CN112386684A - 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种covid-19疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112386684A
CN112386684A CN202011264313.XA CN202011264313A CN112386684A CN 112386684 A CN112386684 A CN 112386684A CN 202011264313 A CN202011264313 A CN 202011264313A CN 112386684 A CN112386684 A CN 112386684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
covid
vector
vaccine
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011264313.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112386684B (zh
Inventor
李鹏
秦乐
汤朝阳
蒋治武
赵若聪
崔元彬
姚瑶
胡朵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Zhaotai Cell Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Foshan Zhaotai Innovation Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Zhaotai Innovation Biotechnology Co ltd filed Critical Foshan Zhaotai Innovation Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011264313.XA priority Critical patent/CN112386684B/zh
Publication of CN112386684A publication Critical patent/CN112386684A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112386684B publication Critical patent/CN112386684B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供了一种COVID‑19疫苗及其制备方法和应用，所述COVID‑19疫苗包括表达SARS‑CoV‑2 S蛋白的T细胞；所述COVID‑19疫苗的制备方法包括以下步骤：(1)将SARS‑CoV‑2 S蛋白的编码基因插入腺病毒载体中，构建重组腺病毒载体；(2)将重组腺病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞，制备重组腺病毒；(3)采用重组腺病毒感染T细胞，得到COVID‑19疫苗。本发明利用病毒系统构建表达SARS‑CoV‑2 S蛋白的重组T细胞，回输入机体内持续性表达S蛋白，诱导机体产生特异性体液免疫反应或细胞免疫反应，使机体获得对SARS‑CoV‑2的保护性免疫能力。

Description

一种COVID-19疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种COVID-19疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎(COVID-19)传染性极强，国内外科研工作者正在紧锣密鼓地进行疫苗研发。研究发现，SARS-CoV-2在人体内的感染途径与SARS-CoV类似，病毒的棘突蛋白S蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)相互作用，感染呼吸道上皮细胞。针对SARS，研究者尝试了类病毒、蛋白亚单位等多种形式制备疫苗，并成功在动物实验中诱导产生中和抗体，但是尚无任何针对SARS病毒的疫苗进入临床阶段。
冠状病毒的S蛋白通过识别宿主细胞受体介导病毒和细胞膜的融合，在病毒感染中发挥重要作用，是病毒生命周期的关键，也是抗病毒药物和疫苗的主要目标。SARS-CoV-2病毒的S蛋白是位于病毒外壳的I型病毒融合蛋白，由约1,300个氨基酸组成，可被水解为一个氨基(N)末端的S1亚基(约700个氨基酸)和一个羧基(C)末端的S2亚基(约600个氨基酸)。S1亚基是受体结合亚基，包含受体结合结构域(RBD)；S2亚基是融合亚基，包含疏水融合肽和两个七肽重复区。冠状病毒S蛋白具有两个不同的蛋白酶切割位点。SARS-CoV的S蛋白的S1/S2裂解位点位于前体蛋白的残基667之后，而S2'裂解位点在S2亚基上，位于其N端130个氨基酸处。
传统疫苗多为灭活的死疫苗、减毒疫苗或重组亚单元疫苗，制备工艺存在诸多问题：(1)制备工艺复杂，需要使用细胞培养方法生产病毒，存在一定的安全性隐患；(2)质量控制和工艺放大要求高，控制不好会引发产品质量事故；(3)有效抗原量低，需要增加生产成本提高病毒滴度。
新型疫苗为含有抗原蛋白的编码核酸或能激发特异性免疫应答的细胞疫苗，新型冠状病毒疫苗的种类包括腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗和重组蛋白疫苗等。截止目前，COVID-19的生物特性还不甚明显，传染性很强，活疫苗缺乏安全性且制备较困难，灭活疫苗存在与野毒株重组而恢复的风险。相比之下，基于基因工程制备的能激发特异性免疫应答的细胞疫苗具有更强的安全性、实用性以及可操作性。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种COVID-19疫苗及其制备方法和应用，利用基因工程载体将病毒抗原基因导入T细胞，使T细胞持续表达病毒抗原，回输机体后引发机体针对抗原的特异性体液或细胞免疫反应，产生中和抗体或特异性T细胞，使机体获得针对该病毒的保护性免疫能力。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种COVID-19疫苗，所述COVID-19疫苗包括表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞。
本发明中，采用基因工程的方法构建表达SARS-CoV-2S蛋白的重组T细胞，所述重组T细胞持续性表达抗原S蛋白，诱导机体产生特异性体液免疫反应或细胞免疫反应，相较于病毒型疫苗，安全性更高。
优选地，所述S蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。
优选地，所述T细胞包括自体来源T细胞和/或异体来源T细胞。
本发明中，COVID-19疫苗可以由自体T细胞和/或异体T细胞通过病毒转染方法制备得到，原料来源广泛，制备周期短、制备成本低，适用于推广应用。
优选地，所述COVID-19疫苗还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括SARS-CoV-2S蛋白的编码基因。
本发明中，构建含有SARS-CoV-2S蛋白的编码基因的重组载体，用于包装成病毒系统制备稳定表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞，作为疫苗诱导机体产生免疫反应。
优选地，所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
SEQ ID NO:2：
atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggGtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagagacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgacCCaCCtgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacataa。
优选地，所述重组载体为含有SARS-CoV-2S蛋白的编码基因的病毒载体。
优选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为腺病毒载体。
优选地，所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因位于腺病毒载体的Kozak和BGH pA位点之间。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的重组载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的COVID-19疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)全基因合成SARS-CoV-2S蛋白的编码基因SEQ ID NO:2，将所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因插入腺病毒载体的Kozak和BGH pA位点之间，构建重组腺病毒载体；
(2)将所述重组腺病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞，制备得到重组腺病毒；
(3)采用重组腺病毒感染T细胞，筛选阳性细胞培养一段时间，得到所述COVID-19疫苗。
优选地，所述重组腺病毒感染T细胞的MOI为100～500，例如可以是100、200、300、400或500，优选为200。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的COVID-19疫苗在制备COVID-19预防药物和/或COVID-19治疗药物中的应用。
第六方面，本发明提供了一种COVID-19的治疗方法，所述治疗方法包括将第一方面所述的COVID-19疫苗注射入机体的步骤，COVID-19疫苗的S蛋白抗原表位使机体发生特异性体液或细胞免疫反应，产生针对SARS-CoV-2S蛋白的IgG/IgM抗体或特异性T细胞，使机体获得对SARS-CoV-2病毒的保护性免疫能力。
优选地，在COVID-19疫苗注射入机体，还包括获取自体来源和/或异体来源的T细胞并用第三方面所述的重组病毒感染，制备COVID-19疫苗的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的COVID-19疫苗为持续性表达SARS-CoV-2S蛋白的重组T细胞，回输入机体内可以诱导机体发生体液免疫反应或细胞免疫反应，产生针对S蛋白的中和抗体或特异性T细胞，免疫后21天接近病毒直接免疫组水平；
(2)本发明的COVID-19疫苗采用自体来源和/或异体来源的T细胞制备得到，不仅能够高效免疫机体产生保护性免疫反应，而且安全可靠，与病毒型疫苗相比，安全性得到保证，避免了将机体暴露于病毒环境中而可能产生的免疫毒性反应；
(3)本发明的COVID-19疫苗原料来源广泛，制备工艺简单成熟，无需病毒灭活等复杂工艺，可操作性强，质量可控，适用于推广应用。
附图说明
图1为过表达SARS-CoV-2S蛋白编码基因的重组Ad5腺病毒载体；
图2为重组Ad5腺病毒载体图谱；
图3为流式检测小鼠T细胞转导AdV-GFP(对照组)与AdV-S蛋白-GFP(实验组)的GFP阳性细胞比例；
图4为过表达SARS-CoV-2S蛋白T细胞的小鼠体内实验示意图；
图5为过表达SARS-CoV-2S蛋白T细胞在小鼠体内引发体液免疫反应；
图6为体外假病毒感染中和实验结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1构建过表达SARS-CoV-2S蛋白编码基因的AdV5腺病毒载体
本实施例首先利用分子克隆技术获得持续性表达SARS-CoV-2S蛋白分子的质粒载体pUC57-S；随后对pUC57-S质粒进行PCR获得S蛋白编码基因(SEQ ID NO:2)，利用同源重组方式连接至AdV5腺病毒载体(含GFP基因)的Kozak和BGH pA位点之间，构建得到如图1所示的AdV5-S载体，图谱如图2所示。
实施例2SARS-CoV-2假病毒包装
在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
2小时后，配制转染试剂，取500μL opti-DMEM至15mL离心管中，加入7.2μL浓度为10μg/μL的PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；取500μL opti-DMEM至1.5mL离心管中，取SARS-CoV-2S蛋白重组腺病毒载体9μg、pMD2.G辅助质粒3μg和psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀，加入到转染试剂中，颠倒混匀，静置20min；
将上述混合液全部加到293T细胞中，孵育6h后，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；24h后收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
24h后再次收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；24h后收集上清，并且丢弃细胞；培养基上清收集完毕后，在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，得到SARS-CoV-2假病毒原液；
将假病毒原液置于30KD超滤管中，5000rcf离心20min收集浓缩液；利用AKTA pure快速蛋白纯化系统纯化浓缩液，即获得纯化的SARS-CoV-2假病毒。
实施例3构建表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞
T细胞获取和分选：将C57/BL6小鼠脱颈处死后在无菌环境中进行解剖，分离出完整的脾脏；使用注射器研磨脾脏，并通过筛网过滤成单细胞悬液；使用mouse Pan T cellisolation kit进行T细胞分选，目标经分选获得活T细胞量≥4×107，活率≥70％；
T细胞激活：采用预包被anti-CD3/CD28抗体的24孔板进行T细胞激活，将1×107个小鼠脾脏T细胞用2mL含有10％FBS和300IU mouse IL-2的1640培养基中重悬后加入到24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中激活48±3小时；
腺病毒转导：将激活的小鼠T细胞离心收集并重悬，以1×107个细胞/每孔加入MOI＝200病毒液的比例进行AdV转导，单次转导持续72±2小时，转导完成1天后流式检测GFP阳性细胞的比例。
结果如图3所示，对照组单独过表达GFP标签基因和实验组同时过表达S蛋白和GFP标签基因的AdV腺病毒均能够成功转导小鼠原代T细胞。
实施例4过表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞自体回输小鼠体内实验
将转导后的T细胞在含有10％FBS和300IU mouse IL-2的1640培养基中扩增培养，每隔2天进行一次半换液并计数，直至细胞数量达到体内实验需求；
收集实验组T细胞(表达SARS-CoV-2S蛋白)和对照组T细胞(表达GFP)，用100～200μL PBS重悬，将2×106个实验组T细胞(Group1)或对照组T细胞(Group2)尾静脉注射回输至自体C57/BL6小鼠体内；另将2×109vp过表达S蛋白的AdV直接肌肉注射至自体C57/BL6小鼠体内，作为Group3。
实施例5过表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞异体回输小鼠体内实验
将转导后的T细胞在含有10％FBS和300IU mouse IL-2的1640培养基中扩增培养，每隔2天进行一次半换液并计数，直至细胞数量达到体内实验需求；
收集实验组T细胞(表达SARS-CoV-2S蛋白)和对照组T细胞(表达GFP)，用100～200μL PBS重悬，将2×106个实验组T细胞(Group1)或对照组T细胞(Group2)尾静脉注射回输至异体C57/BL6小鼠体内；另将2×109vp过表达S蛋白的AdV直接肌肉注射至异体C57/BL6小鼠体内，作为Group3。
实施例6小鼠体液免疫反应
不同组别的小鼠按照实施例4或实施例5的步骤免疫后，按照图4所示的时间点进行采血，分离血清，利用ELISA检测血清中针对SARS-CoV-2S蛋白的抗体滴度。步骤如下：
向96孔板的每孔中加入0.05μg全长S蛋白(sino Biological Inc,china)，4℃包被过夜，使用含2％BSA的PBST缓冲液室温封闭2小时，得到包被有S蛋白的ELISA板；
将血清样本加入96孔板的每一孔中，37℃孵育30min，再加入1:2000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗(Beyotime Biotechnology,China)，室温孵育30min，加入TMB显色底物，置于酶标仪中，450nm波长处读数。
检测结果如图5所示，相比于对照组表达GFP的T细胞(Group2，Mock)，表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞能够在小鼠体内引发强烈的体液免疫反应(Group1，T-S)，小鼠血清中针对S蛋白S1片段、S2片段和RBD(S蛋白受体结合结构域)的特异性IgG显著升高，且这一作用在免疫后21天接近Adv5病毒直接免疫组(Group3，Ad-S)水平。
实施例7体外假病毒感染中和试验
为了进一步验证小鼠血清中的中和抗体抗新冠病毒的能力，本实施例按照表1进行体外假病毒感染中和实验，具体实验步骤如下：
(1)将100μL待测小鼠血清加入到300μL 1640培养基中，0.22μm滤膜过滤；
(2)向96孔板中加入含待测血清的培养基200μL，同时每孔加入10μL假病毒，4℃孵育30min；
(3)向96孔板的每孔中加入5×104个H1299-ACE2细胞；
(4)48h后加入100μL荧光素酶底物检测荧光强度。
表1
mAB 10μg/mL 10μg/mL 5μg/mL
腺病毒组 小鼠1 小鼠2 小鼠3
无处理小鼠组 小鼠1 小鼠2 小鼠3
T细胞组 小鼠1 小鼠2 小鼠3
无病毒组 小鼠1 小鼠2 小鼠3
结果如图6所示，培养48h后，腺病毒组检测到最弱的荧光强度，说明腺病毒组的小鼠血清中产生中和抗体，中和新冠病毒的能力最强，T细胞组次之，无处理组的小鼠血清中和病毒能力最弱。
综上所述，本发明利用基因工程方法构建表达SARS-CoV-2S蛋白的重组T细胞，所述重组T细胞回输入机体内持续性表达抗原S蛋白，诱导机体产生特异性体液免疫反应或细胞免疫反应，相较于病毒型疫苗，安全性高、免疫能力强。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山昭泰创新生物科技有限公司
<120> 一种COVID-19疫苗及其制备方法和应用
<130> 20201110
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 2
<211> 3822
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒
<400> 2
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg gtgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacccacc tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

Claims (10)

1.一种COVID-19疫苗，其特征在于，所述COVID-19疫苗包括表达SARS-CoV-2S蛋白的T细胞。
2.根据权利要求1所述的COVID-19疫苗，其特征在于，所述S蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述T细胞包括自体来源T细胞和/或异体来源T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的COVID-19疫苗，其特征在于，所述COVID-19疫苗还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括SARS-CoV-2S蛋白的编码基因；
优选地，所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为含有SARS-CoV-2S蛋白的编码基因的病毒载体；
优选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为腺病毒载体。
6.根据权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于，所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因位于腺病毒载体的Kozak和BGH pA位点之间。
7.一种重组病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求4-6任一项所述的重组载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
8.一种权利要求1-3任一项所述的COVID-19疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)全基因合成SARS-CoV-2S蛋白的编码基因SEQ ID NO:2，将所述SARS-CoV-2S蛋白的编码基因插入腺病毒载体的Kozak和BGH pA位点之间，构建重组腺病毒载体；
(2)将所述重组腺病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞，制备得到重组腺病毒；
(3)采用重组腺病毒感染T细胞，筛选阳性细胞培养一段时间，得到所述COVID-19疫苗。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒感染T细胞的MOI为100～500。
10.权利要求1-3任一项所述的COVID-19疫苗在制备COVID-19预防药物和/或COVID-19治疗药物中的应用。
CN202011264313.XA 2020-11-12 2020-11-12 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用 Active CN112386684B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011264313.XA CN112386684B (zh) 2020-11-12 2020-11-12 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011264313.XA CN112386684B (zh) 2020-11-12 2020-11-12 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112386684A true CN112386684A (zh) 2021-02-23
CN112386684B CN112386684B (zh) 2023-12-05

Family

ID=74599275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011264313.XA Active CN112386684B (zh) 2020-11-12 2020-11-12 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112386684B (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113402591A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 李丁 基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用
CN113444156A (zh) * 2021-06-07 2021-09-28 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 新型冠状病毒肺炎重组人5型腺病毒疫苗
CN114150005A (zh) * 2022-02-09 2022-03-08 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
WO2022232300A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 expressing sars-cov-2 spike protein and its use
WO2022233287A1 (zh) * 2021-05-04 2022-11-10 斯微(上海)生物科技股份有限公司 一种疫苗试剂和接种方法
CN115820556A (zh) * 2022-07-14 2023-03-21 厦门大学 重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用
WO2023051701A1 (zh) * 2021-09-29 2023-04-06 成都威斯津生物医药科技有限公司 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗
CN116617382A (zh) * 2022-09-30 2023-08-22 珠海丽凡达生物技术有限公司 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2023169500A1 (zh) * 2022-03-09 2023-09-14 中生复诺健生物科技(上海)有限公司 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
CN116925195A (zh) * 2022-04-22 2023-10-24 仁景(苏州)生物科技有限公司 一种基于新型冠状病毒的mRNA疫苗

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160136251A1 (en) * 2014-03-06 2016-05-19 The Catholic University Of Korea Industryacademic Cooperation Foundation CD4 T Cell Vaccine and Use Thereof
CN110317830A (zh) * 2019-04-18 2019-10-11 肇庆大华农生物药品有限公司 一种鸭腺病毒2型dna疫苗及其制备方法和应用
CN111358953A (zh) * 2020-03-25 2020-07-03 上海市公共卫生临床中心 一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途
CN111518175A (zh) * 2020-05-11 2020-08-11 广州派真生物技术有限公司 Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160136251A1 (en) * 2014-03-06 2016-05-19 The Catholic University Of Korea Industryacademic Cooperation Foundation CD4 T Cell Vaccine and Use Thereof
CN110317830A (zh) * 2019-04-18 2019-10-11 肇庆大华农生物药品有限公司 一种鸭腺病毒2型dna疫苗及其制备方法和应用
CN111358953A (zh) * 2020-03-25 2020-07-03 上海市公共卫生临床中心 一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途
CN111518175A (zh) * 2020-05-11 2020-08-11 广州派真生物技术有限公司 Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
病毒学报: "COVID-19疫苗的研究进展", 《病毒学报》, vol. 36, no. 4, pages 687 *
郝春秋: "HCV结构蛋白腺病毒表达载体的构建及T细胞疫苗对HCV清除作用的研究", 《中国博士学位论文电子期刊网》, pages 47 - 61 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022232300A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 expressing sars-cov-2 spike protein and its use
WO2022233287A1 (zh) * 2021-05-04 2022-11-10 斯微(上海)生物科技股份有限公司 一种疫苗试剂和接种方法
CN113444156A (zh) * 2021-06-07 2021-09-28 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 新型冠状病毒肺炎重组人5型腺病毒疫苗
CN113444156B (zh) * 2021-06-07 2022-06-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 新型冠状病毒肺炎重组人5型腺病毒疫苗
CN113402591A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 李丁 基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用
WO2023051701A1 (zh) * 2021-09-29 2023-04-06 成都威斯津生物医药科技有限公司 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
CN114150005A (zh) * 2022-02-09 2022-03-08 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
WO2023169500A1 (zh) * 2022-03-09 2023-09-14 中生复诺健生物科技(上海)有限公司 编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA疫苗
CN116925195A (zh) * 2022-04-22 2023-10-24 仁景(苏州)生物科技有限公司 一种基于新型冠状病毒的mRNA疫苗
CN115820556A (zh) * 2022-07-14 2023-03-21 厦门大学 重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用
CN116617382A (zh) * 2022-09-30 2023-08-22 珠海丽凡达生物技术有限公司 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
CN116617382B (zh) * 2022-09-30 2024-02-02 珠海丽凡达生物技术有限公司 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112386684B (zh) 2023-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112386684B (zh) 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用
CN113185613B (zh) 新型冠状病毒s蛋白及其亚单位疫苗
CN112538105B (zh) 稳定的冠状病毒刺突(s)蛋白抗原和相关疫苗
CN113416259B (zh) 一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用
CN113230395B (zh) 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
CN111560076B (zh) 一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
CN113943373B (zh) 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
CN105263506A (zh) 稳定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚体疫苗及其使用方法
Lévy et al. Lentiviral vectors displaying modified measles virus gp overcome pre-existing immunity in in vivo-like transduction of human T and B cells
CN110964697A (zh) 一种抗肿瘤nk细胞及其制备方法和应用
CN112442514B (zh) 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
CN112010984A (zh) 一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白多聚体纳米疫苗
CN113151184A (zh) 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法
CN111139222B (zh) 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途
CN116836243A (zh) 呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突变体及其应用
CN116410992A (zh) 预防和/或治疗新型冠状病毒的mRNA、疫苗及其制备方法和应用
He et al. Heavy-chain CDR3-engineered B cells facilitate in vivo evaluation of HIV-1 vaccine candidates
CN117362417A (zh) 广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用
CN110878126B (zh) Tcr样嵌合抗原受体及其应用
CN116621949B (zh) 一种增加狂犬病毒g蛋白分泌表达的方法及应用
CN115975042B (zh) 一种β冠状病毒异源多聚体抗原、其制备方法和应用
CN116024269B (zh) 一种冠状病毒假病毒颗粒的制备方法
CN112521515B (zh) Cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用
EP4257688A9 (en) Nucleic acid construct for aids gene therapy
CN114751992A (zh) 一种冠状病毒的通用疫苗及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230526

Address after: No. 0501, No. 3 Zhicheng Road, Fengsha Village, Daliang Street, Shunde District, Foshan City, Guangdong Province, 528399

Applicant after: Guangdong Zhaotai Cell Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No.3, Zhicheng Road, fengsha village, Daliang street, Shunde District, Foshan City, Guangdong Province, 528399 0506

Applicant before: Foshan Zhaotai innovation Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant