ES2201611T3 - Utilizacion del magnesio (mg2+) para aumentar la introduccion de genes en terapia genica. - Google Patents

Abstract

Utilización de magnesio (Mg2+) para la preparación de un compuesto terapéutico o profiláctico para la transfección in vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia génica o en la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una concentración de entre 0, 1 a 10 mM aproximadamente.

Description

Utilización del magnesio (Mg^{2+}) para aumentar la introducción de genes en terapia génica.

La presente invención se refiere a la utilización de magnesio (Mg^{+2})para la preparación de un compuesto terapéutico, con el objetivo de mejorar la transfección de un polinucleótido a una célula. Tal compuesto es útil en la terapia génica, vacunación, y cualquier situación terapéutica o profiláctica en la que un producto basado en un gen se administra a células in vivo.

La terapia génica se ha concebido generalmente como aplicable principalmente a las enfermedades caracterizadas por deficiencias heredables (fibrosis quística, distrofias, hemofilias, etc.), en las que puede llevarse a cabo la curación permanente introduciendo un gen funcional. Sin embargo, un grupo mucho más amplio de enfermedades, especialmente las enfermedades adquiridas (cáncer, SIDA, esclerosis múltiple, etc.), podría ser susceptible de tratamiento aplicando transitoriamente las técnicas de ingeniería genética a células huésped para producir proteínas beneficiosas.

Las aplicaciones son, por ejemplo, el tratamiento de distrofias musculares o de fibrosis quísticas. Los genes de la distrofia muscular de Duchenne/Becker y de la fibrosis quística se han identificado y codifican los polipéptidos denominados distrofina y regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) respectivamente. La expresión directa de estos genes en el interior de, respectivamente, las células musculares o de las pulmonares de los pacientes, contribuirá a un mejora significativa de los síntomas mediante la expresión del polipéptido funcional en los tejidos diana. Además, en la fibrosis quística, los estudios han sugerido que se requeriría alcanzar la expresión del producto del gen CFTR en sólo el 5% de las células epiteliales pulmonares, a efectos de mejorar significativamente los síntomas pulmonares.

Otra aplicación de la terapia génica es la vacunación. A este respecto, el producto inmunogénico codificado por el polinucleótido introducido en las células de un vertebrado puede ser expresado y secretado o ser presentado por dichas células en el contexto de los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad, provocando de este modo una respuesta inmune contra el inmunógeno expresado. Los polinucleótidos funcionales pueden introducirse en las células mediante diversas técnicas que dan lugar a la expresión transitoria del gen de interés, a la que se alude como transfección transitoria, o a la transformación permanente de las células huésped que provienen de la incorporación del polinucleótido al genoma del huésped.

La terapia génica satisfactoria depende del suministro eficiente a y de la expresión de la información genética en el interior de las células de un organismo viviente. La mayoría de los mecanismos de suministro utilizados hasta la fecha implican a vectores víricos, especialmente a vectores adeno y retrovíricos. Los virus han desarrollado diversos mecanismos muy sofisticados para alcanzar este objetivo, incluyendo el cruce de la membrana celular, el escape de la degradación lisosómica, el suministro de su genoma al núcleo y, consecuentemente, se han utilizado en muchas aplicaciones de suministro génico en la vacunación o en la terapia génica aplicada al hombre. La utilización de virus presenta algunas desventajas: los vectores retrovíricos no pueden acomodar el ADN de gran tamaño (por ejemplo, el gen de la distrofina que tiene alrededor de 13 Kb), el genoma retrovírico se integra en el ADN de la célula huésped y puede causar, de este modo, cambios genéticos en la célula receptora y las partículas víricas infecciosas podrían diseminarse en el organismo o en el entorno, y los vectores adenovíricos pueden inducir una intensa respuesta inmune en los pacientes tratados (Mc Coy y otros, Human Gene Therapy 6 (1995), páginas 1553-1560; Yang y otros, Immunity 1 (1996), páginas 433-442). Sin embargo, a pesar de estos inconvenientes, los vectores víricos constituyen habitualmente los sistemas de suministro más útiles debido a su eficiencia.

Se han desarrollado sistemas de suministro no vírico que se basan en mecanismos mediados por los receptores (Perales y otros, Eur. J. Biochem 226 (1994), páginas 255-266; Wagner y otros, Advanced Drug Delivery Reviews 14 (1994), páginas 113-135), sobre la transfección mediada por polímero tal como la poliamidoamina (Haensler y Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), páginas 372-379), el polímero dendrítico (WO 95/24221), polietilén imina o polipropilén imina (WO 96/02655), polilisina (US-A-5 595 897 ó FR 2 719 316) o sobre la transfección mediada por lípidos (Felgner y otros, Nature 337 (1989), páginas 387-388), tal como DOTMA (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), páginas 7413-7417), DOGS o Transfectam^{TM} (Behr y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), páginas 6982-6986), DMRIE o DORIE (Felgner y otros, Methods 5 (1993), páginas 67-75, DC-CHOL (Gao y Huang, BBRC 179 (1991), páginas 280-285), DOTAP^{TM} (McLachlan y otros, Gene Therapy 2 (1995), páginas 674-622) o Lipofectamina^{TM}. Estos sistemas presentan ventajas potenciales con respecto a la producción a gran escala, seguridad, diana de las células transfectables, inmunogenicidad baja y la capacidad de suministrar grandes fragmentos de ADN. Sin embargo, su eficiencia in vivo es todavía limitada.

Finalmente, en 1990, Wolff y otros (Science 247 (1990), páginas 1465-1468) mostraron que la inyección directa en el músculo esquelético del ratón, del ARN ó ADN desnudos, sin un sistema de suministro específico, da lugar a la expresión de genes informadores en el interior de las células musculares. Esta técnica para transfectar células ofrece la ventaja de la simplicidad y se han llevado a cabo experimentos que avalan la utilidad de este sistema para el suministro al pulmón (Tsan y otros, Am. J. Physiol. 268 (1995), páginas L102-L1056; Meyer y otros, Gene Therapy 2 (1995), páginas 450-460), cerebro (Schwartz y otros, Gene Therapy 3 (1996), páginas 405-411), articulaciones (Evans y Roddins, Gene therapy for arthritis; en Wolff (ed) Gene Therapeutics: Methods and Applications of direct Gene Transfer. Birkhaiser. Boston (1990), páginas 320-343), tiroides (Sikes y otros, Human Gen. Ther. 5 (1994), páginas 837-844), piel (Raz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), páginas 9519-9523) e hígado (Hickman y otros, Hum. Gen. Ther. 5 (1994), páginas 1477-1483).

Sin embargo, Davis y otros (Human Gene Therapy 4 (1993), páginas 151-159 y Human Mol. Genet. 4 (1993), páginas 733-740) observaron una gran variabilidad de la expresión del ADN desnudo inyectado en el músculo esquelético in vivo que hubiera sido insuficiente para el tratamiento de las miopatías primarias, por ejemplo. Los autores proponen soluciones a efectos de obtener una mejora de la eficiencia de la transferencia génica, preinyectando los músculos con un volumen relativamente grande de sacarosa hipertónica o con toxinas, por ejemplo, cardiotoxina aislada de serpientes, a efectos de estimular la regeneración de los músculos. Sin embargo, estos métodos, aunque prometedores, no serían aplicables para el tratamiento humano.

Así pues, los métodos de suministro disponibles no son satisfactorios en términos de seguridad o de eficiencia para su ejecución en la terapia génica in vivo.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención es la provisión de métodos mejorados y de medios para el suministro de moléculas de ácido nucleico en la terapia génica.

Este problema técnico se resuelve proveyendo formas de realización tal como se definen en las reivindicaciones.

Así pues, la presente invención se refiere a la utilización de magnesio (Mg^{2+}) para la preparación de un compuesto terapéutico o profiláctico para la transfección in vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia génica o en la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una concentración de entre 0,1 y 10 mM aproximadamente. Se descubrió, sorprendentemente, que la adición específica de magnesio en la transfección de un polinucleótido a los tejidos de los vertebrados conduce a una mejora importante en la eficiencia de la transfección. De este modo, la presente invención se refiere a la utilización del magnesio (Mg^{2+}) para la preparación de un compuesto farmacéutico para una transfección mejorada de un polinucleótido a una célula. El término "transfección mejorada" en el alcance de la presente invención significa, a este respecto, una captación más eficiente de un polinucleótido por las células, cuando el magnesio (Mg^{2+}) se encuentra presente, comparado con una introducción realizada sin magnesio. Esto puede determinarse comparando la cantidad del polinucleótido captada sin utilización de magnesio y comparando esta cantidad con la captada por las células cuando se utiliza magnesio bajo las mismas condiciones experimentales. Preferentemente, la mejora en la transfección puede determinarse mediante una cantidad expresada más alta del polinucleótido transferido a las células cuando se utiliza magnesio (Mg^{+2}) en comparación a cuando no se lo utiliza.

Los compuestos terapéuticos preparados según la utilización de la presente invención son particularmente útiles para el suministro de polinucleótidos a las células o tejidos de un individuo en el ámbito de un método terapéutico génico, pero no se limitan a tal utilización. El término "método terapéutico génico" se entiende preferentemente como un método para la transfección de un polinucleótido a las células in vivo. "Terapia génica", en particular, se refiere al caso en el que el producto génico se expresa en un tejido diana, así como también el caso en el que el producto génico es excretado, especialmente a la corriente sanguínea.

En el ámbito de la presente invención, el término "transfección" significa la transferencia del polinucleótido a una célula, en la que el polinucleótido no se asocia con partículas víricas. Así pues, la transfección debe distinguirse de la infección, que se refiere a polinucleótidos asociados con partículas víricas.

El magnesio (Mg^{2+}) ha mostrado que:

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reduce la interacción del virus con agua, conduciendo a una disminución en el grado de penetración acuosa en la cápsida vírica (Chen y otros, Arch. Biochem. Biophys. 342 (1997), páginas 108-116);

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se une a los ácidos nucleicos (Rowatt y Williams, J. Inorg. Biochem. 46 (1992), páginas 87-97);

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influencian la inactivación de la DNasa mediante tratamiento calorífico (Bickler y otros, Biotechniques 13 (1992), páginas 64-6);

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está implicado en funciones metabólicas tal como glicólisis, síntesis de ARN/ADN o la síntesis proteica (Günter, Magnesium 5 (1986), páginas 53-9);

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actúa como un cofactor para la unión de la proteína C a su sitio específico en el ADN (De y otros, Biochemistry 37 (1998), páginas 3831-8) o de la endonucleasa de restricción EcoRV (Thielking y otros, Biochemistry 31 (1992), páginas 3727-32).

El resumen de la solicitud de patente Japonesa (J08308573) da a conocer un método in vitro para la introducción de un gen en las células utilizando un virus como vector, preparado en un medio de infección vírica que contiene ingredientes sin suero o iones metálicos divalentes seleccionados de entre Mg, Ca y Zn combinados con un medio de cultivo celular basado en aminoácidos.

El término "magnesio (Mg^{2+})" tal como se utiliza en la presente memoria, significa el catión divalente del magnesio. Tal producto se encuentra disponible comercialmente asociado con uno o varios aniones biológicamente aceptables, tales como, por ejemplo, bisulfito, cromato, fluoruro, gluconato, acetato, hidróxido, yoduro, metóxido, óxido, fosfato, sulfato, cloruro, bromuro, etc. (véase el catálogo Aldrich, 1994/1995, por ejemplo). Según una realización preferente, dicho magnesio (Mg^{2+}) está asociado con cloruro (MgCl_{2}).

La cantidad de magnesio en los compuestos preparados según la utilización de la presente invención es del orden de 0,1 a 10 mM aproximadamente, y preferentemente todavía de 0,5 mM. Esta concentración puede también ser adaptada por los expertos en la materia en casos particulares en los que la concentración de magnesio puede verse afectada. Por ejemplo, cuando el compuesto terapéutico comprende además un agente quelante, tal como EDTA, sería preferible mejorar la concentración de magnesio a efectos de compensar la reducción del magnesio debida a la quelación. Esto puede ocurrir cuando el polinucleótido se ha preparado previamente en un tampón tal como TE (Tris-EDTA).

En una realización preferente, el compuesto terapéutico preparado según el uso de la presente invención se realiza en una forma para la administración a un tejido de vertebrado. Estos tejidos incluyen los del músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfáticos, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojos, glándulas, tejido conjuntivo, sangre, tumorales, etc. Las células en las que la transfección mejorada de un polinucleótido extraño se puede obtener son aquellas que se encuentran en cada uno de los tejidos diana listados (células musculares, células de las vías aéreas, células hematopoyéticas, etc.). La administración puede llevarse a cabo mediante inyección intradérmica, subdérmica, intravenosa, intramuscular, intranasal, intracerebral, intratraqueal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical, intrapleural, intracoronaria o intratumoral, con una jeringa u otros dispositivos. También se considera la administración transdérmica, como son la inhalación y la administración por aerosol.

En una realización preferente, el compuesto terapéutico preparado según la utilización es para introducirlo en el tejido muscular, más preferentemente, mediante las vías de inyección intramuscular.

En otra realización preferente, la invención prevé la utilización de magnesio para la preparación de un compuesto terapéutico para mejorar la transfección de un polinucleótido a una célula, en la que dicho compuesto terapéutico se administra independientemente a partir de una segunda administración, que consiste en la administración de un compuesto que contiene por lo menos un polinucleótido. Según la presente invención, la primera administración puede realizarse previamente a, a la vez que o después de, la segunda administración, y viceversa. La administración del compuesto terapéutico y la segunda administración pueden llevarse a cabo mediante distintas o idénticas vías de suministro (suministro sistémico y suministro dirigido, o suministros dirigidos, por ejemplo). En una realización preferente, cada uno se realizará al mismo tejido diana y más preferentemente mediante inyección.

En otra realización preferente de la utilización según la presente invención, el compuesto terapéutico comprende además por lo menos un polinucleótido. En una realización particularmente preferente, el polinucleótido que se contiene en el compuesto contiene y es capaz de expresar funcionalmente un gen en dicha célula. El polinucleótido puede ser un ADN o un ARN, mono o bicatenario, lineal o circular, natural o sintético, modificado o no (véase US 5525711, US 4711955 ó EP-A302175 para ejemplos de modificación). Puede ser, entre nosotros, un ADN genómico, un cADN, un ARNm, un ARN antisentido, un ARN ribosómico, un ribozima, un ARN de transferencia o un ADN que codifique tal ARN. "Polinucleótidos" y "ácidos nucleicos" son sinónimos con respecto a la presente invención. El polinucleótido puede también estar en forma de un plásmido o polinucleótido lineal que contiene por lo menos una secuencia capaz de la expresión de un ácido nucleico que puede generar un polipéptido, un ribozima, un ARN antisentido u otra molécula de interés después de su suministro a una célula. El polinucleótido puede también ser un oligonucleótido que va a suministrarse a la célula, por ejemplo, para funciones antisentido o ribozímicas.

En una realización particularmente preferente de la invención, el polinucleótido es un polinucleótido desnudo (Wolff y otros, Science 247 (1990), páginas 1465-1468) o es un polinucleótido asociado o que forma un complejo con un polipéptido, con la condición de que cuando dicho polipéptido es un polipéptido vírico, dicho polinucleótido entonces combinado con el polipéptido vírico no forma partículas víricas infecciosas, o con un compuesto catiónico o con cualquier componente que pueda participar en la protección y captación del polinucleótido en las células (véase Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144 para una revisión). Los compuestos catiónicos con los que el polinucleótido forma complejos son preferentemente lípidos catiónicos, especialmente los que se dan a conocer en WO 98/34910. Tanto el ADN como el ARN pueden suministrarse a las células para formar en las mismas un polipéptido de interés. Preferentemente, el polinucleótido que se encuentra en el compuesto terapéutico está en forma de ADN plasmídico. Si el polinucleótido contiene la apropiada información genérica, dirigirá la síntesis de cantidades relativamente grandes del polipéptido codificado. Cuando el polinucleótido suministrado a las células codifica un polipéptido inmunizante, la utilización según la invención puede aplicarse a alcanzar una inmunidad mejorada y efectiva contra agentes infecciosos, incluyendo virus intracelulares, y también contra células tumorales. Las informaciones genéticas necesarias para la expresión mediante una célula diana comprenden todos los elementos requeridos para la transcripción de dicho ADN al ARNm y para la traslación del ARNm al polipéptido. Los promotores transcripcionales apropiados para la utilización en varios sistemas de vertebrados son bien conocidos. Por ejemplo, promotores apropiados incluyen los promotores víricos como RSV, MPSV, SV40, CMV ó 7,5k, promotores de la vacuna, promotores inducibles, etc. El polinucleótido puede también incluir secuencias intrónicas, secuencias diana, secuencias de transporte, secuencias implicadas en la replicación o integración. De dichas secuencias se ha informado en la literatura y pueden obtenerse fácilmente por los expertos en la materia. El polinucleótido puede también ser modificado a efectos de ser estabilizado con componentes específicos como espermina.

En general, la concentración del polinucleótido en el compuesto está entre 0,1 \mug/ml y 20 mg/ml aproximadamente. Según la invención, el polinucleótido puede ser homólogo o heterólogo para las células diana en las que se introduce. Ventajosamente, dicho polinucleótido codifica la totalidad o parte de un polipéptido, especialmente un polipéptido terapéutico o profiláctico. Se entiende que un polipéptido es cualquier producto transicional de un polinucleótido independientemente del tamaño, y si está o no glicosilado, e incluye péptido y proteínas. Los polipéptidos terapéuticos incluyen, como un ejemplo primario, aquellos polipéptidos que pueden compensar las proteínas defectuosas o deficientes en un organismo animal o humano, o los que actúan mediante efectos tóxicos para limitar o eliminar las células perjudiciales del cuerpo. También pueden ser polipéptidos que confieren inmunidad que actúan como inmunógenos endógenos para provocar una respuesta celular o humoral, o ambas. Ejemplos de polipéptidos codificados por el polinucleótido son enzimas, hormonas, citocinas, receptores membranales, polipéptidos estructurales, polipéptidos de transporte, adhesinas, ligandos, factores de transcripción, factores de traducción, factores de replicación, factores de estabilización, anticuerpos, más especialmente CFTR, distrofina, factores VIII ó IX, E6 ó E7 de HPV, MUC1, BRCA1, interferones, interleucinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF (Factor estimulante de las otrosonias de granulocitos macrófagos), el gen tk del virus Herpes simple de tipo 1 (HSV-1), p53 ó VEGF. El polinucleótido puede también codificar un anticuerpo. A este respecto, el anticuerpo abarca la totalidad de las inmunoglobulinas de cualquier tipo, anticuerpos quiméricos y anticuerpos híbridos con especificidades epitópicas o antigénicas múltiples o duales, y fragmentos, tales como F(ab)_{2}, Fab', Fab incluyendo fragmentos híbridos y anti-idiotipos (US 4.699.880).

En otra realización preferente, el compuesto comprende además, por lo menos, un componente seleccionado del grupo formado por cloroquina, compuestos próticos tales como propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etanol, 1-metil L-2-pirrolidona o sus derivados, compuestos apróticos tales como dimetilsulfóxido (DMSO), dietilsulfóxido, di-n-propilsulfóxido, dimetilsulfona, sulfulano, dimetilformamida, dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo o derivados. Dicho compuesto puede también comprender por lo menos un componente seleccionado del grupo formado por citocinas, especialmente interleucina-10 (IL-10), e inhibidores de la nucleasa tales como, por ejemplo, la actina G.

En otra realización preferente, el compuesto preparado según la utilización de la invención puede emplearse en un método para el tratamiento terapéutico humano o de los animales. En este caso particular, el compuesto puede también comprender un portador inyectable farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980, Mack Publishing Co). El portador es preferentemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico, y posee una fuerza iónica relativamente baja, tal como la proporcionada por una solución de sacarosa. Además, puede contener algunos solventes pertinentes, portadores líquidos acuosos o parcialmente acuosos que incluyen agua estéril sin pirógenos, medios de dispersión, revestimientos, y equivalentes, o diluyentes (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), emulsificantes, solubilizantes o adyuvantes. El pH de la preparación farmacéutica se ajusta apropiadamente y se tampona a efectos de que sea útil en las aplicaciones in vivo.

Los compuestos preparados según la utilización de la invención pueden emplearse en un método para transfectar un polinucleótido a células, en el que dicho método comprende el contacto de dichas células con un compuesto preparado según la utilización de la invención antes, simultáneamente o después de que contacten con el polinucleótido. Este método puede aplicarse mediante la administración directa de dicho compuesto a las células del animal in vivo. Según la práctica de la invención, "células diana" y "vía de administración in vivo" se definen tal como se describieron anteriormente.

Preferentemente, se utiliza el músculo como un sitio para el suministro y expresión de un polinucleótido en distintas aplicaciones terapéuticas, debido a que los animales tienen una masa muscular proporcionalmente grande a la que se accede mediante inyección directa a través de la piel. De acuerdo con ello, en un caso preferente, el compuesto preparado según la utilización en la invención puede emplearse en un método para introducir un polinucleótido, preferentemente en forma desnuda, en las células musculares in vivo, que comprende las etapas de administración in vivo de, por lo menos, un polinucleótido y magnesio, preferentemente intramuscularmente, por lo que el polinucleótido se introduce en las células musculares del tejido. El polinucleótido puede codificar un polipéptido terapéutico que se expresa por las células musculares y se secreta eventualmente a la corriente sanguínea después de la etapa de contacto para proporcionar la terapia al vertebrado. De modo similar, puede codificar un polipéptido inmunogénico que se expresa mediante las células musculares después de la etapa de contacto y que genera una respuesta inmune, inmunizando de este modo al vertebrado. Un aspecto importante a este respecto es un método para el tratamiento de la distrofia muscular, en el que dicho polinucleótido codifica operativamente la distrofina. Preferentemente, el compuesto se introduce en el tejido muscular en dicho método.

La invención se ha descrito de una forma ilustrativa, y debe entenderse que la terminología que se ha utilizado tiene el propósito de hacer hincapié en la naturaleza de las palabras de descripción más que en las que limitan la invención. Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención, a la luz de las enseñanzas anteriores. Debe por lo tanto entenderse que en el ámbito del alcance de las reivindicaciones, la invención puede practicarse de otro modo que en el que se ha descrito específicamente.

La figura 1 muestra los efectos opuestos de CaCl_{2} y de MgCl_{2} sobre la transfección intramuscular de pTG11033. La actividad de la luciferasa de los músculos anteriores tibiales izquierdo y derecho de ratón, medida 7 días después de la inyección con 25 \mug de plásmido al que se añadió un tampón de NaCl al 0,9% (Control, NaCl) o entre 0,1 a 100 mM de CaCl_{2} o 100 mM de MgCl_{2}. Las franjas representan medias de RLU (Unidad de luz relativa) por minuto por mg de proteína +/- s.e.m. de 6 determinaciones.

Las figuras 2 y 3 muestran el efecto de la dosis de MgCl_{2} sobre la transferencia intramuscular del plásmido-luciferasa (pTG11033). Las franjas representan medias de RLU por minuto por mg de proteína +/- s.e.m de 6 determinaciones. La actividad de la luciferasa se midió 7 días después de la inyección de 25 \mug de plásmido en los ratones C57BL/10 (4 ratones por grupo) al que se añadió NaCl al 0,9% (franjas vacías) o concentraciones diferentes de MgCl_{2} (franjas negras).

Los ejemplos siguientes ilustran la invención.

Material y métodos

Los siguientes materiales y métodos se utilizan en los ejemplos.

1. Administración intramuscular del compuesto plásmido/ion divalente

El ADN plasmídico (pTG11033: promotor CMV, intrón de \beta-globina, casete de luciferasa - WO 98/34910) se preparó según Bischoff y otros, Analytical Biochemistry 254 (1997), páginas 69-81. Antes de la inyección intramuscular, las moléculas ensayadas se mezclaron con la preparación del ADN plasmídico. 25 \mug del ADN plasmídico se inyectaron por músculo en ratones C57BL/10 de edades comprendidas entre 5 y 10 semanas. Se inyectaron los 2 músculos tibialis anterior (derecho e izquierdo) (cada músculo se consideró como una muestra). Además, para cada situación, se omitieron tanto los valores más bajos como los más altos de la luciferasa, lo que significa que el número de muestras por situación = (2 x número de ratones por situación)-2.

2. Biopsias musculares y medición de la luciferasa

Una semana después de la inyección del compuesto, se sacrificaron los ratones y los músculos tibialis anteriores se recuperaron y se congelaron.

La actividad de la luciferasa se cuantificó sobre extractos del músculo entero utilizando un equipo de medición convencional (Luciferase Assay System, Promega). Brevemente, se pulverizaron los músculos separadamente y se diluyeron en 200 \mul de tampón informador de lisis (Promega). Muestras de 10 \mul se situaron en placas de 96 pocillos y se mezclaron con 100 \mul de sustrato. La actividad de la luciferasa se expresó como el número de RLU emitidas por minuto, por mg de proteína.

3. Determinación de las proteínas

Las proteínas se midieron sobre muestras de 10 \mul utilizando un equipo VCA de ensayo de proteínas (Pierce).

Ejemplo 1 En contraste con el calcio (Ca^{+2}), el magnesio (Mg^{+2}) aumenta la transferencia génica de un plásmido que incluye el gen de la luciferasa

En este ejemplo, la solución de almacenamiento del plásmido pTG11033 se preparó en tampón TE (Tris 10 mM-EDTA 1 mM) con una concentración del ácido nucleico de 1 \mug/\mul.

Soluciones de almacenamiento de CaCl_{2} y MgCl_{2} se prepararon en agua a una concentración de 1 M.

Cuatro ratones C57BI/10 se inyectaron por situación en el músculo tibialis anterior izquierdo y derecho con distintos compuestos que comprendían pTG11033 (25 \mug/músculo) y varias concentraciones de cloruro de calcio (CaCl_{2}; 100, 10, 1, 0,1 mM) o cloruro de magnesio (MgCl_{2}; 100 mM). El experimento de control se realizó según las mismas condiciones, excepto porque no se añadió ion divalente y porque se añadieron 5 \mul de NaCl al 0,9%. El volumen inyectado fue de 30 \mul.

Los resultados se presentan en la figura 1. Muestran que la adición de CaCl_{2} conduce a una inhibición importante de la actividad de la luciferasa de los músculos que se inyectaron (una disminución de entre 3 y 100 veces, dependiendo de la concentración final de CaCl_{2}), incluso con la concentración más baja ensayada (0,1 mM). Contrariamente, MgCl_{2} permitió una actividad de luciferasa aumentada en los músculos que se inyectaron (de 3 veces aproximadamente en el presente ejemplo).

Ejemplo 2 Dilución en serie de MgCl_{2}

En este ejemplo, el plásmido pTG11033 se preparó en NaCl al 0,9% y se guardó en 1 \mug/\mul. Se prepararon diluciones en serie de una solución de MgCl_{2} en NaCl al 0,9% y se añadieron al pTG11033 almacenado en un volumen final de 30 \mul. El control contenía la misma cantidad del plásmido al que se añadieron 5 \mul de NaCl al 0,9%. La fuerza iónica de las soluciones de MgCl_{2} se equilibró con volúmenes apropiados de agua, según los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se describió anteriormente, se inyectaron cuatro ratones por cada situación.

Los resultados se presentan en la figura 2. Muestran que MgCl_{2} posee una influencia sobre la actividad de la luciferasa de los músculos inyectados. La dosis más baja (0,1 mM) de MgCl_{2} no ejerció efecto sobre la actividad de luciferasa de los músculos inyectados, mientras que la actividad de la luciferasa fue más elevada en los músculos inyectados en presencia de 1 mM de MgCl_{2}, similar al control cuando se utilizaron 10 mM de MgCl_{2}, inhibiéndose intensamente a concentraciones más altas.

Se evaluó un rango más preciso de concentraciones de MgCl_{2} (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 mM) utilizando las mismas condiciones que se describieron para el Ejemplo 2. Se encontró que la concentración óptima fue de 0,5 mM cuando se utilizó una preparación del plásmido pTG11033 en NaCl al 0,9%.

Claims (17)

1. Utilización de magnesio (Mg^{2+}) para la preparación de un compuesto terapéutico o profiláctico para la transfección in vivo de un polinucleótido a una célula en la terapia génica o en la vacunación, en la que el magnesio se encuentra a una concentración de entre 0,1 a 10 mM aproximadamente.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho magnesio es cloruro de magnesio (MgCl_{2}).

3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho compuesto terapéutico es apropiado para la administración a un tejido diana de vertebrados.

4. Utilización, según la reivindicación 3, en la que dicha administración se realiza mediante inyección intradérmica, subdérmica, intravenosa, intramuscular, intranasal, intracerebral, intratraqueal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical, intrapleural, intracoronaria o intratumoral.

5. Utilización, según la reivindicación 3, en la que dicha administración se realiza en el pulmón mediante administración por inhalación o por aerosol.

6. Utilización, según la reivindicación 3, en la que dicho tejido diana es músculo.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la administración de magnesio (Mg^{2+}) se lleva a cabo independiente de una segunda administración que consiste en la administración de un compuesto que contiene, por lo menos, un polinucleótido en el mismo tejido diana.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que la administración de magnesio (Mg^{2+}) se lleva a cabo previamente a dicha segunda administración.

9. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho polinucleótido contiene un gen y es capaz de expresar funcionalmente dicho gen en dicha célula.

10. Utilización, según la reivindicación 9, en la que dicho polinucleótido está desnudo.

11. Utilización, según la reivindicación 9, en la que dicho polinucleótido forma complejos con componentes catiónicos.

12. Utilización, según la reivindicación 11, en la que dichos componentes catiónicos son lípidos catiónicos.

13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que dicha concentración del polinucleótido oscila entre 0,1 \mug/ml a 20 mg/ml aproximadamente.

14. Utilización, según la reivindicación 9, en la que dicho gen codifica la totalidad o parte de los polipéptidos distrofina o del regulador de la conductancia transmembranal en la fibrosis cística (CFTR).

15. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicho compuesto comprende además por lo menos un componente seleccionado del grupo formado por cloroquina, compuestos próticos tales como propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etanol, 1-metil L-2-pirrolidona o sus derivados, compuestos apróticos tales como dimetilsulfóxido (DMSO), dietilsulfóxido, di-n-propilsulfóxido, dimetilsulfona, sulfulano, dimetilformamida, dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo o derivados.

16. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho compuesto comprende además por lo menos un componente seleccionado del grupo formado por las citocinas o actina-G.

17. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho compuesto comprende además un portador inyectable farmacéuticamente aceptable.