JP2655148B2 - 新規な耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミド - Google Patents
新規な耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドInfo
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- JP2655148B2 JP2655148B2 JP23748487A JP23748487A JP2655148B2 JP 2655148 B2 JP2655148 B2 JP 2655148B2 JP 23748487 A JP23748487 A JP 23748487A JP 23748487 A JP23748487 A JP 23748487A JP 2655148 B2 JP2655148 B2 JP 2655148B2
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- Japan
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- amylase
- recombinant plasmid
- amylase gene
- thermostable amylase
- escherichia coli
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ジクチオグロムス・サーモフィラム（Dict
yoglomus thermophilum）より取得された新規な耐熱
性、耐酸性アミラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
に関するものである。
yoglomus thermophilum）より取得された新規な耐熱
性、耐酸性アミラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
に関するものである。
アミラーゼは澱粉様多糖を加水分解してオリゴ糖ある
いはグルコース、マルトースを生成する酵素であり、製
糖産業を中心に広く食品加工分野などで用いられてい
る。
いはグルコース、マルトースを生成する酵素であり、製
糖産業を中心に広く食品加工分野などで用いられてい
る。
食品加工に用いられる酵素は微生物汚染を防ぐ観点か
ら高温使用に耐え得る耐熱性酵素が望ましい。
ら高温使用に耐え得る耐熱性酵素が望ましい。
本発明はこの要望にかなう耐熱性アミラーゼを提供す
ることにある。
ることにある。
従来の技術および発明が解決しようとする問題点 ジクチオグロムス・サーモフィラムは複数種の有用な
耐熱性アミラーゼを培地中に生産する（日本農芸化学会
昭和61年度大会、講演要旨集第652頁）。
耐熱性アミラーゼを培地中に生産する（日本農芸化学会
昭和61年度大会、講演要旨集第652頁）。
しかしながら、本菌は嫌気条件下にて高温（74℃）で
培養しなければならないので実用的ではなかった。ま
た、多種類のアミラーゼを生産するため、特定のアミラ
ーゼを精製するためには多大の労力を要する難点があっ
た。
培養しなければならないので実用的ではなかった。ま
た、多種類のアミラーゼを生産するため、特定のアミラ
ーゼを精製するためには多大の労力を要する難点があっ
た。
問題点を解決するための手段 本発明者らは上記問題点を解決する目的で鋭意研究し
た結果、常法にしたがってショットガン・クローニング
を行い、ジクチオグロムス・サーモフィラムのアミラー
ゼ遺伝子を発現ベクター遺伝子に組み込み、新規な組換
えプラスミドを得、この組換えプラスミドを用いて大腸
菌を形質転換させ、更にこの形質転換された大腸菌に耐
熱性アミラーゼを生産させることに成功し、本発明に到
達した。
た結果、常法にしたがってショットガン・クローニング
を行い、ジクチオグロムス・サーモフィラムのアミラー
ゼ遺伝子を発現ベクター遺伝子に組み込み、新規な組換
えプラスミドを得、この組換えプラスミドを用いて大腸
菌を形質転換させ、更にこの形質転換された大腸菌に耐
熱性アミラーゼを生産させることに成功し、本発明に到
達した。
まず、制限酵素Sau3A Iで部分消化したジクチオグロ
ムス・サーモフィラムの染色体DNA断片を、制限酵素Bam
H Iで完全に消化した合成コンセンサスプロモーターを
含むベクターpYEJ001に挿入することにより作成したプ
ラスミドで大腸菌を形質転換した。取得された形質転換
体の中から、アミラーゼ生産能が付与された形質転換体
を澱粉含有プレート上でのヨード澱粉反応の消失活性に
より検出した。
ムス・サーモフィラムの染色体DNA断片を、制限酵素Bam
H Iで完全に消化した合成コンセンサスプロモーターを
含むベクターpYEJ001に挿入することにより作成したプ
ラスミドで大腸菌を形質転換した。取得された形質転換
体の中から、アミラーゼ生産能が付与された形質転換体
を澱粉含有プレート上でのヨード澱粉反応の消失活性に
より検出した。
アミラーゼ生産能が付与された形質転換体は多数であ
ったが、これらの保有するプラスミドの制限酵素地図は
２種類に集約された。ここで制限酵素Sau3A Iで消化し
た5.6kbpの断片に由来するアミラーゼ遺伝子をamyBと称
し、amyBを含む組換え体プラスミドをpDA201と命名し
た。もう一方の制限酵素Sau3A Iで消化した3.1kbpの断
片に由来するアミラーゼ遺伝子をamyCと称し、amyCを含
む組換え体プラスミドをpDA401と命名した。pDA201の制
限酵素地図を第１図に、pDA401の制限酵素地図を第２図
にそれぞれ記載した。またM13ダイデオキシ法により決
定された塩基配列のうち、pDA201に含まれるHind III−
Sph I消化部位に狭まれた4.5kbpの領域の塩基配列を第
３図に、pDA401に含まれるSma I−Sau3A I/BamH I消化
部位に狭まれた2.2kbpの領域の塩基配列を第４図に記載
した。
ったが、これらの保有するプラスミドの制限酵素地図は
２種類に集約された。ここで制限酵素Sau3A Iで消化し
た5.6kbpの断片に由来するアミラーゼ遺伝子をamyBと称
し、amyBを含む組換え体プラスミドをpDA201と命名し
た。もう一方の制限酵素Sau3A Iで消化した3.1kbpの断
片に由来するアミラーゼ遺伝子をamyCと称し、amyCを含
む組換え体プラスミドをpDA401と命名した。pDA201の制
限酵素地図を第１図に、pDA401の制限酵素地図を第２図
にそれぞれ記載した。またM13ダイデオキシ法により決
定された塩基配列のうち、pDA201に含まれるHind III−
Sph I消化部位に狭まれた4.5kbpの領域の塩基配列を第
３図に、pDA401に含まれるSma I−Sau3A I/BamH I消化
部位に狭まれた2.2kbpの領域の塩基配列を第４図に記載
した。
pDA201あるいはpDA401で大腸菌エシエリキア・コリ
（Esherichiacoil）C600rK-mK-株を形質転換して得られ
た株はそれぞれエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA20
1）およびエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA401）と
命名されて、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている（微工研菌寄第9572号（FERM P−9572）および
微工研菌寄第9571号（FERM P−9571））。
（Esherichiacoil）C600rK-mK-株を形質転換して得られ
た株はそれぞれエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA20
1）およびエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA401）と
命名されて、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている（微工研菌寄第9572号（FERM P−9572）および
微工研菌寄第9571号（FERM P−9571））。
前記組換えプラスミドで形質転換された大腸菌は好気
的に通常の培養温度、例えば37℃程度で培養でき、この
ように培養して得られた菌体あるいは培養液から耐熱性
アミラーゼを採取することができる。
的に通常の培養温度、例えば37℃程度で培養でき、この
ように培養して得られた菌体あるいは培養液から耐熱性
アミラーゼを採取することができる。
菌体、培養液から耐熱性アミラーゼは容易に精製でき
る。すなわち、大腸菌由来の蛋白質は70℃、30分程度の
加熱処理により大部分は編成して沈澱となるが、耐熱性
アミラーゼは熱処理液中に溶解している。この熱処理液
を遠心分離した後、各種クロマトグラフィーを用いて容
易に精製して純度を向上させることができる。
る。すなわち、大腸菌由来の蛋白質は70℃、30分程度の
加熱処理により大部分は編成して沈澱となるが、耐熱性
アミラーゼは熱処理液中に溶解している。この熱処理液
を遠心分離した後、各種クロマトグラフィーを用いて容
易に精製して純度を向上させることができる。
形質転換株によって生産される耐熱性アミラーゼAmyB
（amyB由来）およびAmyC（amyC由来）の諸性質を第１表
に記載した。
（amyB由来）およびAmyC（amyC由来）の諸性質を第１表
に記載した。
実施例 以下の実施例によってさらに具体的に本発明を説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本
発明で使用する制限酵素などのDNA修飾酵素あるいは試
薬類はすべて市販品として入手できる。またベクタープ
ラスミドpYEJ001はファルマシア社から購入できる。
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本
発明で使用する制限酵素などのDNA修飾酵素あるいは試
薬類はすべて市販品として入手できる。またベクタープ
ラスミドpYEJ001はファルマシア社から購入できる。
実施例１ 耐熱性アミラーゼ遺伝子の分離 ジクチオグロムス・サーモフィラム（Dictyoglomus th
ermophilum）Ｈ−６−12株（FERM Ｐ−7114）の染色体
DNAは斎藤、三浦の方法〔バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第72巻、第
619頁（1963年）〕に準じて調製した。調製した染色体D
NAは制限酵素Sau3A Iで部分消化した。一方、合成コン
センサスプロモーターベクターであるpYEJ001は制限酵
素BamH Iで消化し、アルカリフォスファターゼで５′−
末端を脱リン酸処理した。両者をT4DNAリガーゼで連結
して、組換え体プラスミドを作成した。ついで、得られ
た組換えプラスミドを用い冷塩化カルシウム法で大腸菌
エシエリキア・コリ（Esherichia coli）C600rK-mK-株
を形質転換した。形質転換株の選択培地には、Ｌ−ブロ
ス培地に50μg/mlとなるようにアンピシリンおよび寒天
をそれぞれ加えた0.7％寒天培地を使用した。
ermophilum）Ｈ−６−12株（FERM Ｐ−7114）の染色体
DNAは斎藤、三浦の方法〔バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第72巻、第
619頁（1963年）〕に準じて調製した。調製した染色体D
NAは制限酵素Sau3A Iで部分消化した。一方、合成コン
センサスプロモーターベクターであるpYEJ001は制限酵
素BamH Iで消化し、アルカリフォスファターゼで５′−
末端を脱リン酸処理した。両者をT4DNAリガーゼで連結
して、組換え体プラスミドを作成した。ついで、得られ
た組換えプラスミドを用い冷塩化カルシウム法で大腸菌
エシエリキア・コリ（Esherichia coli）C600rK-mK-株
を形質転換した。形質転換株の選択培地には、Ｌ−ブロ
ス培地に50μg/mlとなるようにアンピシリンおよび寒天
をそれぞれ加えた0.7％寒天培地を使用した。
Ｌ−ブロス培地（pH7.3）： バクトトリプトン（Difco社製） 1.0％ 酵母エキス（Difco社製） 0.5％ 塩化ナトリウム 0.5％ グルコース 0.1％ 選択した株について以下の要領でアミラーゼ活性の発
現を検出した。まず、上記選択培地に滅菌した濾紙をの
せて、ここに滅菌爪楊枝で選択株を接種し、37℃で一夜
培養した。この操作によりプレートと濾紙の双方に菌が
レプリカされる。菌のコロニーが十分生育したところで
濾紙をはがし、この濾紙を溶菌酵素溶液〔0.1％トリト
ンｘ−100、2mg/mlリゾチームを含む50mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）〕に37℃で１時間浸して溶菌させた。
溶菌後、可溶性澱粉含有プレート〔0.2％可溶性澱粉、1
00μg/mlクロラムフェニコールを含む40mMリン酸緩衝液
（pH6.0）の0.7％寒天プレート〕にコロニーが下になる
ようこの濾紙をのせ、60℃に一晩保温した。濾紙をはが
した後にこのプレートをヨード蒸気で染色したところ、
アミラーゼが発現した株は可溶性澱粉が分解されている
ためにヨード澱粉反応が起こらずにハローが形成され
る。レプリカされたプレートからアミラーゼを発現した
株を単離できる。さらに実施例２に示した方法でアミラ
ーゼが生産されていることを確認した。
現を検出した。まず、上記選択培地に滅菌した濾紙をの
せて、ここに滅菌爪楊枝で選択株を接種し、37℃で一夜
培養した。この操作によりプレートと濾紙の双方に菌が
レプリカされる。菌のコロニーが十分生育したところで
濾紙をはがし、この濾紙を溶菌酵素溶液〔0.1％トリト
ンｘ−100、2mg/mlリゾチームを含む50mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）〕に37℃で１時間浸して溶菌させた。
溶菌後、可溶性澱粉含有プレート〔0.2％可溶性澱粉、1
00μg/mlクロラムフェニコールを含む40mMリン酸緩衝液
（pH6.0）の0.7％寒天プレート〕にコロニーが下になる
ようこの濾紙をのせ、60℃に一晩保温した。濾紙をはが
した後にこのプレートをヨード蒸気で染色したところ、
アミラーゼが発現した株は可溶性澱粉が分解されている
ためにヨード澱粉反応が起こらずにハローが形成され
る。レプリカされたプレートからアミラーゼを発現した
株を単離できる。さらに実施例２に示した方法でアミラ
ーゼが生産されていることを確認した。
取得されたアミラーゼ生産株からプラスミドを調製し
て、制限酵素地図を作成したところ、amyB、amyCの２種
類の遺伝子がクローニングされていることが明らかにな
った。それぞれの遺伝子のM13ダイデオキシ法で決定さ
れた塩基配列について第３図、第４図に図示した。
て、制限酵素地図を作成したところ、amyB、amyCの２種
類の遺伝子がクローニングされていることが明らかにな
った。それぞれの遺伝子のM13ダイデオキシ法で決定さ
れた塩基配列について第３図、第４図に図示した。
実施例２ 大腸菌からのアミラーゼの製造 実施例１で得られた形質転換体、すなわち、プラスミ
ドpDA201を含むエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA20
1）FERM Ｐ−9572株およびプラスミドpDA401を含むエ
シエリキア・コリC600rK-mK-（pDA401）FERM Ｐ−9571
株を50μg/mlアンピシリンを含む10mlのＬ−ブロス培地
に接種後、37℃で一晩好気的に培養した。
ドpDA201を含むエシエリキア・コリC600rK-mK-（pDA20
1）FERM Ｐ−9572株およびプラスミドpDA401を含むエ
シエリキア・コリC600rK-mK-（pDA401）FERM Ｐ−9571
株を50μg/mlアンピシリンを含む10mlのＬ−ブロス培地
に接種後、37℃で一晩好気的に培養した。
遠心分離により得られる培養上清を菌体外画分とし
た。また、沈澱した菌体を10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.3）で洗浄し、さらに1.5mlの同緩衝液に懸濁させて超
音波破砕した後に遠心分離により得られる上清を菌体内
画分とした。
た。また、沈澱した菌体を10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.3）で洗浄し、さらに1.5mlの同緩衝液に懸濁させて超
音波破砕した後に遠心分離により得られる上清を菌体内
画分とした。
次ぎに各画分について以下の方法でアミラーゼ活性を
測定した。
測定した。
まず、基質溶液〔0.5ml;1％可溶性澱粉溶液（メルク
社製ジアスターゼ定量用可溶性澱粉を使用し、0.15％Na
BH4で末端還元基を処理）、0.25ml;0.2M酢酸緩衝液（pH
5.5）〕に、適宜希釈した試料あるいは対照としての蒸
留水を0.5ml添加して、80℃にて30分間反応させた。つ
いで1.5Nの酢酸を1.25ml添加して反応を停止した。反応
液にヨウ素溶液（0.1％I2、１％KI）2.5mlおよび蒸留水
7.5mlを加えて、光学密度OD690nmを測定した。ここで
は、アミラーゼ活性をヨード澱粉反応の青色を30分間で
１割減少させる活性を１単位（unit）と定義しているの
で、次式にしたがって活性を算出できる。
社製ジアスターゼ定量用可溶性澱粉を使用し、0.15％Na
BH4で末端還元基を処理）、0.25ml;0.2M酢酸緩衝液（pH
5.5）〕に、適宜希釈した試料あるいは対照としての蒸
留水を0.5ml添加して、80℃にて30分間反応させた。つ
いで1.5Nの酢酸を1.25ml添加して反応を停止した。反応
液にヨウ素溶液（0.1％I2、１％KI）2.5mlおよび蒸留水
7.5mlを加えて、光学密度OD690nmを測定した。ここで
は、アミラーゼ活性をヨード澱粉反応の青色を30分間で
１割減少させる活性を１単位（unit）と定義しているの
で、次式にしたがって活性を算出できる。
アミラーゼ活性（unit）＝ ｛OD（対照）−OD（試料）/OD（対照）｝×10× （30/反応時間（分））×希釈倍率 その結果、pDA201を含む大腸菌では菌体内画分にのみ
アミラーゼ（AmyB）活性が認められたが、pDA401を含む
大腸菌では菌体内画分、菌体外画分ともにアミラーゼ
（AmyC）活性が認められた。
アミラーゼ（AmyB）活性が認められたが、pDA401を含む
大腸菌では菌体内画分、菌体外画分ともにアミラーゼ
（AmyC）活性が認められた。
発明の効果 本発明は、高度好熱性絶対嫌気性菌ジクチオグロムス
・サーモフィラムＨ−６−12 FERM Ｐ−7114の耐熱性
アミラーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換可能ならしめたも
のであり、これによって、これまで嫌気的条件でかつ高
温で生産していた耐熱性アミラーゼを好気的条件下でし
かも常温培養によって製造することが可能となった。
・サーモフィラムＨ−６−12 FERM Ｐ−7114の耐熱性
アミラーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換可能ならしめたも
のであり、これによって、これまで嫌気的条件でかつ高
温で生産していた耐熱性アミラーゼを好気的条件下でし
かも常温培養によって製造することが可能となった。
さらに、形質転換体を培養することによって単一のア
ミラーゼのみを生産させることができるようになり、ア
ミラーゼの精製が容易に行えるようになった。
ミラーゼのみを生産させることができるようになり、ア
ミラーゼの精製が容易に行えるようになった。
第１図および第２図は、プラスミドpYEJ001に耐熱性ア
ミラーゼ遺伝子を連結して得られるプラスミドpDA201お
よびpDA401の各種制限酵素による切断地図をそれぞれ示
した図である。 第３図および第４図はpDA201およびpDA401の塩基配列を
それぞれ示した図である。
ミラーゼ遺伝子を連結して得られるプラスミドpDA201お
よびpDA401の各種制限酵素による切断地図をそれぞれ示
した図である。 第３図および第４図はpDA201およびpDA401の塩基配列を
それぞれ示した図である。
Claims (4)
- 【請求項１】ジクチオグロムス・サーモフィラム（Dict
yoglomus thermophilum）Ｈ−６−12株（FFRM P−711
4）に由来する耐熱性アミラーゼ遺伝子を有するDNA断片
を発現ベクターDNAに組み込んだ新規組換え体プラスミ
ド。 - 【請求項２】前記耐熱性アミラーゼ遺伝子が制限酵素Sa
u3A I消化で生じた約5.6kbpの染色体断片内にあること
を特徴とする前記特許請求の範囲第１項に記載の組換え
体プラスミド。 - 【請求項３】前記耐熱性アミラーゼ遺伝子が制限酵素Sa
u3A I消化で生じた約3.1kbpの染色体断片内にあること
を特徴とする前記特許請求の範囲第１項に記載の組換え
体プラスミド。 - 【請求項４】ジクチオグロムス・サーモフィラム（Dict
yoglomus thermophilum）Ｈ−６−12株（FFRM P−711
4）に由来する耐熱性アミラーゼ遺伝子を有するDNA断片
を発現ベクターDNAに組み込んだ新規組換え体プラスミ
ドで形質転換された新規な大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23748487A JP2655148B2 (ja) | 1987-09-24 | 1987-09-24 | 新規な耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23748487A JP2655148B2 (ja) | 1987-09-24 | 1987-09-24 | 新規な耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6485083A JPS6485083A (en) | 1989-03-30 |
| JP2655148B2 true JP2655148B2 (ja) | 1997-09-17 |
Family
ID=17016010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23748487A Expired - Lifetime JP2655148B2 (ja) | 1987-09-24 | 1987-09-24 | 新規な耐熱性アミラーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2655148B2 (ja) |
-
1987
- 1987-09-24 JP JP23748487A patent/JP2655148B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6485083A (en) | 1989-03-30 |
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