CN104651308A - 一种用磷酸盐扩增γδT细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法及其应用。所述体外扩增人γδT细胞的方法包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获所述细胞；所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。本发明采用rhIL-2和IBA联合刺激人外周血单个核细胞（PBMC）的方法在体外扩增人γδT细胞，该方法成本低、制备简单、扩增效率高，且能得到肿瘤杀伤力强、TCR克隆多样的γδT细胞。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用磷酸盐扩增γδT细胞的方法及其应用。
背景技术
T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)的不同分为两类：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞，分别简称为αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。如何高效、快速地在体外大量扩增人外周血γδT细胞，对于γδT细胞免疫功能的研究、提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力非常重要，但由于γδT细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，一般不超过T细胞总数的5％，要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞是十分困难的。
授权公告号为CN1306027C的发明专利提供了一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法，该方法采用固相抗γδTCR抗体选择性扩增γδT细胞，但是其使用的抗γδTCR抗体较贵，生产成本太高。
授权公告号为CN102533649B的发明专利提供了一种简单高效制备人γδT细胞的方法，该方法采用结核杆菌耐热性抗原联合细胞因子人重组rhIL-2及人重组rhIL-21刺激扩增γδT细胞，但该法获得的γδT细胞的特异性克隆占优势，但普适性较差，不能广泛杀伤不同类型的肿瘤。
因此有必要提供一种高效、低成本的对肿瘤具有广泛杀伤能力的γδT细胞的制备方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法，该体外扩增人γδT细胞的方法采用(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2刺激单个核细胞，从而扩增其中的γδT细胞；该方法成本低、操作流程简单、且能在较短时间内获得具有广泛杀伤性的γδT细胞；本发明还提供了该体外扩增人γδT细胞的方法的应用。
本发明所述“γδT细胞”是指T淋巴细胞受体（TCR）由γ和δ链构成的淋巴细胞；本发明所述“单个核细胞”是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。
第一方面，本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法，包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获培养后的细胞，所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。
优选地，所述细胞培养箱的条件设置为37℃，5%CO2。
优选地，所述(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐（IBA）在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μM～2.0μM。
优选地，所述人重组白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10～100U/ml。
本发明提供的细胞培养液中rhIL-2的浓度为10～100U/ml是本发明的优选范围，根据需要，可以适当加大rhIL-2在细胞培养基中的浓度，比如采用含100～500U/ml的rhIL-2的细胞培养液。
在本发明技术方案的细胞培养液中选用人重组白细胞介素rhIL-2。其他来源的IL-2（比如直接从动物体内提取的IL-2）可做为人重组白细胞介素rhIL-2的替代品，但用来扩增人γδT细胞可能会引起免疫反应，是较差效果的选择。
优选地，所述树突状细胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5～20。
进一步优选地，所述树突状细胞为所述单个核细胞的0.1倍。
优选地，所述细胞培养的过程中，每2～3天进行半量更换培养液。
优选地，所述细胞培养的时间为8～14天。
进一步优选地，所述细胞培养的时间为8天。
优选地，所述单个核细胞来源于人的外周血。
优选地，所述细胞培养液为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗。其中，RPMI-1640购自gilco公司，FBS为牛胎血清，双抗为链霉素和青霉素。
优选地，所述细胞培养液中含有10%～15%的牛胎血清（FBS）或10%～15%的人血清。
进一步优选地，所述细胞培养液中含有10%的牛胎血清（FBS）或10%的人血清。
本发明采用含10%～15%FBS的培养细胞液是本发明的优选范围，此外，可以根据需要调整细胞培养液中血清的浓度，比如培养液采用15%以上的血清浓度。
可选地，人血清为分离PBMC所收集的血清，该血清需要56℃灭活30min以去除血清中补体等对热敏感的物质。
本发明采用rhIL-2以及(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐（伊班膦酸钠，IBA）联合刺激PBMC，能快速、简便、低成本扩增得到γδT细胞。其中，rhIL-2是T细胞生长因子，能使T细胞在试管内长期存活，并刺激T细胞进入细胞分裂周期，此外，rhIL-2能诱导T细胞分泌IFN-γ、TNF、CSF等细胞因子，增强T细胞的杀伤活性；IBA属于非肽类的小分子磷酸化合物，而人γδT细胞能直接对非肽类配体起反应，表现为细胞毒性和细胞因子产生。
本发明采用IBA利用与结核杆菌耐热性抗原不同的机制选择性激活γδT细胞，能丰富扩增后γδT细胞的亚群种类，激活的γδT细胞呈多克隆化，其TCR具有更丰富的CDR3克隆，对肿瘤的杀伤能力更具普适性；与只添加了rhIL-2的对照组相比，rhIL-2和IBA的联合使用使得肿瘤杀伤的细胞因子表达量上升，rhIL-2和IBA的联合使用比单纯使用rhIL-2对γδT细胞的扩增效率更高，扩增得到的γδT细胞对肿瘤的杀伤力更强，具有广泛靶向各种肿瘤的能力。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述体外扩增人γδT细胞的方法在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
本发明提供了的体外扩增人γδT细胞的方法及其应用具有如下有益效果：
（1）本发明采用rhIL-2和IBA联合刺激进行体外扩增人γδT细胞的方法，相比仅采用rhIL-2刺激的方法，本发明所得γδT细胞的扩增效率更高；
（2）本发明提供的体外扩增人γδT细胞的方法能得到TCR多样性更丰富，肿瘤的杀伤性更广泛的人γδT细胞；
（3）本发明提供的体外扩增人γδT细胞的方法成本低、扩增效率高、耗时短且制备流程简单。
附图说明
图1～图4为本发明实施例2所提供的样品的流式细胞数据二维散点图；
图5为本发明实施例3所提供的样品的CCR5表达水平检测结果；
图6为本发明效果实施例所提供的样品的肿瘤细胞杀伤实验结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1
本实施例提供了一种分离人外周血单个核细胞即PBMC的方法，包括如下步骤：
（1）无菌采集血液至肝素抗凝管中；
（2）取淋巴细胞分离液加入15ml离心管管底，将离心管倾斜45°角，用吸管吸取血液样品（分离液体积：血样体积=1:2），小心加入分离液上1cm处，沿离心管管壁缓慢地将血样叠加到分离液上，勿破坏分离液层界面；
（3）室温400g水平离心20min，缓慢升降速；
（4）平稳取出离心管，此时最下层是红细胞和粒细胞，中间层是淋巴细胞分离液，最上层是血浆、稀释液等。血浆层与分离液交界处浑浊灰白色层（白膜层），富含单个核细胞。
（5）小心吸取上层血浆（约1/2体积）至另一干净离心管中，56℃灭活30min，1000g离心10min，保留上清，放置于4℃冰箱备用。
（6）用吸管轻轻吸取白膜层细胞，放入另一15ml离心管中。加入适量PBS，室温200g离心10min，弃上清，重复三遍，尽量除去血小板。
实施例2
本实施例提供了一种体外扩增γδT细胞的方法，包括如下步骤：
（1）设计对照组和实验组，实验组分为3组；对照组和实验组1～3组培养基中均加入10U/ml的rhIL-2，其中，实验组1～3组的培养基中分别加入0.5μM、1.0μM和2.0μM的IBA；
（2）取含有500μL培养基的24孔板、实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC，其中，对照组和实验组每孔加入2×105的PBMC；所用培养基为RPMI-1640+15%FBS+1%双抗；
根据步骤（1）和步骤（2），得出对照组和各实验组设计如下表1：
表1对照组和实验组各成分添加情况
（3）按照步骤（1）设计的实验方案向各组标记的培养孔中加入相应的物质后，将培养板置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中进行扩增培养。
（4）每两天进行半量换液，至第8天收集细胞并检测扩增效率，扩增倍数如表2所示：
表2实施例3对照组和实验组所得γδT细胞的扩增倍数
本实施例采用流式细胞仪图（BD公司，分选型流式细胞仪ariaⅢ）分析对照组和实验组采用的方法对γδT细胞扩增效率的影响，结果如图1～4所示，图1～4为本实施例1所提供的样品的流式细胞数据二维散点图，其中，横坐标CD3+表示细胞的表型为CD3+，纵坐标γδTTCR+表示细胞的表型为γδTTCR+，表型同时为CD3+以及γδTTCR+的细胞即γδT细胞，为第1象限（右上角）所示，第1象限右上角的数据代表扩增后γδT细胞所占的比例。
图1显示了对照组γδT细胞占外周血单个核细胞的比例（3.35%）；图2显示了实验组1的结果，即加入10U/mL人重组IL-2以及0.5μM IBA后培养8天γδT细胞所占比例（14.1%）；图3显示了实验组2的结果，即加入10U/mL人重组IL-2以及1.0μM IBA后培养8天γδT细胞所占比例（14.3%）；图4显示了实验组3的结果，即加入10U/mL人重组IL-2以及2.0μM IBA后培养8天γδT细胞所占比例（10.9%）。
结合表2和图1～4可知，相比对照组，实验组1～3均出现明显的γδT细胞的扩增，这是由于对照组细胞培养液中只含rhIL-2，仅添加rhIL-2可以维持细胞存活，但是刺激扩增效果不明显；实验组1～3分别多加了浓度为0.5μM、1.0μM、2.0μM的IBA，其γδT细胞扩增倍数得到较大提高；且随IBA浓度的增加（0.5μM～2.0μM），其提高PBMC中γδT细胞的扩增效率的能力逐渐增强。
为充分说明本发明的有益效果，本发明还对实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC、实施例3步骤（4）对照组以及实验组1扩增培养8天后的细胞的γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA水平进行了测定，包括如下步骤：
（1）将实施例1步骤（4）扩增培养8天后得到的γδT细胞收集并用Trizol处理，并按照Invitrogen Trizol（货号为15596-026）抽提总RNA的操作说明抽取总RNA，用NanoDrop测定总RNA浓度；
（2）反转录：依照promega货号为M1705的M-MLV逆转录酶试剂盒说明反转总RNA，从而获得cDNA；
（3）实时定量PCR：依照applied biosystems货号为4368708的SYBR GreenPCR试剂盒说明进行CCR5mRNA的实时定量；检测结果见图5。
如图5所示，本底对照组即实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC，作为本底对照，即无扩增前检测得到的CCR5mRNA的含量；由图5可知，对照组（只添加10U/mL人重组IL-2）和实验组(添加了10U/mL人重组IL-2以及0.5μM的IBA)的CCR5mRNA的含量相对于本底对照组均有提高，即其CCR5的表达量均有上调，且实验组的上调倍数为对照组的2倍，CCR5的表达水平的上升显示扩增后γδT细胞的迁移能力提高，即细胞杀伤肿瘤的能力提高。
实施例4
本实施例提供了一种体外扩增γδT细胞的方法，包括如下步骤：
（1）设计对照组和实验组，实验组分为3组；对照组和实验组1～3组培养基中均加入50U/ml的rhIL-2，其中，实验组1～3组的培养基中分别加入0.5μM、1.0μM和2.0μM的IBA；
（2）取含有500μL培养基的24孔板、实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC，其中，对照组和实验组每孔加入2×105的PBMC；所用培养基为RPMI-1640+12%FBS+1%双抗；
（3）按照步骤（1）设计的实验方案向各组标记的培养孔中加入相应的物质后，将培养板置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中进行扩增培养。
（4）每两天半进行半量换液，至第10天收集细胞并检测扩增效率，扩增倍数如表3所示：
表3实施例4实验组1～3所得γδT细胞的扩增倍数
实施例5
本实施例提供了一种体外扩增γδT细胞的方法，包括如下步骤：
（1）设计对照组和实验组，实验组分为3组；对照组和实验组1～3组培养基中均加入100U/ml的rhIL-2，其中，实验组1～3组的培养基中分别加入0.5μM、1.0μM和2.0μM的IBA；
（2）取含有500μL培养基的24孔板、实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC，其中，对照组和实验组每孔加入2×105的PBMC；所用培养基为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗；
（3）按照步骤（1）设计的实验方案向各组标记的培养孔中加入相应的物质后，将培养板置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中进行扩增培养。
（4）每三天半量换液，至第14天收集细胞并检测扩增效率，扩增倍数如表4所示：
表4实施例5实验组1～3所得γδT细胞的扩增倍数
相对实施例3，实施例4～5采用了更高浓度的rhIL-2，但对增加γδT细胞的扩增倍数影响不大（如表3～4所示），为节约成本，实施例3中较小浓度的rhIL-2为本发明更优选的实施方式。
此外，本发明实施例3～5采用的IBA为小分子物质，相比多肽类抗原，其生物安全性更高，临床应用价值更大，其采用与结核杆菌耐热抗原不一样的机制激活γδT细胞活化和扩增，具有更丰富的TCR多样性。
效果实施例
为充分说明本发明体外扩增人γδT细胞的方法的有益效果，本发明还提供了效果实施例，该效果实施例提供了本发明在体外扩增的人γδT细胞对不同肿瘤细胞的杀伤实验，步骤如下：
分别取对数生长期的H1299作为靶细胞，并调整细胞密度为3×104/ml每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取本发明实施例3对照组和实验组1制备的细胞分别调至密度为3×104/ml，分别加入96孔培养板中，使效靶比分别为1：1，设3个复孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMSO100μl，于A490nm处测吸光度(A)值，按下式计算杀伤活性：杀伤活性(％)＝(A靶细胞+A效应细胞-A效靶混合细胞)/A靶细胞×100％。图6为本发明效果实施例提供的样品对H1299细胞的杀伤实验，其中，NC为空白对照。
结果显示，本发明实施例3对照组（只添加rhIL-2）和实验组1（添加rhIL-2和IBA）制备的γδT细胞对H1299细胞均具有杀伤活性；由图6可知，对照组和实验组1活化并扩增后的γδT细胞对H1299细胞的平均杀伤率分别为40%和60％(图6中的误差线表示的是3次检测的标准误差)，即rhIL-2和IBA组对H1299细胞的杀伤力更强；本发明采用的IBA和rhIL-2联合使用能提高扩增后γδT细胞的杀伤力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种体外扩增人γδT细胞的方法，包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获所述培养后的细胞，其特征在于，所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。
2.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μM～2.0μM。
3.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述人重组白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10～100U/ml。
4.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5～20。
5.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养的过程中，每2～3天进行半量更换培养液。
6.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养的时间为8～14天。
7.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述单个核细胞来源于人的外周血。
8.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养液中含有10%～15%的牛胎血清或10%～15%的人血清。
9.如权利要求1所述的一种体外扩增人γδT细胞的方法在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150527 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |