WO2007034809A1 - 組み換え蛋白質産生のための宿主細胞 - Google Patents

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WO2007034809A1
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Hideharu Taira
Tetsuro Yamashita
Masao Miyazaki
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Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a host cell for producing a recombinant protein, and use of the cell.
  • the present invention relates to a host cell for producing a recombinant protein isolated from a mammal, and use of the cell.
  • Prokaryotic cell systems include E. coli and related bacteria (eg, E. coli, Pseudomonas, Zymomonas, Thermus, etc.), Bacillus subtilis and related bacteria (eg actinomycetes, lactic acid bacteria, amino acid producing bacteria, acetic acid Bacteria, thermophilic bacteria, etc.).
  • E. coli and related bacteria eg, E. coli, Pseudomonas, Zymomonas, Thermus, etc.
  • Bacillus subtilis and related bacteria eg actinomycetes, lactic acid bacteria, amino acid producing bacteria, acetic acid Bacteria, thermophilic bacteria, etc.
  • yeast filamentous fungi
  • plant culture cells e. baculovirus vectors
  • insect culture cells baculovirus vectors
  • cauxin a glycoprotein with a molecular weight of 60 kDa, which is named cauxin, is excreted at a high concentration of about 1 mg / ml in cat urine. It has been reported that cauxin is produced by distal tubular epithelial cells and secreted from the aviation membrane (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Miyazaki, M., Kamiie, K., Soeta, S "Taira, H” and Yamashita, T .: Molecular cloning and characterization of a novel carboxylesterase— like protein that is physiologically present at high concentration in the urine of domestic cats (Pelis cat us) Biochem.J., 370, 101-110 (2003)
  • the present invention provides a host cell that can be grown in a serum-free medium, can synthesize and secrete a large amount of the target protein, and can produce a glycoprotein having a sugar chain structure.
  • a problem to be solved can be solved.
  • a cell line in which a distal tubular epithelial cell force derived from a mammal is established.
  • the cell line of the present invention is used as a host cell for producing a recombinant protein.
  • the cell line of the present invention is derived from a cat.
  • the cell line of the present invention has a gene encoding a foreign immortalization factor.
  • the cell line of the present invention has a foreign selectable marker gene.
  • the cell line of the present invention can be grown in a serum-free medium.
  • the cell line of the present invention is a cell having the accession number FERM BP-10643.
  • a transformant obtained by introducing a gene encoding a target protein to be expressed into the above-described cell line of the present invention.
  • a foreign gene is introduced into the above-described cell line of the present invention to produce a transformed cell, and the resulting transformed cell is cultured to produce a recombinant protein encoded by the foreign gene. Recombinant protein can be recovered.
  • the produced recombinant protein is modified with a sugar chain.
  • the cell of the present invention is a cell line established from a distal tubular epithelial cell derived from a mammal.
  • mammals include cats, dogs, rabbits, guinea pigs, rats, musters, rats, mice, humans, and the like. Cats are preferred.
  • the cells of the present invention can also collect, for example, feline kidney strength.
  • the kidneys removed from the cat were treated with Joklik buffer (111 mM NaCl, 24 mM NaHCO 3, 10 mM Na HPO, 5.4 mM KCl,
  • Treat the cells with the lysing solution remove the cell mass from the dissociated cells, and collect the cells by centrifugation.
  • the cells can then be suspended in Eagle MEM medium 1 (Nissi), and distal tubular cells can be separated and collected by Percoll density gradient centrifugation.
  • DME-F12 medium Suspend in DME-F12 medium and incubate on collagen coated dish.
  • Cells can be established by introducing an immortalization factor and a selection gene into the distal tubule-derived cells isolated as described above.
  • An immortal acquisition factor means a factor that immortalizes a cell when the factor is introduced into the cell.
  • Epstein-Barr virus (EBV) Simian virus 40 (SV40) T antigen ⁇ 3 ⁇ 4V40 large It is necessary to use the power of S antigen, adenovirus E1A, adenovirus E1B, human papillomavirus (HPV) E6, HPV E7, and telomerase reverse transcriptase protein (hTERT).
  • EBV Epstein-Barr virus
  • SV40 Simian virus 40
  • S antigen a factor that immortalizes a cell when the factor is introduced into the cell.
  • adenovirus E1A adenovirus E1B
  • HPV human papillomavirus
  • hTERT telomerase reverse transcriptase protein
  • selectable marker gene a drug
  • a neomycin resistance gene for example, a puromycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a zeocin resistance gene and the like can be used.
  • Introduction of a gene encoding an immortal acquisition factor and a selectable marker gene can be carried out by an ordinary transfection method. After transfection, the medium is replaced with a selective medium (for example, if a drug resistance gene is introduced, the medium containing the drug), and the selection marker gene is stably introduced, and cells that can stably grow By selecting the strain, the cell line of the present invention can be established.
  • FKD cells (indication for identification: FKD) obtained in the following examples, which are examples of the cells of the present invention, are given the accession number FERM P-20605 in 2005.
  • FERM P-20605 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), Patent Biological Depositary Center (T 305-85 66, Ibaraki, Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1st, 6th)
  • FERM BP—10643 was transferred to the international deposit under the “Budapest Convention on the International Approval of Deposits of Microorganisms in Patent Procedures”.
  • the established cell line of the present invention established as described above can be cultured according to a normal method for culturing animal cells.
  • Common culture media such as RPM11640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952)), DMEM (Virology, 8 , 396 (1959)], DMEM—F12 medium, and the like can be used.
  • a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums can also be used.
  • the cells of the present invention can be grown in a serum-free medium, There is no need to add serum.
  • the medium may be appropriately supplemented with insulin, transferrin, selenium, etc.
  • Cultivation can usually be performed under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as neomycin
  • a gene encoding the recombinant protein is inserted downstream of the promoter in an appropriate expression vector, and then the gene The expression vector into which is inserted is introduced into the cell of the present invention.
  • a vector that can replicate autonomously in the cell of the present invention or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the target gene can be transcribed can be used.
  • expression vectors include pCHHO (PL), pcDNAI, pcDM8 (Funakoshi), pcD NAI / AmP (invitrogen), pREP4 (invitrogen), pCDNA3 (invitrogen), pCMVscript, stratagene), pS (j5 (stratagene), pZeoSV2 (invitrogen), pEFl / V5 HisA / B / C (invitrogen), pEF-Bos-Myc, pREP4 (invitrogen), pBK-RSV (stratagene) and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • cytomegalovirus (human CMV) IE immediate early gene promoter
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus Promoters SV40 early promoter
  • metamouthone promoters SV40 early promoter
  • heat shock promoters SRa promoters
  • a method for introducing the recombinant expression vector into the cell of the present invention a usual method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • a usual method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • an electopore method, a calcium phosphate method, a lipofusion method, or the like can be used.
  • recombinant protein expression methods such as secretory production and fusion protein expression can be performed.
  • a protein with an added sugar or sugar chain can be obtained.
  • a transformant obtained by introducing a gene encoding a target protein to be expressed into the cells of the present invention is cultured in a suitable medium, and the target protein is produced and accumulated in the culture. By collecting the protein, the target protein can be produced. Proteins produced by force are also within the scope of the present invention.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing the transformant As a medium for culturing the transformant, a commonly used RPM11640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)] ], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], DMEM-F12 medium, etc. can be used. Alternatively, a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums can also be used. However, since the cells of the present invention can grow in a serum-free medium, there is no need to add serum.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% C0.
  • antibiotics such as neomycin
  • the cells are collected by centrifugation after suspension of the cells, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a manton. Crush the cells with a Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent,
  • Anion exchange chromatography using resin such as Jetylaminoethyl (DEAE) Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), Cation exchange chromatography using resin such as S- Sepharose FF (Falmacia)
  • Electrophoretic methods such as chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Use a method such as Obtainable.
  • the protein When the recombinant protein is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the protein is similarly collected from the precipitate fraction obtained by crushing and centrifuging, and the protein is obtained by a conventional method. After recovery, the insoluble matter of the protein is solubilized with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a dilute solution that does not contain a protein denaturant or the concentration of the protein denaturant does not denature the protein, and then the protein is formed into a normal three-dimensional structure. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein or a derivative such as a sugar chain adduct can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
  • the cat distal tubule-derived epithelial cells were prepared as follows according to the method of tissue culture technique (2nd edition) edited by the Japanese Tissue Culture Society, Asakura Shoten 7-4 Kidney Cell Culture Method (pages 141-145). Anesthetize the cat and aseptically remove the kidney with a scalpel in Joklik buffer (111 mM NaCl, 24 mM NaHC O, 10 mM Na HPO, 5.4 mM KC1, 1 mM Mg SO, 11 mM glucose).
  • Example 2 Establishment of FKD cells PSV3-neo (ATCC37150) was transferred to the distal tubule-derived cells isolated in Example 1 using Lipofectamine-Plus (Invitrogen). 48 hours after transfection, the medium was changed to G418-containing medium, and stable mutagenesis strains were selected. The obtained FKD cells are shown in FIG. Proliferated cells were passaged and stored in liquid nitrogen.
  • the expression efficiency pCHl10 (Pharmacia) in which LacZ was bound to the SV40 promoter was used to examine the efficiency of the transfection. Transfusion was performed using Lipofectamine—PlusQnvitrogen). As the cells, FKD cells, COS cells and HeLa cells were used. After 24 hours, the cells were fixed by removing the medium, rinsing once with 1.5 ml of PBS, and allowing 1.5 ml of Fixative solution to stand for 10 minutes. Cells were rinsed twice with 1.5 ml PBS and incubated with 1.25 ml Staining solution ( ⁇ -gal Staining Kit (Invitrogen)). After 3 hours, the percentage power of the stained cells also confirmed the efficiency of expression. The result is shown in figure 2. The FKD cells of the present invention showed higher gene transfer efficiency than COS cells and HeLa cells.
  • Example 5 Creation of proliferation curves of FKD cells and COS cells (Fig. 3)
  • FKD cells were analyzed for cell growth in serum-free medium / serum medium and COS cells in serum medium. FKD cells were mixed in a confluent 6 cm collagen-coated dish (4.0 ⁇ 10 6 cell) so that the number of cells was 1:10 (4.0 ⁇ 10 5 cell). Similarly, a 3.5 cm dish of serum medium was spread to 1:10 (1.6 X 10 5 cell). Cells were treated with PBS / EDTA, 0.1% trypsin 'PBS / EDTA, then suspended in 2 ml of serum-free medium (lml of blood in serum medium) Suspended in a clear medium), collected, and centrifuged at 700 rpm for 10 minutes.
  • Example 6 Transfection of mouse interferon a and purification of expressed protein
  • the medium of FKD cells cultured to a subconfluent (about 90% ⁇ ) in a 10 cm diameter dish (collagen coated dish, IWAKI) was removed, and 12 ml DMEM-F12 (+ Supplement, except penicillin / streptomycin) was added and incubated.
  • 12 / z g of pHGGS-Mu-IFN a 1 which is also an expression plasmid for mouse interferon (hereinafter abbreviated as IFN) ⁇ and 1.5 ml of OPTI-MEM.
  • IFN In order to elute, 25 ml of 0.4 M Glycine-HC1 having pH 3.5 was first poured in, and then 25 ml of 0.4 M Glycine-HC1 having pH 2.0 was eluted. Mouse IFN ⁇ is eluted with pH 2.0 solution and IFN jS is eluted with pH 3.5 solution.
  • IFN o since IFN o; should have been synthesized in FKD cells, IFN o; eluted in the PH2.0 elution fraction. Also, since IFN has the property of adsorbing to glass, plastic containers were used for the elution fraction.
  • each 25 ml elution fraction was dialyzed against 1 X PBS. At that time, 1 X PBS was changed twice. After dialysis, concentrate with AQUACIDE II (CALBIOCHEM), dialyze again with 1 X PBS, Ultr a-4
  • Centrifugation was performed at 5000 rpm for 30 min in a centrifugal filter unit (Amicon), and each elution fraction was finally concentrated to about 100 ⁇ m.
  • the anti-mouse IFNa polyclonal antibody (Husagi) was diluted 500 times as the primary antibody, and the filter was reacted in a polypack for 1 hour at room temperature.
  • protein A-HRP (diluted 2000 times) was used as the secondary antibody and allowed to react for 1 hour at room temperature. Washed with TBS-T (5 minutes ⁇ 5), reacted with ECL plus (Amersham Biosciences) and exposed to X-ray film.
  • a band (about 20 kDa) was detected at the position of IFN a to which a sugar chain was added, and it was found that caro IFN a with sugar chain was secreted.
  • Example 7 Measurement of physiological activity of IFN (CPE (cytopathic effect) Assay, Fig. 4)
  • the IFN expression vector is transfected into FKD cells, and this transfected medium is transferred to L cells (Flow laboratories) and infected with the virus. If the cells do not subsequently undergo CPE due to viral infection, it is evident that active IFN is present in the medium, that is, active IFN is secreted outside the FKD cell. [0046] In performing the CPE assay, LSV was diluted with VSV, and the cells were observed 24 hours later. As a result, it was confirmed that CPE sufficiently occurred at a dilution of 100 to 200 times. IFN expression vectors were transfected into FKD cells and collected by changing the medium for 5 days. Thereafter, the mixture was centrifuged at 300 Orpm for 5 minutes, and the supernatant was collected as a sample.
  • Cauxin expression vector was prepared using PCDNA6.2 / GW / D-TOPO (Invitrogen).
  • F-Primer CACCATGAGTGGGATGTGGGTGCA (SEQ ID NO: 1)
  • RV- Primer TCAGGGGACAATGGTATTCA (SEQ ID NO: 2)
  • PCR uses TOYOBO's KOD-Plus) and incorporated into the vector at position 950 ⁇ .
  • Transfection used the lipofection method. Except for the medium of FKD cells cultured to subconfluent (about 80% to 90%) with 3cmdish, remove 1.5 ml of 5% FBS-DMEM-F12 (—peni 1.5 ml of cillin / streptomycin) was added and incubated. At the same time, CMV-cau xin (lg / 1) with 2 1 and OPTI-MEM with 250 ⁇ 1 were prepared. Separately, 6 ⁇ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 250 ⁇ 1 OPTI-MEM were prepared. The solution was allowed to stand for 5 minutes, Lipofectamine 2000 solution was added to the DNA solution and allowed to stand for 20 minutes.
  • FBS-DMEM-F12 —peni 1.5 ml of cillin / streptomycin
  • the cells were added to the incubated cells and stirred. After 20 hours, the medium was exchanged with DMEM-F12 and 5% FBS-DMEM-F12 and incubated for 8 hours. After 8 hours, the medium (1.5 ml) was collected and lml of solubilization buffer was stored in each dish. Thereafter, sonication was carried out for 5 minutes, followed by centrifugation at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a cell lysate (900 ⁇ 1). In addition, the medium was treated at 3000 rpm for 5 minutes, and dead cells existing in the medium were removed to prepare a medium.
  • Example 9 Treatment with Glycopeptidase F (GPF) ( Figure 5)
  • the supernatant was collected and subjected to SDS-PAGE. At that time, 10 1 was applied to each lane of 10% gel, and the sample was run at 15 mA until the sample flowed. After the electrophoresis, 3 sheets of filter paper, membrane, gel, and 3 sheets of filter paper were stacked in this order, and transfer was performed at a constant current of 1.5 mA / cm 2 for 1 hour and 30 minutes. After completion of the transfer, it was immersed in Blocking buffer and subjected to blocking treatment at 4 ° C.
  • a cauxin C-terminal peptide antibody (diluted 8000 times) was used as the primary antibody, and the filter was reacted in a polypack for 1 hour at room temperature.
  • protein A_HRP (diluted 8000 times) was used as the secondary antibody, and the same treatment as the primary antibody was performed. Washed with TBS-T (5 min x 5), reacted with ECL (purchased from Amersham Biosciences) and exposed to X-ray film. The results are shown in FIG. From the results in FIG. 5, it was confirmed that a sugar chain was added to the cauxin protein expressed in the FKD cell of the present invention.
  • Example 10 FKD cell suspension culture FKD cells were cultured in four 10 cm dishes until almost confluent (medium: DM EM F-12 (10565-018, GIBCO), 5% FCS). Remove the medium and wash the cells with 5 ml PBS-EDTA, then add 1 ml 0.1% trvpsin / PBS-EDTA and incubate for 4 minutes in a CO incubator.
  • medium DM EM F-12 (10565-018, GIBCO), 5% FCS.
  • Figure 6 shows the state of cells from the first day to the fourth day after the start of suspension culture.
  • Fig. 7 shows the results of cell count measurement up to day 5 after the start of suspension culture. As shown in FIG. 7, cell proliferation was observed from the 4th to 5th day after the start of suspension culture.
  • the cell line of the present invention can grow on a serum-free medium, can synthesize and secrete a large amount of the target protein, and can produce a glycoprotein having a sugar chain structure. Therefore, the cell line of the present invention is useful as a host cell for producing a recombinant protein. In particular, by using the cell line of the present invention as a host cell, it becomes possible to produce a large amount of the target protein in a form having physiological activity at low cost.
  • FIG. 1 shows FKD cells.
  • FIG. 2 shows the results of examining the gene transfer efficiency in FKD cells, COS cells, and HeLa cells. Shown are lacZ introduced into each cell and stained with X-gal. The cell density is the same.
  • FIG. 3 shows the results of comparing the proliferation of FKD cells and COS cells.
  • Diamond is FKD Cells (serum-free), squares indicate FKD cells (serum), triangles indicate COS cells (serum).
  • FIG. 4 shows the results of examining the expression of Mu IFN- ⁇ 1 in FKD cells and COS cells.
  • FIG. 5 shows the results of examining the expression of glycoprotein cauxin.
  • EndoF glycoprotein glycoprotein cauxin
  • Endo F glycoslation enzyme
  • Western blotting with an anti-Cauxin antibody was performed.
  • Endo F Endo F (Endoglycosidase F) specifically cleaves the binding site (GlcNAc-Asn binding) between the N-glycoside sugar chain and the protein. Except for sugar chains in which fucose is bound to GluNAc at the reducing end, it is cleaved regardless of the structure of the sugar chain.
  • FIG. 6 shows the state of cells on day 1 (a), day 2 (b), day 3 (c) and day 4 (d) after the start of suspension culture of FKD cells.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the number of cells from day 1 to day 5 after the start of suspension culture of FKD cells.

Abstract

　本発明の目的は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる宿主細胞を提供することである。本発明によれば、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から樹立された株化細胞が提供される。

Description

明 細 書
組み換え蛋白質産生のための宿主細胞
技術分野
[0001] 本発明は、組み換え蛋白質産生のための宿主細胞、及び該細胞の利用に関する
。特に本発明は、哺乳動物から榭立された組み換え蛋白質産生のための宿主細胞、 及び該細胞の利用に関する。
背景技術
[0002] 機能が未知である遺伝子の機能解析においては、当該遺伝子によりコードされる 組み換え蛋白質の入手が不可欠である。現在使用されて 、る組み換え蛋白質の産 生のための発現系としては、原核細胞系、真核細胞系、及び無細胞系のものが存在 する。原核細胞系としては、大腸菌および関連細菌（例えば、 E.coli, Pseudomonas 属細菌， Zymomonas属細菌， Thermus属細菌など）、枯草菌および関連細菌（例え ば、放線菌，乳酸菌，アミノ酸生産菌，酢酸菌，好熱性細菌など）を宿主とするものが 挙げられる。また、真核細胞系としては、酵母、糸状菌、植物培養細胞、昆虫培養細 胞 (バキュロウィルスベクター）、及び動物培養細胞を宿主とするものが挙げられる。
[0003] 上記のうち、大腸菌'酵母等の微生物を用いた組換えタンパク質の大量生産系が 確立され、その一部は医薬品としても使用されているが、真核細胞、特にヒトタンパク 質は特有の糖鎖の付加やタンパク質合成後の複雑なプロセシングが活性に不可欠 であることが知られており、微生物での機能タンパク質の生産が困難な場合がある。
[0004] また、翻訳後修飾を受けな!/、ケースにぉ 、ても、大腸菌発現系でヒト遺伝子を発現 させた場合、 codon usage 'タンパク質高次構造の違いから封入体を形成することが 多ぐ遺伝子は取得できてもその遺伝子産物 (タンパク質)の取得までに膨大な時間 を有すること力 多くのケースでボトルネックとなっている。
[0005] 一方、昆虫細胞や動物培養細胞を用いて興味タンパク質の生産を行う場合、 (1) 生産量が少ない、（2)発現できる遺伝子が限られる、（3)コストが高い、などの問題を 有するため、スクリーニングなどに供するためのタンパク質を入手するのに時間と労 力を必要とする。 [0006] また、動物細胞を用いて大規模タンパク質生産を行う際に、（1)一過性タンパク質 発現の場合、短時間に目的のタンパク質を得ることができるが、一回のトランスフエク シヨンで生産できるタンパク質の量は限られており、スケールアップが簡単ではなぐ 大量の細胞と導入試薬が必要である、 (2)安定発現遺伝子導入株を作製すること〖こ より、長期に渡りタンパク質を高発現する細胞を得ることができるが、外来遺伝子の安 定導入株の作製に長時間 (数ケ月）かかる、 、つた問題があった。
[0007] 一方、ネコの尿にはコーキシンと命名された分子量 60 kDaの糖タンパク質が約 1 mg/mlの高濃度で排泄される。コーキシンは遠位尿細管上皮細胞で作られ，アビ力 ル膜から分泌されることが報告されて ヽる (非特許文献 1)。
[0008] 非特許文献 1 : Miyazaki, M., Kamiie, K., Soeta, S" Taira, H" and Yamashita, T.: M olecular cloning and characterization of a novel carboxylesterase— like protein that is physiologically present at high concentration in the urine of domestic cats (Pelis cat us) Biochem.J., 370, 101—110(2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合成及び分泌 することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる宿主細胞を 提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ネコ由来の遠 位尿細管上皮細胞カも榭立された株化細胞は、無血清培地で増殖することができ、 目的蛋白質を大量に合成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質 を製造することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成され たものである。
[0011] 即ち、本発明によれば、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞力 樹立された株化 細胞が提供される。
好ましくは、本発明の株化細胞は、組み換え蛋白質産生用の宿主細胞として使用 される。 好ましくは、本発明の株化細胞は、ネコ由来である。
好ましくは、本発明の株化細胞は、外来の不死性獲得因子をコードする遺伝子を 有する。
好ましくは、本発明の株化細胞は、外来の選択マーカー遺伝子を有する。 好ましくは、本発明の株化細胞は、無血清培地で増殖することができる。 好ましくは、本発明の株化細胞は、受託番号 FERM BP— 10643を有する細胞 である。
[0012] 本発明の別の側面によれば、発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を上記し た本発明の株化細胞に導入することにより得られる形質転換体が提供される。
[0013] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の株化細胞を用いて組み換え 蛋白質を製造する方法が提供される。
好ましくは、上記した本発明の株化細胞に外来遺伝子を導入して形質転換細胞を 作成し、得られた形質転換細胞を培養して該外来遺伝子によりコードされる組み換え 蛋白質を産生させ、産生した組換え蛋白質を回収することができる。
好ましくは、産生される組み換え蛋白質が糖鎖で修飾されて ヽる。
[0014] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法で産生される組み換え 蛋白質が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細胞は、哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞から榭立された株化細胞 である。哺乳動物の例としては、ネコ、ィヌ、ゥサギ、モルモット、ノ、ムスター、ラット、マ ウス、ヒトなどが挙げられる力 好ましくはネコである。
[0016] 本発明の細胞は、例えば、ネコの腎臓力も採取することができる。ネコから摘出した 腎臓を Joklik緩衝液 (111 mM NaCl, 24 mM NaHCO , 10 mM Na HPO , 5.4 mM KCl,
3 2 4
1 mM Mg SO , 11 mMグルコース)中で細断ィ匕し、細断した組織片をコラゲナーゼ消
2 4
化液で処理し、ばらばらになった細胞力も細胞塊を除き、遠心することにより細胞を 回収する。次いで、細胞をイーグル MEM培地 1 (ニッスィ）に懸濁し、 Percollの密度勾 配遠心により、遠位尿細管細胞を分離し、回収することができる。細胞をイーグル ME M培地 1で洗い Percollを除いた後、 DME-F12培地に懸濁し、コラーゲンコートデイツ シュで培養する。
[0017] 上記のようにして単離した遠位尿細管由来細胞に、不死性獲得因子および選択マ 一力一遺伝子を導入することにより細胞を株化することができる。不死性獲得因子は 、当該因子が細胞に導入されることにより、細胞が不死化される因子を意味し、例え 【 、 Epstein— Barr virus (EBV)、 Simian virus 40 (SV40) T antigenゝ ¾V40 large T antig en、 adenovirus E1A、 adenovirus E1B、 human papillomavirus (HPV) E6、 HPV E7、 tel omerase reverse transcriptase protein (hTERT)等の遺 is十を使用すること力 Sでさる。 選択マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを使用する ことができ、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグ ロマイシン耐性遺伝子、ゼォシン耐性遺伝子などを使用することができる。不死性獲 得因子をコードする遺伝子および選択マーカー遺伝子の導入は、通常のトランスフエ クシヨン法で行うことができる。トランスフエクシヨン後に、培地を選択培地 (例えば、薬 剤耐性遺伝子を導入した場合には、当該薬剤を含有する培地）に交換し、選択マー カー遺伝子が安定に導入され、かつ安定に増殖できる細胞株を選択することにより、 本発明の細胞株を榭立することができる。
[0018] なお、本発明の細胞の一例である、以下の実施例で取得した FKD細胞 (識別のた めの表示： FKD)は、受託番号 FERM P— 20605として、平成 17年（2005年） 7月 27日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター ( T 305-85 66 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 1 中央第 6)に寄託され、平成 18年（200 6年） 7月 19日に、 FERM BP— 10643として、「特許手続上の微生物の寄託等の 国際的承認に関するブタペスト条約」の下の国際寄託に移管された。
[0019] 上記のようにして榭立された本発明の株化細胞は、動物細胞の通常の培養方法に 従って培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されている RPM116 40培地〔The Journal of the American Medical Association, 199,519(1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501(1952)〕、 DMEM培地 [Virology, 8, 396(1959)〕、 DMEM — F12培地などを用いることができる。または、これら培地に牛胎児血清等を添加した 培地を用いることもできる。但し、本発明の細胞は、無血清培地でも増殖できるので、 血清を添加する必要性はない。さらに、培地には、インシュリン、トランスフェリン、セリ ンなどを適宜添カロしてもよ 、。
[0020] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%C0存在下等の条件下で行うことができる。ま
2
た、培養中必要に応じて、ネオマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養 は、 collagen- coated dishの上で行ってもよい。
[0021] 目的とする組み換え蛋白質を本発明の細胞中で発現させるためには、まず、該組 み換え蛋白質をコードする遺伝子を、適当な発現ベクター中においてプロモーター の下流に挿入し、次いで上記遺伝子を挿入した発現ベクターを、本発明の細胞に導 入する。
[0022] 発現ベクターとしては、本発明の細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込みが可能で、上記目的とする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有 して 、るものを用いることができる。
[0023] 発現ベクターとして、例えば、 pCHHO (PL社）、 pcDNAI、 pcDM8(フナコシ社)、 pcD NAI/AmP(invitrogen)、 pREP4(invitrogen)、 pCDNA3(invitrogen)、 pCMVscript、stratag ene)、 pS(j5(stratagene)、 pZeoSV2(invitrogen)、 pEFl/V5 HisA/B/C(invitrogen)、 pEF - Bos- Myc、 pREP4(invitrogen)、 pBK- RSV(stratagene)等を例示することができる。
[0024] プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス (ヒト CMV)の IE(immediate early)遺伝子のプロモー ター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロ モーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。ま た、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。
[0025] 本発明の細胞への組換え発現ベクターの導入法としては、動物細胞に DNAを導入 するための通常の方法を用いることができる。例えば、エレクト口ポーレーシヨン法、リ ン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を用いることができる。
また、組み換え蛋白質の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合タン ノ ク質発現等を行うことができる。
本発明の細胞を用いて組み換え蛋白質を発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が 付加された蛋白質を得ることができる。 [0026] 発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を本発明の細胞に導入することにより 得られる形質転換体を好適な培地で培養し、培養物中に目的蛋白質を生成蓄積さ せ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、目的蛋白質を製造することができる 。力べして製造される蛋白質も本発明の範囲内である。
[0027] 本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
[0028] 形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPM11640培地〔The J ournal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、 Eagleの MEM培地〔Scie nce, 122, 501(1952)〕、 DMEM培地 [Virology, 8, 396(1959)〕、 DMEM— F12培地など を用いることができる。または、これら培地に牛胎児血清等を添加した培地を用いるこ ともできる。但し、本発明の細胞は、無血清培地でも増殖できるので、血清を添加す る必要性はない。
[0029] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%C0存在下等の条件下で 1〜7日間行うことが
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できる。また、培養中必要に応じて、ネオマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
[0030] 本発明の形質転換体の培養物から、目的とする組み換え蛋白質を単離精製するに は、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
[0031] 例えば、組み換え蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後 、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレ ス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液 を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質 の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による 沈殿法、ジェチルアミノエチル (DEAE)セファロース、 DIAION HPA-75(三菱化成社製 )等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (フアルマシア 社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、プチルセファロース、フ ェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いた ゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点 電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を 得ることができる。
[0032] また、組み換え蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞 を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により 蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を 、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程 度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた 後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0033] 組み換え蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合に は、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができ る。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶 性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。
[0034] 以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるも のではない。
実施例
[0035] 実施例 1 :ネコ尿細管細胞の単離
ネコ遠位尿細管由来上皮細胞は、組織培養の技術 (第二版）日本組織培養学会編 朝倉書店 7-4腎細胞培養法 (第 141〜145頁)の方法に従って、以下の通り行った 。ネコを麻酔し、無菌的に摘出した腎臓を Joklik緩衝液 (111 mM NaCl, 24 mM NaHC O , 10 mM Na HPO , 5.4 mM KC1, 1 mM Mg SO , 11 mMグルコース)中でメスで細
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断化した。 100ml三角フラスコ中で、 0.02%コラゲナーゼ消化液を細断した組織片 lg に付き 30ml加え、スターラーで 30分撹拌した。上清液を捨て、新しい消化液を加え、 さらに 30分間反応させる。ばらばらになった細胞をガーゼろ過し細胞塊を除き、 lOOOr pm X 5分の遠心で細胞を回収した。細胞をイーグル MEM培地 1 (ニッスィ）に懸濁し、 Percollの密度勾配遠心により、遠位尿細管細胞を分離し、回収した。細胞をィーグ ル MEM培地 1で洗い Percollを除いた後、 DME-F12培地に suspendし、コラーゲンコー トディッシュで培養した。
[0036] 実施例 2 : FKD細胞の榭立 実施例 1で単離した遠位尿細管由来細胞に pSV3-neo (ATCC37150)を Lipofectami ne-Plus (Invitrogen社）を用いてトランスフエタトした。トランスフエクシヨンの 48時間後、 G418含メディウムに培地を交換し、安定変異導入株の選択を行った。得られた FKD 細胞を図 1に示す。増殖した細胞をパッセージし、液体窒素中で保存した。
[0037] 実施例 3： FKD細胞の継代培養 (passage)
FKD細胞を DMEM- F12 (+supplement)培地、 collagen- coated dishで 37°C、 5%CO
2 条件下で継代培養した。細胞が 80〜90%コンフルェントのとき培地を取り除き、 PBS/ EDTAで洗浄し lmlの PBS/EDTAをカ卩ぇ 37°C、 5%COで 5分間インキュベートした。続
2
いて 0.1 %trypsin' PBS/EDTAで洗浄し同様にインキュベートした。その後、 DMEM- F 12 (+supplement)培地で懸濁し、新しい collagen- coated dishに希釈して培養した。 Su pplement(GIBCO ITS- Xサプリメント)は、インシュリン、トランスフェリン、セリンを含ん だものを使用した。
[0038] 実施例 4 :トランスフエクシヨン実験 (遺伝子導入効率，図 2)
トランスフエクシヨン効率の検討には、 SV40プロモータに LacZを結合した発現べクタ 一 pCHl 10 (Pharmacia)を用いた。トランスフエクシヨンは、 Lipofectamine— PlusQnvitrog en)を用いて行った。細胞としては、 FKD細胞、 COS細胞及び HeLa細胞を用いた。ト ランスフエクシヨン 24時間後、培地を除き 1.5mlの PBSで 1回リンスし、 1.5mlの Fixative s olutionをカ卩ぇ 10分間静置させることで細胞を固定した。細胞を 1.5mlの PBSで 2回リン スし、 1.25mlの Staining solution( β -gal Staining Kit (Invitrogen))をカ卩えてインキュべ ートした。 3時間後、染色している細胞の割合力も発現の効率を確認した。結果を図 2 に示す。本発明の FKD細胞は、 COS細胞及び HeLa細胞より高い遺伝子導入効率を 示した。
[0039] 実施例 5 : FKD細胞、 COS細胞の増殖曲線の作成（図 3)
FKD細胞につ 、て無血清培地 ·血清培地での細胞増殖および血清培地での COS 細胞の細胞増殖を解析した。 FKD細胞はコンフルェントの 6cm collagen-coated dish (4.0 X 106cell)を細胞数 1： 10 (4.0 X 105 cell)になるように同 dishにま 、た。同様に血清 培地の 3.5cm dishにも 1 : 10 (1.6 X 105 cell)になるようにまいた。細胞は PBS/EDTA、 0. l%trypsin' PBS/EDTA処理後、 2mlの無血清培地で懸濁（血清培地の方は lmlの血 清培地で懸濁）、回収して 700rpm、 10分間遠心した。その後上清を捨て、 PBSとトリバ ンブルー溶液をカ卩えよく攪拌し、懸濁液を血球計算盤にのせ 1枚の dishにっき細胞 数 (生細胞、全細胞）を 2回計測した。この際 PBSとトリパンブルー溶液の量は観察す る 1区画（Imm X lmm)に細胞数約 100個になるように計算して加えた。 1日に 2枚の dis hの細胞数を計測して平均値を取り、これを 24時間ごとに 4日続けた。懸濁する PBS、 トリパンブルー量は細胞が観察しやすいようにその日によって変えた。 1区画の深さは 0.1mmであるので、 1区画の体積（0.1mm3)に 104をかけて lml中の細胞数を出し、これ に PBSとトリパンブルー溶液量 Z1000 (ml)をかけた値を懸濁した実際の細胞数とした 。観察終了後、片対数グラフにプロットし増殖曲線を作製した。 COS細胞についても 3 .5cm dishに 1 : 10 (1.6 X 105 cell)になるようにまき、 4日間観察した。各細胞の増殖曲 線の対数増殖期から細胞倍加時間（doubling time)を割り出した。
[0040] 結果を図 3に示す。その結果、無血清培地の FKD、血清培地の FKD、血清培地 の COSの細胞倍カ卩時間はそれぞれ、 19.0、 20.7、 21.8時間であった。
[0041] 実施例 6：マウスインターフェロン aのトランスフエクシヨンと発現タンパク質の精製 直径 10cmデイシュ（collagen coated dish,IWAKI)でサブコンフルェント（約 90%〜） まで培養した FKD細胞の培地を除き、 12mlの DMEM- F12 (+Supplement、ただし peni cillin/streptomycinは除いたもの）をカ卩えてインキュベートした。それと同時進行で、マ ウスインターフェロン（以下 IFNと省略） αの発現プラスミドでもある pHGGS-Mu-IFN a 1を 12 /z g、それに OPTI-MEMを 1.5mlカ卩えたものをそれぞれ作製した。それらとは別 に Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を 36 μ 1、 OPTI- MEMを 1.5ml混ぜたものを作製し た。 5分間静置させ、 DNA溶液に Lipofectamine 2000溶液を加え 20分間静置させた。 20分後、インキュベートしていた細胞に加え攪拌し、 8時間後に DMEM-F12 (+Supple ment) 10mlで培地の交換を行い、そのまま 16時間インキュベートした。
[0042] トランスフエクシヨン終了 24時間後培地を回収する作業を繰り返し、 IFN精製のサン プルとして 200mlの培地を回収した。回収した培地は、 10mlサイズのシリンジに CPG ( Controlled-Pore Glass)を詰めた CPGカラム（カラムサイズ 10ml)に流し入れてカラム に吸着させた。この際流し入れる培地の流速は常に 6〜10mlになるように注意した。 2 00mlの培地を流し終わった後、 100mlの I X PBSでカラム内を洗浄した。その後 IFNを 溶出するために、まず pH3.5の 0.4M Glycine- HC1を 25ml流し入れ、次に pH2.0の 0.4 M Glycine- HC1を 25ml流し溶出した。マウス IFN αは pH2.0の溶液、 IFN jSは pH3.5の 溶液で溶出される。本実験では IFN o;が FKD細胞内で合成されているはずなので、 PH2.0の溶出画分に IFN o;が溶出した。また IFNはガラスに吸着する性質があるので、 溶出画分の容器はプラスチック製のものを使用した。
[0043] 溶出後、それぞれの 25mlの溶出画分を 1 X PBSで透析した。その際 1 X PBSは 2回交 換した。透析後、 AQUACIDE II (CALBIOCHEM)で濃縮し 1 X PBSで再び透析、 Ultr a-4
遠心式フィルターユニット（Amicon)で 5000rpm、 30min遠心して最終的にそれぞれの 溶出画分を 100 μほで濃縮した。
[0044] それぞれの溶出画分 20 μ 1に対し 5 X SDS- PAGEサンプル化バッファー（還元条件） を 5 1加え、 5分間 boilしてサンプル化した。その後 SDS-PAGEを行った。その際、 15 %ゲルの各レーンに 25 μ 1流し、 15mAでサンプルが流れきるまで行った。泳動後のゲ ルと、 blotting緩衝液に予め浸してお!、た濾紙 6枚と PVDFフィルターを下から濾紙 3 枚、 PVDFフィルター、ゲル、濾紙 3枚の順に重ね、 1.5mA/cm2の定電流でトランスファ 一を 1時間 30分行った。トランスファー終了後 Blocking緩衝液に浸し blocking処理を 4 °Cでー晚行った。 blocking処理後、一次抗体には抗マウス IFN aポリクローナル抗体 (ゥサギ）を 500倍希釈して用い、フィルターをポリパック内で 1時間、室温で反応させ た。 TBS-Tで洗浄（5分 X 5)したのち、二次抗体には protein A-HRP (2000倍希釈）を 用い 1時間室温で反応させた。 TBS-Tで洗浄（5分 X 5)した、 ECL plus (Amersham Bi osciences)で反応させ、 X線フィルムに感光させた。ウェスタンブロットによる解析の結 果、糖鎖が付加した IFN aの位置にバンド (約 20kDa)が検出されたことから、糖鎖付 カロ IFN aが分泌されたことが分力ゝつた。
[0045] 実施例 7： IFNの生理活性測定（CPE (cytopathic effect) Assay,図 4)
IFN発現ベクターを FKD細胞にトランスフエクシヨンし、このトランスフエクシヨンした 培地を L細胞（Flow laboratories)にカロえ、ウィルス感染させる。その後細胞がウィルス 感染による CPEを起こさなければ培地中に活性を持つ IFNが存在する、すなわち、活 性型の IFNが FKD細胞外に分泌されているということがわ力る。 [0046] CPE assayを行うにあたり、 L細胞に VSVを希釈して加え 24時間後の細胞を観察した 。その結果、 100〜200倍希釈で CPEが十分に起こることが確認された。 IFN発現べク ターを FKD細胞にトランスフエクシヨンし、 5日間培地を交換して回収した。その後 300 Orpmで 5分間遠心し、上清を回収してサンプルとした。
[0047] 96 wellプレートに 1:2になるように L細胞をまいた。細胞が増殖したら、縦のレーンの 一番上の wellに 50 1の IFNをカ卩え、 10回攪拌した後下の wellに 50 1移した。この操 作を一番下の welほで続け、 3倍ずつ希釈された IFNのレーンを作製した。上記のトラ ンスフエクシヨン後のサンプルについても同様の操作を行い、各レーンを作製した。
[0048] 6時間後各 wellの培地を除き、 0.5%NCS-MEMで 200倍に希釈した VSVを各 wellに 10 0 μ 1ずつ加えた。このとき VSVの control wellも作製した。 24時間培養後、この VSV co ntrol wellの L細胞が CPEを起こしていることが確認できたら、 crystal violet dyeで染色 して乾かし、青紫色に染色された生細胞の割合を観察した。各レーンの wellから細胞 全体の 50%が変性して!/、るスポットを特定し、放出されて 、るおよその IFN量 (unit/ml) を推定した。細胞外に IFNを放出することが COS細胞では確認されているので、同様 な操作を COS細胞についても行い比較した。結果を図 4に示す。 FKD細胞の 50%C PEスポットは COS細胞とほぼ同一であり、分泌量は COS細胞と同等（lOOOOU/ml)で あると考えられた。
[0049] 実施例 8：コーキシンのトランスフエクシヨンとタンパク質の発現
コーキシン発現ベクターの作成は、 PCDNA6.2/GW/D- TOPO (Invitrogen)を使用し た。
インサートは、コーキシンの cDNA (なお、コーキシン遺伝子の塩基配列は、 AB04537
7として NCBIに登録されて 、る）を铸型として、
F- Primer： CACCATGAGTGGGATGTGGGTGCA (配列番号 1)
RV- Primer： TCAGGGGACAATGGTATTCA (配列番号 2)
でオープンリーディングフレーム全長を PCRで増幅し（PCRは、 TOYOBOの KOD-Plu sを利用）、ベクターの 950ηの位置に組み込んだ。
[0050] Transfectionは、リポフエクシヨン法を用いた。 3cmdishでサブコンフルェント（約 80% 〜90%)まで培養した FKD細胞の培地を除き、 1.5mlの 5%FBS- DMEM- F12 (—peni cillin/streptomycin)を 1.5ml加えてインキュベートした。それと同時進行で、 CMV-cau xin (l g/ 1)を 2 1、それに OPTI-MEMを 250 μ 1カ卩えたものをそれぞれ作製した。 それらとは別に Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を 6 μ 1、 OPTI- MEMを 250 μ 1混ぜたも のを作製した。 5分間静置させ、 DNA溶液に Lipofectamine 2000溶液を加え 20分間静 置させた。 20分後、 incubateしていた細胞に加え攪拌し、 20時間後に DMEM-F12及 び 5%FBS-DMEM- F12で培地の交換を行い、そのまま 8時間インキュベートした。 8時 間後、培地（1.5ml)を回収し、それぞれの dishに lmlの可溶化バッファーをカ卩えた。そ の後、 5分間音波処理を行い、 15000rpmで 10分間遠心し上清を回収して細胞溶解液 (900 μ 1)とした。また、培地については 3000rpm、 5分の処理を行い、培地中に存在 する死細胞を除 、たものを作製した。
[0051] 実施例 9： Glycopeptidase F (GPF)での処理（図 5)
コーキシン C末ペプチド抗体で免疫沈降後、 Glycosidase処理を行うサンプルに 20 μ 1の MQ水をカ卩ぇ攪拌し、そこから 10 μ 1別のチューブに移した。それに 10 μ 1の Dena ture buffer ( + 2- ME)を 100°Cで 3分間 boilした。それに 20 1の Stabilized solution, 52 μ 1の MQ水をカロえて攪拌し、続けて 8 μ \ (0.5τηυ/ μ 1)の GPF(TAKARA)をカロえ攪拌し 、 37°Cで 20時間インキュベーションした。その後 5 X SDS- PAGEサンプル化バッファー (還元条件）をそれぞれ 25 1加え、 5分間 boilしてサンプルィ匕した。その上清を回収し 、 SDS-PAGEを行った。その際、 10%ゲルの各レーンに 10 1流し、 15mAでサンプル が流れきるまで行った。泳動後、濾紙 3枚、メンブレン、ゲル、濾紙 3枚の順に重ね、 1. 5mA/cm2の定電流でトランスファーを 1時間 30分行った。トランスファー終了後 Blockin g緩衝液に浸し blocking処理を 4°Cで一晚行つた。
[0052] blocking処理後、一次抗体にはコーキシン C末ペプチド抗体 (8000倍希釈）を用い、 フィルターをポリパック内で 1時間、室温で反応させた。 TBS-Tで洗浄 (5分 X 5)したの ち、二次抗体には protein A_HRP (8000倍希釈）を用い、一次抗体と同様な処理をし た。 TBS- Tで洗浄（5分 X 5)した、 ECL (Amersham Biosciences社より購入）で反応さ せ、 X線フィルムに感光させた。結果を図 5に示す。図 5の結果から、本発明の FKD 細胞で発現させたコーキシン蛋白質に糖鎖が付加されていることが確認された。
[0053] 実施例 10： FKD細胞の浮遊培養 FKD細胞を 10cmディッシュ 4枚にほぼコンフルェントになるまで培養した（培地： DM EM F-12 (10565-018, GIBCO ), 5%FCS)。培地を除去し、細胞を 5ml PBS- EDTAで 洗った後、 1ml 0.1%trvpsin/PBS- EDTAをカ卩え、 COインキュベータ内で 4分間保温
2
した。ディッシュから遊離した細胞を P1000のピペットマンで回収し、 5mgの soybean Tr ypsin Inhibitor (Wako 202- 09221)を含む無血清培地（OPTI PRO SFM, 12309-019, GIBCO) 10mlの入った 50ml遠心管に入れ、 100gで 4分間遠心した。上清を取り除き、 細胞を 10mlの無血清培地（上述のもの）に懸濁し、 100gで 4分間遠心した。上清を除 いた後、 10mlの無血清培地に再懸濁し、 lml Pluronic F-68 (11905-031, GIBCO)を 含む 90mlの無血清培地が入ったスピナ一フラスコ（S-フラスコ 4500-250, TAITEC) にカロえ、 COインキュベータ内（5%CO , 37°C)においてスターラー回転数 90rpmで培
2 2
養を行った。浮遊培養開始後 1日目力ら 4日目までの細胞の様子を図 6に示す。
[0054] 細胞数の測定は、培養液 lmlを 100g x 4min遠心して回収した細胞を、 lml PBS-ED TAで洗った後、 lml 0.1% trypsin/PBS- EDTAをカ卩ぇ室温で 5minおき、細胞塊を分散 させた後に血球測定板を用いて行った。浮遊培養開始後 1日目力 5日目までの細 胞数の測定結果を図 7に示す。図 7に示す通り、浮遊培養開始後 4〜5日目まで細胞 の増殖が認められた。
産業上の利用可能性
[0055] 本発明の株化細胞は、無血清培地で増殖することができ、目的蛋白質を大量に合 成及び分泌することができ、また糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造することができる 。従って、本発明の株化細胞は、組み換え蛋白質産生のための宿主細胞として有用 である。特に、本発明の株化細胞を宿主細胞として用いることにより、低コストで、目 的蛋白質を大量に、生理活性を有する形で製造することが可能になる。
図面の簡単な説明
[0056] [図 1]図 1は、 FKD細胞を示す。
[図 2]図 2は、 FKD細胞、 COS細胞、及び HeLa細胞における遺伝子導入効率を検討 した結果を示す。各細胞に lacZを導入し、 X— galで染色したものを示す。細胞の密 度は何れも同一である。
[図 3]図 3は、 FKD細胞及び COS細胞の増殖を比較した結果を示す。菱形は FKD 細胞 (無血清）を示し、四角は FKD細胞 (血清）を示し、三角は COS細胞 (血清）を 示す。
[図 4]図 4は、 FKD細胞及び COS細胞における Mu IFN- α 1の発現を検討した結果を 示す。
[図 5]図 5は、糖蛋白質コーキシンの発現を検討した結果を示す。 Cauxin遺伝子を発 現させた FKD細胞抽出液に EndoF (糖鎖切断酵素）を添加した場合と添加しな！、場 合について、抗 Cauxin抗体によるウェスタンブロッテイングを行った。なお、 Endo F (E ndoglycosidase F)は、 N-グリコシド型糖鎖とタンパク質との結合部位（GlcNAc-Asn結 合)を特異的に切断する。還元末端の GluNAcにフコースが a 1-3結合している糖鎖 以外は、糖鎖部分の構造にかかわりなく切断する。
[図 6]図 6は、 FKD細胞の浮遊培養の開始後 1日目（a)、 2日目（b)、 3日目（c)及び 4日目（d)の細胞の様子を示す。
[図 7]図 7は、 FKD細胞の浮遊培養開始後 1日目力ら 5日目までの細胞数の測定結 果を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 哺乳動物由来の遠位尿細管上皮細胞力 樹立された株化細胞。
[2] 組み換え蛋白質産生用の宿主細胞として使用する、請求項 1に記載の株化細胞。
[3] ネコ由来である、請求項 1又は 2に記載の株化細胞。
[4] 外来の不死性獲得因子をコードする遺伝子を有する、請求項 1から 3の何れかに記 載の株化細胞。
[5] 外来の選択マーカー遺伝子を有する、請求項 1から 4の何れかに記載の株化細胞。
[6] 無血清培地で増殖することができる、請求項 1から 5の何れかに記載の株化細胞。
[7] 受託番号 FERM BP— 10643を有する細胞である、請求項 1から 6の何れかに記 載の株化細胞。
[8] 発現すべき目的蛋白質をコードする遺伝子を請求項 1から 7の何れかに記載の株化 細胞に導入することにより得られる形質転換体。
[9] 請求項 1から 7の何れかに記載の株化細胞を用いて組み換え蛋白質を製造する方 法。
[10] 請求項 1から 7の何れかに記載の株化細胞に外来遺伝子を導入して形質転換細胞 を作成し、得られた形質転換細胞を培養して該外来遺伝子によりコードされる組み換 え蛋白質を産生させ、産生した組換え蛋白質を回収することを特徴とする、請求項 9 に記載の方法。
[II] 産生される組み換え蛋白質が糖鎖で修飾されている、請求項 9又は 10に記載の方 法。
[12] 請求項 9から 11の何れかに記載の方法で産生される組み換え蛋白質。
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