CN113402591A

CN113402591A - 基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN113402591A
Application number: CN202110740587.XA
Authority: CN
Inventors: 李丁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明公开了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞，用于表达棘突蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示序列。所述制备方法包括：构建表达棘突蛋白的腺病毒载体、制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒、纯化富集腺病毒颗粒、获取间充质干细胞、获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞。本发明的疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新型冠状病毒的预防提供了全新的选择。

Description

基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

2019-nCov病毒感染者的症状一般为发热、乏力、干咳、头疼，逐渐出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，甚至死亡。病毒潜伏期最短有1天发病，最长的潜伏期是14天，潜伏期具有传染性。

然而，目前没有特别有效的治疗手段，对患者主要采用先隔离，然后雾化吸入α-干扰素，口服洛匹那韦/利托那韦，及短期内使用糖皮质激素。然而这些治疗方法的有效率并不高。病毒感染造成的肺纤维化(pulmonary fibrosis)也是发病中重要的临床表现，肺纤维化可对肺造成不可逆的伤害，可导致进行性呼吸困难，肺功能受损，严重者可致死亡。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。

研究发现，MSCs是一种幼稚的发育早期的具有分化潜能的细胞，它具有以下几种特性： 1)具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；2)具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；3)趋化性：MSCs可以向受损组织、肿瘤部位迁移；4)具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性；5)由于无主要组织相容性复合体的表达，几乎无免疫排斥，异体移植免疫排异较轻，配型要求不严格。正是由于间充质干细胞所具备的这些独特的免疫学特性，使其在临床治疗方面具有广阔的临床应用前景。

鉴于此，业界亟需发展出一种安全性高、可靠有效的新型冠状病毒疫苗。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题在于提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗及其制备方法与应用，该干细胞可在体内长时间滞留，高效分泌新型冠状病毒棘突蛋白，启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，避免病毒对人体的感染。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：

本发明实施例提供了一种棘突蛋白，用于表达棘突蛋白的核苷酸序列具有SEQ IDNO：2 所示序列，或者与SEQ ID NO：2的全长序列95％以上相同的序列。即，本发明实施例提供的棘突蛋白的核苷酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。

本发明实施例还提供了用于编码所述棘突蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述的编码基因具有SEQ ID NO：1所示序列或者与SEQ IDNO：1的全长序列95％以上相同的序列。

本发明实施例还提供了一种重组腺病毒载体，其包含所述棘突蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述重组腺病毒载体包括但不限于pAd/CMV/V5-DEST等。

本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其包含所述棘突蛋白的编码基因。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的干细胞；以及，医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了所述棘突蛋白或免疫组合物在制备新型冠状病毒疫苗中的用途。

本发明实施例还提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗包含前述棘突蛋白、重组腺病毒载体、宿主细胞，或者免疫组合物。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白编码基因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒疫苗可应用于预防新型冠状病毒。

本发明实施例还提供了所述基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法，其包括：

(1)通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；

(2)采用步骤(1)构建的腺病毒载体转染细胞，制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(3)纯化富集步骤(2)所获棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(4)采用富集的棘突蛋白重组腺病毒颗粒对间充质干细胞进行感染，获得棘突蛋白编码基因修饰的间充质干细胞。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明将细胞治疗和基因治疗相结合，以三聚体形式的棘突蛋白修饰的间充质干细胞作为疫苗的活性成分，具有方便获取的优势，其可以补充局部干细胞数量，并高效分泌三聚体棘突蛋白及人源性生长因子(如EGF、bFGF等)，在来改善局部微环境及免疫调节的同时，刺激机体产生针对新型冠状病毒的中和性抗体，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景；

(2)本发明通过基因修饰的手段使得脐带来源间充质干细胞高效表达三聚体棘突蛋白，以最接近病毒棘突蛋白的天然形态对个体进行免疫，从而有效防御病毒；

(3)本发明从脐带中分离间充质干细胞，能大量扩增治疗用细胞的数量，并克服从骨髓获取间充质干细胞数量少、取材具有创伤性等特点，降低了生产及使用成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中新型冠状病毒棘突蛋白的结构域示意图；

图2为本发明实施例1中新型冠状病毒棘突蛋白的RBD区域抗原性分析图；

图3为本发明实施例1中腺病毒载体pAD/CMV/Spike的结构示意图；

图4为本发明实施例1中新型冠状病毒疫苗的制备流程示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面主要是提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，该干细胞可在体内长时间滞留，高效分泌新型冠状病毒棘突蛋白，启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，避免病毒对人体的感染。

例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗包含前述棘突蛋白、重组腺病毒载体、宿主细胞，或者免疫组合物。

在一些具体实施方式中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组腺病毒感染来获得棘突蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞的表面。

进一步的，所述棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达，表达棘突蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。

进一步的，所述棘突蛋白与新型冠状病毒的表面糖蛋白相同，新型冠状病毒的表面糖蛋白编码核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法，其主要包括构建表达棘突蛋白的腺病毒载体、制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒、纯化富集腺病毒颗粒、获取间充质干细胞、获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞等步骤。

在一些实施方式中，所述制备方法包括：

(1)通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；

(3)纯化富集步骤(2)所获棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

在本发明实施例的一个更具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；

(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用步骤(1)中的表达棘突蛋白的腺病毒载体分别转染人胚肾细胞HEK293T制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(3)纯化富集腺病毒颗粒：把步骤(2)中可表达棘突蛋白的重组腺病毒颗粒进行纯化富集；

(4)获取间充质干细胞：从脐带分离间充质干细胞，选择第2-3代处于对数生长期的间充质干细胞；

(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：待步骤(4)中的间充质干细胞生长至70-80％汇合度时，用富集的腺病毒颗粒混合物进行感染，获得棘突蛋白编码基因修饰的间充质干细胞。

本发明实施例的该具体实施方案中，将细胞治疗和基因治疗相结合，以三聚体形式的棘突蛋白修饰的间充质干细胞作为疫苗的活性成分，具有方便获取的优势，其可以补充局部干细胞数量，并高效分泌三聚体棘突蛋白及人源性生长因子(如EGF、bFGF等)，在来改善局部微环境及免疫调节的同时，刺激机体产生针对新型冠状病毒的中和性抗体，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景。

本发明实施例的该具体实施方案中，通过基因修饰的手段使得脐带来源间充质干细胞高效表达三聚体棘突蛋白，以最接近病毒棘突蛋白的天然形态对个体进行免疫，从而有效防御病毒。

本发明实施例的该具体实施方案中，从脐带中分离间充质干细胞，能大量扩增治疗用细胞的数量，并克服从骨髓获取间充质干细胞数量少、取材具有创伤性等特点，降低了生产及使用成本。

综上所述，本发明的基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新型冠状病毒的预防提供了全新的选择。

下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1

本发明实施例的一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒疫苗可应用于预防新型冠状病毒。

其中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组腺病毒感染来获得棘突蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞的表面。

参照附图1～图2，棘突蛋白为新型冠状病毒的表面糖蛋白(Surfaceglycoprotein)，该蛋白不包含TMPRSS2蛋白酶切割位点，其密码子经过优化，在真核细胞内可高效翻译，具体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，新型冠状病毒的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，具体为：

参照附图3，棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达。具体的，表达棘突蛋白的表达序列从5’端到3’端依次为CMV启动子、密码子优化的棘突蛋白基因开放读码框、HBB基因3`-UTR、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的加尾信号(TKpA)。表达棘突蛋白的表达序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

参照附图4，本实施例中一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：从NCBI GenBank中下载棘突蛋白的基因序列 (MN908947：nt21563-25384)，用GeneOptimizer对棘突蛋白的开放读码框进行密码子优化，把优化后的棘突蛋白编码序列通过人工合成的方法导入pENTR1A载体(A10462，ThermoFisher)的BamHI和XhoI酶切位点之间，分别命名为pENTR1A-_COV19Spike；使用Gateway LR Clonase II Enzyme(11791-020，ThermoFisher)把棘突蛋白从pENTR1A-_COV19Spike 转移到pAd/CMV/V5-DEST腺病毒表达载体(V493-20，ThermoFisher)中，分别命名为 pAd-CMV-_COV19Spike。

(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用限制性内切酶PacI(R0547S，New EnglandBiolabs) 分别对5μg pAd-CMV-_COV19Spike进行酶切，使质粒线性化，用异丙醇纯化线性化的DNA片段。利用Lipofectamine 2000(11668-019，ThermoFisher)把线性化pAd-CMV-_COVl9Spike转染 HEK293细胞；转染的HEK293在培养过程中要观察细胞生长情况，约2周后可观察到细胞病变(cytopathic effect，CPE)出现。转染10-14天后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS 混悬，反复冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃；取30-50％上清，感染70％汇合度的T25 细胞培养瓶中的293细胞，培养2-3天后出现明显细胞病变；3-5天后，当1/3的细胞漂浮时收集细胞沉淀，PBS重悬后反复冻融，离心后收集上清并保存于-80℃环境中；

(3)纯化富集腺病毒颗粒：取5μl病毒上清加入5μl 2×PBS，煮沸5分钟，离心后取1-2μl 作为模板进行PCR，检测棘突蛋白的编码基因，然后将步骤(2)中可表达棘突蛋白的腺病毒颗粒进行纯化富集；

(4)获取间充质干细胞：无菌条件下，用无血清低糖DMEM培养基(11885092，Lowglucose DMEM，ThermoFisher)冲洗5-10克正常脐带组织，去除血污，在灭菌处理过的培养皿中把脐带组织剪碎为细颗粒状，再用低糖DMEM培养基清洗3次，直至组织碎块变为灰白色。将剪碎的组织碎块转入含有1mg/ml胶原酶(C1639，Collagenase，Sigma)的低糖DMEM 培养基中，完全浸没组织碎块，置于37℃细胞培养箱中充分消化2小时。常温下1000rpm离心5分钟，弃上清，用低糖DMEM重悬沉淀。将组织碎块悬液转入T25细胞培养瓶(430168，Corning)，用含20％胎牛血清(10438026，Fetal Bovine Serum，ThermoFisher)的低糖DMEM培养，置于37℃5％CO₂恒温细胞培养箱。当细胞约80％汇合时用0.25％胰酶消化细胞进行传代培养。取第2-3代细胞，使用流式细胞术检测细胞表面分子标志(CD14-、CD34-、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+)，来验证所培养的细胞是否具有间充质干细胞的表型。本发明中脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14-、CD34-和CD45-，由此可见培养的细胞为间充质干细胞。

(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：用T175cm²培养瓶(431080， Corning)培养人脐带间充质干细胞，当细胞汇合度达到70％时，把表达棘突蛋白的腺病毒颗粒加入到T175cm²培养瓶中，混匀，37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养24-48小时，加入胰酶进行消化，制备细胞悬液。

实施例2

本实施例通过小鼠实验来对本发明做进一步说明。

将10只小鼠分成两组，A组5只，B组5只，将它们放置在相同的环境下生活：

A组注射疫苗：把1×10⁷个棘突蛋白编码基因修饰人脐带间充质干细胞用胰酶消化，充分吹打成单细胞悬液，2000rpm离心收集细胞沉淀，用2ml医用生理盐水把沉淀重新悬浮；用微量注射器把棘突蛋白编码基因修饰间充质干细胞分别注入5只小鼠腹腔，每次注射100μl，每隔1-2周注射一次，注射3次；

B组注射生理盐水：用微量注射器把医用生理盐水分别注入另外5只小鼠腹腔，每次注射100μl，每隔1-2周注射一次，注射3次；

最后，分别取A、B组的小鼠血清，通过ELISA法检测中和抗体，其抗体检测情况如表1所示：

表1：中和抗体浓度检测结果

由上表数据可看出，注射本发明的基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，能够有效地对机体进行免疫，诱导机体产生针对棘突蛋白的中和抗体，并且抗体能够长期稳定保存在机体内，本发明的疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新型冠状病毒的预防提供了一个全新的选择。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 李丁

<120> 基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2685

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒（novel coronavirus）(新型冠状病毒（novel coronavirus）)

<400> 1

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag 720

tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat 780

ccacagacac ttgagattct tgacattaca ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata 840

acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt atcaggatgt taactgcaca 900

gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactccta cttggcgtgt ttattctaca 960

ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac 1020

tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca ggtatatgcg ctagttatca gactcagact 1080

aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct agtcaatcca tcattgccta cactatgtca 1140

cttggtgcag aaaattcagt tgcttactct aataactcta ttgccatacc cacaaatttt 1200

actattagtg ttaccacaga aattctacca gtgtctatga ccaagacatc agtagattgt 1260

acaatgtaca tttgtggtga ttcaactgaa tgcagcaatc ttttgttgca atatggcagt 1320

ttttgtacac aattaaaccg tgctttaact ggaatagctg ttgaacaaga caaaaacacc 1380

caagaagttt ttgcacaagt caaacaaatt tacaaaacac caccaattaa agattttggt 1440

ggttttaatt tttcacaaat attaccagat ccatcaaaac caagcaagag gtcatttatt 1500

gaagatctac ttttcaacaa agtgacactt gcagatgctg gcttcatcaa acaatatggt 1560

gattgccttg gtgatattgc tgctagagac ctcatttgtg cacaaaagtt taacggcctt 1620

actgttttgc cacctttgct cacagatgaa atgattgctc aatacacttc tgcactgtta 1680

gcgggtacaa tcacttctgg ttggaccttt ggtgcaggtg ctgcattaca aataccattt 1740

gctatgcaaa tggcttatag gtttaatggt attggagtta cacagaatgt tctctatgag 1800

aaccaaaaat tgattgccaa ccaatttaat agtgctattg gcaaaattca agactcactt 1860

tcttccacag caagtgcact tggaaaactt caagatgtgg tcaaccaaaa tgcacaagct 1920

ttaaacacgc ttgttaaaca acttagctcc aattttggtg caatttcaag tgttttaaat 1980

gatatccttt cacgtcttga caaagttgag gctgaagtgc aaattgatag gttgatcaca 2040

ggcagacttc aaagtttgca gacatatgtg actcaacaat taattagagc tgcagaaatc 2100

agagcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtcagagt gtgtacttgg acaatcaaaa 2160

agagttgatt tttgtggaaa gggctatcat cttatgtcct tccctcagtc agcacctcat 2220

ggtgtagtct tcttgcatgt gacttatgtc cctgcacaag aaaagaactt cacaactgct 2280

cctgccattt gtcatgatgg aaaagcacac tttcctcgtg aaggtgtctt tgtttcaaat 2340

ggcacacact ggtttgtaac acaaaggaat ttttatgaac cacaaatcat tactacagac 2400

aacacatttg tgtctggtaa ctgtgatgtt gtaataggaa ttgtcaacaa cacagtttat 2460

gatcctttgc aacctgaatt agactcattc aaggaggagt tagataaata ttttaagaat 2520

catacatcac cagatgttga tttaggtgac atctctggca ttaatgcttc agttgtaaac 2580

attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gttgccaaga atttaaatga atctctcatc 2640

gatctccaag aacttggaaa gtatgagcag tatataaaat ggcca 2685

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gccaccatgc tggtcatggc gccccgaacc gtcctcctgc tgctctcggc ggccctggcc 60

ctgaccgaga cctgggccgg ctcccactcc atgagg 96

<210> 3

<211> 895

<212> PRT

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn

275 280 285

Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val

290 295 300

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr

305 310 315 320

Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

325 330 335

His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

340 345 350

Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser

355 360 365

Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu

370 375 380

Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe

385 390 395 400

Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr

405 410 415

Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser

420 425 430

Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala

435 440 445

Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe

450 455 460

Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly

465 470 475 480

Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys

485 490 495

Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp

500 505 510

Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala

515 520 525

Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro

530 535 540

Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu

545 550 555 560

Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu

565 570 575

Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly

580 585 590

Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln

595 600 605

Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala

610 615 620

Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala

625 630 635 640

Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser

645 650 655

Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu

660 665 670

Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr

675 680 685

Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala

690 695 700

Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

705 710 715 720

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln

725 730 735

Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

740 745 750

Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys

755 760 765

Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp

770 775 780

Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp

785 790 795 800

Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn

805 810 815

Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu

820 825 830

Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu

835 840 845

Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

850 855 860

Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile

865 870 875 880

Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro

885 890 895

Claims

1.棘突蛋白，用于表达棘突蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示序列。

2.用于编码权利要求1所述棘突蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：它具有SEQ ID NO：1所示序列。

4.重组腺病毒载体，其包含权利要求1所述棘突蛋白的编码基因。

5.如权利要求4所述的重组腺病毒载体，其特征在于：所述重组腺病毒载体包括pAd/CMV/V5-DEST。

6.宿主细胞，其包含权利要求1所述棘突蛋白的编码基因。

7.一种免疫组合物，其特征在于包括：三聚体形式的、权利要求1所述的棘突蛋白基因修饰的干细胞；以及，医药学上可接受的载剂。

8.如权利要求1所述棘突蛋白或权利要求7所述免疫组合物在制备新型冠状病毒疫苗中的用途。

9.一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述棘突蛋白、权利要求4或5所述的重组腺病毒载体、权利要求6所述的宿主细胞，或者权利要求7所述的免疫组合物，优选的，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白编码基因修饰的间充质干细胞。

10.如权利要求9所述的新型冠状病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括：

(1)通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；

(3)纯化富集步骤(2)所获棘突蛋白重组腺病毒颗粒；