JP2013150609A - 抗原提示細胞の活性化処理方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗原提示細胞の活性化処理方法および前記活性化抗原提示細胞から疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を含む免疫担当細胞をインビトロにおいて効率よく誘導させる方法を提供する。
【解決手段】アミノビスホスホネートと疾病抗原で前記抗原提示細胞を共感作する工程を含む、インビトロにおける抗原提示細胞の活性化処理方法、および前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程を含む、インビトロにおける免疫担当細胞の誘導方法。
【選択図】なし

Description

本発明はビスホスホネートと疾病抗原で共感作した抗原提示細胞に関する。また本発明は、該抗原提示細胞を含む医薬、該樹状細胞を用いた治療・予防方法、該抗原提示細胞を用いた免疫担当細胞の誘導方法に関する。更に本発明は、該誘導方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法に関する。

がんの治療方法としては手術による切除、放射線、抗がん剤を用いた化学療法が行われている。近年ではそれらの療法以外にも様々な治療方法が研究され、実用化されている。その中の一つに免疫細胞を利用した免疫細胞療法がある。

免疫細胞療法には、リンパ球を体外でリンフォカインにより活性化して体内に戻すＬＡＫ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）療法、病変を特異的に認識・傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬと記す）を用いたＣＴＬ療法、及び、樹状細胞療法等が含まれる。

前記樹状細胞療法は、疾病抗原を直接又は細胞内でプロセッシングした後にＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ、主要組織適合抗原複合体）に提示させた樹状細胞を用い、体内で病原を選択的に攻撃する疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導し、治療を行う療法である。提示させる前記疾病抗原には、例えば、がん抗原蛋白若しくはペプチド、感染症抗原蛋白若しくはペプチド、又はその一部が含まれる（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。

疾病抗原で感作した樹状細胞とリンパ球を混合培養して樹状細胞でリンパ球を刺激することによりｉｎ ｖｉｔｒｏ（体外）で疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導できる。例えば、がん抗原蛋白若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白若しくはペプチドを感作した樹状細胞を使用した場合、１回の混合培養で誘導される疾病抗原ＣＴＬの増加は、前記樹状細胞を使用しない場合に比べて５〜２０倍である。

がん抗原蛋白若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白若しくはペプチドを感作した樹状細胞を用いた樹状細胞療法では、ｉｎ ｖｉｖｏ（体内）の疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率、すなわち、全リンパ球に占めるＣＴＬの割合が、２〜１４倍まで上昇することが知られている。

樹状細胞による疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高めることにより樹状細胞療法の効果を一層良好なものにするため、現在、主に２つの方法が行われている。

１つは、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、さらに樹状細胞上のＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＴＬＲと記す）と反応する薬剤等を樹状細胞に反応させて樹状細胞の抗原提示能力を高めることにより、直接的に疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高める方法である（ＴＬＲを介してのアジュバント効果、例えば、非特許文献３、非特許文献４参照）。他方は、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、樹状細胞上のＭＨＣ分子以外の抗原提示分子、例えばＣＤ１ｄ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １ｄ）分子上に糖脂質等のようなものを提示させて疾病抗原特異的ＣＴＬ以外のｉＮＫＴ（ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）等を含む免疫担当細胞を活性化し、この活性化した免疫担当細胞を介して間接的に疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高める方法である（疾病抗原特異的ＣＴＬ以外の免疫担当細胞を介してのアジュバント効果、例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。

しかしながら、上記のＴＬＲを介しての直接的なアジュバンド効果、又は疾病抗原特異的ＣＴＬ以外の免疫担当細胞を介しての間接的なアジュバント効果による疾病抗原特異的ＣＴＬ誘導の上昇は、これらのアジュバントを用いない場合に比べ４倍から６倍程度である（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。したがって、さらに効率よく疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導できる技術の開発が望まれている。

Ｂｌｏｏｄ ２００４,１０３,３８３−３８９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００１，９８，８８０９−８８１４ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４，４，４４９−５１１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００４，６４，５４６１−５４７０ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００４，１１４，１８００−１８１１ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００２，１９５，６１７−６２４

本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞をｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率よく誘導させるための抗原提示細胞（例えば、樹状細胞等）の活性化処理方法、該活性化抗原提示細胞を含む医薬、該活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法、該活性化抗原提示細胞を用いた疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を含む免疫担当細胞の誘導方法、該方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、及び該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法を提供する。

本発明者らは上記課題を解決するために研究を行った。その結果、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えてビスホスホネートで共感作すると、ビスホスホネートを添加しない場合に比べ、疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞の全リンパ球に占める割合及び細胞数が著しく増加することを見出し、本発明を完成した。例えば、ビスホスホネートの添加することにより、添加しない場合に比べて全リンパ球に占める疾病抗原特異的ＣＴＬの割合が約１００倍またγδＴ細胞の割合が約３倍高くなり、細胞数として疾病抗原特異的ＣＴＬが約９０倍、γδＴ細胞が約６倍になりうる。ただし、本発明は、これらの数値に限定されない。本発明によれば、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を誘導してがん及び／又は感染症を治療・予防する免疫細胞療法のさらなる発展が促される。

すなわち、本発明は以下の通りである。

（１）抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネートと疾病抗原で前記抗原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処理方法、
（２）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（１）記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（３）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、

上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される（１）又は（２）記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
（４）前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される（１）から（３）いずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（５）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである（１）から（４）いずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（６）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである（５）記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（７）前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される（１）から（６）いずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（８）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである（１）から（７）いずれかに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（９）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである（８）記載の抗原提示細胞の活性化処理方法、
（１０）活性化抗原提示細胞の生産方法であって、（１）から（９）いずれかに記載の活性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方法、
（１１）（１０）記載の生産方法により生産された活性化抗原提示細胞、
（１２）がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、（１１）記載の活性化抗原提示細胞を含む医薬組成物、
（１３）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（１２）記載の医薬組成物、
（１４）がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、（１１）記載の活性化抗原提示細胞を投与することを含む予防・治療方法、
（１５）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（１４）記載の予防・治療方法。

（１６）免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことを特徴とする免疫担当細胞の誘導方法；
（ｉ） ビスホスホネートと疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程、
（ｉｉ）前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程、
（１７）誘導される免疫担当細胞が、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びγδＴ細胞の少なくとも一方を含む（１６）記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（１８）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（１６）又は（１７）記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（１９）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、

上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアルキル基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される（１６）から（１８）いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法。
（２０）前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される（１６）から（１９）いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（２１）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである（１６）から（２０）いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（２２）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである（２１）記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（２３）前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される（１６）から（２２）いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（２４）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである（１６）から（２３）いずれかに記載の免疫担当細胞の誘導方法、
（２５）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである（２４）記載の免疫担当細胞の誘導方法。

（２６）免疫担当細胞の生産方法であって、（１６）から（２５）いずれかに記載の誘導方法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法、
（２７）（２６）記載の生産方法により生産された免疫担当細胞、
（２８）がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、（２７）記載の免疫担当細胞を含む医薬組成物、
（２９）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（２８）記載のがん及び／又は感染症のための医薬組成物、
（３０）がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、（２７）記載の免疫担当細胞を投与することを含む予防・治療方法、
（３１）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（３０）記載のがん及び／又は感染症の予防・治療方法。

（３２）ビスホスホネートを有効成分として含有する疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤、
（３３）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（３２）記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤、
（３４）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、

上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される（３２）又は（３３）記載の疾病抗原で感作した抗原提示細胞の活性化促進剤、
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される（３２）から（３４）いずれかに記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。

図１は、Ａ２７Ｌ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの割合を測定した結果の一例を示すグラフである。

第一の実施形態：活性化抗原提示細胞の作製
まず、本発明の活性化抗原提示細胞について詳説する。

本発明の活性化抗原提示細胞とはビスホスホネート及び疾病抗原で共感作した抗原提示細胞である。

本発明に用いる前記抗原提示細胞は、特に制限されず、例えば、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、その他の抗原提示細胞、人工抗原提示細胞及びそれらの混合物のいずれを用いてもよい。その中でも、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞が好ましく、より好ましくは、未成熟樹状細胞である。ビスホスホネートと疾病抗原とで共感作した場合には未成熟樹状細胞のほうがより好適に疾病抗原特異的ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を誘導させることができるためである。また、前記人工抗原提示細胞とは、人為的に作製した抗原提示細胞であって、例えば、少なくとも主要組織適合抗原(ＭＨＣ)クラスＩ及び補助刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）を発現させるよう遺伝子工学的に作製した細胞が挙げられる。さらに、前記人工抗原提示細胞は、腫瘍由来の細胞株を上述のようにＭＨＣクラスＩ及び補助刺激分子を発現するよう改変したものであってもよい。前記細胞株の例としては、乳がん由来のＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ*０２０１）、腎がん由来のＴＵＨＲ１０ＴＫＢ（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ*０２０１／Ａ*２４０２）、胃がん由来のＪＲ‐ｓｔ株（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ*２４０２）等が挙げられる。これらの細胞株は、例えば、ＡＴＣＣやＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ等から入手できる。前記人工抗原提示細胞の作製については、米国公開公報ＵＳ−２００５−００４８６４６−Ａ１に開示され、この引用によりその内容の全体がここに組み込まれる。

本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、ピロリン酸のアナログであって、ピロリン酸骨格のＰ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）をＣ（炭素原子）で置換した化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物が挙げられる。

上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞ
れ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。

本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール−低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ₁−Ｃ₁₀シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。

また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、例えば、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものが挙げられる。その例として、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばゾレドロン酸ナトリウム水和物（Ｚｏｍｅｔａ（商品名）、ノバルティスファーマ））、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばパミドロン酸二ナトリウム・五水和物（Ａｒｅｄｉａ（商品名）、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばアレンドロン酸ナトリウム三水和物（Ｏｎｃｌａｓｔ（商品名）、萬有製薬））、リセドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばリセドロン酸ナトリウム水和物）、イバンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばイバンドロン酸ナトリウム）、インカドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばインカドロン酸二ナトリウム）、エチドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばエチドロン酸二ナトリウム）等が挙げられる。これらの中で、とりわけゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物が好ましい。

本発明で使用する疾病抗原において、前記「疾病」とは、特に制限されないが、例えば、がんや感染症等である。前記がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんを含み、例えば、治療が困難であるがん（前がん状態を含む）等が挙げられる。前記感染症としては、特に制限されず、例えば、エイズ、Ｂ型・Ｃ型肝炎等のウイルス感染症や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、若しくは、原虫による感染症等が挙げられる。本発明において使用する疾病抗原の形態は特に制限されず、例えば、がん抗原又は感染症抗原蛋白及びそのペプチドが挙げられる。また、前記疾病抗原としては、例えば、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物を使用できる。

前記疾病抗原ががん抗原である場合、そのがん抗原のがんの種類は問わず、どのような抗原も用いることができる。例えば、前立腺がん、肝がん、すい臓がん等のどのようながん抗原であっても利用できる。前記がん抗原としては、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＲＡＧＥ等のＭＡＧＥ遺伝子ファミリーにコードされるものが挙げられる。他のがん抗原としては、例えば、ｐ５３、Ｋ‐ｒａｓ、ＣＤＫ４及びｂｃｌ‐ｃ‐ａｂｌ遺伝子産物等の変異により生じるがん抗原、ｃ‐ｅｒｂ２（ｎｅｕ）蛋白等のがん細胞で過剰発現されるがん抗原、および、ＨＰＶ‐１６のＥ７蛋白等の発がんウイルス抗原等が挙げられる。さらに、がん胎児抗原（ＣＥＡ）やα‐フェトプロテイン(ＡＦＰ)等の腫瘍胎児抗原、ならびに、前立腺特異的抗原や、白血病およびリンパ腫のＢ細胞で発現するＣＤ‐１０（ＣＡＬＬＡ抗原）等の分化抗原も使用することができる。

また、感染症抗原の感染症の種類も、特に制限されず、例えば、エイズやＢ型・Ｃ型肝炎、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染症、ＨＰＶ感染症等のウイルス性感染症の中でも難治性疾患も挙げられる。また、マラリア原虫のスポロゾイド周囲蛋白のような寄生虫の抗原も用いることができる。

また、本発明では前記疾病抗原ペプチドとして合成ペプチドを用いることができる。これにより、自己のがん組織等から採取したがん抗原を使用する場合と比べて患者の負担を少なくすることが可能となる。前記がん抗原蛋白又はペプチドとしては、例えば、下記表１〜３に記載のものが使用でき、これらは、当該分野の当業者が容易に入手又は合成できる。

本発明において、抗原提示細胞をある物質で感作するとは、抗原提示細胞をその物質と反応させることをいい、好ましくは、前記物質を抗原提示細胞の表面上に直接的に又は間接的に提示させることをいう。また、抗原提示細胞を共感作するとは、同時、連続的、又は断続的に２以上の物質で抗原提示細胞を感作することをいう。前記物質は、好ましくは、ビスホスホネート及び／又は疾病抗原である。

次に、本発明の抗原提示細胞の活性化処理方法、及び、本発明の活性化抗原提示細胞の生産方法を、樹状細胞を抗原提示細胞として用いた下記一例に基づき詳説する。本発明において、抗原提示細胞の活性化処理とは、上述のとおり、抗原提示細胞をビスホスホネート及び疾病抗原で共感作することを含む処理をいう。

まず、抗原提示細胞（この例では、樹状細胞）の調製について説明する。樹状細胞の調製は、樹状細胞の前駆細胞を得るための試料を取得することから始める。前記試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血等が利用できる。入手の容易さ、患者への負担の少なさを考慮して末梢血を利用することが好ましい。採血量は提供者の負担とならない程度の量を採血するのが好ましい。採血する方法としては、真空採血管、採血バッグ等による全血採取を利用することができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取する方法を用いれば、直接末梢血単核球を入手することが可能である。上記採取した血液には凝固が起こらないようにヘパリンやクエン酸を加えてもよい。

次に、採取した血液から樹状細胞の前駆細胞を含む単核細胞を分離する。分離する方法としては、有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることもできる。例えばフィコール分画つまりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配又は溶出を利用する方法が一般的に使用される。なお、回収した細胞は血小板等を除去するために培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと記す）等を用いて数回洗浄することが好ましい。

次に、回収した単核細胞から、樹状細胞の前駆細胞である単球（ＣＤ１４陽性細胞）を分離する。ＣＤ１４は樹状細胞の前駆細胞である単球に発現しているマーカーとして知られている。そのため、抗ＣＤ１４抗体マグネットビーズを用いたＭａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、以下、ＭＡＣＳと記す）を利用して単球を単離・回収できる。この方法は、簡単でかつ単球細胞の回収率が高いため好ましい。あるいは、回収した単核細胞を培養フラスコに移し，３４℃〜３８℃、より好ましくは３７℃、２％〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ₂の条件下で１時間以上培養し、付着細胞を樹状細胞の前駆細胞として用いる方法等を使用してもよい。

その後、得られた樹状細胞の前駆細胞から未成熟樹状細胞あるいは成熟樹状細胞への分化誘導を行う。培養のための培地としてＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）を使用する。またＡＩＭ−Ｖ培地のほかに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下、ＤＭＥＭと記す）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社、以下、ＫＢＭと記す）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下、ＩＭＥＭと記す）等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて０．５〜２０％の牛血清、牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す）、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。

未成熟樹状細胞を得る場合、培養培地に分化誘導因子を添加して樹状細胞の前駆細胞を培養することにより未成熟樹状細胞を得る。分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできる。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦと記す）、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４と記す。他のインターロイキンについても同様に記す）、ステムセルファクター（以下、ＳＣＦと記す）、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（以下、ＴＮＦ−αと記す）等が、効率よく未成熟樹状細胞を誘導できる。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等を添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４との組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ₂条件下で行い、培養期間は５〜７日間が好ましい。

また、成熟樹状細胞を得る場合には、培養開始後５〜７日目にさらなる分化誘導因子を添加して更に培養する。分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、プロスタグランジンＥ₂（以下、ＰＧＥ₂と記す）等で効率よく成熟樹状細胞を誘導することが好ましい。必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＧＥ₂及びＴＮＦ−αの組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。培養は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ₂条件下で行い、培養時間としては２４〜４８時間が好ましい。

また、樹状細胞の前駆細胞として造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αとｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、又はトロンボポエチン（ＴＰＯ）を単独、又はこれらの組合せで添加し、未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞を得る方法や、血液又は末梢血単核球を分離したものからパーコール等の比重液を用いて直接樹状細胞分画を回収する方法も利用することができる。

次に、得られた抗原提示細胞（この例では、前記未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞）をビスホスホネートと疾病抗原で共感作する。

ビスホスホネートの濃度は通常細胞をビスホスホネートにより感作する濃度であればよく、特に限定はされないが、例えば、文献［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．１６６，５５０８−５５１４、又は、Ｂｌｏｏｄ，２００１，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．５，１６１６−１６１８］に記載されているように０．００１μＭから２０μＭであることが好ましく、さらには０．００１μＭから５μＭであることが好ましい。

疾病抗原の濃度は、通常樹状細胞を疾病抗原により感作する濃度であればよく、特に限定はされない。例えば、上述のような疾病抗原蛋白又はペプチドの場合、文献［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ．５９，２１６７−２１７３、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．１５４，２２５７−２２６５、又は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１５３，９９６−１００３］に記載されているように、０．０１〜２０μｇ／ｍＬであることが好ましく、さらには０．１〜２μｇ／ｍＬであることが好ましい。

また、疾病抗原としてアポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を含む細胞群で樹状細胞を感作する場合、前記細胞群の調製方法として、例えば、１）がん細胞又はがん細胞株を培養し自然発生的に形成させる、２）がん細胞又はがん細胞株に対しＵＶ照射（１Ｊ／ｃｍ²・ｓｅｃを２分間）して形成させる、３）がん細胞又はがん細胞株を８５℃、１０分間熱処理をして形成させる方法等が挙げられる。

このような本発明の活性化処理方法により調製（生産）された本発明の活性化抗原提示細胞（この例では、活性化樹状細胞）は、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞を効率よく誘導することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれの場合でも、本発明の活性化抗原提示細胞は、疾病抗原特異的ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞を誘導することができる医薬として使用することができる。特に、医薬としては、がん及び／又は感染症の治療・予防剤用途が好ましい。本発明において、免疫担当細胞とは、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等を含む、抗原の特異性を認識したり及び／若しくは特異的免疫反応に携わったりする能力がある細胞、又は、これらの１種類若しくは２種類以上を含む細胞群をいう。また、本発明において、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含むとは、刺激前に比較して疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞の割合及び／又は細胞数が増加することをいう。本発明の活性化抗原提示細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞誘導させることができる組成物として利用することが可能となる。また、本発明の活性化抗原提示細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、遊離ビスホスホネート及び疾病抗原を洗浄、除去したのち、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞を誘導させることができる樹状細胞ワクチンなどのワクチンとして使用可能である。また、本発明の活性化抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで用いるいずれの場合にも、必要に応じて、例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−２）やその他の蛋白（例えばアルブミン）等を併用してもよい。

第二の実施形態：本発明の活性化抗原提示細胞を含む医薬
次に、本発明の活性化抗原提示細胞を用いた医薬について、上述と同様に、樹状細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。

まず、前述の第一の実施形態で得られた活性化抗原提示細胞（活性化樹状細胞）を遠心分離法等によって回収する。次に、回収した前記細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能である。この後、患者に投与することを考えると、生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。そして、回収された樹状細胞は生理食塩水に懸濁されることで医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じてアルブミン等の血清成分やサイトカインを添加することができる。特に、当該医薬としてはがん及び／又は感染症の治療・予防剤用途であることが好ましい。したがって、関連する実施形態として、本発明は、がん及び／又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性化抗原提示細胞の使用を含む。

第三の実施形態：本発明の活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法
次に、本発明の樹状細胞を用いた治療・予防方法について、上述と同様に、樹状細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。

前述の第一の実施形態で得られた本発明の活性化抗原提示細胞（活性化樹状細胞）、又は、第二の実施形態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん及び／又は感染症に対する治療・予防を行うことができる。

投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であり、特に制限されない。通常、一回の投与で１０⁶〜１０⁸個／人であることが好ましく、より好ましくは１０⁷個／人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通常、４〜６回を１クールとして投与する。投与間隔は投与する樹状細胞数に依存し、特に制限されない。通常、１週間から１ヶ月に一度であることが好ましく、さらには投与する樹状細胞数が５×１０⁶個である場合には２週間に１度、２×１０⁷以上であるならば１ヶ月に一度投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限されないが、静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。

このようにして、本発明の活性化抗原提示細胞を投与することにより患者体内で疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬのみでなくγδＴ細胞を活性化して、増殖させることができる。

これら疾病抗原特異的ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞は直接的にがん細胞や感染細胞を殺傷するばかりでなく、インターフェロンγ（以下、ＩＦＮγと記す）等のサイトカインを介して間接的にこれら細胞を傷害することができるため、例えば、がんや感染症等、様々な治療・予防に有効に用いることが可能である。本発明の活性化抗原提示細胞をワクチンとして用いることの利点としては、以下のことが挙げられる。すなわち、従来の疾病抗原のみで感作した樹状細胞をワクチンでは、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬのみが活性化される。それに対して、本発明の活性化抗原提示細胞のワクチンは、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化に加えてγδＴ細胞を活性化することもできる。さらには、これら疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞から誘導されたサイトカインは、ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞やｉＮＫＴ細胞（ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）及びＢ細胞を活性化することができる。これにより、生体内全体の液性及び細胞性免疫系が活性化され、その結果、治療・予防効果の向上をもたらすことができる。また、活性化処理に用いる抗原提示細胞は、患者の自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。患者に投与された際に患者自身の免疫に排除されることなく、その機能を発揮することが可能となるからである。

第四の実施形態：疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞の誘導方法
次に、本発明の免疫担当細胞の誘導方法について説明する。本発明の免疫担当細胞の誘導方法は、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞を誘導する方法であって、より具体的には、ビスホスホネートと疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程（ｉ）、及び、前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程（ｉｉ）を含む誘導方法である。ここで、免疫担当細胞とは、上述のとおり、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等を含み、抗原の特異性を認識したり及び／若しくは特異的免疫反応に携わったりする能力がある細胞、又は、これらの１種類若しくは２種類以上を含む細胞群をいう。

まず、第一の実施形態と同様に抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の活性化処理を行う（工程（ｉ））。そして、前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞と反応細胞を培養容器に播種して混合培養をする（工程（ｉｉ））。これにより、前記活性化処理された抗原提示細胞からの疾病抗原特異的刺激を受け、前記反応細胞中の疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬが活性化されうる。さらに、ビスホスホネート感作による抗原提示細胞代謝系阻害によって抗原提示細胞表面上に提示されたＩＰＰ（Ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、イソペンテニル二リン酸）様分子からの刺激を受け、前記反応細胞中のγδＴ細胞が活性化されうる。γδＴ細胞から産生されたＩＦＮγは、前記疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの更なる活性化と増殖を助けることができる。なお、ここでいう反応細胞とは、例えば、ヒトリンパ球であって、末梢血由来の単核球等が好ましい。この反応細胞は、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。

前記培養容器は特に限定されるものではなく、通常、当該分野で使用される培養用プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ等を利用することができる。各々の細胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。

前記抗原提示細胞が樹状細胞の場合、樹状細胞と反応細胞との混合培養には、例えば、ＡＩＭ−Ｖ培地を用いて培養することができる。また、ＡＩＭ−Ｖ培地のほか、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＴＩＬ、ＫＢＭ、ＩＭＥＭ等、細胞培養に使用されている市販の培地を利用することができる。さらに必要に応じて５％〜２０％の牛血清、ＦＢＳ、ヒト血漿等の血清、サイトカイン等を添加してもよい。培養は、例えば、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃で、例えば、２％〜１０％、好ましくは５％のＣＯ₂条件下で行う。培養期間としては、特に制限されないが、５〜２１日間が好ましく、さらに７〜１４日間が好ましい。播種する樹状細胞及び反応細胞の数は播種する容器及び用途に応じて設定することができる。また、樹状細胞と反応細胞を混合する割合は状況に応じて適宜設定することが可能であり、特に制限されない。反応細胞中の疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞の割合を増加させるという目的から、反応細胞と樹状細胞の割合は２０：１から２：１が好ましい。

このような本発明の誘導方法により、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む本発明の免疫担当細胞を調製（生産）することが可能である。また、このようにして得られた本発明の免疫担当細胞は、そのまま又は本発明の活性化抗原提示細胞で繰り返し刺激することにより、より高い割合で疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を含む免疫担当細胞として免疫細胞療法に用いることができ、がんや感染症に対してより高い治療・予防効果が期待できる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の免疫担当細胞を調製することの利点としては、本発明の活性化抗原提示細胞によって反応細胞を繰り返し刺激することにより、がん細胞や感染症細胞を直接殺傷可能な多量の免疫担当細胞を簡便に調製できることが挙げられる。

第五の実施形態：本発明の免疫担当細胞を含む医薬
次に、本発明の免疫担当細胞を含む医薬について説明する。

まず、前述の第四の実施形態で得られた疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む本発明の免疫担当細胞を遠心分離法等によって回収する。次に、回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体は、等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能である。この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。そして、回収された疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を優位に含む免疫担当細胞は、生理食塩水に懸濁されることで医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカイン等を添加することができる。当該医薬としては特に、がん及び／又は感染症の治療・予防剤用途が好ましい。したがって、関連する実施形態として、本発明は、がん及び／又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性化抗原提示細胞の使用を含む。

第六の実施形態：本発明の免疫担当細胞を用いた治療・予防方法
次に、本発明の免疫担当細胞を用いた治療・予防方法について説明する。

前述の第四の実施形態で得られた本発明の免疫担当細胞、又は、第五の実施形態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん及び／又は感染症に対する治療・予防を行うことができる。

投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であり、特に制限されない。通常、１回の投与数は１０⁸〜１０¹²個／人であることが好ましく、より好ましくは１０⁹個／人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通常、４−６回を１クールとして投与する。投与間隔は、特に制限されないが、例えば２週間に１回又は１ヶ月に１回投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限されないが、静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。また、本発明の免疫担当細胞は、患者の自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。患者に投与された際に、患者自身の免疫系に排除されることなく、その機能を発揮することが可能となるからである。

第七の実施形態：疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤
次に、本発明の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤について説明する。

本発明の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤は、ビスホスホネートを有効成分として含む。前記活性化促進剤は、さらに、薬学的に許容できる賦形薬及び/又はキャリアを含んでもよい。前記活性化促進剤は、生体内及び/又は生体外において抗原提示細胞を疾病抗原で感作する際、すなわち、疾病抗原で感作する前、疾病抗原で感作すると同時及び／又は疾病抗原で感作した後に添加することができる。本発明は、その他の態様として、疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤の製造のためのビスホスホネートの使用である。本発明は、さらにその他の態様として、ビスホスホネートを用いたがん及び／又は感染症に対する治療・予防方法である。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。

＜実施例１−１：樹状細胞の採取及び調製＞
健常人ドナー（ＨＬＡ−Ａ*０２０１）から末梢血を３０ｍＬ採血した。この健常人末梢血から単核細胞を取得した。この際、血球分離用比重液を用いて単核細胞層を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために１０％ ＦＢＳを添加したＡＩＭ−Ｖで数回洗浄した後、ＭＡＣＳにより単球成分としてＣＤ１４陽性細胞を単離した。

得られた樹状細胞前駆細胞から樹状細胞への分化誘導を行った。培地は１０％ ＦＢＳまたはＡＢ血清を添加したＡＩＭ−Ｖを使用し、これに５００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＭＭＵＮＥＸ）と５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を添加した。培養開始から５〜７日目で未成熟樹状細胞を得た。

さらに、培養開始後５〜７日目に１００Ｕ／ｍＬもしくは１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）、及び１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ₂（ＳＩＧＭＡ）を添加して更に培養し、２４〜４８時間後の細胞を成熟樹状細胞とした。

＜実施例１−２：樹状細胞の状態の確認＞
調製して得られた樹状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。

測定する細胞をＰＢＳに懸濁したものに目的の抗体を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。抗体はＰＥ標識された抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ネガティブコントロールとしてそれぞれの抗体のアイソタイプを用いた。染色した細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬで測定した。

その結果、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４で培養した細胞はＣＤ１４、ＣＤ８３陰性、ＨＬＡ−ＤＲは陽性を示しており、未成熟樹状細胞集団であることを確認した。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＰＧＥ₂で培養した細胞においては、ＣＤ１４以外は陽性を示し、成熟樹状細胞集団であることを確認した。

＜実施例１−３：Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した樹状細胞の調製及び反応細胞の調製＞
上述のとおり調製した末梢血由来の未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞の懸濁液に、アミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）をゾレドロン酸として０．０１μＭとなるように添加し、及び／又は、疾病抗原ペプチドとしてＭＡＲＴ−１抗原ペプチドＡ２７Ｌ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（以下、Ａ２７Ｌと記す）を最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で約１２時間培養した。ネガティブコントロールには、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養した樹状細胞を用いた。

約１２時間の培養後、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び抗原ペプチドで共感作した活性化樹状細胞の一部を１５ｍＬチューブ（ＢＤファルコン）に回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットとなった樹状細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分間で遠心した後、洗浄した。洗浄作業を２回繰り返し行った。これにより回収された樹状細胞を刺激細胞とした。すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原ペプチドで共感作した活性化樹状細胞、いずれか一方で感作した樹状細胞、及び、どちらも感作していない樹状細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞として、樹状細胞調製のためにＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）であって、１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。

＜実施例１−４：Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した樹状細胞によって誘導された免疫担当細胞の性状の解析＞
上述のようにして得られた刺激細胞（樹状細胞）２×１０⁵個を各々、全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）で反応細胞２×１０⁶個と混合培養を行った（反応細胞：樹状細胞＝１０：１）。培養は約３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７日間行った。この混合培養溶液中に２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に４０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。樹状細胞と反応細胞の混合培養開始から７日後に標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで全細胞中にしめるＡ２７Ｌ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ（疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ）の割合を測定した。

ＨＬＡ−Ａ*０２０１ Ａ２７Ｌテトラマー陽性、ＣＤ８陽性細胞が占める割合を算出する手順として、まずＰＥ標識されたＡ２７Ｌテトラマー（ＭＢＬ）を培養後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。遮光の状態で室温１５分染色後、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。コントロールには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定はＥｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬを用い、測定結果の解析にはＥｐｉｃｓ３２を用いた。

その結果を下記表４ａに示す。同表に示すとおり、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）０．０１μＭとＡ２７Ｌ ２μｇ／ｍＬで共感作された活性化樹状細胞は抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導することが確認された。また、この活性化樹状細胞を用いた場合、ペプチドのみで感作した樹状細胞が誘導するＣＴＬの割合と比較すると、約４倍高くなることが確認された。

また、表４ｂ及び図１は同様の実験を被験数を増やして行い、ｔ検定を行った結果である。Ａ２７ＬとＺｏｍｅｔａで共感作した樹状細胞を用いて得られたＣＤ８＋ＣＴＬの割合はＡ２７Ｌのみで感作した樹状細胞を用いて得られたＣＤ８＋ＣＴＬの割合よりも高く、両者の間には有意差があることが明らかとなった。

＜実施例２−１：Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及びＡ２７Ｌ存在下で共感作されている樹状細胞と反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞の性状の解析＞
実施例１で調製した末梢血由来の未成熟樹状細胞、又は成熟樹状細胞を各々１×１０⁵個、全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に播種した。さらに、アミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）を０．０１μＭとなるように添加し、及び／又は、Ａ２７Ｌを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で約２４時間培養した。ネガティブコントロールには、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養した樹状細胞を用いた。そして、この感作をおこなっているままの樹状細胞を刺激細胞として、１２時間培養後、さらに反応細胞２×１０⁶個を播種し、混合培養を行った（反応細胞：刺激細胞＝２０：１）。培養は約３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７日若しくは１４日間行った。混合培養液中に、細胞の増殖に従って１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を加えた。

混合培養開始から７日と１４日後に増殖してくる全細胞数と標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで前記全細胞中にしめる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とγδＴ細胞の割合を測定した。ＰＥ標識されたＡ２７Ｌ ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＭＢＬ）を混合培養終了後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加し、遮光の状態で室温１５分間染色した。その後、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。γδＴ細胞が占める割合の算出にはＦＩＴＣ標識された抗ＴＣＲ Ｖγ９抗体、ＰＥ標識された抗ＴＣＲ ｐａｎα／β抗体、及びＰＣ５標識された抗ＣＤ３抗体（全てＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。これらの抗体を培養後の細胞をＰＢＳで洗浄したものに添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。ネガティブコントロールには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定はＥｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬを用い、測定結果の解析にはＥｐｉｃｓ３２を用いた。

その結果を下記表５及び６に示す。下記表５に示されるように、０．０１μＭのＺｏｍｅｔａ（商品名）と２μｇ／ｍＬのＡ２７Ｌ存在下で樹状細胞とリンパ球を混合培養すると、Ａ２７Ｌのみの存在下で樹状細胞とリンパ球を混合培養した場合に比べ、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの誘導の上昇が観察された。この結果は、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）の疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ誘導のアジュバント効果を示唆している。また、このアジュバント効果は未成熟樹状細胞でより強いことが確認された。

さらに、下記表６に示されるように、０．０１μＭのＺｏｍｅｔａ（商品名）及びＡ２７Ｌ存在下で共感作されている樹状細胞とリンパ球を混合培養することによりγδＴ細胞誘導の上昇も確認された。

＜実施例２−２：Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及びＡ２７Ｌ存在下で共感作されている樹状細胞と反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞のＩＦＮγ産生能の解析＞
続いて、上述の混合培養により誘導された免疫担当細胞のＩＦＮγ生産能を以下のようにして解析した。

ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）の各ｗｅｌｌに７０％エタノールを添加し、２分以内に除去した。前記プレートの各ｗｅｌｌを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。コーティング用抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン：１−Ｄ１Ｋ、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を１５μＬ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈して前記プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。このプレートを４℃で一晩静置した。このプレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３０分間以上室温でブロッキングを行った。ブロッキング培地を除去し、プレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄した。上述の混合培養と同様の方法で得られた各条件での混合培養細胞群を遠心分離により回収し、ＡＩＭ−Ｖにより２回洗浄した。

回収した混合培養細胞２５００個に実施例１で得られた未成熟樹状細胞５００個及びＡ２７Ｌを再刺激のため添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２時間の前培養を行った。細胞数はアッセイプレート１ｗｅｌｌあたりを示す。同時に混合培養細胞のみの前培養、樹状細胞とＡ２７Ｌのみの前培養も行った。また、培養容量は１ｗｅｌｌあたり１００μＬになるように調整した。各培養条件については３ｗｅｌｌ分、３００μＬの培養を行った。ブロッキング後ＰＢＳで洗浄したプレートに、各条件での前培養を終えた細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ、３ｗｅｌｌに播種し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。ｗｅｌｌから培養細胞を除去し、２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。検出用のビオチン標識抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン：７−Ｂ６−１、ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を、０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。プレートを室温で２時間静置した。プレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。アルカリフォスファターゼを結合したストレプトアビジン（ＭＡＢＴＥＣＨ ＥＬＩＳｐｏｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｋｉｔ）を、０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。プレートを室温で１時間静置した。プレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴｐｌｕｓ基質液（Ｗａｋｏ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、暗所でスポットが確認できるまで静置した。肉眼でスポットが確認されたら蒸留水で十分に洗浄した。プレートのメンブレンが乾燥したことを確認した後、ＥＬＩＳＰｏｔリーダー（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ）を用いてスポット数を測定し、データをＡＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ （ＡＩＤ）にて解析した。

その結果を下記表７に示す。同表に示されるように、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）０．０１μＭ及びＡ２７Ｌ ２μｇ／ｍＬで共感作した樹状細胞とリンパ球の混合培養細胞群を、Ａ２７Ｌで感作した樹状細胞を用いて再刺激した場合に、最もＩＦＮγ産生細胞を示すスポット数が増加した。この結果は実施例１で示したＡ２７Ｌテトラマー陽性細胞の割合（％）（表４参照）とも相関した。

＜Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及びがん細胞株由来のアポトーシス細胞存在下で樹状細胞及び反応細胞を混合培養して誘導された免疫担当細胞の性状の解析＞
健常人ドナーから末梢血を２００ｍＬ採血した。健常人末梢血から単核細胞を取得した。この際、血球分離用比重液を用いて単核細胞層を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために数回洗浄した後，ＭＡＣＳにより単球成分としてＣＤ１４陽性細胞を単離した。得られた樹状細胞前駆細胞から樹状細胞への分化誘導を行った。培地は１０％ ＦＢＳを添加したＡＩＭ−Ｖを使用し、これに５００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＭＭＵＮＥＸ）と５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を添加した。培養開始から５〜７日目で未成熟樹状細胞を得た。

ＭＡＲＴ−１陽性のメラノーマ由来がん細胞株を１５ｍＬチューブ（ＢＤファルコン）に回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットとなった細胞株をＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を２回繰り返し行った。これにより回収された細胞株を１×１０⁶個／ｍＬとなるようＡＩＭ−Ｖで再浮遊させた。細胞浮遊液にカンプトテシン（ｓｉｇｍａ）１０μＭ加えて３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。培養後の細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットとなった細胞株をＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を２回繰り返し行った。遠心、洗浄して得られた細胞をアポトーシス細胞とした。

未成熟樹状細胞の懸濁液にアミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）を０．０１μＭとなるように添加し、及び／又は、樹状細胞と同量のアポトーシス細胞を含むがん細胞株を添加し、約２４時間混合培養した。コントロールにはアポトーシス細胞のみと約２４時間培養した樹状細胞、及び、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）とアポトーシス細胞のどちらも添加せずに培養した樹状細胞を用いた。約２４時間培養した未熟樹状細胞に１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα、１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ₂を添加して更に培養し、４８時間後の細胞を成熟樹状細胞とした。

ここで得られた成熟樹状細胞を刺激細胞とした。この刺激細胞１×１０⁵個を各々、反応細胞２×１０⁶個と、全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）で混合培養を行った（反応細胞：刺激細胞＝２０：１）。反応細胞として、樹状細胞調製のためにＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）であって、１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。培養は、約３７℃、５％ＣＯ₂条件下で行った。この混合培養溶液中に２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を添加した。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に４０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２，１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。

混合培養開始から７、１１、１４日後に増殖してくる全リンパ球数と、標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで前記全リンパ球中にしめる抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの割合を測定した。詳しくはＰＥ標識されたＡ２７Ｌ ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＭＢＬ）を培養後の細胞をＰＢＳで洗浄したものに添加し、遮光の状態で室温１５分染色した。その後、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。ネガティブコントロールには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定はＥｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬを用い、測定結果の解析にはＥｐｉｃｓ３２を用いた。

その結果を下記表８に示す。同表に示すように、アポトーシスした細胞を含む細胞株で感作した場合、培養１１日目に０．０１％のテトラマー陽性細胞が確認された。またＺｏｍｅｔａ（商品名）を加えることで０．１４％と約１５倍増加することが確認された。

＜Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した樹状細胞との混合培養を行ったリンパ球のメラノーマ細胞株に対する傷害性の解析＞
実施例１で調製した末梢血由来の未成熟樹状細胞を４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０⁵個／ｗｅｌｌとなるように播種した。各ｗｅｌｌに疾病抗原ペプチドとしてＭＡＲＴ１抗原ペプチドＡ２７Ｌ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加した。同時にアミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）をゾレドロン酸として０.０１μＭとなるように添加したものと添加しなかったものを準備した。同一ドナーのリンパ球を１×１０⁶個／ｗｅｌｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で樹状細胞との混合培養を行った。

混合培養を開始してから１３〜１７日目のリンパ球を回収した。ＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性、ＭＡＲＴ１陽性のヒトメラノーマ細胞株ＪＣＯＣＢをＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ）で標識し、ターゲット細胞とした。回収したリンパ球をエフェクター細胞とし、エフェクター細胞：ターゲット細胞が５：１、もしくは２０：１となるように混合して２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。４時間３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養を行った。

混合培養後の細胞を回収し、氷冷しておいたＰＢＳで洗浄した。遠心後の細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ ＰｅｒＭｉｎｇｅｎ）に懸濁し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと７ＡＡＤ（共にＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加した。氷上で１５分反応させた後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを４００〜５００μＬずつ添加し、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にてアポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞）の割合（％ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を測定した。

下記表９に、ドナー２名について、Ａ２７Ｌ及びＺｏｍｅｔａで共感作した活性化樹状細胞によって誘導されたＡ２７Ｌ抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの割合（％）、テトラマー陽性細胞が検出される平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）及びアポトーシス細胞の割合（％）を測定した結果を示す。同表に示すとおり、ドナー１及び２の双方において、Ａ２７Ｌ及びＺｏｍｅｔａで共感作した活性化樹状細胞を用いて刺激したリンパ球は、Ａ２７Ｌのみで感作した樹状細胞で刺激したリンパ球よりも高い割合でテトラマー陽性細胞が認められた。また、このときのテトラマー陽性細胞が検出される平均蛍光強度も、Ａ２７Ｌ及びＺｏｍｅｔａで共感作した場合の方が高値を示した。また、培養開始後１３〜１７日後のリンパ球をエフェクター細胞（Ｅ）とし、ＭＡＲＴ−１陽性、ＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性のヒトメラノーマ細胞株をターゲット細胞（Ｔ）として混合培養を行った結果、エフェクター細胞：ターゲット細胞の比が５：１、２０：１どちらの場合においても、Ａ２７Ｌ及びＺｏｍｅｔａで共感作した活性化樹状細胞を用いて刺激したリンパ球は、Ａ２７Ｌのみで感作した樹状細胞を用いて刺激したリンパ球よりも高い標的細胞の傷害性を示した。

＜Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した樹状細胞によって誘導された免疫担当細胞の性状の解析＞
実施例１で調製した末梢血由来の未成熟樹状細胞、又は成熟樹状細胞の懸濁液にアミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）をゾレドロン酸として０〜２０μＭとなるように添加し、同時に疾病抗原ペプチドとしてＥＢＶ抗原ペプチドＢＭＬＦ１（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）（以下、ＢＭＬＦ１と記す）を最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で約１２時間培養して活性化処理した。ネガティブコントロールには、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養した樹状細胞を用いた。

約１２時間の培養後、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを共感作した活性化樹状細胞の一部を１５ｍＬチューブ（ＢＤファルコン）に回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットとなった樹状細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を２回繰り返し行った。これにより回収された樹状細胞を刺激細胞とした。すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原ペプチドで共感作した活性化樹状細胞、いずれか一方で感作した樹状細胞、及び、どちらも感作していない樹状細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞として、樹状細胞調製のためにＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）であって、１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。得られた刺激細胞（樹状細胞）１×１０⁵個を各々、反応細胞１×１０⁶個と、全量を１ｍＬとして４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）で混合培養を行った（反応細胞：樹状細胞＝１０：１）。培養は、約３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７日間行った。この混合培養溶液中に２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に４０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。樹状細胞及び反応細胞の混合培養開始から７日後に標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで全細胞中に占めるＢＭＬＦ１特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ（疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ）の割合を測定した。

ＨＬＡ−Ａ*０２０１ ＢＭＬＦ１テトラマー陽性、ＣＤ８陽性細胞が占める割合を算出する手順として、まずＰＥ標識されたＢＭＬＦ１テトラマー（ＭＢＬ）を培養後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。遮光の状態で室温１５分染色後、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、遮光の状態で４℃、１５分間染色した。コントロールには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定はＥｐｉｃｓ ＸＬ・ＭＣＬを用い、測定結果の解析にはＥｐｉｃｓ３２を用いた。

その結果を下記表１０に示す。同表に示すように、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）０〜２０μＭとＢＭＬＦ１で共感作した活性化樹状細胞は抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導することが確認された。また、ペプチドのみで感作された樹状細胞が誘導するＣＴＬの割合と比較すると、約３．２倍高くなることが確認された。

＜実施例６−１：人工抗原提示細胞株の作製＞
ＭＨＣクラスＩ分子を発現する乳がん由来の細胞株：ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ*０２０１）に、補助刺激分子であるヒトＣＤ８０遺伝子をリポフェクション法によりトランスフェクションし、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞でヒトＣＤ８０を安定に恒常的に発現する細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ／ＣＤ８０を樹立した。米国公開公報ＵＳ−２００５−００４８６４６−Ａ１に開示されるとおり、このＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞株の細胞は、抗原提示細胞として機能し、ＣＴＬを誘導することができる。

＜実施例６−２：Ｚｏｍｅｔａ（商品名）及び疾病抗原ペプチドで共感作した人工抗原提示細胞によって誘導された免疫担当細胞の性状の解析＞
上述のとおり調製した人工抗原提示細胞ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０の懸濁液にアミノビスホスホネート剤であるＺｏｍｅｔａ（商品名）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）をゾレドロン酸として０．０１μＭ又は１μＭとなるように添加し、同時に疾病抗原ペプチドとしてＭＡＲＴ−１抗原ペプチドＡ２７Ｌ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で約１２時間培養した。ネガティブコントロールには、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを添加せずに培養したＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞を用いた。

約１２時間の培養後、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）と抗原ペプチドを共感作した活性化ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞の一部を１５ｍＬチューブ（ＢＤファルコン）に回収し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットとなったＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し、洗浄した。洗浄作業を２回繰り返し行った。これにより回収されたＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞を刺激細胞とした。すなわち、ビスホスホネート及び疾病抗原ペプチドで共感作した活性化ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞、いずれか一方で感作させたＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞、及び、どちらも感作していないＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞を刺激細胞とした。また、反応細胞として、上述のとおり樹状細胞調製のためにＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団、ＨＬＡ−Ａ*０２０１）であって、１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して凍結保存されていた細胞を解凍、洗浄して用いた。

上述のようにして得られた刺激細胞（ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞）２×１０⁵個を各々、反応細胞２×１０⁶個と、全量を１ｍＬとして２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）で混合培養を行った（反応細胞：刺激細胞＝１０：１）。培養は約３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７日間行った。この混合培養溶液中に２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を加えると、よりよい細胞増殖が認められた。細胞の増殖が速い場合には、４〜６日目に４０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２、１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培地を１ｍＬ添加した。ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞と反応細胞の混合培養開始から７日後に標識抗体と抗原特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで全細胞中にしめるＡ２７Ｌ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ（疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ）の割合を、上述のように測定した。

その結果を下記表１１に示す。同表に示すとおり、Ｚｏｍｅｔａ（商品名）０．０１μＭ又は１μＭと、Ａ２７Ｌ ２μｇ／ｍＬとで共感作された活性化ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞は抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導することが確認された。また、この活性化ＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞を用いた場合、ペプチドのみで感作されたＭＤＡ−ＭＢ／ＣＤ８０細胞が誘導するＣＴＬの割合と比較すると、約６倍高くなることが確認された。

以上説明したように、本発明の活性化抗原提示細胞は疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを、従来のペプチドのみで感作した樹状細胞と比較して、非常に効率よく誘導することができ、さらにγδＴ細胞を誘導することが可能である。そのため投与用組成物として患者に投与することでｉｎ ｖｉｖｏにおいて疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を誘導し、がんや感染症に対する治療・予防効果が期待できる。さらにｉｎ ｖｉｔｒｏでは疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を誘導するための組成物として利用することができる。

Claims (35)

1. 抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネートと疾病抗原で前記抗原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処理方法。
2. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項１記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
3. 前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
   

   

   上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
   独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
   上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項１又は２記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
4. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される請求項１から３いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
5. 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである請求項１から４いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
6. 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである請求項５記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
7. 前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される請求項１から６いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
8. 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである請求項１から７いずれか一項記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
9. 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである請求項８記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
10. 活性化抗原提示細胞の生産方法であって、請求項１から９いずれか一項記載の活性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方法。
11. 請求項１０記載の生産方法により生産された活性化抗原提示細胞。
12. がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、請求項１１記載の活性化抗原提示細胞を含む医薬組成物。
13. 前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項１２記載の医薬組成物。
14. がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、請求項１１記載の活性化抗原提示細胞を投与することを含む予防・治療方法。
15. 前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項１４記載の予防・治療方法。
16. 免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことを特徴とする免疫担当細胞の誘導方法。
    （ｉ） ビスホスホネートと疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程。
    （ｉｉ）前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程。
17. 誘導される免疫担当細胞が、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びγδＴ細胞の少なくとも一方を含む請求項１６記載の免疫担当細胞の誘導方法。
18. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項１６又は１７記載の免疫担当細胞の誘導方法。
19. 前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
    

    

    上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
    独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
    上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項１６から１８記載の免疫担当細胞の誘導方法。
20. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される請求項１６から１９いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
21. 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである請求項１６から２０いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
22. 前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである請求項２１記載の免疫担当細胞の誘導方法。
23. 前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白、そのペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される請求項１６から２２いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
24. 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである請求項１６から２３いずれか一項記載の免疫担当細胞の誘導方法。
25. 前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである請求項２４記載の免疫担当細胞の誘導方法。
26. 免疫担当細胞の生産方法であって、請求項１６から２５いずれか一項記載の誘導方法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法。
27. 請求項記載の生産方法により生産された免疫担当細胞。
28. がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、請求項２７記載の免疫担当細胞を含む医薬組成物。
29. 前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項２８記載のがん及び／又は感染症のための医薬組成物。
30. がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、請求項２７記載の免疫担当細胞を投与することを含む予防・治療方法。
31. 前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項３０記載のがん及び／又は感染症の予防・治療方法。
32. ビスホスホネートを有効成分として含有する疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。
33. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項３２記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。
34. 前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
    

    

    上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ
    独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ₁とＲ₂は同じ環状構造の一部を形成し、
    上記Ｒ₁とＲ₂における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項３２又は３３記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。
35. 前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される請求項３２から３４いずれか一項記載の疾病抗原で感作する際の抗原提示細胞の活性化促進剤。

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