ES2201611T3 - Utilizacion del magnesio (mg2+) para aumentar la introduccion de genes en terapia genica. - Google Patents
Utilizacion del magnesio (mg2+) para aumentar la introduccion de genes en terapia genica.Info
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Abstract
Utilización de magnesio (Mg2+) para la preparación de un compuesto terapéutico o profiláctico para la transfección in vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia génica o en la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una concentración de entre 0, 1 a 10 mM aproximadamente.
Description
Utilización del magnesio (Mg^{2+}) para
aumentar la introducción de genes en terapia génica.
La presente invención se refiere a la utilización
de magnesio (Mg^{+2})para la preparación de un compuesto
terapéutico, con el objetivo de mejorar la transfección de un
polinucleótido a una célula. Tal compuesto es útil en la terapia
génica, vacunación, y cualquier situación terapéutica o profiláctica
en la que un producto basado en un gen se administra a células in
vivo.
La terapia génica se ha concebido generalmente
como aplicable principalmente a las enfermedades caracterizadas por
deficiencias heredables (fibrosis quística, distrofias, hemofilias,
etc.), en las que puede llevarse a cabo la curación permanente
introduciendo un gen funcional. Sin embargo, un grupo mucho más
amplio de enfermedades, especialmente las enfermedades adquiridas
(cáncer, SIDA, esclerosis múltiple, etc.), podría ser susceptible de
tratamiento aplicando transitoriamente las técnicas de ingeniería
genética a células huésped para producir proteínas beneficiosas.
Las aplicaciones son, por ejemplo, el tratamiento
de distrofias musculares o de fibrosis quísticas. Los genes de la
distrofia muscular de Duchenne/Becker y de la fibrosis quística se
han identificado y codifican los polipéptidos denominados distrofina
y regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis
quística (CFTR) respectivamente. La expresión directa de estos genes
en el interior de, respectivamente, las células musculares o de las
pulmonares de los pacientes, contribuirá a un mejora significativa
de los síntomas mediante la expresión del polipéptido funcional en
los tejidos diana. Además, en la fibrosis quística, los estudios han
sugerido que se requeriría alcanzar la expresión del producto del
gen CFTR en sólo el 5% de las células epiteliales pulmonares, a
efectos de mejorar significativamente los síntomas pulmonares.
Otra aplicación de la terapia génica es la
vacunación. A este respecto, el producto inmunogénico codificado por
el polinucleótido introducido en las células de un vertebrado puede
ser expresado y secretado o ser presentado por dichas células en el
contexto de los antígenos del complejo principal de
histocompatibilidad, provocando de este modo una respuesta inmune
contra el inmunógeno expresado. Los polinucleótidos funcionales
pueden introducirse en las células mediante diversas técnicas que
dan lugar a la expresión transitoria del gen de interés, a la que se
alude como transfección transitoria, o a la transformación
permanente de las células huésped que provienen de la incorporación
del polinucleótido al genoma del huésped.
La terapia génica satisfactoria depende del
suministro eficiente a y de la expresión de la información genética
en el interior de las células de un organismo viviente. La mayoría
de los mecanismos de suministro utilizados hasta la fecha implican a
vectores víricos, especialmente a vectores adeno y retrovíricos. Los
virus han desarrollado diversos mecanismos muy sofisticados para
alcanzar este objetivo, incluyendo el cruce de la membrana celular,
el escape de la degradación lisosómica, el suministro de su genoma
al núcleo y, consecuentemente, se han utilizado en muchas
aplicaciones de suministro génico en la vacunación o en la terapia
génica aplicada al hombre. La utilización de virus presenta algunas
desventajas: los vectores retrovíricos no pueden acomodar el ADN de
gran tamaño (por ejemplo, el gen de la distrofina que tiene
alrededor de 13 Kb), el genoma retrovírico se integra en el ADN de
la célula huésped y puede causar, de este modo, cambios genéticos en
la célula receptora y las partículas víricas infecciosas podrían
diseminarse en el organismo o en el entorno, y los vectores
adenovíricos pueden inducir una intensa respuesta inmune en los
pacientes tratados (Mc Coy y otros, Human Gene Therapy 6 (1995),
páginas 1553-1560; Yang y otros, Immunity 1 (1996),
páginas 433-442). Sin embargo, a pesar de estos
inconvenientes, los vectores víricos constituyen habitualmente los
sistemas de suministro más útiles debido a su eficiencia.
Se han desarrollado sistemas de suministro no
vírico que se basan en mecanismos mediados por los receptores
(Perales y otros, Eur. J. Biochem 226 (1994), páginas
255-266; Wagner y otros, Advanced Drug Delivery
Reviews 14 (1994), páginas 113-135), sobre la
transfección mediada por polímero tal como la poliamidoamina
(Haensler y Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), páginas
372-379), el polímero dendrítico (WO 95/24221),
polietilén imina o polipropilén imina (WO 96/02655), polilisina
(US-A-5 595 897 ó FR 2 719 316) o
sobre la transfección mediada por lípidos (Felgner y otros, Nature
337 (1989), páginas 387-388), tal como DOTMA
(Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), páginas
7413-7417), DOGS o Transfectam^{TM} (Behr y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), páginas
6982-6986), DMRIE o DORIE (Felgner y otros, Methods
5 (1993), páginas 67-75, DC-CHOL
(Gao y Huang, BBRC 179 (1991), páginas 280-285),
DOTAP^{TM} (McLachlan y otros, Gene Therapy 2 (1995), páginas
674-622) o Lipofectamina^{TM}. Estos sistemas
presentan ventajas potenciales con respecto a la producción a gran
escala, seguridad, diana de las células transfectables,
inmunogenicidad baja y la capacidad de suministrar grandes
fragmentos de ADN. Sin embargo, su eficiencia in vivo es
todavía limitada.
Finalmente, en 1990, Wolff y otros (Science 247
(1990), páginas 1465-1468) mostraron que la
inyección directa en el músculo esquelético del ratón, del ARN ó ADN
desnudos, sin un sistema de suministro específico, da lugar a la
expresión de genes informadores en el interior de las células
musculares. Esta técnica para transfectar células ofrece la ventaja
de la simplicidad y se han llevado a cabo experimentos que avalan la
utilidad de este sistema para el suministro al pulmón (Tsan y otros,
Am. J. Physiol. 268 (1995), páginas L102-L1056;
Meyer y otros, Gene Therapy 2 (1995), páginas
450-460), cerebro (Schwartz y otros, Gene Therapy 3
(1996), páginas 405-411), articulaciones (Evans y
Roddins, Gene therapy for arthritis; en Wolff (ed) Gene
Therapeutics: Methods and Applications of direct Gene Transfer.
Birkhaiser. Boston (1990), páginas 320-343),
tiroides (Sikes y otros, Human Gen. Ther. 5 (1994), páginas
837-844), piel (Raz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91 (1994), páginas 9519-9523) e hígado (Hickman
y otros, Hum. Gen. Ther. 5 (1994), páginas
1477-1483).
Sin embargo, Davis y otros (Human Gene Therapy 4
(1993), páginas 151-159 y Human Mol. Genet. 4
(1993), páginas 733-740) observaron una gran
variabilidad de la expresión del ADN desnudo inyectado en el músculo
esquelético in vivo que hubiera sido insuficiente para el
tratamiento de las miopatías primarias, por ejemplo. Los autores
proponen soluciones a efectos de obtener una mejora de la eficiencia
de la transferencia génica, preinyectando los músculos con un
volumen relativamente grande de sacarosa hipertónica o con toxinas,
por ejemplo, cardiotoxina aislada de serpientes, a efectos de
estimular la regeneración de los músculos. Sin embargo, estos
métodos, aunque prometedores, no serían aplicables para el
tratamiento humano.
Así pues, los métodos de suministro disponibles
no son satisfactorios en términos de seguridad o de eficiencia para
su ejecución en la terapia génica in vivo.
Por lo tanto, el problema técnico que subyace en
la presente invención es la provisión de métodos mejorados y de
medios para el suministro de moléculas de ácido nucleico en la
terapia génica.
Este problema técnico se resuelve proveyendo
formas de realización tal como se definen en las
reivindicaciones.
Así pues, la presente invención se refiere a la
utilización de magnesio (Mg^{2+}) para la preparación de un
compuesto terapéutico o profiláctico para la transfección in
vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia génica o en
la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una
concentración de entre 0,1 y 10 mM aproximadamente. Se descubrió,
sorprendentemente, que la adición específica de magnesio en la
transfección de un polinucleótido a los tejidos de los vertebrados
conduce a una mejora importante en la eficiencia de la transfección.
De este modo, la presente invención se refiere a la utilización del
magnesio (Mg^{2+}) para la preparación de un compuesto
farmacéutico para una transfección mejorada de un polinucleótido a
una célula. El término "transfección mejorada" en el alcance de
la presente invención significa, a este respecto, una captación más
eficiente de un polinucleótido por las células, cuando el magnesio
(Mg^{2+}) se encuentra presente, comparado con una introducción
realizada sin magnesio. Esto puede determinarse comparando la
cantidad del polinucleótido captada sin utilización de magnesio y
comparando esta cantidad con la captada por las células cuando se
utiliza magnesio bajo las mismas condiciones experimentales.
Preferentemente, la mejora en la transfección puede determinarse
mediante una cantidad expresada más alta del polinucleótido
transferido a las células cuando se utiliza magnesio (Mg^{+2}) en
comparación a cuando no se lo utiliza.
Los compuestos terapéuticos preparados según la
utilización de la presente invención son particularmente útiles para
el suministro de polinucleótidos a las células o tejidos de un
individuo en el ámbito de un método terapéutico génico, pero no se
limitan a tal utilización. El término "método terapéutico
génico" se entiende preferentemente como un método para la
transfección de un polinucleótido a las células in vivo.
"Terapia génica", en particular, se refiere al caso en el que
el producto génico se expresa en un tejido diana, así como también
el caso en el que el producto génico es excretado, especialmente a
la corriente sanguínea.
En el ámbito de la presente invención, el término
"transfección" significa la transferencia del polinucleótido a
una célula, en la que el polinucleótido no se asocia con partículas
víricas. Así pues, la transfección debe distinguirse de la
infección, que se refiere a polinucleótidos asociados con partículas
víricas.
El magnesio (Mg^{2+}) ha mostrado que:
- -
- reduce la interacción del virus con agua, conduciendo a una disminución en el grado de penetración acuosa en la cápsida vírica (Chen y otros, Arch. Biochem. Biophys. 342 (1997), páginas 108-116);
- -
- se une a los ácidos nucleicos (Rowatt y Williams, J. Inorg. Biochem. 46 (1992), páginas 87-97);
- -
- influencian la inactivación de la DNasa mediante tratamiento calorífico (Bickler y otros, Biotechniques 13 (1992), páginas 64-6);
- -
- está implicado en funciones metabólicas tal como glicólisis, síntesis de ARN/ADN o la síntesis proteica (Günter, Magnesium 5 (1986), páginas 53-9);
- -
- actúa como un cofactor para la unión de la proteína C a su sitio específico en el ADN (De y otros, Biochemistry 37 (1998), páginas 3831-8) o de la endonucleasa de restricción EcoRV (Thielking y otros, Biochemistry 31 (1992), páginas 3727-32).
El resumen de la solicitud de patente Japonesa
(J08308573) da a conocer un método in vitro para la
introducción de un gen en las células utilizando un virus como
vector, preparado en un medio de infección vírica que contiene
ingredientes sin suero o iones metálicos divalentes seleccionados de
entre Mg, Ca y Zn combinados con un medio de cultivo celular basado
en aminoácidos.
El término "magnesio (Mg^{2+})" tal como
se utiliza en la presente memoria, significa el catión divalente del
magnesio. Tal producto se encuentra disponible comercialmente
asociado con uno o varios aniones biológicamente aceptables, tales
como, por ejemplo, bisulfito, cromato, fluoruro, gluconato, acetato,
hidróxido, yoduro, metóxido, óxido, fosfato, sulfato, cloruro,
bromuro, etc. (véase el catálogo Aldrich, 1994/1995, por ejemplo).
Según una realización preferente, dicho magnesio (Mg^{2+}) está
asociado con cloruro (MgCl_{2}).
La cantidad de magnesio en los compuestos
preparados según la utilización de la presente invención es del
orden de 0,1 a 10 mM aproximadamente, y preferentemente todavía de
0,5 mM. Esta concentración puede también ser adaptada por los
expertos en la materia en casos particulares en los que la
concentración de magnesio puede verse afectada. Por ejemplo, cuando
el compuesto terapéutico comprende además un agente quelante, tal
como EDTA, sería preferible mejorar la concentración de magnesio a
efectos de compensar la reducción del magnesio debida a la
quelación. Esto puede ocurrir cuando el polinucleótido se ha
preparado previamente en un tampón tal como TE
(Tris-EDTA).
En una realización preferente, el compuesto
terapéutico preparado según el uso de la presente invención se
realiza en una forma para la administración a un tejido de
vertebrado. Estos tejidos incluyen los del músculo, piel, cerebro,
pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfáticos, hueso,
cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino,
testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojos,
glándulas, tejido conjuntivo, sangre, tumorales, etc. Las células en
las que la transfección mejorada de un polinucleótido extraño se
puede obtener son aquellas que se encuentran en cada uno de los
tejidos diana listados (células musculares, células de las vías
aéreas, células hematopoyéticas, etc.). La administración puede
llevarse a cabo mediante inyección intradérmica, subdérmica,
intravenosa, intramuscular, intranasal, intracerebral,
intratraqueal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical,
intrapleural, intracoronaria o intratumoral, con una jeringa u otros
dispositivos. También se considera la administración transdérmica,
como son la inhalación y la administración por aerosol.
En una realización preferente, el compuesto
terapéutico preparado según la utilización es para introducirlo en
el tejido muscular, más preferentemente, mediante las vías de
inyección intramuscular.
En otra realización preferente, la invención
prevé la utilización de magnesio para la preparación de un compuesto
terapéutico para mejorar la transfección de un polinucleótido a una
célula, en la que dicho compuesto terapéutico se administra
independientemente a partir de una segunda administración, que
consiste en la administración de un compuesto que contiene por lo
menos un polinucleótido. Según la presente invención, la primera
administración puede realizarse previamente a, a la vez que o
después de, la segunda administración, y viceversa. La
administración del compuesto terapéutico y la segunda administración
pueden llevarse a cabo mediante distintas o idénticas vías de
suministro (suministro sistémico y suministro dirigido, o
suministros dirigidos, por ejemplo). En una realización preferente,
cada uno se realizará al mismo tejido diana y más preferentemente
mediante inyección.
En otra realización preferente de la utilización
según la presente invención, el compuesto terapéutico comprende
además por lo menos un polinucleótido. En una realización
particularmente preferente, el polinucleótido que se contiene en el
compuesto contiene y es capaz de expresar funcionalmente un gen en
dicha célula. El polinucleótido puede ser un ADN o un ARN, mono o
bicatenario, lineal o circular, natural o sintético, modificado o no
(véase US 5525711, US 4711955 ó EP-A302175 para
ejemplos de modificación). Puede ser, entre nosotros, un ADN
genómico, un cADN, un ARNm, un ARN antisentido, un ARN ribosómico,
un ribozima, un ARN de transferencia o un ADN que codifique tal ARN.
"Polinucleótidos" y "ácidos nucleicos" son sinónimos con
respecto a la presente invención. El polinucleótido puede también
estar en forma de un plásmido o polinucleótido lineal que contiene
por lo menos una secuencia capaz de la expresión de un ácido
nucleico que puede generar un polipéptido, un ribozima, un ARN
antisentido u otra molécula de interés después de su suministro a
una célula. El polinucleótido puede también ser un oligonucleótido
que va a suministrarse a la célula, por ejemplo, para funciones
antisentido o ribozímicas.
En una realización particularmente preferente de
la invención, el polinucleótido es un polinucleótido desnudo (Wolff
y otros, Science 247 (1990), páginas 1465-1468) o es
un polinucleótido asociado o que forma un complejo con un
polipéptido, con la condición de que cuando dicho polipéptido es un
polipéptido vírico, dicho polinucleótido entonces combinado con el
polipéptido vírico no forma partículas víricas infecciosas, o con un
compuesto catiónico o con cualquier componente que pueda participar
en la protección y captación del polinucleótido en las células
(véase Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995),
1129-1144 para una revisión). Los compuestos
catiónicos con los que el polinucleótido forma complejos son
preferentemente lípidos catiónicos, especialmente los que se dan a
conocer en WO 98/34910. Tanto el ADN como el ARN pueden
suministrarse a las células para formar en las mismas un polipéptido
de interés. Preferentemente, el polinucleótido que se encuentra en
el compuesto terapéutico está en forma de ADN plasmídico. Si el
polinucleótido contiene la apropiada información genérica, dirigirá
la síntesis de cantidades relativamente grandes del polipéptido
codificado. Cuando el polinucleótido suministrado a las células
codifica un polipéptido inmunizante, la utilización según la
invención puede aplicarse a alcanzar una inmunidad mejorada y
efectiva contra agentes infecciosos, incluyendo virus
intracelulares, y también contra células tumorales. Las
informaciones genéticas necesarias para la expresión mediante una
célula diana comprenden todos los elementos requeridos para la
transcripción de dicho ADN al ARNm y para la traslación del ARNm al
polipéptido. Los promotores transcripcionales apropiados para la
utilización en varios sistemas de vertebrados son bien conocidos.
Por ejemplo, promotores apropiados incluyen los promotores víricos
como RSV, MPSV, SV40, CMV ó 7,5k, promotores de la vacuna,
promotores inducibles, etc. El polinucleótido puede también incluir
secuencias intrónicas, secuencias diana, secuencias de transporte,
secuencias implicadas en la replicación o integración. De dichas
secuencias se ha informado en la literatura y pueden obtenerse
fácilmente por los expertos en la materia. El polinucleótido puede
también ser modificado a efectos de ser estabilizado con componentes
específicos como espermina.
En general, la concentración del polinucleótido
en el compuesto está entre 0,1 \mug/ml y 20 mg/ml aproximadamente.
Según la invención, el polinucleótido puede ser homólogo o
heterólogo para las células diana en las que se introduce.
Ventajosamente, dicho polinucleótido codifica la totalidad o parte
de un polipéptido, especialmente un polipéptido terapéutico o
profiláctico. Se entiende que un polipéptido es cualquier producto
transicional de un polinucleótido independientemente del tamaño, y
si está o no glicosilado, e incluye péptido y proteínas. Los
polipéptidos terapéuticos incluyen, como un ejemplo primario,
aquellos polipéptidos que pueden compensar las proteínas defectuosas
o deficientes en un organismo animal o humano, o los que actúan
mediante efectos tóxicos para limitar o eliminar las células
perjudiciales del cuerpo. También pueden ser polipéptidos que
confieren inmunidad que actúan como inmunógenos endógenos para
provocar una respuesta celular o humoral, o ambas. Ejemplos de
polipéptidos codificados por el polinucleótido son enzimas,
hormonas, citocinas, receptores membranales, polipéptidos
estructurales, polipéptidos de transporte, adhesinas, ligandos,
factores de transcripción, factores de traducción, factores de
replicación, factores de estabilización, anticuerpos, más
especialmente CFTR, distrofina, factores VIII ó IX, E6 ó E7 de HPV,
MUC1, BRCA1, interferones, interleucinas (IL-2,
IL-4, IL-6, IL-7,
IL-12, GM-CSF (Factor estimulante
de las otrosonias de granulocitos macrófagos), el gen tk del virus
Herpes simple de tipo 1 (HSV-1), p53 ó VEGF. El
polinucleótido puede también codificar un anticuerpo. A este
respecto, el anticuerpo abarca la totalidad de las inmunoglobulinas
de cualquier tipo, anticuerpos quiméricos y anticuerpos híbridos con
especificidades epitópicas o antigénicas múltiples o duales, y
fragmentos, tales como F(ab)_{2}, Fab', Fab
incluyendo fragmentos híbridos y anti-idiotipos (US
4.699.880).
En otra realización preferente, el compuesto
comprende además, por lo menos, un componente seleccionado del grupo
formado por cloroquina, compuestos próticos tales como
propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etanol,
1-metil
L-2-pirrolidona o sus derivados,
compuestos apróticos tales como dimetilsulfóxido (DMSO),
dietilsulfóxido,
di-n-propilsulfóxido,
dimetilsulfona, sulfulano, dimetilformamida, dimetilacetamida,
tetrametilurea, acetonitrilo o derivados. Dicho compuesto puede
también comprender por lo menos un componente seleccionado del grupo
formado por citocinas, especialmente interleucina-10
(IL-10), e inhibidores de la nucleasa tales como,
por ejemplo, la actina G.
En otra realización preferente, el compuesto
preparado según la utilización de la invención puede emplearse en un
método para el tratamiento terapéutico humano o de los animales. En
este caso particular, el compuesto puede también comprender un
portador inyectable farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, véase
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980, Mack
Publishing Co). El portador es preferentemente isotónico, hipotónico
o débilmente hipertónico, y posee una fuerza iónica relativamente
baja, tal como la proporcionada por una solución de sacarosa.
Además, puede contener algunos solventes pertinentes, portadores
líquidos acuosos o parcialmente acuosos que incluyen agua estéril
sin pirógenos, medios de dispersión, revestimientos, y equivalentes,
o diluyentes (por ejemplo, Tris-HCl, acetato,
fosfato), emulsificantes, solubilizantes o adyuvantes. El pH de la
preparación farmacéutica se ajusta apropiadamente y se tampona a
efectos de que sea útil en las aplicaciones in vivo.
Los compuestos preparados según la utilización de
la invención pueden emplearse en un método para transfectar un
polinucleótido a células, en el que dicho método comprende el
contacto de dichas células con un compuesto preparado según la
utilización de la invención antes, simultáneamente o después de que
contacten con el polinucleótido. Este método puede aplicarse
mediante la administración directa de dicho compuesto a las células
del animal in vivo. Según la práctica de la invención,
"células diana" y "vía de administración in vivo"
se definen tal como se describieron anteriormente.
Preferentemente, se utiliza el músculo como un
sitio para el suministro y expresión de un polinucleótido en
distintas aplicaciones terapéuticas, debido a que los animales
tienen una masa muscular proporcionalmente grande a la que se accede
mediante inyección directa a través de la piel. De acuerdo con ello,
en un caso preferente, el compuesto preparado según la utilización
en la invención puede emplearse en un método para introducir un
polinucleótido, preferentemente en forma desnuda, en las células
musculares in vivo, que comprende las etapas de
administración in vivo de, por lo menos, un polinucleótido y
magnesio, preferentemente intramuscularmente, por lo que el
polinucleótido se introduce en las células musculares del tejido. El
polinucleótido puede codificar un polipéptido terapéutico que se
expresa por las células musculares y se secreta eventualmente a la
corriente sanguínea después de la etapa de contacto para
proporcionar la terapia al vertebrado. De modo similar, puede
codificar un polipéptido inmunogénico que se expresa mediante las
células musculares después de la etapa de contacto y que genera una
respuesta inmune, inmunizando de este modo al vertebrado. Un aspecto
importante a este respecto es un método para el tratamiento de la
distrofia muscular, en el que dicho polinucleótido codifica
operativamente la distrofina. Preferentemente, el compuesto se
introduce en el tejido muscular en dicho método.
La invención se ha descrito de una forma
ilustrativa, y debe entenderse que la terminología que se ha
utilizado tiene el propósito de hacer hincapié en la naturaleza de
las palabras de descripción más que en las que limitan la invención.
Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la
presente invención, a la luz de las enseñanzas anteriores. Debe por
lo tanto entenderse que en el ámbito del alcance de las
reivindicaciones, la invención puede practicarse de otro modo que en
el que se ha descrito específicamente.
La figura 1 muestra los efectos opuestos de
CaCl_{2} y de MgCl_{2} sobre la transfección intramuscular de
pTG11033. La actividad de la luciferasa de los músculos anteriores
tibiales izquierdo y derecho de ratón, medida 7 días después de la
inyección con 25 \mug de plásmido al que se añadió un tampón de
NaCl al 0,9% (Control, NaCl) o entre 0,1 a 100 mM de CaCl_{2} o
100 mM de MgCl_{2}. Las franjas representan medias de RLU (Unidad
de luz relativa) por minuto por mg de proteína +/- s.e.m. de 6
determinaciones.
Las figuras 2 y 3 muestran el efecto de la dosis
de MgCl_{2} sobre la transferencia intramuscular del
plásmido-luciferasa (pTG11033). Las franjas
representan medias de RLU por minuto por mg de proteína +/- s.e.m de
6 determinaciones. La actividad de la luciferasa se midió 7 días
después de la inyección de 25 \mug de plásmido en los ratones
C57BL/10 (4 ratones por grupo) al que se añadió NaCl al 0,9%
(franjas vacías) o concentraciones diferentes de MgCl_{2} (franjas
negras).
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Los siguientes materiales y métodos se utilizan
en los ejemplos.
El ADN plasmídico (pTG11033: promotor CMV, intrón
de \beta-globina, casete de luciferasa - WO
98/34910) se preparó según Bischoff y otros, Analytical Biochemistry
254 (1997), páginas 69-81. Antes de la inyección
intramuscular, las moléculas ensayadas se mezclaron con la
preparación del ADN plasmídico. 25 \mug del ADN plasmídico se
inyectaron por músculo en ratones C57BL/10 de edades comprendidas
entre 5 y 10 semanas. Se inyectaron los 2 músculos tibialis anterior
(derecho e izquierdo) (cada músculo se consideró como una muestra).
Además, para cada situación, se omitieron tanto los valores más
bajos como los más altos de la luciferasa, lo que significa que el
número de muestras por situación = (2 x número de ratones por
situación)-2.
Una semana después de la inyección del compuesto,
se sacrificaron los ratones y los músculos tibialis anteriores se
recuperaron y se congelaron.
La actividad de la luciferasa se cuantificó sobre
extractos del músculo entero utilizando un equipo de medición
convencional (Luciferase Assay System, Promega). Brevemente, se
pulverizaron los músculos separadamente y se diluyeron en 200 \mul
de tampón informador de lisis (Promega). Muestras de 10 \mul se
situaron en placas de 96 pocillos y se mezclaron con 100 \mul de
sustrato. La actividad de la luciferasa se expresó como el número de
RLU emitidas por minuto, por mg de proteína.
Las proteínas se midieron sobre muestras de 10
\mul utilizando un equipo VCA de ensayo de proteínas (Pierce).
En este ejemplo, la solución de almacenamiento
del plásmido pTG11033 se preparó en tampón TE (Tris 10
mM-EDTA 1 mM) con una concentración del ácido
nucleico de 1 \mug/\mul.
Soluciones de almacenamiento de CaCl_{2} y
MgCl_{2} se prepararon en agua a una concentración de 1 M.
Cuatro ratones C57BI/10 se inyectaron por
situación en el músculo tibialis anterior izquierdo y derecho con
distintos compuestos que comprendían pTG11033 (25 \mug/músculo) y
varias concentraciones de cloruro de calcio (CaCl_{2}; 100, 10, 1,
0,1 mM) o cloruro de magnesio (MgCl_{2}; 100 mM). El experimento
de control se realizó según las mismas condiciones, excepto porque
no se añadió ion divalente y porque se añadieron 5 \mul de NaCl al
0,9%. El volumen inyectado fue de 30 \mul.
Los resultados se presentan en la figura 1.
Muestran que la adición de CaCl_{2} conduce a una inhibición
importante de la actividad de la luciferasa de los músculos que se
inyectaron (una disminución de entre 3 y 100 veces, dependiendo de
la concentración final de CaCl_{2}), incluso con la concentración
más baja ensayada (0,1 mM). Contrariamente, MgCl_{2} permitió una
actividad de luciferasa aumentada en los músculos que se inyectaron
(de 3 veces aproximadamente en el presente ejemplo).
En este ejemplo, el plásmido pTG11033 se preparó
en NaCl al 0,9% y se guardó en 1 \mug/\mul. Se prepararon
diluciones en serie de una solución de MgCl_{2} en NaCl al 0,9% y
se añadieron al pTG11033 almacenado en un volumen final de 30
\mul. El control contenía la misma cantidad del plásmido al que se
añadieron 5 \mul de NaCl al 0,9%. La fuerza iónica de las
soluciones de MgCl_{2} se equilibró con volúmenes apropiados de
agua, según los métodos bien conocidos por los expertos en la
técnica.
Tal como se describió anteriormente, se
inyectaron cuatro ratones por cada situación.
Los resultados se presentan en la figura 2.
Muestran que MgCl_{2} posee una influencia sobre la actividad de
la luciferasa de los músculos inyectados. La dosis más baja (0,1 mM)
de MgCl_{2} no ejerció efecto sobre la actividad de luciferasa de
los músculos inyectados, mientras que la actividad de la luciferasa
fue más elevada en los músculos inyectados en presencia de 1 mM de
MgCl_{2}, similar al control cuando se utilizaron 10 mM de
MgCl_{2}, inhibiéndose intensamente a concentraciones más
altas.
Se evaluó un rango más preciso de concentraciones
de MgCl_{2} (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 mM) utilizando las mismas
condiciones que se describieron para el Ejemplo 2. Se encontró que
la concentración óptima fue de 0,5 mM cuando se utilizó una
preparación del plásmido pTG11033 en NaCl al 0,9%.
Claims (17)
1. Utilización de magnesio (Mg^{2+}) para la
preparación de un compuesto terapéutico o profiláctico para la
transfección in vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia
génica o en la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una
concentración de entre 0,1 a 10 mM aproximadamente.
2. Utilización, según la reivindicación 1, en la
que dicho magnesio es cloruro de magnesio (MgCl_{2}).
3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicho compuesto terapéutico es apropiado para la
administración a un tejido diana de vertebrados.
4. Utilización, según la reivindicación 3, en la
que dicha administración se realiza mediante inyección intradérmica,
subdérmica, intravenosa, intramuscular, intranasal, intracerebral,
intratraqueal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical,
intrapleural, intracoronaria o intratumoral.
5. Utilización, según la reivindicación 3, en la
que dicha administración se realiza en el pulmón mediante
administración por inhalación o por aerosol.
6. Utilización, según la reivindicación 3, en la
que dicho tejido diana es músculo.
7. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en la que la administración de magnesio
(Mg^{2+}) se lleva a cabo independiente de una segunda
administración que consiste en la administración de un compuesto que
contiene, por lo menos, un polinucleótido en el mismo tejido
diana.
8. Utilización, según la reivindicación 7, en la
que la administración de magnesio (Mg^{2+}) se lleva a cabo
previamente a dicha segunda administración.
9. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho polinucleótido contiene un
gen y es capaz de expresar funcionalmente dicho gen en dicha
célula.
10. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho polinucleótido está desnudo.
11. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho polinucleótido forma complejos con componentes
catiónicos.
12. Utilización, según la reivindicación 11, en
la que dichos componentes catiónicos son lípidos catiónicos.
13. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en la que dicha concentración del
polinucleótido oscila entre 0,1 \mug/ml a 20 mg/ml
aproximadamente.
14. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que dicho gen codifica la totalidad o parte de los polipéptidos
distrofina o del regulador de la conductancia transmembranal en la
fibrosis cística (CFTR).
15. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en la que dicho compuesto comprende además
por lo menos un componente seleccionado del grupo formado por
cloroquina, compuestos próticos tales como propilenglicol,
polietilenglicol, glicerol, etanol, 1-metil
L-2-pirrolidona o sus derivados,
compuestos apróticos tales como dimetilsulfóxido (DMSO),
dietilsulfóxido,
di-n-propilsulfóxido,
dimetilsulfona, sulfulano, dimetilformamida, dimetilacetamida,
tetrametilurea, acetonitrilo o derivados.
16. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho compuesto comprende además
por lo menos un componente seleccionado del grupo formado por las
citocinas o actina-G.
17. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho compuesto comprende además
un portador inyectable farmacéuticamente aceptable.
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