH2: Cáncer de corazón y colon MAPK1 Cáncer de pulmón, etc. PAF1 Hepatoma

IFI16: Leucemia de linfocitos T MARK4 Tumor cerebral PAP Cáncer de próstata

IGBP1: Linfoma B, etc. MART-1 Melanoma PDAP1 Diversos cánceres

IKBKAP: Cáncer cervicouterino MAZ Cáncer pancreático, etc. PDI Cáncer de colon, cáncer de pulmón, etc.

Linfocitoma T,

ILF3: cáncer MBD2 Linfoma PDXK Cáncer de ovario

cervicouterino

Cáncer

INPP1: Cáncer de colon MCM3 cervicouterino, cáncer PECI Hepatoma

pancreático, etc.

JPHL1: Mieloma MED6 Cáncer de pulmón, etc. PFAS Tumor cerebral

JUN: Diversos cánceres MESDC2 Mieloma PFKFB3 Tumor cerebral, etc.

KCNAB3: Tumor cerebral MIF Tumor cerebral, etc. PFN1 Cánceres de colon, pulmón y pancreático

KIAA0117: Mieloma, cáncer de pulmón MJD1 Tumor cerebral PFN2 Tumor cerebral

KIAA0175: Leucemia mieloide MK167 Diversos cánceres PHF11 Eritoblastoma

KIAA0291: Tumor cerebral, etc. MLF1 Cáncer de vejiga urinaria, etc. PHF3 Glioma, etc.

Cáncer

KIAA0570: Tumor cerebral MLH1 pancreático, cáncer de vejiga PHKG2 Hepatoma, etc.

urinaria

KIAA0619: Tumor cerebral MRPS26 Cáncer de piel PI3 Cáncer de piel

KIAA0801: Tumor cerebral MSLN Cáncer de útero, cáncer de mama y ovario PIAS1 Leucemia de linfocitos B

Cáncer de

KIAA0909: Tumor cerebral MUC-1 mucina, cáncer PICALM Mieloma

pancreático, etc.

KIAA0975: Tumor cerebral MUM-1 Melanoma PKCB1 Tumor de linfocitos B

KIAA0989: Tumor cerebral MVP Tumor de retina PKD1 Cáncer renal

KIF22: Linfoblastoma MYH10 Sarcoma PMSCL1 Linfoblastoma

KIF9: Carcinoma escirro, etc. MYH9 Mieloma POLR2E Cáncer de pulmón

KLHL2: Tumor cerebral MYO9B Hepatoma PPM1B Hepatoma

KNS2 KRT13 KRT14 KRT18 KRT7KRT8 KTN1 LB1 LDHA: Tumor cerebral, etc. Cáncer pancreático Cáncer pancreático Cáncer cervicouterino Placentoma Cáncer de colon, etc. Linfoma Linfoma B, etc. Sarcoma NAF1 NAP NAP1L1 NASP NBC4 NCOR2 NDUFV3 NEDD9 NFE2L2 Linfoma Carcinoma escirro Melanoma Carcinoma escirro Carcinoma escirro Tumor cerebral Tumor cerebral Linfoma Melanoma PPP2R5C PPP4C PRC1 PRDM5 PRDX1 PRKWNK2 proteinasa 3 PSA PSMD4 Mieloma, etc. Placentoma, mieloma Cáncer renal Diversos cánceres Cáncer de vejiga urinaria Cáncer de colon Leucemia mieloide aguda Cáncer de próstata Tumor cerebral

Tabla 3

Nombre: Clase Nombre Clase Nombre Clase

de antígeno: de cáncer de antígeno de cáncer de antígeno de cáncer

PSMD9: Sarcoma SLC25A2 Carcinoma escirro TMF1 Cáncer cervicouterino, cáncer pancreático

PSME3: Cáncer de pulmón, etc. SLC25A27 Tumor cerebral TNKS2 Cáncer de mama

PTMS: Cáncer renal SLX13 Tumor cerebral TNNT1 Sarcoma

PTTG: Tumor cerebral SMTN Cáncer de colon TOP2B Diversos cánceres

QPRT: Tumor cerebral, sarcomas cerebral y renal, etc. SNN Tumor cerebral TP53BP2 Diversos cánceres

RAB5C: Cáncer de pulmón, etc. SNT-1 Cáncer de útero TPD52 Cáncer de mama

RAGE: Cáncer renal SNX6 Diversos cánceres TPI1 Hepatoma

RAN: Tumor cerebral SOX1 Tumor cerebral TPM1 Hepatoma

ras: Cáncer pancreático, cáncer de colon, hepatoma, etc. SOX2 Tumor cerebral TRAPPC1 Cáncer de útero

RASSF1: Cáncer pancreático SPN Cáncer renal, etc. TRP1,2 Melanoma

RBM10: Cáncer de pulmón, mieloma SR+89 Cáncer de pulmón TSTA3 Cáncer de pulmón

RBM6: Cáncer de pulmón SRP19 Hepatoma, etc. TTC12 Linfoma

RGS19IP1: Cáncer de pulmón, etc. SSA1 Timoma, etc. TXNRD1 Cáncer pancreático, etc.

RNF12: Cáncer renal SSA2 Cáncer de piel tirosinasa Melanoma

RNPC2: Hepatoma SSNA1 Carcinoma escirro U2AF1L1 Tumor cerebral

RPA2: Cáncer renal, etc. SSP1 Hepatoma, etc. U2AF1L2 Tumor cerebral

RPL10: Cáncer de mama SSSCA1 Cáncer de útero UBE1 Placentoma

RPL10A: Cáncer de piel SSX1 Fibroblastoma UBE2D2 Carcinoma escirro

RPL21: Cáncer de colon SSX4 Cáncer de vejiga urinaria, etc. UBQLN2 Cáncer de pulmón

RPL27A: Cáncer de colon ST13 Cáncer de colon UE3A Queratinocitoma

Cáncer de mama,

RPL3: Cáncer de colon STARD10 Cáncer de colon UN1 cáncer de pulmón, cáncer

de estómago, etc.

RPL30: Cáncer de mama STARD7 Cáncer de útero, etc. USH1C Cáncer de colon

RPL32: Cáncer renal STIP1 Cáncer de pulmón USP1 Carcinoma escirro

RPL34: Cáncer de útero STK11 Hepatoma, etc. USP10 Mieloma

RPL37A: Tumor cerebral STM Tumor cerebral USP16 Carcinoma escirro

RPS15A: Cáncer de colon STX4A Diversos cánceres USP19 Tumor cerebral

RPS18: Placentoma SUCLA2 Hepatoma, etc. USP32 Tumor cerebral

RSN: Leucemia monocítica SULT1A3 Tumor cerebral, etc. USP4 Tumor cerebral

RUVBL1: Cánceres de colon y recto SURF5 Cáncer de pulmón, cáncer de piel, etc. VCL Cáncer de útero

SART-1: Diversos cánceres SYCP1 Carcinoma escirro VEGFB Fibroblastoma

SATB1: Cáncer de pulmón TADA3L Diversos cánceres VESPR Cáncer de piel

SBDS: Cáncer de útero TAF10 Hepatoma, etc. VPS45A Tumor cerebral

Diversas

SCNN1A: Cáncer renal, etc. TAF7 Cáncer de piel WT1 leucemias,

diversos cánceres

SCP1: Carcinoma escirro TBC1D1 Tumor cerebral, etc. YARS Cáncer de pulmón, etc.

SCP2: Hepatoma TBC1D4 Tumor cerebral YWHAE Hepatoma, etc.

SCR3: Cáncer de pulmón TBC1D5 Mieloma ZFP36L2 Leucemia de linfocitos T

SDBCAG84: Cáncer de pulmón TCE1 Cáncer renal ZIC2 Tumor cerebral

SEC14L1: Cáncer de pulmón, etc. TCEB3 Cáncer de pulmón ZNF202 Carcinoma escirro

1-Sep: Cáncer de mama TCF4 Timoma ZNF232 Eritoblastoma

SFRS5: Cáncer de colon TDRD3 Placentoma ZNF282 Leucemia de linfocitos T

SGPL1: Tumor cerebral TEL-AML1 Leucemia monocítica aguda ZNF292 Placentoma

SIN3A: Tumor cerebral TGFB1 Cáncer renal β-catenina Melanoma

SK-Br-3: Cáncer de mama TIAF1 Cáncer de mama Idiotipo de anticuerpo Linfoma B

SLC22A17 Tumor cerebral TIMP3 Cáncer renal SLC25A11 Tumor cerebral TKT Hepatoma

En la presente invención, someter a pulsos una célula presentadora de antígeno con cierta sustancia significa causar que la célula presentadora de antígeno reaccione con esa sustancia, y preferiblemente significa presentar directa o indirectamente la sustancia anteriormente observada sobre la superficie de una célula presentadora de

5 antígeno. También someter a pulsos conjuntamente una célula presentadora de antígeno significa someter a pulsos la célula presentadora de antígeno con al menos dos sustancias simultánea, sucesiva o intermitentemente. La sustancia anteriormente mencionada es preferiblemente bisfosfonato y/o un antígeno de enfermedad.

Ahora, se detallarán el método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según la

10 presente invención y el método para producir una célula presentadora de antígeno activada según la presente invención con referencia al siguiente ejemplo, que usa una célula dendrítica como célula presentadora de antígeno. En la presente invención, el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno designa un proceso que incluye someter a una célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad, como se describe anteriormente.

15 En primer lugar, se explicará la preparación de las células presentadoras de antígeno (células dendríticas en este ejemplo). La preparación de las células dendríticas empieza al adquirir una muestra para obtener precursores de células dendríticas. La muestra anteriormente observada puede ser sangre periférica, médula ósea, sangre de cordón umbilical o similar. Se usa preferiblemente sangre periférica en vista del hecho de que es fácilmente

20 disponible y no supone una gran carga para el paciente. Es preferible que la cantidad de sangre a recoger se determine de modo que no suponga una carga para el donante. El método de recogida de la sangre puede ser recogida de sangre completa usando un tubo de recogida de sangre a vacío, una bolsa de recogida de sangre o similar. También, cuando se necesita una gran cantidad de células, es posible obtener células mononucleares de sangre periférica directamente empleando un método de recogida de la fracción de células mononucleares usando

25 un instrumento de aféresis. Para evitar la coagulación, pueden añadirse heparina o ácido cítrico a la sangre recogida.

A continuación, se separan las células mononucleares que contienen los precursores de células dendríticas de la sangre recogida. La separación puede llevarse a cabo mediante cualquier método de separación de células

30 nucleadas de eritrocitos. Por ejemplo, se emplea generalmente un método que utiliza el fraccionamiento de Ficoll, concretamente, el gradiente de densidad o elución de Ficoll-Paque. Es preferible lavar las células recogidas varias veces usando un medio de cultivo, una solución salina fisiológica o una solución salina tamponada con fosfato (de aquí en adelante designada como PBS) con el fin de eliminar los trombocitos.

35 Posteriormente, se separan los monocitos (células positivas de CD14), que son los precursores de las células dendríticas, de las células mononucleares recogidas. CD14 es conocido como un marcador que se expresa en monocitos, que son los precursores de las células dendríticas. Por tanto, los monocitos pueden aislarse y recogerse mediante clasificación celular magnética (Miltenyi Biotec; de aquí en adelante designada como MACS) usando perlas magnéticas con anticuerpos anti-CD14. Este método es preferible debido a su simplicidad y mayor

40 recuperación de monocito. Como alternativa, puede ser posible también emplear un método que incluya transferir las células mononucleares recogidas a un matraz de cultivo, cultivarlas a 34 a 38ºC, más preferiblemente a 37ºC, en condiciones de 2% a 10% de CO2, más preferiblemente 5% de CO2, durante al menos una hora, y usando células adherentes como precursores de las células dendríticas.

45 Después de ello, se lleva a cabo la inducción de la diferenciación de células dendríticas inmaduras o células dendríticas maduras a partir de los precursores obtenidos de las células dendríticas. Como medio de cultivo, se usa un medio AIM-V (Invitrogen Corporation). Además del medio AIM-V, es posible usar un medio comercialmente disponible que se use para cultivo celular, tal como un medio RPMI-1640 (Invitrogen Corporation), medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen Corporation; de aquí en adelante designado como DMEM), TIL (Immuno

50 Biological Laboratories Co., Ltd.), un medio de queratinocitos epidérmicos (Kohjin Bio. Co., Ltd.: de aquí en adelante designado como KBM) o medio de Iscove (Invitrogen Corporation; de aquí en adelante designado como IMEM). Adicionalmente, es posible añadir de 0,5 a 20% de suero bovino, suero fetal bovino (de aquí en adelante designado como FBS), suero humano, plasma humano o similar, según sea necesario.

55 En caso de obtención de células dendríticas inmaduras, se añade un inductor de la diferenciación al medio de cultivo para cultivar los precursores de las células dendríticas. El inductor de la diferenciación puede ser cualquier citocina. Por ejemplo, un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (de aquí en adelante designado como GM-CSF), interleucina 4 (de aquí en adelante designada como IL-4; otras interleucinas se designan también de manera similar); un factor citoblástico (de aquí en adelante designado como SCF), IL-13 o un factor de necrosis

60 tumoral α (de aquí en adelante designado como TNF-α) puede inducir eficazmente las células dendríticas inmaduras. Adicionalmente, es preferible añadir IL-I, IL-2 o IL-3 según sea necesario. Más preferiblemente, el uso de GM-CSF e IL-4 en combinación permite una inducción eficaz. El cultivo se realiza a 34 a 38ºC, preferiblemente a 36ºC en condiciones de 2 a 10% de CO2, preferiblemente 5% de CO2, y el periodo de cultivo es preferiblemente de 5

a 7 días.

En caso de obtener las células dendríticas maduras, se añade un inductor de la diferenciación adicional del día 5 a al 7 después de iniciar el cultivo, seguido de cultivo adicional. El inductor de la diferenciación puede ser cualquier 5 citocina. Por ejemplo, es preferible inducir eficazmente las células dendríticas maduras usando GM-CSF, IL-4, SCF, IL-1β, IL-6, IL-13, TNF-α o prostaglandina E2 (de aquí en adelante designada como PGE2). Adicionalmente, es preferible añadir IL-l, IL-2, o IL-3, según sea necesario. Más preferiblemente, el uso de GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1β, PGE2 y TNF-α en combinación permite una inducción eficaz. El cultivo se realiza a 34 a 38ºC, preferiblemente a 37ºC, en condiciones de 2 a 10% de CO2, preferiblemente 5% de CO2, y el tiempo de cultivo es preferiblemente de

10 24 a 48 horas.

Además, también es posible usar un método que incluya recoger citoblastos hematopoyéticos (células positivas de CD34) como precursores de las células dendríticas y añadir a los mismos GM-CSF, TNF-α y ligando flt-3 (FL), ligando c-kit (SCF) o trombopoyetina (TPO) únicamente o en combinación, obteniendo por tanto las células

15 dendríticas inmaduras o las células dendríticas maduras, o un método que incluya recoger la fracción de células dendríticas directamente de la sangre o de células mononucleares de sangre periférica separadas usando una solución de gradiente de densidad tal como Percoll.

A continuación, se someten las células presentadoras de antígeno resultantes (en este ejemplo, las células

20 dendríticas inmaduras o las células dendríticas maduras) a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad.

La concentración de bisfosfonato no está particularmente limitada, a condición de que sea la concentración a que las células se someten habitualmente a pulsos con bisfosfonato. Por ejemplo, se prefieren de 0,001 a 20 μM y se

25 prefieren adicionalmente de 0,001 a 5 μM, como se describe en el documento [The Journal of Immunology, 2001, vol. 166, 5508-5514 o en Blood, 2001, vol. 98, nº 5, 1616-1618]

La concentración del antígeno de enfermedad no está particularmente limitada, a condición de que sea la concentración a que las células dendríticas se someten habitualmente a pulsos con un antígeno de enfermedad. Por

30 ejemplo, en el caso de la proteína o péptido antigénico de enfermedad descrito anteriormente, se prefiere de 0,01 a 20 μg/ml, y se prefieren adicionalmente de 0,1 a 2 μg/ml, como se describe en los documentos [Cancer Research, 1999, vol. 59, 2167-2173, The Journal of Immunology, 1995, vol. 154, 2257–2265 o The Journal of Immunology, 1994, 153, 996-1003].

35 Adicionalmente, en el caso de someter células dendríticas a pulsos con una población celular que incluye células apoptóticas y/o células necróticas como antígeno de enfermedad, los ejemplos de método para preparar la población celular anteriormente observada pueden incluir 1) un método de cultivo de una célula de cáncer o una línea celular de cáncer de modo que se permita la formación espontánea de una población celular, 2) un método para someter una célula de cáncer o una línea celular de cáncer a irradiación UV (1 J/cm2·s durante 2 minutos) para causar la

40 formación de la población celular y 3) un método de tratamiento térmico de una célula de cáncer o línea celular de cáncer a 85ºC durante 10 minutos para causar la formación de la población celular.

Las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención (en este ejemplo, las células dendríticas activadas) preparadas (producidas) mediante el método anteriormente descrito para tratamiento de activación según 45 la presente invención pueden inducir eficazmente inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ. Por ejemplo, en el caso in vitro o in vivo, las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención pueden usarse como composición médica capaz de inducir inmunocitos que incluyen predominantemente CTL específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ. En particular, dicha composición médica se usa preferiblemente como agente de tratamiento y prevención de cáncer 50 y/o enfermedades infecciosas. En la presente invención, los inmunocitos designan células capaces de reconocer la especificidad de un antígeno y/o de estar implicadas en una reacción inmunitaria específica que incluye linfocitos T, linfocitos iNKT, linfocitos NK (linfocitos citolíticos naturales), linfocitos B, monocitos, células dendríticas y macrófagos, o una población celular que incluye una clase o dos o más clases de estas células. También, en la presente invención, incluir predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ 55 significa que la relación y/o el número de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ aumenta en comparación con antes de la estimulación. En el caso en que las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención se usen in vitro, pueden usarse como composición capaz de inducir inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno y/o linfocitos T γδ. En el caso en que las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención se usen in vivo, pueden usarse como vacuna

60 tal como una vacuna de células dendríticas capaz de inducir inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno y/o linfocitos T γδ después de eliminar bisfosofonato y antígeno de enfermedad libres por lavado. Adicionalmente, en ambos casos de uso de las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención in vitro e in vivo, pueden usarse también citocinas (por ejemplo IL-2) y otras proteínas (por ejemplo, albúmina), etc., por ejemplo, según sea necesario.

65 Realización 2: Composición médica que comprende células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención

Se describirá ahora una composición médica que usa células presentadoras de antígeno activadas de la presente 5 invención a modo de ejemplo usando células dendríticas como células presentadoras de antígeno de forma similar a anteriormente.

En primer lugar, se recogen mediante centrifugación las células presentadoras de antígeno activadas (las células dendríticas activadas) obtenidas en la realización 1 descrita anteriormente. A continuación, se lavan las células 10 recogidas. El líquido usado para el lavado puede ser cualquier líquido, a condición de que sea isotónico y pueda usarse para preparaciones farmacéuticas. Considerando la administración posterior a un paciente, es preferible usar una solución salina fisiológica, PBS o similar. Se suspenden entonces en una solución salina fisiológica las células dendríticas recogidas y se vuelven aplicables como composición médica. También es posible añadir un componente sérico tal como albúmina y citocinas, según sea necesario. En particular, dicha composición médica se usa

15 preferiblemente como agente de tratamiento y prevención para cáncer y/o enfermedades infecciosas. Por consiguiente, como realización relacionada, la presente invención incluye el uso de la célula presentadora de antígeno activada de la presente invención para producir una composición médica para un cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

20 Realización 3: Método de tratamiento y prevención que usa células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención

Se describirá ahora un método de tratamiento y prevención que usa células dendríticas de la presente invención a modo de ejemplo, que usa células dendríticas como células presentadoras de antígeno de forma similar a 25 anteriormente.

Al administrar las células presentadoras de antígeno activadas (las células dendríticas activadas) de la presente invención, obtenidas en la realización 1, o la composición médica de la presente invención, obtenida en la realización 2 descrita anteriormente, es posible tratar y prevenir un cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

30 El número de células a administrar puede seleccionarse adecuadamente según un método de administración y unas condiciones del paciente sin ninguna limitación particular. Por ejemplo, se administran preferiblemente de una vez de 106 a 108 células por persona, y al menos 107 células por persona más preferiblemente. El número de administraciones varía según el estado del paciente y puede ser de 4 a 6 veces en una tanda. El intervalo de

35 administraciones depende del número de células dendríticas a administrar y no está particularmente limitado. Se prefiere administrar las células dendríticas una vez por semana a una vez al mes. Adicionalmente, se prefiere administrar las células dendríticas cada dos semanas si el número de células es de 5 x 106, y se prefiere administrarlas una vez al mes si el número es de 2 x 107 o mayor. El método de administración no está particularmente limitado, sino que puede ser inyección intravenosa, inyección hipodérmica, inyección intracutánea,

40 inyección directa en un nódulo linfático regional, inyección directa en el sitio dañado o administración sistémica por goteo. Como alternativa, también es posible inyectar las células dendríticas en una arteria cercana al sitio dañado.

Al administrar las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención de esta manera, es posible activar y hacer proliferar no solo los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad, sino también los linfocitos T 45 γδ, en el cuerpo del paciente.

Estos CTL específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ no solo pueden destruir una célula de cáncer y una célula infectada directamente, sino que también dañan estas células indirectamente mediante citocinas tales como interferón γ (de aquí en adelante designado como IFNγ). Por lo tanto, pueden usarse eficazmente para 50 diversos tratamientos y prevenciones de cánceres y enfermedades infecciosas, por ejemplo. Sigue la ventaja de usar las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención como vacuna. Una vacuna convencional de células dendríticas sometidas a pulsos con un antígeno de enfermedad solo activa solo CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad. En contraposición, la vacuna de las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención puede activar linfocitos T γδ además de CTL CD8+ específicos de antígeno de 55 enfermedad. Además, las citocinas que se inducen a partir de estos CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ son capaces de activar un linfocito T auxiliar, un linfocito NK, un linfocito iNKT (linfocito T citolítico natural) y un linfocito B. Esto activa la inmunidad humoral y celular en el organismo entero, de modo que mejora el efecto del tratamiento y la prevención. También, las células presentadoras de antígeno usadas para el tratamiento de activación son preferiblemente células presentadoras de antígeno autólogas del paciente o células

60 presentadoras de antígeno alogénicas que comparten el mismo HLA. Esto es debido a que, cuando se administran al paciente, pueden exhibir su función sin eliminarse por la inmunidad del paciente.

Realización 4: Método para inducir inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ 65

Se describirá ahora un método para inducir inmunocitos según la presente invención. El método para inducir inmunocitos según la presente invención es un método para inducir inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ, y más específicamente, un método de inducción que incluye un proceso de (i) someter una célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con 5 bisfosfonato y antígeno de enfermedad, y un proceso de (ii) cultivar conjuntamente la célula presentadora de antígeno y un linfocito simultáneamente a o después del pulso conjunto. Aquí, inmunocito designa una célula capaz de reconocer la especificidad de un antígeno y/o de estar implicada en una reacción inmunitaria específica, incluyendo un linfocito T, un linfocito iNKT, un linfocito NK, un linfocito B, un monocito, una célula dendrítica y un macrófago, o una población celular que incluye una clase o dos o más clases de estas células, como se describe

10 anteriormente.

En primer lugar, se lleva a cabo un tratamiento de activación de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas) de forma similar a la realización 1 (el proceso (i)). Se añaden entonces simultáneamente o después del pulso conjunto las células presentadoras de antígeno y las células sensibles a un recipiente de cultivo

15 para cultivo conjunto (el proceso (ii)). De este modo, los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad en las células sensibles podrían activarse en respuesta a una estimulación específica de antígeno de enfermedad por las células presentadoras de antígeno que se han sometido al tratamiento de activación. Adicionalmente, en respuesta a la estimulación con moléculas similares a IPP (difosfato de isopentenilo) que se presentan en la superficie de las células presentadoras de antígeno mediante la inhibición de un sistema metabólico de la célula presentadora de

20 antígeno causada por el pulso de bisfosfonato, podrían activarse los linfocitos T γδ en las células sensibles. El IFNγ producido a partir de los linfocitos T γδ es capaz de ayudar a una activación y proliferación adicionales de los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad. Incidentalmente, las células sensibles aquí son, por ejemplo, linfocitos humanos y preferiblemente son monocitos derivados de sangre periférica. Estas células sensibles son preferiblemente células sensibles autólogas o células sensibles alogénicas que comparten el mismo HLA.

25 El recipiente de cultivo anteriormente mencionado no está particularmente limitado, y habitualmente puede ser una placa de cultivo, un disco de laboratorio, un matraz, una bolsa o similar usado en la materia. La concentración a que se añade cada población celular puede fijarse libremente según la situación.

30 En el caso en que las células presentadoras de antígeno sean células dendríticas, las células dendríticas y las células sensibles pueden cultivarse conjuntamente usando un medio AIM-V, por ejemplo. Además del medio AIM-V, es posible usar un medio comercialmente disponible que se use para cultivo celular, tal como un medio RPMI-1640, DMEM, TIL, KBM o IMEM. Adicionalmente, puede añadirse de 5% a 20% de suero tal como suero bovino, FBS, plasma humano o citocina o similar, según sea necesario. El cultivo se lleva a cabo, por ejemplo, a 34 a 38ºC,

35 preferiblemente a 37ºC, en condiciones de, por ejemplo, 2% a 10% de CO2, preferiblemente 5% de CO2. El periodo de cultivo no está particularmente limitado y es preferiblemente de 5 a 21 días, y adicionalmente es preferiblemente de 7 a 14 días. El número de células dendríticas y células sensibles a añadir puede fijarse según el recipiente que se use y su uso pretendido. También, la relación de mezcla entre las células dendríticas y las células sensibles puede fijarse adecuadamente según la situación, sin ninguna limitación particular. Con el fin de aumentar la relación de

40 CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ en las células sensibles, es preferible que la relación de células sensibles a células dendríticas sea de 20:1 a 2:1.

Con el método de inducción de la presente invención anteriormente descrito, es posible preparar (producir) los inmunocitos de la presente invención que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de

45 enfermedad y/o linfocitos T γδ. También, los inmunocitos así obtenidos de la presente invención pueden usarse como tal, o después de estimulaciones repetidas con las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención, como inmunocitos que incluyen CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ a una relación mayor en una terapia inmunocelular. Por consiguiente, puede esperarse un efecto potenciado del tratamiento y la prevención de cáncer y enfermedades infecciosas.

50 Sigue la ventaja de preparar los inmunocitos de la presente invención in vitro. Al estimular las células sensibles repetidamente con las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención, es posible preparar una gran cantidad de inmunocitos capaces de destruir directamente células de cáncer y células de enfermedad infecciosa de manera simplificada.

55 Realización 5: Composición médica que comprende inmunocitos de la presente invención

Se describirá ahora una composición médica que comprende inmunocitos de la presente invención.

60 En primer lugar, se recogen mediante centrifugación los inmunocitos de la presente invención que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ obtenidos en la realización 4 descrita anteriormente. A continuación, se lavan las células recogidas. El líquido usado para el lavado puede ser cualquier líquido, a condición de que sea isotónico y pueda usarse en preparaciones farmacéuticas. Considerando la administración posterior a un paciente, es preferible usar una solución salina fisiológica, PBS o similar. Se

65 suspenden entonces los inmunocitos que incluyen predominantemente CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ en una solución salina fisiológica y se vuelven aplicables como composición médica. También es posible añadir citocinas, según sea necesario. En particular, dicha composición médica se usa preferiblemente como agente de tratamiento y prevención para cáncer y/o enfermedades infecciosas. Por consiguiente, como realización relacionada, la presente invención incluye el uso de la célula presentadora de

5 antígeno activada de la presente invención para producir una composición médica para un cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

Realización 6: Método de tratamiento y prevención que usa inmunocitos de la presente invención

10 Se describirá ahora un método de tratamiento y prevención que usa inmunocitos de la presente invención.

Al administrar los inmunocitos de la presente invención obtenidos en la realización 4 o la composición médica de la presente invención obtenida en la realización 5 descritas anteriormente, es posible tratar y prevenir un cáncer y/o una enfermedad infecciosa.

15 El número de inmunocitos a administrar puede seleccionarse adecuadamente según el método de administración y las condiciones del paciente, sin ninguna limitación particular. Por ejemplo, se administran preferiblemente de una vez de 108 a 1012 inmunocitos por persona, y al menos 109 inmunocitos por persona más preferiblemente. El número de administraciones varía según las condiciones del paciente y es habitualmente de 4 a 6 veces en una tanda. El

20 intervalo de administraciones no está particularmente limitado, y se prefiere administrar los inmunocitos cada dos semanas o una vez al mes, por ejemplo. El método de administración no está particularmente limitado, sino que puede ser inyección intravenosa, inyección hipodérmica, inyección intracutánea, inyección directa en un nódulo linfático regional, inyección directa en el sitio dañado o administración sistémica por goteo. Como alternativa, también es posible inyectar los inmunocitos en una arteria cercana al sitio dañado. También, los inmunocitos de la

25 presente invención son preferiblemente inmunocitos autólogos del paciente o inmunocitos alogénicos que comparten el mismo HLA. Esto es debido a que, cuando se administran al paciente, pueden exhibir su función sin ser rechazados por la inmunidad del paciente.

Realización 7: Acelerador de la activación de células presentadoras de antígeno en el momento del pulso con 30 antígeno de enfermedad

Se describirá ahora un acelerador de la activación de las células presentadoras de antígeno en el momento del pulso con antígeno de enfermedad de la presente invención.

35 El acelerador de la activación de células presentadoras de antígeno en el momento del pulso con antígeno de enfermedad de la presente invención contiene bisfosfonato como componente eficaz. El acelerador de la activación anteriormente observado puede contener adicionalmente un vehículo y/o un portador que sean farmacéuticamente aceptables. El acelerador de la activación anteriormente observado puede añadirse en el momento del pulso de las células presentadoras de antígeno con el antígeno de enfermedad in vivo y/o in vitro, a saber, antes,

40 simultáneamente y/o después del pulso con el antígeno de enfermedad. Los demás aspectos de la presente invención incluyen el uso de un bisfosfonato para producir el acelerador de la activación de células presentadoras de antígeno en el momento del pulso con el antígeno de enfermedad. Adicionalmente, los demás modos de la presente invención incluyen un método de tratamiento y prevención de cáncer y/o enfermedad infecciosa usando bisfosfonato.

45 Lo siguiente es una descripción detallada de la presente invención a modo de ejemplos. Ni que decir tiene que la presente invención no está limitada en modo alguno a estos ejemplos.

Ejemplo 1

50 Ejemplo 1-1: Recogida y preparación de células dendríticas

Se recogieron 30 ml de sangre periférica de un donante sano (HLA-A*0201). Se obtuvieron las células mononucleares de esta sangre periférica del donante sano. En ese momento, se recogió una capa de células mononucleares usando una solución de gradiente de densidad para la separación de células sanguíneas. Para

55 eliminar las plaquetas y otros componentes, se lavaron las células recogidas varias veces con AIM-V al que se había añadido 10% de FBS, y se aislaron las células positivas de CD14 como monocitos con MACS.

A partir de los precursores de células dendríticas obtenidos, se llevó a cabo la inducción de la diferenciación de células dendríticas. Se preparó el medio añadiendo GM-CSF (IMMUNEX) 500 U/ml e IL-4 (Osteogenetics GmbH)

60 500 U/ml a AIM-V al que se habían añadido 10% de FBS o suero AB. Del día 5 al día 7 después de iniciar el cultivo, se obtuvieron células dendríticas inmaduras.

Además, del día 5 al día 7 después de iniciar el cultivo, se añadieron IL-6 100 U/ml o 10 ng/ml (R&D Systems), IL-1β (CHEMICON) 10 ng/ml, TNF-α (PHARMINGEN) 10 ng/ml y PGE2 (SIGMA) 1 μg/ml, seguido de cultivo adicional,

65 obteniendo así células dendríticas maduras después de 24 a 48 horas.

Ejemplo 1-2: Confirmación del estado de las células dendríticas

Se detectó un antígeno de superficie de las células dendríticas preparadas usando un citómetro de flujo (EPICS XL-MCL; Beckman Coulter).

5 Se añadió un anticuerpo diana a una suspensión de células a medir en PBS, tiñendo por tanto las células en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. El anticuerpo era un anticuerpo anti-CD14, un anticuerpo anti-CD83 o un anticuerpo anti-HLA-DR que se marcó con PE (Beckman Coulter). Como control negativo, se usó un isotipo de cada uno de los anticuerpos. Después de lavar con PBS las células teñidas, se midieron con EPICS XL·MCL.

Los resultados mostraron que las células cultivadas con GM-CSF e IL-4 eran negativas de CD14, negativas de CD83 y positivas de HLA-DR. Por tanto, se confirmó que era una población de células dendríticas inmaduras. También las células cultivadas con GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1β, TNF-α y PGE2 eran positivas, excepto de CD14. Por tanto, se confirmó que era una población de células dendríticas maduras.

15 Ejemplo 1-3: Preparación de células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y péptidos antigénicos de enfermedad y preparación de células sensibles

Se añadió ZOMETA™ (Novartis), que era un agente aminobisfosfonato, a una suspensión de las células dendríticas inmaduras o las células dendríticas maduras derivadas de sangre periférica preparadas como se describe anteriormente, en forma de ácido zoledrónico como para conseguir 0,01 μM y/o se añadieron los péptidos antigénicos A27L de MART-1 (ELAGIGILTV) (de aquí en adelante designados como A27L) como péptidos antigénicos de enfermedad como para conseguir una concentración final de 2 μg/ml, seguido de cultivo a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante aproximadamente 12 horas. Como control negativo, se usaron células

25 dendríticas que se cultivaron sin adición de ZOMETA™ ni péptidos antigénicos.

Después de aproximadamente 12 horas de cultivo, se recogieron parte de las células dendríticas activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y los péptidos antigénicos, se dispusieron en un tubo de 15 ml (BD Falcon) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Se suspendieron las células dendríticas resultantes en forma de aglomerados en 10 ml de medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, seguido de lavado. Se repitió dos veces la operación de lavado. Las células dendríticas recogidas de esta manera se usaron como células estimulantes. En otras palabras, se usaron como células estimulantes células dendríticas activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y los péptidos antigénicos de enfermedad, células dendríticas que sometieron a pulsos con cualquiera de ellos y células dendríticas que no se

35 sometieron a pulsos con ninguno de ellos. Las células preparadas suspendiendo aquellas que permanecen después del aislamiento de las células positivas de CD14 (una población de células negativas de CD14 que era principalmente una población de linfocitos T) para preparar las células dendríticas en medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y conservándolas congeladas, se descongelaron, se lavaron y se usaron como células sensibles.

Ejemplo 1-4: Caracterización de inmunocitos inducidos por células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y péptidos antigénicos de enfermedad

Se cultivaron 2 x 105 de cada una de las células estimulantes (células dendríticas) obtenidas como se describe

45 anteriormente con 2 x 106 células sensibles de tal modo que la cantidad total fuera de 1 ml en placa de 24 pocillos (SUMILON) (células sensibles:células dendríticas= 10:1). Se llevó a cabo el cultivo aproximadamente a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 7 días. Cuando se añadió IL-2 20 U/ml a esta solución cultivada conjuntamente, las células proliferaron más favorablemente. En el caso en que las células proliferaron rápidamente, se añadieron 1 ml de medio AIM-V suplementado con IL-2 40 U/ml y 10% de FBS del día 4 al día 6. Entonces, 7 días después del inicio del cultivo conjunto de las células dendríticas y las células sensibles, se midió la relación de los CTL CD8+ específicos de A27L (los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad) en todas las células con un citómetro de flujo, usando un anticuerpo marcado y un tetrámero específico de antígeno.

El procedimiento de cálculo de la relación de células positivas de tetrámero HLA-A*0201 A27L y positivas de CD8 es

55 como sigue: en primer lugar, se añadió tetrámero A27L, que se marcó con PE (MBL), a células que se habían lavado con PBS después del cultivo. Después de teñir en estado protegido a temperatura ambiente durante 15 minutos, se añadió un anticuerpo anti-CD8 marcado con FITC (BD Pharmingen), seguido de tinción en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. Como control, se usó un isotipo de cada uno de los anticuerpos. Se midieron las células usando EPICS XL·MCL, y se analizaron los resultados de medida usando EPICS 32.

Los resultados se muestran en la tabla 4a siguiente. Como se muestra en esta tabla, se confirmó que las células dendríticas activadas que se sometían a pulsos conjuntamente con ZOMETA™0,01 μM y A27L 2 μg/ml inducían CTL CD8+ específicos de antígeno. Adicionalmente, se confirmó que la relación de CTL CD8+ específicos de antígeno en el caso de uso de estas células dendríticas activadas era aproximadamente 4 veces más alta que la de

65 los CTL inducidos en células dendríticas que se sometieron a pulsos solo con péptidos.

Además, la tabla 4b y la FIG. 1 muestran los resultados de una prueba t cuando se realizó un experimento similar con un número mayor de sujetos. Resultó evidente que la relación de CTL CD8+ obtenidos usando las células dendríticas que se sometieron a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™ era mayor que la de los CTL CD8+ obtenidos usando células dendríticas que se sometieron a pulsos con A27L solo, existiendo una diferencia

5 significativa entre ellos.

Tabla 4

(Tabla 4a) Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad inducidos cultivando células 10 dendríticas inmaduras activadas sometidas a pulsos usando ZOMETA™ y/o A27L y linfocitos

Muestra usada para someter a pulsos células dendríticas

A27L: ZOMETA™ A27L + ZOMETA™

0,09: 0,00 0,39

(Tabla 4b) Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad inducidos cultivando células dendríticas inmaduras activadas sometidas a pulsos usando ZOMETA™ y/o A27L y linfocitos

Muestra usada para someter a pulsos células dendríticas

Donante: A27L A27L + ZOMETA™ Factor de escala

01: 0,05 0,38 7,60

02: 0,09 0,61 6,78

03: 0,07 0,40 5,71

04: 1,02 2,66 2,61

05: 0,22 0,94 4,27

06: 0,15 1,64 10,93

07: 1,15 2,25 1,96

08: 0,21 0,43 2,05

Ejemplo 2-1: Caracterización de inmunocitos inducidos cultivando conjuntamente células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente en presencia de ZOMETA™ y A27L y células sensibles

15 Ejemplo 2

20 Se añadieron 1 x 105 de cada una de las células dendríticas inmaduras o de las células dendríticas maduras derivadas de sangre periférica preparada en el ejemplo 1 a una placa de 24 pocillos (SUMILON) de tal modo que la cantidad total fuera de 1 ml. Adicionalmente, se añadió ZOMETA™, que era un agente aminobisfosfonato, como para conseguir una concentración final de 0,01 μM y/o se añadió A27L como para conseguir una concentración final de 2 μg/ml, seguido de cultivo a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante aproximadamente 24 horas. Como

25 control negativo, se usaron células dendríticas que se cultivaron sin añadir ZOMETA™ ni péptidos antigénicos. Se añadieron entonces, después de cultivar durante 12 horas usando estas células dendríticas sometidas a pulsos como células estimulantes, 2 x 106 células sensibles, seguidas de cultivo conjunto (células sensibles: células estimulantes = 20:1). Se realizó el cultivo aproximadamente a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 7 días o 14 días. Dependiendo de la proliferación celular, se añadieron 1 a 100 U/ml de IL-2 a la solución cultivada

30 conjuntamente.

Usando el número total de células que proliferaban respectivamente 7 y 14 días después del inicio del cultivo conjunto, un anticuerpo marcado y un tetrámero específico de antígeno, se midió la relación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno y linfocitos T γδ en todas las células mencionadas anteriormente con un citómetro de flujo. 35 Se añadió tetrámero A27L marcado con PE (MBL) a las células, que se habían lavado con PBS después de terminar el cultivo conjunto, y se tiñeron en estado protegido a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de ello, se añadió un anticuerpo anti-CD8 marcado con FITC (BD Pharmingen), seguido de tinción en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. Se determinó la relación de linfocitos T γδ usando un anticuerpo V γ9 anti-TCR marcado con FITC, un anticuerpo pan α/β anti-TCR marcado con PE y un anticuerpo anti-CD3 marcado con PC5 (todos de

40 Beckman Coulter). Se añadieron estos anticuerpos a las células que se habían cultivado y se lavaron entonces con PBS, seguido de tinción en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. Como control negativo, se usó un isotipo de cada uno de los anticuerpos. Se midieron las células usando EPICS XL·MCL y se analizaron los resultados de medida usando EPICS 32.

45 Se muestran los resultados en las tablas 5 y 6 siguientes. Como se muestra en la tabla 5, se observó que la inducción de los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad, cuando se cultivaban conjuntamente las células dendríticas y los linfocitos en presencia de ZOMETA™ 0,01 μM y A27L 2 μg/ml, aumentaba en comparación con el caso de cultivo conjunto de células dendríticas y linfocitos en presencia de A27L solo. Estos resultados sugieren un efecto coadyuvante de ZOMETA™ para la inducción de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad. Se

5 confirmó también que este efecto coadyuvante era mayor en las células dendríticas inmaduras.

Adicionalmente, como se muestra en la tabla 6 más adelante, se confirmó que aumentaba también la inducción de los linfocitos T γδ mediante cultivo conjunto de las células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente en presencia de ZOMETA™ 0,01 μM y A27L y los linfocitos.

10 Tabla 5

(Tabla 5) a) Relación (%) de CTL específicos de antígeno de enfermedad inducidos por el cultivo conjunto de células dendríticas sometidas a pulsos usando ZOMETA™ y A27L y linfocitos a todos los linfocitos y b) número de estas

15 células

a)

Estado de las células dendríticas: Periodo de cultivo Muestra usada para someter a pulsos células dendríticas

Péptido antigénico: ZOMETA™ Péptido antigénico + ZOMETA™

Control: 0 días 0,03

Células dendríticas inmaduras: 7 días 0,15 0,08 1,64

14 días: 0,05 0,26 5,08

Células dendríticas maduras: 7 días 0,97 0,32 2,03

14 días: 2,48 0,39 1,69

b)

Péptido antigénico: ZOMETA™ Péptido antigénico + ZOMETA™

Control: 0 días 6,0 x 102

Células dendríticas inmaduras: 7 días 4,1 x 103 4,6 x 103 3,9 x 103

14 días: 2,0 x 103 2,6 x 103 1,8 x 105

Células dendríticas maduras: 7 días 3,0 x 104 1,4 x 104 5,2 x 104

14 días: 1,1x 105 3,5 x 104 7,4 x 104

20 Se calculó el número de células multiplicando el número total de células por la relación.

Tabla 6

25 (Tabla 6) Relación (%) de linfocitos T γδ inducidos cultivando conjuntamente células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente usando ZOMETA™ y péptido antigénico y linfocitos y número de estas células

Estado de células dendríticas: Periodo de cultivo Muestra usada para someter a pulsos conjuntamente células dendríticas

A27L + ZOMETA™

Relación de linfocitos T γδ: Número de linfocitos T γδ

Antes de iniciar el cultivo conjunto: 0 días 13,0 2,6 x 105

Células dendríticas inmaduras: 7 días 25,7 6,1 x 105

14 días: 26,9 9,7 x 105

Células dendríticas maduras: 7 días 27,0 7,0 x 105

Se calculó el número de células multiplicando el número total de células por la relación.

Ejemplo 2-2: Análisis de la capacidad de producción de IFNγ de inmunocitos inducida por el cultivo conjunto de 5 células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente en presencia de ZOMETA™ y A27 y células sensibles

Posteriormente, se analizó como sigue la capacidad de producción de IFNγ de inmunocitos que se indujeron por el cultivo conjunto anteriormente descrito.

10 Se añadió etanol al 70% a cada pocillo de una placa MultiScreen (MILLIPORE) y se retiró al cabo de 2 minutos. Se lavó cada pocillo de la placa anteriormente observada 5 veces con 200 μl de PBS. Se diluyó con PBS un anticuerpo de recubrimiento anti-IFNγ (clon: 1-D1K, kit MABTECH ELISpot para interferón γ humano) como para conseguir 15 μl/ml y se añadiron 100 μl del mismo por pocillo a la placa anteriormente observada. Se dejó esta placa durante una noche a 4ºC. Se lavó esta placa 4 veces con 200 μl de PBS/pocillo. Se añadieron entonces 200 μl de un medio AIM

15 V suplementado con 10% de FBS a cada pocillo, seguido de bloqueo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Se retiró el medio de bloqueo y se lavó la placa 4 veces con 200 μl de PBS/pocillo. Se recogió una población celular cultivada conjuntamente en cada condición, obtenida mediante un método similar al cultivo conjunto anteriormente descrito, mediante centrifugación y lavado dos veces con AIM-V.

20 Para la reestimulación, se añadieron 500 células dendríticas inmaduras y A27L obtenido en el ejemplo 1 a 2500 células cultivadas conjuntamente que se recogieron después del precultivo a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 2 horas. El número de células indica el número por pocillo de una placa de ensayo. Al mismo tiempo, se llevaron a cabo también el precultivo usando células cultivadas conjuntamente solas y el precultivo usando células dendríticas y A27 solo. Se ajustó el volumen de cultivo a 100 μl por pocillo. Para cada condición de cultivo, se actuó

25 en 300 μl de cultivo, que corresponden a 3 pocillos. Se añadieron 100 μl por pocillo de las células precultivadas en cada condición a 3 pocillos de la placa que se había lavado con PBS después del bloqueo, y se cultivaron durante una noche a 37ºC en condiciones de 5% de CO2. Se retiraron las células cultivadas de los pocillos y se lavaron 5 veces con 200 μl de PBS/pocillo. Se diluyó un anticuerpo anti-IFNγ marcado con biotina (clon: 7-B6-1, kit MABTECH ELISPot™ para interferón γ humano) con PBS suplementado con 0,5% de FBS como para conseguir 1 μg/ml y se

30 añadieron 100 μl del mismo por pocillo. Se dejó la placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavó esta placa 5 veces con 200 μl de PBS/pocillo. Se diluyó estreptavidina a la que se había unido fosfatasa alcalina (kit MABTECH ELISPot™ para interferón γ humano) con PBS suplementado con 0,5% de FBS a 1:1000, y se añadieron 100 μl de la misma por pocillo. Se dejó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó esta placa 5 veces con 200 μl de PBS/pocillo. Se añadieron entonces 100 μl de solución de sustrato BCIP/NBTplus (Wako) por pocillo, que se dejó en

35 un lugar oscuro hasta que se hicieron visibles los puntos. Cuando se hicieron visibles los puntos a simple vista, se lavó suficientemente la placa con agua destilada. Después de comprobar que la membrana de la placa está seca, se midió el número de puntos usando un lector ELISPot™ (AID Autoimmun Diagnostika GmbH), y se analizaron los datos con el software AID versión 3.1 (AID).

40 Se muestran los resultados en la tabla 7 siguiente. Como se muestra en esta tabla, el número de puntos, que indicaban células productoras de IFN-γ, aumentaba mucho en el caso de la población celular cultivada conjuntamente de células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ 0,01 μM y A27L 2 μg/ml y los linfocitos se reestimulaban usando las células dendríticas sometidas a pulsos con A27L. Este resultado mostraba correlación con la relación (%) de células positivas de tetrámero A27L mostradas en el ejemplo 1 (véase la tabla 4).

45 Tabla 7

(Tabla 7) Número de células productoras de IFN-γ obtenidas cultivando conjuntamente células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y péptido antigénico y linfocitos en 2500 linfocitos

Linfocitos solos: Linfocitos + células dendríticas sometidos a pulsos conjuntamente con péptidos

Sin ZOMETA™: Con ZOMETA™ Sin ZOMETA™ Con ZOMETA™

Donante A: 1 4 55 100

Donante B: 2 0 3 50

50: Ejemplo 3

55: Caracterización de inmunocitos inducidos cultivando conjuntamente células dendríticas en presencia de ZOMETA™ y células apoptóticas derivadas de una línea celular de cáncer y células sensibles

A partir de un donante sano, se recogieron 200 ml de sangre periférica. Se obtuvieron las células mononucleares de esta sangre periférica del donante sano. En ese momento, se recogió una capa de células mononucleares usando una solución en gradiente de densidad para la separación de las células sanguíneas. Después de varios lavados para retirar las plaquetas, etc. de las células recogidas, se aislaron las células positivas de CD4 en forma de

5 monocitos con MACS. A partir de los precursores de células dendríticas obtenidos, se llevó a cabo la inducción de la diferenciación de células dendríticas. Se preparó el medio añadiendo GM/CSF (IMMUNEX) 500 U/ml e IL-4 (Osteogenetics GmbH) 500 U/ml a AIM-V suplementado con 10% FBS. Del día 5 al 7 después del inicio del cultivo, se obtuvieron células dendríticas inmaduras.

10 Se recogió una línea celular derivada de cáncer de melanoma positivo de MART-1, se dispuso en un tubo de 15 ml (BD Falcon) y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. Se suspendió la línea celular resultante en forma de aglomerados en 10 ml de medio AIM-V y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos, seguido de lavado. Se repitió dos veces la operación de lavado. Se suspendió de nuevo la línea celular recogida de esta manera en AIM-V como para conseguir 1 x 106 células/ml. Se añadieron entonces 10 μl de camptotecina (Sigma) a la suspensión celular y

15 se cultivaron a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 24 horas. Se recogieron las células cultivadas, se dispusieron en un tubo de 15 ml y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Se suspendió la línea celular resultante en forma de aglomerados en 10 ml de medio AIM-V y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos, seguido de lavado. Se repitió dos veces la operación de lavado. Se usaron las células obtenidas mediante centrifugación y lavado como células apoptóticas.

20 Se añadió ZOMETA™, que era un agente aminobisfosfonato, a la suspensión de células dendríticas inmaduras como para conseguir 0,01 μM y/o se añadió a la misma una línea celular de cáncer que contenía como células apoptóticas las células dendríticas, seguido de cultivo conjunto durante aproximadamente 24 horas. Como control, se usaron las células dendríticas que se cultivaron con las células apoptóticas solas durante aproximadamente 24

25 horas y las células dendríticas que se cultivaron sin añadir ZOMETA™ ni las células apoptóticas. Adicionalmente, se añadieron IL-6 100 U/ml, IL-1β 10 ng/ml, TNF-α 10 ng/ml y PGE2 1 μg/ml a las células dendríticas inmaduras que se habían cultivado durante aproximadamente 24 horas, y se cultivaron adicionalmente como para obtener células dendríticas maduras 48 horas después.

30 Se usaron las células dendríticas maduras aquí obtenidas como células estimulantes. Se cultivaron 1 x 105 de cada una de estas células estimulantes con 2 x 106 células sensibles de tal modo que la cantidad total fuera de 1 ml en una placa de 24 pocillos (SUMILON) (células sensibles: células estimulantes= 20:1). Las células preparadas suspendiendo aquellas que permanecen después del aislamiento de las células positivas de CD14 (una población celular negativa de CD14 que era principalmente una población de linfocitos T) para preparar las células dendríticas

35 en un medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y conservándolas congeladas, se descongelaron, se lavaron y se usaron como células sensibles. Se llevó a cabo el cultivo aproximadamente a 37ºC en condiciones de 5% de CO2. Se añadieron IL-2 20 U/ml a esta solución cultivada conjuntamente. En el caso en que las células proliferaran rápidamente, se añadió 1 ml de medio AIM-V suplementado con IL-2 40 U/ml y 10% de FBS del día 4 al día 6.

40 Usando el número de todos los linfocitos que proliferaron los días 7, 11 y 14 después del inicio del cultivo conjunto, un anticuerpo marcado y un tetrámero específico de antígeno, se midió la relación de CTL CD8+ específicos de antígeno a todos los linfocitos con un citómetro de flujo. Más específicamente, se añadió tetrámero A27L (MBL), que se marcó con PE, a las células que se habían lavado con PBS después de cultivar, seguido de tinción en estado

45 protegido a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de ello, se marcó un anticuerpo anti-CD8 que se había marcado con FITC (BD Pharmingen), seguido de tinción en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. Como control negativo, se usó un isotipo de cada uno de los anticuerpos. S midieron las células usando EPICS 32.

Se muestran los resultados en la tabla 8 siguiente. Como se muestra en esta tabla, en caso de pulso con la línea

50 celular que contiene células apoptóticas, se determinó un 0,01% de las células positivas de tetrámero el día 11 de cultivo. Adicionalmente, se confirmó que eran un 0,14%, a saber, un aumento de aproximadamente 15 veces, por la adición de ZOMETA™.

Tabla 8

55 (Tabla 8) Relación de CTL CD8+ específicos de antígeno A27L inducidos por células dendríticas activadas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y células apoptóticas Se calculó el número de células multiplicando el número total de células por la relación.

Células dendríticas: CTL CD8+ específicos de A27L

Relación de CTL CD8+ (%): Número de CTL CD8+

Células dendríticas solas: 0,00 0

Células apoptóticas + células dendríticas: 0,01 0,6 x 103

Células apoptóticas + ZOMETA™ + células dendríticas: 0,14 2,7 x 103

Ejemplo 4

5 Análisis de la citotoxicidad de linfocitos cultivados con células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y péptidos antigénicos de enfermedad contra una línea celular de melanoma

Se añadieron 1 x 105 células dendríticas inmaduras derivadas de sangre periférica preparada en el ejemplo 1 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Como péptido antigénico de enfermedad, se añadieron péptidos antigénicos

10 A27L de MART-1 (ELAGIGILTV) a cada pocillo, como para conseguir una concentración final de 2 μg/ml. Al mismo tiempo, se prepararon células a las que se añadió ZOMETA™, que era un agente aminobisfosfonato, en forma de ácido zoledrónico como para conseguir 0,01 μM y células a las que no se añadió ZOMETA™. En cada pocillo, se añadieron 1 x 106 linfocitos derivados del mismo donante y se cultivaron con las células dendríticas a 37ºC en condiciones de 5% de CO2.

15 Se recogieron los linfocitos del día 13 al 17 después del inicio del cultivo conjunto. Se marcó la línea celular JCOCB de melanoma humano positiva de HLA-A*0201 y positiva de MART1 con PKH-26 (Sigma) y se usó como células diana. Se usaron los linfocitos recogidos como células efectoras. Se mezclaron con las células diana de modo que células efectoras: células diana= 5:1 o 20:1, y se añadieron a una placa de 24 pocillos. Se realizó el cultivo durante 4

20 horas a 37ºC en condiciones de 5% de CO2.

Se recogieron las células después del cultivo conjunto y se lavaron con PBS que se había enfriado con hielo. Después de centrifugar, se suspendieron las células en tampón de unión de anexina V (BD PharMingen) y se añadieron al mismo anexina V y 7AAD (ambos de Beckman Coulter). Después reacción en hielo durante 15 minutos,

25 se añadió tampón de unión de anexina V a una cantidad de 400 a 500 μl cada vez, y se midió la relación (% de citotoxicidad) de células apoptóticas (células positivas de anexina V) por citometría de flujo (Beckman Coulter).

La tabla 9 siguiente muestra el resultado de medir la relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno A27L inducidos por células dendríticas activadas sometidas a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™, la intensidad 30 media de fluorescencia (IMF) a la que se detectan las células positivas de tetrámero y la relación (%) de células apoptóticas con referencia a los dos donantes. Como se muestra en esta tabla, tanto en el donante 1 como en el donante 2, los linfocitos estimulados usando las células dendríticas activadas sometidas a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™ mostraron una relación mayor de células positivas de tetrámero que los estimulados con las células dendríticas sometidas a pulsos con A27L solo. También la intensidad media de fluorescencia a la que se 35 detectan las células positivas de tetrámero era mayor en el caso de pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™. Adicionalmente, cuando se llevó a cabo el cultivo conjunto usando los linfocitos de 13 a 17 días después del inicio del cultivo como células efectoras (E) y la línea celular de melanoma humano positiva de MART1 y positiva de HLAA*0201 como células diana (T), los linfocitos estimulados usando las células dendríticas activadas sometidas a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™ mostraron una mayor citotoxicidad por las células diana que los

40 estimulados usando las células dendríticas sometidas a pulsos con A27L solo tanto en los casos en que las células efectoras: células diana= 5:1 como 20:1.

Tabla 9

45 (Tabla 9) Características de los CTL CD8+ específicos de antígeno A27L inducidos por células dendríticas activadas preparando sometiendo los linfocitos de dos donantes a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™

Donante 1

Linfocitos solos: Linfocitos + células dendríticas sometidos a pulsos con A27L Linfocitos + células dendríticas sometidos a pulsos conjuntamente con A27L y ZOMETA™

Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno A27L: 0,00 0,27 0,27

MFI: Ninguno 21,2 36,9

Relación (%) de células apoptóticas: E/T= 5 5,9 9,3 10,2

E/T= 20: 7,4 13,7 19,9

50 Donante 2

Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno A27L: 0,01 0,99 1,15

MFI: Ninguno 36,3 41,0

Relación (%) de células apoptóticas: E/T= 5 15,9 28,5 37,4

E/T= 20: 50,0 58,5 69,5

Ejemplo 5

Caracterización de inmunocitos inducidos por células dendríticas sometidas a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ 5 y péptidos antigénicos de enfermedad

Se añadió ZOMETA™ (Novartis), que era un agente aminobisfosfonato, en forma de ácido zoledrónico a una suspensión de las células dendríticas inmaduras o las células dendríticas maduras derivadas de sangre periférica preparadas en el ejemplo 1 como para conseguir de 0 a 20 μM y, al mismo tiempo, se añadieron los péptidos

10 antigénicos de EBV BMLF1 (GLCTLVAML) (de aquí en adelante designado como BMLF1) como péptidos antigénicos de enfermedad como para conseguir una concentración final de 2 μg/ml, seguido de cultivo a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante aproximadamente 12 horas, efectuando por tanto un tratamiento de activación. Como control negativo, se usaron células dendríticas que se cultivaron sin añadir ZOMETA™ ni péptidos antigénicos.

15 Después de 12 horas de cultivo, se recogieron parte de las células dendríticas activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y los péptidos antigénicos, se dispusieron en un tubo de 15 ml (BD Falcon) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Se suspendieron las células dendríticas resultantes en forma de aglomerados en 10 ml de medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5

20 minutos, seguido de lavado. Se repitió dos veces la operación de lavado. Se usaron las células dendríticas recogidas de esta manera como células estimulantes. En otras palabras, se usaron como células estimulantes las células dendríticas activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y los péptidos antigénicos de enfermedad, las células dendríticas que se sometieron a pulsos con cualquiera de ellos y las células dendríticas que no se sometieron a pulsos con ninguno de ellos. Las células preparadas suspendiendo aquellas que permanecen

25 después del aislamiento de las células positivas de CD14 (una población de células negativas de CD14, que era principalmente una población de linfocitos T) para preparar las células dendríticas en un medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y conservándolas congeladas, se descongelaron, lavaron y usaron como células sensibles. Se cultivaron 1 x 105 de cada una de las células estimulantes obtenidas (células dendríticas) con 1 x 106 células sensibles de tal modo que la cantidad total fuera de 1 ml en una placa de 48 pocillos

30 (CORNING) (células sensibles: células dendríticas= 10:1). Se llevó a cabo el cultivo conjunto aproximadamente a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 7 días. Cuando se añadió IL-2 20 U/ml a esta solución cultivada conjuntamente, las células proliferaron más favorablemente. En el caso en que las células proliferaron rápidamente, se añadió 1 ml de medio AIM-V suplementado con IL-2 40 U/ml y 10% de FBS del día 4 al día 6. 7 días después del inicio del cultivo conjunto de las células dendríticas y las células sensibles, se midió entonces la relación de CTL

35 CD8+ específicos de BMLF1 (los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad) en todas las células con un citómetro de flujo, usando un anticuerpo marcado y un tetrámero específico de antígeno.

El procedimiento de cálculo de la relación de células positivas de tetrámero HLA-A*0201 BMLF1 y positivas de CD8 es como sigue: en primer lugar, se añadió tetrámero BMLF1 (MBL), que se marcó con PE, a las células que se

40 habían lavado con PBS después del cultivo. Después de teñir en estado protegido a temperatura ambiente durante 15 minutos, se añadió un anticuerpo anti-CD8 que se marcó con FITC (BD Pharmingen), seguido de tinción en estado protegido a 4ºC durante 15 minutos. Como control, se usó un isotipo de cada uno de los anticuerpos. Se midieron las células usando EPICS XL·MCL, y se analizaron los resultados de medida usando EPICS 32.

45 Los resultados se muestran en la tabla 10 siguiente. Como se muestra en esta tabla, se confirmó que las células dendríticas activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ 0 a 20 μM y BMLF1 indujeron CTL CD8+ específicos de antígeno. Adicionalmente, se confirmó que la relación de CTL CD8+ específicos de antígeno era aproximadamente 3,2 veces la de los CTL inducidos por células dendríticas que se sometieron a pulsos solo con péptidos.

50 Tabla 10

(Tabla 10) Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad inducidos cultivando células

dendríticas inmaduras activadas sometidas a pulsos conjuntamente con BMLF1 y ZOMETA™ y linfocitos

ZOMETA™ (μM): 0 μM 0,01 μM 0,1 μM 1 μM 5 μM 20 μM

Relación de CTL (%): 0,33 0,54 0,56 0,58 0,75 0,72

Número total de células: 2,03 x 106 2,01 x 106 2,17 x 106 1,96 x 106 2,84 x 106 2,94 x 106

Número de CTL: 6715 10845 12130 11389 21266 21133

Ejemplo 6

5 Ejemplo 6-1: Producción de una línea celular presentadora de antígeno artificial

Se transfectó un gen CD80 humano, que era una molécula coestimulante, mediante un método de lipofección en una línea celular derivada de cáncer de mama MDA-MB-231 (antígeno HLA-A*0201 de clase I) que expresa moléculas MHC de clase I, estableciendo así la línea celular MDA-MB/CD80 que expresa estable y constantemente

10 CD80 humano en células MDA-MB-231. Como se da a conocer en la publicación de EE.UU. US-2005-0048646-A1, las células en esta línea celular MDA-MB/CD80 funcionan como células presentadoras de antígeno y son capaces de inducir CTL.

Ejemplo 6-2: Caracterización de inmunocitos inducidos por células presentadoras de antígeno artificiales sometidas 15 a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y péptidos antigénicos de enfermedad

Se añadió ZOMETA™ (Novartis), que era un agente aminobisfosfonato, en forma de ácido zoledrónico a una suspensión de las células presentadoras de antígeno artificiales MDA-MB/CD80 preparadas como se describe anteriormente como para conseguir 0,01 o 1 μM y, al mismo tiempo, se añadieron los péptidos antigénicos A27L de

20 MART-1 (ELAGIGILTV) como péptidos antigénicos de enfermedad como para conseguir una concentración final de 2 μg/ml, seguido de cultivo a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante aproximadamente 12 horas. Como control negativo, se usaron células MDA-MB/CD80 que se cultivaron sin añadir ZOMETA™ ni péptidos antigénicos.

Después de aproximadamente 12 horas de cultivo, se recogieron parte de las células MDA-MB/CD80 activadas que

25 se sometieron a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ y los péptidos antigénicos, se dispusieron en un tubo de 15 ml (BD Falcon) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Se suspendieron las células MDA-MB/CD80 resultantes en forma de aglomerados en 10 ml de medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, seguido de lavado. Se repitió dos veces la operación de lavado. Se usaron las células MDA-MB/CD80 recogidas de esta manera como células estimulantes. En otras palabras, se usaron como células

30 estimulantes las células MDA-MB/CD80 activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y los péptidos antigénicos de enfermedad, las células MDA-MB/CD80 que se sometieron a pulsos conjuntamente con cualquiera de ellos y las células MDA-MB/CD80 que no se sometieron a pulsos con ninguno de ellos. Como se describe anteriormente, las células preparadas suspendiendo aquellas que permanecen después del aislamiento de las células positivas de CD14 (una población celular negativa de CD14, que era principalmente una población de

35 linfocitos T, HLA-A*0201) para preparar las células dendríticas en medio AIM-V suplementado con 10% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y conservándolas congeladas, se descongelaron, lavaron y usaron como células sensibles.

Se cultivaron 2 x 105 de cada una de las células estimulantes (células MDA-MB/CD80) obtenidas como se describe

40 anteriormente con 2 x 106 células sensibles de tal modo que la cantidad total fuera de 1 ml en una placa de 24 pocillos (SUMILON) (células sensibles: células estimulantes= 10:1). Se llevó a cabo el cultivo conjunto aproximadamente a 37ºC en condiciones de 5% de CO2 durante 7 días. Cuando se añadió IL-2 20 U/ml a esta solución cultivada conjuntamente, las células proliferaron más favorablemente. En el caso en que las células proliferaron rápidamente, se añadió 1 ml de medio AIM-V suplementado con IL-2 40 U/ml y 10% de FBS del día 4 al

45 día 6. 7 días después del inicio del cultivo conjunto de las células MDA-MB/CD80 y las células sensibles, se midió entonces la relación de CTL CD8+ específicos de A27L (los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad) en todas las células con un citómetro de flujo, usando un anticuerpo marcado y un tetrámero específico de antígeno como se describe anteriormente.

50 Se muestran los resultados en la tabla 11 siguiente. Como se muestra en esta tabla, se confirmó que las células MDA-MB/CD80 activadas que se sometieron a pulsos conjuntamente con ZOMETA™ 0,01 μM o 1 μM y A27L 2 μg/ml indujeron CTL CD8+ específicos de antígeno. Adicionalmente, se confirmó que la relación de CTL CD8+ específicos de antígeno en el caso de uso de estas células MDA-MB/CD80 activadas, era aproximadamente 6 veces la de los CTL inducidos por células MDA-MB/CD80 que se sometieron a pulsos con péptidos solos.

55 Tabla 11

(Tabla 11) Relación (%) de CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad inducidos cultivando células MDAMB/CD80 activadas

Muestra usada para células MDA-MB/CD80 sometidas a pulsos conjuntamente

A27L: A27L + ZOMETA™ 0,01 μM A27L + ZOMETA™ 1 μM

0,12: 0,75 0,98

Aplicabilidad industrial

Como se describe anteriormente, las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención son

5 capaces de inducir los CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad muy eficazmente en comparación con las células dendríticas convencionales que se someten a pulsos solo con péptidos, y de inducir adicionalmente linfocitos T γδ. Por consiguiente, al administrar las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención a un paciente como composición para administración, se inducen in vivo CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ, de modo que puede esperarse el efecto de tratamiento y prevención de cáncer y

10 enfermedades infecciosas. Además, las células presentadoras de antígeno activadas de la presente invención pueden utilizarse in vitro como composición para inducir CTL CD8+ específicos de antígeno de enfermedad y/o linfocitos T γδ.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno, comprendiendo el método:

someter la célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con un bisfosfonato y un antígeno de 5 enfermedad.
2. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 1, en el que la célula presentadora de antígeno es al menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial.
3. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 1 o 2, en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (I), una sal del mismo o su hidrato:

Fórmula 1

en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo

20 sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2 forman parte de la misma estructura cíclica, y

un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, 25 un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico.
4. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el bisfosfonato es al menos uno seleccionado del grupo consistente en un ácido zoledrónico, un ácido pamidrónico, un ácido alendrónico, un ácido risedrónico, un ácido ibandrónico, un ácido

30 incadrónico, un ácido etidrónico, una sal de los mismos o su hidrato.
5. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración del bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 20 μM.

35 6. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 5, en el que la concentración de bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 5 μM.
7. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el antígeno de enfermedad es al menos uno seleccionado del grupo consistente en

40 una proteína antigénica de cáncer, un péptido antigénico de cáncer, una proteína antigénica de enfermedad infecciosa o un péptido antigénico de enfermedad infecciosa, una célula de cáncer lisada o una célula de enfermedad infecciosa lisada y una célula apoptótica y una célula necrótica de una célula de cáncer o célula de enfermedad infecciosa, y un producto termotratado de los mismos.

45 8. El método para tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración del antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,01 a 20 μg/ml.
9. El método para el tratamiento de activación de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 8, en 50 el que la concentración del antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,1 a 2 μg/ml.
10. Un método para la producción de una célula presentadora de antígeno activada, comprendiendo el método: tratar la célula presentadora de antígeno con el método para tratamiento de activación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un método para inducir un inmunocito, comprendiendo el método: (i) someter una célula presentadora de antígeno a pulsos conjuntamente con bisfosfonato y un antígeno de enfermedad, y

5 (ii) cultivar conjuntamente la célula presentadora de antígeno y un linfocito simultáneamente a o después del pulso conjunto.
12. El método para inducir un inmunocito según la reivindicación 11, en el que el inmunocito a inducir comprende al

menos uno de un CTL CD8+ específico de antígeno de enfermedad y/o un linfocito T γδ. 10
13. El método para inducir un inmunocito según la reivindicación 11 o 12, en el que la célula presentadora de antígeno es al menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial.

15 14. El método para inducir un inmunocito según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (II) siguiente, una sal del mismo o su hidrato:

Fórmula 1

20 en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2

25 forman parte de la misma estructura cíclica, y

un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico.
15. El método para inducir un inmunocito según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el bisfosfonato es al menos uno seleccionado del grupo consistente en ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, ácido alendrónico, ácido risedrónico, ácido ibandrónico, ácido incadrónico, ácido etidrónico, una sal de los mismos y su hidrato.
16. El método para inducir un inmunocito según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la concentración del bisfosfonato en el pulso conjunto es de 0,001 a 20 μM.
17. El método para inducir un inmunocito según la reivindicación 16, en el que la concentración del bisfosfonato en el 40 pulso conjunto es de 0,001 a 5 μM.
18. El método para inducir un inmunocito según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el antígeno de enfermedad es al menos uno seleccionado del grupo consistente en una proteína antigénica de cáncer, un péptido antigénico de cáncer, una proteína antigénica de enfermedad infecciosa o un péptido antigénico de

45 enfermedad infecciosa, una célula de cáncer lisada o una célula de enfermedad infecciosa lisada y una célula apoptótica y una célula necrótica de una célula de cáncer o célula de enfermedad infecciosa, y un producto termotratado de los mismos.
19. El método para inducir un inmunocito según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que la 50 concentración del antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,01 a 20 μg/ml.
20. El método para inducir un inmunocito según la reivindicación 19, en el que la concentración del antígeno de enfermedad en el pulso conjunto es de 0,1 a 2 μg/ml.

55 21. Un método para la producción de un inmunocito, comprendiendo el método: inducir el inmunocito mediante el método de inducción según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20.
22. Uso de un bisfosfonato como componente eficaz en un acelerador de la activación en un método que comprende someter una célula presentadora de antígeno a pulsos con dicho acelerador de la activación en el momento del pulso con un antígeno de enfermedad.
23. El uso según la reivindicación 22, en el que la célula presentadora de antígeno es al menos una seleccionada del grupo consistente en una célula dendrítica, una célula dendrítica inmadura y una célula presentadora de antígeno artificial.

10 24. El uso según la reivindicación 22 o 23, en el que el bisfosfonato es un compuesto químico representado por la fórmula (I) siguiente, una sal del mismo o su hidrato:

Fórmula 1

15 en la que R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente entre sí del grupo consistente en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo arilo o un grupo arilo sustituido, un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido, un grupo alquilamino inferior, un grupo aralquilo, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico, o R1 y R2

20 forman parte de la misma estructura cíclica, y

un sustituyente en R1 y R2 se selecciona del grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo ariltio, un grupo ariloxilo, un grupo alquiltio, un grupo cicloalquilo y un grupo heterocíclico.
25. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que el bisfosfonato es al menos uno seleccionado del grupo consistente en ácido zoledrónico, ácido pamidrónico, ácido alendrónico, ácido risedrónico, ácido ibandrónico, ácido incadrónico, ácido etidrónico, una sal de los mismos y su hidrato.