JPS6140792A - 細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み換え体プラスミドにより形質転換されたエスチェリチア属菌 - Google Patents
細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み換え体プラスミドにより形質転換されたエスチェリチア属菌Info
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- JPS6140792A JPS6140792A JP59161678A JP16167884A JPS6140792A JP S6140792 A JPS6140792 A JP S6140792A JP 59161678 A JP59161678 A JP 59161678A JP 16167884 A JP16167884 A JP 16167884A JP S6140792 A JPS6140792 A JP S6140792A
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- wall lytic
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は細胞壁溶解酵素系遺伝子を含有する組み換え体
プラスミド、それにより形質転換されたエスチェリチア
属菌およびこの菌を用いて細胞壁溶解酵素を製造する方
法に関する。
プラスミド、それにより形質転換されたエスチェリチア
属菌およびこの菌を用いて細胞壁溶解酵素を製造する方
法に関する。
（従来技術）
酵母やクロレラなどの微生物の蛋白質を食料源もしくは
飼料源として利用するうえで、これら微生物の菌体細胞
壁を溶解除去することが必要である。しかしながら、こ
れら菌体細胞壁を分解しうる酵素を工業的に効果的に生
産しうる技術はいまだ確立されていない。
飼料源として利用するうえで、これら微生物の菌体細胞
壁を溶解除去することが必要である。しかしながら、こ
れら菌体細胞壁を分解しうる酵素を工業的に効果的に生
産しうる技術はいまだ確立されていない。
（発明の目的）
本発明の目的は、細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み
換え体プラスミドおよびこの組み換え体プラスミドを導
入したエスチェリチア属菌を提供することにある。本発
明の他の目的は、この組み換え体プラスミドもしくはこ
れを導入したエスチェリチア属菌を使って細胞壁溶解酵
素を容易かつ大量に生産する方法を提供することにある
。
換え体プラスミドおよびこの組み換え体プラスミドを導
入したエスチェリチア属菌を提供することにある。本発
明の他の目的は、この組み換え体プラスミドもしくはこ
れを導入したエスチェリチア属菌を使って細胞壁溶解酵
素を容易かつ大量に生産する方法を提供することにある
。
（発明の構成）
本発明の組み換え体プラスミドは、アルスロバクタ−属
菌の細胞壁溶解酵素系遺伝子をエスチェリチア・コリー
ｔｒｐｃ −９８３０のベクタープラスミドＹＲｐ ７
に導入して得られ、これをエスチェリチア・コリーＩＩ
Ｂ １０１もしくはエスチェリチア・コリーＪＡ２２
１などのエスチェリチア属菌に導入することにより細胞
壁溶解酵素系遺伝子を発現させ、そのことにより上記目
的が達成される。
菌の細胞壁溶解酵素系遺伝子をエスチェリチア・コリー
ｔｒｐｃ −９８３０のベクタープラスミドＹＲｐ ７
に導入して得られ、これをエスチェリチア・コリーＩＩ
Ｂ １０１もしくはエスチェリチア・コリーＪＡ２２
１などのエスチェリチア属菌に導入することにより細胞
壁溶解酵素系遺伝子を発現させ、そのことにより上記目
的が達成される。
また９本発明の細胞壁溶解酵素の製造方法は。
上記組み換え体プラスミドを含有するエスチェリチア・
コリー属菌を培養しその菌体内もしくは培地中に蓄積さ
れる細胞壁溶解酵素を採集することを包含し、そのこと
により上記目的が達成される。
コリー属菌を培養しその菌体内もしくは培地中に蓄積さ
れる細胞壁溶解酵素を採集することを包含し、そのこと
により上記目的が達成される。
この細胞壁溶解酵素の生産は、親株アルスロバクタ−Ｙ
ＣＷＤ３が誘導的であるのに対し、形質転換株エスチェ
リチア・コリーでは構成的である。
ＣＷＤ３が誘導的であるのに対し、形質転換株エスチェ
リチア・コリーでは構成的である。
本発明におけるアルスロバクタ−ＹＣＷＤ３の細胞壁溶
解酵素系遺伝子のエスチェリチア・コリーへのクローニ
ングは次のようにして行われる：アルスロバクター（八
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ） Ｙ ＣＷ Ｄ ３の対数増
殖期の細胞からＪ、Ｍａｒｍｕｒの方法（Ｊ。
解酵素系遺伝子のエスチェリチア・コリーへのクローニ
ングは次のようにして行われる：アルスロバクター（八
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ） Ｙ ＣＷ Ｄ ３の対数増
殖期の細胞からＪ、Ｍａｒｍｕｒの方法（Ｊ。
Ｍａｒｍｕｒ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ３２０８
（１９６１））により染色体ＤＮＡが調製される。これ
を制限酵素Ｂａｎ＋ ＩＩＩで不完全分解して２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を得る。他方。
（１９６１））により染色体ＤＮＡが調製される。これ
を制限酵素Ｂａｎ＋ ＩＩＩで不完全分解して２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を得る。他方。
ベクタープラスミドＹＲｐ ７は制限酵素Ｂａｎ旧によ
りテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子上に１ケ所のみ
切れる配列を有する。このベクタープラスミドＹＲｐ
７を切り直線状にする。次いで、アルカリフォスファタ
ーゼで末端のリン酸を切り取る。こうすることにより、
後に加える修復酵素Ｔ、ＤＮＡリガーゼによりＹＲｐ
７が元の環状ＤＮＡに戻るのを防ぐ０両ＤＮＡを混合し
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加えて、切れているリン酸結合
をつなぐことにより目的の組み換え体プラスミド（ｐ、
Ｘ ２０と命名）を含む種々のプラスミドの混合物を
得る。これを。
りテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子上に１ケ所のみ
切れる配列を有する。このベクタープラスミドＹＲｐ
７を切り直線状にする。次いで、アルカリフォスファタ
ーゼで末端のリン酸を切り取る。こうすることにより、
後に加える修復酵素Ｔ、ＤＮＡリガーゼによりＹＲｐ
７が元の環状ＤＮＡに戻るのを防ぐ０両ＤＮＡを混合し
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加えて、切れているリン酸結合
をつなぐことにより目的の組み換え体プラスミド（ｐ、
Ｘ ２０と命名）を含む種々のプラスミドの混合物を
得る。これを。
次いで、あらかじめＣａＣ１ｚ処理などにより外来ＤＮ
Ａを受は入れやすくした宿主微生物エスチェリチア・コ
リー（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＨＢ
１０１またはエスチェリチア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪΔ２２１へ入れる０組み換え
体プラスミドｐＸ２０はＹＲｐ７のＴｃ’中へ染色体Ｄ
ＮＡ断片が入り込んだものであるから、これが導入され
たエスチェリチ−ｉ’ ・：Ｉ ＩＪ −ＨＢ １０１
（ｐ Ｘ２０）またはＪＡ２２１（１）Ｘ２０）はテト
ラサイクリン耐性遺伝子が分離されてテトラザイクリン
惑受性（Ｔｃ’ ）となる。ＹＲｐ７のもつもう一つの
アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍ’ ）は生かされている
ため、エスチェリチア・コリーＨＢ １０１ （ｐＸ
２０＞またはＪ Ａ２２Ｈｐ Ｘ２０）はアンピシリン
面（性（Ａ１）である。
Ａを受は入れやすくした宿主微生物エスチェリチア・コ
リー（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＨＢ
１０１またはエスチェリチア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪΔ２２１へ入れる０組み換え
体プラスミドｐＸ２０はＹＲｐ７のＴｃ’中へ染色体Ｄ
ＮＡ断片が入り込んだものであるから、これが導入され
たエスチェリチ−ｉ’ ・：Ｉ ＩＪ −ＨＢ １０１
（ｐ Ｘ２０）またはＪＡ２２１（１）Ｘ２０）はテト
ラサイクリン耐性遺伝子が分離されてテトラザイクリン
惑受性（Ｔｃ’ ）となる。ＹＲｐ７のもつもう一つの
アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍ’ ）は生かされている
ため、エスチェリチア・コリーＨＢ １０１ （ｐＸ
２０＞またはＪ Ａ２２Ｈｐ Ｘ２０）はアンピシリン
面（性（Ａ１）である。
アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３由来の細胞壁溶解酵素系遺
伝子を発現する形質転換株を選び出すために、八ｍ“の
エスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩまたはＪΔ２２１の
コロニーを選択し、そのうちで細胞壁溶解酵素活性を有
する株をスクリーニングする。細胞壁溶解酵素活性を有
するエスチェリチア・コリーＩＩ １３１０１（ｐＸ２
０）またはＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０）のスクリーニン
グは、 Ａｍ’のコロニーをパン酵母細胞壁基質と共に
インキュベートしてコロニー周辺に細胞壁溶解斑の生じ
る株を選択することにより行われる。選択培地にアンピ
シリンと細胞壁とを共存させておくことにより Ａｍ
Ｉ’でかつ細胞壁溶解活性陽性の株を同時に選択するこ
とが可能である。
伝子を発現する形質転換株を選び出すために、八ｍ“の
エスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩまたはＪΔ２２１の
コロニーを選択し、そのうちで細胞壁溶解酵素活性を有
する株をスクリーニングする。細胞壁溶解酵素活性を有
するエスチェリチア・コリーＩＩ １３１０１（ｐＸ２
０）またはＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０）のスクリーニン
グは、 Ａｍ’のコロニーをパン酵母細胞壁基質と共に
インキュベートしてコロニー周辺に細胞壁溶解斑の生じ
る株を選択することにより行われる。選択培地にアンピ
シリンと細胞壁とを共存させておくことにより Ａｍ
Ｉ’でかつ細胞壁溶解活性陽性の株を同時に選択するこ
とが可能である。
このようにして本発明において得られた形質転換株エス
チェリチア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０ （受託番
号：微工研菌寄第７７４２号）およびＪＡ２２１（ｐＸ
２０） （受託番号：微工研菌寄第７７４４号）は細
胞壁溶解酵素系遺伝子、特に、β−１・３グルカナーゼ
遺伝子を有している。この酵素活性は主としてペリプラ
ズム区分に見出される。
チェリチア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０ （受託番
号：微工研菌寄第７７４２号）およびＪＡ２２１（ｐＸ
２０） （受託番号：微工研菌寄第７７４４号）は細
胞壁溶解酵素系遺伝子、特に、β−１・３グルカナーゼ
遺伝子を有している。この酵素活性は主としてペリプラ
ズム区分に見出される。
形質転換株エスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐＸ２
０）およびＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０）の生産するβ−
１・３グルカナーゼは、酵母グルカンなどに作用させて
得られるオリゴ糖のペーパークロマトグラム。
０）およびＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０）の生産するβ−
１・３グルカナーゼは、酵母グルカンなどに作用させて
得られるオリゴ糖のペーパークロマトグラム。
アビセル吸着クロマトグラフィによる吸着性およびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、親株の生産するグ
ルカナーゼ■と同一であることが確認された。
アクリルアミドゲル電気泳動により、親株の生産するグ
ルカナーゼ■と同一であることが確認された。
（実施例）
以下に本発明を実施例について詳述する。
プ」１例」＝（組み換え体プラスミドの調製）■ 親株
二本発明で用いる親株アルスロバクタ−（ＡｒＬｂｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）ＹＣＷＤ ３ （受託番号：微工研菌寄
第７７３９号）は細胞壁溶解酵素β−１・３・グルカナ
ーゼ（グルカナーゼＩおよびグルカナーゼ１１）の生産
株として空気中に放置して腐敗したコンニャクの表面か
ら分離され固定された。その同定データは第１表に示さ
れる。 この菌株はこの同定データからＲ，Ｅ、Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ、Ｅ、Ｇｉｂｂｏｎｓ＋二
８ｅｒＢｅｙ’ｓ、 Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
＋７ｔｈ ＩＥｄｉＬｉｏｎ、 Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ＋ ’。
二本発明で用いる親株アルスロバクタ−（ＡｒＬｂｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）ＹＣＷＤ ３ （受託番号：微工研菌寄
第７７３９号）は細胞壁溶解酵素β−１・３・グルカナ
ーゼ（グルカナーゼＩおよびグルカナーゼ１１）の生産
株として空気中に放置して腐敗したコンニャクの表面か
ら分離され固定された。その同定データは第１表に示さ
れる。 この菌株はこの同定データからＲ，Ｅ、Ｂｕｃ
ｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ、Ｅ、Ｇｉｂｂｏｎｓ＋二
８ｅｒＢｅｙ’ｓ、 Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
＋７ｔｈ ＩＥｄｉＬｉｏｎ、 Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ＋ ’。
１１ａｌＬｉｍｏｒｅ、によりアルスロバクタ−に属す
る新菌種であり、アルスロバクタ−・シトレウスの変異
株であると同定された。この菌株はβ−１・３グルカナ
ーゼを含有する細胞壁溶解酵素遺伝子を存する。
る新菌種であり、アルスロバクタ−・シトレウスの変異
株であると同定された。この菌株はβ−１・３グルカナ
ーゼを含有する細胞壁溶解酵素遺伝子を存する。
第−表
（１）形態：液体振盪培養（Ｄｉｆｃｏ ｎｕＬｒｉｅ
ｎｔｂｒｏ ｔｈ）中の最初はほぼ球形（直径約１μｍ
）であり、５時間後には提体（屈曲した桿棒状で全長約
１．０μｍ）となり、９〜１０時間後には再び球形細胞
が現れ、２４時間後には全てほぼ球形（直径１μｍ）の
細胞となる。
ｎｔｂｒｏ ｔｈ）中の最初はほぼ球形（直径約１μｍ
）であり、５時間後には提体（屈曲した桿棒状で全長約
１．０μｍ）となり、９〜１０時間後には再び球形細胞
が現れ、２４時間後には全てほぼ球形（直径１μｍ）の
細胞となる。
（２）胞子：形成しない。
（３）運動性二球形のものは非運動性であるが、長提体
が現れる前後の短い間においてのみ運動性のある個体の
存在が認められた。
が現れる前後の短い間においてのみ運動性のある個体の
存在が認められた。
（４）鞭毛：生育中における運動性のある個体が現れる
時期の菌体を電子顕微鏡で観察すると周毛の長桿形菌の
存在が認められる。
時期の菌体を電子顕微鏡で観察すると周毛の長桿形菌の
存在が認められる。
（５）色素：大抵の場合黄色を呈する。若い培養ではこ
の色素が培地中に拡散することはないが、長時間はげし
く振盪培養するときには培地中にわずかに色素がでてく
る。
の色素が培地中に拡散することはないが、長時間はげし
く振盪培養するときには培地中にわずかに色素がでてく
る。
（６）液体培養（Ｄｉｆｃｏ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒ
ｏｔｈ）３０’Ｃの積置培養では菌体の生育はあまりよ
くないが、振盪培養するときには良好に生育した。積置
培養では表面に被膜、及びリングを生じない。
ｏｔｈ）３０’Ｃの積置培養では菌体の生育はあまりよ
くないが、振盪培養するときには良好に生育した。積置
培養では表面に被膜、及びリングを生じない。
（７）寒天平面 培養（Ｄｉｆｃｏ ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ａｇａｒ） ３７℃で生育し、１日日コロニーは金縁
が凸円状を形成し、５日日コロニーの周縁は赫状となり
仮菌緑（各画線は球菌の集団）の生育が認められた。コ
ロニーの色は常にレモン黄色で、古くなると濃黄色赤味
を帯びる。
ａｇａｒ） ３７℃で生育し、１日日コロニーは金縁
が凸円状を形成し、５日日コロニーの周縁は赫状となり
仮菌緑（各画線は球菌の集団）の生育が認められた。コ
ロニーの色は常にレモン黄色で、古くなると濃黄色赤味
を帯びる。
（８）肉汁培、養
生育：表面の生育なし
濁度：わずかににとる
香り：わずかにアンモニア臭
沈渣：微黄色の沈渣を生じる
（９）肉汁寒天培養（３０℃、７２時間培養）生育：中
等度、直径０．８〜１．０朋 形状：円形 表面：平滑 辺縁：完全、ただし古い培養（５日間以後）では放射状
となる。
等度、直径０．８〜１．０朋 形状：円形 表面：平滑 辺縁：完全、ただし古い培養（５日間以後）では放射状
となる。
隆起：隆起する
粘性：バク−状
光沢：あり
色素：黄色
深部集落：集落の直下、または中央に直径０．５ｍｉ＋
以下の固い集落が認められる。
以下の固い集落が認められる。
（１０）生育温度：２０〜４０℃。（最適３０〜３７°
Ｃ）（１１）生育ｐＨ： ｐＨ６，０〜９．０゜（最適
ｐＨ７，０〜８．０）（１２）嫌・好気性：好気性。
Ｃ）（１１）生育ｐＨ： ｐＨ６，０〜９．０゜（最適
ｐＨ７，０〜８．０）（１２）嫌・好気性：好気性。
（１３）ダラム染色性：陽性
（１４）抗酸性：陰性
（１５）メチルレッドテスト：陽性
（１６）フォーゲス・プロスカラエル反応：陰性（１７
）インドールの生成：陰性 （Ｅｈｒｌｉｃｈ法、亜硝酸法３０℃、３日）（１８）
ｇ化水素の生成：陽性 （Ｄｉｆｃｏ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ、 Ｎ
ａＣｌ ＰｂＣ０゜寒天培地） （１９）アンモニアの生成：陽性 （２０）硝酸塩の還元：陽性 （２１）カタラーゼの生成：陽性 （２２）ウレアーゼの生成：陰性 （３０℃、３日振盪培養） （２３）ゼラチンの液化：陽性（２０”Ｃ，７日）（２
４）澱＄５）の加水分解：陰性（３０’Ｃ，３日）（２
５）クエン酸の利用性：利用しない（３０℃、３日 振
盪培養） （２６）牛乳の凝固：陽性もしくは陰性（３０’Ｃ，５
日）（２７） ’Ｊ ｌ−７ス１７）還元性：陰性（３
０”Ｃ，５日）（２８）硝酸塩の利用性：陰性（３７℃
、１３日振盪培養）（２９）セルロースの分解：陰性（
３７℃、 １０日）（３０）耐塩性ニア％まで生育する
（３０”Ｃ，５日振盪培養） （３１）各種炭素源の利用性 ３７℃、８日積置培養でグルコース、マンノース、フラ
クトース、ガラクトース、マルトース、シュクロースよ
り酸を生成する。ラクトース、マンニトール、ソルビト
ール、でんぷん、セルロースからは酸の生成は認められ
ない。
）インドールの生成：陰性 （Ｅｈｒｌｉｃｈ法、亜硝酸法３０℃、３日）（１８）
ｇ化水素の生成：陽性 （Ｄｉｆｃｏ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ、 Ｎ
ａＣｌ ＰｂＣ０゜寒天培地） （１９）アンモニアの生成：陽性 （２０）硝酸塩の還元：陽性 （２１）カタラーゼの生成：陽性 （２２）ウレアーゼの生成：陰性 （３０℃、３日振盪培養） （２３）ゼラチンの液化：陽性（２０”Ｃ，７日）（２
４）澱＄５）の加水分解：陰性（３０’Ｃ，３日）（２
５）クエン酸の利用性：利用しない（３０℃、３日 振
盪培養） （２６）牛乳の凝固：陽性もしくは陰性（３０’Ｃ，５
日）（２７） ’Ｊ ｌ−７ス１７）還元性：陰性（３
０”Ｃ，５日）（２８）硝酸塩の利用性：陰性（３７℃
、１３日振盪培養）（２９）セルロースの分解：陰性（
３７℃、 １０日）（３０）耐塩性ニア％まで生育する
（３０”Ｃ，５日振盪培養） （３１）各種炭素源の利用性 ３７℃、８日積置培養でグルコース、マンノース、フラ
クトース、ガラクトース、マルトース、シュクロースよ
り酸を生成する。ラクトース、マンニトール、ソルビト
ール、でんぷん、セルロースからは酸の生成は認められ
ない。
■ 染色体ＤＮＡの調製： Ｌ−ｂｒｏｔｈ寒天斜面か
らアルスロバクタ−ＹＣＷＤ３の一白金耳をとり。
らアルスロバクタ−ＹＣＷＤ３の一白金耳をとり。
これを１００１！のＬ−ｂｒｏｔｈ （１％Ｂａｃｔ
ｏｐｅｐＬｏｎｅ−０，５％Ｄｉｆｃｏ ｙｅａｓｔｅ
ｘｔｒａｃｔ−０，５％ＮａＣ１）に植え３７℃にて一
夜振盪培養した。この培養液の１０ｎｌを１００ｍ６の
２％グリシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈに加え。
ｏｐｅｐＬｏｎｅ−０，５％Ｄｉｆｃｏ ｙｅａｓｔｅ
ｘｔｒａｃｔ−０，５％ＮａＣ１）に植え３７℃にて一
夜振盪培養した。この培養液の１０ｎｌを１００ｍ６の
２％グリシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈに加え。
３７℃にて２時間振盪した。得られた細胞を遠心分離し
て集めた。これを０．１５Ｍ ＮａＣ１−０，１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ （ｐＨ８，０）に）甑濁し、同じ溶媒に溶かし
たりゾチーム（２０ｍｇ／ ｍｌｌ 、 Ｓｉｇｍａ社
製、 ｇｒａｄｅ 、１ ）を２ｍｇ／ｍｌになるよう
に加え３７℃で６５分間保温した。１０％硫酸ドデシル
ナトリウム（ＳＤＳ）を２％（、終濃度）に加え、６５
°Ｃにて２０分間加熱し溶菌液を得た。 これにＰｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅ Ｋ （Ｍｅｒｃｋ社製）を１２０μＢ
／ｍｌになるように加え、３７℃で２．５時間保温した
。ＮａＣｌ０．を終濃度ＩＭになるように加えたのチ等
容のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４： １
ｖ／ｖ）と振った。遠心（１０，ＯＯＯｒｐｍ、、
１０分、２０℃）して上層をとり２容のエタノールを重
層して攪拌し生じた糸状沈澱をガラス棒にまきとった。
て集めた。これを０．１５Ｍ ＮａＣ１−０，１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ （ｐＨ８，０）に）甑濁し、同じ溶媒に溶かし
たりゾチーム（２０ｍｇ／ ｍｌｌ 、 Ｓｉｇｍａ社
製、 ｇｒａｄｅ 、１ ）を２ｍｇ／ｍｌになるよう
に加え３７℃で６５分間保温した。１０％硫酸ドデシル
ナトリウム（ＳＤＳ）を２％（、終濃度）に加え、６５
°Ｃにて２０分間加熱し溶菌液を得た。 これにＰｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅ Ｋ （Ｍｅｒｃｋ社製）を１２０μＢ
／ｍｌになるように加え、３７℃で２．５時間保温した
。ＮａＣｌ０．を終濃度ＩＭになるように加えたのチ等
容のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４： １
ｖ／ｖ）と振った。遠心（１０，ＯＯＯｒｐｍ、、
１０分、２０℃）して上層をとり２容のエタノールを重
層して攪拌し生じた糸状沈澱をガラス棒にまきとった。
これを０．ＯＩＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５） −０，
００１ＭＩＴ八にとかし、 ＮａＣ１を０．２５Ｍに、
そしてＥＤＴＡを０．０２Ｍになるように加えた。 こ
れに、さらに。
００１ＭＩＴ八にとかし、 ＮａＣ１を０．２５Ｍに、
そしてＥＤＴＡを０．０２Ｍになるように加えた。 こ
れに、さらに。
Ｉ？ＮΔａｓｅＡ （Ｓｉｇｍａ社製 Ｔｙｐｅｎｌ−
Ａ）を１００μｚ７ｍｌｌになるように加え、３７℃で
３０分間保温した。これに等容のクロロホルム−イソア
ミルアルコールを加えて振ったのち、遠心（２，４０Ｏ
ｒｐｍ、 、 １５分、室＃りＬ上層をとり２容のエタ
ノールを加えた。生じた糸状沈澱をガラス棒にまきとっ
た。これを再び０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ１７，５）
−０，００１Ｍ ＥＤＴＡにとかし、 ＮａＣ１を０
．１Ｍに、そしてＵＤＴＡを０．０１Ｍになるように追
加した。そしてα−アミラーゼ（ＷｏｒＬＩ＋１ｎＢＬ
ｏｎ社製）を０．０５ユニット／ｍｌに加え。
Ａ）を１００μｚ７ｍｌｌになるように加え、３７℃で
３０分間保温した。これに等容のクロロホルム−イソア
ミルアルコールを加えて振ったのち、遠心（２，４０Ｏ
ｒｐｍ、 、 １５分、室＃りＬ上層をとり２容のエタ
ノールを加えた。生じた糸状沈澱をガラス棒にまきとっ
た。これを再び０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ１７，５）
−０，００１Ｍ ＥＤＴＡにとかし、 ＮａＣ１を０
．１Ｍに、そしてＵＤＴＡを０．０１Ｍになるように追
加した。そしてα−アミラーゼ（ＷｏｒＬＩ＋１ｎＢＬ
ｏｎ社製）を０．０５ユニット／ｍｌに加え。
３７℃で１時間保温した。これを等容のフェノール（（
］、００５Ｍ＋−リス塩酸（ｐＨ８，０） −０，１Ｍ
ＮａＣ１で平衡化）と振り、遠心（２，４０Ｏｒｐｍ
、、 １０分、室温）し上層をとった。エーテル抽出し
てフェノールを除いたの５２容のエタノールを加えた。
］、００５Ｍ＋−リス塩酸（ｐＨ８，０） −０，１Ｍ
ＮａＣ１で平衡化）と振り、遠心（２，４０Ｏｒｐｍ
、、 １０分、室温）し上層をとった。エーテル抽出し
てフェノールを除いたの５２容のエタノールを加えた。
生じた糸状、沈澱を０．０１Ｍ ） ＩＪ ス塩酸（ｐ
Ｈ７，５） −０，００１Ｍ ＥＤＴＡにとかした（３
９０μＢ／ｌｌｌ１）。
Ｈ７，５） −０，００１Ｍ ＥＤＴＡにとかした（３
９０μＢ／ｌｌｌ１）。
グリシン処理を行った定常状態の培養１０ｍＪにつき約
１■の染色体ＤＮＡ標品を得る。こ′の染色体ＤＮＡは
Ｂａｍ ＨＩやＰｓｔ Ｉによりよく分解されるが、
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ［［およびＸｂａＩではほと
んど分解されない。
１■の染色体ＤＮＡ標品を得る。こ′の染色体ＤＮＡは
Ｂａｍ ＨＩやＰｓｔ Ｉによりよく分解されるが、
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ［［およびＸｂａＩではほと
んど分解されない。
■ 染色体ＤＮＡ断片の調製：上で得た染色体ＤＮＡ
１００．ｃｏｇ ／ｍｌｌを制限酵素Ｒａｍ ）ＩＩ
（３７，５ユニット／ｍｌ、宝酒造９ｍ製）を用い、
Ｂａｎ＋ ＩＩ緩衝液（０，ＯＩＭ ）リス塩酸（ｐ
Ｈ８，０）、 ０．１ＭＮａＣ１゜０．００７ Ｍ
ＭｇＣｈ、および０．００２Ｍ β−メルカプトエタ
ノール）中で３０℃にて１５．３０．４５および６０分
間処理した。各処理物を合わせ、フェノール抽出を行い
２体いで、２容のエタノールで生じる沈澱物をエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。得られた染色体ＤＮＡ断片を
０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）−Ｏ，ＯＯＩＭＥ
ＤＴＡに溶かした（約５５０μｇ／ｍｚ）。
１００．ｃｏｇ ／ｍｌｌを制限酵素Ｒａｍ ）ＩＩ
（３７，５ユニット／ｍｌ、宝酒造９ｍ製）を用い、
Ｂａｎ＋ ＩＩ緩衝液（０，ＯＩＭ ）リス塩酸（ｐ
Ｈ８，０）、 ０．１ＭＮａＣ１゜０．００７ Ｍ
ＭｇＣｈ、および０．００２Ｍ β−メルカプトエタ
ノール）中で３０℃にて１５．３０．４５および６０分
間処理した。各処理物を合わせ、フェノール抽出を行い
２体いで、２容のエタノールで生じる沈澱物をエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。得られた染色体ＤＮＡ断片を
０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）−Ｏ，ＯＯＩＭＥ
ＤＴＡに溶かした（約５５０μｇ／ｍｚ）。
■ ベクタープラスミド二本発明で用いるベクタープラ
スミドはＹＲｐ ７である。 このベクタープラスミド
は、酵母菌のｔｒｐ Ｉ遺伝子を含む断片とｐＨＲ３２
２とを結び合わせたベクターで１分子量が３．８ ＸＩ
Ｏ’°ダルトンである。テトラサイクリンとアンピシリ
ンとトリプトファン（ｔｒｐｌ）の選択マーカーをもつ
。制限酵素Ｂａｍ ＩＩにより１ケ所で切断され、この
切断点に外来ＤＮＡが挿入されるとテトラサイクリン耐
性（Ｔｃ’ ）を失う。 このベクタープラスミドＹＲ
ｐ ７はよく知られ容易に入手しうるが１本実施例では
これを保持するエスチェリチア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ｔｒｐＣ−９８３０（ＹＲｐ
７） （受託番号：微工研菌寄第７７４０号）から取
り出した。 ベクタープラスミドＹＲｐ ７を得るには
、まず、これを保持する上記エスチェリチア・コリーｔ
ｒｐＣ−９８３０（ＹＲｐ ７ ）を１００ｍｊ２のＬ
−ｂｒｏｔｂ （１％Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ−０
，５％Ｄｉｒｃ。
スミドはＹＲｐ ７である。 このベクタープラスミド
は、酵母菌のｔｒｐ Ｉ遺伝子を含む断片とｐＨＲ３２
２とを結び合わせたベクターで１分子量が３．８ ＸＩ
Ｏ’°ダルトンである。テトラサイクリンとアンピシリ
ンとトリプトファン（ｔｒｐｌ）の選択マーカーをもつ
。制限酵素Ｂａｍ ＩＩにより１ケ所で切断され、この
切断点に外来ＤＮＡが挿入されるとテトラサイクリン耐
性（Ｔｃ’ ）を失う。 このベクタープラスミドＹＲ
ｐ ７はよく知られ容易に入手しうるが１本実施例では
これを保持するエスチェリチア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ｔｒｐＣ−９８３０（ＹＲｐ
７） （受託番号：微工研菌寄第７７４０号）から取
り出した。 ベクタープラスミドＹＲｐ ７を得るには
、まず、これを保持する上記エスチェリチア・コリーｔ
ｒｐＣ−９８３０（ＹＲｐ ７ ）を１００ｍｊ２のＬ
−ｂｒｏｔｂ （１％Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ−０
，５％Ｄｉｒｃ。
ＹｅａｓＬｅｘＬｒａｃｔ −０，５％ＮａＣ１）に植
え、３７℃で一夜培養した。この培養液の１０ｎｌを１
２のＬ−ｂｒｏｔｈに加え３７℃で２．５時間培養し、
クロラムフェニコールを１７０Ｍｇ ／ｍβに加え、３
７℃でさらに一夜培養した。遠心して菌体をあつめ、氷
冷した１５ｎｌの０．０５Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ８，０
） −２５％蔗糖にけん濁しリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社
製、 ｇｒａｄｅ Ｉを２０ｍｇ／＋ｊ！になるよう０
．０１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８，０）にとかしたもの）
を３ ｍｌ加えて混ぜ氷上に５分おいた。次 −いで、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）を６ ｍｌ加
えて混ぜ氷上に１０分おき、さらに５ Ｍ ＮａＣ１’
１．５ｍｌを加えて混ぜた後１０％ＳＤＳ３ｍｊ！を加
えて混ぜた。 氷上に一夜放置したのち遠心（２０，０
０Ｏｒｐｍ、、 ４５分。
え、３７℃で一夜培養した。この培養液の１０ｎｌを１
２のＬ−ｂｒｏｔｈに加え３７℃で２．５時間培養し、
クロラムフェニコールを１７０Ｍｇ ／ｍβに加え、３
７℃でさらに一夜培養した。遠心して菌体をあつめ、氷
冷した１５ｎｌの０．０５Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ８，０
） −２５％蔗糖にけん濁しリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社
製、 ｇｒａｄｅ Ｉを２０ｍｇ／＋ｊ！になるよう０
．０１Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８，０）にとかしたもの）
を３ ｍｌ加えて混ぜ氷上に５分おいた。次 −いで、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）を６ ｍｌ加
えて混ぜ氷上に１０分おき、さらに５ Ｍ ＮａＣ１’
１．５ｍｌを加えて混ぜた後１０％ＳＤＳ３ｍｊ！を加
えて混ぜた。 氷上に一夜放置したのち遠心（２０，０
０Ｏｒｐｍ、、 ４５分。
０℃）シ、上澄みをとった。これを６５℃の湯浴に１５
分浸した。生じた沈澱を遠心して除き、上澄み’Ｆｒ：
等容（Ｄ ７ 工／ −）Ｌｉ （０，０５Ｍ ） ’
） ス塩酸（ｐＨ８，０）−Ｏ，ＩＭ ＮａＣ１に対し
平衡化）と振り上層をすて下層をとりこれをエーテル抽
出後２容のエタノールで沈澱させた。沈澱を遠心して集
め、エタノール士洗った後、風乾した。これを０．０１
Ｍ ）リス塩酸（ｐ）１７．５） −０，００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡにとかし、 ＮａＣ１を０．２５Ｍになるように
加えた。 次いで、２容のエタノールで沈澱させ、沈澱
をエタノールで洗った後風乾した。 これを再び０．Ｏ
ＩＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）−ｏ、ｏｏ１ｉ１１！
ＤＴＡに溶かした。 これにＣｓＣ１を重量で４８％に
加えて溶かしエチジウムプロミドを４００μＢ７ｍｌｌ
に加え室温にしばらく置いた。生じた沈澱を遠心（３，
００Ｏｒｐｍ、 、 ２０分）して除き、上澄みを遠心
（４（ＬＯＯＯｒｐｍ、、 ４４時間、１５℃）した。
分浸した。生じた沈澱を遠心して除き、上澄み’Ｆｒ：
等容（Ｄ ７ 工／ −）Ｌｉ （０，０５Ｍ ） ’
） ス塩酸（ｐＨ８，０）−Ｏ，ＩＭ ＮａＣ１に対し
平衡化）と振り上層をすて下層をとりこれをエーテル抽
出後２容のエタノールで沈澱させた。沈澱を遠心して集
め、エタノール士洗った後、風乾した。これを０．０１
Ｍ ）リス塩酸（ｐ）１７．５） −０，００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡにとかし、 ＮａＣ１を０．２５Ｍになるように
加えた。 次いで、２容のエタノールで沈澱させ、沈澱
をエタノールで洗った後風乾した。 これを再び０．Ｏ
ＩＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）−ｏ、ｏｏ１ｉ１１！
ＤＴＡに溶かした。 これにＣｓＣ１を重量で４８％に
加えて溶かしエチジウムプロミドを４００μＢ７ｍｌｌ
に加え室温にしばらく置いた。生じた沈澱を遠心（３，
００Ｏｒｐｍ、 、 ２０分）して除き、上澄みを遠心
（４（ＬＯＯＯｒｐｍ、、 ４４時間、１５℃）した。
遠心管を紫外線下で観察しプラスミドのバンドを注射針
で取り出し、これを等容のｎ−ブタノールで２回抽出し
た。下層を水で５倍にうすめ、２容のエタノールで沈澱
させた。沈澱を遠心して集め、エタノールで洗った後、
風乾した。これを０．０１Ｍ ｌ−リス塩酸（ｐＨ７，
５） −０，００１Ｍ ＥＤＴＡに溶かし、 １ｌａｃ
１を０．２５Ｍになるように加えた。そして２容のエタ
ノールで再び沈澱させ、沈澱を遠心して集め、エタノー
ルで洗った後、風乾した。これを最後に０．０１Ｍ ｌ
−リス塩酸（ｐｌ＋７．５） −０，００１Ｍ ＥＤＴ
Ａに溶かし。
で取り出し、これを等容のｎ−ブタノールで２回抽出し
た。下層を水で５倍にうすめ、２容のエタノールで沈澱
させた。沈澱を遠心して集め、エタノールで洗った後、
風乾した。これを０．０１Ｍ ｌ−リス塩酸（ｐＨ７，
５） −０，００１Ｍ ＥＤＴＡに溶かし、 １ｌａｃ
１を０．２５Ｍになるように加えた。そして２容のエタ
ノールで再び沈澱させ、沈澱を遠心して集め、エタノー
ルで洗った後、風乾した。これを最後に０．０１Ｍ ｌ
−リス塩酸（ｐｌ＋７．５） −０，００１Ｍ ＥＤＴ
Ａに溶かし。
４℃に保存した。このようにして精製プラスミドＤＮＡ
ＹＲｐ７を得た。
ＹＲｐ７を得た。
■ ベクタープラスミドｙＲｐ ７の切断二上記精製ベ
クタープラスミドＤＮＡ ＹＲｐ７ ５０＃ ｇ／ｍｌ
を、制限酵素Ｂａｍ ＩＩＩ （宝酒蔵社製）６０ユニ
ット／ｍβを用い、 Ｂａｍ ＨＩＮＤ街液中で３０℃
で６５分間処理した。６５℃で１５分間加熱し、 ＥＤ
ＴＡを０．０２５ＭにそしてＮａＣ１を０．２５Ｍにな
るように加え、２容のエタノールで沈澱させた。沈澱を
遠心して集め、エタノールで洗った後、 ０．０５Ｍ
）リス塩酸（ｐＨ８，０）に溶かした（ ＹＲｐ７につ
き１００μｇ ／ｍｌ＞ 、次いで。
クタープラスミドＤＮＡ ＹＲｐ７ ５０＃ ｇ／ｍｌ
を、制限酵素Ｂａｍ ＩＩＩ （宝酒蔵社製）６０ユニ
ット／ｍβを用い、 Ｂａｍ ＨＩＮＤ街液中で３０℃
で６５分間処理した。６５℃で１５分間加熱し、 ＥＤ
ＴＡを０．０２５ＭにそしてＮａＣ１を０．２５Ｍにな
るように加え、２容のエタノールで沈澱させた。沈澱を
遠心して集め、エタノールで洗った後、 ０．０５Ｍ
）リス塩酸（ｐＨ８，０）に溶かした（ ＹＲｐ７につ
き１００μｇ ／ｍｌ＞ 、次いで。
Ｘ子牛小腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ社製、 Ｇｒａｄｅ （１）を０．１Ｍ１−リス
塩酸（ｐＨ８，５） −０，００１Ｍ ＭｇＣ１ｚ
Ｏ，０００１Ｍ Ｚｎ（ＯＡｃ）ｚに対して透析した後
１等容のグリセリンを加えたちの；３．３ユニツト／μ
ｌ）を８０ユニット／ｍｌに加え、３７℃に３０分間保
温後６８℃で１５分間加熱した。ＥＤＴＡを０．０２Ｍ
になるように加えてから等容のフェノール（０，０５Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ８，０）−０，１Ｍ ＮａＣＬに対し
て平衡化）で抽出し水層にＮａＣ１を０．２５Ｍになる
ように加えた後、２容のエタノールで沈澱させた。沈澱
を遠心して集め、エタノールで洗った後風乾した。
ｅｒ社製、 Ｇｒａｄｅ （１）を０．１Ｍ１−リス
塩酸（ｐＨ８，５） −０，００１Ｍ ＭｇＣ１ｚ
Ｏ，０００１Ｍ Ｚｎ（ＯＡｃ）ｚに対して透析した後
１等容のグリセリンを加えたちの；３．３ユニツト／μ
ｌ）を８０ユニット／ｍｌに加え、３７℃に３０分間保
温後６８℃で１５分間加熱した。ＥＤＴＡを０．０２Ｍ
になるように加えてから等容のフェノール（０，０５Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ８，０）−０，１Ｍ ＮａＣＬに対し
て平衡化）で抽出し水層にＮａＣ１を０．２５Ｍになる
ように加えた後、２容のエタノールで沈澱させた。沈澱
を遠心して集め、エタノールで洗った後風乾した。
これを０．ＯＩＭ トリス塩酸（ｐＨ７，５） −〇、
００１１１ ［ＥＤＴＡに溶かした。こうして、アルカ
リフォスファターゼ処理Ｙｌ１９７を得た。
００１１１ ［ＥＤＴＡに溶かした。こうして、アルカ
リフォスファターゼ処理Ｙｌ１９７を得た。
■ 組み換え体プラスミドｐｘ２ｏを含む種々のプラス
ミドの混合物の調製：上記■で得た親株の染色体ＤＮＡ
断片１００１１ｇ ／ｍｌｌと上記Ｂａｍ Ｈ１切断さ
れかつアルカリフォスファターゼ処理されたＹＲｐ７
２０＃Ｃ／ｍｌとを、ＴａＤＮＡリガーゼ緩衝液（０，
０１Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、 ０．０５Ｍ Ｎ
ａＣ１゜０．０１Ｍ ＭＰ、Ｃ１，、および０．０１Ｍ
ジチオスレイトール）中で１ｍＭのＡＴＰとＴａ ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造１１製）４０ユニット／ｍｌと共に
４℃にて２４時間反応させ組み換え体プラスミドｐＸ２
０を含む種々のプラスミドの混合物を得た。 これに０
．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ１８，０）を１／２５容加えた
後、６５℃にて１５分間加熱し、水冷後４℃に保存した
。
ミドの混合物の調製：上記■で得た親株の染色体ＤＮＡ
断片１００１１ｇ ／ｍｌｌと上記Ｂａｍ Ｈ１切断さ
れかつアルカリフォスファターゼ処理されたＹＲｐ７
２０＃Ｃ／ｍｌとを、ＴａＤＮＡリガーゼ緩衝液（０，
０１Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、 ０．０５Ｍ Ｎ
ａＣ１゜０．０１Ｍ ＭＰ、Ｃ１，、および０．０１Ｍ
ジチオスレイトール）中で１ｍＭのＡＴＰとＴａ ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造１１製）４０ユニット／ｍｌと共に
４℃にて２４時間反応させ組み換え体プラスミドｐＸ２
０を含む種々のプラスミドの混合物を得た。 これに０
．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ１８，０）を１／２５容加えた
後、６５℃にて１５分間加熱し、水冷後４℃に保存した
。
太施炎ｌｃ組み換え体プラスミドｐＸ２０の宿主微生物
への導入） ■ 宿主微生物−宿主微生物としてエスチェリチア・コ
リー（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （受託番号：
微工研菌寄第７７４１号）およびＪＡ２２１（受託番号
：徽工研菌寄第７７４３号）を用いた。その遺伝子型は
。
への導入） ■ 宿主微生物−宿主微生物としてエスチェリチア・コ
リー（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （受託番号：
微工研菌寄第７７４１号）およびＪＡ２２１（受託番号
：徽工研菌寄第７７４３号）を用いた。その遺伝子型は
。
それぞれ、 Ｆ−ｒｋ−ｍｋ−ｒｅｃＡ−ｐｒｏ ｌ
ｅｕ ｔｈｉ １ａｃＹＳｔｒ’ ｅｎｄｏｌ−およ
び ｒｅｃＡ−１ｅｕＢ６ ｔｒｐΔ［５ｈｓｄＲ−Ｍ
” ＩａｃＹ ｔｈｒ ｔｈｉである。
ｅｕ ｔｈｉ １ａｃＹＳｔｒ’ ｅｎｄｏｌ−およ
び ｒｅｃＡ−１ｅｕＢ６ ｔｒｐΔ［５ｈｓｄＲ−Ｍ
” ＩａｃＹ ｔｈｒ ｔｈｉである。
■ 宿主菌株の前処理： Ｌ−ｂｒｏｔｈで一晩培養し
たエスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩの培養液を同培地
に１％植菌し、２．５時間培養する。 細胞を遠心分離
で集め、 ｌｏｏｍＭのＭｇＣｌ□で遠心洗浄し。
たエスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩの培養液を同培地
に１％植菌し、２．５時間培養する。 細胞を遠心分離
で集め、 ｌｏｏｍＭのＭｇＣｌ□で遠心洗浄し。
１００ｍＭのＣａＣ１ｇに懸濁する。次いで、０°Ｃで
２０分間保つ。 そして、遠心で菌体を集め、 １００
ｎ＋ＭのＣａＣ１ｇに約２００ Ｘ １０’セル／ｖａ
ｌｌに再懸濁する。
２０分間保つ。 そして、遠心で菌体を集め、 １００
ｎ＋ＭのＣａＣ１ｇに約２００ Ｘ １０’セル／ｖａ
ｌｌに再懸濁する。
■ 宿主菌株への組み換え体プラスミドの導入：前記組
み換え体プラスミドｐＸ２０を含む種々のプラスミドの
混合物０．０５ ｍｌ （アルスロバクタ−ＤＮＡ断片
を５μｇ含有）を０．０２Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ１８，
０） −０，ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ −０，０２Ｍ Ｎａ
Ｃ１でうすめて０．２ｍ ｊ！にし、これをＣａＣ１，
処理された上記エスチェリチア・コリーＨＢ １０１の
けん濁液０．４ｍｌと混ぜＱ ’Ｃにて３０分間保持す
る。次いで、４２℃に２分間置いた後Ｌ−ｂｒｏｔｈ
６ ｍ ｌ加え、３７℃で１．５時間培養した。
み換え体プラスミドｐＸ２０を含む種々のプラスミドの
混合物０．０５ ｍｌ （アルスロバクタ−ＤＮＡ断片
を５μｇ含有）を０．０２Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ１８，
０） −０，ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ −０，０２Ｍ Ｎａ
Ｃ１でうすめて０．２ｍ ｊ！にし、これをＣａＣ１，
処理された上記エスチェリチア・コリーＨＢ １０１の
けん濁液０．４ｍｌと混ぜＱ ’Ｃにて３０分間保持す
る。次いで、４２℃に２分間置いた後Ｌ−ｂｒｏｔｈ
６ ｍ ｌ加え、３７℃で１．５時間培養した。
■ 組み換え体ＤＮＡプラスミドｐＸ２０を有するエス
チェリチア・コリー形質転換株の検索二上記■にて組み
換え体プラスミドの混合物を導入され形質転換したエス
チェリチア・コリーＨＢ １０１株のすべての細胞を、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％のパン酵母
細胞壁（Ｈ，Ｔａｎａｋａ ＆ Ｈ，Ｊ。
チェリチア・コリー形質転換株の検索二上記■にて組み
換え体プラスミドの混合物を導入され形質転換したエス
チェリチア・コリーＨＢ １０１株のすべての細胞を、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％のパン酵母
細胞壁（Ｈ，Ｔａｎａｋａ ＆ Ｈ，Ｊ。
円１ａｒｆ、 Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、 ８９．１５
７０（１９６５）に従って調製したもの）を含むＬ−ｂ
ｒｏｔｈ寒天平板に・播き３７℃で保温した。生育した
約３．５００個のコロニーのうらの１つが細胞壁溶解環
を示した。この形質転換株を同じ寒天培地に塗布して生
じるコロニーはすべて細胞壁溶解環を示した。宿主菌株
エスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩはこのような細胞壁
溶解環を示さなかった。
７０（１９６５）に従って調製したもの）を含むＬ−ｂ
ｒｏｔｈ寒天平板に・播き３７℃で保温した。生育した
約３．５００個のコロニーのうらの１つが細胞壁溶解環
を示した。この形質転換株を同じ寒天培地に塗布して生
じるコロニーはすべて細胞壁溶解環を示した。宿主菌株
エスチェリチア・コリーＨＢＩＯＩはこのような細胞壁
溶解環を示さなかった。
■ 細胞壁溶解酵素系遺伝子を含む組み換え体プラスミ
ドｐｘ２ｏの同定二上記形質転換株をアンピシリンを含
むＬ−ｂｒｏｔｈで液体培養し、その細胞から前記ベク
タープラスミドＹＲｐ ７と同じ手法でプラスミドを調
製した。この組み換え体プラスミドは既述のようにｐＸ
２０と命名された。この組み換え体ブラースミドｐＸ２
０は約１４．５Ｋｂ （キロベースペヲーズ）の大きさ
で、制限酵素Ｒａｍ旧により。
ドｐｘ２ｏの同定二上記形質転換株をアンピシリンを含
むＬ−ｂｒｏｔｈで液体培養し、その細胞から前記ベク
タープラスミドＹＲｐ ７と同じ手法でプラスミドを調
製した。この組み換え体プラスミドは既述のようにｐＸ
２０と命名された。この組み換え体ブラースミドｐＸ２
０は約１４．５Ｋｂ （キロベースペヲーズ）の大きさ
で、制限酵素Ｒａｍ旧により。
５．８ ＫｂのｙＲｐ ７部分と約８．５Ｋｂの外来Ｄ
ＮＡ部分とに分かれた。 この外来ＤＮＡ部分はＩＥｃ
ｏＲＩ 。
ＮＡ部分とに分かれた。 この外来ＤＮＡ部分はＩＥｃ
ｏＲＩ 。
Ｈｉｎｄｎ［およびＸｂａｌでは切断されないアルスロ
バクタ−ＹＣＷＤ３の染色体ＤＮＡの特徴をもっていた
。この組み換え体プラスミドｐＸ２０は約３×１０’コ
ロニー／μｇの程度で宿主菌株エスチェリチア・コリー
ＨＢＩＯＩまたはＪＡ２２１にアンピシリン耐性形質転
換株を生せしめる。そして、これらすべての形質転換株
がパン酵母細胞壁を含むＬ−ｂｒｏ ｔｈ寒天平板上で
細胞壁溶解環を示した。ちなみに、 ＹＲｐ７を導入
されたエスチェリチア・コリー ＨＢ １０１株および
ｐ１３Ｒ３２２を導入されたエスチェリチア・コリーＪ
Ａ２２１株は、いづれも、同寒天平板上で柳胞壁溶解斑
を示さない。
バクタ−ＹＣＷＤ３の染色体ＤＮＡの特徴をもっていた
。この組み換え体プラスミドｐＸ２０は約３×１０’コ
ロニー／μｇの程度で宿主菌株エスチェリチア・コリー
ＨＢＩＯＩまたはＪＡ２２１にアンピシリン耐性形質転
換株を生せしめる。そして、これらすべての形質転換株
がパン酵母細胞壁を含むＬ−ｂｒｏ ｔｈ寒天平板上で
細胞壁溶解環を示した。ちなみに、 ＹＲｐ７を導入
されたエスチェリチア・コリー ＨＢ １０１株および
ｐ１３Ｒ３２２を導入されたエスチェリチア・コリーＪ
Ａ２２１株は、いづれも、同寒天平板上で柳胞壁溶解斑
を示さない。
（以下余白）
去貨炭ユ（形質転換株による細胞壁溶解酵素の生産）
■ エスチェリチア・コリー形質転換株の培養条件：形
質転換株をアンピシリン１００μｇ／ｌｌ、Ｉ！、を含
むＬ−ｂｒｏＬｌｉ″Ｘ天平板上で３７℃にて一夜培養
し。
質転換株をアンピシリン１００μｇ／ｌｌ、Ｉ！、を含
むＬ−ｂｒｏＬｌｉ″Ｘ天平板上で３７℃にて一夜培養
し。
生育したコロニーの一部を１００＋＋ｌｌのＬ−ｂｒｏ
ｔｈに接種し３７℃で２４時間振盪培養した。
ｔｈに接種し３７℃で２４時間振盪培養した。
■ 細胞壁溶解活性活性二〇℃にて遠心分離して得た菌
体を以下の二つの方法のいづれかにより処理し、 １１
胞壁溶解活性を調べた。
体を以下の二つの方法のいづれかにより処理し、 １１
胞壁溶解活性を調べた。
（ｉ）菌体を冷ＰＢＳ緩衝液（０，１３７Ｍ ＮａＣ１
−０，０１Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，２）で洗浄
し、これを５−ｌの同緩衝液に懸濁し超音波処理を施し
た。これを０℃のもとで１ｌ１０００ｒｐで２０分間遠
心しその上澄を回収した。
−０，０１Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，２）で洗浄
し、これを５−ｌの同緩衝液に懸濁し超音波処理を施し
た。これを０℃のもとで１ｌ１０００ｒｐで２０分間遠
心しその上澄を回収した。
（ｉｉ）菌体を冷０．ＯＩＭ トリス塩酸（ｐＨ７，３
） −０，０３Ｍ ＮａＣ１で洗浄し、これを４Ｏｍｌ
の０．０３３Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，３）に懸濁した
。 これを４Ｏｎ＋βの０．０３３ Ｍ Ｉ−リス塩酸
（ｐＨ７，３）−４０％蔗糖と混ぜ。
） −０，０３Ｍ ＮａＣ１で洗浄し、これを４Ｏｍｌ
の０．０３３Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，３）に懸濁した
。 これを４Ｏｎ＋βの０．０３３ Ｍ Ｉ−リス塩酸
（ｐＨ７，３）−４０％蔗糖と混ぜ。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ１７，５）０．１６ ｉ
ｎを追加した。これを２０〜２４℃で１５分間ゆるやか
にかき混ぜた。 遠心（１１，００Ｏｒｐｍ、、 １５
分、０℃）して上澄みをすて菌体を氷水８０＋ｍｆと混
ぜ、０℃で１５分間ゆるやかにかきまぜたのち遠心（１
１，０ＯＯｒｐｏ＋、、 １５分、０℃）して上澄みを
取ることによりステージＨ画分を調製した（ Ｎ、Ｇ、
Ｎｏ５ｓａｌ ＆ Ｌ、Ａ、ＩＩｅｐｐｅｌ ； Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
ｎを追加した。これを２０〜２４℃で１５分間ゆるやか
にかき混ぜた。 遠心（１１，００Ｏｒｐｍ、、 １５
分、０℃）して上澄みをすて菌体を氷水８０＋ｍｆと混
ぜ、０℃で１５分間ゆるやかにかきまぜたのち遠心（１
１，０ＯＯｒｐｏ＋、、 １５分、０℃）して上澄みを
取ることによりステージＨ画分を調製した（ Ｎ、Ｇ、
Ｎｏ５ｓａｌ ＆ Ｌ、Ａ、ＩＩｅｐｐｅｌ ； Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
ＣｈｅＩＩｌ、 Ｖｏ１２４１．Ｐ、３０５５（１９６
６）） 、上記（１）により調製された抽出液から得た
細胞壁溶解活性を第２表に示す。活性測定は０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，２５）−０，１％パン酵母細胞
壁の組成を有する反応液２．５＋ＩＩＡを３７℃に保温
し１反応混合液の濁度の低下をＫｌｅｔｔ−５ｕｍｍｅ
ｒｓｏｎ光度計（フィルター阻６６使用；Ｋｌｅｔｔ
ＭＦＧ、ＧＯ，、Ｉｎｃ、 Ｎ、Ｙ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）
にて測定した。活性は酵素を加えないままの対照の値と
の差（ΔＫｌｅｔｔ値）として表示される。
６）） 、上記（１）により調製された抽出液から得た
細胞壁溶解活性を第２表に示す。活性測定は０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，２５）−０，１％パン酵母細胞
壁の組成を有する反応液２．５＋ＩＩＡを３７℃に保温
し１反応混合液の濁度の低下をＫｌｅｔｔ−５ｕｍｍｅ
ｒｓｏｎ光度計（フィルター阻６６使用；Ｋｌｅｔｔ
ＭＦＧ、ＧＯ，、Ｉｎｃ、 Ｎ、Ｙ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）
にて測定した。活性は酵素を加えないままの対照の値と
の差（ΔＫｌｅｔｔ値）として表示される。
比較のために示した親株のアルスロバクタ−ＹＣＷＤ３
については、この親株を１％Ｄｉｒｃｏ トリプトン
−０，１％Ｄｆｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ中
で３５℃で２〜３日前培養したものの１７２０容を１容
（６００＋＋＋ ｊ！ ）の８％パン酵母（オリエンタ
ル酵母社製）−１％ＫｄｌＰＯ４−０，０１％Ｍｇ５Ｏ
＊４ＨｚＯに加え、３５℃にて４８時間培養して得た培
養液（Ｋ、Ｄｏｉ、 Ａ、Ｄｏｉ ＆Ｔ、Ｆｕｋｕｉ
；＾ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｎ＋、 Ｖｏｌ ３２
． Ｐ、１２６１（１９［ｉ３） ）の上澄の細胞壁溶
解活性をみたものである。
については、この親株を１％Ｄｉｒｃｏ トリプトン
−０，１％Ｄｆｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ中
で３５℃で２〜３日前培養したものの１７２０容を１容
（６００＋＋＋ ｊ！ ）の８％パン酵母（オリエンタ
ル酵母社製）−１％ＫｄｌＰＯ４−０，０１％Ｍｇ５Ｏ
＊４ＨｚＯに加え、３５℃にて４８時間培養して得た培
養液（Ｋ、Ｄｏｉ、 Ａ、Ｄｏｉ ＆Ｔ、Ｆｕｋｕｉ
；＾ｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｎ＋、 Ｖｏｌ ３２
． Ｐ、１２６１（１９［ｉ３） ）の上澄の細胞壁溶
解活性をみたものである。
（以下余白）
また、形質転換株エスチェリチア・コリーＨＢ１０１（
ｐ ’Ｘ ２０）の培養菌体を上記（ｉｉ）の方法に従
って処理したとき、０℃にて集めた培養液−上澄および
菌体洗浄液にはパン酵母細胞壁溶解活性はほとんど検出
されず、ステージ■液（いわゆるペリプラズム区分）に
全活性の約７０％が検出された。
ｐ ’Ｘ ２０）の培養菌体を上記（ｉｉ）の方法に従
って処理したとき、０℃にて集めた培養液−上澄および
菌体洗浄液にはパン酵母細胞壁溶解活性はほとんど検出
されず、ステージ■液（いわゆるペリプラズム区分）に
全活性の約７０％が検出された。
■ 細胞壁溶解酵素の生産形態：形質転換株エスチェリ
チア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０）をＬ−ｂｒｏｔ
ｈまたはＴ−ｂｒｏＬｈ （Ｄｉｆｃｏ）リプトン１
％、グルコース０．１％、 ＮａＣｌ Ｑ、３％、 Ｃ
ａＣ１ｚ ０．１ｍＭ、 ＭｇＣｌｚｌｍＭ、に１１２
１１０４０．３２ｍＭ）の寒天平板上に３７℃で一夜生
育させ、得られた菌体をクロロフォルムの蒸気で殺す。
チア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０）をＬ−ｂｒｏｔ
ｈまたはＴ−ｂｒｏＬｈ （Ｄｉｆｃｏ）リプトン１
％、グルコース０．１％、 ＮａＣｌ Ｑ、３％、 Ｃ
ａＣ１ｚ ０．１ｍＭ、 ＭｇＣｌｚｌｍＭ、に１１２
１１０４０．３２ｍＭ）の寒天平板上に３７℃で一夜生
育させ、得られた菌体をクロロフォルムの蒸気で殺す。
これにパン酵母細胞壁を含む寒天を重層し、３７℃に保
温する。すると、いづれの培地で生育したコロニーにも
その周辺に明瞭な細胞壁溶解窯が認められた。他方、親
株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３をＬ−ｂｒｏｔｈまたは
Ｔ−ｂｒｏｔｈの寒天平板上で生育させ、これを形質転
換株と同じ処理に供した。 Ｌ−ｂｒｏｔｈ寒天平板上
で生育したコロニーにはごくわずかな細胞壁溶解窯が認
められたが、 Ｔ−ｂｒｏｔｈ寒天平板上で生育したコ
ロニーは細胞壁溶解窯を生じなかった。
温する。すると、いづれの培地で生育したコロニーにも
その周辺に明瞭な細胞壁溶解窯が認められた。他方、親
株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３をＬ−ｂｒｏｔｈまたは
Ｔ−ｂｒｏｔｈの寒天平板上で生育させ、これを形質転
換株と同じ処理に供した。 Ｌ−ｂｒｏｔｈ寒天平板上
で生育したコロニーにはごくわずかな細胞壁溶解窯が認
められたが、 Ｔ−ｂｒｏｔｈ寒天平板上で生育したコ
ロニーは細胞壁溶解窯を生じなかった。
以上の事実から、親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３は細
胞壁溶解酵素を誘導的に生産するのに対し、形質転換株
エスチェリチア・コリーＨＢ １０１（ｐＸ２０）は該
酵素を構成的に生産することがわかる。 形質転換株エ
スチェリチア・コリーＪＡ２２Ｈｐ Ｘ２０）について
も、同様に、該酵素を構成的に生産することが確認され
た。それゆえ１本発明はより得られる形質転換株は、培
養に際しインデューサーを必要としない。
胞壁溶解酵素を誘導的に生産するのに対し、形質転換株
エスチェリチア・コリーＨＢ １０１（ｐＸ２０）は該
酵素を構成的に生産することがわかる。 形質転換株エ
スチェリチア・コリーＪＡ２２Ｈｐ Ｘ２０）について
も、同様に、該酵素を構成的に生産することが確認され
た。それゆえ１本発明はより得られる形質転換株は、培
養に際しインデューサーを必要としない。
■ 細胞壁溶解酵素の精製：前項■の（ｉ）の方法によ
り調製された形質転換株エスチェリチア・コリーＨＢ
１０１（ｐ Ｘ２０）およびＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０
）の菌体抽出液をそれぞれプロタミン硫酸処理し。
り調製された形質転換株エスチェリチア・コリーＨＢ
１０１（ｐ Ｘ２０）およびＪ Ａ２２１（ｐ Ｘ２０
）の菌体抽出液をそれぞれプロタミン硫酸処理し。
次いで、硫酸アンモニウムで沈澱させる。あるいは（ｉ
ｉ）の方法により得た菌体抽出液をロータリーエバポレ
ーターなどで濃縮した。
ｉ）の方法により得た菌体抽出液をロータリーエバポレ
ーターなどで濃縮した。
得られた硫安沈澱物もしくは濃縮物を０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，２５） （０，０℃Ｍ ＥＤＴ八を
含むこともある）に透析したう同じ緩衝液に対して平衡
化した八ｖｉｃｅｌ ＴＧＩＯＩ（旭化成＠３ ｌ！ｌ
）を透析内液の１０倍容のカラムに充填し室温にてクロ
マトグラフィーを行った（に、Ｄｏｉ＋＾、Ｄｏｉ ＆
Ｓ、Ｎａｋａｍｕｒａ ； Ａｇｒ。
緩衝液（ｐＨ６，２５） （０，０℃Ｍ ＥＤＴ八を
含むこともある）に透析したう同じ緩衝液に対して平衡
化した八ｖｉｃｅｌ ＴＧＩＯＩ（旭化成＠３ ｌ！ｌ
）を透析内液の１０倍容のカラムに充填し室温にてクロ
マトグラフィーを行った（に、Ｄｏｉ＋＾、Ｄｏｉ ＆
Ｓ、Ｎａｋａｍｕｒａ ； Ａｇｒ。
Ｂｉｏｌ、 ＣＩ＋ｅｍ、 Ｖｏｌ ４０． Ｐ、１６
６９（１９７６）） 、細胞壁溶解活性をもつ画分を合
わせ、これをロータリーエバポレーターで濃縮し、水に
対して４℃にて一夜透析した。得られた酵素は単一蛋白
に精製されていた。
６９（１９７６）） 、細胞壁溶解活性をもつ画分を合
わせ、これをロータリーエバポレーターで濃縮し、水に
対して４℃にて一夜透析した。得られた酵素は単一蛋白
に精製されていた。
上記精製酵素の電気泳動（ポリアクリルアミドゲルおよ
び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）において観察され
るグルカナーゼ蛋白のバンドの染色度から、１００ｍＪ
のＬ−ｂｒｏＬｈ中で３７℃にて２４時間培養した定常
期に達した菌体から約５０μｇのグルカナーゼ蛋白（後
述の親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３のグルカナーゼＩ
−３およびＩ−４にそれぞれ相当する二つのバンドの和
）が得られる。
び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）において観察され
るグルカナーゼ蛋白のバンドの染色度から、１００ｍＪ
のＬ−ｂｒｏＬｈ中で３７℃にて２４時間培養した定常
期に達した菌体から約５０μｇのグルカナーゼ蛋白（後
述の親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３のグルカナーゼＩ
−３およびＩ−４にそれぞれ相当する二つのバンドの和
）が得られる。
なお、親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３についての３５
°Ｃで約４８時間培養して得られる培養上澄１００ｍＡ
からは、 Ａｖｉｃｅｌ ＴＧＩＯＩのカラムクロマト
グラフィーによりグルカナーゼ■とグルカナーゼ■との
混合物が得られ、このうちグルカナーゼＩにつし−ては
上記の方法により約５００μｇであることがわかった。
°Ｃで約４８時間培養して得られる培養上澄１００ｍＡ
からは、 Ａｖｉｃｅｌ ＴＧＩＯＩのカラムクロマト
グラフィーによりグルカナーゼ■とグルカナーゼ■との
混合物が得られ、このうちグルカナーゼＩにつし−ては
上記の方法により約５００μｇであることがわかった。
■ 形質転換株の生産する細胞壁溶解酵素と親株の細胞
壁溶解酵素との同一性：前記■の（ｉ）の方法で得た菌
体抽出液をプロタミン硫酸処理後。
壁溶解酵素との同一性：前記■の（ｉ）の方法で得た菌
体抽出液をプロタミン硫酸処理後。
硫酸アンモニウム沈澱で濃縮し、 ０．ＯＩＭ リン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に透析した。得た溶液０．２麟β
を酵母グルカン（Ｄ、Ｊ、Ｂｅ１ｌ ＆ Ｄ、１１．Ｎ
ｏｒｔｈｃｏＬｅ、 Ｊ。
緩衝液（ｐＨ７，０）に透析した。得た溶液０．２麟β
を酵母グルカン（Ｄ、Ｊ、Ｂｅ１ｌ ＆ Ｄ、１１．Ｎ
ｏｒｔｈｃｏＬｅ、 Ｊ。
Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、１９５０１９４４に従って調製し
たもの）またはＰａｃｈｙｍａｎ （Ｈ，５ａｉｔｏ、
Ａ、Ｍｉｓａｋｉ ＆ Ｔ、１Ｉａｒａｄａ。
たもの）またはＰａｃｈｙｍａｎ （Ｈ，５ａｉｔｏ、
Ａ、Ｍｉｓａｋｉ ＆ Ｔ、１Ｉａｒａｄａ。
Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ３２ １２６Ｈ１９
６８）に従って調製したもの。）の０．５％懸濁液に混
ぜ全量を１ ｍｌとした。これを３７℃にて３時間保温
した。反応液の濁度は著しく低下した。これを１００℃
で１０分間加熱して反応を止め、遠心分離した。得た上
澄に含まれる糖をペーパークロマトグラフィーにかけた
ところ、そのクロマトグラムは、親株アルスロバクタ−
ＹＣＷＤ３のグルカナーゼＩによる酵母グルカンまたは
Ｐａｃｈｙｍａｎの分解物が示すクロマトグラム（Ｋ、
Ｄｏｉ、 Ａ、Ｄｏｉ＋ ＆ Ｔ、Ｆｕｋｕｉ ；＾
ｇｒ、 Ｂｉｏｌ。
６８）に従って調製したもの。）の０．５％懸濁液に混
ぜ全量を１ ｍｌとした。これを３７℃にて３時間保温
した。反応液の濁度は著しく低下した。これを１００℃
で１０分間加熱して反応を止め、遠心分離した。得た上
澄に含まれる糖をペーパークロマトグラフィーにかけた
ところ、そのクロマトグラムは、親株アルスロバクタ−
ＹＣＷＤ３のグルカナーゼＩによる酵母グルカンまたは
Ｐａｃｈｙｍａｎの分解物が示すクロマトグラム（Ｋ、
Ｄｏｉ、 Ａ、Ｄｏｉ＋ ＆ Ｔ、Ｆｕｋｕｉ ；＾
ｇｒ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ ３７．１６１９ （１９７３））と
本質的に一致した。
本質的に一致した。
１１１１記■のＡｖｉｃｅｌ吸着クロマトグラフィーに
よる精製標品を、同様に、酵母グルカンまたはＰａｃｌ
＋ｙｍａｎに作用させたとき生ずるオリゴ糖のペーパー
クロマトグラムは、親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３の
グルカナーゼＩによって得られるものと本質的に一致し
た。
よる精製標品を、同様に、酵母グルカンまたはＰａｃｌ
＋ｙｍａｎに作用させたとき生ずるオリゴ糖のペーパー
クロマトグラムは、親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ３の
グルカナーゼＩによって得られるものと本質的に一致し
た。
また、上記精製標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけアミドブラックで蛋白質の染色を行った。その結
果８例えば、エスチェリチア・コリーＨｌ３１０１（ｐ
Ｘ２０）についていえば２図に示すように、２本のバ
ンドがみとめられ、これらは標品により量比が異なるも
のの親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ、３の既知のグルカ
ナーゼ分子種（グルカナーゼ１−ａ、 Ｉ−１，１−
２，１−３および■−４）のうちのグルカナーゼＩ−３
およびグルカナーゼＩ−４のそれぞれに一致した。図中
矢印は蛋白の泳動方向を示す。また同一条件下で泳動し
た２本のゲルのうちの１つを用いて酵母グルカンおよび
パン酵母細胞壁に対するザイモグラムをつくり、他の１
本については上記蛋白染色を行ってこれらを比較したと
ころ、いづれのバンドもそれぞれ酵母グルカン分解活性
およびパン酵母細胞壁分解活性を持つことが認められた
。さらに、上 −配積製標品を５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、クーマシーブルーＲ−２５０
で蛋白染色を行ったところ、どの標品にも一本のバンド
が認められ、その移動度は親株アルスロバクタ−ＹＣＷ
Ｄ３のグルカナーゼｌ−４（分子量５５０００）の移動
度と一致した。エスチェリチア・コリーＪＡ２２Ｈｐ
Ｘ２０）についても同様な結果が得られた。
にかけアミドブラックで蛋白質の染色を行った。その結
果８例えば、エスチェリチア・コリーＨｌ３１０１（ｐ
Ｘ２０）についていえば２図に示すように、２本のバ
ンドがみとめられ、これらは標品により量比が異なるも
のの親株アルスロバクタ−ＹＣＷＤ、３の既知のグルカ
ナーゼ分子種（グルカナーゼ１−ａ、 Ｉ−１，１−
２，１−３および■−４）のうちのグルカナーゼＩ−３
およびグルカナーゼＩ−４のそれぞれに一致した。図中
矢印は蛋白の泳動方向を示す。また同一条件下で泳動し
た２本のゲルのうちの１つを用いて酵母グルカンおよび
パン酵母細胞壁に対するザイモグラムをつくり、他の１
本については上記蛋白染色を行ってこれらを比較したと
ころ、いづれのバンドもそれぞれ酵母グルカン分解活性
およびパン酵母細胞壁分解活性を持つことが認められた
。さらに、上 −配積製標品を５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、クーマシーブルーＲ−２５０
で蛋白染色を行ったところ、どの標品にも一本のバンド
が認められ、その移動度は親株アルスロバクタ−ＹＣＷ
Ｄ３のグルカナーゼｌ−４（分子量５５０００）の移動
度と一致した。エスチェリチア・コリーＪＡ２２Ｈｐ
Ｘ２０）についても同様な結果が得られた。
（発明の効果）
本発明により得られる組み換え体プラスミドｐＸ２０お
よびこれにより形質転換されたエスチェリチア・コリー
ＨＢｌｏｔ（ｐ Ｘ２０）およびエスチェリチア・コリ
ーＪ Ａ２２Ｈｐ Ｘ２０）は、菌体細胞壁溶解活性を
有するβ−１・３グルカナーゼ遺伝子を含有する。形質
転換株はβ−１・３グルカナーゼを構成的に生産するた
め、培養が容易かつ安価に行われうる。
よびこれにより形質転換されたエスチェリチア・コリー
ＨＢｌｏｔ（ｐ Ｘ２０）およびエスチェリチア・コリ
ーＪ Ａ２２Ｈｐ Ｘ２０）は、菌体細胞壁溶解活性を
有するβ−１・３グルカナーゼ遺伝子を含有する。形質
転換株はβ−１・３グルカナーゼを構成的に生産するた
め、培養が容易かつ安価に行われうる。
第１図＋ａ）および（ｂ）は、それぞれ、親株アルスロ
バクタ−ＹＣＷＤ３および本発明の形質転換株エスチェ
リチア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０）の生産する細
胞壁溶解酵素のポリアクリルアミド電気泳動による蛋白
バンドを示す。 Ｉ−ａ、 Ｉ−ｂ、 Ｉ−１，Ｉ−２，１−−３お
よびＩ−４・・・親株のグルカナーゼ分子種。 以上
バクタ−ＹＣＷＤ３および本発明の形質転換株エスチェ
リチア・コリーＨＢＩＯＩ（ｐ Ｘ２０）の生産する細
胞壁溶解酵素のポリアクリルアミド電気泳動による蛋白
バンドを示す。 Ｉ−ａ、 Ｉ−ｂ、 Ｉ−１，Ｉ−２，１−−３お
よびＩ−４・・・親株のグルカナーゼ分子種。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞壁溶解酵素系遺伝子ＤＮＡを含有する組み換え
体プラスミド。 ２、前記細胞壁溶解酵素系遺伝子ＤＮＡがアルスロバク
ターＹＣＷＤ３に由来する特許請求の範囲第１項に記載
の組み換え体プラスミド。 ３、前記アルスロバクターＹＣＷＤ３由来の細胞壁溶解
酵素系遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミドＹＲｐ７に連
結した特許請求の範囲第２項に記載の組み換え体プラス
ミド。 ４、前記細胞壁溶解酵素系遺伝子がβ−１・３グルカナ
ーゼを含有する特許請求の範囲第２項に記載の組み換え
体プラスミド。 ５、細胞壁溶解酵素系遺伝子ＤＮＡを含有する組み換え
体プラスミドで形質転換されたエスチェリチア属に属す
る微生物。 ６、前記細胞壁溶解酵素系遺伝子ＤＮＡがアルスロバク
ターＹＣＷＤ３に由来する特許請求の範囲第５項に記載
の微生物。 ７、前記アルスロバクターＹＣＷＤ３由来の細胞壁溶解
酵素系遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミドＹＲｐ７に連
結した特許請求の範囲第６項に記載の微生物。 ８、前記細胞壁溶解酵素系遺伝子がβ−１・３グルカナ
ーゼを含有する特許請求の範囲第６項に記載の微生物。 ９、前記細胞壁溶解酵素を構成的に生産する特許請求の
範囲第５項に記載の微生物。 １０、細胞壁溶解酵素系遺伝子ＤＮＡを含有する組み換
え体プラスミドで形質転換された細胞壁溶解酵素を生産
する能力を有するエスチェリチア属に属する微生物を培
地に培養し、該微生物菌体内もしくは培地中に該酵素を
生成蓄積させ該微生物菌体もしくは培養液から該酵素を
採取する細胞壁溶解酵素の製造方法。 １１、前記細胞壁溶解酵素がβ−１・３グルカナーゼで
ある特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59161678A JPS6140792A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | 細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み換え体プラスミドにより形質転換されたエスチェリチア属菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59161678A JPS6140792A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | 細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み換え体プラスミドにより形質転換されたエスチェリチア属菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6140792A true JPS6140792A (ja) | 1986-02-27 |
| JPH0256072B2 JPH0256072B2 (ja) | 1990-11-29 |
Family
ID=15739758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59161678A Granted JPS6140792A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | 細胞壁溶解酵素系遺伝子を有する組み換え体プラスミドにより形質転換されたエスチェリチア属菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6140792A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62157993U (ja) * | 1986-03-24 | 1987-10-07 | ||
| US5786392A (en) * | 1995-01-30 | 1998-07-28 | Silverman; Gary S. | Organometallic compounds and polymers made therefrom |
| US5883244A (en) * | 1990-08-17 | 1999-03-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The National Research Council Of Canada | Lytic β-1,3-glucanase gene |
| WO2012084225A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Direvo Industrial Biotechnology Gmbh | Improving fermentation processes and by-products |
| WO2014127851A1 (en) | 2013-02-21 | 2014-08-28 | Direvo Industrial Biotechnology Gmbh | Mycotoxin-binders |
| WO2014127852A1 (en) | 2013-02-21 | 2014-08-28 | Direvo Industrial Biotechnology Gmbh | Prebiotic animal feed product |
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-
1984
- 1984-07-31 JP JP59161678A patent/JPS6140792A/ja active Granted
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0256072B2 (ja) | 1990-11-29 |
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