CN115819600B - 一种γδT细胞制备以及在癌症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种γδT细胞制备以及在癌症中的应用，在扩增培养基中添加IL‑2和帕米磷酸钠以及微生素C能够较好的促进γδT细胞的增殖，增殖后的效果通过实验在低剂量的效靶比的情形下即可实现较好的杀灭肿瘤的效果。将γδT细胞与HDAC6单克隆抗体一起使用，同样具有较好的抑制肿瘤生长的效果。

Description

一种γδT细胞制备以及在癌症中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及γδT细胞的制备扩增方法以及在癌症中的应用。

背景技术

T细胞可分为αβT细胞和γδT细胞。γδ细胞可以分为2个亚群：Vδ1T细胞和Vδ2T细胞。Vδ1T细胞带有不同的Vγ，主要分布在上皮和黏膜。Vδ2T细胞主要存在于外周血中，占外周γδT细胞总数的50﹪-75﹪，在TCRγδ重组过程中，几乎只和Vγ9共表达。与αβT细胞类似，γδT细胞可以根据CD27和CD45RA表达水平分为4个亚群：幼稚型细胞(CD27+CD45RA+)、中央记忆型细胞(CD27+CD45RA-)、效应记忆型细胞(CD27-CD45RA-)和终末分化型细胞(CD27-CD45RA+)。其中幼稚型细胞和中央记忆型细胞主要分布在次级淋巴组织，不具有直接效应功能，受到抗原刺激后，中央记忆型细胞较幼稚型细胞增殖更显著。而效应记忆型细胞和终末分化型细胞主要分布于感染部位和肿瘤部位，具有直接效应功能，效应记忆型细胞的增殖水平低，但能分泌细胞因子，如IFN-γ和TNF-α。外周血中的γδT细胞，可被募集至炎症部位后迅速增殖、分泌细胞因子，并分化成细胞毒性细胞，杀伤受感染细胞或肿瘤细胞。

γδT细胞可以通过NKG2D识别肿瘤抗原。γδT细胞表面表达NKG2D受体，可与肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体识别并结合，借助酪氨酸激酶的作用传递活化信号，促使免疫细胞活化增殖及进入效应阶段，以激活机体抗肿瘤免疫。这一途径的抗肿瘤免疫过程受肿瘤细胞表达的NKG2D配体的数量影响，在不同肿瘤中也有不同的作用效果。其次，DNAM-1(CD226)和CD96途径。γδT细胞表面的DNAM-1可与肿瘤细胞表面的CD155分子和CD112分子结合，向胞内传递活化信号，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。CD96与CD226类似，识别肿瘤细胞表面的CD155分子介导杀伤效应。

γδT细胞通过两条独立的途径直接溶解杀伤肿瘤细胞:一方面，分泌穿孔素和颗粒酶，穿孔素通过介入靶细胞膜的结构组成，破坏其原有的膜完整性及功能性的膜结构，达到杀伤肿瘤细胞的目的，颗粒酶可以直接进入胞质，活化蛋白酶，引起细胞自身结构破坏而死亡。另一方面，γδT细胞表面高表达FasL，通过识别肿瘤细胞表面的Fas，可激活肿瘤细胞的程序性凋亡。

应用含IPP和IL-2的RPMI1640培养基体外激活和扩增人γδT细胞，并将其分别与胰腺癌细胞株、肝癌及胃癌细胞株按不同的效靶比进行杀伤活性的试验，结果证实γδT细胞对以上肿瘤具有明确的杀伤活性，并且贴壁生长的群体较悬浮生长的群体作更强，这可能与肿瘤细胞高表达黏附因子受体增强了与γδT细胞的接触有关。通过临床研究证实联合γδT细胞治疗组的非小细胞肺癌患者的客观缓解率、卡氏评分及3年生存率明显优于单用化疗的对照组，且骨髓抑制和恶心的发生率低于单纯化疗组。对于卵巢癌的促凋亡作用在研究中也得到证实。此外，国内外众多的实验室及临床研究还证实了γδT细胞在体内、外对于包括乳腺癌、骨肉瘤及结肠癌在内的多种实体瘤均具有明显的杀伤作用。

γδT细胞具有较强的抗肿瘤功能，体外扩增的γδT细胞亦具有稳定的抗肿瘤效应，使用体外扩增的γδT细胞进行肿瘤细胞免疫治疗，对体内γδT细胞数量极少或γδT细胞功能严重缺陷的肿瘤患者病情的控制及缓解具有重要意义。因此，体外扩增足够数量γδT细胞并用于恶性肿瘤的临床治疗具有重要的科学和应用价值。但是，目前γδT细胞体外扩增技术问题值得进一步研究。

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶,对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下,组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同调控。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。特别是HDAC6是组蛋白去乙酰化酶重要的一种，其作用研究还不够多。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种改进的获得γδT细胞的方法。

具体的，本发明提供的γδT细胞制备和扩增方法，包括以下步骤：

外周血，乙二胺四乙酸抗凝。将抗凝外周血样品1000×g、4℃，离心10min；将血浆转移至新的离心管中，使用无菌生理盐水重悬细胞沉淀并稀释，加于到Ficoll溶液上，1000×g、4℃，离心10min。转移中间层细胞至离心管中，使用无菌生理盐水，1000×g、4℃，离心10min，洗涤2次。弃上清液，应用γδT细胞扩增液(100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基+200IU/mlIL-2+帕米磷酸钠5μg/ml+1μg/ml微生素C)重悬分离，所得的外周血单个核细胞置于75cm²培养瓶中，调整细胞总数为10⁷个，5.0％CO₂、37℃培养，3d半量补充γδT细胞扩增液，培养15d后即获得了扩增后的γδT细胞。

进一步的，本发明提供了制备的γδT细胞在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。

进一步的，本发明提供了制备的γδT细胞在制备治疗A549细胞和K562细胞的药物组合物中的用途。

进一步的，本发明的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

进一步的，本发明还提供了一种特异性针对HDAC6的单克隆抗体。

具体的，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTEMTPWPAVKGRLYWFLQRPGQSPQLLIYTFKNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCHTVCTEQEWFGSGTKLEIK

重链可变区的氨基酸序列：

VKPGGSLKLSCAASGESEIRWDMSWVRQTPDKRLEWVAIAYSCHEHQYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCCTWNEWMKDSAWGQGTTVTVS。

在各种实施例中，轻链可变结构域和重链可变结构域的变体对于如上定义的轻重链可变区域是恒定的，即在框架区域中出现任何变化，并共享，在各种实施例中，至少80％，优选至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与相应的参考序列，即SEQ ID NO.1-2中所述的氨基酸序列中的任一个序列同一性。

进一步的，本发明提供了制备的单克隆抗体在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。

进一步的，本发明提供了制备的单克隆抗体在制备治疗A549细胞和K562细胞的药物组合物中的用途。

进一步的，本发明还提供一种药物组合物，包含治疗有效量的本发明抗体和任选的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括，例如，水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。药学上可接受的载体还可包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其可提高融合蛋白的保质期或有效性。所述组合物可被配制成在给药后提供活性成分的快速，持续或延迟释放。合适的药物组合物及其制备方法是本领域已知的。

进一步的，通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体混合，赋形剂或稳定剂，例如冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体，赋形剂或稳定剂是药学上可接受的，即在所用剂量和浓度下，对接受者无毒，并包括缓冲液，如磷酸盐，柠檬酸盐，乙酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六次甲基氯化铵；苯扎氯铵，苯扎氯铵；苯酚，丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；甜味剂和其它调味剂；填料如微晶纤维素，乳糖，玉米和其它淀粉；粘合剂；添加剂；着色剂；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如Tween-20或聚乙二醇(PEG)。

该药物组合物可以单独或作为联合疗法(即同时或依次)与免疫抑制剂/免疫调节剂和/或抗癌剂给药。不同的免疫疾病可能需要使用可用于治疗免疫疾病的特异性辅助化合物，这可以根据患者对患者的情况来确定。例如，药物组合物可以与一种或多种合适的佐剂，例如细胞因子(例如IL-10和IL-13)或其它免疫刺激剂，例如趋化因子，肿瘤相关抗原和肽联合给药。合适的佐剂是本领域已知的。

可以使用任何合适的方法或途径给予抗体或药物组合物。给药途径包括，例如，静脉内，腹膜内，皮下或肌肉内给药。给予的抗体的治疗有效剂量取决于许多因素，包括，例如，所治疗的免疫疾病的类型和严重程度，联合治疗的使用，抗体或药物组合物的给予途径，以及患者的体重。抗体的治疗有效量的非限制性范围相对于患者的体重为0.1-20毫克/千克(mg/kg)，在一方面为1-10mg/kg。

进一步的，本发明还提供一种药物组合物，包含治疗有效量本发明的抗体以及γδT细胞和任选的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括，例如，水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。

具体的，本发明的药物组合物可以治疗各种癌症，包括黑素瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肝细胞癌和间皮瘤及其他类型的癌症。

有益效果

本发明提供了一种改进的γδT细胞的分离及扩增制备方法，在扩增培养基中添加IL-2和帕米磷酸钠以及微生素C能够较好的促进γδT细胞的增殖，增殖后的效果通过实验在低剂量的效靶比的情形下即可实现较好的杀灭肿瘤的效果。将γδT细胞与HDAC6单克隆抗体一起使用，同样具有较好的抑制肿瘤生长的效果。

附图说明

图1γδT细胞增殖效果图

图2γδ细胞毒性检测结果图

图3HDAC6单克隆抗体的抑癌特性鉴定，分别在50:1-1:1效靶比的条件下。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本公开进行进一步的描述，然而，本公开中这些实施例仅用于阐明而不限制本公开的范围。同样，本公开不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本公开技术特征所作的等同替换、或相应的改进仍属于本公开的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。

实施例1γδT细胞的分离及扩增制备方法

外周血标本50ml，乙二胺四乙酸抗凝。将抗凝外周血样品1000×g、4℃，离心10min；将血浆转移至新的离心管中，使用无菌生理盐水重悬细胞沉淀并稀释至100ml，加于到Ficoll溶液上，1000×g、4℃，离心10min。转移中间层细胞至50ml离心管中，使用无菌生理盐水，1000×g、4℃，离心10min，洗涤2次。弃上清液，应用25mlγδT细胞扩增液(100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基+200IU/mlIL-2+帕米磷酸钠5μg/ml+1μg/ml微生素C)重悬分离，所得的外周血单个核细胞置于75cm²培养瓶中，调整细胞总数为10⁷个，5.0％CO₂、37℃培养，3d半量补充γδT细胞扩增液，培养15d后进行细胞计数。以γδT细胞扩增液2(100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基+2.0μg/mLPAM+100.0U/mLIL-2)作为对照扩增液2。以γδT细胞扩增液3(100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基)作为对照扩增液3，结果如图1所示。

本发明制备的γδT细胞扩增液培养的γδT细胞呈悬浮状态生长，细胞状态及折光性好，可见成团细胞，生长状态较好。从图1可以看出，本发明的扩增液相对于对照组能够显著的增加细胞的总数，在培养15d，细胞总数达到(1360±53)×10⁷个，具有较好的效果。

实施例2γδ细胞表型检测

细胞表型检测：将实施例1培养15d扩增后的细胞重悬为单细胞悬液，1×10⁶个/管，每管加入0.1μg/μlmIgG溶液2.0μl，室温封闭20min。加入γδTCR和CD3荧光抗体，4℃、避光30min；加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，4℃、3000r/min，离心6min，弃上清液。应用流式细胞仪检测250μlPBS重悬细胞表面分子的表达情况。

流式细胞术检测显示，体外培养15d后，CD3+γδTCR+T细胞占全部细胞的(94.82±1.69)％。

实施例3γδ细胞毒性检测

应用红色荧光标记靶细胞A549细胞和K562细胞，37℃、避光，水浴25min，每3min轻轻摇晃1次，混匀细胞。应用RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，25℃、3000r/min，离心10min，共3次，将细胞浓度调整为1×10⁵个/ml，在荧光激活细胞分选器(FACs)管中加入100μl标记后靶细胞。根据效应细胞与靶细胞比例调整实施例1制备的效应细胞(γδT细胞)的浓度，并向各管中加入γδT细胞悬液，100μl/孔，对照管不加效应细胞，加入100μl RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)。每个实验设置4个复孔。轻轻混匀，在5.0％CO₂、37℃环境下培养4h。应用FACs检测靶细胞的荧光强度，计算细胞毒性，细胞毒性(％)＝[(对照组靶细胞数－实验组靶细胞数)/对照组靶细胞数]×100％。

从图2的结果可以看出，本发明制备的γδT细胞对A549细胞和K562细胞均有较好的程度的杀伤活性，对K562细胞的杀伤活性最强，在效靶比为50：1时，杀伤效率＞87％；γδT细胞对A549等细胞也具有较强的杀伤活性，在效靶比为50：1时，杀伤效率也＞80％(图2)。

实施例3 HDAC6单克隆抗体的制备及性能分析

以组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)重组蛋白(品牌：KALANG，货号：kl-E906Hu01)免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫的BALB/c小鼠小鼠脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养液选择性培养，第三天开始出现融合细胞，384个培养孔中有323个孔内有杂交瘤细胞生长，融合率为84.1％。融合10天后换用HT培养基，当每孔杂交瘤细胞覆盖孔底40％时，采用ELISA方法检测323个杂交瘤细胞生长孔培养上清液，有46孔表现阳性反应，阳性率为14.2％。选择5个具最强阳性反应的杂交瘤细胞系，经过三次有限稀释法克隆，获得1株效果最好的单克隆抗体杂交瘤细胞株4H15。该杂交瘤细胞经过ELISA检测发现，只与HDAC6反应，而不与HDAC1或HDAC9或BSA反应，具有较好的特异反应。该杂交瘤细胞在3个月内经40次继代培养，细胞生长良好，并继续稳定分泌抗体。

将小鼠腹腔注射降植烷，再注射4H15单克隆杂交瘤细胞，约10后采集腹水，通过间接ELISA检测腹水效价为：1:512000。将腹水纯化后备用。

利用biacore技术验证4H15单克隆抗体与HDAC6的结合能力，结果如表1所示。

表1 4H15单克隆抗体与HDAC6的结合能力

抗体名称	解离常数(Kd nM)
		4H15单克隆抗体	0.48±0.03

解离常数越小，结合能力越强，从表1的结果可以看出，4H15单克隆抗体与HDAC6的结合能力较好。

将4H15杂交瘤细胞进行扩大培养，分别收集培养后的细胞进行总RNA的提取，经RT-PCR技术，获得4H15单克隆抗体的轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)基因序列，其对应的轻链可变区的氨基酸序列如下所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTEMTPWPAVKGRLYWFLQRPGQSPQLLIYTFKNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCHTVCTEQEWFGSGTKLEIK

重链可变区的氨基酸序列如下所示：

VKPGGSLKLSCAASGESEIRWDMSWVRQTPDKRLEWVAIAYSCHEHQYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCCTWNEWMKDSAWGQGTTVTVS。

实施例4 HDAC6单克隆抗体的抑癌特性鉴定

A549细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至指数生长期并接受相应处理后，用胰蛋白酶消化后收集，用台盘蓝和血细胞计计数后将A549细胞接种在细胞培养板中，37℃MTT试剂孵育3h，随后用MTT溶剂在室温下处理细胞15min。最后在OD590nm使用酶标仪测定吸光度。采用50μg/L的HDAC抑制剂RGFP966作为阳性对照。以对照组的细胞活性为100％，各实验组的细胞活力＝(1-(对照组OD-实验组OD)/对照组OD)*100％.结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，本发明的单抗和HDAC抑制剂RGFP966一样都能显著的抑制癌细胞的细胞活性(相对于空白对照P<0.05),并且随着抗体浓度的增强，对细胞活性的抑制效果更好具有一定的浓度依赖性。在浓度为100μg/L单抗处理下，细胞活性最高只有(29.8±1.98)％，具有较好的效果。

实施例5γδT细胞联合单抗在小鼠体内抗肿瘤活性检测

取裸鼠BALB/c，每只小鼠皮下注射200μl，即1×10⁶个A549细胞，建立裸鼠肺癌移植瘤模型。接种A549细胞第10天左右，荷瘤小鼠皮下肿瘤体积均≥80mm³。采用随机数字表法将小鼠随机分为实验组和对照组，其中：

实验组1给予制备好的γδT细胞溶液(2.0×10⁸个/ml)，皮下注射4.0×10⁷个γδT细胞200μl至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；

实验组2给予制备好的4H15单克隆抗体，皮下注射100μg/只，至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；

实验组3给予RGFP966，皮下注射100μg/只，至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；

实验组4给予RGFP966，皮下注射100μg/只，至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；每次给药2h后，再给予制备好的γδT细胞溶液(2.0×10⁸个/ml)，皮下注射4.0×10⁷个γδT细胞200μl至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；

实验组5给予制备好的4H15单克隆抗体，皮下注射100μg/只，至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；每次给药2h后，再给予制备好的γδT细胞溶液(2.0×10⁸个/ml)，皮下注射4.0×10⁷个γδT细胞200μl至肿瘤组织周围，每周2次，连续2周；

对照组皮下注射无菌PBS溶液至肿瘤组织周围200μl，每每周2次，连续2周；

测量并比较各组小鼠的肿瘤体积。结果如下表2所示。

表2各组肿瘤体积

实验组别	<![CDATA[肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)]]>
		实验组1	762.33±32.54*
实验组2	453.25±21.46*
		实验组3	567.88±30.03*
实验组4	286.31±19.44*
		实验组5	167.53±12.45*
对照组	1825.32±79.46

从表2的结果可以看出，实验组小鼠的肿瘤体积都远远小于对照组[(1825.32±79.46)mm³，P＜0.05]。γδT细胞和4H15单克隆抗体都可以延缓荷瘤小鼠肿瘤的生长速度，具有较好的体内抗瘤能力。而且，γδT细胞和4H15单克隆抗体一起使用后具有较好的协同作用，能够最大化的抑制肿瘤的生长，具有极好的应用价值。

实施例6安全性检测

取C57BL/6小鼠10只，采用随机数字表法将小鼠随机分为对照组和实验组，每组5只。实验组每只小鼠腹腔注射2×10⁸个/mlγδT细胞溶液0.5ml和200ug单抗/只，对照组每只小鼠腹腔注射0.5mlPBS溶液，连续观察1周。结果显示，所有小鼠均未发生不良反应、过敏反应和局部刺激反应。具有较好的安全性。

虽然已经结合其特定实施例描述了本发明，可以理解，它能够进一步修改，并且本申请旨在覆盖任何变化，本发明的应用或修改一般遵循本发明的原理，并包括在本发明所属技术领域内的已知或习惯实践中以及可应用于上文所述的基本特征的对本公开的偏离。这样的修改和变化意欲落在本公开和/或所附权利要求的范围内。应当理解，本公开不限于特定的方法，或组合物，当然这些方法或组合物可以变化。还应当理解，这里使用的术语仅是为了描述特定的实施例，而不是为了限制本发明。

Claims (6)

1.一种特异性针对HDAC6的单克隆抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的HDAC6的单克隆抗体在制备通过抑制HDAC活性进而用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

3.一种γδT细胞联合权利要求1所述的HDAC6的单克隆抗体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途，所述γδT细胞是通过如下方法扩增制备的：分离的γδT细胞在γδT细胞扩增液中培养，其中扩增液是由100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基+200IU/ml IL-2+帕米磷酸钠5μg/ml+1μg/ml微生素C组成，3d半量补充γδT细胞扩增液，培养15d后即获得了扩增后的γδT细胞。

4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

5.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的癌症是A549细胞导致的癌症。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

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