JPS60188069A - 酢酸菌の環状ｄνａ導入法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酢酸菌の形質転換方法に関するものである。

従来、酢酸菌の形質転換については接合伝達を利用した
方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ＋１４５（１）、３５８−３６８．１９８１　）およ
び塩化カルシウム等で酢酸菌体を処理し染色体ＤＮＡ断
片やプラスミドを導入させる方法（％願昭５８−１１６
１５０　）が知られているのみである。

酢酸菌において遺伝子操作的に形質転換できれば、より
すぐれた酢酸菌が得られるとの発想から研究が行なわれ
、上述の発明（特願昭５８−１１６１５０）が完成され
るに至ったが、該発明においては主として染色体ＤＮＡ
断片の酢酸菌への導入条件について詳しく研死が行なわ
れてはいるが、シラスミドの酢酸菌への導入条件につい
ての検討は少ない。

一般に遺伝子操作による育種により微生物の有用物質の
生産性を向上させるためには、プラスミドの該微生物へ
の効率の良い導入方法を確立することが重要であシ、ま
た、染色体ＤＮＡの導入方法とプラスミドの導入方法と
に相違が認められる場合がある。

本発明者等は以上の観点から、プラスミドの酢酸菌への
導入方法に関し、鋭意研究を行なったところ、より効率
の良い導入方法を完成するに至シ、本発明を完成するこ
とができた。

本発明は二価の金属から選択された１つもしくは２つ以
上の金属を含有する溶液中で環状ＤＮＡを酢酸菌に導入
することを特徴とする酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法に関す
るものである。

さらに詳しくは、二価の金属のうちカルシウム、マグネ
シウム、ストロンチウム、ハリｆ）ム、マンガン、亜鉛
が用いられ、またポリエチレングライコール、ジメチル
スルホキサイド、Ｎ、Ｎ−ｕメチルホルムアミド、プロ
タミン、オルニチン、ポリビニルアルコール、ＤＢＡＥ
−デキストラン、シュークロースおよびグリセロ−・ル
などの形質転換促進物質が用いられ、対数期初期から対
数期中期に得られたＤＮＡ受容菌を用い、ｐＨ６，５〜
Ｚ６の溶液を用いてＤＮＡを導入させることを実施態様
とする酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法に関するものである。

本発明において形質転換のために用いられるＤＮＡは環
状のＤＮＡ、例えばプラスミドに限られるが、環状であ
れば良く、その構造や形状に制限は無い。

また、本発明において形質が転換される酢酸菌としては
アセトバクター属、グルコノバクタ−稿の菌すべてが対
象となるが、本発明におけるＤＮＡ供給菌及び形質転換
菌の例示菌としてアセトバクター・アセチ４１０２３が
示される。

アセトバクター・アセチ／ｌ６１０２３は酢酸発酵醪か
ら単離されたものであり、後述するプラスミドｐＴＡ５
［１［］１（４）及びシラスミドｐ’ｌ’Ａ３００１（
功を含んだまま微工研にＦＥＲＭ　Ｐ〜７１２２　とし
て寄託されている。

アセトバクター・アセチＡ１０２３は菌学的性質におい
てバーシイ第８版のアセトバクター・アセチの醒学的性
質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性及びエタノール酸
化能を有することで特徴的であり、Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ　ａｃｅｔｉ　ＡＩ　Ｏ２３（Ａｃｅｒ＋Ｅｔｈ＋
＋）と表示されることもある。

アセトバクター・アセチ４１０２３は、例えば通常的に
は下記のＹＰＧ培地で培養され、また形質転換株の検出
にはＹＰＧ培地に抗生物質等の薬剤を適当な濃度となる
ように、例えばアンピシリンを５０γ／１ｎｌの濃度と
なるように、添加したものを用いても培養される。

（ＹＰＧ培地） イーストエキストラクト　０．５チ ポリベプトン　０．２％ グルコース　３．０％ 寒天（固体培地の場合）２．０チ ｐＨ＝６．５ アセトバクター・アセチ／ｌ６１０２３はＹＰＧ液体培
地で、６０℃で２４〜６６時間振とう培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十分洗浄
し、緩衝液に懸濁され、これにリゾチームが添加され、
溶菌される。溶菌液には界面活性剤及び食塩が添加され
、靜置後遠心分離し、上清にポリエチレングリコールが
添加され、静置後遠心分離し沈澱物を得る。この沈澱物
は緩衝液に溶解し、エチジウムブロマイドを加え、更に
塩化セシウムを加え、密度を１．５７に合わせ、密度勾
配遠心分離をおこなう。遠心分離後、遠心チューブに紫
外線ランプで３６５　ｎｍの紫外線照射によシ、染色体
−バンドの下に出たバンドを分取する。

ここに得られるバンドにはプラスミドｐＴＡ５００１囚
とシラスミドｐＴＡ５００１（８）が混在している。

混在する２つのプラスミドは制限酵素による解析の結果
、はじめて２棟類のほぼ同一分子量のプラスミドの混在
物であることが明らかとなったものである。

プラスミドｐＴＡ　５００１囚の分子量は２３．５　Ｋ
ｂで、制限酵素開裂地図は第１図に示される。

また、プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂｌの分子量は２２
、．５Ｋｂで、制限酵素開裂地図は第２図に示される。

第１図及び第２図に示される略記号の意味は次の通りで
ある。

Ｅ　：　ｇｃｏＲＩ　：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ几ｙｉｓ給源の制限酵素 Ｓ　：　Ｓａｌ　Ｉ　：　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ａｌｂｕｓ　Ｇ給源の制限酵素 Ｘ　：　ＸｈｏＩ：　Ｘｈａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｈｏ
ｌｃｉｃｏ＋ａ給源の制限酵素 プラスミドｐＴＡ５００１（４）及びプラスミドｐＴＡ
５００１（ＢｌはいずれもＸｈｏＩによってただ１ケ所
のみ切断されることによってきわめて特徴的であって、
この切断部位に他のプラスミド断片や染色体断片を導入
し、キメ２プラスミドを作成するのがきわめて容易であ
る。

シラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）及びプラスミドｐＴＡ
５００１ｔＩＪ）はそれぞれ単独もしくは混在物で酢酸
菌ベクターとして使用されるものである。

即ち、プラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）及び／又はシラ
スミドｐＴＡ５００１（Ｂ）にプラスミド断片又は染色
体断片を導入したキメラシラスミドは、本発明に有効に
使用されるものである。

本発明においてはプラスミド断片を挿入したキメラプラ
スミドとしてｐＴＡ５００１ｔＢ）に対し犬腸菌桑剤耐
性プラスミドであるｐＡｃＹｃ　１７７（カナマイシン
耐性およびアノピシリン耐性遺伝子を待つ；　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋　１５４（
３）、１１４１−１１５６．１９７８）を連結したもが
例示される。

プラスミドｐＡｃＹｃ１７７は分子量３．６７Ｋｂであ
り、簡単な制限酵素開裂地図は第６図に示される。

プラスミドｐＡＣＹＣ１７７は、そのプラスミドを持つ
大腸菌（Ｆｔｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｎ目Ｃ６００）
を下記のＬＢ培地に適当な抗生物質を添加したもの５例
えば、アンピシリン（２５μ９／ｄ）およびカナマイシ
ン（２５μＩ／ｍｌ＞を添加したものを用いて、６７℃
で１晩培養した培養液について遠心分離処理して集菌さ
れた菌体について、ｐＴＡ５００１囚およびｐＴＡ５０
０１（Ｈａの場合と同様にして調製される。

（ＬＢ培地） バクトドリゾトン　１　％ イーストエキストラクト　０，５％ グルコース　０．１％ 食塩　０．５％ 裸大（固体培地の場合）１．７％ ｐＨ＝７．２ プラスミドｐＡｃＹｃ１７７はカナマイシン耐性遺伝子
内に存在するＸｈｏＩ切断部位で咄−ケ所切断さｎ、ま
たｐ’Ｌ”Ａ３００１（Ａ）およびｐＴＡ５００１　（
８１もともにＸｈｏＩ切断部位で唯一ケ、所切断される
ので、ＸｈｏＩによる切断とＴ４　ＤＮＡリガーゼによ
る再連結によって酢酸菌内で複製、維持されうるアンピ
クリン耐性の２種類のキメラシラスミドすなわちｐＴＡ
５００１囚とｐＡＣＹＣ１７７が連結したものおよびｐ
ＴＡ５００１（ＢｌとｐＡＣＹＣ１７７が連結したもの
が作製される。

また、親株であるアセトバクター・アセチ應１０２３、
ＦＡＲＭ　Ｐ−７１２２よシラ００μ９／ｍｌ濃度のニ
トロングアニジン（ＮＴＧ）変異処理によって得られた
プロリン要求性（Ｐｒｏ−）の親株であるアセトバクタ
ー・アセチ１０−８　（Ａｃｅｒ。

Ｂｔｈ＋＋、　Ｐｒｏ−）から自然変異によって得た酢
酸耐性およびエタノール酸化能が低下欠失しくＡｃ　ｅ
　ＳＳｇＥｔｈ−）％かつ、ストレフトマイシン耐性（
ｓｔｒｒ）となった菌株であるアセトバクター・アセチ
１０−８０８１　（ＡｃｅＳｌ、　Ｅｔｈ−＋　Ｐｒｏ
　ｒ　５ｔｒｒ　）をＤＮＡ受容菌として形質転換を実
施することができる。

すなわち前述のようにして作製されたキメラプラスミド
をＤＮＡ受容菌に導入するのであるが、導入の方法は特
願昭５８−１１５１６０に示されるようにＤＮＡ受容菌
を塩化カルシウムなどで処理するものである。

キメラプラスミドの導入処理の完了した菌体は、抗生物
質等の薬剤を適当な濃度となるように５例えばアンピシ
リンを５０μｍ７１１の濃度となるように、添加したＹ
ＰＧ培地（固体）で５０℃、５日間培養し、コロニーを
分離する。

得られた菌体の形質を確認したところ、存在しなかった
各種形質が導入されているのが分る。

形質転換に際しては、プラスミドもしくはキメラプラス
ミドの場合は細胞にと９こまれてそのままま形質が発現
する。

そして、ここに得られた形質転換株をアンピシリンを２
５μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した大量のＹＰＧ
培地で６０℃で２４時間培養し、得られた菌体より前述
の要領でキメラシラスミドを含むプラスミド溶液を調製
する。

調製されたキメラプラスミドは前述の要領で制限酵素に
よる解析などが行なわれるが、ここに得られるキメラプ
ラスミドには２棟類のものがある。

すなわち、プラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）とｐＡＣＹ
Ｃ１７７がＸｈｏＩ切断部位を介して連結したもの（ｐ
ＴＡ５００１と命名）とプラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ
）とｐＡＣＹＣ１７７がＸｈｏＩ切断部位を介して連結
したもの（ｐＴＡ５０２１と命名）とである。

ここに得られた２種類のキメラプラスミドのうちｐＴＡ
５０２１を用いてプラスミドによる酢酸菌の形質転換方
法に関する種々の条件について研究がなされる。

本発明においては、環状ＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入す
るに際して、まずＤＮＡ受容菌体が低温（０℃）で溶液
によって処理される。

溶液は２価の金属から選択された１つもしくは２つ以上
の金属を含有する塩溶液であるのが好ましい。

例えばカルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バ
リウム、マンガンなどの塩化物や酢酸塩およびチオシア
ン酸塩などがあげられる。

ＤＮＡ受容菌体を溶液で６０分程度浸漬処理するのであ
るが、溶液によって処理された菌体には、溶液で浸漬さ
れた状態で、環状ＤＮＡが溶液で添加される。

ＤＮＡの導入に際しては、ＤＮＡ受容菌体とキメラプラ
スミドの混合溶液に対してポリエチレングライコールや
ジメチルスルホキサイドおよびＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミドなどを添加した方が形質転換
効率を著しるしく向上させることができる。

そのほか、プロタミン、ポリオルニチン、ポリビニルア
ルコール、ＤＥＡＥ−７’キストラン、シュークロース
およびグリセロールなどを添加することによっても形質
転換効率を向上させうる。

形質転換効率を向上させるものとしてジメチルスルホキ
サイドを用いた場合にはその添加濃度は最終濃度として
１０〜６０チ（重量／容量）が好ましい。

また、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドでは最終濃度が１
０〜３０チ（容ｉｔ／容量）であるのが好ましい。

またポリエチレングライコールを用いる場合には、ポリ
エチレングライコールの平均分子量は約１．０００以上
のものが良（３，０００〜７．５００が好ましく、また
その添加濃度は２０チ以上が良く６０〜４０チであるの
が好ましい。

平均分子量６０００のポリエチレングライコール（ＰＥ
Ｇ４０００）を最終濃度６５チとなるように添加して形
質転換を行なう場合には例えば溶液の塩化カルシウムの
濃度は１００〜４００　ｍＭ　が良く、また塩化マグネ
シウムの濃度は６０〜２０〇−が良く、また塩化ストロ
ンチウムの濃度は２５〜２００ｍＭが良く、また塩化バ
リウムの濃度は２５〜３００ｍＭが良くさらに塩化７８
／がンの濃度は５０〜２００ｍＭが良い。さらに、溶液
の…は中性付近が良く好ましくはｐＨ６，５〜７．６に
するのが良い。

また、形質転換すべき菌体は、好ましくは対数増殖初期
から対数増殖期中期のものが集菌し用いられる。

また、溶液の緩衝剤として用いるトリス−塩酸塩の濃度
を烏めるとよシ高い形質転換効率が得られるっ 環状ＤＮＡの取込みは低温（０℃）で行なわれ、取り込
みのだめの時間は３０分以上で良く、取シ込みの間は時
々（約１０分間隔）ゆるやかに撹拌して行なわれる。

最後に４２６Ｃ６分程度の熱処理を加えることによシさ
らに形質転換効率が向上する場合もある。

環状ＤＮＡの導入処理の完了した菌体はＹＰＧ培地で約
１０倍程度に希釈され、直ちに６０℃で１時間以上振と
う培養される。

その後、抗生物質等の薬剤を適当な濃度となるように、
例えばアンピシリンを５０μｍ１／ｒｉｌｌの濃度とな
るように、添加したＹＰＧ培地（固体）で６０°Ｃ３〜
５日間培養し、増殖してきたコロニーを検出する。４ら
れた菌体の形質を確認し、存在しなかった各種形質がキ
メラプラスミドの導入によって形質転換されているのが
分かる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例Ｉ　ＤＮＡ受容菌体の調製 アセトバクター・アセチ＊　１０２３　（ＡｃｅｒｒＷ
ｔｈ”１　ｐｒｏ＋ｒ　５ｔｒＳ）、Ｆ’ＥＲＭ　Ｐ−
７１２２からＮＴＧ変異処理及び自然変異処理によって
分離されたアセトバクター・アセ−７−１０−８０８１
（Ａｃｅｓｓ＋　Ｂｔｈ−＋　ｐｒｏ−、ｓｔｒ’　）
を５００ゴ坂口フラスコに入れた１００ｍ１！ＹＰＧ液
体培地に接種し、５０℃で２０時間振とう培養した。

培養液は０℃で、６．０００ｘ、！ｉ＋で、１０分間遠
心分離し、集菌する。菌体は１００　ｍＭ　Ｎａ（Ｖ及
び５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有する５　ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６）の０．５倍容量で２回洗滌する
。再び０℃で、６．ｏｏｏｘ、ｙで、５分間遠心分離し
、集菌する。

この菌体には０．４倍容量のＣａＣ１１２溶液（１００
ｍＭ　ＣａＣ７２，２５０ｍＭ　ＫＣＪｉ！、５　ｍＭ
　Ｍｇｃｌ、、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＶ　、　ｐ
Ｈ７，６）が加えられ、０℃で、６、ｏｏＯｘ＆で、５
分間遠心分離し、集菌する。

菌体には０．００４倍容量の上記ＣａＣＡ’、　溶液を
添加し、ＤＮＡ受容菌体懸濁液とした。

実施例２　プラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）とプラスミ
ドｐＴＡ５００１ｆＢ）の混在物の単離アセトバクター
・アセチＡ１０２　′５．ＦＥＲＭＰ−７１２２を４Ｑ
ｄのＹＰＧ培地に植菌し、５０、℃で一晩振とり培養し
た。

その後盾らしいＹＰＧ培地４ノに１％で植え継ぎさらに
３０℃で３６時間邊とう培養した。

集菌後、ＴＥ緩衝液（２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０ｍ
Ｍトリス塩酸、ｐ）１８．０）で２回菌体を洗浄した。

得られた湿菌体２ＩあたシフｄのＴＢＳ［衝液（５０ｍ
Ｍ　）リス塩酸、２０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５チシヨ楯
、ｐＨ８，０）を加え、菌体を懸濁し、４−のりゾチー
ム液（０，２５Ｍ　トリス塩酸、リゾチーム２％、ｐＨ
８，０）をさらに加え、０℃で５分装置した。次に０．
２５Ｍ　ＥＤＴＡ液（ｐＨ８，０）を４ｄ加え、０℃で
５分装置した後、３７℃で２０分間反応させた。反応後
、１ｄの１０チラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃
で２０分間靜置後、５ｍｌの５Ｍ食塩水を加え、０℃で
一夜装置した。

４８．２００ｘｐで６０分間遠心分離をかけ、上清を分
取した。次にこの上清に最終濃度で１０％になるように
ポリエチレングリコール６．０００を加え、４℃で一夜
装置した後、！１．０００Ｘ、！Ｔ？で１０分間遠心分
離し、沈澱物を得た。この沈澱物を７ＷＬｌのＵＣ緩衝
液（５０ｍＭ　）リス塩酸、５　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、
５０　ｍＭ　ＮａＣＡ！、ｐ）１７８）に溶解させた後
、最終濃度で５００μｇ／Ｉｒｄｌになるようにエチジ
ウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密
度を１．５７に合わせた。この溶液を１５℃、１００．
２００ｘ、ｉＪで４０時時間区勾配遠心分離をおこなっ
た。遠心分離後、遠心チューブに紫外線ランプで３６５
　ｎｍの紫外線を照射することにより、染色体バンドの
下にあられれるバンドをプラスミド分画として分取した
。次いで、分画液をイソプロパツールで処理し、エチジ
ウムブロマイドを除去した後、ＴＢ緩衝液（１０ｍＭ　
）　！Ｊス塩酸、１　ｍＭ　ＦｉＤＴＡ、ｐＨ７，５）
に対して透析した。これをプラスミド混在溶液とした。

得られたプラスミド混在溶液中には２つの環状プラスミ
ドが混在しており、制限酵素による解析の結果、第１図
に示すプラスミドｐＴＡ５００１（４）と第２図に示す
プラスミドＩ）Ｔｉ６Ｏ１１（Ｂ）であることが明らか
となった。

すなわち前記で調製したプラスミド混在溶液に対し、少
なくとも５倍量過剰の制限酵素（ＥｃｏＲＩおよび５ａ
ｌＩは全酒造社製、Ｘｈｏ　Ｉは、ベセスダ・リサーチ
社製を使用した。）を常法に従がって各科の制限酵素の
至適条件下で反応させた。反応後。

垂直型アガロースゲル電気泳動で分析した。即ち、１チ
アガロースゲルを用い、トリス酢酸緩衝液（４０ｍＭ　
トリス、２０　ｍＭ酢酸、２ｍＭ　ＢＤＴＡ、ｐＨ８，
１）中で泳動させた。その後、ゲルをエチジウムブロマ
イドの１μ！！／ｄ液に浸して染色した。

このゲルに紫外線を照射し、生成断片の数を判定し、各
断片の泳動距離から、各々の分子量を算出した。分子量
は、同一アガロース上で同時に泳動したラムダファー：
）ＤＮＡのＨｉｎｄｕ切断で生成する分子量既知の各断
片の泳動距離から作成した標準線をもとに算出した。

各種制限酵素を単独で用いて得られた各断片及び各制限
酵素の２種以上を組合わせて用いた処理によって得られ
た各断片の断片数及び分子量などからｐＴＡ５００１Ｌ
Ａｌ及びｐＴＡ５００１（Ｂ）の第１図及び第２図に示
した制限酸素開裂地図が決定された、 実施例６　プラスミドｐＴＡ５．００１（Ａｌとプラス
ミドｐＴＡ５００１ｆＢｌの混在物の（フタ−としての
利用 実施例２で得られたプラスミド混在溶液（ＤＮＡ量１０
μｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクターであるｐＡＣＹＣ
１７７＜カナマイシン耐性及びアンピシリン耐性；　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋１３
４（ろ）、１１４１ｉ１５６，１９７８）を持つ大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ６００）から
得たプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（第６図に示す。ＤＮ
Ａ７２μｇ）を添加し、少なくとも５倍量過剰の制限酵
素Ｘｈｏ　Ｉを常法により至適条件下で反応させ、反応
終了後、等量のフェノールを加え激しく撹拌して制限酵
素を失活させた後、さらにエーテル抽出を充分性なって
フェノールを除去し、さらに２倍量のエタノールを加え
て一８０℃に１時間保持した後、１５’、０ＯＯＸ、）
７で５分間遠心分離を行なってＤＮＡを沈降させ、さら
に真空乾燥してエタノールを除去した後、次に沈殿を水
に溶解後、常法によって、Ｔ４ＤＮＡ！ｊガーゼによる
反応を２１℃で２時間行ない、さらに前記と同様にして
エタノール沈殿、真空乾燥を行なって得られた沈殿をＴ
ｇ緩衝液ｏ、ｉｙに溶解してキメジブラスミド含有溶液
を得た。

それぞれのキメラプラスミドはいずれもプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１７７を含有している。しかし、プラスミドｐＡ
ＣＹＣ１７７の力六マイシン耐性部位にＸｈｏＩ切断点
があって、そこが切断されているためにカナマイシン耐
性は発現せず、アンピアリン耐性のみが発現することに
なる。

実施例４　キメラプラスミドを用いた形質転換実施例１
で傅たＤＮＡ受容菌体懸濁液０．２　ｍｌ！を用意し、
これに実施例６で得たキメ２プラスミド含有溶液０．１
−を添加し、０℃で９０分間ゆるやかに撹拌しつつ、キ
メラプラスミドの直接導入を行なった。

ことに傅らｔたキメラプラスミド導入菌体を含む液を３
−のＹＰＧ培地に移し、３０’Ｃ６時間振とう培養を行
なった後、ｆノビシリン５ｏγ／　ｍｌ添加したＹＰＧ
培地（固体）上で３０’Ｃで５日間培養し、９株のコロ
ニーを得だ。これらを１Ｏ−８０１９１−Ａ１−−Ａ９
と命名した。このうち、１０−８［］８ｌ−ＡＩをアン
ピシリンを３０ｒ／Ｎ添加したＹＰＧ液体培地で３０’
Ｃ，，２４時間娠とう培養し、実施例２の方法に従って
プラスミドを分離したところ、プラスミドｐＴＡ５００
１（３）トフラスｆ　ｌ−’ｐＴＡ　５００１　（Ｂｌ
の混在物以外にこれらよシやや分子量の大きいプラスミ
ドが得られた。このプラスミドは先に導入したキメラプ
ラスミドのうち、ｐＴＡ５００１（Ａ）とｐＡＣＹＣ１
７７がＸｈｏＩ切断部位を介して連結したキメラシラス
ミド（ｐＴＡ５０１１と命名）と認められた。また、ア
セトバクター・アセチ１０−８０８１はアンピシリン耐
性を有しないが１０−８０８１−ＡＩは゛アンピシリン
耐性を持っていることなどからもキメラプラスミドが導
入され、形質転換が行なわれたことが確認された。

同様にして、少なくとも１Ｏ−８Ｏ８１〜Ａ２〜−Ａ６
はｐＴＡ５００１（旬とｐＡＣＹＣ１７７が制限酵素Ｘ
ｈｏ　Ｉ切断部位を介して連結したキメラプラスミド（
＋）Ｔｉ６Ｏ１１と命名）が導入されていることが確認
された。

ここに得られたｐＴＡ５０２１を持つ菌株１Ｏ−８０８
１−Ａ３をアンピンリンを３０４　／　ｍｌで含有する
ＹＰＧ培地で大量（約２０りに培養して得た菌体につい
て、実施例２の方法に従がってプラスミドを分離し、得
られたキメラプラスミドｐＴＡ５０２１を含有するプラ
スミド混合液（ＤＮＡ濃度約１０μｇ／ゴ）を環状ＤＮ
Ａ溶液として以下の実施例に供した。

実施例５ 実施例１の方法で調製したＤＮＡ受容菌体懸濁液（対照
）および実施例１の方法においてＣａＣＡ１２溶液のか
わりに１０　ｍＭ　）　！ｊスス−酸緩衝液（ｐ１１７
．６）に１００　ｍＭのナトリウム、カリウム、ルビジ
ウム、セシウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム
、ストロンチウム、バリウム、マンガン、の塩を含む溶
液を用いて調製したＤＮＡ受容菌体懸濁液０．２１Ｌｌ
のそれぞれに対し、実施例４において調製した環状ＤＮ
Ａ溶液を０．１コ添加し、実施例４と同様にして形質転
換を行ない、形質転換効率を比較した。

また、上記の方法において、ＤＮＡ受容菌体懸濁液に環
状ＤＮＡ溶液を添加し０℃で６０分間ＤＮＡの導入を行
なわせた佐、各々に対し、平均分子量３，０００のポリ
エチレングライコールを６５％（重量／容量）、ジメチ
ルスルホキサイドラ６５係（容量／容量）、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを６３％（容！／８−１ｍ）となる
ように添加し、引続き同様にして６０分間ＤＮＡの導入
を行なわせて形質転換を行ない、形質転換効率を比較し
た。

結果は以下の表１に示す通りであり、マグネシウム、カ
ルシウム、ストロンチウム、バリウム、マンガンなどの
２価の金属が必須であり、それぞれの金属において、ポ
リエチレングライコール、ジメチルスルホキサイドおよ
びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドが形質転換促進効果を
持つことが分かった。

実施例６ 実施例１の方法で調製したＤＮＡ受容菌体懸濁液（対照
Ａ）および実施例１の方法においてＣａＣ１ｘ溶液の１
００　ｍＭ　ＣａＣＡ！２のかわシに１００ｍＭＭｇＣ
６ｔを用いて調製したＤＮＡ受容菌体懸濁液（対照Ｂ）
各々０．２　ｍに対し実施例４で調製した環状ＤＮＡ溶
液を０．１７１７添加して実施例４と同様にして形質転
換を行なわせた。そして、上記の方法において、Ｔ）Ｎ
Ａ受容菌体懸濁液に環状ＤＮＡ溶液ｒ添加し６０分間Ｄ
ＮＡの導入を行なわせた後、各々に対し平均分子量ろ、
０００のポリエチレングライコールを６５％（重量／容
量）、ジメチルスルホキサイドを３５％（容量／容量）
、Ｎ。

Ｎ／−−ジメチルホルムアミドを３６チ（容量／容量）
、ゾロタミンを１００μｇ／Ｉｊｄ、ポリオルニチンを
６００μ９７ｍ１、ポリビニルアルコールを１７．５チ
（重量／容量）、ＤＢＡＥ−デキスト２ンを５チ（重量
／容１ｔ）、シュークロースを６５％（重量／容ｔ）お
よびグリセロールを６５チ（重量／容量）となるように
それぞれ２倍濃度の溶液を０．３ｄ添加し、引続き同様
にして６０分間ＤＮＡの導入を行なわせて形質転換を行
ない、形質転換効率を比較した。

結果は以下の表２に示す通りであり、添加した全ての物
質において形質転換促進効果が認められた。

実施例７ 実施例乙において、添加する物質をポリエチレングライ
コールに限り、その平均分子量で変化させて形質転換を
行なわせ、形質転換効率を比較した。冷加するポリエチ
レングライコールの濃度は全て６５チ（重量／容量）と
した。

結果は以下の表６に示した。

平均分子量１０００以上において促進効果が認められ、
平均分子ｚｓ、ｏｏｏ〜７．０００が好ましいことが分
かった。

実施例８ 実施例６において、添加する物質を平均分子量３．００
０のポリエチレングライコール（ＰＥＧ４０００）、ジ
メチルスルホキサイドおよびＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミドに限り、これらの添加濃度を変化させて形質転換を
行なわせ、形質転換効率を比較した。結果は以下の表４
に示した。

平均分子量３，０００のポリエチレングライコールにお
いてはその添加濃度は、２０％以上で促進効果が認めら
れ、また６０〜４０チで強い効果が認められた。同様に
ジメチルスルホキサイドでは濃度１０〜３０チで、また
、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドでも濃度１０〜５０チ
で促進効果が認められた。

実施例９ 実施例１のＣａＣ１１２溶液のかわシに、５ｍＭト！ｊ
スー塩酸緩衝液（ｐ１１７．６）に対し種々の濃度で塩
化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム
、塩化バリウム、塩化マンガンをそれぞれ含有する溶液
を用いてＤＮＡ受容菌体懸濁液０．２痕を調製し、各々
に対し実施例４で調製した環状ＤＮＡ溶液をｏ、ｉｙ添
加し、０℃で６０分間ＴＵＮＡを取り込゛ませた後、平
均分子量３．０００のポリエチレングライコール溶液を
０．６Ｍ加えて最終濃度が６５チ（重ｉ／容ｆｉｔ）と
なるようにし、引続き同様にして３０分間ＤＮＡを取シ
込ませて、以−ト実施例４と同様にして形質転換を行な
わせて、形質転換効率を比較した。

結果は第４図〜第９図に示す通りである。

塩化カルシウムは１００〜４００ｍＭが、塩化マグネシ
ウムは６０〜２００　ｍＭが、塩化ストロンチウムは２
５〜２００ｍＭが、塩化バリウムは２５〜３００　ｍＭ
が、また塩化マンガンは５０〜２００蘭が形質転換効率
が高いことが分かった。

実施例１０ 実施例１の方法において、ＤＮＡ受容菌の培養時間を種
々変化させ、各々について実施例１の方法によＪＤ’Ｎ
Ａ受容菌体を調製し、これらのＤＮＡ受容菌体懸濁液０
．２　ｍに対し、実施例４で調製した環状ＤＮＡ溶液を
０．１　ａｔづつ添加し、実施例４と同様にして６０分
間ＤＮＡを取り込ませ、さらに以下実施例９と同様にし
て形質転換を行なわせて、形質転換効率を比較した。

結果は第９図に示す逼シであシ、対数増殖初期〜中期環
の菌体を用いるのが相対的に高い形質転換効率が得られ
た。

実施例１１ 実施例１の方法において、用いるＣａＣ１ｊ２の溶液の
…を種々変化させ、以下実施例１０の方法と同様にして
形質転換を行なわせて形質転換効率を比較した。

実施例１の方法と同じＣａ　Ｃ１ｔ　を溶液（ｐＨ７，
６）を用いた場合を対照とし、酸性側（ｐｉ１５．５〜
６．５）テハ緩衝剤として１０ｍＭメチルエタンスルホ
ネート（ＭｇＳ＞を、また中性からアルカリ性側（ｐＨ
７〜８，５　）　ｉ’ｊ：’１０　ｍＭモルホリノプロ
パンスルホネート（ＭＯＰ８）を１０　ｍＭ　トリス−
塩酸の替わりに用いてｐＨを調整した。

結果は第１０図に示す通りである。

ｐｌ（６，５〜ｚ６の間でより高い形質転換効率が得ら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐ’ｒＡ５００１（Ａ）の制限酵素
開裂地図を示し、第２図はプラスミドｐＴＡ５００１　
（Ｂ）の制限酵素開裂地図を示し、第６図はプラスミド
ｐＡＣＹＣ１７７の制限酵素開裂地図を示す。 Ｂ　−Ｅｃｏ几■による切断部位、８−５ａｌＩによる
切断部位、Ｘ　Ｘｈｏ　Ｉ忙よる切断部位、Ｋｍ−カナ
マイ７ノ耐性遺伝子、靜Ｆ・・アンピシリン耐性遺伝子
。 第４図から第８図は実施例９における各種金−属塩の種
々の濃度での形質転換効率を示すグラフであり、第４図
は塩化マグネシウムの場合、第５図は塩化カルシウムの
場合、ＫｆＪ６図は塩化ストロンチウムの場合、第７図
は塩化バリウムの場合、第８図は塩化マンガンの場合の
結果を示す。 第９図は受容菌の採取時期と形質転換効率の関係を示す
グラフである。また、第１０図はＣａ　Ｃ１ｚ溶液の…
と形質転換効率の関係を示すグラフである。 第４図から第１０図においては、最も高い形質転換効率
を１００とした相対形質転換効率が示されている。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　１　図 Ｘ 第　２　図 ｈｏｌ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）２価の金属から選択された１つもしくは２つ以上
   の金属を含有する溶液中で環状ＤＮＡを酢酸菌に導入す
   ることを特徴とする酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法。
2. （２）　溶ｉがマグネ７ウム、カルシウム、ストロンチ
   ウム、バリウム、マンガン、から選択された１つもしく
   は２つ以上の金属を含有することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法。
3. （３）溶液がポリエチレングライコール、ジメチルスル
   ホキサイド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、プロタミ
   ン、ポリオルニチン、ポリビニルアルコール、ＤＥＡＲ
   −−７’キストラン、シュクロース、グリセロールから
   選択された１つもしくは２つ以上の形質転換促進物質を
   含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法。
4. （４）溶液の−が６．５〜Ｚ６であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法
   。
5. （５）酢酸菌が対数増殖初期から中期に集菌されたもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲ｔ４１項記載の
   酢酸菌の環状ＤＮＡ導入法。