JPH08308574A - 細胞への遺伝子導入方法 - Google Patents
細胞への遺伝子導入方法Info
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- JPH08308574A JPH08308574A JP7121264A JP12126495A JPH08308574A JP H08308574 A JPH08308574 A JP H08308574A JP 7121264 A JP7121264 A JP 7121264A JP 12126495 A JP12126495 A JP 12126495A JP H08308574 A JPH08308574 A JP H08308574A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ウィルスをベクターとして、宿主細胞に遺伝
子を導入する方法において、あらかじめ宿主細胞をアフ
ィディコリンで処理し、この細胞に組換え遺伝子を有す
るウィルスを感染させることを特徴とする、細胞に遺伝
子を導入する方法。 【効果】 宿主細胞中へ有用な遺伝子を効率よく導入す
ることができる。その結果、医療上有用な遺伝子を導入
した細胞は、治療剤として高い治療効果を期待すること
ができる。
子を導入する方法において、あらかじめ宿主細胞をアフ
ィディコリンで処理し、この細胞に組換え遺伝子を有す
るウィルスを感染させることを特徴とする、細胞に遺伝
子を導入する方法。 【効果】 宿主細胞中へ有用な遺伝子を効率よく導入す
ることができる。その結果、医療上有用な遺伝子を導入
した細胞は、治療剤として高い治療効果を期待すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、宿主細胞に組換え遺伝
子を有するウィルスを感染させることにより、細胞に遺
伝子を効率よく導入する方法に関する。本発明により、
例えば欠陥遺伝子をもつ細胞にウィルスをベクターとし
て正常遺伝子が導入された細胞は、遺伝子疾患の治療剤
として用いることができる。また、標的細胞に治療上有
用な生体物質を産生する遺伝子を効率よく導入すること
により治療効果を上げることができる。
子を有するウィルスを感染させることにより、細胞に遺
伝子を効率よく導入する方法に関する。本発明により、
例えば欠陥遺伝子をもつ細胞にウィルスをベクターとし
て正常遺伝子が導入された細胞は、遺伝子疾患の治療剤
として用いることができる。また、標的細胞に治療上有
用な生体物質を産生する遺伝子を効率よく導入すること
により治療効果を上げることができる。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞に遺伝子を導入する方法とし
て、ウィルスをベクターとして用いる方法が知られてい
る。即ち、一般にウィルスが細胞に感染すると、自分の
遺伝子を宿主細胞の核内にもぐり込ませて自己増殖を行
うことができる性質を利用して、有用な遺伝子だけ取り
出して遺伝子組換え技術等により人工的にウィルスの遺
伝子中に予め組み込んでおいて、このウィルスを宿主細
胞に感染させると、有用な遺伝子を宿主細胞内に導入す
ることができる。そして、この遺伝子が導入された細胞
は有用な生体物質を産生するので、例えば、治療剤とし
て動物やヒトに用いることもできる。
て、ウィルスをベクターとして用いる方法が知られてい
る。即ち、一般にウィルスが細胞に感染すると、自分の
遺伝子を宿主細胞の核内にもぐり込ませて自己増殖を行
うことができる性質を利用して、有用な遺伝子だけ取り
出して遺伝子組換え技術等により人工的にウィルスの遺
伝子中に予め組み込んでおいて、このウィルスを宿主細
胞に感染させると、有用な遺伝子を宿主細胞内に導入す
ることができる。そして、この遺伝子が導入された細胞
は有用な生体物質を産生するので、例えば、治療剤とし
て動物やヒトに用いることもできる。
【０００３】例えば、HUMAN GENE THERAPY vol.6 p145-
153 (1995)には、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスベクターを用いて、抗生物質及び２
％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）培地中で、ヒト気管上皮細胞に感染処理
を行い、この遺伝子が組み込まれた細胞を培養すること
が記載されている。また、BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICA
L COMMUNICATIONS vol.195 p1174-1183 (1993)には、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだアデノウィルス
ベクターを用いて、ＲＰＭＩ培地中でヒト単核細胞に感
染処理を行い、この遺伝子を組み込んだ細胞を培養する
ことが記載されている。
153 (1995)には、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスベクターを用いて、抗生物質及び２
％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）培地中で、ヒト気管上皮細胞に感染処理
を行い、この遺伝子が組み込まれた細胞を培養すること
が記載されている。また、BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICA
L COMMUNICATIONS vol.195 p1174-1183 (1993)には、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだアデノウィルス
ベクターを用いて、ＲＰＭＩ培地中でヒト単核細胞に感
染処理を行い、この遺伝子を組み込んだ細胞を培養する
ことが記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし従来の方法で
は、細胞の種類によって細胞内への遺伝子の導入率が低
く、例えば大部分の血球系の細胞には導入率が非常に低
く適用できないという問題があった。また、導入率を高
めるために感染処理時間を長くすると、細胞に障害が生
じて宿主細胞の生存率が低下するという問題があった。
従って、従来の方法では、対象となる細胞が限られるた
めに治療の対象が特定されたり、遺伝子導入率が低いた
めに、遺伝子導入を行った細胞の治療剤としての効果が
十分に期待できない問題があった。
は、細胞の種類によって細胞内への遺伝子の導入率が低
く、例えば大部分の血球系の細胞には導入率が非常に低
く適用できないという問題があった。また、導入率を高
めるために感染処理時間を長くすると、細胞に障害が生
じて宿主細胞の生存率が低下するという問題があった。
従って、従来の方法では、対象となる細胞が限られるた
めに治療の対象が特定されたり、遺伝子導入率が低いた
めに、遺伝子導入を行った細胞の治療剤としての効果が
十分に期待できない問題があった。
【０００５】本発明は、種々の細胞に高い導入率で遺伝
子を導入することが可能で、且つ宿主細胞の生存率の低
下を最小限に抑えて、細胞に遺伝子を導入する方法を提
供することを目的とする。
子を導入することが可能で、且つ宿主細胞の生存率の低
下を最小限に抑えて、細胞に遺伝子を導入する方法を提
供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、あらかじめ宿
主細胞をアフィディコリンで処理し、この細胞に組換え
遺伝子を有するウィルスを感染させることを特徴とす
る、ウィルスをベクターとして細胞に遺伝子を導入する
方法である。
主細胞をアフィディコリンで処理し、この細胞に組換え
遺伝子を有するウィルスを感染させることを特徴とす
る、ウィルスをベクターとして細胞に遺伝子を導入する
方法である。
【０００７】以下本発明について詳細に説明する。本発
明でベクターとして用いられるウィルスは、宿主細胞に
感染し得るものであって、目的とする遺伝子を組み込む
ことができるものの中から選ばれるが、特に多種類の細
胞に感染可能で、培養し易く、組換え遺伝子を有するウ
ィルスの作製が容易であるものが好ましい。例えば、ア
デノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス
（ＡＡＶ）等のウィルスを挙げることができる。中でも
アデノウィルスは、感染力が強く、非分裂細胞にも感染
可能であるので特に好ましい。
明でベクターとして用いられるウィルスは、宿主細胞に
感染し得るものであって、目的とする遺伝子を組み込む
ことができるものの中から選ばれるが、特に多種類の細
胞に感染可能で、培養し易く、組換え遺伝子を有するウ
ィルスの作製が容易であるものが好ましい。例えば、ア
デノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス
（ＡＡＶ）等のウィルスを挙げることができる。中でも
アデノウィルスは、感染力が強く、非分裂細胞にも感染
可能であるので特に好ましい。
【０００８】このウィルスに組み込む遺伝子は、そのサ
イズがウィルスベクターに組み込み可能な範囲内のもの
であり、動物やヒトにとって有用な遺伝子である。ウィ
ルス中への遺伝子の組み込みは、公知の方法に準じて行
うことができる。例えばアデノウィルスへの遺伝子の組
み込みは、「バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入
と発現・解析法（羊土社、１９９４年、鐘ヶ江裕美他
著）」４３〜５８頁に記載されており、レトロウィルス
については、「Short protcols in molecular biology.
Second edition （John Wiley & Sons, 1992, New Yor
k 、Ausbel F.M.他著）」に記載されており、アデノ関
連ウィルスについては、「Viruses as therapeutic gen
e transfer vectors（Nienhuis A.W. 他著、Marcell De
kker inc.1993（Viruses and Bone Marrow, Young N.S.
編））」３５３〜４１４頁に記載されている。これら
の方法では、酵素やＤＮＡ合成装置などの遺伝子工学の
分野で一般に用いられている技術によって、ウイルス遺
伝子の不要部分を切りとり、代わりに有用な遺伝子をは
め込むことでウイルスベクターを作製する。
イズがウィルスベクターに組み込み可能な範囲内のもの
であり、動物やヒトにとって有用な遺伝子である。ウィ
ルス中への遺伝子の組み込みは、公知の方法に準じて行
うことができる。例えばアデノウィルスへの遺伝子の組
み込みは、「バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入
と発現・解析法（羊土社、１９９４年、鐘ヶ江裕美他
著）」４３〜５８頁に記載されており、レトロウィルス
については、「Short protcols in molecular biology.
Second edition （John Wiley & Sons, 1992, New Yor
k 、Ausbel F.M.他著）」に記載されており、アデノ関
連ウィルスについては、「Viruses as therapeutic gen
e transfer vectors（Nienhuis A.W. 他著、Marcell De
kker inc.1993（Viruses and Bone Marrow, Young N.S.
編））」３５３〜４１４頁に記載されている。これら
の方法では、酵素やＤＮＡ合成装置などの遺伝子工学の
分野で一般に用いられている技術によって、ウイルス遺
伝子の不要部分を切りとり、代わりに有用な遺伝子をは
め込むことでウイルスベクターを作製する。
【０００９】本発明で用いる宿主細胞は、目的に合わせ
て適宜選択することができる。例えばヒトの治療剤とし
て用いる場合は、血球系細胞等のヒト生体細胞が用いら
れ、本発明によれば、リンパ球、血球前駆細胞等の従来
の方法では遺伝子導入が困難であった細胞にも容易に遺
伝子を導入することができる。
て適宜選択することができる。例えばヒトの治療剤とし
て用いる場合は、血球系細胞等のヒト生体細胞が用いら
れ、本発明によれば、リンパ球、血球前駆細胞等の従来
の方法では遺伝子導入が困難であった細胞にも容易に遺
伝子を導入することができる。
【００１０】アファディコリンは次式の構造を有し、細
胞周期同調薬として細胞の増殖や分化の研究に従来から
用いられている化合物である。
胞周期同調薬として細胞の増殖や分化の研究に従来から
用いられている化合物である。
【００１１】
【化１】
【００１２】宿主細胞をアフィディコリンで処理するに
は、アフィディコリンを含む培地中で、１〜５０℃、好
ましくは３０〜４３℃、最も好ましくは３５〜３９℃
で、０．１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、１〜
１０％程度の炭酸ガスを含む空気中に、宿主細胞を保持
することによって行う。
は、アフィディコリンを含む培地中で、１〜５０℃、好
ましくは３０〜４３℃、最も好ましくは３５〜３９℃
で、０．１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、１〜
１０％程度の炭酸ガスを含む空気中に、宿主細胞を保持
することによって行う。
【００１３】アフィディコリンの濃度は、０．１〜１０
μg/ml、好ましくは０．１〜５μg/mlである。培地とし
ては、アミノ酸を０．０１〜１，０００mmol/l、好まし
くは０．１〜１００mmol/l含むものが適当であり、アミ
ノ酸としては、宿主細胞に合わせて適宜選択することが
できる。例えばヒトの細胞にウィルスを感染させる場合
には、必須アミノ酸２１種の中から数種を適宜選択して
水に溶解し培地とする。
μg/ml、好ましくは０．１〜５μg/mlである。培地とし
ては、アミノ酸を０．０１〜１，０００mmol/l、好まし
くは０．１〜１００mmol/l含むものが適当であり、アミ
ノ酸としては、宿主細胞に合わせて適宜選択することが
できる。例えばヒトの細胞にウィルスを感染させる場合
には、必須アミノ酸２１種の中から数種を適宜選択して
水に溶解し培地とする。
【００１４】この培地は、例えばＭＥＭ（Minimum Esse
ntial Medium：アルギニン、システィン、グルタミン、
アラニン、ロイシン、メチオニン等のアミノ酸を含
む）、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Mediu
m ：グルタミン、リシン、ロイシン、アルギニン、ヒス
チジン、セリン等のアミノ酸を含む）、ＲＰＭＩ１６４
０（アルギニン、グルタミン、アスパラギン、シスチン
等のアミノ酸を含む）等として一般的に知られ、また販
売されているものが使用される。培地には血清を必須成
分として含むものが適当であり、血清の濃度は、０．１
〜５０％、好ましくは１〜２０％であり、動物やヒトの
血清を用いることができる。
ntial Medium：アルギニン、システィン、グルタミン、
アラニン、ロイシン、メチオニン等のアミノ酸を含
む）、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Mediu
m ：グルタミン、リシン、ロイシン、アルギニン、ヒス
チジン、セリン等のアミノ酸を含む）、ＲＰＭＩ１６４
０（アルギニン、グルタミン、アスパラギン、シスチン
等のアミノ酸を含む）等として一般的に知られ、また販
売されているものが使用される。培地には血清を必須成
分として含むものが適当であり、血清の濃度は、０．１
〜５０％、好ましくは１〜２０％であり、動物やヒトの
血清を用いることができる。
【００１５】上記の培地には、必要に応じて、ｐＨを制
御するための緩衝剤、例えばＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子）等の増殖因子、その他の
添加剤が含まれていてもよい。
御するための緩衝剤、例えばＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子）等の増殖因子、その他の
添加剤が含まれていてもよい。
【００１６】アフィディコリン処理後、同じ培地を用い
て続けて次のウィルス感染処理を行ってもよいが、生存
率を向上させるためには、感染処理に先立ち、遠心分離
操作等によりアフィディコリンを培地から洗浄・除去す
ることが好ましい。
て続けて次のウィルス感染処理を行ってもよいが、生存
率を向上させるためには、感染処理に先立ち、遠心分離
操作等によりアフィディコリンを培地から洗浄・除去す
ることが好ましい。
【００１７】アフィディコリン処理の次に行う感染処理
は、ウィルスベクターと宿主細胞とを、ウィルス感染培
地中で共存させ、１〜５０℃、好ましくは３０〜４３
℃、最も好ましくは３５〜３９℃にて、０．１〜４８時
間、好ましくは１〜２４時間、１〜１０％程度の炭酸ガ
スを含む空気中に保持することによって行う。温度及び
感染時間は、ウィルス及び宿主細胞の種類により適宜決
定される。
は、ウィルスベクターと宿主細胞とを、ウィルス感染培
地中で共存させ、１〜５０℃、好ましくは３０〜４３
℃、最も好ましくは３５〜３９℃にて、０．１〜４８時
間、好ましくは１〜２４時間、１〜１０％程度の炭酸ガ
スを含む空気中に保持することによって行う。温度及び
感染時間は、ウィルス及び宿主細胞の種類により適宜決
定される。
【００１８】ウィルス感染培地は、アミノ酸を主成分と
して含む細胞培養培地であり、アミノ酸濃度は０．０１
〜１，０００mmol/l、好ましくは０．１〜１００mmol/l
である。アミノ酸の種類は、宿主細胞に合わせて適宜選
択することができる。例えばヒトの細胞にウィルスを感
染させる場合には、必須アミノ酸２１種の中から数種を
適宜選択して水に溶解し培地とする。ウィルス感染培地
として、上記ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の
細胞培養培地を使用してもよい。
して含む細胞培養培地であり、アミノ酸濃度は０．０１
〜１，０００mmol/l、好ましくは０．１〜１００mmol/l
である。アミノ酸の種類は、宿主細胞に合わせて適宜選
択することができる。例えばヒトの細胞にウィルスを感
染させる場合には、必須アミノ酸２１種の中から数種を
適宜選択して水に溶解し培地とする。ウィルス感染培地
として、上記ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の
細胞培養培地を使用してもよい。
【００１９】ウィルス感染培地には、血清等の細胞を生
存させるのに有効な成分が含まれていてもよい。なお、
血清の代りに上記のアミノ酸を主成分とする培地に無血
清成分、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、イン
シュリン、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、トランス
フェリン、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナト
リウム、リノール酸、コレステロール、大豆脂質等の物
質の中から選ばれる数種を添加してもよい。またＭｇ、
Ｃａ、Ｚｎのような２価金属イオン、特にＭｇイオンを
添加してもよい。
存させるのに有効な成分が含まれていてもよい。なお、
血清の代りに上記のアミノ酸を主成分とする培地に無血
清成分、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、イン
シュリン、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、トランス
フェリン、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナト
リウム、リノール酸、コレステロール、大豆脂質等の物
質の中から選ばれる数種を添加してもよい。またＭｇ、
Ｃａ、Ｚｎのような２価金属イオン、特にＭｇイオンを
添加してもよい。
【００２０】使用するウィルスの量は、１〜１，０００
moi、好ましくは、５〜２００moiである。少なすぎる
と十分に感染が起こらず、また貴重なウィルスを多量に
使用するのは実用的でないからである。なお、moi は次
式で示される単位である。 moi ＝ＰＦＵ／細胞数 （但し、ＰＦＵは、Plaque forming unit 、即ちウィル
スの力価である。）
moi、好ましくは、５〜２００moiである。少なすぎる
と十分に感染が起こらず、また貴重なウィルスを多量に
使用するのは実用的でないからである。なお、moi は次
式で示される単位である。 moi ＝ＰＦＵ／細胞数 （但し、ＰＦＵは、Plaque forming unit 、即ちウィル
スの力価である。）
【００２１】ウィルス感染処理後、宿主細胞を必要に応
じて同培地で培養することにより、遺伝子にコードされ
ているタンパク質を発現させることができる。またウィ
ルスによっては、遺伝子を導入した細胞を十分な数まで
さらに増殖させてもよい。
じて同培地で培養することにより、遺伝子にコードされ
ているタンパク質を発現させることができる。またウィ
ルスによっては、遺伝子を導入した細胞を十分な数まで
さらに増殖させてもよい。
【００２２】以上の一連の処理を行った細胞は、例えば
遺伝子疾患の治療剤として用いることができる。本発明
によれば遺伝子の導入率が高いので、治療上有用な遺伝
子を持った細胞を多数作製でき、これを用いて優れた治
療効果が期待できる。
遺伝子疾患の治療剤として用いることができる。本発明
によれば遺伝子の導入率が高いので、治療上有用な遺伝
子を持った細胞を多数作製でき、これを用いて優れた治
療効果が期待できる。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は、この実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は、この実施例に限定されるもので
はない。
【００２４】〔実施例１〕ＩＭＤＭ(Iscove's Modified
Dulbecco's Media、GIBCO 社）に、アフィディコリンを
濃度１μg/ml、ＦＣＳ（fetal calf serum、牛胎児血
清）を濃度１０ vol％及びＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子）を５ng/ml となるように加
えた培地中に、ヒト白血病細胞株ＴＦ−１を加え、５％
炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１６時間保持してアフ
ィディコリン処理を行った。その後、遠心分離操作によ
り１０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄し
てアフィディコリンを除去した。
Dulbecco's Media、GIBCO 社）に、アフィディコリンを
濃度１μg/ml、ＦＣＳ（fetal calf serum、牛胎児血
清）を濃度１０ vol％及びＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子）を５ng/ml となるように加
えた培地中に、ヒト白血病細胞株ＴＦ−１を加え、５％
炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１６時間保持してアフ
ィディコリン処理を行った。その後、遠心分離操作によ
り１０ vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄し
てアフィディコリンを除去した。
【００２５】一方、Journal of Virology vol.54 (198
5) ，７１１〜７１９頁に記載された方法を用いて、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子をアデノウィルスベクターに
組み込んだ。このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスと、アフィディコリン処理したヒト
白血病細胞株ＴＦ−１とを、２５moi の割合で、ウィル
ス感染培地として上記血清添加ＩＭＤＭ培地中に共存さ
せ、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１時間保持し
て感染処理を行った。ついで、遠心分離操作により１０
vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄してウィ
ルスを除去した。さらに、１０ vol％のＦＣＳ及び５ng
/ml のＧＭ−ＣＳＦを含むＩＭＤＭ培地中で、５％炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で２日間培養した。その結
果、遺伝子導入率は３３％であった。
5) ，７１１〜７１９頁に記載された方法を用いて、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子をアデノウィルスベクターに
組み込んだ。このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込
んだアデノウィルスと、アフィディコリン処理したヒト
白血病細胞株ＴＦ−１とを、２５moi の割合で、ウィル
ス感染培地として上記血清添加ＩＭＤＭ培地中に共存さ
せ、５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で１時間保持し
て感染処理を行った。ついで、遠心分離操作により１０
vol％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で３回洗浄してウィ
ルスを除去した。さらに、１０ vol％のＦＣＳ及び５ng
/ml のＧＭ−ＣＳＦを含むＩＭＤＭ培地中で、５％炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で２日間培養した。その結
果、遺伝子導入率は３３％であった。
【００２６】ここで、導入率の測定は次のように行っ
た。 導入率： Ｂｌｕｏ−ｇａｌ染色法；Journal of Neuroscience Re
search vol.36 p88に記載の Friedrichらの方法に準じ
て、０．５％のグルタルアルデヒドで固定後、１mmol/l
のＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳ（Phosphate buffered salin
e)で３回洗浄後、１mg/ml のｂｌｕｏ−ｇａｌ、０．０
０５mol/l のＫ3 Ｆｅ（ＣＮ)6、及び１mmol/lのＭｇＣ
ｌ2 を含むＰＢＳ中で３７℃、２４時間反応させ、血球
計算盤上で染色された細胞（導入細胞）と非染色細胞
（非導入細胞）をカウントして測定する。
た。 導入率： Ｂｌｕｏ−ｇａｌ染色法；Journal of Neuroscience Re
search vol.36 p88に記載の Friedrichらの方法に準じ
て、０．５％のグルタルアルデヒドで固定後、１mmol/l
のＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳ（Phosphate buffered salin
e)で３回洗浄後、１mg/ml のｂｌｕｏ−ｇａｌ、０．０
０５mol/l のＫ3 Ｆｅ（ＣＮ)6、及び１mmol/lのＭｇＣ
ｌ2 を含むＰＢＳ中で３７℃、２４時間反応させ、血球
計算盤上で染色された細胞（導入細胞）と非染色細胞
（非導入細胞）をカウントして測定する。
【００２７】〔比較例１〕実施例１において、アフィデ
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同
様に操作し、ＴＦ−１細胞中に遺伝子導入を行った。そ
の結果、遺伝子導入率は９．６％と低かった。
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同
様に操作し、ＴＦ−１細胞中に遺伝子導入を行った。そ
の結果、遺伝子導入率は９．６％と低かった。
【００２８】〔実施例２〕実施例１において、宿主細胞
としてヒト白血病細胞株Ｋ５６２を用い、アフィディコ
リン処理を、１μg/mlのアフィディコリン及び１０ vol
％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）か
らなる培地中で行った。ウィルス感染培地としてＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を用いて感染処理し、その後ウィルス除
去後に、１０ vol％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地中で培養した以外は、実施例１と同様に操作して、Ｋ
５６２細胞中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入し
た。その結果、遺伝子導入率は１１％であった。
としてヒト白血病細胞株Ｋ５６２を用い、アフィディコ
リン処理を、１μg/mlのアフィディコリン及び１０ vol
％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）か
らなる培地中で行った。ウィルス感染培地としてＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を用いて感染処理し、その後ウィルス除
去後に、１０ vol％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培
地中で培養した以外は、実施例１と同様に操作して、Ｋ
５６２細胞中にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入し
た。その結果、遺伝子導入率は１１％であった。
【００２９】〔比較例２〕実施例２において、アフィデ
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例２と同
様に操作し、Ｋ５６２細胞中に遺伝子を導入した。その
結果、遺伝子導入率は３．７％と低かった。
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例２と同
様に操作し、Ｋ５６２細胞中に遺伝子を導入した。その
結果、遺伝子導入率は３．７％と低かった。
【００３０】〔実施例３〕実施例１において、宿主細胞
としてヒト白血病細胞株ＣＭＫを用い、アフィディコリ
ン処理を、１μg/mlのアフィディコリン及び１０ vol％
のＦＣＳを含むＩＭＤＭからなる培地中で行った。ウィ
ルス感染処理し、その後ウィルス除去後に、１０ vol％
のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で培養した以外は、実施
例１と同様に操作して、ＣＭＫ細胞中にβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を導入した。その結果、遺伝子導入率は
３．５％であった。
としてヒト白血病細胞株ＣＭＫを用い、アフィディコリ
ン処理を、１μg/mlのアフィディコリン及び１０ vol％
のＦＣＳを含むＩＭＤＭからなる培地中で行った。ウィ
ルス感染処理し、その後ウィルス除去後に、１０ vol％
のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で培養した以外は、実施
例１と同様に操作して、ＣＭＫ細胞中にβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を導入した。その結果、遺伝子導入率は
３．５％であった。
【００３１】〔比較例３〕実施例３において、アフィデ
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例３と同
様に操作し、ＣＭＫ細胞中に遺伝子を導入した。その結
果、遺伝子導入率は０．２％と低かった。
ィコリン処理を行わなかったこと以外は、実施例３と同
様に操作し、ＣＭＫ細胞中に遺伝子を導入した。その結
果、遺伝子導入率は０．２％と低かった。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、宿主細胞をアフィディコ
リンで処理することにより、ウィルスをベクターとして
用いて、宿主細胞中へ有用な遺伝子を効率よく導入する
ことができる。その結果、医療上有用な遺伝子を導入し
た細胞は、治療剤として高い治療効果を期待することが
できる。
リンで処理することにより、ウィルスをベクターとして
用いて、宿主細胞中へ有用な遺伝子を効率よく導入する
ことができる。その結果、医療上有用な遺伝子を導入し
た細胞は、治療剤として高い治療効果を期待することが
できる。
Claims (1)
- 【請求項１】 ウィルスをベクターとして、宿主細胞に
遺伝子を導入する方法において、あらかじめ宿主細胞を
アフィディコリンで処理し、この細胞に組換え遺伝子を
有するウィルスを感染させることを特徴とする、細胞に
遺伝子を導入する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7121264A JPH08308574A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7121264A JPH08308574A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308574A true JPH08308574A (ja) | 1996-11-26 |
Family
ID=14806955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7121264A Pending JPH08308574A (ja) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | 細胞への遺伝子導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08308574A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109801A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-09-27 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 一种慢病毒转染助转剂及其应用 |
-
1995
- 1995-05-19 JP JP7121264A patent/JPH08308574A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109801A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-09-27 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 一种慢病毒转染助转剂及其应用 |
| CN115109801B (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-22 | 深圳市先康达生命科学有限公司 | 一种慢病毒转染助转剂及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040323 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040713 |