CN115074373B - 一种新冠病毒rbd蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用。本发明通过优化RBD蛋白的密码子，使得RBD蛋白在Bac‑to‑Bac系统内高效分泌表达。本发明设计的方案通过超滤和离子交换柱两个步步骤即可从细胞上清中纯化高浓度的纯度高达90％以上的RBD蛋白。本发明提供了RBD蛋白的表达纯化方案简单高效，有望应用于新冠疫苗商业化生产。

Description

一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及疫苗领域，尤其涉及一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用。
背景技术
新型冠状病毒是继严重急性呼吸系统综合症冠状病毒和中东呼吸综合症冠状病毒后又一能引发严重急性呼吸道疾病且具有严重传染性的病毒，其所引发的新型冠状病毒肺炎尚无特效疗法。当前国际病毒分类委员会将新型冠状病毒的病毒名为SARS-CoV-2，其引起的疾病则被世界卫生组织命名为COVID-19。
目前，研发人员解析了SARS-CoV-2病毒的关键组成蛋白的三维结构、揭示了新冠病毒的入侵细胞的机理。SARS-CoV-2通过的S蛋白与ACE2受体(血管紧张素转换酶2)结合，介导病毒进入宿主细胞。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并且病毒从融合前状态转变为融合后状态。S1亚基和S2亚基都由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，其中S1亚基主要负责与宿主细胞受体结合，S2亚基主要负责和细胞膜融合。S1亚基又包括N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。
RBD蛋白在SARS-CoV-2病毒入侵细胞中发挥着重要的功能，同时，RBD蛋白也常被用作抗原用于疫苗制备。如目前已批准上市人用新冠病毒疫苗—智克威得，此疫苗为安徽智飞生物研发，其中RBD蛋白质的氨基酸序为“RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF”,理论分子量为25.1KDa。
RBD蛋白作为抗原可用于预防新型冠状病毒的感染，但是其生产工艺复杂，产率低，因而成本较高。需要进一步优化RBD蛋白的生产制备工艺，简化工艺以降低成本的同时保证产品质量。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用
本发明提供了一种编码RBD蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述核酸为基于RBD蛋白的氨基酸序列和表达宿主的密码子偏好性优化所得的最适宜RBD蛋白表达的基因序列；在本发明的实施例里，所述表达宿主为SF9细胞系。密码子优化后RBD蛋白的表达量明显提升，相对于野生型编码序列，密码子优化后RBD蛋白产率50mg/L提升至200mg/L。
本发明提供的编码所述RBD蛋白的核酸中编码RBD蛋白部分的核酸如SEQ ID NO:2所示。本发明在SEQ ID NO:2所示核酸序列的5’端添加编码GP64分泌信号肽的片段以提高可溶性蛋白的表达量，在表达后信号肽被自动切除，不影响RBD蛋白的序列。本发明中，编码GP64信号肽的核酸序列为atggttagtgctatcgtactttatgtg ctgcttgccgctgccgcgcactcagctttcgct。
进一步地，本发明提供了一种载体，其包括骨架载体和所述的核酸。
本发明所述的载体为用于保藏或扩增的质粒载体，或者为用于构建或包装病毒的穿梭质粒。所述病毒选自腺病毒、慢病毒或杆状病毒。本发明实施例中，以杆状病毒为载体侵染昆虫细胞从而实现蛋白的表达。一些实施例中，所述骨架载体包括pFastbac质粒或杆状病毒穿梭质粒。
更进一步地，本发明还提供了转化了所述的载体的宿主，所述宿主包括昆虫细胞或大肠杆菌。
一些实施例中，转化载体的骨架为pFastbac质粒，宿主为大肠杆菌。一些具体实施例中，以DH10 Bac为骨架载体实现杆状病毒的包装。
一些实施例中，转化载体的骨架为杆状病毒穿梭质粒，宿主为昆虫细胞。一些具体实施例中，用sf9细胞作为蛋白表达的宿主细胞。
本发明还提供了一种用于Bac-to-Bac表达系统的重组杆状病毒，所述病毒的基因组中包括本发明所述的核酸。
本发明中，所述重组杆状病毒的构建方法包括利用Bac-to-Bac表达系统将目的基因构建到杆状病毒的穿梭质粒，再将重组穿梭质粒导入细胞在细胞中组装成重组杆状病毒。
本发明使用病毒-昆虫细胞系统表达目的RBD蛋白。具体地，将目的基因(所述编码RBD蛋白的核酸)与pFastbac质粒相连得到目的基因供体质粒，将所述质粒转化胞内含有杆状病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10 Bac。转化进入菌株的pFastbac-目的基因质粒与胞内的杆状病毒穿梭质粒发生重组，产生包含目的基因的杆状病毒的穿梭质粒。将所得的重组穿梭质粒侵染昆虫细胞，可以制备重组杆状病毒。所述重组杆状病毒可用于表达RBD蛋白。
本发明提供了所述融合蛋白的制备方法，包括：用所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达目的蛋白、从所述昆虫细胞的培养上清液中纯化目的蛋白。
所述纯化目的蛋白的步骤包括超滤和离子交换层析；所述离子交换层析包括：使用阳离子交换柱富集目的蛋白、梯度盐浓度的盐溶液洗脱分离目的蛋白。
一些具体的实施例中，选用GE的SP柱对目的蛋白的表达上清液进行离子交换层析。洗脱条件为：选用pH8.0磷酸盐缓冲液为洗脱低盐，选用pH8.0磷酸盐、1M氯化钠的溶液为洗脱高盐，设置洗脱梯度为：70mL洗脱体积内,洗脱高盐的比例从0％(V/V)线性递增到50％(V/V)。
所述超滤能去除细胞上清液中的许多杂质，缩小蛋白液的体积，增加蛋白的浓度和纯度，并且能起到换液的作用。离子交换层析能根据蛋白在特定pH值溶液中所带的电性，分离获得高纯度的目的蛋白。
本发明提供了所述的核酸、所述的载体、所述的宿主、所述的病毒和/或所述方法制备获得的蛋白在制备防治新冠肺炎的疫苗中的应用。
本发明提供了一种新冠肺炎疫苗，其原料包括所述的核酸、所述的载体、所述的宿主、所述的病毒和/或所述方法制备获得的融合蛋白。
本发明还提供了治疗和/或预防新冠肺炎的方法，其为给予本发明所述的疫苗。
本发明通过优化RBD蛋白的密码子，使得RBD蛋白能在Bac-to-Bac系统内高效分泌表达。本发明设计的方案通过超滤和离子交换层析两步纯化即可从细胞培养液上清中纯化出大量纯度高达90％以上的RBD蛋白。本发明提供了RBD蛋白的表达纯化工艺简单高效，有望应用于新冠疫苗商业化生产。
本发明的RBD蛋白不包含组氨酸纯化标签或其他标签，避免了新增人工合成序列可能导致非预期免疫原性的风险，符合疫苗开发的基本要求。
附图说明
图1示Bac-to-Bac蛋白表达体系的构建流程图；
图2示构建Bac-to-Bac蛋白表达体系的工艺流程图；
图3示pFastbac-GP64-RBD质粒合成信息；
图4示pFastbac-GP64-RBD质粒的PCR鉴定结果；
图5示转座GP64-RBD基因的Bacmid的PCR鉴定结果；
图6示RBD蛋白纯化流程图；
图7示鉴定RBD蛋白表达情况的SDS-PAGE图；
图8示鉴定RBD蛋白表达情况的Western-Blot图；
图9示超滤步骤中膜包夹具与膜包的实物图；
图10示收集到的细胞上清经过纯化前后的纯度SDSpage对比图；
图11示蛋白纯化设备实物图；
图12示离子交换柱纯化RBD蛋白的吸收峰图；
图13示鉴定下游纯化过程中RBD蛋白情况的蛋白胶图；
图14示检测所纯化的RBD蛋白的HPLC结果图；
图15示使用Trypsin,Chymotrypsin,Glu-C三种酶分别对制备获得RBD蛋白进行酶切后经LC-MS/MS分析的结果；
图16示RBD蛋白免疫小鼠后体重变化；
图17示RBD蛋白免疫小鼠后血清中和滴度测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、表达体系、材料和方法
1、构建蛋白表达体系的实验方法
构建bac-to-bac表达系统的方法和流程如图1所示。本发明采用杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统，以胞外分泌的形式获得目的蛋白。设计思路为：以新冠病毒RBD蛋白(SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Protein(RBD)
(YP_009724390.1)(Arg319-Phe541))的氨基酸序列为源模板，通过密码子优化得到一套最适宜SF9细胞系的基因序列，并在蛋白序列N端添加GP64信号序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外。依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pFast-bac1-targetgene表达质粒，委托苏州金斯瑞公司生产该质粒。将该质粒转化DH10bac菌后，通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid，将重组的质粒经PCR鉴定之后转染sf9细胞，以此获得P1代病毒和P2代病毒。然后用获得的病毒侵染200ml的细胞做小试表达，通过westernblot检测蛋白表达情况。
2、工艺路线设计
具体的工艺路线如图2所示：将分泌信号肽GP64与新冠病毒RBD蛋白相连接，并且根据种属特异性优化该序列的密码子从而促进蛋白的表达，优化后的核酸序列如SEQ IDNO:1所示。
合成pFastBac与目的片段的质粒以后，于DH10Bac细胞中构建目的基因的Bacmid，随后转染昆虫细胞制备P1代病毒，随后再扩增制备P2代病毒，最后将制备的病毒感染细胞以表达目的蛋白。
3、细胞培养
1)细胞培养材料
培养细胞选用SF9细胞。SF9细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(2019年11月26日)，CCTCC库编号：GDC0008，全名为草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperdacell)细胞。
培养基采用表1所示的配方进行配制，然后在30℃磁力搅拌3小时，然后用KOH调节pH为6.5，过滤除菌，待使用。
表1细胞培养基成分表
Grace’s昆虫细胞培养基 1瓶 GIBCO
酵母提取物 3.3g GIBCO
蛋白水解物 3.3g GIBCO
碳酸氢钠 0.35g 国药BR
超纯水 1000ml /
2)细胞培养方法：
细胞传代：细胞密度达到80-90％时即可传代。弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；加入新鲜培养基，将细胞用刮刀轻轻刮下，用移液器轻轻吹打混匀，按照传代比例：一般为1：3或者1：6进行传代。
细胞复苏：将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，加入4ml培养基混匀。在1000RPM条件下离心4min，弃上清,加2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加培养基。
细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种，弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；加入新鲜培养基，将细胞用刮刀轻轻刮下，用移液器轻轻吹打混匀，将细胞悬液1000RPM离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
4、目标基因供体质粒的构建质粒为本发明设计并委托第三方公司生产，委托信息见表2，第三方公司返回质粒的示意图以及酶切鉴定图见图3。
表2质粒合成信息表
蛋白名称 委托合成公司 时间 bp数
S-RBD(sp) 金斯瑞 20210108 732
5、试剂和耗材
转染试剂(购自碧云天生物公司)；无血清培养基(购自北京义翘神州公司)；无添加培养基(购自南京普诺赛公司)；抽提试剂盒(购自碧云天生物公司)；PCR试剂盒(BBI公司)；血清(购自上海翔圣公司)；六孔板(购自广州洁特公司)；细胞培养瓶(购自广州洁特公司)；离心管(购自广州洁特公司)；PCR反应管(购自AXYGEN公司)；Agarose(购自生工生物公司)；DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自天根公司)；低熔点琼脂糖(购自BBI)；中性红(购自碧云天生物公司)；SF9细胞(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)；其它试剂均为国产分析纯。
6、主要实验仪器
台式高速冷冻离心机(购自长沙英泰)，台式高速离心机(购自长沙英泰)，超纯水机(购自赛默飞)，蛋白纯化仪(购自苏州赛普)、Mini Protean II垂直平板电泳系统、凝胶成像系统、水平电泳系统(购自北京六一生物科技)，PCR基因扩增仪(购自杭州博日)，荧光显微镜(购自舜宇光学)，光学显微镜(购自徕卡)，二氧化碳培养箱及智能生化培养箱(购自杭州博日)，凝胶成像系统(购自北京六一生物科技)，JY92-2D超声波细胞粉碎机(购自上海皓庄)，蛋白核酸检测仪(北京六一生物科技)，核酸浓度检测仪(购自天根公司)，HPLC液相色谱仪(购自安捷伦)。
7、实验步骤。
如图2所示，利用Bac-to-Bac杆状病毒感染昆虫细胞产生重组蛋白的思路为：将融合目的基因的pFastBac质粒转化DH10bac感受态细胞，在感受态细胞内产生了含有目的基因的重组bacmid，然后通过蓝白筛选筛选正确重组的Bacmid，经PCR进一步鉴定正确之后，将所得含有目的基因的重组bacmid转染sf9细胞，以获得携带目的基因的P1代病毒。用于构建Bacmid的DH10bac细胞购自优宝生物(货号：ST1003)，来源为Invitrogen。
下面详细说明实验步骤。
A、重组质粒鉴定
委托第三方公司合成GP64-RBD目的基因，并与pFastbac载体重组成质粒。将合成质粒的甘油菌进行单克隆挑选和菌种保存，随后，将所得甘油菌小量活化并从中纯化pFastbac-GP64-RBD质粒，然后用通用引物对质粒进行PCR扩增以鉴定质粒是否正确，测序的引物为：
5'测序引物:F:TATTCCGGATTATTCATACC；
3'测序引物:ACAAATGTGGTATGGCTGA。
PCR 50μl反应体系如下(样本)：
pFastbac-GP64-RBD质粒的PCR鉴定结果如图4所示，说明载体上有GP64-RBD目的序列。
B、重组bacmid的构建与鉴定
转化。用三蒸水将步骤1)所得的重组质粒稀释至0.2ng/μL，然后缓慢加入5μL(总共1ng)到感受态E.coli DH10 Bac中，并小心混匀。随后将混合物先冰浴30min，再42℃热激45s，冰浴2～3min，最后加入LB培养基1ml，于摇床200rpm 37℃，孵育4h。
抗性筛选。将转化后的菌液用相同的培养基连续稀释至10-1、10-2、10-3倍，分别取10-2、10-3倍的稀释液各200μl涂板于三抗(7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、50μg/ml卡那霉素，含有X-gal、IPTG)固体LB培养基，并置于摇床中37℃培养36～48h。
鉴定Bacmid。挑选单个的白斑菌落加入含三抗(7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、50μg/ml卡那霉素)的液体LB培养基中培养，然后放入摇床37℃200rpm震荡培养12h。采用碱裂解和异丙醇沉淀相结合法从培养的菌中提取重组杆状病毒基因组DNA，并以通用M13引物对其进行PCR，然后将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，以确认所构造Bacmid的正确性。
因杆粒的长度>135Kb，很难用酶切的方式进行鉴定，故采用PCR方式进行验证。理论上，若目的基因成功转座至Bacmid中，则扩增产物的大小应为2300bp+(目的基因长度为2300bp+)，PCR鉴定的结果如图5所示，说明本发明构建的Bacmid上含有GP64-RBD基因。
C、转染sf9细胞以产生重组杆状病毒
该步骤涉及的一些操作和专业名词解释如下：
sf9细胞的培养：一般每3天分瓶传代一次。处于对数生长期且细胞活力大于95％的sf9细胞可用于转染实验。
sf9细胞冻存方法：细胞培养至对数生长期，活力超过90％；计数，使得储存浓度处于1×107个/ml至2×107个/ml之间；往培养液中加入10％(V/V)的DMSO和30％(V/V)的FBS，混匀得到冻存液。，然后将冻存液保存于4℃预冷；将悬浮细胞于100×g的转速离心5min，去除上清液。然后用用预冷的冻存液将细胞悬浮至所需密度，然后混匀，分装至冻存管；将冻存管放入填有脱脂棉的泡沫盒，-80℃放置1天；移入液氮罐中保存。
细胞生长曲线确定：在细胞传代之后，记录每日的细胞数目，根据时间和细胞数目的生长曲线。根据细胞生长曲线可以计算最佳的细胞传代时间和在无血清条件下能达到的最高细胞浓度。
无血清驯化：经过梯度血清驯化，使细胞在无血清条件下的生长状况可达到与添加血清时的生长状况一致，但是接下来需要做蛋白表达量测试，该实验中所用培养基为北京义翘神州SIM-SF，Cat:MSF1。
主细胞库：为购买细胞传代10次以内的细胞，冻存在-80℃，每隔半年复苏传代三次冻存。
工作细胞库(WCB)为：从主细胞库传代增值的冻存管中提取的组成均匀的细胞，用于细胞培养生产。一般而言，主细胞库通过连续传代培养扩大到特定的传代数(或群体倍增，视情况而定)时合并，并低温保存以形成WCB。
病毒主种子批是指世卫组织推荐的抗原性优良的一批病毒毒株，由国家权威机构批准，可于来制备工作种子批。本发明保存的主种子批为经鉴定能成功表达蛋白的杆状病毒的P2代(-80℃)。
工作种子批是指通过多次传代从主种子批中制备的，具有和主种子批相同特征的病毒，其传代次数不超过国家监管机构批准的最大数量，可用于生产疫苗。本发明保存的工作种子批为经鉴定能成功表达蛋白的杆状病毒的P3代(-80℃)。
P1病毒液的收集：当细胞出现感染迹象时，将细胞上清转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min以去除细胞及大的碎片，可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤，滴度损失小于10％；将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中(一般P1的滴度在106pfu/ml左右),将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱(短期)。若长期保存，进行1ml分装，避光储存于-80℃。
P2病毒扩增及收获：原代病毒滴度(P1)较低，介于1×106～1×107pfu/ml，扩增后滴度为1×107～1×108pfu/ml。50ml摇瓶中加入适量的P1病毒，控制接种的初始滴度在0.01～0.1之间。接种体积的计算公式如下：病毒接种体积(ml)×desired MOI(phf/ml)＝Totalnumber ofcells×tlterofviral inoculum(病毒培养液的滴度，puf/cells)。感染细胞48h后病毒扩增近100倍，此时可以收集病毒，超过48h后病毒的质量将降低。
病毒滴度检测：六孔板中细胞的密度为120万个/孔，静置培养1h，将病毒依次梯度稀释101、102、103、104、105、106、107和108倍，去掉六孔板中的上清，取106、107、108三个稀释倍率的病毒加入到六孔板中，平行对照2组，孵育1h，配制空斑培养基，每孔加入2mL空斑培养基；第四天加入中性红染色液；7-10天计数空斑数，计算病毒滴度。
重组的Bacmid转染sf9细胞具体的操作步骤如下：
(1)在六孔板中接种细胞，每个孔中2mL细胞，浓度为9×105个/孔。所用培养基为Grace’s medium，其中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS。
(2)27℃培养1h，使细胞贴壁。
(3)在这期间制备Bacmid与转染试剂Cellfectin Reagent的复合物：
A.用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释1μg Bacmid(约5μl)。
B.使用前将Cellfectin Reagent倒置5～10次，使其充分混匀，取6ul CellfectinReagent用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释。
C.将上述A和B步骤制得的两种稀释液合并(总体积约210ul)，轻轻混匀，室温孵育15～45min。
(4)在制备Bacmid与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉培养基。
(5)在步骤(3)制得的含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Gracesmedium(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，然后加到洗涤过的细胞孔中。
(6)将六孔板内的细胞孵育5h，27℃。
(7)去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基(SF900含双抗、10％FBS。
(8)在27℃湿度培养箱中孵育72h，直到细胞出现病毒感染迹象。
(9)将感染的细胞上清和沉淀分别制备样品，后续可用westernblot鉴定样品中目的蛋白的表达情况。
D、重组蛋白的表达鉴定
sf9细胞以2×106个/ml的浓度接种于500ml细胞培养瓶中；待细胞生长至对数期，接P2代病毒感染sf9细胞；48～72h内收集细胞及上清，留待测定重组蛋白的表达量，并依此方法放大培养所述病毒。
测定蛋白表达量的具体步骤为，将收集的细胞及上清于4℃10000g离心20min，取样品上样20μl，上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时；电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1小时；用封闭液稀释一抗(RBD兔多抗，购自义翘神州)，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时；洗膜4次，每次5分钟；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时；洗膜DAB显影。
感染重组病毒的sf9细胞样品的SDS-PAGE电泳结果如图7所示，本发明所构病毒明显表达了大小为25KD左右的蛋白，并且16uL的“2”号样品所表达的目的蛋白的量与500ug的BSA相当。继而用Western-Blot验证所述病毒培养液样品，如图8所示，根据WB的抗体印迹结果进一步验证表达的目的蛋白是RBD重组蛋白。本发明设计的方案中RBD蛋白能在在细胞上清中高效表达，具有放大和下游研究的价值。
实施例2下游纯化
1、实验设计。实施例1说明RBD目的蛋白由细胞分泌表达。接下来可用根据蛋白质的分子量、等电点和疏水性等性质设计方案纯化目的蛋白，以达到能生产和应用的目的。本项目中，RBD蛋白的pI值约为9.0，分子量为26kda，利用含有目的蛋白的细胞上清液进行优选预实验，最终确定初步的纯化路径，如图6所示。
2、纯化的工艺流程：
1)膜包准备:用到100KD和30KD两种孔径的0.1m2大小的膜包。然后按照图9所示安装膜包，先用1L超纯水冲洗整个系统，再用0.5M氢氧化钠清洗系统，再次用5L超纯水清洗系统，再用平衡液平衡系统。
2)细胞上清过滤:将细胞上清经5000rpm离心去除细胞碎片和杂质，再经过0.22μm过滤器过滤。装好100KD的超滤夹具设置蠕动泵转速为80rpm，进口端与出口端压力都要小于0.3MPa，一般进口端与出口端压力差在0.1Mpa左右，，将过滤后的细胞上清作为流动相，经过超滤系统滤过，最终得到流穿液1.5L截留液0.2L。使用完毕后，滤出液为微黄色，置于4℃冰箱中保存。
3)浓缩置换
将步骤2所得的1.5L滤出液用30kd膜包进行浓缩。将所得滤出液浓缩至100ml左右，加入300ml的pH7.0的20mM磷酸盐缓冲溶液继续浓缩。按照30倍体积进行浓缩换液的原则，浓缩期间换液了大约2L的磷酸盐缓冲溶液，可认为所得浓缩液中的缓冲液变成了所述的磷酸盐缓冲。最终获得150ml样品液。置换完毕后，用1倍管路体积的缓冲液冲洗整个管路。浓缩换液后的样品呈现微黄色，于4℃冰箱中保存。
将浓缩置换过程中的样品进行电泳，结果如图10所示，浓缩置换后RBD蛋白的纯度变高。
4)SP柱子分离纯化：
SP柱：体积：21.6ml；柱效：7020；对称性：1.63；最大压力：0.3MPa；
最适流速：2.5～3ml/min；柱高：10.8cm，直径：25mm；
生产商：GE(思拓凡)
蛋白纯化仪：(赛普)
缓冲液：PH7.0磷酸缓冲液，PH8.0磷酸缓冲液，1MNaCl
其他试剂：20％乙醇，1M氢氧化钠，超纯水
实验方法：将蛋白纯化仪、缓冲液、Sp柱如图11所示组装，过2个柱体积的纯水去除20％乙醇，再过平衡液(PH7.0磷酸盐缓冲液)3个柱体积，待电导率稳定在6.5时开始上样，每次上样体积2-3个柱体积，上样完毕，继续过1个柱体积平衡液(PH7.0磷酸盐缓冲溶液)，然后更换为洗脱液进行洗脱步骤(洗脱低盐：pH8.0磷酸盐缓冲液；洗脱高盐：pH8.0磷酸盐、1M氯化钠溶液；设置洗脱梯度为：50％，70ml)。收集的信号基于280nm吸收峰，收集信号设置为高于8mha-8mha(过峰顶)，每管收集2ml。离子柱分离过程中的紫外吸光等信号的吸收值随时间的变化如图12所示，在140min左右有一个明显的蛋白吸收峰。
将纯化的蛋白进行电泳同时与已知量的BSA对比定量，结果如图13所示，经过纯化，得到高纯度高浓度的RBD蛋白。
4、质量检测
1)HPLC检测。按照药典通则0512所得蛋白样品进行HPLC检测,结果如图14所示，结果显示，该批次蛋白纯度在90％以上。
2)委托检测
本发明委托中科新生命公司测定本发明所得蛋白质的高分辨率分子量和肽段覆盖率，得出结论：本发明所得蛋白的相对分子质量为27131.25da，肽段覆盖率为100％，均与理论RBD融合蛋白相符(图15)。
本发明利用昆虫杆状病毒表达系统，实现了可工业化规模扩大的新冠病毒RBD蛋白生产的完整上下游工艺。经过密码子优化，本发明实现了新冠病毒RBD蛋白的分泌表达，经过超滤和离子交换两步纯化可以得到纯度超过90％的RBD蛋白。本发明提供的RBD蛋白的制备方案简单，有潜力投入实际疫苗的生产。
实施例3疫苗免疫效果
一、实验材料
1.病毒株及细胞株
检测所用动物为Balb/c小鼠。
检测所用细胞系为293T细胞和Vero-E6细胞，由本实验室保存。细胞培养条件：培养于添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃和5％CO2培养箱中培养。
检测所用病毒：检测所用新型冠状病毒假病毒(SARS-CoV-2pseudovirusparticles野生株，VSV病毒骨架，S基因，GenBank:MN908947.3)由本实验室保存。
2.实验试剂及仪器
受检测样品为岳阳新华达制药有限公司提供的新冠RBD蛋白，批号：RBD-20220224-P4-第五批；编号：A3-A5；体积：1mL；蛋白质总量：0.7mg；纯度(SEC-HPLC)：78.66％)。样品经过0.22μm滤膜过滤除菌。
佐剂：弗氏完全佐剂(CFA)[Sigma,目录号F5881-10ml]；弗氏不完全佐剂(IFA)[Sigma,目录号F5506-6x10ml]。
缓冲液组成：27.5mM磷酸盐+200mM氯化钠溶液(磷酸氢二钾5.59g+磷酸二氢钾0.41g+氯化钠11.7g，溶解于1000ml水)，pH 8.0。
其他主要试剂有DMEM培养基(Gibco)、胎牛血清(FBS)、胰酶、PBS缓冲液。
实验所用仪器主要有CO2培养箱、生物安全柜、光学显微镜、高内涵细胞分析仪等。
二、实验方法
1.试验动物数量及分组：15只Balb/c小鼠称重随机分组，3μg/只实验组(60μg/ml，50μl/只),6μg/只实验组(120μg/ml，50μl/只)，佐剂溶液对照组，每组5只。
2.试验免疫及处理：RBD蛋白原液经佐剂乳化，首次免疫用CFA乳化，后续免疫用IFA乳化。
3μg/只实验组：用1ml的注射器吸取0.4ml抗原(实施例2制得，0.5ml终浓度120μg/ml：85.7μl RBD原液+414.3μl缓冲液)，用另一个1ml注射器吸取37℃预热的0.4ml的佐剂，用一个双孔接头将2个注射器连接起来，进行乳化(在稀释RBD蛋白样品时，按照蛋白总量计算浓度)。
6μg/只实验组：用1ml的注射器吸取0.4ml抗原(实施例2制得，0.5ml终浓度240μg/ml：171.4μl RBD原液+328.6μl缓冲液)，用另一个1ml注射器吸取37℃预热的0.4ml的佐剂，用一个双孔接头将2个注射器连接起来，进行乳化。
佐剂对照组：用1ml的注射器吸取0.4ml缓冲液，用另一个1ml注射器吸取37℃预热的0.4ml的佐剂，用一个双孔接头将2个注射器连接起来，进行乳化。
3.免疫处理：小鼠大腿外侧肌注3次，每次间隔1周(第1、8、15天)。
4.采样：每次免疫后1周并加上末次免疫后2周(即第8、15、22、29天)进行采样，共4次。采样前进行称重，眼眶静脉采血，离心取血清冻存备用。
5.包装新型冠状病毒假病毒：(1)600万293T细胞铺到T75细胞培养瓶中，37℃和5％CO2培养箱中培养过夜备用；(2)第二天转染包装质粒30μgpCAGGS-S-del18；(3)转染24h后感染VSV-ΔG病毒(moi＝2)；(4)继续培养24-30h收集病毒液上清，离心去碎片后分装4℃保存备用。
6.假病毒滴度测定：(1)96孔板中铺Vero-E6细胞，15000个/孔，37℃和5％CO2培养箱中培养过夜备用；(2)用2％FBS的DMEM梯度稀释病毒液，每孔100μl病毒稀释液感染Vero-E6细胞，放入37℃培养箱培养20～24小时；(3)观察感染假病毒的Vero-E6细胞的荧光(GFP)，确定假病毒滴度。
7.血清中和滴度测定：(1)96孔板中铺Vero-E6细胞，15000个/孔，37℃和5％CO2培养箱中培养过夜备用；(2)中和滴度检测：血清样品从2％起始，5倍梯度稀释，6个稀释度，等体积稀释好的血清样品与病毒液(1500FFU)混匀37℃孵育1h后加入到Vero-E6细胞中培养；(3)培养24-48h，高内涵拍照(10倍镜，9个视野)，并进行分析，计算抑制率。
四、实验结果
1.新冠疫苗(RBD蛋白)免疫小鼠对小鼠体重的影响
分别在RBD蛋白免疫小鼠的第1、8、15、22、29天称每只小鼠体重，观察小鼠免疫后的体重变化。结果(图16)显示3μg/只、6μg/只小鼠体重与佐剂对照组无明显差异。
2.新冠疫苗(RBD蛋白)免疫小鼠后血清中和滴度检测
分别在RBD蛋白免疫小鼠的第8、15、22、29天取血，测血清中和新型冠状病毒假病毒滴度。结果如表3和图17所示，第一次免疫后第7天取的血清在所测试浓度范围内基本没有中和效果，第二次免疫后第7天取的血清中和效果有所提高。第三次免疫后第7天取的血清具有中和新型冠状病毒假病毒作用，免疫剂量为3μg/只组的中和滴度(IC50)为血清稀释525倍，免疫剂量为6μg/只组的中和滴度(IC50)为血清稀释1253倍。第三次免疫后第14天取的血清中和新型冠状病毒假病毒，免疫剂量为3μg/只组的中和滴度(IC50)为832，免疫剂量为6μg/只组的中和滴度(IC50)为16711。
表3血清中和新型冠状病毒假病毒作用检测
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 岳阳新华达制药有限公司
<120> 一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用
<130> MP22001741
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggttagtg ctatcgtact ttatgtgctg cttgccgctg ccgcgcactc agctttcgct 60
cgtgttcagc ctacggagtc cattgtacga ttccctaata ttacaaattt atgtcccttt 120
ggggaggtct ttaatgcaac tcgtttcgct tctgtgtatg cctggaatcg caaacgaata 180
agcaattgcg ttgcggatta tagtgtccta tacaactcgg caagtttctc gacctttaag 240
tgttacggag tgagcccaac gaaactcaac gatctgtgtt tcactaatgt atatgccgat 300
tcctttgtga taagaggtga cgaagttaga caaattgcgc cgggacaaac agggaaaatc 360
gcggactaca actacaagtt gcctgacgac tttaccgggt gcgtaatagc gtggaactca 420
aataatctcg attcaaaggt cggcggcaac tacaattatc tttatcgctt gtttaggaag 480
tctaatttga aaccatttga acgggacata tctaccgaaa tctaccaggc aggcagcact 540
ccctgcaatg gtgtcgaggg gtttaactgt tatttcccgt tacaatcata cggcttccag 600
ccaacgaacg gagtcggtta tcagccgtac cgtgttgtag tcttatcgtt cgagctacta 660
catgcaccgg caacggtgtg cggacccaag aaatccacaa acctcgttaa gaacaaatgt 720
gtaaacttct ga 732
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtgttcagc ctacggagtc cattgtacga ttccctaata ttacaaattt atgtcccttt 60
ggggaggtct ttaatgcaac tcgtttcgct tctgtgtatg cctggaatcg caaacgaata 120
agcaattgcg ttgcggatta tagtgtccta tacaactcgg caagtttctc gacctttaag 180
tgttacggag tgagcccaac gaaactcaac gatctgtgtt tcactaatgt atatgccgat 240
tcctttgtga taagaggtga cgaagttaga caaattgcgc cgggacaaac agggaaaatc 300
gcggactaca actacaagtt gcctgacgac tttaccgggt gcgtaatagc gtggaactca 360
aataatctcg attcaaaggt cggcggcaac tacaattatc tttatcgctt gtttaggaag 420
tctaatttga aaccatttga acgggacata tctaccgaaa tctaccaggc aggcagcact 480
ccctgcaatg gtgtcgaggg gtttaactgt tatttcccgt tacaatcata cggcttccag 540
ccaacgaacg gagtcggtta tcagccgtac cgtgttgtag tcttatcgtt cgagctacta 600
catgcaccgg caacggtgtg cggacccaag aaatccacaa acctcgttaa gaacaaatgt 660
gtaaacttct ga 672

Claims (8)

1.编码RBD蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
2.质粒载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。
3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，所述骨架载体包括pFastbac质粒或杆状病毒穿梭质粒。
4.转化或转染有权利要求3所述的质粒载体的宿主，所述宿主包括昆虫细胞或大肠杆菌。
5.一种用于Bac-to-Bac表达系统的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒的基因组中包括权利要求1所述的核酸。
6.RBD蛋白的制备方法，其特征在于，包括：用权利要求5所述的重组杆状病毒侵染昆虫细胞后表达目的蛋白、然后从所述昆虫细胞的培养上清液中纯化目的蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，所述纯化目的蛋白的步骤包括超滤和离子交换层析。
8.权利要求1所述的核酸、权利要求2或3所述的质粒载体、权利要求4所述的宿主和/或权利要求5所述的病毒在制备预防新型冠状病毒感染的疫苗中的应用；所述新型冠状病毒为SARS-Cov-2。
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