JPH04228071A - マルトペンタオース生産性アミラーゼａ−１８０、その製法、ｄｎａ−構造体及び好アルカリ単離体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はマルトペンタオース（
Ｇ５）生産性アミラーゼ及びその誘導体に関する。

【０００２】

【公知技術】グルコース（グルコアミラーゼ）及びマル
トース（β−アミラーゼ）の他には非常に僅かなマルト
オリゴ糖類のみが十分な純度で直接デンプンのアミラー
ゼによる加水分解により得ることができる。一般にデン
プンの加水分解においてα−アミラーゼはグルコース及
び低分子マルトオリゴ糖類（Ｇ２〜Ｇ９）からなる混合
物を生産する。このような混合物から個々の成分を精製
することは手数がかかり、高い費用になる。しかしなが
ら、いくつかのα−アミラーゼは十分に高い生産物特異
性を有しており、これを一定のオリゴ糖類を工業的に生
産するために使用することができる。

【０００３】従来、Ｇ５形成アミラーゼは３種類公知で
ある： ａ）　　バシラス・リヒェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）−米国特許第４０
３９３８３号明細書、１９７７年８月２日；Ａｒｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第１５５巻、第２
９０〜２９８頁、１９７３年−好熱性有機体バシラス・
リヒェニホルミスからの酵素は７０℃の最適温度を有し
、ｐＨ４．０〜１０．０という広いｐＨ−範囲で活性で
ある。分子量（ＭＷ）は２２．５ｋＤａである。デンプ
ン加水分解における生成物としてはまず長鎖マルトオリ
ゴ糖類（Ｇ５〜Ｇｎ）が生じ、これは反応の経過におい
て主反応生成物Ｇ５及びやはり多量のＧ１〜Ｇ４に分解
される。１９７７年８月２日の米国特許第４０３９３８
３号明細書はアミロース（難水溶性基質）を加水分解し
、可溶性にするための方法を記載している。次いで、こ
の溶解したアミロースを精製したアミラーゼのための基
質としてＧ５−生産のために使用する。多くの副生成物
のために、この酵素反応による生成物混合物をクロマト
グラフィーにより精製しなければならない。

【０００４】ｂ）　　バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ）ＮＹ−１４−特願昭５７−１
５８０９９号公報、１９８２年９月１３日＝米国特許第
４５９１５６１号公報、１９８６年５月２７日；特願昭
５８−１４２３３０号公報、１９８３年８月３日；Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第４９（１２）巻、第
３３６９〜３３７６頁、１９８５年（ＡＢＣ）−上記文
献（ＡＢＣ）中にはバシラス・セレウスＮＹ−１４から
の５５ｋＤａアミラーゼの精製及び特徴付けが記載され
ており、これはｐＨ６．０のｐＨ−最適値と５５℃の最
適温度を有する。この酵素はまずデンプンをマルトオリ
ゴ糖類Ｇ３〜Ｇ８に切断する。次いで、長鎖糖を二次的
にＧ１〜Ｇ５に分解する。特願昭５７−１５８０９９号
公報は使用した有機体の酵素によりマルトオリゴ糖類に
切断されうる基質（デンプン、アミロース等）を含有す
る培地中でバシラス菌株（ここではＮＹ−１４）を培養
することによるＧ５の生産を記載している。一定のオリ
ゴ糖類の獲得はこの方法においては培養液の濾過及び引
き続くクロマトグラフィーにより行なわれる。

【０００５】特願昭５８−１４２３３０号公報はバシラ
ス・セレウスＮＹ−１４からのＧ５−特異的酵素を保護
している。この酵素の記載においてＡＢＣ中の記載と矛
盾がある、それというのもこの特願昭５８−１４２３３
０号公報においては酵素のＭＷが９０ｋＤａで記載され
ており、ＡＢＣ中には５５ｋＤａと記載されている。

【０００６】ｃ）　　プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＯ　　８９４０−特願昭５９−０４
４０６９、１９８４年３月９日；特願昭５９−０４４０
７０、１９８４年３月９日；特願昭６２−２５３７８６
（特願昭５９−０４４０６９からの分割）；Ａｐｐｌ．
　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
、第２５巻、第１３７〜１４２頁、１９８６年；Ａｇｒ
ｉｃ．　　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５４（１）巻、第
１４７〜１５６頁、１９９０年−Ａｐｐｌ．　　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．中の論文に
おいて著者はまずプソイドモナス単離体ＫＯ　　８９４
０及びＧ５−アミラーゼを形成する条件を記載している
。最も新しい文献（Ａｇｒｉｃ．　　Ｂｉｏｌ．　　Ｃ
ｈｅｍ．第５４（１）、第１４７〜１５６頁、１９９０
年）中には多分このＧ５−アミラーゼの精製及びバイオ
化学的特性が記載されている。しかしながら、プソイド
モナス−単離体ＫＯ　　８９４０からのアミラーゼはは
っきりとは挙げられていない。精製した酵素は高い開始
Ｇ５−形成活性を有する。長い恒温保持時間の後、はじ
めてより短かい加水分解生成物が生じる。特願昭６２−
２５３７８６号明細書はプソイドモナスＫＯ　　８９４
０からの酵素とＧ５−生産のためのその使用を保護する
。このアミラーゼはこれによれば４５℃〜５５℃の最適
温度とｐＨ６．０〜７．０のｐＨ最適値を有する。その
ＭＷは７２．５ｋＤａである。

【０００７】特願昭５９−０４４０７０号明細書中では
アミラーゼ生産プソイドモナスＫＯ８９４０を保護して
いる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】公知酵素の使用下での
マルトペンタオースの獲得法は手をかけて精製した酵素
を使用するか、又はマルトヘプタオースを培養基質から
手をかけて精製する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は単離体１
６３−２６（ＤＳＭ５８５３）からのマルトペンタオー
ス生産性アミラーゼ（Ａ−１８０）並びにこのアミラー
ゼの誘導体の製法である。本発明の更なる課題は単離体
１６３−２６（ＤＳＭ５８５３）からのアミラーゼの誘
導体をコードするＤＮＡ−構造体である。

【００１０】本発明によりバクテリア、有利には好アル
カリデンプン分解バクテリアを公知法でデンプンからの
マルトペンタオースの生産のための能力に関してスクリ
ーニングする。

【００１１】この特性を有するバクテリアを特徴づけし
、かつアミロース分解酵素を精製して、バイオ化学的に
特徴付けする。

【００１２】原核細胞、有利に大腸菌中で酵素を多量に
製造することを可能にするためには酵素をコードする遺
伝子をベクター中で、有利にプラスミド中でクローン化
し、かつ公知法で配列決定を行なう。このコードする遺
伝子を所定の突然変異で修飾し、アミラーゼとして機能
の良好な修飾蛋白質の分泌を好適な原核細胞中で可能に
する。

【００１３】このことを達成するために、この構造遺伝
子をプラスミド中で誘発性プロモーターの制御下に、有
利にはラクトース誘発性ｔａｃ−プロモーターの制御下
に配置する。こうして強力な、調節可能なアミラーゼの
過生産が可能となる。この酵素が細胞内で分解されるこ
とを阻止するために、かつ煩雑な単離工程なしに酵素の
使用を可能とするために、酵素の培地中への効果的な分
泌は望ましい。

【００１４】このことを達成するために、分泌可能な酵
素のシグナルペプチドに関する、有利にクレブシエラ・
オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ・ｏｘｙｔｏｃａ）
からのＣＧＴアーゼのシグナルペプチドに関するコード
域を読み取り枠の保持下に酵素の構造遺伝子と融合する
。例えば、蛋白質配列と公知アミラーゼの配列との比較
により、機能的に重要な酵素ドメイン及び機能に重要で
ない蛋白質域を評価し、これに続けて更なる構造遺伝子
の修飾を実施し、この修飾により生成物特異性の保持下
に培地中への増強した酵素分泌に導びくか、又は培地中
での高められた酵素安定性を生ぜしめる。

【００１５】こうして、培地上澄からの酵素の精製又は
濃縮は不必要である。培地上澄はマルトペンタオース生
産のために直接使用することができる。次いで、マルト
ペンタオースの精製が不必要である程マルトペンタオー
ス収量が高い方法を、反応条件の好適な選択により確立
する。９０％を越えるＧ５−収率においてマルトペンタ
オースの更なる精製を中止することができる。例えば、
噴霧乾燥により、加水分解配合物からのマルトペンタオ
ースの簡単な獲得は可能である。

【００１６】本発明によるアミラーゼ及びその誘導体に
よるデンプン加水分解において生じる主生成物であるマ
ルトペンタオースは現在３つの分野で使用されている。

【００１７】Ｇ５の主な適用範囲は現在医学的アミラー
ゼ診断学にある。体液、例えば尿又は血清中のアミラー
ゼ濃度を正確に測定するために、マルトオリゴ糖類、特
にマルトペンタオースを基質として使用する方法におい
て、多くの異なる方法が記載されている。

【００１８】−Ｇ５依存性の方法は、非修飾Ｇ５を一連
の酵素との組合わせにおいてアミラーゼ測定のための基
質として使用することを特徴としている。添加した酵素
は、試料材料中に内生的に存在するグルコース又はオリ
ゴ糖類が測定を妨害することを阻止するか、又はＧ５−
加水分解において生じた生成物の酵素的測定に働らくべ
きである。

【００１９】例：特願昭６０−９８２８２号明細書、Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第
２１巻、第４５〜５２頁、１９８３年。

【００２０】薬理学においては、マルトペンタオースは
更に２つの分野で使用される：−その低い甘さ、良好な
溶解性及びその溶液の低い粘度のために、マルトオリゴ
糖類は子供、老人又は病人のための液体栄養分中の炭水
化物源として使用される。

【００２１】−Ｇ５での脂肪酸のエステル化により、こ
れを水溶性にすることができる。エステル化した脂肪酸
のこのような溶液は安定であるので、鉱物塩の添加の後
この溶液を注入溶液として使用する。

【００２２】例：特願昭６０−２２６６１０号明細書。

【００２３】図１はプラスミドｐＡＣＡ１の概略図であ
り、単離体１６３−２６からの染色体ＤＮＳの７．９ｋ
ｂフラグメントがプラスミドｐＡＣ１（ｐＡＣＹＣ１８
４−誘導体）のＢａｍＨＩ／ＸｍａＩＩＩ−位中にクロ
ーン化された。フラグメント中に含有されるＡ−１８０
構造遺伝子を明細書中に記載した突然変異の構成のため
に使用した。

【００２４】図２はベクターｐＡＣ１中にクローン化さ
れた単離体１６３−２６からのＤＮＡフラグメント（ｐ
ＡＣＡ１）の制限地図である。概略図は発現プラスミド
ｐＥＸ１０５１及びｐＥＸ２１に導びく突然変異を示す
。

【００２５】

【実施例】例中には本発明によるマルトペンタオース生
産性アミラーゼ、そのＤＮＡ−配列、その遺伝工学的修
飾並びに大腸菌中でのその発現を記載している。更に、
アミラーゼ及びその遺伝工学的に変えられた修飾体を使
用したデンプン変換の例を示す。

【００２６】例１ マルトペンタオース生産性好アルカリバクテリアによる
スクリーニング大地の種々の地域からの土壌試料を集め
た。土０．１〜０．２ｇを秤量し、滅菌容器中で、滅菌
生理食塩溶液１ｍｌで懸濁させた。粗大な部分の沈降の
後、それぞれ０．１ｍｌをデンプン寒天培地（可溶性デ
ンプン１０ｇ／ｌ；ペプトン５ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ
／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　　１ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２
Ｏ　　０．２ｇ／ｌ；Ｎａ２ＣＯ３　　１０ｇ／ｌ；寒
天１５ｇ／ｌ；ｐＨ１０．４）上にぬる。寒天プレート
の恒温保持を２〜３日間３０℃で行なった。デンプンを
分解するバクテリアのコロニーは混濁のカサを示し、こ
れは低分子量デンプン分子の劣化により生じた。コロニ
ーを単離し、デンプン寒天プレート上で２回精製した。 更に、前記の組成の液体培地２ｍｌ中で培養を実施した
。３０℃で４８時間恒温保持した後、細胞を遠心分離し
、上澄をアミラーゼ活性に関してテストした。上澄２０
０μｌを２０ｍＭトリス／Ｃｌ　　ｐＨ９．０；５ｍＭ
　　ＣａＣｌ２中の１０％デンプン溶液２００μｌと共
に４０℃で１〜５時間恒温保持した。この酵素テストを
メタノール６００μｌの添加により中止し、上澄を遠心
分離した後ＨＰＬＣにより分析する。多くの単離体のう
ちで菌株１６３−２３のみが所望の酵素活性を示した。

【００２７】例２ 菌株の特徴付け 好アルカリ単離体１６３−２６は次の特徴を示した。

【００２８】細胞形　　　　　　：桿状、単細胞、ダイ
マー及び短鎖 細胞の大きさ：１〜１．６μｍ×０．２〜０．３μｍ可
動性　　　　　　：対数増殖期においてはほぼすべての
細胞は可動性である；定常 期にはほぼすべての細胞が非可動性である。

【００２９】胞　　子　　　　　　：増殖期には胞子は
現われない。

【００３０】増殖パラメーター：温　　度　　　　　　
：３０℃〜３７℃の間で最適な増殖。

【００３１】ｐＨ　　　　　　　　：ｐＨ８．０〜９．
０の間が最適。

【００３２】ＮａＣｌ−耐性：８％ＮａＣｌはなお耐性
。

【００３３】キノン　　　　　　：好気的にも嫌気的に
もキノンは現われず。

【００３４】グラム挙動　　：対数増殖期においては細
胞の３０〜７０％がグラム陽性である。

【００３５】脂肪酸型　　　　：直鎖及びイソ−、アン
テイソ−分枝鎖脂肪酸 ムレイン型　　：Ａ１γ ＧＣ−含量　　：４１．５　　＋／−　　０．５　　Ｍ
ｏｌ％例３ アミラーゼＡ−１８０の精製及び特徴付け典型的な精製
法の例： 単離体１６３−２６を培地Ｍ３／１（ノレデュクス（Ｎ
ｏｒｅｄｕｘ）１５０Ｂ５ｇ／ｌ；カゼインからのペプ
トン　　５ｇ／ｌ；酵母抽出液　　５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
　　５ｇ／ｌ；Ｎａ２ＣＯ３　　３．５ｇ／ｌ；ＫＨ２
ＰＯ４　　１ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４　　０．２ｇ／ｌ）４
０ｌ中で３７℃で好気的に培養した。２０時間後、この
培養物に氷を添加して、４℃に冷却した。細胞を培養液
から横断流マイクロ濾過によりミリポアフィルターカセ
ット（孔径０．２μｍ）で除去する。細胞不含の培養上
澄液中の蛋白質をフィルトロン（Ｆｉｌｔｒｏｎ）フィ
ルターカセット（分離限界１０ｋＤａ）を介して限外濾
過により容量１ｌに濃縮した。引き続き、この溶液に粉
末状硫酸アンモニウムを添加して６０％硫酸アンモニウ
ム飽和溶液にした。この際生じた蛋白質を遠心分離し、
ＴＣ−緩衝液（２０ｍＭ　　トリス／Ｃｌ　　ｐＨ７．
２；５ｍＭ　　ＣａＣｌ２）５０ｍｌ中に溶かし、ＴＣ
−緩衝液に対して透析した。溶液中のデンプン分解酵素
をデンプン吸着により精製した。このためには蛋白質溶
液を透析の後、２０％硫酸アンモニウム飽和溶液上にも
たらし、３％溶解性デンプンと混合した。配合物を４℃
で３時間撹拌し、引き続き遠心分離した。沈殿を出発容
量の１／２量の洗浄緩衝液（２０％硫酸アンモニウム飽
和溶液、ＴＣ−緩衝液中の１Ｍ　　ＮａＣｌ）中に懸濁
させ、４℃で１０分間撹拌し、新たに遠心分離した。こ
こで得られた沈殿を出発容量と同量の溶離緩衝液（３Ｍ
ＮａＣｌ；０．１Ｍマルトース、ＴＣ−緩衝液中）中に
懸濁させ、４℃で２時間撹拌する。引き続き、デンプン
を遠心分離し、上澄をＴＣ−緩衝液に対して透析する。 透析の後、溶液中の蛋白質を硫酸アンモニウム（６０％
飽和）の添加により沈殿させ、ＴＣ−緩衝液中に溶かし
、新たに透析する。このようにして得られた溶液は単離
体１６３−２６から形成されたα−アミラーゼＡ−６０
及びマルトペンタオース生産性アミラーゼＡ−１８０の
みを含有する。この両方の酵素をモレキュラールシーブ
カラムＴＳＫ　　ＳＷ３０００Ｇ（ＬＫＢ）でのゲル濾
過により相互に分離することができる。

【００３６】アミラーゼＡ−１８０の特徴付けＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分
子量（ＭＷ）−測定はアミラーゼＡ−１８０に関して約
１８０ｋＤａの分子量を示した。等電点集中により、精
製した酵素に関して等電点４．６５が示された。デンプ
ン加水分解における生成物形成の動力学はアミラーゼＡ
−１８０に関して、開始時に著しく高いＧ５−特異性を
与えた。Ａ−１８０は６．０と８．５のｐＨ値において
２段階のｐＨ−最高値を有する。Ａ−１８０の不可逆的
不活性化は５．５より下まわるか、または１１．０をう
わまわるｐＨ値においてはじめて生じる。デンプン加水
分解に関する最適温度は５５℃であるが、この温度では
酵素はすでに容易に不安定であるのでＧ５生産のために
は４５℃の温度が使用される。γ−シクロデキストリン
はアミラーゼＡ−１８０により加水分解されない。この
結果は高いＧ５−特異性の発見と共に、Ａ−１８０がエ
キソ−マルトペンタオヒドロラーゼであることを示す。

【００３７】例４ Ａ−１８０−構造遺伝子のクローン化及び配列決定クロ
ーン化 構造遺伝子をその助けによって同定することのできるＡ
−１８０特異的ゾンデを得るために、まず精製アミラー
ゼＡ−１８０のＮ−末端アミノ酸配列を自動エドマン分
解（ガス相−シークエネーター）により決定した。この
配列決定により得られたアミノ酸配列は次のようである
： Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　
Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｎ　　ＬｅｕＧｌｕ　　Ａｓ
ｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒ
ｐ　　Ａｓｐ　　ＡｓｎＡｌａ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　
　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ．逆翻訳によ
り、この配列の１部（Ｔｒｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　
Ａｌａ　　ＡｓｎＶａｌ）から長さ１７塩基のヌクレオ
チド配列が誘導され、これはＡ−１８０−構造遺伝子中
に含有されていなければならない。このオリゴヌクレオ
チド混合物の正確な配列は次のようである：このオリゴ
ヌクレオチド配列（３２回変性した１７−ｍｅｒ）をＤ
ＮＳ−シンテサイザーを用いて製造し、かつ３２Ｐ−γ
−ＡＴＰで放射性標識した。

【００３８】単離体１６３−２６の染色体ＤＮＡを種々
の反応酵素で切断し、０．８％アガロースゲル中で電気
泳動を行なうことにより分離し、ナイロン膜上に移した
（サザン・ブロット法）。放射性オリゴヌクレオチド混
合物を用いて、ハイブリッド化工程により、Ａ−１８０
のＮ−末端域をコードするＣｌａＩ−フラグメント２．
７ｋＢを標識することができた。このＣｌａＩ−フラグ
メントを単離し、ＣｌａＩで切断したベクターｐＢＲ３
２２中に連結し、かつ大腸菌ＨＢ１０１中で形質転換し
た。正しい挿入物を有するクローンはそのプラスミドＤ
ＮＳと放射性オリゴヌクレオチド混合物とをハイブリッ
ド化することにより同定された。標識され、ハイブリッ
ド化プローブとして使用されたクローン化ＤＮＳ−フラ
グメントを用いて総Ａ−１８０−構造遺伝子をクローン
化することができた。

【００３９】配列決定 Ａ−１８０−構造遺伝子のヌクレオチド配列の決定のた
めにはプラスミドｐＵＣ１９中の遺伝子の重複フラグメ
ントをサブクローン化した。サブクローンの配列を一般
的であるか、又は内在の配列プライマーを用いてジデオ
キシ鎖切断法により測定した。完全なＡ−１８０ヌクレ
オチド配列及び誘導したアミノ酸配列の表示を遺伝子の
５′及び３′側面域と共に次に示す。

【００４０】

【化１】

【００４１】

【化２】

【００４２】

【化３】

【００４３】

【化４】

【００４４】

【化５】

【００４５】Ａ−１８０をコードする開放読み取り枠は
アミノ酸１６８４個に相応するヌクレオチド５０５２を
包含する。誘導された分子量１８６．５ｋＤａはＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより判明した１８０ｋＤａと一致する。

【００４６】例５ Ａ−１８０−構造遺伝子の突然変異誘発クローン化Ａ−
１８０−構造遺伝子を、Ｇ５−特異性アミラーゼの搬送
及び蛋白加水分解安定性と結びついた大量生産が好適な
大腸菌株中で行なわれるように変えるために、３回の突
然変異が必要であった。

【００４７】−Ａ−１８０−構造遺伝子の大量発現及び
これによる強いアミラーゼ生産を得るために、更に加え
て簡単な方法により制御可能である、すなわち誘発性で
あるか、又は抑圧性であるためには、Ａ−１８０−構造
遺伝子を新規プロモーターの制御下に置く。このために
はプラスミドｐＡＣＡ１（図１）からＡ−１８０−構造
遺伝子を単離し、かつ′ｔａｃ′−プロモーターの後方
で発現プラスミドのポリリンカーｐＪＦ１１８ｕ（Ｇｅ
ｎｅ　　第４８巻、第１１９〜１３１頁、１９８６年；
ｐｋｋ２２３の誘導体、これはＦａ．Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社、フライブルグにおいて得られる）中でクローン化
する。このプロモーターはｌａｃＩｑ−遺伝子生成物（
これは同様にｐＪＦ１１８ｕ上にコードされている）に
より、インデューサー、例えばラクトース又は類似の化
合物、例えばＩＰＴＧが培地に添加されるまで抑圧され
る。

【００４８】この突然変異によりＡ−１８０の多量の生
産は可能であるが、組換遺伝子生成物は１００％まで大
腸菌の細胞質中に局在し、そこで強く分解された。

【００４９】−生産されたアミラーゼＡ−１８０の培地
上澄中への搬送を達成するために、搬送に必要なシグナ
ルペプチドを形成するＡ−１８０の３７Ｎ−末端アミノ
酸を除去し、大腸菌中に搬送されたクレブシエラ・オキ
シトカからのＣＧＴアーゼのシグナルペプチド（Ｇｅｎ
ｅ、第４７巻、第２６９〜２７７頁、１９８６年）によ
り変える。この組換プラスミドをｐＥＸ１０５１と命名
する（図２）。組換遺伝子の発現は′ｔａｃ′−プロモ
ーターを介して更に行なわれた。シグナルペプチドの交
換はＡ−１８０の搬送挙動に全く変化を与えなかった。 多量に生産された酵素はなお細胞質中に存在し、強く分
解される。Ｇ５−特異性はシグナルペプチド交換にもか
かわらず保持される。

【００５０】−第３の突然変異はＡ−１８０−構造遺伝
子を３′−末端でヌクレオチド３７９２個短かくするこ
とにある。このヌクレオチドを除去し、その位置にスト
ップトリプレットを挿入することによりＣ末端でアミラ
ーゼは正確にアミノ酸１２６４個だけ短かくなる（プラ
スミドｐＥＸ２１、図２）。残ったアミラーゼ基は総Ａ
−１８０−構造遺伝子と同様にラクトース誘発により′
ｔａｃ′−プロモーターから多量に発現される。突然変
異した総アミラーゼとは異なり、生じた生成物は好適な
大腸菌株のペリプラズム又は培養上澄中に搬送される。 搬送された蛋白質は安定である、すなわち崩壊されず、
かつその酵素的特性は生成物特異性に関して安全なアミ
ラーゼＡ−１８０のそれと同じである。

【００５１】この遺伝子生成物はＧ５−生成に必要であ
るすべての要求を満たす。

【００５２】例６ 種々の大腸菌株中のアミラーゼＡ−１８０及びＡ−１８
０誘導体（Ａ−１８０Ｄ）の発現及び分泌アミラーゼＡ
−１８０又はＧ５−特異性６３ｋＤａ−Ａ−１８０−誘
導体であるＡ−１８０Ｄの発現のためには大腸菌株ＨＢ
１０１及びＷＣＭ１００を使用する。ＨＢ１０１はドイ
ツ微生物保存機関（ＤＳＭ１００７）に寄託されており
、ＷＣＭ１００はヨーロッパ特許（ＥＰ−Ａ）第３３８
４１０号明細書に記載された方法により得られる。アミ
ラーゼの発現及び分泌に関してヨーロッパ特許（ＥＰ−
Ａ）第３３８４１０号明細書中に開示された方法により
得られた他の菌株により変えられる。大腸菌株はＡ−１
８０の発現のために発現プラスミドｐＥＸ１０５１、Ａ
−１８０Ｄの発現のために発現プラスミド、分泌プラス
ミドｐＥＸ２１を含有する。培地（カゼインからのペプ
トン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　　１
０ｇ／ｌ、ラクトース５ｇ／ｌ及びアンピシリン０．１
ｇ／ｌ）１０００ｍｌを各菌株の予培地（同じ培地）２
０ｍｌで接種し、２０℃（ｐＥＸ１０５１）もしくは２
５℃（ｐＥＸ２１）で好気的に恒温保持する。４８時間
（ｐＥＸ１０５１）もしくは２４時間（ｐＥＸ２１）後
、細胞を培養液の遠心分離により採集する。

【００５３】菌株ＨＢ１０１／ｐＥＸ１０５１及びＷＣ
Ｍ１００／ｐＥＸ１０５１を使用する際に、採集した細
胞をＴＣ−緩衝液で洗浄し、培養容量の１／２００のＴ
Ｃ−緩衝液中に懸濁させ、超音波（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）
又は加圧（′ｆｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓ′）を用いて細胞
溶解する。得られた細胞溶解物をＤＮアーゼ−処理後１
０分間１００００ｘｇで遠心分離する。この遠心分離後
の上澄（以降細胞質フラクションと呼ぶ）はアミラーゼ
Ａ−１８０を含有し、デンプン変換のために直接使用す
ることができる。

【００５４】菌株ＨＢ１０１／ｐＥＸ２１を使用する際
、ペリプラズマ中に局在するアミラーゼＡ−１８０Ｄを
ＣＨＣｌ３処理により（Ａｍｅｓ等著、１９８４年、Ｊ
．Ｂａｃｔ．、第１６０巻、第１１８１〜１１８３頁）
細胞から抽出する。このためには遠心分離した細胞を１
０ｍＭ　　トリス／ＨＣｌ　　ｐＨ８．０　　５ｍｌ中
に懸濁させ、ＣＨＣｌ３　　５ｍｌと混合し、室温で１
５分間恒温保持する。次いで懸濁液をＴＣ−緩衝液４０
ｍｌで希釈し、６０００ｘｇで２０分間遠心分離する。 遠心分離後、この細胞ペレットをすてる。上澄（ペリプ
ラズマフラクション）は形成されたアミラーゼＡ−１８
０Ｄ　　６０〜７０％を含有する。ペリプラズマフラク
ション中に含有される他の蛋白質はＡ−１８０Ｄ−活性
に抑制的に作用しないので、更に精製する必要はない。

【００５５】菌株ＷＣＭ１００／ｐＥＸ２１を使用する
際に採集した細胞を捨てる。培養上澄は上記の条件下に
組換遺伝子Ａ−１８０Ｄ　　０．１〜０．５ｇを含有し
、インデューサーであるラクトースはこの時点までに完
全に使用されている。細胞不含の培養上澄を直接デンプ
ン変換に使用することができる。

【００５６】例７ 単離体１６３−２６又は大腸菌から得られたマルトペン
タオース生産性アミラーゼを用いるデンプン変換例７．
１ 単離体１６３−２６の培養上澄から精製されたアミラー
ゼＡ−１８０を用いるデンプン変換 精製したアミラーゼＡ−１８０をＴＣ−緩衝液中に５０
μｇ／ｍｌの濃度に溶かす。ＴＣ−緩衝液中の可溶性デ
ンプンの１０％溶液を温度４５℃にする。両方の溶液を
容量比１：１で混合し、４５℃で恒温保持する。１時間
後、メタノール１．５容量部を添加することにより反応
をとめる。メタノール添加により析出した非加水分解残
留デンプンを遠心分離する。溶液中に残った加水分解生
成物は′逆転相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ　　ｐｈａｓｅ）′
−カラムクロマトグラフィーにより定性的及び定量的に
検査することができる。

【００５７】酵素溶液１ｍｌ及び基質溶液１ｍｌを添加
する典型的なデンプン変換において、１時間後配合物中
に含有されるデンプンの１８．５％が加水分解される。 これから生じた生成物は次の組成を示す：Ｇ５、８２．
７％：Ｇ４、６．４％；Ｇ３、４．２％；Ｇ２、３．９
％；Ｇ１、２．８％ 例７．２ 大腸菌細胞の細胞質蛋白質フラクション中に含有される
アミラーゼＡ−１８０でのデンプン変換大腸菌ＨＢ１０
１／ｐＥＸ１０５１もしくは大腸菌ＷＣＭ１００／ｐＥ
Ｘ１０５１の細胞質蛋白質フラクションを例６に記載し
たように製造する。蛋白質の濃度をＴＣ−緩衝液で２ｍ
ｇ／ｍｌに調節する。３０％ノレデュクス１５０Ｂ−溶
液（ＴＣ−緩衝液中）３５ｍｌを４５℃で平衡状態にす
る。ノレデュクス１５０Ｂはヘンケル社の酸処理により
部分的に加水分解されたデンプンである。次いで、基質
を蛋白質溶液（２ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌと混合し、４５℃
で恒温保持する。１，２，３及び４時間後に、それぞれ
配合物４ｍｌを取り出し、メタノール６ｍｌと混合し、
遠心分離する。それぞれの上澄中の溶解性生成物の定性
的及び定量的組成をＨＰＬＣ−分析により調べる。大腸
菌ＨＢ１０１／ｐＥＸ１０５１もしくは大腸菌ＷＣＭ１
００／ｐＥＸ１０５１の細胞質蛋白質中に含有されるア
ミラーゼＡ−１８０を用いる典型的デンプン変換の結果
を次表に示す： 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
ｈ　　　　　　　　　　２ｈ　　　　　　　　３ｈ　　
　　　　　　　　４ｈ加水分解された基質分：１２．１
％　　　　１９．９％　　　　２４．９５％　　　　３
１．１％生成物組成： マルトペンタオース：１００％　　　　　　　７９％　
　　　　　　７２％　　　　　　　　　６４％マルトテ
トラオース：　　　　０％　　　　　　　　　８．５％
　　　　１０．４％　　　　　　１２．２％マルトトリ
オース　　：　　　　０％　　　　　　　　　７．５％
　　　　１０．４％　　　　　　１１．６％マルトース
　　　　　　　　：　　　　０％　　　　　　　　　５
％　　　　　　　　　６．２％　　　　　　　　７．４
％グルコース　　　　　　　　：　　　　０％　　　　
　　　　　０％　　　　　　　　　１．０％　　　　　
　　　４．８％例７．３大腸菌ＨＢ１０１／ｐＥＸ２１
のペリプラズマフラクション中に含有されるアミラーゼ
Ａ−１８０Ｄを用いるデンプン変換１０％ノレデュクス
１５０Ｂ−溶液９５ｍｌを４５℃で平衡状態とする。次
いで、この溶液を大腸菌ＨＢ１０１／ｐＥＸ２１のペリ
プラズマフラクション（例６参照）５ｍｌと混合し、４
５℃で恒温保持する。１時間後、この反応をメタノール
１５０ｍｌを添加することにより終止する。この配合物
を遠心分離し、引き続き上澄中の生成物組成をＨＰＬＣ
−分析により測定する。１時間後、記載した条件下に使
用した基質の３８．４％が加水分解されている。生じた
生成物は次の組成を示す：Ｇ５、６７．７％；Ｇ４、１
１．１％；Ｇ３、１．７％；Ｇ２、８．７％；Ｇ１、１
０．８％。

【００５８】例７．４ 大腸菌ＷＣＭ１００／ｐＥＸ２１の培養上澄中に含有さ
れるアミラーゼＡ−１８０Ｄを用いるデンプン変換１０
％ノレデュクス１５０Ｂ−溶液７５ｍｌを４５℃で平衡
状態にする。次いで、この溶液を大腸菌ＷＣＭ１００／
ｐＥＸ２１の培養上澄（例６参照）２５ｍｌと混合し、
４５℃で恒温保持する。１時間後、メタノール１５０ｍ
ｌを添加することによりこの反応を終止させる。この配
合物を遠心分離し；引き続き上澄中の生成物組成をＨＰ
ＬＣ−分析により測定する。

【００５９】１時間後、使用した基質の１５．８％が利
用されていた。生成物組成は次の通りであった：マルト
ペンタオース　　　　９１．３％マルトテトラオース　
　　　　　５．４％マルトトリオース　　　　　　　　
１．２％マルトース　　　　　　　　　　　　　　０．
９％グルコース　　　　　　　　　　　　　　０．９％

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＡＣＡ１の概略図である。

【図２】ベクターｐＡＣ中にクローン化された単離体１
６３−２６からのＤＮＡフラグメント（ｐＡＣＡ１）の
制限地図、並びに発現プラスミドｐＥＸ１０５１及びｐ
ＥＸ２１に導びく突然変異を示す概略図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　マルトペンタオース生産性アミラーゼ
   Ａ−１８０
2. 【請求項２】　　請求項１によるアミラーゼをコードす
   る遺伝子を増強された発現及び／又は分泌に関して修飾
   し、かつ好適な原核生物中で発現させるか、もしくは発
   現させ、かつ分泌させることを特徴とするマルトペンタ
   オース生産性アミラーゼの製法。
3. 【請求項３】　　ａ）　　請求項１によるアミラーゼの
   遺伝子をベクター中に制御可能なプロモーターの調節下
   に配置し、 ｂ）　　この遺伝子のはじめの１１１個のコードする塩
   基をクレブシラ・オキシトカからのＣＧＴアーゼのシグ
   ナルペプチドのＤＮＡ−配列により替え、ｃ）　　この
   遺伝子の３′−末端でヌクレオチド３７９２個を欠失さ
   せ、かつそこに終止トリプレットを組込み、ｄ）　　こ
   のように修飾された遺伝子を好適な原核生物中で発現さ
   せ、かつ分泌させることにより得られるマルトペンタオ
   ース生産性アミラーゼ。
4. 【請求項４】　　請求項１によるアミラーゼをコードす
   る遺伝子が増強された発現及び／又は分泌に関して修飾
   されていることを特徴とするマルトペンタオース生産性
   アミラーゼをコードするＤＮＡ構造体。
5. 【請求項５】　　好アルカリ単離体１６３−２６（ＤＳ
   Ｍ５８５３）。