JP2011015688A - 非マルトース生成エキソアミラーゼ類及び澱粉の劣化を遅延することへのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アミロペクチンの側鎖の非還元末端から4〜8個のD−グルコピラノシル単位から主として成る1又は複数の線状マルトオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を加水分解することができるシュードモナス・サッカロフィラ由来の非マルトース生成エキソアミラーゼを澱粉基材に添加することを含む方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質類、特に澱粉を分解することかできるタンパク質類に関する。
特に、本発明は、澱粉の有害な劣化を遅延することができるタンパク質の使用に関する。
有害な劣化(retrogradation)過程、たとえば老化(staling)は、典型的には、澱粉基材、特に水性澱粉懸濁液の加熱及び冷却の後に生じ、そしてゲル化された澱粉の徐々の規則状態への転位のためである。
さらに特別には、本発明は、ベーキングされたパン生成物を調製するためへのタンパク質の使用、及びそのベーキングされたパン生成物自体にも関する。
さらに特別には、本発明は、ベーキングされた澱粉質のパン生成物の劣化の遅延にも関する。
本発明はまた、非マルトース生成エキソアミラーゼを含んで成る、ドウ及びベーキングされた澱粉質のパン生成物のための改良された生成物にも関する。
澱粉はアミロペクチン及びアミロースを含んで成る。アミロペクチンは、枝分かれした及びブッシュ様構造を形成するα−(1→6)結合を通して枝分かれ点で一緒に連結される短いα−(1→4)−D−グルカン鎖を有する高度に枝分かれされた炭水化物ポリマーである。平均的に、20〜25のα−(1→4)結合されたグルコース残基ごとに1つの枝分かれ点が存在する。対照的に、アミロースは、枝だなしのα−(1→4)−D−グルカン単位から主に成る線状構造である。典型的には、澱粉は、約75%のアミロペクチン分子及び約25%のアミロース分子を含む。
特定の長さのマルト−オリゴ糖を生成する微生物酵素の発見は、多量のそれらのオリゴ糖の生成を可能にする[2]。
アメリカ特許第5,204,254号は、好アルカリ性細菌(DSM5853)の天然の及び遺伝子的に修飾されたエキソ−マルトペンタヒドロラーゼを記載する。
冷却は、澱粉濃度に依存して、ゲル化された相を粘弾性ペースト又は弾性ゲルに転換する。この工程の間、アミロース及びアミロペクチン鎖は、より規則化された構造を形成するために再会合する。時間の経過に従って、会合がより形成され、そしてそれらはさらにより規則的に成る。アミロペクチン鎖DP−15−20の会合が熱可逆性擬似結晶構造を導くと思われる。
ベーキングされたパン生成物の品質が貯蔵の間、徐々に劣化することは知られている。パンの中味は柔軟性及び弾性を失い、そして堅く且つ脆くなる。このいわゆる劣化は、非晶性状態から擬似結晶状態に、ベーキングの間ゲル化される澱粉の転移であることが理解されている、主に澱粉の有害な劣化のためである。パンの中味の堅さの上昇はしばしば、パンの劣化過程の測定値として使用される。
グルコース生成及びマルトース生成エキソ−アミラーゼ、たとえばグルコースを開放することによって澱粉を加水分解するアミログリコシダーゼ、及び非還元鎖末端からマルトースを開放することによって澱粉を加水分解するマルトース生成エキソアミラーゼ又はβ−アミラーゼを用いることによって、パンの劣化を遅延することは、当業界において知られている。
JP−62−79745号及びJP−62−79746号は、それぞれ、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)及びバチルス・メガテリウム(Bacillus megateriumu )により生成されるβ−アミラーゼの使用がパンを包含する澱粉食品の劣化の遅延において効果的であることを言及している。
それにもかかわらず、澱粉生成物、特にベーキングされた生成物、より特定にはパン生成物の有害な劣化を遅延するための、たとえば老化を遅延するための、異なった及び効果的な、好ましくはより効果的手段を提供する必要性がまだ存在する。
本発明は、有害な劣化特性が遅延する澱粉生成物の製造方法を提供する。
本発明はまた、本発明の方法において有用である酵素も提供する。
本発明の酵素はアミラーゼ酵素である。より具体的には、本発明の酵素は非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素である。
非マルトース生成エキソアミラーゼが、ベーキングされた生成物における老化を遅延するためにはもちろんのこと、澱粉生成物の有害な劣化を遅延するためにこれまで使用されたことはないことが注目されるべきである。
澱粉基材への非マルトース生成エキソアミラーゼの添加は、澱粉生成物の加熱の間、及び/又はその後に行うことができる。
従って、本発明の第2の観点によれば、本発明の方法により得られる、ベーキングされた生成物が提供される。
従って、本発明の第4の観点によれば、澱粉生成物の有害な劣化を遅延するために澱粉生成物への非マルトース生成エキソアミラーゼの使用が提供される。
従って、本発明の第5の観点によれば、新規非マルトース生成エキソアミラーゼが提供される。
本発明のそれらの及び他の観点は、請求の範囲に提供される。さらに、本発明のそれらの及び他の観点、並びにそれらの好ましい観点が下記に提供され、そして論じられる。
従って、本発明は、澱粉基材、特に澱粉ゲルの有害な劣化を遅延することができるタンパク質の使用に関する。
1つの好ましい観点においては、本発明は、澱粉の劣化を遅延することができるタンパク質の使用に関する。
もう1つの観点においては、本発明は、澱粉基材、たとえば澱粉ゲルの有害な劣化を遅延することができるタンパク質の使用に関する。
本発明によれば、用語“澱粉”とは、澱粉自体、又はその成分、特にアミロペクチンを意味する。
本発明によれば、用語“澱粉基材”とは、澱粉を含んで成るいずれかの適切な基材を意味する。
好ましくは、澱粉生成物は、小麦粉から得られた澱粉を含み、又はその澱粉に基づかれ、又はその澱粉に由来する。
用語“小麦粉”とは、本明細書において使用される場合、小麦粉又は他の穀物の細かく粉砕された粉と同義語である。しかしながら、好ましくは、その用語は、小麦自体から得られ、そして他の穀物からではない食料粉を意味する。従って、及び特にことわらない限り、“小麦粉”とは、本明細書において使用される場合、小麦粉自体を意味し、そして基材、たとえばドウに存在する場合も小麦粉を意味する。
好ましくは、澱粉生成物は、大麦生成物である。
より好ましくは、澱粉生成物は、パン生成物である。
さらにより好ましくは、澱粉生成物は、ベーキングされた澱粉質のパン生成物である。
用語“非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素”とは、最初、澱粉を実質的な量のマルトースに分解しない酵素を意味する。非常に好ましい観点においては、その用語はまた、最初、澱粉を実質的な量のマルトース及びグルコースに分解しない酵素を意味する。
本発明に従ってアミラーゼ活性を決定するための適切なアッセイは、後で提供される。便利には、このアッセイは“アミラーゼアッセイプロトコール”と呼ばれる。
従って、好ましくは、用語“非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素”とは、本明細書に提供される“アミラーゼ活性プロトコール”に記載のような生成物測定方法に従って分析される場合、前記酵素が最初、澱粉を実質的な量のマルトースに分解しないことを意味する。
参照の容易さ及び本発明の目的のために、パルスされた電流滴定検出及び標準として、グルコース〜マルトヘプタオースの既知線状マルトオリゴ糖と共にDionex PA 100 カラムを用いて、アニオン交換HPLCによる加水分解生成物の分析特徴は、“アニオン交換による分析”として言及され得る。もちろん、及びまさに示されるように、他の分析技法及び他の特定のアニオン交換技法でも十分である。
用語“P.サッカロフィラ(Pseudomonas sacharophila)から得ることができる”とは、酵素がP.サッカロフィラから必ずしも得られる必要はないことを意味する。代わりに、酵素は組換えDNA技法の使用により調製され得る。
バチルス・グラウジから得ることができる酵素に関しての用語“その機能的同等物”とは、その機能的同等物が他の源から得られることを意味する。機能的に同等の酵素は異なったアミノ酸配列を有するが、しかし非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するであろう。
本発明は、非マルトース生成エキソアミアーゼが澱粉生成物、たとえばベーキングされた生成物において有害な劣化、たとえば老化(staling)を遅延し又は低めることにおいて非常に効果的である驚くべき発見に基づかれている。
本発明者は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼが、グルース生成及びマルトース生成エキソアミラーゼよりも、パンにおける有害な劣化、たとえば老化を遅延することにおいてより効果的であり得ることを見出した。
有害な劣化の低下は、当業界において知られている標準の技法により測定され得る。例によれば、いくつかの技法が、セクション標題“劣化の測定のためのアッセイ”において、後で示される。
さらに、本発明者は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼを用いることによって得ることができる有害な劣化の遅延が非常に広範囲にわたって、用量応答性であることを見出した。これは、かなり制限され、そして強く低下する用量応答を有するマルトース生成エキソアミラーゼからの効果と対照的である。
1つの観点において、本発明は、澱粉生成物、たとえば製パン製品を調製するためへの一定のアミラーゼの使用を提供する。この観点においては、非マルトース生成エキソアミラーゼであるアミラーゼは、澱粉生成物、特にベーキングされた澱粉質パン生成物の老化を遅延し、又は低める(すなわち、老化の速度を低める)。
好ましくは、アミラーゼは、単離された形で及び/又は実質的に純粋な形で存在する。ここで、用語“単離された”とは、酵素がその天然の環境下で存在しないことを意味する。
本発明によれば、非マルトース生成エキソアミラーゼは、アミロペクチンの側鎖の非還元末端から、4〜8個のD−グルコピラノシル単位から主に成る線状マルトオリゴ糖を切り離すことができる。この特徴を有し、そして本発明への使用のために適切である非マルトース生成エキソアミラーゼは、アミラーゼアッセイプロトコール(前記)に示されるモデル系におけるゲル化されたモチ状トウモロコシを加水分解するそれらの能力により同定される。
本発明のより好ましい観点においては、前記試験における前記加水分解生成物は、少なくとも60重量%、特に少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%そして最も好ましくは少なくとも85重量%の、4個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の生成物パターンを有する。
好ましくは、非マルトース生成エキソアミラーゼは、その一次生成物をグルコース、マルトース及びマルトトリオースに転換するように該生成物を実質的に加水分解しない。その場合、前記一次生成物は、酵素に対してアミロペクチン非還元鎖末端と基質として競争し、その結果、その抗−劣化効率を低められる。
好ましくは、本発明の使用のために適切である非マルトース生成エキソアミラーゼは、1単位のエキソアミラーゼ活性当たり0.05より少いEAUを有し、そしてより好ましくは、1単位のエキソアミラーゼ活性当たり0.01より少いEAUを有する。
エンドアミラーゼ単位は、下記に示されるエンドアミラーゼアッセイプロトコールにより決定され得る。
1つの観点においては、本発明はまた、本発明の澱粉生成物、たとえば製パン生成物を調製するために適切である新規アミラーゼを提供する。本発明の新規アミラーゼは、非マルトース生成エキソアミラーゼである。本発明の研究において、本発明者は、食品、特に製パン生成物の調製に使用するためのドウの調製のために適切であるこの新規アミラーゼを特性決定した。
本発明の酵素はまた、たとえば標準技法の使用により、抗体を生成するためにも使用され得る。従って、本発明の個々の酵素に対する抗体が生成され得る。個々の抗体は、発明の他の適切なアミラーゼ酵素をスクリーンするために使用され得る。さらに、個々の抗体は本発明の酵素を単離するためにも使用され得る。
示されるように、本発明の1つの観点は、澱粉生成物、特にドウ及び/又はドウから製造されるベーキングされた澱粉質パン生成物のための改良性組成物に関する。
改良性組成物は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼ及び少なくとも1つの追加のドウ成分又はドウ添加剤を含んでなる。
本発明によれば、追加のドウ成分又はドウ添加剤は、上記に記載されるドウ成分又はドウ添加剤のいずれかであり得る。
本発明の1つの観点によれば、その方法は、適切な非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素、たとえば本明細書に示される新規の非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素の1つを、澱粉基材に添加することによって、澱粉生成物を形成することを含んで成る。
澱粉基材がドウである場合、ドウは、穀物、水、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼ及び他の可能な成分及び添加剤を一緒に混合することによって調製される。
膨化剤(leavening agent)は、化学膨化剤、たとえば炭酸水素ナトリウム、又はサッカロミセス・セレビシアエのいずれかの株(パン酵素)であり得る。
非マルトース生成エキソアミラーゼは、いずれかのドウ成分、たとえば水又はドウ成分混合物と共に、又はいずれかの添加剤又は添加剤混合物と共に添加され得る。
澱粉質パン生成物、たとえば精白パン、篩分けされたライ麦粉及び小麦粉から製造されたパン、ロールパン及び同様のものベーキングは、典型的には、180〜250℃の範囲のオーブン温度で、約15〜60分間、パン用ドウをベーキングすることによって達成される。ベーキング工程の間、急な温度グラジェント(200→120℃)が外部ドウ層において有力であり、ここでベーキングされた生成物の特徴的な外皮が進行する。しかしながら、蒸気発生による熱消費のために、パンの中味の温度がベーキング工程の最後で、100℃に接近する。
ベーキングされた生成物の性質をさらに改良し、そしてベーキングされた生成物に特徴的な性質を付与するために、追加のドウ成分及び/又はドウ添加剤がドウ中に導入され得る。典型的には、そのような追加の成分は、ドウ成分、たとえば塩、穀粒、脂肪及び油、糖、ダイエット用繊維物質、粉乳、グルテン及びドウ添加剤、たとえば乳化剤、他の酵素、親水コロイド、風味剤、酸化剤、鉱物及びビタミンを含むことができる。
本明細書においては、1単位の非マルトース生成エキソアミラーゼは、この後に記載されるように、50mMのMES, 2mMの塩化カルシウム溶液(pH6.0)中、10mg/mlのモチ状トウモロコシ澱粉4mlを有する試験管において50℃でインキュベートされる場合、1分当たり1μモルの還元糖に等しい加水分解生成物を開放する量の酵素として定義される。
本発明は、食品の製造への使用のための適切なアミラーゼを提供する。動物飼料を包含する典型的な食品は、酪農製品、食肉製品、家禽製品、魚製品及び製パン製品を包含する。
好ましくは、食品は製パン生成物、たとえば上記に記載される製パン生成物である。本発明の範囲内に組み込まれる典型的な製パン(ベーキングされた)生成物は、パン、たとえば一塊のパン、ロールパン、バン、ビザ生地、等、プレッツェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー、等を包含する。
次のシステムが、本発明への使用のために適切である非マルトース生成エキソアミラーゼを特徴づけるために使用される。
初期のバックグラウンド情報によれば、モチ状トウモロコシアミロペクチン(Roquette, France からWAXILYS 200 として得ることができる)は、非常に高いアミロペクチン含有率(90%以上)を有する澱粉である。
20mg/mlのモチ状トウモロコシ澱粉は、50mMのMES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)、2mMの塩化カルシウムの緩衝液(pH6.0)において3分間煮沸され、そして続いて50℃でインキュベートされ、そして30分以内に使用される。
還元糖は、標準としてマルトースを用い、及びBernfeld, Methods Enzymol., (1954), 1, 149-158のジニトロサリチル酸法又は還元糖を定量化するための当業界において知られている他の方法を用いて測定される。
0.75mlの酵素溶液が、50mMのMES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)、2mMの塩化カルシウム溶液(pH6.0)中、0.5%(w/v)のAZCL−アミロース(Megazyme, Ireland から入手できるアズリン架橋されたアミロース)6.75mlと共に50℃でインキュベートされる。5, 10, 15, 20及び25分後、それぞれ1.0mlの反応混合物が、4%(w/v)のTRIS(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)から成る停止溶液4.0mlに移される。
本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼの抗老化効果の評価のために、パン中味の堅さが、Instrn 4301 Universal Food Taxture Analyzer 又は当業界において知られている類似する装置により、ベーキングの1, 3及び7日後、測定され得る。
要約すれば、本発明は、アミロペクチンの非還元鎖末端から4〜8個の範囲のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を加水分解し、そして好ましくは、十分な程度の熱安定性を有する非マルトース生成エキソアミラーゼが、ベーキングされた生成物における有害な劣化を遅延し、又は低めるのに非常に効果的である驚くべき発見に基づかれている。
次のサンプルが、1999年3月12日、公認された寄託機関DSMZ(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH of Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig)に、ブダペスト条約に従って寄託された:BT−21 DSM番号DSM12731。
本発明はまた、それらの寄託物及びそれを含んで成る具体物から誘導でき、そして/又は発現できる配列、及びその活性フラグメントも包含する。
例1.シュードモナス・サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの発酵及び生成
1.1生成:
P.サッカロフィラ株IAM No. 1544を、IAM Culture Collection, Inst. Of Mloecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo, Japan から得た。
温度: 30℃
撹拌速度: 1000rpm
通気 1体積空気/1体積培地/分
pH: 2Mの水酸化ナトリウム及び10%(w/v)の塩酸による調節による一定のpH7.4
Bacto Yeast 抽出物 20g/l
澱粉 20g/l
Na2HPO4・2H2O 5.6g/l
KH2PO4 1.5g/l。
1日の発酵の後、発酵ブイヨンを遠心分離し、そして濾過し、細胞を除いた。細胞フリーブイヨンにおける非マルトース生成エキソアミラーゼの活性は、上記のようにして決定される場合、5単位/mlであった。
P.サッカロフィラの非マルトース生成エキソアミラーゼを、200mMの硫酸ナトリウム、50mMのトリエタノールアミン、2mMの塩化カルシウムを含むA−緩衝液(pH7.2)を含む、150mlのPhenyl Sepharose FF低サブカラム(Pharmacia, Sweden) を用いて、疎水性相互作用グロマトグラフィーにより、部分的に精製した。濾過された発酵ブイヨン(500ml)を、200mMの硫酸ナトリウムによりpH7.2に調節し、そしてカラム上に負荷した。非マルトース生成エキソアミラーゼを、A−緩衝液中、直線的に低下する硫酸ナトリウムグラジエントにより遊離した。エキソアミラーゼ活性を含む画分をプールした。
最初に、P.サッカロフィラのエキソ−アミラーゼ(PS4と呼ばれる)をコードする遺伝子のDNA配列が、Zhouなど(Zho JH, Baba T, Takano T, Kobayash S, Arai Y (1989) FEBS Lett 1989 Sep 11; 255 (1): 37-41 “Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas sacchrophila”)により公開されている。さらに、前記DNA配列は、受託番号X16732としてGenBankから入手できる。
PS4の最適温度及びpHは、Zhouなど(Zhon JH, Baba T, Takano T, Kobayashi S, Arai Y (1992) Carbohydr Res 1992 Jan; 223: 255-61 “Properties of the enzyme exzyme expressed by the Pseudomonas saccharophila maltotetrahydrolase gene (mta) in Escherichia coli”)によれば、45℃及びpH6.5である。
ベーキング試験を、P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの抗固化効果を試験するために設定した。Danish Toast Bread のためのレセピーを使用した。それは、食料粉(2000g)、乾燥酵母(30g)、糖(30g)、塩(30g)及び水(400g Brabender Units (BU)のドウコンシステンシーに対応する約1200g+使用される乾燥酵母を補足するための追加の水60g)を含み、そしてそれらを、遅い速度で2分間及び早い速度で12分間、Hobartミキサー(モデルA−200)において混合する。
ANOVA表は、次の2種の成分に7日目での堅さの変動を分ける:グループ間成分及びグループ内成分。この場合、72.0に等しいF−比率は、グループ内推定値に対するグルループ間推定値の比率である。F−試験のP−値は0.05以下であるので、95.0%の信頼レベルで、1つの酵素レベルからもう1つの酵素レベルでの平均堅さ間に統計学的に有意な差異が存在する。平均が他の平均と有意に異なるかどうかを決定するためには、Tabalar Options の列挙からMaltiple Range Testを選択すること。
次のことは、E.コリMC1061におけるシュードモナス・サッカロフィラからの非マルトース生成エキソアミラーゼをコードするmta遺伝子の本発明のクローニング及び発現を記載する。
この観点においては、P.サッカロフィラIAM1520を、2mlのLB培地において増殖し、そして細胞を、20,000xgで10分間の遠心分離により収穫した。全DNAを、わずかに変更されたminiprep プロトコールを用いて単離した。細胞を、300μlの再懸濁緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH8.0:10mMのEDTA;100μg/mlのRNアーゼA)に再懸濁し、この後、細胞を、Fastprep FP120 (BIO101; California)を用いて粉砕した。
#1 ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC 位置213−233
#2 GCT CCT GAT ACG ACA GCG 位置2403−2386
#3 GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC CCG 位置663−683
#4 TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T 位置2258−2238
反応2:1605bpのグラグメントを付与する#3+#4.
GAT CAT CAA GGA CTG GTC C 1382-1400
CTT GAG AGC GAA GTC GAA C 1439-1421
GAC TTC ATC CGC CAG CTG AT 1689-1780
前記位置は、GenBan受託番号X16732号に見出されるmtaについての配列を示す。上方の番号のプライマーはまず、アンチセンスプライマーであり、そしてその配列は相補的配列である。
サツマイモβ−アミラーゼ(EC 3. 2. 1. 2; 製品番号A7005号としてSigmaから得ることができる)は、澱粉の非還元末端からマルトースを開放するマルトース生成エキソアミラーゼである。
このマルトース生成エキソアミラーゼの熱安定性は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMの塩化カルシウム溶液(pH6.5)において45〜75℃の温度で15分間インキュベートした後、残留活性により示されるように、P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの熱安定性に類似する(表4)。
材料及び方法:
材料:コーンからのアミロペクチン及びアミロース、コーン澱粉、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ウシ血清アルブミン(BSA)、デキストラン、プルラン、マルトース、マルトトリオース、及びマルトテトラオース〜マルトデカオースの混合物を、Sigma Chemical Co., St. Louis, USAから得た。可溶性澱粉を、Merck, Darmstadt, Germany から得た。酵素抽出物及びトリプトンは、Difco Laboratories, Detroit, USAから得られた。
B.クラウジBT−21の単離:前記株は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, Braunshweig, Germany)により同定された、Assens, Denmark により集められた土壌サンプルから単離される。
酵素アッセイ:0.1Mの硼酸緩衝液(pH10.0)中、2mlの可溶性澱粉溶液(1.25%)を、0.5mlの酵素溶液と共に45℃で2時間インキュベートした。反応を、その混合物を10分間、煮沸することによって停止した。還元糖の形成を、CuSO4/ビシンコネート アッセイ[38]により決定し、そして形成されるmMマルトース同等物として計算した。1単位の活性は、pH10.0及び45℃で1分当たり1μモルのマルトース同等物を生成する酵素の量に対応する。
B.グラウジBT−21の同定:その脂肪酸組成によれば、前記菌株は、バチルス属に対する類似性を示した。16SrDNAの部分配列決定は、B.クラウジに対して99.4%の類似性を示した。アルカリ耐性株の生理学的性質がこの同定を確認した。
B.グラウジBT−21によるアミラーゼ活性の生成:ジャガイモからの可溶性澱粉、コーン澱粉、トウモロコシ及び玄米からのアミロペクチンは、基材において異なったレベルの細胞外アミラーゼ活性をもたらした。
生成物−特異的アミラーゼの精製:酵素を、β−CD Sepharose 6Bによる親和性クロマトグラフィー、続くアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した(表6)。
澱粉加水分解の間、酵素の作用のモードをさらに試験するために、異なった基質を、精製された酵素と共にインキュベートした(表7)。
ベーキング実験を、生成物−特異的アミラーゼにより行った。ドウを、10gの標準デンマークの小麦粉(Danisco 98078)、及び40単位の酵素(セクションBの材料及び方法に記載されるように、45℃及びpH10でアッセイされる)を有さない(対照)又は有する、0.2MのNaOH−グリシン緩衝液(pH10)6.2mlにより調製し、ベーキングし、そして“劣化及び老化の測定のためのアッセイ”に従って、貯蔵の後、DSCにより分析した。表8に示されるように、酵素は、それが有意な抗老化効果有することを示すベーキングの7日後に見出される劣化されるアミロペクチンの量を有意に低める。
本発明は製パン製品を製造するための方法、及びそのような方法への使用のために適切なアミラーゼを開示する。
本発明の好ましい態様は、次の番号付けされた文章により示される。
1.遅延された老化性質を有するベーキングされた澱粉質パン生成物を製造する方法が提供され、ここで前記方法は、ベーキング工程の間、アミロペクチンの側鎖の非還元末端から、4〜8個のD−グルコピラノシル単位から主に成る線状マルトオリゴ糖を分解することによって、澱粉を加水分解することができる有効量の非マルトース生成エキソアミラーゼのドウ成分、ドウ添加物又はドウへの添加を含んで成る。
3.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、kg食料粉当たり50〜100,000単位、好ましくはkg食料粉当たり100〜50,000単位の範囲で存在する量で添加される前記1又は2の方法。
4.前記非マルトース生成エキソアミラーゼがkg食料粉当たり200〜20,000単位の範囲で存在する量で添加される前記3の方法。
6.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当たり0.05以下のエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有する前記1〜4のいずれかに記載の方法。
7.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当たり0.01以下のエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有する前記1〜4のいずれかに記載の方法。
10.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記8記載の条件下でインキュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項8記載のようにして分析される場合、それが少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%及び最も好ましくは少なくとも90重量%のマルトペンタオースを生成する前記8の方法。
12.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記8記載の条件下でインキュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項8記載のようにして分析される場合、それが少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%及び最も好ましくは少なくとも90重量%のマルヘプタオースを生成する前記8の方法。
14.少なくとも1つの乳化剤がドウ成分、ドウ添加剤又はドウに添加される請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
17.前記追加の酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ及びプロテアーゼから成る群から選択される前記16の方法。
18.ベーキング工程の間、アミロペクチンの側鎖の非還元末端から、4〜8個のD−グルコピラノシル単位から主として成る線状マルトオリゴ糖を分解することによって、澱粉を加水分解できる非マルトース生成エキソアミラーゼ、少なくとも1つの追加のドウ成分又はドウ添加剤から成るドウから製造されるドウ及びベーキングされた澱粉質パン生成物のための改良生成物。
20.前記非マルトース生成エキソアミラーゼがエキソアミラーゼ活性1単位当たり0.05以下のエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有する前記18の改良性組成物。
21.前記非マルトース生成エキソアミラーゼがエキソアミラーゼ活性1単位当たり0.01以下のエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有する前記18の改良性組成物。
24.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項8記載の条件下でインキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項8記載のようにして分析される場合、少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%及び最も好ましくは少なくとも90重量%のマルトペンタオースを生成する前記22の改良性組成物。
26.前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項8記載の条件下でインキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項8記載のようにして分析される場合、少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%及び最も好ましくは少なくとも90重量%のマルトヘプタオースを生成する前記22の改良性組成物。
28.乳化剤及びヒドロコロイドから成る群から選択された少なくとも1つの添加剤を含んで成る前記19〜27のいずれかに記載の改良性組成物。
29.少なくとも1つの乳化剤がドウ成分、ドウ添加剤又はドウに添加される前記28の改良性組成物。
31.セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ及びプロテアーゼから成る群から選択された少なくとも1つの追加の酵素を含んで成る前記19〜30のいずれかに記載の改良性組成物。
32.請求項1〜17のいずれか1項記載の方法により得ることができるベーキングされた澱粉質パン生成物。
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Claims (22)
- 澱粉生成物の製造方法であって、アミロペクチンの側鎖の非還元末端から4〜8個のD−グルコピラノシル単位から主として成る1又は複数の線状マルトオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を加水分解することができる非マルトース生成エキソアミラーゼを澱粉基材に添加することを含んで成る方法。
- 前記澱粉基材が食料粉を含んで成り、前記食料粉が小麦粉もしくはライ麦粉、又はそれらの混合物である請求項1記載の方法。
- 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、50〜100,000単位/kg食料粉、好ましくは100〜50,000単位/kg食料粉、より好ましくは200〜20,000単位/kg食料粉の範囲の量で添加される請求項2記載の方法。
- 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当たり0.5より少いエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有し、好ましくは単位エキソアミラーゼ活性当たり0.05より少いエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有し、より好ましくは単位エキソアミラーゼ活性当たり0.01より少いエンドアミラーゼ単位(EAU)のエンドアミラーゼ活性を有する請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験において、2〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意にはグルコースの1又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物を生成する能力を有し、その結果、少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%そして最も好ましくは少なくとも85重量%の前記加水分解生成物が、3〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは4〜8個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から成ることをさらに特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%そして最も好ましくは少なくとも85%の前記加水分解生成物が、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオール、マルトヘプタオース又はマルトオクタオースである請求項5記載の方法。
- 少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、及び最も好ましくは少なくとも80%の前記加水分解生成物がマルトテトラオースである請求項6記載の方法。
- 前記酵素がシュードモナス・サッカロフィラ(Pseudomonas sacharophila)から得られるもの又はその機能的同等物である請求項7記載の方法。
- 前記加水分解生成物の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%そして最も好ましくは少なくとも85%がマルトへキサオースである請求項6記載の方法。
- 前記酵素が、バチルス・グラウジ(Bacillus clausii)から得られるもの又は機能的同等物である請求項9記載の方法。
- 前記酵素が、約101,000Da(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により推定される場合)の分子量を有する請求項10記載の方法。
- 前記酵素が、pH9.5及び55℃で最適活性を有する請求項10又は11記載の方法。
- 前記澱粉生成物がドウである請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記澱粉生成物がベーキングされたドウである請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記澱粉生成物がベーキングされた澱粉質のパン生成物の調製のためのものである請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
- 前記澱粉生成物がベーキングされる請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
- 請求項16記載の方法により得られるベーキングされた生成物。
- 請求項1〜17のいずれか1項記載の非マルトース生成エキソアミラーゼ、及び少なくとも1つの追加のドウ成分又はドウ添加剤を含んで成る、ドウのための改良性組成物。
- 約101,000Da(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により推定される場合)の分子量、及び/又はpH9.5及び55℃で最適活性を有する、バチルス・クラウジから得られる非マルトース生成エキソアミラーゼ又はその機能的同等物。
- 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験において、2〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意にはグルコースの1又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物を生成する能力を有し、その結果、前記加水分解生成物の少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも70重量%、より好ましくは少なくとも80重量%そして最も好ましくは少なくとも85重量%が、3〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは4〜8個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から成ることをさらに特徴とする請求項19記載の非マルトース生成エキソアミラーゼ。
- 澱粉生成物の劣化を遅延するために前記澱粉生成物への非マルトース生成エキソアミラーゼの使用。
- 本明細書に及び請求項1に実質的に記載されるような方法、改良性組成物、酵素又は使用。
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