CN110423737A - 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 - Google Patents

来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α‑淀粉酶及其定点突变改进。本发明成功构建了含amyGSM的重组质粒，以及含突变后的M1‑amyGSM，M2‑amyGSM的重组质粒。从而获得多种高表达菌株，包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌及霉菌。本发明得到的重组宿主细胞，适于上述α‑淀粉酶基因的表达。根据本发明的α‑淀粉酶最适pH为6.5，在最适温度70℃，且在70℃的热稳定性良好，保温8h，仍具有50％左右的酶活。将第163位的谷氨酸突变为精氨酸，且第215和第216位分别删除异亮氨酸和甘氨酸后，获得了更高的热稳定性，在85℃保温30min，该α‑淀粉酶仍保留85.6％的酶活。

Description

来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及食品领域，具体涉及一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用。
背景技术
α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)作为一种重要的淀粉水解酶，能特异性水解淀粉、糖原或多糖的内部的α-1,4糖苷键，产生短链糊精、寡糖和葡萄糖等产物，在工业中具有广泛应用，如酿造、食品、医药和纺织等领域(Kandra L.α-Amylases ofmedical and industrial importance.Journal of Molecular Structure Theochem,2003,666:487-498.)。已有报道α-淀粉酶可用于生产果葡糖浆，做抗陈化剂以提高烘焙食品的质量，以及用于洗涤行业，造纸业和生产燃料乙醇等重要应用(Gupta R,Gigras P,Mohapatra H,et al.Microbialα-amylases:a biotechnological perspective.ProcessBiochemistry,2003,38(11):1599-1616；Mojsov K.Microbial alpha-amylases andtheir industrial applications:a review.International Journal of ManagementIt&Engineering,2012,2(10):583-609；K.Pir elová,D.Fermentationof starch to ethanol by a co-culture of Saccharomycopsis fibuligera,andSaccharomyces cerevisiae.World Journal of Microbiology&Biotechnology,1993,9(3):338.)。α-淀粉酶的最适温度与其来源的微生物的生长温度有关。已有文献报道，来自Fusarium oxysporum的α-淀粉酶具有较低的最适温度，为25-30℃(Chary S J,Reddy SM.Starch-degrading enzymes of two species of Fusarium.Folia Microbiologica,1985,30(5):452-457)。而来自古细菌Pyrococcus furiosus和Pyrococcus woesei则具有较高的最适温度，分别为100℃和130℃(Laderman K A,Asada K,Uemori T,et al.Alpha-amylase from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcusfuriosus.Journal of Biological Chemistry,1993,268(32):24402-24407.MohebiR.Cloning,Expression,and Purification of Hyperthermophileα-Amylase fromPyrococcus woesei.Osong Public Health and Research Perspectives,2015,6(6):336-340)。α-淀粉酶的工业应用中通常需要较高的反应温度，比如在淀粉液化过程中，需要在高温(105-118℃)条件下进行，这可使淀粉液化的效果更好，也可以提高产品得率、获得高附加值产品如葡萄糖、结晶葡萄糖、葡萄糖浆、麦芽糖和麦芽糖糊精等。因此筛选具有优良的热稳定性的α-淀粉酶具有重要的意义。来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的酶通常具有良好的热稳定性(Norman B E.New Developments in Starch SyrupTechnology.Enzymes Food Process.1981,1:15-51.)。如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus.licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)的α-淀粉酶已被报道具有较好的热稳定性。但由于产量低和高生产成本等原因造成了商业应用的局限性，克隆来自原始菌株的α-淀粉酶基因并在异源宿主中进行表达能有效解决这一困难。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一个食品安全级外源基因表达宿主，具有诸如遗传操作简单，表达效率高，培养简单，产物易于纯化等优点，已被广泛地应用于各种酶制剂和生物活性多肽的表达(Cereghino J L,Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris.FEMS microbiology reviews,2000,24(1):45-66.)。
此外，除了通过筛选嗜热菌来源的α-淀粉酶以外，定点突变也是获得性质优良的新酶的一种有效手段。研究人员利用化学诱变剂甲基磺酸乙酰(EMS)以及物理辐射方法对解淀粉芽孢杆菌UNG-16(B.amyloliquefaciens UNG-16)进行突变，筛选得到了一株酶活比原始菌株高出1.4倍的突变菌株(Gangadharan D,Sivaramakrishnan S,Madhavan K,etal.Solid culturing of Bacillus amyloliquefaciens forα-amylase Production.FoodTechnology&Biotechnology,2006,44(2):269-274.)。还有研究者运用定点突变提高了来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的热稳定性和催化效率，与野生型酶相比，热稳定性最好的突变体A269K/S187D/N188T在95℃和pH 5.5条件下的半衰期提高了9倍，催化效率也比野生型酶高出1.84倍(Li Z,Duan X,Chen S,et al.Improving the reversibility of thermaldenaturation and catalytic efficiency of Bacillus licheniformisα-amylasethrough stabilizing a long loop in domain B.PLoS ONE,2017,12(3):e0173187.)。
本发明提供了来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶的基因克隆、在毕赤酵母中表达和酶学性质的表征。并对其进行定点突变，获得了稳定性更强的α-淀粉酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种热稳定性优良、符合工业应用的需求、具有较大的应用潜力的耐热型高温α-淀粉酶的编码基因，并通过定点突变提高α-淀粉酶的热稳定性。
为了实现上述目的，本发明的耐热型α-淀粉酶的编码基因，及其定点突变基因序列的异源表达具体如下：
本发明提供了一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，记为amyGSM。
所述的耐热型α-淀粉酶基因与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％以上的一致性、更优的是具有85％以上的一致性或与所述SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的一致性。
本发明提供了一种根据所述的耐热型α-淀粉酶的编码基因，所述的α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或其无义突变序列，记为AmyGSM。
所述耐热型α-淀粉酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性，更优的是具有90％以上的一致性。
本发明提供了一种含有编码所述的氨基酸片段的核苷酸序列的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得，记为pPIC9K-amyGSM。
本发明提供了上述耐热型α-淀粉酶的编码基因的突变序列，将第163位的谷氨酸突变为精氨酸，且第215和第216位分别删除异亮氨酸和甘氨酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，记为M1-amyGSM。
本发明提供了一种含有编码α-淀粉酶氨基酸片段的核苷酸序列M1-amyGSM的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得，记为pPIC9K-M1-amyGSM。
本发明提供了上述耐热型α-淀粉酶的编码基因的突变序列进行密码子优化后的氨基酸序列，使其适宜在毕赤酵母宿主中进行表达，记为M2-amyGSM。
本发明提供了一种含有编码α-淀粉酶氨基酸片段的核苷酸序列M2-amyGSM的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得，记为pPIC9K-M2-amyGSM。
本发明提供了一种具有α-淀粉酶活性的氨基酸片段，将氨基酸AmyGSM片段的第163位的谷氨酸突变为精氨酸，且第215和第216位分别删除异亮氨酸和甘氨酸，即M1-amyGSM/M2-amyGSM编码的氨基酸序列，为SEQ ID NO.5所示的氨基酸，记为M-AmyGSM。
本发明提供了以上重组表达所述的具有α-淀粉酶活性的氨基酸片段(AmyGSM和M-AmyGSM)的载体，所述的载体是细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体。
其中所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。
本发明提供了根据所述的重组表达的具有α-淀粉酶活性的氨基酸片段(AmyGSM和M-AmyGSM)在环保、食品、或保健中的应用。
本发明提供了一种来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus的α-淀粉酶基因和氨基酸序列。成功构建了含amyGSM的重组质粒，本发明得到的毕赤酵母重组细胞，适于上述α-淀粉酶基因的表达，利用1％甲醇诱导得到的重组表达蛋白的酶活为31.65U/mL。根据本发明的α-淀粉酶最适pH为6.5，在pH 6.5条件下保温8h仍保留87％的酶活。最适温度70℃，且在70℃的热稳定性良好，在85℃保温30min，该α-淀粉酶仍保留65.7％的酶活，适于工业上应用的要求。将第163位的谷氨酸突变为精氨酸，且第215和第216位分别删除异亮氨酸和甘氨酸后，获得了更高的热稳定性。使其更适用于工业上的要求。
附图说明
图1：嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶毕赤酵母GS115重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图，M为蛋白Marker，1-3为M-amyGSM诱导第三天至第五天，4-6为AmyGSM诱导第三天至第五天。
图2：重组α-淀粉酶AmyGSM和M-AmyGSM的最适温度(pH 6.5的条件下测定)。
图3：重组α-淀粉酶AmyGSM和M-AmyGSM的最适pH(70℃的条件下测定)。
图4：重组α-淀粉酶AmyGSM的温度耐受性，分别在70℃下保温8h，每隔2h取样冷却后测定残余酶活。
图5：重组α-淀粉酶M-AmyGSM的温度耐受性，在85℃下保温30min。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
α-淀粉酶基因的扩增
1.1菌株及其培养
本发明所述的α-淀粉酶基因克隆自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。
本发明所述的嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(DSMZ456)可以从德国微生物菌种保藏中心直接购买，菌种编号为DSMZ 456，其原始来源是在奥地利从甜菜汁中提取得到的。因此，本发明所述的嗜热脂肪土芽孢杆菌可通过商购途径获得，也可以通过野外采集和其他途径获得。
接种甘油菌至1号培养基，55℃培养2天收集菌体，用于基因组提取。
1.2基因组提取
参照Generay细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书。
1.3嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶基因的扩增
在NCBI上找到嗜热脂肪土芽孢杆菌相近种属α-淀粉酶的基因序列，设计引物，其中：
456-AU 5'gtagaattccctagggcggccgcgaATGGCCGCACCGTTTAACC 3'
456-AD 5'aaggcgaattaattcgcggccgcTCACTATCTTTGAACATAAATTGAAACC 3'
进行PCR扩增，PCR体系为：
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，进行后续表达载体的构建。
实施例2
含有α-淀粉酶的毕赤酵母重组表达载体的构建及表达
2.1重组表达载体pPIC9K-amyGSM的构建
含pPIC9K的大肠杆菌DH5α宿主菌用AxyPrep质粒DNA提取试剂盒提取质粒(操作步骤参照说明书)，用Not I(购自Themo公司)进行单酶切，切胶回收线性载体片段，然后用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒(操作步骤参照说明书)连接载体与目的基因(实施例1中获得)，转化至大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技(北京)有限公司)，PCR验证阳性克隆并测序，将测序结果在NCBI上进行比对并分析表明，所获得的α-淀粉酶基因DNA由1650个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.1所示。
该DNA编码549氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。
2.2重组表达载体pPIC9K-M1-amyGSM，pPIC9K-M2-amyGSM的构建
重组表达载体pPIC9K-M1-amyGSM，pPIC9K-M2-amyGSM由上海捷瑞生物工程有限公司合成，于大肠杆菌DH5α宿主中。
2.3毕赤酵母系统表达
用Sac I对pPIC9K-amyGSM进行单酶切，运用电转化方法将线性化的重组质粒转入毕赤酵母感受态细胞中，用含不同浓度梯度的G418平板进行筛选。挑取在高浓度G418(4mg/mL)平板中生长出的转化子，接种至含有25mL液体BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃，220r/min培养24h；6000rpm离心约10min后，收集菌体，用含有25mL液体BMMY培养基，将菌体重悬于250mL三角瓶中，30℃，220r/min，在培养的过程中，每隔24h补加一次甲醇，每次补加都要使其终浓度为1％(v/v)；在甲醇诱导表达的同时，每隔24h取一次样，测定粗酶液的酶活力，待酶活达到最高时，将发酵液于6000rpm离心10min，收集上清液和菌体，存于-40℃。
pPIC9K-M1-amyGSM，pPIC9K-M2-amyGSM酵母转化及诱导表达同上。
图1：嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶毕赤酵母GS115重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图，其中M为蛋白Marker，1-3为M-amyGSM诱导第三天至第五天，4-6为AmyGSM诱导第三天至第五天。
实施例3
α-淀粉酶酶活测定
3.1标准曲线绘制
取干净试管将试管标号，配制葡萄糖浓度梯度溶液，分别向试管中加入0.2-1.4mL(以0.2mL为间隔)的1％的葡萄糖溶液，以不加葡萄糖的试管做空白对照。每管做三个平行样品。分别向试管中补ddH2O至总体积为2.0mL，再向试管中加入3mL DNS试剂，煮沸15min，立即加入10mL ddH2O并预冷，在波长540nm处用分光光度计比色测量，并记下各试管对应的样品的光密度值再求其平均值，再绘制葡萄糖标准曲线。
3.2酶活测定
用DNS终止法来测量重组α-淀粉酶的酶活。
反应体系：
于70℃水浴下反应20min。立即加入750μL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min后迅速置于冰上。将上述各反应样品在540nm吸光度出测量其观密度值(用空白对照试管的样品调零分光光度计)。
α-淀粉酶酶活定义为：在所选取的条件下，每分钟分解可溶性淀粉产生的还原糖，其还原力相当于1μmol葡萄糖所需要的酶量，以1U表示。
实施例4
重组α-淀粉酶的酶学性质测定
4.1最适反应温度测定：按标准反应体系分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃和温度下反应20min，然后用DNS法测定α-淀粉酶活力，其中酶活力最高的设为100％(如图2)。
如图2所示，表明重组α-淀粉酶AmyGSM的最适反应温度为70℃，在60-75℃条件下仍具有80％以上的酶活。突变体M-AmyGSM的最适温度也为70℃，在60-75℃条件下也仍具有80％以上的酶活。
4.2最适pH值测定：分别配制pH 5.5-7.5的缓冲液，其中pH 5.5为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 6.0-7.0为20mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH 7.5为20mM的Tris-HCl缓冲液。按3.2的方法测定α-淀粉酶活力，其中酶活力最高的设为100％。
如图3所示，AmyGSM的最适pH为6.5，在pH＝5.5-.5时具有80％的酶活。M-AmyGSM的最适pH与野生型相同。
4.3AmyGSM热稳定性分析：将适量的酶液放置在70℃的恒温水浴中，每隔2h取样测定残余酶活力，以保温0min时的酶活力为100％。
如图4所示，AmyGSM在70℃条件下稳定，在70℃保温8h，该α-淀粉酶仍保留50％左右的酶活。表明该酶的热稳定性优良，符合工业应用的需求，具有较大的应用潜力。
4.4M-AmyGSM热稳定性分析：将适量的酶液放置在85℃的恒温水浴中，30min取样测定残余酶活力，以保温0min时的酶活力为100％。
突变体M-AmyGSM的热稳定性明显优于野生型α-淀粉酶，在85℃保温30min残余酶活达85.6％。作为对照AmyGSM在85℃保温30min残余酶活为65.7％。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110> 白银赛诺生物科技有限公司
<120> 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgctaacgt ttcaccgcat cattcgaaaa ggatggatgt tcctgctcgc gtttttgctc 60
actgccttgc tgttctgccc aaccggacag cccgccaagg ctgccgcacc gtttaacggc 120
accatgatgc agtattttga atggtacttg ccggatgatg gcacgttatg gaccaaagtg 180
gccaatgaag ccaacaactt atccagcctt ggcatcaccg ctctttggct gccgcccgct 240
tataaaggaa caagccgcag cgacgtaggg tacggagtat acgacttgta tgacctcggt 300
gaattcaatc aaaaaggggc cgtccgcaca aaatacggaa caaaagctca atatcttcaa 360
gccattcaag ccgcccacgc cgctggaatg caagtgtacg ccgatgtcgt gttcgaccat 420
aaaggcggcg ccgacggcac ggaatgggtg gacgccgtcg aagtcaatcc gtccgaccgc 480
aaccaagaaa tctcgggcac ctatcaaatc caagcatgga cgaaatttga ttttcccggg 540
cggggcaaca cctactccag ctttaagtgg cgctggtacc attttgatgg cgttgattgg 600
gacgaaagcc gaaaattgag ccgcatttac aaattccgcg gcatcggcaa agcgtgggat 660
tgggaagtag acacggaaaa cggaaactat gactacttaa tgtatgccga ccttgatatg 720
gatcatcccg aagtcgtgac tgagctgaaa agctggggga aatggtatgt caacacaacg 780
aacattgatg ggttccggct tgatgccgtc aagcatatta agttcagttt ttttcctgat 840
tggttgtcgt atgtgcgttc tcagactggc aagccgctat ttaccgttgg ggaatattgg 900
agctatgaca tcaacaagtt gcacaattac attatgaaaa caaacggaac gatgtctttg 960
tttgatgccc cgttacacaa caaattttat accgcttcca aatcaggggg cacatttgat 1020
atgcgcacgt taatgaccaa tactctcatg aaagatcaac caacattggc cgtcaccttc 1080
gttgataatc atgacaccga acccggccaa gcgctgcagt catgggtcga cccatggttc 1140
aaaccgttgg cttacgcctt tattctaact cggcaggaag gatacccgtg cgtcttttat 1200
ggtgactatt atggcattcc acaatataac attccttcgc tgaaaagcaa aatcgatccg 1260
ctcctcatcg cgcgcaggga ttatgcttac ggaacgcaac atgattatct tgatcactcc 1320
gacatcatcg ggtggacaag ggaaggggtc actgaaaaac caggatccgg actggccgca 1380
ttgatcaccg atgggccggg aggaagcaaa tggatgtacg ttggcaaaca acacgccgga 1440
aaagtgttct atgaccttac cggcaaccgg agtgacaccg tcaccatcaa cagtgatgga 1500
tggggggaat tcaaagtcaa tggcggttcg gtttcggttt gggttcctag aaaaacgacc 1560
gtctctacta tcgcttggtc gatcacaacc cgaccgtgga ctgatgaatt cgtccgttgg 1620
accgaaccac ggttggtggc atggccttga 1650
<210> 2
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Leu Thr Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Met Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Thr Ala Leu Leu Phe Cys Pro Thr Gly Gln Pro Ala
20 25 30
Lys Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp
35 40 45
Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala
50 55 60
Asn Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu
85 90 95
Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr
100 105 110
Gly Thr Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala
115 120 125
Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala
130 135 140
Asp Gly Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg
145 150 155 160
Asn Gln Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe
165 170 175
Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp
180 185 190
Tyr His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg
195 200 205
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
210 215 220
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met
225 230 235 240
Asp His Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr
245 250 255
Val Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His
260 265 270
Ile Lys Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln
275 280 285
Thr Gly Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile
290 295 300
Asn Lys Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu
305 310 315 320
Phe Asp Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly
325 330 335
Gly Thr Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp
340 345 350
Gln Pro Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro
355 360 365
Gly Gln Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala
370 375 380
Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr
385 390 395 400
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser
405 410 415
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr
420 425 430
Gln His Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
435 440 445
Gly Val Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp
450 455 460
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly
465 470 475 480
Lys Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile
485 490 495
Asn Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
500 505 510
Val Trp Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile
515 520 525
Thr Thr Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg
530 535 540
Leu Val Ala Trp Pro
545
<210> 3
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgctaacgt ttcaccgcat cattcgaaaa ggatggatgt tcctgctcgc gtttttgctc 60
actgccttgc tgttctgccc aaccggacag cccgccaagg ctgccgcacc gtttaacggc 120
accatgatgc agtattttga atggtacttg ccggatgatg gcacgttatg gaccaaagtg 180
gccaatgaag ccaacaactt atccagcctt ggcatcaccg ctctttggct gccgcccgct 240
tataaaggaa caagccgcag cgacgtaggg tacggagtat acgacttgta tgacctcggt 300
gaattcaatc aaaaaggggc cgtccgcaca aaatacggaa caaaagctca atatcttcaa 360
gccattcaag ccgcccacgc cgctggaatg caagtgtacg ccgatgtcgt gttcgaccat 420
aaaggcggcg ccgacggcac ggaatgggtg gacgccgtcg aagtcaatcc gtccgaccgc 480
aaccaacgaa tctcgggcac ctatcaaatc caagcatgga cgaaatttga ttttcccggg 540
cggggcaaca cctactccag ctttaagtgg cgctggtacc attttgatgg cgttgattgg 600
gacgaaagcc gaaaattgag ccgcatttac aaattccgcg gcaaagcgtg ggattgggaa 660
gtagacacgg aaaacggaaa ctatgactac ttaatgtatg ccgaccttga tatggatcat 720
cccgaagtcg tgactgagct gaaaagctgg gggaaatggt atgtcaacac aacgaacatt 780
gatgggttcc ggcttgatgc cgtcaagcat attaagttca gtttttttcc tgattggttg 840
tcgtatgtgc gttctcagac tggcaagccg ctatttaccg ttggggaata ttggagctat 900
gacatcaaca agttgcacaa ttacattatg aaaacaaacg gaacgatgtc tttgtttgat 960
gccccgttac acaacaaatt ttataccgct tccaaatcag ggggcacatt tgatatgcgc 1020
acgttaatga ccaatactct catgaaagat caaccaacat tggccgtcac cttcgttgat 1080
aatcatgaca ccgaacccgg ccaagcgctg cagtcatggg tcgacccatg gttcaaaccg 1140
ttggcttacg cctttattct aactcggcag gaaggatacc cgtgcgtctt ttatggtgac 1200
tattatggca ttccacaata taacattcct tcgctgaaaa gcaaaatcga tccgctcctc 1260
atcgcgcgca gggattatgc ttacggaacg caacatgatt atcttgatca ctccgacatc 1320
atcgggtgga caagggaagg ggtcactgaa aaaccaggat ccggactggc cgcattgatc 1380
accgatgggc cgggaggaag caaatggatg tacgttggca aacaacacgc cggaaaagtg 1440
ttctatgacc ttaccggcaa ccggagtgac accgtcacca tcaacagtga tggatggggg 1500
gaattcaaag tcaatggcgg ttcggtttcg gtttgggttc ctagaaaaac gaccgtctct 1560
actatcgctt ggtcgatcac aacccgaccg tggactgatg aattcgtccg ttggaccgaa 1620
ccacggttgg tggcatggcc ttga 1644
<210> 4
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttgactt ttcacagaat catcaggaaa ggatggatgt tcttgctggc ctttttgctt 60
accgcactat tgttctgccc aacgggccag cctgcaaaag ctgctgcacc attcaatggc 120
acgatgatgc agtacttcga atggtatcta cctgatgatg gaacattgtg gacgaaagtg 180
gcaaatgagg ctaacaattt gagttcatta ggaataaccg ctctgtggtt gcctcccgca 240
tacaaaggta cttccagatc agatgtcggt tatggtgttt acgacttata tgacttaggc 300
gagtttaatc aaaagggcgc agtaaggacg aagtatggta caaaggctca atatctgcaa 360
gctatacaag ccgcccatgc cgctggaatg caggtttacg cagatgtagt attcgaccac 420
aagggcggtg ccgatggtac tgaatgggtg gacgctgtcg aagtgaatcc ctccgacagg 480
aaccagcgta tcagtggcac ataccaaatt caagcctgga cgaaatttga cttccctgga 540
agaggtaaca catactcatc attcaagtgg aggtggtacc atttcgatgg tgtagactgg 600
gatgagtcta ggaagctttc acgtatctac aaatttaggg gtaaagcatg ggactgggaa 660
gttgacactg agaacggaaa ctatgattac ttgatgtacg ctgatcttga tatggatcat 720
ccagaagtcg taacggagct gaagtcctgg ggcaaatggt acgtaaatac aaccaacata 780
gatggcttca gattagatgc agtaaagcat atcaagtttt cttttttccc tgattggctt 840
agttacgttc gttcacagac tggcaagcct ctattcacgg tcggcgaata ctggtcctat 900
gatataaaca agttgcataa ctatattatg aaaaccaatg gcacgatgtc attatttgac 960
gcacccctgc ataacaaatt ttacaccgca tccaagagtg gtggaacttt cgacatgaga 1020
acacttatga cgaatacatt gatgaaggac cagccaacgc tggcagttac tttcgttgat 1080
aaccacgata ccgagcctgg acaggcccta caaagttggg tcgatccttg gttcaaaccc 1140
ctagcctatg catttatcct tactcgtcaa gaaggttatc catgtgtgtt ttacggtgac 1200
tactacggaa tcccacagta caacatccct agtttaaaat ccaagataga tcctttgtta 1260
attgctagac gtgactacgc atatggtaca caacatgact acctggatca ctccgacatc 1320
atcggttgga cgagagaggg agtcacggaa aagcctggta gtggcctagc tgcactgatt 1380
acggatggtc ccggtggcag taaatggatg tatgtaggta agcaacacgc cggtaaggtt 1440
ttctatgatc taactggcaa taggtctgac actgttacaa tcaattctga cggctgggga 1500
gagttcaaag taaacggagg aagtgtaagt gtctgggtgc ctcgtaagac taccgtgtcc 1560
acgattgcct ggagtataac cacaaggccc tggacagatg agtttgtgag gtggacagag 1620
ccaagactag ttgcttggcc ttga 1644
<210> 5
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Leu Thr Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Met Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Thr Ala Leu Leu Phe Cys Pro Thr Gly Gln Pro Ala
20 25 30
Lys Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp
35 40 45
Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala
50 55 60
Asn Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu
85 90 95
Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr
100 105 110
Gly Thr Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala
115 120 125
Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala
130 135 140
Asp Gly Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg
145 150 155 160
Asn Gln Arg Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe
165 170 175
Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp
180 185 190
Tyr His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg
195 200 205
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
210 215 220
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
225 230 235 240
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
245 250 255
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
260 265 270
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly
275 280 285
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
290 295 300
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
305 310 315 320
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
325 330 335
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
340 345 350
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
355 360 365
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
370 375 380
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
385 390 395 400
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
405 410 415
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
420 425 430
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
435 440 445
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
450 455 460
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
465 470 475 480
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
485 490 495
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
500 505 510
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
515 520 525
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
530 535 540
Ala Trp Pro
545

Claims (8)

1.一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，记为amyGSM。
2.根据权利要求1所述的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，记为AmyGSM。
3.根据权利要求1所述的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的编码基因与SEQ ID NO.1所示具有80％以上的一致性。
4.一种定点突变改造的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，记为AmyGSM。
5.根据权利要求4所述的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，记为M1-amyGSM。
6.根据权利要求4所述的耐热型α-淀粉酶，其特征在于，所述的耐热型α-淀粉酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，记为M2-amyGSM。
7.含有编码权利要求1至6中任一项所述的耐热型α-淀粉酶的核苷酸序列的重组质粒，其特征在于，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得。
8.一种包括宿主菌和权利要求7所述的重组质粒的重组菌，所述的载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体；所述的细菌表达载体包括大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。
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