JPS61282073A - 新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法 - Google Patents
新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS61282073A JPS61282073A JP60122669A JP12266985A JPS61282073A JP S61282073 A JPS61282073 A JP S61282073A JP 60122669 A JP60122669 A JP 60122669A JP 12266985 A JP12266985 A JP 12266985A JP S61282073 A JPS61282073 A JP S61282073A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- starch
- recombinant plasmid
- stable
- genus escherichia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規アミラーゼおよび組み換えプラスミドによ
る製造法に関する。デンプンの糖化は一般に液化型アミ
ラーゼ（例えばα−アミラーゼ）と糖化型アミラーゼ（
例えばグルコアミラーゼ）を使用するが、液化型アミラ
ーゼが細菌由来の耐熱性であるのに対し、現在広く使用
されている糖化型アミラーゼは糸状菌由来のものであり
、耐熱性が低く、実用的な見地からさらに改善が必要で
ある。
る製造法に関する。デンプンの糖化は一般に液化型アミ
ラーゼ（例えばα−アミラーゼ）と糖化型アミラーゼ（
例えばグルコアミラーゼ）を使用するが、液化型アミラ
ーゼが細菌由来の耐熱性であるのに対し、現在広く使用
されている糖化型アミラーゼは糸状菌由来のものであり
、耐熱性が低く、実用的な見地からさらに改善が必要で
ある。
本発明者らはかかる技術的課題を解決すべく、好熱性細
菌の生産するデンプン糖化酵素について検討を重ねた結
果、バチルス・ステアロサーモフ−（／Ｌ／ス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓぶμ工則肛μ狽匡国し）の１菌種が、耐
熱性の優れた糖化型アミラーゼ蛋白のコードされた遺伝
子を有することを発見した。この遺伝子はバチルス・ス
テアロサーモフィルスにおいてほとんど発現じないよう
に制御を受けているものの、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属細菌へ導入すると、強く発現して耐熱
性糖化型アミラーゼ蛋白が生合成される。本耐熱性アミ
ラーゼはデンプンを基質として反応せしめた際、グルコ
ースおよびマルトースのみを生成することから糖化型ア
ミラーゼとしての特性を有しているだけでなく、マルト
トリオース以上のオリゴ糖に対しても有効に作用し、グ
ルコースおよびマルトースにまで分解することを見出し
た。バチルス・ステアロサーモフィルスが耐熱性アミラ
ーゼを生産することはよく知られている（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、 ４６ （５） １０５９〜ｌ Ｏ
６５（１９８３））。しかし多くの場合、液化型のアミ
ラーゼであり、糖化型のアミラー、ゼはほとんど知られ
ていない。本発明のアミラーゼは耐熱性で、かつデンプ
ンをグルコースとマルトースにまで分解できる糖化型ア
ミラーゼであり、従来知られているアミラーゼとは明ら
かに異なる。さらに、遺伝子組み換え技術を用いること
によって本発明の新規アミラーゼをエシェリシア属細菌
で大量に生産することに成功した。
菌の生産するデンプン糖化酵素について検討を重ねた結
果、バチルス・ステアロサーモフ−（／Ｌ／ス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓぶμ工則肛μ狽匡国し）の１菌種が、耐
熱性の優れた糖化型アミラーゼ蛋白のコードされた遺伝
子を有することを発見した。この遺伝子はバチルス・ス
テアロサーモフィルスにおいてほとんど発現じないよう
に制御を受けているものの、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属細菌へ導入すると、強く発現して耐熱
性糖化型アミラーゼ蛋白が生合成される。本耐熱性アミ
ラーゼはデンプンを基質として反応せしめた際、グルコ
ースおよびマルトースのみを生成することから糖化型ア
ミラーゼとしての特性を有しているだけでなく、マルト
トリオース以上のオリゴ糖に対しても有効に作用し、グ
ルコースおよびマルトースにまで分解することを見出し
た。バチルス・ステアロサーモフィルスが耐熱性アミラ
ーゼを生産することはよく知られている（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、 ４６ （５） １０５９〜ｌ Ｏ
６５（１９８３））。しかし多くの場合、液化型のアミ
ラーゼであり、糖化型のアミラー、ゼはほとんど知られ
ていない。本発明のアミラーゼは耐熱性で、かつデンプ
ンをグルコースとマルトースにまで分解できる糖化型ア
ミラーゼであり、従来知られているアミラーゼとは明ら
かに異なる。さらに、遺伝子組み換え技術を用いること
によって本発明の新規アミラーゼをエシェリシア属細菌
で大量に生産することに成功した。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
前述の如くバチルス・ステアロサーモフィルスの生産す
るアミラーゼの中にはデンプンをグルコースとマルトー
スにまで加水分解する糖化型アミラーゼが潜在的に存在
し、本アミラーゼはエシェリシア属細菌へクローン化す
ることにより強く発現することが明らかとなった。本発
明のアミラーゼは以下に示すような理化学的性質を有す
る。
るアミラーゼの中にはデンプンをグルコースとマルトー
スにまで加水分解する糖化型アミラーゼが潜在的に存在
し、本アミラーゼはエシェリシア属細菌へクローン化す
ることにより強く発現することが明らかとなった。本発
明のアミラーゼは以下に示すような理化学的性質を有す
る。
■ 作用：グルコシド結合（主としてα−１，４−グル
コシド結合）を加水分解する。
コシド結合）を加水分解する。
■ 基質特異性：デンブン、デンプン様多糖およびオリ
ゴ糖に作用する。
ゴ糖に作用する。
■ 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは６〜７で
あり、安定ｐＨ範囲は４〜８である。
あり、安定ｐＨ範囲は４〜８である。
■ 力価の測定法：０．５％可溶性デンプンを含む５０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）２ｍｊｌ！へ適当に希釈
した酵素溶液１ｍｆｆを添加し、６０℃で適当な時間（
１０〜３０分間）反応させ、０．１７ｍＭＩｔ−ＫＴ溶
液５ ｍ Ｅ中へ酵素反応液０．２ｍｌを注入すること
によって反応を停止せしめる。反応停止液の７０Ｏｎ、
ｍの吸光度を測定し、１分間に１μｇ可溶性デンプンを
分解した量を１ユニツトとした。
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）２ｍｊｌ！へ適当に希釈
した酵素溶液１ｍｆｆを添加し、６０℃で適当な時間（
１０〜３０分間）反応させ、０．１７ｍＭＩｔ−ＫＴ溶
液５ ｍ Ｅ中へ酵素反応液０．２ｍｌを注入すること
によって反応を停止せしめる。反応停止液の７０Ｏｎ、
ｍの吸光度を測定し、１分間に１μｇ可溶性デンプンを
分解した量を１ユニツトとした。
■ 作用適温の範囲＝１０〜９５°Ｃで作用するが、好
ましい温度は５０〜７０℃である。
ましい温度は５０〜７０℃である。
■ ｐＨ，温度などによる失活の条件： ｐＨ２以下、
ｐＨ１２以上の条件で容易に失活し、また１００℃、１
５分間の熱処理でほとんど失活する。
ｐＨ１２以上の条件で容易に失活し、また１００℃、１
５分間の熱処理でほとんど失活する。
■ カルシウムの影響：塩化カルシウムによる熱安定性
の向上は認められない。
の向上は認められない。
■ 反応生成物二可溶性デンプンに作用させると、最終
産物としてグルコースおよびマルトースを生ずる。マル
トトリオースに作用させると、グルコースおよびマルト
ースを生ずる。
産物としてグルコースおよびマルトースを生ずる。マル
トトリオースに作用させると、グルコースおよびマルト
ースを生ずる。
■ 耐熱性二６０°Ｃ１３０分間もしくは７０°Ｃ１１
５分間の熱処理を行っても安定しており、大部分の活性
を保持している。
５分間の熱処理を行っても安定しており、大部分の活性
を保持している。
本発明のアミラーゼは、クローン化されたエシェリシア
属細菌から硫酸アンモニウム、アセトン。
属細菌から硫酸アンモニウム、アセトン。
アルコール類などの蛋白沈澱剤によって濃縮でき、各種
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどのゲルクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどのゲルクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。
本発明により、提供される第２の発明は、バチルス・ス
テアロサーモフィルスの染色体ＤＮＡに由来し、制限酵
素Ｈ４ｎｄ［Ｉ処理によって調製され、上記性質を有す
る耐熱性アミラーゼ蛋白をコードしている遺伝子が組み
込まれているＤＮＡ断片を有し、かつエシェリシア属の
細菌を宿主として復製維持できる組換えプラスミドであ
る。ここで、バチルス・ステアロサーモフィルスとして
は、たとえばバチルス・ステアロサーモフィルスＩＦＯ
１２５５０などがある。
テアロサーモフィルスの染色体ＤＮＡに由来し、制限酵
素Ｈ４ｎｄ［Ｉ処理によって調製され、上記性質を有す
る耐熱性アミラーゼ蛋白をコードしている遺伝子が組み
込まれているＤＮＡ断片を有し、かつエシェリシア属の
細菌を宿主として復製維持できる組換えプラスミドであ
る。ここで、バチルス・ステアロサーモフィルスとして
は、たとえばバチルス・ステアロサーモフィルスＩＦＯ
１２５５０などがある。
本耐熱性アミラーゼ蛋白をコードする遺伝子の調製方法
は、種々の公知制限酵素を用いて実施することができる
が、Ｈｉｎｄ ｍを用いて処理したものが好適である。
は、種々の公知制限酵素を用いて実施することができる
が、Ｈｉｎｄ ｍを用いて処理したものが好適である。
該遺伝子のベクター・プラスミドとしては大腸菌を宿主
として複製維持できるプラスミドであって、制限酵素に
対する切断箇所を有するものであればその起源や分子量
の大きさを問わず使用できる。これらベクター・プラス
ミドの具体的なものとしては、例えば蛋白質核酸酵素、
第２６巻、第４号（１９８１）に記載されている以下の
ものが好ましい。
として複製維持できるプラスミドであって、制限酵素に
対する切断箇所を有するものであればその起源や分子量
の大きさを問わず使用できる。これらベクター・プラス
ミドの具体的なものとしては、例えば蛋白質核酸酵素、
第２６巻、第４号（１９８１）に記載されている以下の
ものが好ましい。
ｐｓｃｌｏｌ、ｐＲＫ３５３．ｐＲＫ６４６゜ｐＲＫ２
４８．ｐＤＦ４１．Ｃｏ１Ｅ１．ｐＶＨ５１、ｐＡｃ１
０５．Ｒ３Ｆ２１２４．ｐｃＲｌ。
４８．ｐＤＦ４１．Ｃｏ１Ｅ１．ｐＶＨ５１、ｐＡｃ１
０５．Ｒ３Ｆ２１２４．ｐｃＲｌ。
ｐＭＢ９．ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４
、ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ
２２８９．ｐＫＹ２７００゜ｐＫＮ８０．ｐＫＣ７，ｐ
ＫＢ１５８．ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＡ
ｃＹｃ１８４゜λｄｖｌ、 λｇｔ・λＣ１λＷＥＳ
−λＣ９λＷＥＳ・λＢ＋、λＺＪｖｉｒ・λＢ＋、λ
ＡＬＯ・λＢ、λＷＥ ５−Ｔｓ６２２． λＤ□な
ど。
、ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ
２２８９．ｐＫＹ２７００゜ｐＫＮ８０．ｐＫＣ７，ｐ
ＫＢ１５８．ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＡ
ｃＹｃ１８４゜λｄｖｌ、 λｇｔ・λＣ１λＷＥＳ
−λＣ９λＷＥＳ・λＢ＋、λＺＪｖｉｒ・λＢ＋、λ
ＡＬＯ・λＢ、λＷＥ ５−Ｔｓ６２２． λＤ□な
ど。
耐熱性アミラーゼ生産菌から耐熱性アミラーゼ生産性を
遺伝情報としてもつ染色体ＤＮＡを抽出するには斉藤・
三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｃｐｈｙｓ。
遺伝情報としてもつ染色体ＤＮＡを抽出するには斉藤・
三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｃｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ、７２．６１９ （１９６３））に記載され
ている方法によって行うことができる。得られたＤＮＡ
を耐熱性アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ源として用いる。
ている方法によって行うことができる。得られたＤＮＡ
を耐熱性アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ源として用いる。
染色体ＤＮＡおよびベクター・プラスミドはそれぞれ制
限酵素を用いて切断する。この場合、ベクターの種類に
よりそれぞれ適した制限酵素があるので、適切な制限酵
素を用いるべきである。染色体ＤＮＡおよびベクター・
プラスミドをそれぞれ制限酵素により処理した後、ベク
ター・プラスミドについては市販アルカリ・ホスファタ
ーゼによる処理を行って５”−末端のリン酸基を除くこ
とが望ましい。このようにして得られた染色体ＤＮＡ断
片と切断されたベクター・プラスミドをＴ、ＤＮＡリガ
ーゼなどのりガーゼを用いる通常の方法によって連結す
る。かくして得られる本発明の組換えプラスミドは耐熱
性アミラーゼを生産するバチルス・ステアロサーモフィ
ルスの染色体ＤＮＡに由来するものであって、制限酵素
Ｈｉｎｄ■により調製されるＤＮＡ断片を有し、かつエ
シェリシア属の細菌を宿主として複製維持できる組換え
プラスミドのすべてが包含される。より具体的には制限
酵素Ｈ４ｎｄｌｌ＋処理により調製されるＤＮＡ断片が
分子量約４．７ｘｌＯ′３ｂｐで各種の制限酵素に対す
る切断箇所がそれぞれ（ａｔ Ｂ ａｍ Ｆ（Ｔで２ケ
所、 （ｂ）ＥｃｏＲＩで２ケ所、（ｃ）ＰｓｔＩで１
ケ所、ｆｄ）ＳａｌＩで１ケ所およびｆｅｌＡｖａｌで
１ケ所である組換えプラスミドを挙げることができる。
限酵素を用いて切断する。この場合、ベクターの種類に
よりそれぞれ適した制限酵素があるので、適切な制限酵
素を用いるべきである。染色体ＤＮＡおよびベクター・
プラスミドをそれぞれ制限酵素により処理した後、ベク
ター・プラスミドについては市販アルカリ・ホスファタ
ーゼによる処理を行って５”−末端のリン酸基を除くこ
とが望ましい。このようにして得られた染色体ＤＮＡ断
片と切断されたベクター・プラスミドをＴ、ＤＮＡリガ
ーゼなどのりガーゼを用いる通常の方法によって連結す
る。かくして得られる本発明の組換えプラスミドは耐熱
性アミラーゼを生産するバチルス・ステアロサーモフィ
ルスの染色体ＤＮＡに由来するものであって、制限酵素
Ｈｉｎｄ■により調製されるＤＮＡ断片を有し、かつエ
シェリシア属の細菌を宿主として複製維持できる組換え
プラスミドのすべてが包含される。より具体的には制限
酵素Ｈ４ｎｄｌｌ＋処理により調製されるＤＮＡ断片が
分子量約４．７ｘｌＯ′３ｂｐで各種の制限酵素に対す
る切断箇所がそれぞれ（ａｔ Ｂ ａｍ Ｆ（Ｔで２ケ
所、 （ｂ）ＥｃｏＲＩで２ケ所、（ｃ）ＰｓｔＩで１
ケ所、ｆｄ）ＳａｌＩで１ケ所およびｆｅｌＡｖａｌで
１ケ所である組換えプラスミドを挙げることができる。
さらに具体的には、該ＤＮＡ断片をベクター・プラスミ
ドｐＢＲ３２２に組み込み、本発明者らによってｐＮＢ
Ｅｌと命名された組換えプラスミドは遺伝子工学的手法
による有用物質の生産を目的とするために好適なものと
して挙げることができる。
ドｐＢＲ３２２に組み込み、本発明者らによってｐＮＢ
Ｅｌと命名された組換えプラスミドは遺伝子工学的手法
による有用物質の生産を目的とするために好適なものと
して挙げることができる。
これらのプラスミドの制限酵素地図は第１図に示す通り
である。
である。
本発明により提供される第３の発明は、エシェリシア属
細菌を宿主として前述の組換えプラスミドをＮ ｏｒｇ
ａｒｄらの方法（Ｇｅｎｅ、３． ２７９〜２９２（１
９７８））にしたがって形質転換せしめた新規微生物で
あり、該微生物は耐熱性アミラーゼ生産に有用である。
細菌を宿主として前述の組換えプラスミドをＮ ｏｒｇ
ａｒｄらの方法（Ｇｅｎｅ、３． ２７９〜２９２（１
９７８））にしたがって形質転換せしめた新規微生物で
あり、該微生物は耐熱性アミラーゼ生産に有用である。
かかる微生物の具体的なものとしては、エシェリシア・
コリＭＫ１８−２９があり、本菌は工業技術院微生物工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−８２５２として寄託さ
れている。
コリＭＫ１８−２９があり、本菌は工業技術院微生物工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−８２５２として寄託さ
れている。
また、第４の本発明は上記微生物を用いた耐熱性アミラ
ーゼの製造法を提供するものである。この発明の方法に
従って耐熱性アミラーゼを生産せしめるには、エシェリ
シア属に属する細菌が生育し得る栄養培地、例えば炭素
源としてはグルコース、フラクトースおよびこれらの糖
を含有するモラッセス、果汁、デンプン加水分解物等が
あり、窒素源としてはアンモニウム塩、アンモニア水。
ーゼの製造法を提供するものである。この発明の方法に
従って耐熱性アミラーゼを生産せしめるには、エシェリ
シア属に属する細菌が生育し得る栄養培地、例えば炭素
源としてはグルコース、フラクトースおよびこれらの糖
を含有するモラッセス、果汁、デンプン加水分解物等が
あり、窒素源としてはアンモニウム塩、アンモニア水。
アンモニアガス、乾燥酵母、ミルクカゼイン、ペプトン
、肉エキス、コーン・ステイープ・リカー。
、肉エキス、コーン・ステイープ・リカー。
ペプチド含有物、アミノ酸類等を単独ないし適宜組合せ
て使用する。そのほか必要により少量の無機塩類を適当
に添加した培地に上記菌株を接種し、好ましくはｐＨ６
〜８．３０〜４０℃で培養する。
て使用する。そのほか必要により少量の無機塩類を適当
に添加した培地に上記菌株を接種し、好ましくはｐＨ６
〜８．３０〜４０℃で培養する。
培養終了後、培養液から菌体を集め、次に超音波処理な
どの手段によって菌体を破砕すれば、耐熱性アミラーゼ
を含む溶液を得ることができる。耐熱性アミラーゼを分
離するには、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等での
塩析；減圧濃縮；メタノール、エタノール、アセトンの
ような溶媒による分画沈澱法や各種のクロマトグラフィ
ーを単独または適宜組み合わせて実施することができる
が、６０℃、３０分間あるいは７０℃、１５分間加熱処
理することにより不要な蛋白質を変性沈澱せしめて遠心
分離等により除去することにより耐熱性アミラーゼが高
収率で容易に精製できる。
どの手段によって菌体を破砕すれば、耐熱性アミラーゼ
を含む溶液を得ることができる。耐熱性アミラーゼを分
離するには、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等での
塩析；減圧濃縮；メタノール、エタノール、アセトンの
ような溶媒による分画沈澱法や各種のクロマトグラフィ
ーを単独または適宜組み合わせて実施することができる
が、６０℃、３０分間あるいは７０℃、１５分間加熱処
理することにより不要な蛋白質を変性沈澱せしめて遠心
分離等により除去することにより耐熱性アミラーゼが高
収率で容易に精製できる。
本発明の方法によれば、耐熱性アミラーゼ遺伝子をクロ
ーン化し、該遺伝子が増幅された微生物を用いるので、
発現制御の問題を解決することができ、有用な潜在蛋白
を多量に生産することが可能になった点で画期的であり
、かつ工業的に有利な製造法といえる。
ーン化し、該遺伝子が増幅された微生物を用いるので、
発現制御の問題を解決することができ、有用な潜在蛋白
を多量に生産することが可能になった点で画期的であり
、かつ工業的に有利な製造法といえる。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例
（１） 染色体ＤＮＡの調製
バチルス・ステアロサーモフィルスＩＦ０１２５５０株
を液体栄養培地（１％ニュートリエンド・ブロス（ＤＩ
ＦＣＯ社製）、０．５％酵母エキス、０．３％塩化ナト
リウム、ｐＨ７，０）１１に植菌し、５５℃で対数増殖
期後期まで生育せしめた。菌体を遠心分離により集めて
洗浄後、斉藤・三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ？ ２゜６１．９ （１９６
３））によって染色体ＤＮＡ４．１曙を得た。
を液体栄養培地（１％ニュートリエンド・ブロス（ＤＩ
ＦＣＯ社製）、０．５％酵母エキス、０．３％塩化ナト
リウム、ｐＨ７，０）１１に植菌し、５５℃で対数増殖
期後期まで生育せしめた。菌体を遠心分離により集めて
洗浄後、斉藤・三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ？ ２゜６１．９ （１９６
３））によって染色体ＤＮＡ４．１曙を得た。
（２）染色体ＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵
素による切断 バチルス・ステアロサーモフィルスＩＦ０１２５５０株
の染色体ＤＮＡ２μｇ、制限酵素ＨｉｎｄｎＩ２０単位
（宝酒造側製）、塩化ナトリウム５０ｍＭ、！−リス塩
酸緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ７．５）および塩化マグネシウ
ム６ｍＭを含存する溶液Ｑ、１ｍｆｆを３７℃、１時間
反応せしめた。反応後、７０゛Ｃで１０分間熱処理を行
って制限酵素を失活させた。プラスミドｐＢＲ３２２，
６μｇを同様に）（ｉｎｄＩ［ｒにより切断し、その後
アルカリホスファターゼ処理を行って５°末端のリン酸
基を除去し、プラスミドｐＢＲ３２２の再結合を防止し
た。
素による切断 バチルス・ステアロサーモフィルスＩＦ０１２５５０株
の染色体ＤＮＡ２μｇ、制限酵素ＨｉｎｄｎＩ２０単位
（宝酒造側製）、塩化ナトリウム５０ｍＭ、！−リス塩
酸緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ７．５）および塩化マグネシウ
ム６ｍＭを含存する溶液Ｑ、１ｍｆｆを３７℃、１時間
反応せしめた。反応後、７０゛Ｃで１０分間熱処理を行
って制限酵素を失活させた。プラスミドｐＢＲ３２２，
６μｇを同様に）（ｉｎｄＩ［ｒにより切断し、その後
アルカリホスファターゼ処理を行って５°末端のリン酸
基を除去し、プラスミドｐＢＲ３２２の再結合を防止し
た。
（３） リガーゼによるプラスミドへの染色体ＤＮＡ
断片の挿入 上記（１）で得られた染色体ＤＮＡ断片およびプラスミ
ドｐＢＲ３２２を混合し、これにＡＴＰ、 ジチオスレ
イトールおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて１５℃で１
６時間反応を行った。反応液組成は６０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール。
断片の挿入 上記（１）で得られた染色体ＤＮＡ断片およびプラスミ
ドｐＢＲ３２２を混合し、これにＡＴＰ、 ジチオスレ
イトールおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて１５℃で１
６時間反応を行った。反応液組成は６０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール。
０．５ｍＭ ＡＴＰである。
（４）耐熱・庄アミラーゼ遺伝子のクローニングエシェ
リシア・コリ０６００株をＬ培地（１％トリプトン、０
８５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ｐＨ７，
２）１０ｒｒ＋ｊ！に接種し、３７℃で振とう培養を行
い対数増殖期中期まで生育させた後、集菌した。これを
水冷下、１０ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄したのち菌体を
３０ｍＭ塩化カルシウムに懸濁し、３０分間保持してコ
ンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁
液に（３）で得られた組換えプラスミドＤＮＡを加えて
水冷下３０分保持した。次に、Ｌ培地へ接種し、３７℃
で１時間培養を行って形質転換反応を完了した。
リシア・コリ０６００株をＬ培地（１％トリプトン、０
８５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ｐＨ７，
２）１０ｒｒ＋ｊ！に接種し、３７℃で振とう培養を行
い対数増殖期中期まで生育させた後、集菌した。これを
水冷下、１０ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄したのち菌体を
３０ｍＭ塩化カルシウムに懸濁し、３０分間保持してコ
ンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁
液に（３）で得られた組換えプラスミドＤＮＡを加えて
水冷下３０分保持した。次に、Ｌ培地へ接種し、３７℃
で１時間培養を行って形質転換反応を完了した。
培養液をアンピシリン５０μｇ ／ ｍ ｌを含むし培
地寒天平板上に塗布した。３７°Ｃに１日保温後、出現
したコロニーをスターチ・プレート〔Ｌ培地に１％可溶
性デンプン、１．５％寒天を添加して作製〕へレプリカ
し、３７℃で１日培養後、ヨード液で寒天を覆い残存ス
ターチを赤紫色に発色させた。コロニーの周辺が透明に
なっているクローンがアミラーゼ遺伝子を持つ株として
１株選択された。本枕はエシェリシア・コリＭＫ１８−
２９（ＦＥＲＭ Ｐ−８２５２）と命名し、本枕の保
持するプラスミドはｐＮＢＥｌと命名した。
地寒天平板上に塗布した。３７°Ｃに１日保温後、出現
したコロニーをスターチ・プレート〔Ｌ培地に１％可溶
性デンプン、１．５％寒天を添加して作製〕へレプリカ
し、３７℃で１日培養後、ヨード液で寒天を覆い残存ス
ターチを赤紫色に発色させた。コロニーの周辺が透明に
なっているクローンがアミラーゼ遺伝子を持つ株として
１株選択された。本枕はエシェリシア・コリＭＫ１８−
２９（ＦＥＲＭ Ｐ−８２５２）と命名し、本枕の保
持するプラスミドはｐＮＢＥｌと命名した。
（５）新規耐熱往アミラーゼ生産株による耐熱性アミラ
ーゼの生産 （４）で得られたエシェリシア・コリＭＫ１８−２９（
ＦＥＲＭ Ｐ−８２５２）を用いて耐熱性アミラーゼ
の発酵生産を行った。５０μｇ ／ ｍ １のアンピシ
リンを含むＬ培地１００ｍｆを５００ｍｆｔ容坂ロフラ
スコに入れ、３７°Ｃで１８時間培養したのち菌体を遠
心分離で集め、０．ＯＩＭＩ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）で洗浄した。次に、この菌体を５ｍｌの緩衝液に
懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。一方、対
照として、バチルス・ステアロサーモフィルスＴＦＯ１
２５５０を（１）に従い培養後、培養濾液をＤ Ｅ Ａ
Ｅ −Ｓ ｅｐｈａｒｏｓおよびＣＭ −Ｓ ｅｐｈ
ａｒｏｓｅのカラムクロマトグラフィーで分画し、アミ
ラーゼ活性画分についてデンプンを基質とした際にグル
コースとマルトースを遊離するものを調べた。酵素活性
は６０℃、１分間に基質のデンプン１μｇを分解する酸
素量を１単位とし、ヨウ素デンプン反応に基づく方法（
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １９３．５８ （
１９Ｂ４））に従い測定した。結果を第１表に示した。
ーゼの生産 （４）で得られたエシェリシア・コリＭＫ１８−２９（
ＦＥＲＭ Ｐ−８２５２）を用いて耐熱性アミラーゼ
の発酵生産を行った。５０μｇ ／ ｍ １のアンピシ
リンを含むＬ培地１００ｍｆを５００ｍｆｔ容坂ロフラ
スコに入れ、３７°Ｃで１８時間培養したのち菌体を遠
心分離で集め、０．ＯＩＭＩ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）で洗浄した。次に、この菌体を５ｍｌの緩衝液に
懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。一方、対
照として、バチルス・ステアロサーモフィルスＴＦＯ１
２５５０を（１）に従い培養後、培養濾液をＤ Ｅ Ａ
Ｅ −Ｓ ｅｐｈａｒｏｓおよびＣＭ −Ｓ ｅｐｈ
ａｒｏｓｅのカラムクロマトグラフィーで分画し、アミ
ラーゼ活性画分についてデンプンを基質とした際にグル
コースとマルトースを遊離するものを調べた。酵素活性
は６０℃、１分間に基質のデンプン１μｇを分解する酸
素量を１単位とし、ヨウ素デンプン反応に基づく方法（
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １９３．５８ （
１９Ｂ４））に従い測定した。結果を第１表に示した。
なお、エシェリシア・コリＭＫ１．８−２９ （ＦＥ
ＲＭＰ−８２５２）株の生産するアミラーゼは７０℃。
ＲＭＰ−８２５２）株の生産するアミラーゼは７０℃。
１５分間の熱処理に対しても安定であり、耐熱性酵素で
あることを確認した。
あることを確認した。
第 １ 表
＊デンプンを基質とし、グルコースとマルトースのみを
生成する耐熱性アミラーゼの活性
生成する耐熱性アミラーゼの活性
第１図は組み換えプラスミドｐＮＢＥ１の制限酵素地図
を示す。図中の黒部骨はｐＢＲ３２２に、白部分はアミ
ラーゼ遺伝子に相当する。なお、図中Ｅ ： ＥｃｏＲ
１，Ｈ： ＨｉｎｄＩＩＩ［、Ｐ ： Ｐｓｔｌ。 Ｂ：ＢａｍＨｌ、Ｓ：５ａ１１．Ｃ：Ｃ１ａ１．Ａ：Ａ
ｖａｌをそれぞれ示す。 第１図
を示す。図中の黒部骨はｐＢＲ３２２に、白部分はアミ
ラーゼ遺伝子に相当する。なお、図中Ｅ ： ＥｃｏＲ
１，Ｈ： ＨｉｎｄＩＩＩ［、Ｐ ： Ｐｓｔｌ。 Ｂ：ＢａｍＨｌ、Ｓ：５ａ１１．Ｃ：Ｃ１ａ１．Ａ：Ａ
ｖａｌをそれぞれ示す。 第１図
Claims (7)
- （１）デンプン、デンプン様多糖およびオリゴ糖中のグ
ルコシド結合を加水分解する作用を有し、最終産物とし
てグルコースおよびマルトースを生じ、最適ｐＨが６〜
７、安定ｐＨが４〜８であり、７０℃、１５分間の熱処
理に対しても安定な耐熱性アミラーゼ。 - （２）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体ＤＮ
Ａに由来し、制限酵素ＨｉｎｄIII処理によって調製さ
れ、デンプン、デンプン様多糖およびオリゴ糖中のグル
コシド結合を加水分解する作用を有し、最終産物として
グルコースおよびマルトースを生じ、最適ｐＨが６〜７
、安定ｐＨが４〜８であり、７０℃、１５分間の熱処理
に対しても安定な耐熱性アミラーゼ蛋白をコードしてい
る遺伝子が組込まれているＤＮＡ断片を有し、かつエシ
ェリシア属の細菌を宿主として複製維持できる組み換え
プラスミド。 - （３）制限酵素ＨｉｎｄIII処理によって調製されるＤ
ＮＡ断片が分子量約４．７×１０＾３ｂｐでありかつ下
記の制限酵素に対して下記の切断箇所を示すものである
特許請求の範囲第２項記載の組み換えプラスミド。 （ａ）ＢａｍＨ I は２箇所であり、（ｂ）ＥｃｏＲ I
は２箇所であり、（ｃ）Ｐｓｔ I は１箇所であり（ｄ
）Ｓａｌ I は１箇所であり、（ｅ）Ａｖａ I は１箇所
である。 - （４）バチルス・ステアロサーモフィルスがバチルス・
ステアロサーモフィルスＩＦＯ１２５５０である特許請
求の範囲第２項記載の組み換えプラスミド。 - （５）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体ＤＮ
Ａに由来し、制限酵素ＨｉｎｄIII処理によって調製さ
れ、デンプン、デンプン様多糖およびオリゴ糖中のグル
コシド結合を加水分解する作用を有し、最終産物として
グルコースおよびマルトースを生じ、最適ｐＨが６〜７
、安定ｐＨが４〜８であり、７０℃、１５分間の熱処理
に対しても安定な耐熱性アミラーゼ蛋白をコードしてい
る遺伝子が組み込まれているＤＮＡ断片を有し、かつエ
シェリシア属の細菌を宿主として複製維持できる組み換
えプラスミドにより形質転換されたエシェリシア属に属
する微生物。 - （６）形質転換体たるエシェリシア属に属する微生物が
エシェリシア・コリＭＫ１８−２９である特許請求の範
囲第５項記載の微生物。 - （７）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体ＤＮ
Ａに由来し、制限酵素ＨｉｎｄIII処理によって調製さ
れ、デンプン、デンプン様多糖およびオリゴ糖中のグル
コシド結合を加水分解する作用を有し、最終産物として
グルコースおよびマルトースを生じ、最適ｐＨが６〜７
、安定ｐＨが４〜８であり、７０℃、１５分間の熱処理
に対しても安定な耐熱性アミラーゼ蛋白をコードしてい
る遺伝子が組み込まれているＤＮＡ断片を有し、かつエ
シェリシア属の細菌を宿主として複製維持できる組み換
えプラスミドにより形質転換されたエシェリシア属に属
する微生物を栄養培地で培養し、該培養物から耐熱性ア
ミラーゼを採取することを特徴とする耐熱性アミラーゼ
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122669A JPS61282073A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122669A JPS61282073A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282073A true JPS61282073A (ja) | 1986-12-12 |
Family
ID=14841703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60122669A Pending JPS61282073A (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282073A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110423737A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-08 | 白银赛诺生物科技有限公司 | 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 |
| WO2020213604A1 (ja) * | 2019-04-15 | 2020-10-22 | 公立大学法人大阪 | 新規βアミラーゼ及びその利用・製造法 |
-
1985
- 1985-06-07 JP JP60122669A patent/JPS61282073A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020213604A1 (ja) * | 2019-04-15 | 2020-10-22 | 公立大学法人大阪 | 新規βアミラーゼ及びその利用・製造法 |
| CN110423737A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-11-08 | 白银赛诺生物科技有限公司 | 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06217770A (ja) | プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用 | |
| JPH0472505B2 (ja) | ||
| CN109385413B (zh) | 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用 | |
| JPH04228071A (ja) | マルトペンタオース生産性アミラーゼａ−１８０、その製法、ｄｎａ−構造体及び好アルカリ単離体 | |
| JP3557288B2 (ja) | 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素 | |
| JP3810457B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型耐熱性酵素 | |
| KR100374449B1 (ko) | 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도 | |
| CN110423737B (zh) | 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 | |
| CN114317498B (zh) | 一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用 | |
| US4778760A (en) | Thermostable α-amylase-producing, thermophilic anaerobic bacteria, thermostable α-amylase and process for producing the same | |
| EP0298645B1 (en) | Polypeptide possessing maltotetraose-forming amylase activity, and its uses | |
| Haasum et al. | Growth and glucoamylase production by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in a synthetic medium | |
| US5795766A (en) | Protein having α-glucosidase activity, DNA having genetic information thereof, and production of α-glucosidase | |
| JP3557272B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3025625B2 (ja) | アルカリα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ遺伝子 | |
| JPS61282073A (ja) | 新規アミラ−ゼ，該アミラ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む組換えプラスミド，該プラスミドにより形質転換された微生物および該微生物による新規アミラ−ゼの製造法 | |
| US5281527A (en) | Process for producing pullalanase | |
| US11913053B2 (en) | Application of trehalase in fermentative production | |
| KR0133727B1 (ko) | 이소아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드 및 그 제조방법 | |
| JP2612687B2 (ja) | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ活性を有するポリペプチド | |
| JPH0223872A (ja) | 組換えプラスミド，それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法 | |
| JP3557276B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JP2612684B2 (ja) | シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａを導入した形質転換微生物とその利用 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JPH07143880A (ja) | 超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子 |