JPH0740937B2 - β−アミラーゼの分離法 - Google Patents
β−アミラーゼの分離法Info
- Publication number
- JPH0740937B2 JPH0740937B2 JP4056052A JP5605292A JPH0740937B2 JP H0740937 B2 JPH0740937 B2 JP H0740937B2 JP 4056052 A JP4056052 A JP 4056052A JP 5605292 A JP5605292 A JP 5605292A JP H0740937 B2 JPH0740937 B2 JP H0740937B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- cyclodextrin
- sepharose
- adsorbed
- ammonium sulfate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3814—Affinity chromatography of the substrate or co-factor - enzyme type
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】β−アミラーゼは、大豆，小麦，
大麦，さつまいも等の植物やバチルス(Bacillus)属，ク
ロストリジウム(Clostridium) 属等の微生物に存在して
いることが知られている。これらの中で大豆，小麦，大
麦から調製されたβ−アミラーゼは、α−１，４−グル
カンからマルトースを生成する性質を生かして澱粉糖化
工業でマルトースシラップ製造のため広く使用されてい
る。
大麦，さつまいも等の植物やバチルス(Bacillus)属，ク
ロストリジウム(Clostridium) 属等の微生物に存在して
いることが知られている。これらの中で大豆，小麦，大
麦から調製されたβ−アミラーゼは、α−１，４−グル
カンからマルトースを生成する性質を生かして澱粉糖化
工業でマルトースシラップ製造のため広く使用されてい
る。
【０００２】
【従来の技術】大豆，小麦，大麦等の中にはβ−アミラ
ーゼの他にα−アミラーゼが含まれている。そこで、こ
のα−アミラーゼを除くため、従来からｐＨ，温度変
化，キレート化剤によるα−アミラーゼの失活法等が用
いられてきた。しかしながら、本方法でα−アミラーゼ
を完全に除去しようとした場合、β−アミラーゼの失活
もともなうため、収率を考えると、完全にα−アミラー
ゼを除くことは困難であった。
ーゼの他にα−アミラーゼが含まれている。そこで、こ
のα−アミラーゼを除くため、従来からｐＨ，温度変
化，キレート化剤によるα−アミラーゼの失活法等が用
いられてきた。しかしながら、本方法でα−アミラーゼ
を完全に除去しようとした場合、β−アミラーゼの失活
もともなうため、収率を考えると、完全にα−アミラー
ゼを除くことは困難であった。
【０００３】一方、澱粉糖化工業においても、マルトー
スシラップの高純度化が進み、α−アミラーゼの混入に
よるマルトース以外の糖の生成がほとんどない高純度の
β−アミラーゼが要求されるようになっている。
スシラップの高純度化が進み、α−アミラーゼの混入に
よるマルトース以外の糖の生成がほとんどない高純度の
β−アミラーゼが要求されるようになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】酵素タンパク質の迅速
で特異的精製法としてアフィニティークロマトグラフィ
ーがある。本方法は目的とする酵素のみを、その基質あ
るいは基質類似物質を固定化した不溶性担体に目的物質
を特異的に吸着させることにより可溶性の夾雑物を除
き、目的とする物質のみを特異的かつ迅速に分離、精製
する方法である。
で特異的精製法としてアフィニティークロマトグラフィ
ーがある。本方法は目的とする酵素のみを、その基質あ
るいは基質類似物質を固定化した不溶性担体に目的物質
を特異的に吸着させることにより可溶性の夾雑物を除
き、目的とする物質のみを特異的かつ迅速に分離、精製
する方法である。
【０００５】β−アミラーゼのアフィニティークロマト
グラフィーについても既にいくつか報告がある。例え
ば、Per Vretblad(FEBS Letters,47(1974)86-89)はβ−
アミラーゼの拮抗阻害剤であるα−シクロデキストリン
を固定化したセファロースカラムにさつまいものβ−ア
ミラーゼが特異的に吸着され、その際夾雑蛋白質のモデ
ルとして同時に加えた牛血清アルブミンは本カラムには
吸着せず除去できること、またα−シクロデキストリン
を溶出液に加えることにより、吸着したβ−アミラーゼ
をカラムから特異的に溶出できることを報告している。
また、A. Hoschkeら(Starch,28(1976), 426-432)も起源
は明記されていないが、β−アミラーゼがα−シクロデ
キストリンを固定化したセファロースカラムに吸着する
ことを報告している。
グラフィーについても既にいくつか報告がある。例え
ば、Per Vretblad(FEBS Letters,47(1974)86-89)はβ−
アミラーゼの拮抗阻害剤であるα−シクロデキストリン
を固定化したセファロースカラムにさつまいものβ−ア
ミラーゼが特異的に吸着され、その際夾雑蛋白質のモデ
ルとして同時に加えた牛血清アルブミンは本カラムには
吸着せず除去できること、またα−シクロデキストリン
を溶出液に加えることにより、吸着したβ−アミラーゼ
をカラムから特異的に溶出できることを報告している。
また、A. Hoschkeら(Starch,28(1976), 426-432)も起源
は明記されていないが、β−アミラーゼがα−シクロデ
キストリンを固定化したセファロースカラムに吸着する
ことを報告している。
【０００６】しかしながら、最近K. Subbaramiahら(Sta
rch, 41,(1989)357-359)は、先に述べたPer Vretblad(F
EBS Letters,47,1974)と同様の方法でα−シクロデキス
トリンを固定化したセファロースを調製したところ、さ
つまいも，ジャガイモ，麦芽由来のβ−アミラーゼがい
ずれも吸着しないという異なった報告をしている。
rch, 41,(1989)357-359)は、先に述べたPer Vretblad(F
EBS Letters,47,1974)と同様の方法でα−シクロデキス
トリンを固定化したセファロースを調製したところ、さ
つまいも，ジャガイモ，麦芽由来のβ−アミラーゼがい
ずれも吸着しないという異なった報告をしている。
【０００７】そこで、我々もPer Vretblad(FEBS Letter
s,47,1974)の報告に従いα−シクロデキストリンを固定
化したセファロースカラムを調製し試験したところ、澱
粉糖化工業で重要な役割を担っている大豆及び麦芽由来
のβ−アミラーゼは本担体に吸着しなかった。そして現
在のところ、大豆及び麦芽由来のβ−アミラーゼの特異
的アフィニティークロマトグラフィーに関する報告はな
いのが現状である。
s,47,1974)の報告に従いα−シクロデキストリンを固定
化したセファロースカラムを調製し試験したところ、澱
粉糖化工業で重要な役割を担っている大豆及び麦芽由来
のβ−アミラーゼは本担体に吸着しなかった。そして現
在のところ、大豆及び麦芽由来のβ−アミラーゼの特異
的アフィニティークロマトグラフィーに関する報告はな
いのが現状である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前述したような条件の中
で本発明者らは、澱粉糖化工業で重要な役割を担ってい
る大豆及び麦芽由来のβ−アミラーゼを吸着させるアフ
ィニティークロマトグラフィーについて鋭意検討した結
果、緩衝液等では吸着しないこれらβ−アミラーゼが、
硫酸アンモニウムを溶液に添加することにより、効率的
にα−シクロデキストリンを固定化した担体に吸着する
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
で本発明者らは、澱粉糖化工業で重要な役割を担ってい
る大豆及び麦芽由来のβ−アミラーゼを吸着させるアフ
ィニティークロマトグラフィーについて鋭意検討した結
果、緩衝液等では吸着しないこれらβ−アミラーゼが、
硫酸アンモニウムを溶液に添加することにより、効率的
にα−シクロデキストリンを固定化した担体に吸着する
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、β−アミラーゼを含有
する溶液中よりβ−アミラーゼを分離するに当たり、硫
酸アンモニウムの存在下にα−シクロデキストリンを固
定した水不溶性高分子化合物を作用させ、該高分子化合
物とβ−アミラーゼとの吸着複合体を生じせしめ、該高
分子化合物に吸着しない可溶性の不純物を分離、除去す
ることを特徴とするβ−アミラーゼの分離法に関する。
する溶液中よりβ−アミラーゼを分離するに当たり、硫
酸アンモニウムの存在下にα−シクロデキストリンを固
定した水不溶性高分子化合物を作用させ、該高分子化合
物とβ−アミラーゼとの吸着複合体を生じせしめ、該高
分子化合物に吸着しない可溶性の不純物を分離、除去す
ることを特徴とするβ−アミラーゼの分離法に関する。
【００１０】本発明のβ−アミラーゼの分離法は、β−
アミラーゼをα−シクロデキストリンを固定した担体に
吸着させるに際し、硫酸アンモニウムの存在下に反応さ
せることを特徴とする。一方、α−アミラーゼのアフィ
ニティークロマトグラフィーに関しては、エタノール等
の有機溶媒や、塩析効果のある数種の塩類の添加で澱粉
に効率的に吸着することが知られているが、本発明にお
いて効果があるのは硫酸アンモニウムだけであり、この
ような事実は今までに報告されていない。
アミラーゼをα−シクロデキストリンを固定した担体に
吸着させるに際し、硫酸アンモニウムの存在下に反応さ
せることを特徴とする。一方、α−アミラーゼのアフィ
ニティークロマトグラフィーに関しては、エタノール等
の有機溶媒や、塩析効果のある数種の塩類の添加で澱粉
に効率的に吸着することが知られているが、本発明にお
いて効果があるのは硫酸アンモニウムだけであり、この
ような事実は今までに報告されていない。
【００１１】以下、本発明の好ましい態様を挙げて具体
的に説明する。本発明のβ−アミラーゼの分離の手段で
あるアフィニティークロマトグラフィーにおいてβ−ア
ミラーゼが吸着するリガンドは、β−アミラーゼの拮抗
阻害剤であるα−シクロデキストリンを使用する。α−
シクロデキストリンを固定化するために用いる担体とし
ては特に制限はなく、任意の水不溶性高分子化合物が使
用され、例えばアガロースゲル等は好適である。その他
シクロデキストリンポリマーのようにシクロデキストリ
ン自身を架橋させたものを不溶性担体としてもよい。
的に説明する。本発明のβ−アミラーゼの分離の手段で
あるアフィニティークロマトグラフィーにおいてβ−ア
ミラーゼが吸着するリガンドは、β−アミラーゼの拮抗
阻害剤であるα−シクロデキストリンを使用する。α−
シクロデキストリンを固定化するために用いる担体とし
ては特に制限はなく、任意の水不溶性高分子化合物が使
用され、例えばアガロースゲル等は好適である。その他
シクロデキストリンポリマーのようにシクロデキストリ
ン自身を架橋させたものを不溶性担体としてもよい。
【００１２】β−アミラーゼを吸着させる際に使用する
硫酸アンモニウムの濃度は、溶液中の蛋白質が塩析しな
い範囲で濃度が高ければ高いほど効果的であるが、通常
0.５Ｍ以上、更に好ましくは１Ｍ以上が望ましい。しか
し、２Ｍを越えると酵素液の種類によってはタンパク質
が析出することがあるので、硫酸アンモニウムの濃度の
上限は、実用に際しタンパク質の析出が認められない程
度に濃度（一般に２Ｍ程度）を高くすればよい。また、
吸着方法に関しては、制限がなくバッチ法でもカラム法
でもよい。吸着した酵素の溶出法に関しては、硫酸アン
モニウムを含まない適当な溶液で行えば十分であるが、
α−シクロデキストリンを含む溶液で溶出してもよい。
硫酸アンモニウムの濃度は、溶液中の蛋白質が塩析しな
い範囲で濃度が高ければ高いほど効果的であるが、通常
0.５Ｍ以上、更に好ましくは１Ｍ以上が望ましい。しか
し、２Ｍを越えると酵素液の種類によってはタンパク質
が析出することがあるので、硫酸アンモニウムの濃度の
上限は、実用に際しタンパク質の析出が認められない程
度に濃度（一般に２Ｍ程度）を高くすればよい。また、
吸着方法に関しては、制限がなくバッチ法でもカラム法
でもよい。吸着した酵素の溶出法に関しては、硫酸アン
モニウムを含まない適当な溶液で行えば十分であるが、
α−シクロデキストリンを含む溶液で溶出してもよい。
【００１３】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより何ら制限を受けるも
のではない。 製造例１ α−シクロデキストリンの担体への固定化 α−シクロデキストリンを固定化する担体としては、種
々のものが考えられるが、ここでは吸着に関する担体の
影響をできるだけ減らすため、親水性の高分子担体であ
るアガロースゲル（商品名：セファロース、ファルマシ
ア製）を使用した。固定化は、次のように行った。エポ
キシ活性化セファロース（ファルマシア製）４ｇを２５
ｍｌの水中に懸濁して膨潤させた後、４００ｍｌの水を
用いて膨潤・吸引濾過を繰り返して行い、最後に0.１Ｍ
ＮａＯＨ２５ｍｌで洗った。α−シクロデキストリン
３００ｍｇを0.１Ｍ ＮａＯＨ１２ｍｌに溶解した溶液
に先の洗浄活性化担体を加え、４５℃で１６時間振とう
した。反応終了後、濾過して吸着体を水１００ｍｌ，2.
５％グルコース溶液２００ｍｌ，水１００ｍｌ，0.５Ｍ
ＮａＣｌ含有0.１Ｍ ほう酸緩衝液（ｐＨ8.０）１０
０ｍｌおよび0.５ＭＮａＣｌ含有0.１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ4.０）１００ｍｌを用いて順次洗浄してα−シク
ロデキストリンセファロースを調製した。
説明するが、本発明はこれらにより何ら制限を受けるも
のではない。 製造例１ α−シクロデキストリンの担体への固定化 α−シクロデキストリンを固定化する担体としては、種
々のものが考えられるが、ここでは吸着に関する担体の
影響をできるだけ減らすため、親水性の高分子担体であ
るアガロースゲル（商品名：セファロース、ファルマシ
ア製）を使用した。固定化は、次のように行った。エポ
キシ活性化セファロース（ファルマシア製）４ｇを２５
ｍｌの水中に懸濁して膨潤させた後、４００ｍｌの水を
用いて膨潤・吸引濾過を繰り返して行い、最後に0.１Ｍ
ＮａＯＨ２５ｍｌで洗った。α−シクロデキストリン
３００ｍｇを0.１Ｍ ＮａＯＨ１２ｍｌに溶解した溶液
に先の洗浄活性化担体を加え、４５℃で１６時間振とう
した。反応終了後、濾過して吸着体を水１００ｍｌ，2.
５％グルコース溶液２００ｍｌ，水１００ｍｌ，0.５Ｍ
ＮａＣｌ含有0.１Ｍ ほう酸緩衝液（ｐＨ8.０）１０
０ｍｌおよび0.５ＭＮａＣｌ含有0.１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ4.０）１００ｍｌを用いて順次洗浄してα−シク
ロデキストリンセファロースを調製した。
【００１４】実施例１ 大豆β−アミラーゼのα−シク
ロデキストリンセファロースへの各種溶液からの吸着 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを表１
に示す溶液で平衡化した後、脱脂大豆から抽出したβ−
アミラーゼ粗酵素品５００単位を含む３ｍｌの溶液（α
−シクロデキストリンセファロースの平衡化に使用した
溶液）を加え、低温室（４℃）で１時間振とうし、β−
アミラーゼをα−シクロデキストリンセファロースにバ
ッチ法で吸着させた。
ロデキストリンセファロースへの各種溶液からの吸着 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを表１
に示す溶液で平衡化した後、脱脂大豆から抽出したβ−
アミラーゼ粗酵素品５００単位を含む３ｍｌの溶液（α
−シクロデキストリンセファロースの平衡化に使用した
溶液）を加え、低温室（４℃）で１時間振とうし、β−
アミラーゼをα−シクロデキストリンセファロースにバ
ッチ法で吸着させた。
【００１５】その後、未吸着部分を同溶液にて洗い流し
た後、５０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ5.７を加え３０分振と
うし吸着酵素を溶出した。次いで、その画分の活性を測
定することにより１ｍｌ容のα−サイクロデキストリン
セファロースへのβ−アミラーゼの吸着活性単位を求め
た。なお、吸着時におけるそれぞれの種類の塩濃度が異
なるのは、塩類の溶解度を考慮したためである。活性測
定は、可溶性澱粉を基質として、５０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ5.７）中で行い、３７℃、１分間に１マイクロモ
ルのマルトースを生成する量を１単位（Ｕ）と定義し
た。結果を表１に示す。
た後、５０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ5.７を加え３０分振と
うし吸着酵素を溶出した。次いで、その画分の活性を測
定することにより１ｍｌ容のα−サイクロデキストリン
セファロースへのβ−アミラーゼの吸着活性単位を求め
た。なお、吸着時におけるそれぞれの種類の塩濃度が異
なるのは、塩類の溶解度を考慮したためである。活性測
定は、可溶性澱粉を基質として、５０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ5.７）中で行い、３７℃、１分間に１マイクロモ
ルのマルトースを生成する量を１単位（Ｕ）と定義し
た。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】表１より、硫酸アンモニウム以外の塩溶
液，アルコールを含む緩衝液または緩衝液のみではシク
ロデキストリンを固定化したセファロースに大豆β−ア
ミーラゼはほとんど吸着しないことが判る。そのため、
硫酸アンモニウム溶液下で吸着させたβ−アミーラゼは
硫酸アンモニウムを除くことによって簡単に固定化担体
から溶出することができる。また、α−シクロデキスト
リンと１Ｍ 硫酸アンモニウムを含む緩衝液中ではシク
ロデキストリンを固定化したセファロースに大豆β−ア
ミーラゼは吸着しないことから、担体ではなくα−シク
ロデキストリンに対する親和性で大豆β−アミーラゼが
吸着していることが判る。
液，アルコールを含む緩衝液または緩衝液のみではシク
ロデキストリンを固定化したセファロースに大豆β−ア
ミーラゼはほとんど吸着しないことが判る。そのため、
硫酸アンモニウム溶液下で吸着させたβ−アミーラゼは
硫酸アンモニウムを除くことによって簡単に固定化担体
から溶出することができる。また、α−シクロデキスト
リンと１Ｍ 硫酸アンモニウムを含む緩衝液中ではシク
ロデキストリンを固定化したセファロースに大豆β−ア
ミーラゼは吸着しないことから、担体ではなくα−シク
ロデキストリンに対する親和性で大豆β−アミーラゼが
吸着していることが判る。
【００１８】実施例２ 麦芽由来およびさつまいも由来
のβ−アミラーゼのα−シクロデキストリンセファロー
スへの吸着 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを１Ｍ
硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液とこれ
を含まない５０ｍＭ 酢酸緩衝液でそれぞれ平衡化し
た。それぞれに、麦芽から抽出したβ−アミラーゼ粗酵
素標品またはさつまいものβ−アミラーゼ結晶標品（Ｓ
ｉｇｍａ社製のものを脱塩）５００単位を含む３ｍｌの
溶液（α−シクロデキストリンセファロースの平衡化に
使用した溶液）を加え、低温室で１時間振とうしβ−ア
ミラーゼをα−サイクロデキストリンセファロースに吸
着させた。
のβ−アミラーゼのα−シクロデキストリンセファロー
スへの吸着 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを１Ｍ
硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液とこれ
を含まない５０ｍＭ 酢酸緩衝液でそれぞれ平衡化し
た。それぞれに、麦芽から抽出したβ−アミラーゼ粗酵
素標品またはさつまいものβ−アミラーゼ結晶標品（Ｓ
ｉｇｍａ社製のものを脱塩）５００単位を含む３ｍｌの
溶液（α−シクロデキストリンセファロースの平衡化に
使用した溶液）を加え、低温室で１時間振とうしβ−ア
ミラーゼをα−サイクロデキストリンセファロースに吸
着させた。
【００１９】その後、未吸着部分を同溶液にて洗い流し
た後、１％（Ｗ／Ｖ）シクロデキストリンを含む５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液を加え、３０分振とうし吸着酵素を溶出
し、その画分の活性を測定することにより１ｍｌ容のα
−シクロデキストリンセファロースへの結合活性単位を
求めた。活性測定は、可溶性澱粉を基質として、５０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液中で行い、３７℃、１分間に１マイクロ
モルのマルトースを生成する量を１単位と定義した。な
お、麦芽のβ−アミラーゼの場合に使用した緩衝液はす
べてｐＨ5.２であり、さつまいもの場合はｐＨ4.８であ
る。結果を表２に示す。
た後、１％（Ｗ／Ｖ）シクロデキストリンを含む５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液を加え、３０分振とうし吸着酵素を溶出
し、その画分の活性を測定することにより１ｍｌ容のα
−シクロデキストリンセファロースへの結合活性単位を
求めた。活性測定は、可溶性澱粉を基質として、５０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液中で行い、３７℃、１分間に１マイクロ
モルのマルトースを生成する量を１単位と定義した。な
お、麦芽のβ−アミラーゼの場合に使用した緩衝液はす
べてｐＨ5.２であり、さつまいもの場合はｐＨ4.８であ
る。結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２により、麦芽のβ−アミラーゼも大豆
のβ−アミラーゼと同様に１Ｍの硫酸アンモニウム無し
では吸着しないことが判る。また、さつまいものβ−ア
ミラーゼはPer Vretblad(FEBS Letters, 47(1974)86-8
9) の報告しているように、緩衝液のみでも吸着する
が、１Ｍの硫酸アンモニウム中では更に効果的に吸着す
ることが判る。
のβ−アミラーゼと同様に１Ｍの硫酸アンモニウム無し
では吸着しないことが判る。また、さつまいものβ−ア
ミラーゼはPer Vretblad(FEBS Letters, 47(1974)86-8
9) の報告しているように、緩衝液のみでも吸着する
が、１Ｍの硫酸アンモニウム中では更に効果的に吸着す
ることが判る。
【００２２】実施例３ 大豆β−アミラーゼのα−シク
ロデキストリンセファロースへの吸着に対する硫酸アン
モニウム濃度の効果 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを表３
に示す溶液で平衡化した後、脱脂大豆から抽出したβ−
アミラーゼ粗酵素標品５００単位を含む３ｍｌの溶液
（α−シクロデキストリンセファロースの平衡化に使用
した溶液）を加え、低温室で１時間振とうしβ−アミラ
ーゼをα−サイクロデキストリンセファロースに吸着さ
せた。その後、未吸着部分を同じ溶液にて洗い流した
後、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.７）を加え、３０分振
とうし吸着酵素を溶出した。次に、その画分の活性を測
定することにより１ｍｌ容のα−シクロデキストリンセ
ファロースへの結合活性単位を求めた。活性測定は、実
施例１に準じて行った。その結果を表３に示す。
ロデキストリンセファロースへの吸着に対する硫酸アン
モニウム濃度の効果 １ｍｌ容のα−シクロデキストリンセファロースを表３
に示す溶液で平衡化した後、脱脂大豆から抽出したβ−
アミラーゼ粗酵素標品５００単位を含む３ｍｌの溶液
（α−シクロデキストリンセファロースの平衡化に使用
した溶液）を加え、低温室で１時間振とうしβ−アミラ
ーゼをα−サイクロデキストリンセファロースに吸着さ
せた。その後、未吸着部分を同じ溶液にて洗い流した
後、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.７）を加え、３０分振
とうし吸着酵素を溶出した。次に、その画分の活性を測
定することにより１ｍｌ容のα−シクロデキストリンセ
ファロースへの結合活性単位を求めた。活性測定は、実
施例１に準じて行った。その結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
【００２４】表３より、硫酸アンモニウムの濃度が高い
ほど吸着効率は高くなり、少なくとも0.５Ｍ以上、更に
好ましくは1.０Ｍ以上が吸着のために適当である。上限
については、2.０Ｍ以上においても吸着率は高まると思
われるが、粗酵素液の種類によってはタンパク質が析出
し沈澱するので注意を要する。
ほど吸着効率は高くなり、少なくとも0.５Ｍ以上、更に
好ましくは1.０Ｍ以上が吸着のために適当である。上限
については、2.０Ｍ以上においても吸着率は高まると思
われるが、粗酵素液の種類によってはタンパク質が析出
し沈澱するので注意を要する。
【００２５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、β−アミラーゼ
を含む混合物溶液から澱粉糖化産業上利用価値の高い高
純度のβ−アミラーゼを特異的に効率よく分離すること
ができる。
を含む混合物溶液から澱粉糖化産業上利用価値の高い高
純度のβ−アミラーゼを特異的に効率よく分離すること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:145）
Claims (2)
- 【請求項１】 β−アミラーゼを含有する溶液中よりβ
−アミラーゼを分離するに当たり、硫酸アンモニウムの
存在下にα−シクロデキストリンを固定した水不溶性高
分子化合物を作用させ、該高分子化合物とβ−アミラー
ゼとの吸着複合体を生じせしめ、該高分子化合物に吸着
しない可溶性の不純物を分離、除去することを特徴とす
るβ−アミラーゼの分離法。 - 【請求項２】 硫酸アンモニウムの濃度が0.５〜2.０Ｍ
である請求項１記載のアミラーゼの分離法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4056052A JPH0740937B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | β−アミラーゼの分離法 |
| US07/974,178 US5294341A (en) | 1992-02-07 | 1992-11-10 | Method for separation of β-amylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4056052A JPH0740937B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | β−アミラーゼの分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197757A JPH06197757A (ja) | 1994-07-19 |
| JPH0740937B2 true JPH0740937B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=13016315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4056052A Expired - Lifetime JPH0740937B2 (ja) | 1992-02-07 | 1992-02-07 | β−アミラーゼの分離法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5294341A (ja) |
| JP (1) | JPH0740937B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6017458A (en) | 1997-08-27 | 2000-01-25 | National University Of Singapore | Separating materials for chromatography and electrophoresis applications comprising regiodefined functionalised cyclodextrins chemically bonded to a support via urethane functionalities |
| ATE222983T1 (de) | 2000-03-07 | 2002-09-15 | E F P Floor Prod Fussboeden | Mechanische verbindung von paneelen |
| FI109358B (fi) * | 2001-02-06 | 2002-07-15 | Danisco Sugar Oy | Menetelmä entsyymin uuttamiseksi |
| JP4570067B2 (ja) * | 2003-07-31 | 2010-10-27 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | β−アミラーゼの製造方法 |
| US7785108B2 (en) * | 2004-06-21 | 2010-08-31 | Innovation Tap Inc. | Denture attachment system |
| FR2943686B1 (fr) * | 2009-03-30 | 2013-11-01 | Roquette Freres | Procede d'obtention d'une preparation de beta-amylases a partir des fractions solubles de plantes amidonnieres |
| CN110316935B (zh) * | 2019-07-19 | 2022-03-08 | 清远市清新区谷城矿业开发投资有限公司 | 一种废泥处理方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4539399A (en) * | 1984-07-27 | 1985-09-03 | Advanced Separation Technologies Inc. | Bonded phase material for chromatographic separations |
| JPS6327502A (ja) * | 1986-07-22 | 1988-02-05 | Agency Of Ind Science & Technol | シクロデキストリン−シリカ複合体及びその製造方法 |
| US4867884A (en) * | 1988-02-24 | 1989-09-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Separation of cyclodextrins by affinity chromatography |
| DE4006923A1 (de) * | 1990-03-06 | 1991-09-12 | Merck Patent Gmbh | Trennmaterialien fuer die chromatographie |
| US5080795A (en) * | 1990-05-23 | 1992-01-14 | Research Corporation Technologies, Inc. | Supported chiral liquid membrane for the separation of enantiomers |
| DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
| US5190663A (en) * | 1992-04-16 | 1993-03-02 | Chevron Research And Technology Company | Process for purifying waste water streams by inclusion complexation of polynuclear aromatic hydrocarbons |
-
1992
- 1992-02-07 JP JP4056052A patent/JPH0740937B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-10 US US07/974,178 patent/US5294341A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5294341A (en) | 1994-03-15 |
| JPH06197757A (ja) | 1994-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cuatrecasas et al. | Selective enzyme purification by affinity chromatography. | |
| Wilchek et al. | Affinity Chromatography of Bovine Pancratic Ribonuclease A | |
| US4257938A (en) | Purification method of human fibroblast interferon | |
| KR940005581B1 (ko) | 효소의 고정화방법 및 고정화 효소 | |
| JPH0740937B2 (ja) | β−アミラーゼの分離法 | |
| JPS58219124A (ja) | ヒト上皮細胞増殖因子の製造法 | |
| JP2008517046A5 (ja) | ||
| US4259448A (en) | Protein adsorbent and process for the purification of urokinase | |
| US4708944A (en) | Protease adsorbent and process for purifying TPA utilizing the same | |
| US4146432A (en) | Immobilized proteases | |
| JPH0223158B2 (ja) | ||
| US2594356A (en) | Isolation of alpha-amylase from malt extract | |
| US4610965A (en) | Adsorption-desorption purification of glucose isomerase | |
| Cuatrecasas | Functional purification of proteins and peptides by affinity chromatography | |
| KR830002846B1 (ko) | 덱스트로오스를 함유하는 시럽 제조방법 | |
| JPS596883A (ja) | 人尿カリクレインの濃縮精製法 | |
| JPH0260316B2 (ja) | ||
| JP2659086B2 (ja) | 高純度糖質関連酵素および固定化糖質関連酵素の製造方法 | |
| WO1988001294A1 (en) | Process for separating single-strand tpa and double-strand tpa from each other | |
| JPS63132898A (ja) | 蛋白質の分離精製方法 | |
| JPS5929200B2 (ja) | 水不溶性タンニン製剤の製法 | |
| Cherkasov | Affinity chromatography of enzymes | |
| JPH01180451A (ja) | アフィニティー分離用吸着体 | |
| JPH0117410B2 (ja) | ||
| US4307228A (en) | Protein adsorbent and process for the purification of urokinase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |