ES2241267T3 - Exoamilasas no maltogenicas y su utilizacion en el retraso de la retrogradacion del almidon. - Google Patents
Exoamilasas no maltogenicas y su utilizacion en el retraso de la retrogradacion del almidon.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un producto de panificación que comprende añadir a un medio de almidón una exoamilasa no maltogénica que es capaz de hidrolizar el almidón mediante la escisión de uno o más maltooligosacáridos lineales, que constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo, de los extremos no reductores de las cadenas secundarias de la amilopectina.
Description
Exoamilasas no maltogénicas y su utilización en
el retraso de la retrogradación del almidón.
La presente invención se refiere a proteínas,
especialmente proteínas que son capaces de degradar el almidón.
En particular, la presente invención se refiere a
la utilización de proteínas que son capaces de retardar la
retrogradación perjudicial del almidón.
Los procedimientos de retrogradación
perjudiciales, tales como el envejecimiento, suceden típicamente
después de calentar y enfriar el medio de almidón, en particular
suspensiones de almidón acuosas, y son debidos a la transformación
de almidón gelatinizado a un incrementado estado ordenado.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a la utilización de proteínas que son capaces de retardar
la retrogradación perjudicial de la amilopectina.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a la utilización de proteínas para la preparación de
productos de panificación horneados, además de los mismos productos
de panificación horneados.
Más particularmente, la presente invención se
refiere al retraso en el envejecimiento de productos de
panificación harinosos horneados.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un procedimiento de producción de un producto de
panificación harinoso horneado que posee un envejecimiento
retrasado o reducido, que comprende la adición de una exoamilasa no
maltogénica a la masa de panificación.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición mejoradora para la masa y los productos de panificación
harinosos horneados que comprenden una exoamilasa no
maltogénica.
El almidón comprende amilopectina y amilosa. La
amilopectina es un polímero de carbohidrato elevadamente ramificado
con cadenas cortas de
\alpha-(1\rightarrow4)-D-glucano
que están unidas en los puntos de ramificación a través de enlaces
\alpha-(1\rightarrow6) formando una estructura ramificada y
similar a un arbusto. En promedio, existe un punto de ramificación
para cada 20-25 residuos de glucosa unidos
\alpha-(1\rightarrow4). Por el contrario, la amilasa es una
estructura lineal que consiste principalmente en unidades de
\alpha-(1\rightarrow4)-D-glucano
no ramificados. Típicamente, los almidones contienen aproximadamente
75% de moléculas de amilopectina y aproximadamente 25% de moléculas
de amilosa.
Más específicamente, los maltooligosacáridos
lineales se componen de 2-10 unidades de
\alpha-D-glucopiranosa unida
mediante un enlace \alpha-(1\rightarrow4). Debido a sus
propiedades tales como bajo dulzor, elevada capacidad de retención
de agua, y la prevención de la cristalización de sacarosa [1] estos
compuestos poseen aplicaciones potenciales en la industria
alimentaria. La preparación de maltooligosacáridos con un grado de
polimerización (DP) superior a 3 (es decir, DP >3) en grandes
cantidades es, sin embargo, tediosa y cara.
Como información de base, DP1 = glucosa, DP2 =
maltosa, DP3 = maltotriosa, DP4 = maltotetraosa, DP5 =
maltopentaosa, DP6 = maltohexaosa, DP7 = maltoheptaosa, DP8 =
maltooctaosa, DP9 = maltononaosa, y DP10 = maltodecaosa.
El descubrimiento de enzimas microbianos, que
producen maltooligosacáridos de una longitud específica podría
permitir la producción de cantidades grandes de estos oligosacáridos
[2].
Las amilasas son enzimas que degradan el almidón,
clasificadas como hidrolasas, que escinden los enlaces glucosídicos
\alpha-D-(1\rightarrow4) en el almidón.
Generalmente, las \alpha-amilasas (E.C. 3.2.1.1,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
glucanohidrolasa) se definen como enzimas que endoactúan
escindiendo los enlaces
\alpha-D(1\rightarrow4)
O-glucosídicos dentro de la molécula de almidón de
una forma aleatoria [3]. Por el contrario, las enzimas amilolíticas
que exoactúan, tales como las \beta-amilasas (E.C.
3.2.1.2,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
maltohidrolasa), y algunas amilasas específicas de producto escinden
la molécula de almidón a partir del extremo no reductor del
sustrato [4]. Las \beta-amilasas,
\alpha-glucosidasas (E.C. 3.2.1.20,
\alpha-D-glucósido
glucohidrolasa), glucoamilasa (E.C. 3.2.1.3,
\alpha-D-(1\rightarrow4)-glucano
glucohidrolasa), y amilasas específicas de producto pueden producir
los maltooligosacáridos de una longitud específica a partir del
almidón.
Se han identificado anteriormente diversas
amilasas productoras de maltooligosacáridos de un DP específico
incluyendo amilasas productoras de maltohexaosa a partir de
Klebsiella pneumonia [5, 6], Bacillus subtilis [7],
B. circulans G-6 [8], B.circulans
F-2 [9, 10], y B.caldovelox [11, 12]. Las
amilasas productoras de maltopentaosa se han detectado en B.
licheniformis 584 [13] y en Pseudomonas spp. [14, 15].
Además, las amilasas productoras de maltotetraosa se han publicado
a partir de Pseudomonas stutzeri NRRL B-3389
[16, 17], Bacillus sp. MG-4 [18] y
Pseudomonas sp. IMD353 [19] y amilasas productoras de
maltotriosa a partir de Streptomyces griseus
NA-468 [20] y B. subtilis [21].
El documento
EP-B1-298.645 describe un
procedimiento para la preparación de la exomaltotetraohidrolasa de
Pseudomonas stutzeri o P. saccharophila utilizando
técnicas de ingeniería genética.
La patente US nº 5.204.254 describe una
exomaltopentaohidrolasa nativa y una genéticamente modificada de
una bacteria alcalofílica (DSM 5853).
Se han identificado muy pocas amilasas
específicas de producto activas a pH elevado. Ejemplos de las que
se han identificado incluyen amilasas de Bacillus sp.
H-167 productoras de maltohexaosa [22, 23], de un
aislado bacteriano (163-26, DSM 5853) productoras
de maltopentaosa [24], de Bacillus sp. IMD370 productoras de
maltotetraosa y pequeñas cantidades de maltooligosacáridos [25], y
de Bacillus sp. GM 8901 que produce inicialmente
maltohexaosa a partir de almidón que se convirtió en maltotetraosa
durante periodos de hidrólisis extensos [26].
Los gránulos de almidón calentados en presencia
de agua experimentan una fase de transición de
orden-desorden denominada gelatinización, en la que
el líquido se absorbe por los gránulos hinchados.
Las temperaturas de gelatinización varían para
diferentes almidones y dependen de su fuente biológica para los
almidones nativos, no modificados.
El enfriamiento convierte la fase gelatinizada en
una masa viscoelástica o gel elástico, dependiendo de la
concentración de almidón. Durante este procedimiento, las cadenas
de amilosa y de amilopectina se reasocian para formar una estructura
más ordenada. Con el tiempo, se forman más asociaciones e incluso
se vuelven más ordenadas. Se cree que las asociaciones de cadenas
de amilopectina DP 15-20 llevan a una estructura
cuasi-cristalina, termorreversible.
A consecuencia de la retrogradación perjudicial,
la capacidad de retención de agua del sistema de masa o gel cambia
con implicaciones importantes sobre la textura de gel y sobre las
propiedades alimenticias.
Se conoce que la calidad de los productos de
panificación horneados se deteriora gradualmente durante el
almacenamiento. La miga pierde suavidad y elasticidad y se vuelve
firme y quebradiza. Este envejecimiento así denominado se debe
primariamente a la retrogradación perjudicial del almidón, que se
entiende que es una transición del almidón gelatinizado durante el
horneado a partir de un estado amorfo a un estado
cuasi-cristalino. El incremento en firmeza de la
miga se utiliza a menudo como una medida del procedimiento de
envejecimiento del pan.
Tras el enfriamiento del pan recién horneado la
fracción de amilosa, en horas, se retrograda para desarrollar una
red. Este procedimiento es beneficioso porque crea una estructura
de miga deseable con un grado bajo de firmeza y mejora las
propiedades de rebanado. La cristalización más gradualmente de la
amilopectina tiene lugar dentro de los gránulos de almidón
gelatinizados durante los días posteriores al horneado. En este
procedimiento se cree que la amilopectina refuerza la red de amilosa
en la que están incrustados los gránulos de almidón. El refuerzo
lleva a un incremento en la firmeza de la miga de pan. Este
refuerzo es una de las principales causas del envejecimiento del
pan.
La velocidad de retrogradación perjudicial o
cristalización de la amilopectina depende de la longitud de las
cadenas secundarias de la amilopectina. Según esto, la amilopectina
de cereales retrograda a una velocidad inferior que la amilopectina
de guisante o patata, que posee una longitud de cadena promedio más
larga que la amilopectina de cereal.
Esto está apoyado por observaciones de sistemas
de gel de amilopectina en los que la amilopectina con longitud de
cadena promedio de DP, es decir, grado de polimerización, \leq11
no cristaliza en absoluto. Además la presencia de cadenas muy
cortas de DP 6-9 parece inhibir la cristalización de
los alrededores de las cadenas secundarias más largas probablemente
debido al impedimento estérico. De ese modo estas cadenas cortas
parecen poseer un efecto de retrogradación perjudicial fuerte. Según
esto, la retrogradación de la amilopectina es directamente
proporcional a la fracción molar de cadenas secundarias con DP
14-24 e inversamente proporcional ala fracción molar
de cadenas secundarias con DP 6-9.
En el trigo y en otros cereales las cadenas
secundarias externas de amilopectina están en el intervalo de DP
12-19. De este modo, la hidrólisis enzimática de las
cadenas secundarias de la amilopectina puede reducir marcadamente
sus tendencias de cristalización.
En la técnica se conoce el retraso del
envejecimiento del pan mediante la utilización de exoamilasas
glucogénicas y maltogénicas -tales como amiloglucosidasas que
hidrolizan el almidón mediante liberación de la glucosa- y
exoamilasas maltogénicas o \beta-amilasas -que
hidrolizan el almidón mediante la liberación de la maltosa a partir
de los extremos de cadena no reductores.
A este respecto, Jakubczyk et al.
(Zesz. Nauk. Sck. Gl. Gospod Wiejsk. Warzawie, Technol.
Reino-Spozyw, 1973,
223-235) publicó que la amiloglucosidasa puede
retrasar el envejecimiento del pan de harina de trigo horneado.
Los documentos
JP-62-79745 y
JP-62-79746 describen que la
utilización de la \beta-amilasa producida por
Bacillus stearothermophilus y Bacillus megaterium,
respectivamente pueden ser eficaces en el retraso del envejecimiento
de alimentos de almidón, incluyendo el pan.
El documento
EP-A-412.607 describe un
procedimiento para la producción de un producto de panificación que
posee propiedades de envejecimiento retardadas por la adición a la
masa de una exoamilasa termoestable, que no se activa antes de la
gelatinización. Solo las amiloglucosidasas y las
\beta-amilasas están listadas como exoamilasas
adecuadas para su utilización. La exoamilasa está en una cantidad
que es capaz de modificar selectivamente las propiedades de
cristalización del componente de amilopectina durante el horneo
mediante la separación de la glucosa o maltosa a partir de los
extremos no reductores de amilosa y amilopectina. Según el documento
EP-A-412.607, la exoamilasa reduce
selectivamente las propiedades de cristalización de la
amilopectina, sin afectar sustancialmente las propiedades de
cristalización de la amilosa.
El documento
EP-A-494.233 describe la utilización
de una exoamilasa maltogénica para liberar maltosa en la
configuración \alpha y que no se inactiva antes de la
gelatinización en un procedimiento para la producción de un producto
horneado que posee propiedades de envejecimiento retardadas. Solo
se describe específicamente una \alpha-amilasa
maltogénica de la cepa Bacillus NICB 11837. Aparentemente, la
exoamilasa maltogénica hidroliza enlaces
(1\rightarrow4)-\alpha-glucosídicos
en el almidón (y polisacáridos similares) de una manera gradual
mediante la eliminación de unidades de
\alpha-maltosa a partir de extremos no reductores
de las cadenas de polisacárido.
Min et al. (J. Agric. Food Chem., 1998,
46, 779-782) describe la utilización de una
exoamilasa a partir de Bacillus subtilis SUH
4-2 como un agente antienvejecimiento para el pan,
que produce selectivamente maltosa y maltotriosa del almidón. Min
et al. describen asimismo la utilización de una endoamilasa
para el mismo objetivo.
De este modo, la técnica anterior muestra que
ciertas exoamilasas glucogénicas y exoamilasas maltogénicas pueden
proporcionar un efecto antienvejecimiento reduciendo selectivamente
las tendencias de retrogradación perjudicial de amilopectina
mediante el acortamiento de las cadenas secundarias de
amilopectina.
No obstante, existe todavía una necesidad de
proporcionar medios diferentes y eficaces, preferentemente más
eficaces, para retardar la retrogradación perjudicial, tal como el
retraso del envejecimiento, de los productos de almidón, en
particular de productos horneados, más particularmente de productos
de panificación.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir un producto de almidón que posee
propiedades de retrogradación perjudicial retardada.
Se describen asimismo enzimas que son útiles en
el procedimiento de la presente invención.
Estas enzimas son enzimas amilasa. Más
particularmente, las enzimas son enzimas exoamilasa no
maltogénicas.
Se debe indicar que las exoamilasas no
maltogénicas no se han utilizado hasta ahora para retardar la
retrogradación perjudicial de productos de almidón, solo para
permitir el retraso del envejecimiento de productos horneados.
De este modo, según un primer aspecto de la
presente invención se proporciona un procedimiento para producir un
producto de panificación que comprende la adición a un medio de
almidón de una exoamilasa no maltogénica que es capaz de hidrolizar
el almidón mediante la escisión de uno o más maltooligosacáridos
lineales, que constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, a partir de los extremos no
reductores de cadenas secundarias de amilopectina.
La adición de exoamilasa no maltogénica al medio
de almidón puede ocurrir durante y/o después de calentar el
producto de almidón.
Se proporciona, según un segundo aspecto de la
presente invención, un procedimiento para producir un producto de
panificación que comprende: (a) proporcionar una exoamilasa no
maltogénica que hidroliza el almidón mediante la escisión de uno o
más maltooligosacáridos lineales que constan predominantemente de
cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo, a
partir de los extremos no reductores de las cadenas secundarias de
amilopectina; (b) mezclar dicha exoamilasa no maltogénica con
harina, agua y un agente fermentador en las condiciones de
formación de la masa; y (c) horneando la masa.
De este modo, según un tercer aspecto de la
presente invención, se proporciona un producto de panificación
obtenido por el procedimiento según el primer o segundo aspectos de
la presente invención.
De este modo, según un cuarto aspecto de la
presente invención, se proporciona una composición mejoradora para
una masa; en el que la composición comprende una exoamilasa no
maltogénica según se ha establecido anteriormente, y por lo menos
un ingrediente de masa o un aditivo masa adicional.
De este modo, según un quinto aspecto de la
presente invención, se proporciona la utilización de exoamilasa no
maltogénica en un producto de panificación para retrasar el
envejecimiento, preferentemente la retrogradación perjudicial, del
producto de almidón.
Según un sexto aspecto de la presente invención,
se proporciona una masa que comprende un medio de almidón y una
exoamilasa no maltogénica que es capaz de hidrolizar almidón
mediante la escisión de uno o más maltooligosacáridos lineales que
constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, a partir de los extremos no
reductores de las cadenas secundarias de amilopectina.
Estos y otros aspectos de la presente invención
se presentan en las reivindicaciones anexas. Adicionalmente, estos
y otros aspectos de la presente invención, además de los aspectos
preferidos de la misma, se presentan y se tratan a continuación.
De este modo, la presente invención se refiere a
la utilización de proteínas que son capaces de retrasar la
retrogradación perjudicial de medios de almidón, en particular los
geles de almidón.
En un aspecto preferido, la presente invención se
refiere a la utilización de proteínas que son capaces de retrasar
el envejecimiento del almidón.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a la utilización de proteínas que son capaces de retrasar la
retrogradación perjudicial del medio de almidón, tal como los geles
de almidón.
Según la presente invención, el término
"almidón" significa almidón per se o un componente del
mismo, especialmente amilopectina.
Según la presente invención, el término "medio
de almidón" significa cualquier medio adecuado que comprenda
almidón.
El término "producto de almidón" significa
cualquier producto que contiene o se basa en o se deriva del
almidón.
Preferentemente, el producto de almidón contiene
o se basa en o se deriva del almidón obtenido a partir de la harina
de trigo.
El término "harina de trigo" según se
utiliza en la presente memoria es un sinónimo de harina de trigo o
de otro grano finamente molida. Preferentemente, sin embargo, el
término significa harina obtenida a partir de trigo per se y
no a partir de otro grano. De este modo, y a menos que se indique
lo contrario, las referencias a "harina de trigo" según se
utilizan en la presente memoria significan preferentemente
referencias a harina de trigo per se además de harina de
trigo cuando está presente en un medio, tal como una masa.
Una harina preferida es harina de trigo o harina
de centeno o mezclas de harina de trigo y de centeno. Sin embargo,
se contempla asimismo la masa que comprende harina derivada de
otros tipos de cereales tales como por ejemplo arroz, maíz, cebada y
mijo.
Preferentemente, el producto de almidón es un
producto de panificación.
Más preferentemente, el producto de almidón es un
producto de pan.
Incluso más preferentemente, el producto de
almidón es un producto de panificación harinoso horneado.
El término "producto de panificación harinoso
horneado" se entiende que se refiere a cualquier producto
horneado basado en cereales molidos y horneado en una masa que se
obtiene mezclando harina, agua, y un agente fermentador en las
condiciones de formación de la masa. Sin embargo, se pueden añadir
dentro del alcance de la presente invención los componentes
adicionales a la mezcla de la masa.
El término "amilasa" se utiliza en su
sentido normal - p.ej., una enzima que es inter alia capaz
de catalizar la degradación del almidón. En particular son
hidrolasas que son capaces de escindir enlaces
\alpha-D-(1\rightarrow4)
O-glucosídicos en el almidón.
El término "enzima exoamilasa no
maltogénica" significa la enzima que no degrada inicialmente el
almidón a cantidades sustanciales de maltosa. En un aspecto
mayormente preferido, el término significa asimismo la enzima que no
degrada inicialmente el almidón a cantidades sustanciales de
maltosa y glucosa.
Antes de la presente invención, las enzimas de
exoamilasa no maltogénicas no se habían sugerido para retrasar la
retrogradación perjudicial de medios de almidón, en particular
geles de almidón.
Se presenta posteriormente un ensayo adecuado
para determinar la actividad de la amilasa según la presente
invención. Por conveniencia, este ensayo se denomina "Protocolo
de ensayo de amilasa".
De este modo, preferentemente, el término
"enzima exoamilasa no maltogénica" significa que la enzima no
degrada inicialmente el almidón a cantidades sustanciales de
maltosa como se analizó según el procedimiento de determinación de
producto según se describe en el "Protocolo de ensayo de
amilasa" presentado en la presente memoria.
En un aspecto preferido de la presente invención,
la exoamilasa no maltogénica se puede caracterizar porque si la
cantidad de 0,7 unidades de dicha exoamilasa no maltogénica se
incubaran durante 15 minutos a una temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4
ml de una solución acuosa de 10 mg de almidón de maíz ceroso hervido
previamente por ml de solución reguladora que contiene 50 mM de
ácido 2-(N-morfolin)etansulfónico y cloruro
de calcio 2 mM a continuación proporcionaría producto(s) de
hidrólisis que consistirían en uno o más maltooligosacáridos
lineales que constan de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; de tal
modo que por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más
preferentemente por lo menos 80% y más preferentemente por lo menos
85% en peso de dichos productos de hidrólisis constarían de
maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente de
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo.
Para facilitar la referencia, y para los
objetivos presentes, la característica de incubar una cantidad de
0,7 unidades de exoamilasa no maltogénica durante 15 minutos a una
temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg
de almidón de maíz ceroso hervido previamente por ml de solución
reguladora que contiene ácido
2-(N-morfolin)etanosulfónico 50 mM y cloruro
de calcio 2 mM, se puede referir como "ensayo de incubación de
almidón de maíz ceroso".
De este modo, expresado de forma alternativa, una
exoamilasa no maltogénica se caracteriza por poseer la capacidad en
el ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso de proporcionar
producto(s) de hidrólisis que constaría de uno o más
maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; de tal
modo que por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más
preferentemente por lo menos 80% y más preferentemente por lo menos
85% en peso de dicho producto(s) de hidrólisis constaría de
maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente
maltooligosacáridos lineales que consisten en de cuatro a ocho
unidades de D-glucopiranosilo.
Los productos de hidrólisis en el ensayo de
incubación de almidón de maíz ceroso incluyen uno o más
maltooligosacáridos de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa. Los
productos de hidrólisis en el ensayo de incubación de almidón de
maíz ceroso pueden incluir asimismo otros productos hidrolíticos. No
obstante, las cantidades en % en peso de maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo se basan en la cantidad de
producto de hidrólisis que consiste en uno o más
maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa. En otras
palabras, las cantidades en % en peso de maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo no se basan en la cantidad de
productos de hidrólisis más que uno o más maltooligosacáridos
lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y glucosa.
Los productos de hidrólisis se pueden analizar
por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, los productos de
hidrólisis se pueden analizar por HPLC de intercambio aniónico
utilizando una columna Dionex PA 100 con detección amperométrica de
impulsos, por ejemplo, maltooligosacáridos lineales conocidos de
glucosa a maltoheptaosa como estándares.
Para facilidad de referencia, y para los
presentes objetivos, la característica de analizar los
producto(s) de hidrólisis utilizando HPLC de intercambio
aniónico utilizando una columna Dionex PA 100 con detección
amperométrica de impulsos y con maltooligosacáridos lineales
conocidos de glucosa a maltoheptaosa utilizados como estándares, se
puede referir como "análisis por intercambio aniónico". Por
supuesto, y como justo se indica, otras técnicas analíticas serían
suficientes, además de otras técnicas de intercambio aniónico
específicas.
De este modo, expresado alternativamente, una
exoamilasa no maltogénica preferida según se caracteriza por poseer
la capacidad en un ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso
de producir producto(s) de hidrólisis que constarían de uno o
más maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa, siendo
dichos productos de hidrólisis capaces de ser analizados mediante
intercambio aniónico; de tal modo que por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 85% en peso de dicho
producto(s) de hidrólisis constarían de maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente de
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria con
respecto a la presente invención, el término "maltooligosacárido
lineal" se utiliza en el sentido normal como significando 2 a 10
unidades de \alpha-D-glucopiranosa
unida mediante un enlace \alpha-(1\rightarrow4).
El término "que se puede conseguir de P.
saccharophila" significa que la enzima no necesita
necesariamente obtenerse a partir de P. saccharophila. En
lugar de esto, la enzima podría prepararse mediante la utilización
de técnicas de ADN recombinantes.
El término "equivalente funcional del mismo"
en relación a la enzima que se puede obtener de P.
saccharophila significa que el equivalente funcional se podría
obtener a partir de otras fuentes. La enzima equivalente funcional
puede poseer una secuencia de aminoácido diferente pero tendrá
actividad exoamilasa no maltogénica. La enzima equivalente
funcionalmente puede poseer una estructura química diferente y/o
fórmula pero poseerá actividad exoamilasa no maltogénica. La enzima
equivalente funcionalmente no necesariamente posee exactamente la
misma actividad exoamilasa no maltogénica que la enzima exoamilasa
no maltogénica obtenida de P. saccharophila. Para algunas
aplicaciones, preferentemente, la enzima equivalente funcionalmente
posee por lo menos el mismo perfil de actividad que la enzima
obtenida a partir de P. saccharophila.
El término "que se puede obtener de Bacillus
clausii" significa que la enzima no necesita necesariamente
obtenerse de Bacillus clausii. En su lugar, la enzima podría
se podría preparar mediante la utilización de técnicas de ADN
recombinantes.
El término "equivalente funcional del mismo"
en relación a la enzima que se puede obtener de Bacillus
clausii significa que el equivalente funcional se podría
obtener a partir de otras fuentes. La enzima equivalente
funcionalmente podría poseer una secuencia de aminoácido diferente
pero poseerá actividad exoamilasa no maltogénica. La enzima
equivalente funcionalmente puede poseer estructura química diferente
y/o fórmula pero poseerá actividad exoamilasa no maltogénica. La
enzima equivalente funcionalmente no necesita necesariamente poseer
exactamente la misma actividad exoamilasa no maltogénica que la
enzima exoamilasa no maltogénica obtenida a partir de Bacillus
clausii. Para algunas aplicaciones, preferentemente, la enzima
equivalente funcionalmente posee por lo menos el mismo perfil de
actividad que la enzima obtenida a partir de Bacillus
clausii (tal como el perfil de reactividad mostrado en la Figura
7).
La presente invención se basa en el
descubrimiento sorprendente que las exoamilasas no maltogénicas son
elevadamente eficaces en el retraso o reducción de la
retrogradación perjudicial, tal como el envejecimiento, de productos
de almidón, en particular productos horneados.
Se ha encontrado que las exoamilasas no
maltogénicas pueden ser más eficaces en el retraso de la
retrogradación perjudicial, tal como el envejecimiento, en el pan
que las exoamilasas glucogénicas y maltogénicas.
La reducción de la retrogradación perjudicial se
puede medir mediante técnicas estándar conocidas en la técnica. A
modo de ejemplo, algunas técnicas se presentan a continuación en la
sección titulada "Ensayo para la medición de la
retrogradación".
En nuestros estudios, se ha encontrado que
mediante la incorporación de una cantidad de actividad suficiente
de una exoamilasa no maltogénica, como por ejemplo una
exo-maltotetraohidrolasa (EC. 3.2.1.60), que posee
una termoestabilidad suficiente, proporciona en una masa los
productos horneados con retrogradación perjudicial reducida, en
algunos casos significativamente reducida, comparada con la de un
pan de control, tal como en las condiciones de almacenamiento. Por
el contrario, el efecto reductor de la retrogradación perjudicial
de la incorporación de la misma cantidad de actividad de una
exoamilasa maltogénica con una termoestabilidad comparable a la de
la exoamilasa no maltogénica es significativamente menor. De este
modo, el efecto de antiretrogradación de la exoamilasa no
maltogénica es más eficaz que la de una exoamilasa maltogénica. Se
cree que esta diferencia puede ser, en parte, debida a la extensión
a la que se acortan las cadenas secundarias de amilopectina. Se
cree asimismo que el efecto antiretrogradación puede ser incluso
más pronunciado cuando se utiliza una exoamilasa no maltogénica
según la presente invención que libera maltoheptaosa y/o
maltooctaosa y/o maltohexosa.
En los estudios se ha purificado y caracterizado
asimismo una amilasa específica de producto activa a pH elevado que
produce maltohexaosa. Esta amilasa se aisló a partir de una cepa
tolerante al álcali de Bacillus clausii
BT-21.
Además, se ha encontrado que el retraso de la
retrogradación perjudicial que se puede obtener mediante la
utilización de exoamilasas no maltogénicas según la presente
invención es sensible a la dosis sobre un intervalo muy amplio. Esto
está en contraste con el efecto de las exoamilasas maltogénicas,
que está bastante limitado y posee una sensibilidad a la dosis
fuertemente decreciente.
En un aspecto, la presente invención proporciona
la utilización de ciertas amilasas para preparar productos de
almidón, tales como productos de panificación. A este respecto, las
amilasas -que no son exoamilasas no maltogénicas- retrasan o reducen
las propiedades de envejecimiento (es decir, disminuyen la
velocidad de envejecimiento) del producto de almidón, en particular
un producto horneado harinoso horneado.
Preferentemente, la amilasa está en forma aislada
y/o en forma pura sustancialmente. En la presente memoria, el
término "aislado" significa que la enzima no está en su
entorno natural.
Tal como se indica anteriormente, la enzima de la
exoamilasa no maltogénica no degrada inicialmente el almidón a
cantidades sustanciales de maltosa.
La exoamilasa no maltogénica es capaz de escindir
maltooligosacáridos lineales, que constan predominantemente de
cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo, a
partir de los extremos no reductores de las cadenas secundarias de
amilopectina. Las exoamilasas no maltogénicas poseen esta
característica y las que son adecuadas para su utilización en la
presente invención se identifican por su capacidad de hidrolizar
almidón de maíz ceroso gelatinizado en el sistema modelo presentado
en el Protocolo de ensayo de la amilasa (infra).
Cuando se incubaron 15 min., en las condiciones
descritas en el Protocolo de ensayo de la amilasa, las exoamilasas
no maltogénicas que son adecuadas para su utilización según la
presente invención proporcionarían un producto(s) de
hidrólisis que constaría de uno o más maltooligosacáridos lineales
de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y
opcionalmente glucosa, de tal modo que la estructura de producto de
este producto de hidrólisis consistiría de por lo menos 60%, en
particular por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% y
más preferentemente por lo menos 90% en peso de los productos de
degradación de hidrólisis del almidón más que maltosa y
glucosa.
Para un aspecto preferido de la presente
invención, las exoamilasas no maltogénicas que son adecuadas para
su utilización según la presente invención proporcionarían cuando
se incubara dicho producto de hidrólisis 15 min., en las condiciones
descritas para el ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso,
de tal modo que el producto de hidrólisis poseería una estructura
de producto de por lo menos 60%, en particular por lo menos 70%,
más preferentemente por lo menos 80% y más preferentemente por lo
menos 90% en peso de maltooligosacáridos lineales de tres a diez
unidades de D-glucopiranosilo, en particular
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo.
En un aspecto más preferido de la presente
invención, dicho producto de hidrólisis en dicho ensayo tendría una
estructura de producto de por lo menos 60%, en particular por lo
menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% y más
preferentemente por lo menos 85% en peso de maltooligosacáridos
lineales de 4 a 6 unidades de
D-glucopiranosilo.
En un aspecto más preferido de la presente
invención, dicho producto de hidrólisis en dicho ensayo tendría por
lo menos una estructura de producto de por lo menos 60%, en
particular por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% y
más preferentemente por lo menos 85% en peso de maltooligosacáridos
lineales de 4 unidades de D-glucopiranosilo.
En un aspecto más preferido de la presente
invención, dicho producto de hidrólisis en dicho ensayo tendría por
lo menos una estructura de producto de por lo menos 60%, en
particular por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% y
más preferentemente por lo menos 85% en peso de maltooligosacáridos
lineales de 6 unidades de D-glucopiranosilo.
Preferentemente, las exoamilasas no maltogénica
no hidroliza sustancialmente sus productos primarios para
convertirlos en glucosa, maltosa y maltotriosa. Si ése fuera el
caso, los productos primarios competirían como sustratos con los
extremos de cadena no reductores de amilopectina para la enzima, de
forma que se reduciría su eficacia de antirretrogradación.
De este modo, preferentemente, cuando se incubó
la exoamilasa no maltogénica durante 300 min., en condiciones
similares al ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso pero en
el que el periodo de 15 min., se extendió a 300 min., -como un
aparte, y para la conveniencia de los objetivos presentes, este
ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso modificado se puede
denominar "ensayo de incubación de almidón de maíz ceroso
extendido"- proporcionaría todavía dicho producto de hidrólisis
en el que el producto de hidrólisis tendría una estructura de
producto de por lo menos 50%, en particular por lo menos 60%, más
preferentemente por lo menos 70% y más preferentemente por lo menos
80% en peso de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo.
A modo de ejemplo, una exoamilasa no maltogénica
útil en el procedimiento de la presente invención se puede
caracterizar porque posee la capacidad en un ensayo de incubación
de almidón de maíz ceroso de proporcionar producto(s) de
hidrólisis que constaría de uno o más maltooligosacáridos lineales
de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y
opcionalmente glucosa; de tal modo que por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 85% en peso de dicho
producto(s) de hidrólisis constaría de maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo; y en el que la enzima se puede
obtener a partir de P. saccharophila o es un equivalente
funcional del mismo.
A modo de ejemplo adicional, otra exoamilasa no
maltogénica útil en el procedimiento de la presente invención se
puede caracterizar porque posee la capacidad en un ensayo de
incubación de almidón de maíz ceroso de proporcionar
producto(s) de hidrólisis que constaría de uno o más
maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa; de tal
modo que por lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más
preferentemente por lo menos 80% y más preferentemente por lo menos
85% en peso de dicho producto(s) de hidrólisis constaría de
maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo; en el que la enzima se puede
obtener a partir de Bacillus clausii o es una equivalente
funcional del mismo; y en el que la enzima posee un peso molecular
de aproximadamente 101.000 Da (según se ha estimado mediante
electroforesis de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio) y/o la
enzima posee un óptimo de actividad a pH 9,5 y 55ºC.
Preferentemente, las exoamilasas no maltogénicas
que son adecuadas para su utilización según la presente invención
son activas durante el horneado e hidrolizan el almidón durante y
después de la gelatinización de los gránulos de almidón que empieza
a temperaturas de aproximadamente 55ºC. Cuanto más termoestable es
la exoamilasa no maltogénica, más tiempo puede estar activa y de
este modo proporcionará más efecto antienvejecimiento. Sin embargo,
durante el horneado a temperaturas superiores a aproximadamente
85ºC la exoamilasa no maltogénica preferentemente se inactiva
gradualmente de forma que no existe sustancialmente actividad
después del procedimiento de horneado en el pan final. Por lo
tanto, preferentemente las exoamilasas no maltogénicas adecuadas
para su utilización según la presente invención poseen una
temperatura óptima superior a 45ºC e inferior a 98ºC cuando se
incuban durante 15 min., a 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
o 90ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de almidón de maíz ceroso de 10
mg/ml en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 preparado según
se ha descrito anteriormente y ensayado para la liberación de los
productos de hidrólisis según se ha descrito anteriormente.
Preferentemente la temperatura óptima de la exoamilasa no
maltogénica es superior a 55ºC e inferior a 95ºC e incluso más
preferentemente es superior a 60ºC e inferior a 90ºC.
Las exoamilasas no maltogénicas que se pueden
encontrar que son menos termoestables se pueden mejorar mediante la
utilización de la ingeniería de proteínas para convertirlas en más
termoestables y de este modo más adecuadas para su utilización según
la presente invención. De este modo la presente invención abarca la
utilización de las exoamilasas no maltogénicas modificadas que
llegan a ser más termoestables mediante la ingeniería de
proteínas.
Se conoce que algunas exoamilasas no maltogénicas
pueden tener algún grado de actividad endoamilasa. En algunos
casos, este tipo de actividad puede necesitar reducirse o
eliminarse ya que posiblemente la actividad endoamilasa puede
afectar negativamente la calidad del producto de panificación final
mediante la producción de una miga pegajosa o gomosa debido a la
acumulación de dextrinas ramificadas.
De este modo, en un aspecto preferido de la
presente invención, la exoamilasa no maltogénica poseerá menos de
0,5 unidades de endoamilasa (EAU) por unidad de actividad
exoamilasa.
Preferentemente las exoamilasas no maltogénicas
que son adecuadas para utilizar según la presente invención poseen
menos de 0,05 EAU por unidad de actividad exoamilasa y más
preferentemente menos de 0,01 EAU por unidad de actividad
exoamilasa.
Las unidades de endoamilasa se pueden determinar
por la utilización del Protocolo de ensayo de endoamilasa
presentado a continuación.
Ejemplos de exoamilasas no maltogénicas adecuadas
para su utilización según la presente invención incluyen
exomaltotetraohidrolasa (E.C.3.2.1.60), exomaltopentaohidrolasa y
exomaltohexaohidrolasa (E.C.3.2.1.98) que hidrolizan los enlaces
1,4-\alpha-glucosídicos en
polisacáridos amiláceos de forma que eliminan residuos sucesivos de
maltotetraosa, maltopentaosa o maltohexaosa, respectivamente, a
partir de extremos de cadena no reductores. Ejemplos son
exomaltotetraohidrolasas de Pseudomonas saccharophila y
P. stutzeri (documento EP-0 298 645 B1),
exomaltopentaohidrolasas de una bacteria
gram-positiva alcalifílica (documento
US-5.204.254) y de Pseudomonas sp. (Shida
et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1992,
56, 76-80) y exomaltohexaohidrolasas de
Bacillus sp. # 707 (Tsukamoto et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 1988, 151,
25-31). B. circulans F2 (Taniguchi, ACS
Symp., 1991, Ser. 458, 111-124) y
Aerobacter aerogenes (Kainuma et al., Biochim.
Biophys. Acta, 1975, 410,
333-346).
Otro ejemplo de una exoamilasa no maltogénica
adecuada para su utilización según la presente invención es la
exoamilasa de una cepa Bacillus alcalofílica, GM8901 (28).
Esto es una exoamilasa no maltogénica que produce maltotetraosa
además de maltopentaosa y maltohexaosa a partir del almidón.
Además, las exoamilasas no maltogénicas adecuadas
para su utilización según la presente invención incluyen asimismo
exomaltoheptaohidrolasa o exomaltooctaohidrolasa que hidrolizan los
enlaces 1,4-\alpha-glucosídicos en
polisacáridos amiláceos para eliminar residuos de maltoheptaosa o
maltooctaosa, respectivamente, a partir de los extremos de cadena
no reductores. La exomaltoheptaohidrolasa y la
exomaltooctaohidrolasa se pueden encontrar mediante el barrido de
cepas de tipo salvaje o se pueden desarrollar a partir de otras
enzimas amilolíticas mediante la ingeniería de proteínas. De este
modo, las exoamilasas no maltogénicas desarrolladas mediante
ingeniería de proteínas a partir de otras enzimas amilolíticas que
se convierten en exoamilasas no maltogénicas son adecuadas asimismo
para su utilización según la presente invención.
Se describe asimismo una amilasa nueva que es
adecuada para la preparación de productos de almidón según la
presente invención, tal como productos de panificación. La amilasa
es una exoamilasa no maltogénica. En los estudios, se ha
caracterizado esta amilasa que es adecuada para la preparación de
alimentos, en particular masas para su utilización en la
preparación de productos de panificación.
La exoamilasa no maltogénica se caracteriza
porque posee la capacidad en un ensayo de incubación de almidón de
maíz ceroso de proporcionar producto(s) de hidrólisis que
constaría de uno o más maltooligosacáridos lineales de dos a diez
unidades de D-glucopiranosilo y
opcionalmente glucosa; de tal modo que por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 85% en peso de dicho
producto(s) de hidrólisis constaría de maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, preferentemente
maltooligosacáridos lineales que constan de cuatro a ocho unidades
de D-glucopiranosilo; en el que la enzima se puede
obtener a partir de Bacillus clausii o es un equivalente
funcional del mismo; y en el que la enzima posee un peso molecular
de aproximadamente 101.000 Da (según se ha estimado mediante
electroforesis de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio) y/o la
enzima posee un óptimo de actividad a pH 9,5 y 55ºC.
Preferentemente, la amilasa está en forma aislada
y/o en forma pura sustancialmente. En la presente memoria, el
término "aislado" significa que la enzima no está en su
entorno natural.
Las enzimas se pueden utilizar asimismo para
generar anticuerpos - tal como mediante la utilización de técnicas
estándar. De este modo, los anticuerpos pueden alcanzar a cada
enzima. El o cada anticuerpo se puede utilizar para explorar otras
enzimas amilasa adecuadas para su utilización en la presente
memoria. Además, el o cada anticuerpo se puede utilizar para aislar
cantidades de tal enzima.
Para la producción de anticuerpos se pueden
inmunizar, diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas,
ratones, etc. mediante inyección con el inhibidor o cualquier
porción, variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo u
oligopéptido que retiene las propiedades inmunogénicas. Dependiendo
de las especies de huéspedes, se pueden utilizar diversos
adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes
incluyen, pero no se limitan a, Freund's, geles minerales tales
como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como
lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones
de aceite, hemocianina lympet keyhole, y dinitrofenol. Se pueden
utilizar los adyuvantes humanos potencialmente útiles BCG
(Bacilli Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos monoclonales a la enzima se
pueden incluso preparar utilizando cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante
líneas celulares continuas en el cultivo. Éstas incluyen, pero no se
limitan a, la técnica hibridoma originalmente descrita por Koehler
y Milstein (1975 Nature 256: 495-497), la técnica
hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., (1983) Inmunol.
Today 4: 72; Cole et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci
80:2026-2030) y la técnica hibridoma EBV Cole et
al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss Inc., págs. 77-96). Además, se pueden utilizar
la técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos
híbridos", el corte y el empalme de genes de anticuerpo de ratón
a genes de anticuerpo humanos para obtener una molécula con
especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas
(Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
81:6851-6855; Neuberger et al., (1984)
Nature 312:604-608; Takeda et al., (1985)
Nature 314:452-454). Alternativamente, se pueden
adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de
cadenas únicas (documento
US-A-4946779) para producir
anticuerpos de cadena única específicos de inhibidor.
Los anticuerpos se pueden asimismo producir
mediante la inducción de la producción in vivo en la
población de linfocitos o mediante la exploración de librerías de
inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión
elevadamente específicos según se describe en Orlandi et
al., (1989, Proc. Natl. Acad. Sci
86:3833-3837), y Winter G. and Milstein C. (1991;
Nature 349:293-299).
Según se indica, un aspecto de la presente
invención se refiere a una composición mejoradora para un producto
de almidón, en particular una masa y/o un producto de panificación
harinoso horneado producido a partir de la masa.
La composición mejoradora comprende una
exoamilasa no maltogénica y por lo menos un ingrediente de masa o
aditivo de masa adicional.
Según la presente invención el ingrediente de
masa o el aditivo de masa adicional puede ser cualquiera de los
ingredientes de masa y aditivos de masa que se han descrito
anteriormente.
De forma conveniente, la composición mejoradora
es una composición pulverulenta seca que comprende exoamilasa no
maltogénica mezclada con por lo menos un ingrediente o aditivo
adicional. Sin embargo, la composición mejoradora puede ser asimismo
una preparación líquida que comprende la exoamilasa no maltogénica
y por lo menos un ingrediente o aditivo adicional disuelto o
disperso en agua o en líquido. Se entenderá que la cantidad de la
actividad de la enzima en la composición mejoradora dependerá de
las cantidades y tipos de los ingredientes y aditivos adicionales
que forman parte de la composición mejoradora.
Opcionalmente, la composición mejoradora puede
estar en forma de una mezcla completa, denominada premezcla, que
contiene todos los ingredientes y aditivos secos para preparar un
producto horneado particular.
Se describe un procedimiento que comprende formar
un producto de almidón mediante la adición de una enzima de
exoamilasa no maltogénica adecuada, tal como una de las nuevas
enzimas exoamilasas no maltogénicas presentadas en la presente
memoria, a un medio de almidón.
Si el medio de almidón es una masa, a
continuación la masa se prepara mezclando juntamente harina, agua,
la exoamilasa no maltogénica según la presente invención y otros
posibles ingredientes y aditivos.
A modo de ejemplo adicional, si el producto de
almidón es un producto de panificación harinoso horneado (que es
una forma de realización elevadamente preferida), a continuación el
procedimiento comprende mezclar -en cualquier orden adecuado-
harina, agua, y un agente fermentador en las condiciones de
formación de la masa y añadiendo adicionalmente una enzima
exoamilasa no maltogénica adecuada.
El agente fermentador puede ser un agente
fermentador químico tal como bicarbonato de sodio o cualquier cepa
de Saccharomyces cerevisiae (levadura Baker).
La exoamilasa no maltogénica se puede añadir
junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo el agua o una
mezcla de ingrediente de la masa o con cualquier aditivo o aditivo
de la mezcla.
La masa se puede preparar mediante cualquier
procedimiento de preparación de masa convencional común en la
industria de panificación o en cualquier otra industria productora
de productos basados en masa de harina.
El horneo de productos de panificación harinosos
tales como por ejemplo pan blanco, pan hecho de harina de centeno y
harina de trigo tamizadas, panecillos y similares se lleva a cabo
típicamente mediante el horneo de la masa de panificación a
temperaturas de horno en el intervalo de 180 a 250ºC durante
aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante el procedimiento de
horneado un gradiente brusco de temperatura (200\rightarrow120ºC)
predomina en las capas externas de la masa en las que se desarrolla
la corteza característica del producto de pan. Sin embargo, debido
al consumo de calor debido a la generación de vapor, la temperatura
en la miga solo está próxima a 100ºC al final del proceso de
horneado.
La exoamilasa no maltogénica se puede añadir
como una preparación líquida o como una composición pulverulenta
seca que comprende la enzima como componente activo único o
mezclada con uno o más ingredientes de masa o aditivos de masa
adicionales.
Para mejorar adicionalmente las propiedades del
producto horneado e impartir calidades distintivas al producto
horneado se pueden incorporar ingredientes de masa y/o aditivos de
masa adicionales a la masa. Típicamente, tales componentes añadidos
adicionalmente pueden incluir ingredientes de la masa tales como
sal, cereales, grasas y aceites, azúcar, sustancias de fibra
dietética, leche en polvo, gluten y aditivos de la masa tales como
emulsionantes, otras enzimas, hidrocoloides, agentes aromatizantes,
agentes de oxidación, minerales y vitaminas.
Los emulsionantes son útiles como reforzadores de
la masa y suavizadores de la miga. Como reforzadores de la masa,
los emulsionantes pueden proporcionar tolerancia con respecto al
tiempo de reposo y tolerancia al shock durante la prueba. Además,
los reforzadores de la masa mejorarán la tolerancia de una masa dada
a variaciones en el tiempo de fermentación. La mayoría de
reforzadores de masa mejoran asimismo en la salida del horno lo que
significa el incremento en volumen de los productos prueba a los
productos horneados. Por último, los reforzadores de la masa
emulsionarán cualquier grasa presente en la mezcla de la
receta.
El suavizador de miga, que principalmente es una
característica de los monoglicéridos, se atribuye a una interacción
entre el emulsionante y la fracción amilosa del almidón que lleva a
la formación de complejos de inclusión insolubles con la amilosa que
no recristalizarán al enfriar y que no contribuirán por lo tanto a
la firmeza de la miga de pan.
Emulsionantes adecuados que se pueden utilizar
como aditivos de masa adicionales incluyen lecitina, estearato de
polioxietileno, mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles,
ésteres del ácido acético de mono- y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles, ésteres del ácido láctico de mono- y diglicéridos de
ácidos grasos comestibles, ésteres del ácido cítrico de mono- y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres del ácido
diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles, ésteres de sacarosa de ácidos grasos comestibles,
estearoíl-2-lactilato de sodio y
estearoíl-2-lactilato de calcio.
Otras enzimas que son útiles como aditivos de
masa adicionales incluyen como ejemplos oxidorreductasas, tales
como glucosaoxidasa, hexosaoxidasa y ascorbatooxidasa, hidrolasas,
tales como lipasas y estearasas además de glicosidasas como
\alpha-amilasa, pululanasa y xilanasa.
Oxidorreductasas, tales como por ejemplo glucosaoxidasa y la
hexosaoxidasa, se pueden utilizar para el reforzamiento de la masa y
el control del volumen de los productos horneados y se pueden
añadir las xilanasas y otras hemicelulasas para mejorar las
propiedades de manipulación de la masa, la suavidad de la miga y el
volumen del pan. Las lipasas son útiles como reforzadoras de la masa
y como suavizadoras de la miga y las
\alpha-amilasas y otras enzimas amilolíticas se
pueden incorporar en la masa para controlar el volumen del pan y
reducir adicionalmente la firmeza de la miga.
La cantidad de la exoamilasa no maltogénica que
se añade está normalmente en una cantidad que resulta en la
presencia en la masa acabada de 50 a 100.000 unidades por kg de
harina, preferentemente 100 a 50.000 unidades por kg de harina. En
las formas de realización útiles, la cantidad está en el intervalo
de 200 a 20.000 unidades por kg de harina.
En el contexto actual, se define 1 unidad de
exoamilasa no maltogénica como la cantidad de enzima que libera
productos de hidrólisis equivalentes a 1 \mumol de azúcar
reductor por min., cuando se incuba a 50ºC en un tubo de ensayo con
4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz ceroso en MES 50 mM, cloruro de
calcio 2mM, pH 6,0 según se describe a continuación.
La presente invención proporciona amilasas
adecuadas para su utilización en la fabricación de un alimento. Los
alimentos típicos, que incluyen pienso para animales, incluyen
productos lácteos, productos cárnicos, productos avícolas, productos
de pescado y productos de panificación.
Preferentemente, el alimento es un producto de
panificación, tal como los productos de panificación descritos
anteriormente. Los productos típicos (horneados) de panificación
incorporados dentro del alcance la presente invención incluyen pan
-tal como los panes de molde, panecillos, magdalenas, bases de
pizza, etc- galletas saladas, tortitas, pasteles, galletas,
bizcochos, cráckers, etc.
El sistema siguiente se utiliza para caracterizar
las exoamilasas no maltogénicas que son adecuadas para su
utilización según la presente invención.
A modo de información de base inicial, la
amilopectina de maíz ceroso (que se puede obtener como WAXILYS 200
de Roquette, Francia) es un almidón con un contenido en amilopectina
muy elevado (superior al 90%).
Se hierven 20 mg/ml de almidón de maíz ceroso
durante 3 min., en un regulador MES 50 mM (ácido
2-(N-morfolin)etanosulfónico), cloruro de
calcio 2 mM, pH 6,0 y se incubaron posteriormente a 50ºC y se
utilizaron dentro de la media hora siguiente.
Una unidad de exoamilasa no maltogénica se define
como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis
equivalentes a 1 \mumol de azúcar reductor por min., cuando se
incuba a 50ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón
de maíz ceroso en MES 50 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0
preparado según se ha descrito anteriormente.
Los azúcares reductores se miden utilizando
maltosa como estándar y utilizando el procedimiento de ácido
dinitrosalicílico de Bernfeld, Methods Enzymol., (1954),
1, 149-158 u otro procedimiento conocido en
la técnica para cuantificar los azúcares reductores.
La estructura de producto de hidrólisis de la
exoamilasa no maltogénica se determina mediante la incubación de
0,7 unidades de exoamilasa no maltogénica durante 15 o 300 min., a
50ºC en un tubo de ensayo con 4 ml de almidón de maíz ceroso a
10 mg/ml en el regulador preparado según se ha descrito
anteriormente. La reacción se para mediante inmersión del tubo de
ensayo durante 3 min., en un baño de agua hirviendo.
Los productos de hidrólisis se analizan y se
cuantifican mediante HPLC de intercambio aniónico utilizando una
columna Dionex PA 100 con acetato de sodio, hidróxido de sodio y
agua como eluyentes, con detección amperométrica de impulsos y con
maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a maltoheptaosa
como estándares. El factor de respuesta utilizado para la
maltooctaosa a la maltodecaosa es el factor respuesta encontrado
para la maltoheptaosa.
Se incuban 0,75 ml de solución de enzima con 6,75
ml de AZCL-amilosa al 0,5% (p/v) (amilosa
entrecruzada con azulina disponible en Megazyme, Irlanda) en MES 50
mM (ácido 2-(N-morfolin)etanosulfónico),
cloruro de calcio 2 mM, pH 6,0 a 50ºC. Después de 5, 10, 15, 20 y
25 minutos, respectivamente se transfiere 1,0 ml de la mezcla de
reacción a 4,0 ml de solución de cese que consiste en TRIS
(tris(hidroxi-metil)aminometano) 4%
(p/v).
La muestra completada se filtra a través de un
filtro Whatman nº 1 y su densidad óptica a 590 nm se mide contra
agua destilada. La solución de enzima ensayada se debería diluir de
forma que la densidad óptica obtenida sea una función lineal del
tiempo. La pendiente de la línea para la densidad óptica contra el
tiempo se utiliza para calcular la actividad endoamilasa relativa
al estándar GRINDAMYL™ A1000 (disponible en Danisco Ingredients),
que se define por poseer 1000 unidades de endoamilasa (EAU) por
g.
Para la evaluación del efecto antienvejecimiento
de la exoamilasa no maltogénica, se puede medir la firmeza de la
miga 1, 3 y 7 días después del horneado por medio de un analizador
de textura de alimento universal Instron 4301 o equipo similar en
la técnica.
Otro procedimiento utilizado tradicionalmente en
la técnica y que se utiliza para evaluar el efecto sobre la
retrogradación del almidón de una exoamilasa no maltogénica se basa
en DSC (calorimetría de exploración diferencial). En la presente
memoria se mide la entalpía de fusión de la amilopectina
retrogradada en la miga de pan o en la miga de un sistema modelo de
masa horneada con o sin enzimas (control). El equipo DSC que se
utiliza en los ejemplos descritos es un
Mettler-Toledo DSC 820 que funciona con un gradiente
de temperatura de 10ºC por min., de 20 a 95ºC. Para la preparación
de las muestras se pesan 10-20 mg de miga y se
transfieren en cubetas de aluminio Mettler-Toledo
que se sellan herméticamente.
Las masas del sistema modelo utilizadas en los
ejemplos descritos contienen harina de trigo estándar y cantidades
óptimas de agua o regulador con o sin la exoamilasa no maltogénica.
Se mezclan en un Brabender Farinograph de 10 a 50 g durante 6 o 7
min., respectivamente. Las muestras de las masas se colocan en tubos
de ensayo de vidrio (15*0,8 cm) con un tapón. Estos tubos de ensayo
se someten a un procedimiento de horneado en un baño de agua
empezando con 30 min., de incubación a 33ºC seguida de un
calentamiento de 33 a 95ºC con un gradiente de 1,1ºC por min., y
finalmente una incubación de 5 min., a 95ºC. Posteriormente, los
tubos se almacenan en un termostato a 20ºC antes del análisis de
DSC.
En resumen la presente invención se basa en el
descubrimiento sorprendente que las exoamilasas no maltogénicas -
que hidrolizan el almidón mediante la escisión de
maltooligosacáridos lineales en el intervalo de cuatro a ocho
unidades de
D-glucopiranosilo de los extremos de cadena no
reductores de la amilopectina y que preferentemente poseen un grado
de termoestabilidad suficiente - son elevadamente eficaces en el
retraso o reducción de la retrogradación perjudicial de los
productos horneados.
La muestra siguiente se depositó según el tratado
de Budapest en el depositario reconocido DSMZ (Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH of Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig) el 12 de marzo de 1999:
BT-21
\hskip1cmDSM número DSM 12731
Las secuencias que se pueden derivar y/o
expresar de estos depósitos y formas de realización comprenden los
mismo, además de los fragmentos activos de los mismos que se pueden
utilizar asimismo en los procedimientos y composiciones descritos en
la presente memoria.
A continuación se describirá la presente
invención, únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a
los dibujos adjuntos, en los que:
la Figura 1 muestra un gráfico;
la Figura 2 muestra un gráfico;
la Figura 3 muestra un gráfico;
la Figura 4 muestra un gráfico;
la Figura 5 muestra un gráfico;
la Figura 6 muestra una exploración; y
la Figura 7 muestra un gráfico;
En más detalle:
Figura 1. Actividad amilolítica extracelular
(mU/ml) en cultivos líquidos de B. clausii
BT-21 cultivados en sustratos de almidón al 2% a
45ºC. \blacklozenge almidón soluble, \bullet amilopectina,
\blacklozenge almidón de trigo, \sqbullet arroz integral
entero. Las barras indican la desviación estándar.
Figura 2. Efecto del pH en la actividad de la
amilasa específica del producto. Efecto del pH a 55ºC.
Figura 3. Efecto de la temperatura en la
actividad de la amilasa específica de producto. Efecto de la
temperatura a pH 9,5 \sqbullet con CaCl_{2} 5 mM \Box sin
CaCl_{2}.
Figura 4. Termoestabilidad ensayada como
actividad residual de la amilasa de específica de producto después
de la incubación a temperaturas crecientes a pH 9,5 con CaCl_{2}
5 mM.
Figura 5. Productos (en mM) formados mediante la
incubación de la amilasa específica de producto (505 mU/ml) con
almidón soluble al 1% y CaCl_{2} 5 mM a 55ºC y pH 9,5. \circ
glucosa, \times maltosa, \Box maltotriosa, \blacktriangle
maltotetraosa, \bullet maltopentaosa, \sqbullet
maltohexaosa.
Figura 6. Exploración de
HPAEC-PAD obtenida mediante la incubación de la
amilasa específica de producto (505 mU/ml) con almidón soluble al 1%
a pH 9,5 y 55ºC. A) almidón soluble sin enzima, B) incubación con
enzima durante 30 min.
Figura 7. Determinación de actividad endo- y exo-
de amilasa específica de producto de B. clausii
BT-21 comparada con amilasas de acción de escisión
de almidón conocida. Se representa la formación de color azul (%
del máximo) contra la producción de maltosa en mM. La pendiente de
las curvas indica la prevalencia de la actividad endo- o
exo-.
exo-.
Sección
A
Se obtuvo la cepa de P. saccharophila IAM
nº 1544 de la Colección de cultivo IAM, Inst. of Molecular and
Cellular Biosciencies, Universidad de Tokio, Japón.
La fermentación de la cepa se llevó a cabo en un
bioreactor de 3 litros Applikon ADI con 2 litros de volumen de
trabajo y bajo las condiciones siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Temperatura: \+ 30ºC\cr Velocidad de agitación: \+ 1000 rpm\cr
Aereación: \+ 1 volumen de aire por volumen del medio por minuto\cr
pH: \+ \begin{minipage}[t]{120mm} pH 7,4 constante por ajuste
con hidróxido de sodio 2 M y ácido clorhídrico al 10% (p/v)
\end{minipage} \cr Medio: \+ Bacto triptona 20 g/l\cr
Extracto de levadura Bacto: \+ 20 g/l\cr Almidón \+ 20 g/l\cr
Na _{2} HPO _{4} \cdot 2H _{2} O \+ 5,6 g/l\cr KH _{2} PO _{4} \+
1,5
g/l\cr}
Después de 1 día de fermentación, se centrifugó
el caldo de cultivo y se filtró para eliminar las células. La
actividad de la exoamilasa no maltogénica en el caldo libre de
células fue 5 unidades por ml determinada según se ha descrito
anteriormente.
La exoamilasa no maltogénica de P.
saccharophila se purificó parcialmente mediante cromatografía
de interacción hidrofóbica utilizando una subcolumna de 150 ml de
Phenyl Sepharose FF low (Pharmacia, Suecia) equilibrada con
regulador A siendo éste sulfato de sodio 200 mM, trietanolamina 50
mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 7,2. El caldo de fermentación
filtrado (500 ml) se ajustó a sulfato de sodio 200 mM y pH 7,2 y se
cargó en la columna. La exoamilasa no maltogénica se eluyó con un
gradiente decreciente linealmente de sulfato de sodio en el
regulador A. Las fracciones que contenían actividad exoamilasa se
agruparon.
Las fracciones agrupadas se diluyeron tres veces
con agua y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de
intercambio aniónico en una columna de 150 ml de
Q-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada con un
regulador A que era trietanolamina 50 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH
7,5. La exoamilasa no maltogénica se eluyó con un gradiente lineal
de 0 a 1M de cloruro de sodio en el regulador A. Se agruparon las
fracciones que contenían actividad exoamilasa. Esta preparación
purificada parcialmente se utilizó para los ensayos descritos a
continuación. Tuvo una actividad de 14,7 unidades por ml y solo una
banda de actividad amilasa cuando se ensayó en un sistema de
electroforesis de gel de poliacrilamida teñido para la actividad
amilasa.
A modo de introducción, la secuencia de ADN para
la codificación de genes de la exoamilasa de P.
saccharophila (que nosotros denominamos PS4) ha sido publicada
por Zhou et al. (Zhou JH., Baba T., Takano T., Kobayashi S.,
Arai Y., (1989) FEBS Lett. 1989 Sep. 11;
255(1):37-41 "Nucleotide sequence of the
maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila".
Además, la secuencia de ADN se puede registrar en el GenBank con el
número de registro de entrada X16732.
Se ha determinado ahora el MW de la enzima PS4
purificada mediante espectrometría de masas
(MALDI-TOFF) que es 57500 \pm 500 D que está en
concordancia con el MW teórico de 57741 D derivado de la
secuencia.
La temperatura óptima y el pH de PS4 son 45ºC y
pH 6,5 según Zhou et al (Zhou JH., Baba T., Takano T.,
Kobayashi S., Arai Y., (1992) Carbohydr. Res. 1992 enero;
223:255-61 "Properties of the enzyme expressed by
the Pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase gene
(mta) in Escherichia coli.").
La estructura de hidrólisis de la exoamilasa no
maltogénica se determinó mediante el análisis de los productos de
hidrólisis generados por incubación de 0,7 unidades de exoamilasa
no maltogénica purificada parcialmente durante 15 o 300 min., a 50ºC
en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz ceroso
según se ha descrito anteriormente.
Las estructuras de los productos de hidrólisis
detectadas después de 15 min., y 300 min., se muestran en la Tabla
1 e indican que la P. saccharophila produce una exoamilasa
no maltogénica según se define en la presente invención y que esta
enzima libera maltotetraosa como producto predominante que
representa el 85,8% en peso y 93,0% en peso después de 15 y 300
min., de hidrólisis respectivamente.
Se estableció un ensayo de horneado para ensayar
el efecto antifirmeza de la exoamilasa no maltogénica de P.
saccharophila. Se utilizó una receta de Danish Toast Bread.
Contiene harina (2000 g), levadura seca (30 g), azúcar (30 g), sal
(30 g) y agua (aproximadamente 1200 g que corresponden a una
consistencia de masa de 400 unidades Brabender (BU) + 60 g de agua
adicional para compensar la levadura seca utilizada) se mezclan en
un mezclador Hobart (modelo A-200) durante 2 minutos
a velocidad baja y durante 12 minutos a velocidad elevada. La
temperatura de la masa es 26ºC al final de la mezcla. La masa se
deja reposar durante 10 minutos a 30ºC después de lo cual la masa se
divide en trozos de masa de 750 g. Los trozos de masa se dejan
reposar durante 5 minutos en una cabina de prueba a una temperatura
de 33ºC y a una humedad relativa del 85%. Los trozos de masa se
moldean a continuación sobre un moldeador Glimek (tipo
LR-67) con las fijaciones siguientes 1:4, 2:2, 3:14
y 4:12, después de lo cual los trozos de masa moldeados se
transfieren a las latas de horneo y se prueban en una cabina de
prueba durante 50 minutos a una temperatura de 33ºC y a una humedad
relativa de 85%. Finalmente, los trozos de masa probados se hornean
durante 40 minutos a una temperatura de 220ºC, con 10 segundos de
vapor, en un horno Wachtel (modelo AE 416/38 COM).
Se añadió a la masa una preparación de exoamilasa
parcialmente purificada no maltogénica de P. saccharophila
dosificándola a 1470 unidades por kg de harina. Después del
horneado los panes con o sin exoamilasa no maltogénica se enfriaron
a 20ºC y a continuación se almacenaron a 20ºC en bolsas de plástico.
La firmeza se determinó por medio de un analizador de textura de
alimento universal Instron 4301 en el día 3 y en el día 7 después
de hornear como la media de 10 rebanadas de un pan para el día 3 y
la media de 2 panes con 10 rebanadas por pan medidas por día. La
Tabla 2 muestra que se observó una firmeza inferior en los panes con
enzima añadido para ambos días.
| Tratamiento | Firmeza en el día 3 | Firmeza en el día 7 |
| Control | 49 | 71 |
| PS4 | 43 | 59 |
La Tabla 3 muestra que para el día 7 el efecto
antifirmeza de la exoamilasa no maltogénica de P.
saccharophila es estadísticamente significativa en el nivel de
confianza del 95%.
Lo siguiente describe nuestra clonación y
expresión de la codificación de gen mta de exoamilasa no
maltogénica de Pseudomonas saccharophila en Escherichia
coli MC1061.
A este respecto, la P. saccharophila IAM
1520 creció en 2 ml de medio LB y las células se cultivaron
mediante centrifugación de 10 min., a 20.000 x g. Se aisló el ADN
total utilizando un protocolo de minipreparación modificado
ligeramente. Las células se resuspendieron en 300 \mul de
regulador de resuspensión (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0;
EDTA 10mM; RNasa A 100 \mug/ml.) después de lo cual las células
se rompieron utilizando un Fastprep FP120 (BIO101; California).
Después de la rotura, se añadieron 300 \mul de regulador de lisis
(NaOH 200 mM; SDS 1%) y 300 \mul de regulador de neutralización
(acetato de potasio 3,0 M, pH 5,5). Después de la
centrifugación a 20.000 x g durante 15 min., a 4ºC, se recogió el
sobrenadante y se añadieron 0,6 volúmenes de isopropanol. Se
precipitó el ADN mediante centrifugación a 20.000 x g durante 30
min., a 4ºC, se lavó con etanol al 70%, y se redisolvió en 100
\mul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM).
Para la amplificación PCR se diseñaron 4
cebadores PCR diferentes:
| #1 | ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC | pos 213-233 |
| #2 | GCT CCT GAT ACG ACA GCG | pos 2403-2386 |
| #3 | GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC CCG | pos 663-683 |
| #4 | TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T | pos 2258-2238 |
Las posiciones se refieren a la secuencia para el
mta encontrado en el número de registro de entrada del GenBank
X16732. Los cebadores con el primer número más elevado son
cebadores complementarios y las secuencias son las secuencias
complementarias. En negrita se representan los nucleótidos que no
son complementarios al molde de ADN, y los subrayados son sitios de
restricción introducidos). El cebador #3 introduce un sitio
NcoI único, y el cebador #4 un sitio BamHI que se
utilizan para la clonación siguiente en el vector de expresión
pBAD/gIII (Invitrogen).
Se llevó a cabo una primera amplificación PCR
utilizando la combinación siguiente de cebadores:
reacción 1
\hskip1cm#1 + #2 proporcionando un fragmento en 2190 bp
con 50-150 ng de ADN IAM 1520
genómico como molde, utilizando la polimerasa Expand ADN
(Boehringer Mannheim; Alemania) según las instrucciones del
fabricante y el protocolo de amplificación siguiente:
94ºC 2 min, (94ºC 1 min, 58ºC 2 min, 72ºC 2 min)
durante 35 ciclos y finalmente 72ºC 5 min.
Se aisló del gel un fragmento 2190 bp utilizando
el "equipo de limpieza de gen" (BIO101; California). El
fragmento se utilizó como molde de ADN en una segunda PCR con la
combinación del cebador siguiente:
reacción 2
\hskip1cm#3 + #4 proporcionando un fragmento en 1605 bp
utilizando el mismo protocolo de amplificación
que se ha descrito anteriormente.
Se purificó un fragmento 1605 bp y se clonó en un
vector pCR-BLUNT (Invitrogen) según las
instrucciones del fabricante. La secuencia del fragmento clonado se
confirmó mediante la secuenciación utilizando la tecnología de
secuenciación de tinción única y un secuenciados ALF (Pharmacia;
Suecia) utilizando los cebadores universal e inversos, y cuatro
cebadores internos etiquetados.
| CAT CGT AGA GCA CCT CCA | 999-982 |
| GAT CAT CAA GGA CTG GTC C | 1382-1400 |
| CTT GAG AGC GAA GTC GAA C | 1439-1421 |
| GAC TTC ATC CGC CAG CTG AT | 1689-1708 |
Las posiciones se refieren a la secuencia para el
mta encontrado en el número de registro de entrada del GenBank
X16732. Los cebadores con el primer número más elevado son
cebadores complementarios y las secuencias son las secuencias
complementarias.
Después de confirmar la secuencia, el gen mta se
clonó en el vector de expresión pBAD/gIII (Invitrogen). El gen mta
se liberó de pCR-BLUNT mediante digestión con
BamHI seguida del despuntado con el fragmento Klenow y la
digestión con Ncol, y se purificó un fragmento 1602 bp. El
vector de expresión pBAD/gIII se digerió con Ncol y
Pmel y se purificó. Después de la ligadura se transformó la
construcción de expresión obtenida en células MC1061 de
Escherichia coli, y la proteína se expresó según el manual
pBAD/gIII (Invitrogen).
La \beta-amilasa de patata
dulce (EC 3.2.1.2; que se puede obtener de Sigma con el nº de
producto A7005) es una exoamilasa maltogénica que libera maltosa de
los extremos no reductores del almidón. La termoestabilidad de esta
exoamilasa maltogénica es similar a la de la exoamilasa no
maltogénica de P. saccharophila según se indica por las
actividades residuales después de la incubación durante 15 minutos a
temperaturas de 45 a 75ºC en citrato de sodio 50 mM, cloruro de
calcio 5 mM, pH 6,5 (Tabla 4).
| Temperatura de incubación (ºC) | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 |
| Actividad \beta-amilasa de patata dulce (%) | 100 | 117 | 55 | 12 | 5 | 4 | 4 |
| Actividad exoamilasa de P. saccharophila (%) | 100 | 68 | 29 | 10 | 7 | 6 | 6 |
| ª Actividad después de la incubación a 45ºC fijada a 100%. |
Los efectos de ambas enzimas sobre la
retrogradación del almidón se han ensayado mediante análisis de
DSC de los productos horneados y almacenados de las masas del
sistema modelo según se ha descrito en "Ensayos para la medición
de la retrogradación y el envejecimiento". Para este ensayo se
utilizaron en masas 485 unidades de exoamilasa no maltogénica de
P. saccharophila y 735 unidades de
\beta-amilasa de patata dulce ensayadas según el
"Protocolo de ensayo de amilasa". Se prepararon las masas a
partir de 50 g de harina de trigo Danish estándar (Danisco 98022)
con 30,7 ml de citrato de sodio 50 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH
6,5 sin (control) o con las enzimas añadidas.
Después de 7 días de almacenamiento se cuantifica
la cantidad de amilopectina retrogradada midiendo su entalpía de
fusión. Mediante análisis estadístico se encontró que ambas enzimas
reducen significativamente la retrogradación del almidón (Tabla 5);
es decir, la exoamilasa no maltogénica de P. saccharophila
reduce la cantidad de amilopectina retrogradada en el día 7 a 86%
(1,77 J/g) mientras que la \beta-amilasa de
patata dulce la disminuye a 96% (1,96 J/g) del control (2,05 J/g).
En conclusión, la exoamilasa no maltogénica de P.
saccharophila es claramente mucho más eficaz para reducir la
retrogradación y el envejecimiento que la amilasa maltogénica a una
termoestabilidad comparativa.
Esta tabla aplica un procedimiento de
comparación múltiple para determinar qué medias son
significativamente diferentes de las otras. La mitad inferior de los
datos de salida muestra la diferencia estimada entre cada par de
medias. Se ha colocado un asterisco próximo a los 3 pares,
indicando que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas en el nivel de confianza del 95%. El procedimiento
que se utiliza actualmente para discriminar entre las medias es el
procedimiento de la menor diferencia significativa de Fisher
(LSD).
Ejemplo
Sección
B
Materiales. - Se obtuvieron amilopectina y
amilosa de maíz, almidón de maíz, carboximetilcelulosa (CMC),
albúmina de suero bovino (BSA), dextrán, pullulan, maltosa,
maltotriosa, y una mezcla de maltotetraosa a maltodecaosa de Sigma
Chemical Co., St. Louis, U.S.A. El almidón soluble se obtuvo de
Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. El extracto de levadura y la
triptona se obtuvieron de Difco Laboratories, Detroit, Estados
Unidos. Se utilizó el arroz integral entero de Neue Allgemeine
Reisgesellschaft GmbH, Hamburgo, Alemania. Se obtuvieron \alpha-,
\beta-, y \gamma-ciclodextrinas de calidad
farmacéutica de Wacker Chemie Danmark Aps, Glostrup, Dinamarca. Se
preparó maltotetraosa según se ha descrito anteriormente [32]. Todos
los productos químicos eran de calidad analítica, a menos que se
indique lo contrario.
Aislamiento de B. clausii
BT-21. - Se aisló la cepa de una muestra de
suelo recogida en Assens, Dinamarca, identificada por DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Braunschweig, Alemania).
Producción de la enzima. - B.
clausii BT-21 creció en un medio líquido
optimizado compuesto de 2,0% de almidón soluble de patata,
amilopectina de maíz, almidón de maíz, o arroz integral entero,
0,5% de extracto de levadura, 0,5% de triptona, 0,1% de
KH_{2}PO_{4}, 0,1% de Na_{2}HPO_{4}, 0,02% de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02% de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, y
0,1% de (NH_{4})_{2}SO_{4}. Después del autoclave, se
añadió una solución estéril de Na_{2}CO_{3} a una concentración
final de 1% (aproximadamente pH 10). Se utilizó 1 ml de una
suspensión de espora en glicerol (almacenada a -80C) para inocular
100 ml del medio presente y se incubaron a 45ºC durante 18 h en un
incubador de agitación (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.,
U.S.A.) a 200 rpm. Se utilizaron 2 ml de este cultivo para inocular
un matraz de agitación con 200 ml de medio y se incubaron a 45ºC en
un incubador de agitación. Se tomaron alícuotas a intervalos
regulares y se midió el OD a 600 nm para determinar el crecimiento
de la cepa en el medio. Se centrifugaron las muestras (4 ml) a 9600
rpm durante 10 min a 4ºC y se determinaron el pH y la actividad de
la amilasa. Todos los experimentos de crecimiento se llevaron a
cabo por triplicado. Se determinaron el valor medio
(X=(\sum^{n}_{i=1}X_{i})/n) y los valores de desviación
estándar (std. =
\sqrt(\sum^{n}{}_{i=1}X_{i}-X)/(n-1)).
Purificación de la amilasa específica de
producto. - Después del crecimiento de B. clausii
BT-21 en el arroz integral entero durante 52 h, se
eliminaron del fluido extracelular (1000 ml) las células y los
granos de arroz enteros mediante centrifugación a 9600 rpm durante
15 min a 4ºC. La amilasa específica de producto se purificó
utilizando un gel de afinidad preparado uniendo covalentemente
\beta-ciclodextrina a una matriz 6B de Sepharose
epoxiactivada (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) [33]. Se incubó
el sobrenadante libre de células extracelular con 12 g de gel
mientras se agitaba durante 1 h a 4ºC. A continuación se eliminó el
sobrenadante mediante centrifugación a 9600 rpm durante 10 min a
4ºC. La proteína no unida se eliminó mediante lavado del gel con 75
ml de regulador de fosfato 50 mM pH 8,0 seguido de centrifugación.
La etapa de lavado se repitió 7 veces. La proteína unida se eluyó
con 45 ml de regulador de fosfato 50 mM, pH 8,0 que contenía
\alpha-ciclodextrina 10 mM seguido de
centrifugación. La etapa de elución se repitió 4 veces. Se utilizó
\alpha-ciclodextrina para la elución de la enzima,
ya que la \beta- y la \gamma-ciclodextrinas
interfirieron con el procedimiento de determinación de proteína de
Bradford (1976) [34]. A continuación se eliminó la
\alpha-ciclodextrina mediante diálisis
(6-8 kDa espectros/por membrana de diálisis, The
Spectrum Companies, Gardena, CA, Estados Unidos) contra 5 l de
trietanolamina 10 mM pH 7,5 mientras se agitaba a 4ºC. Se cambió el
regulador después de 2 h seguido por 12 h adicionales de diálisis.
Las bolsas de diálisis se colocaron en CMC para concentrar la
muestra. Se aplicaron diez ml a una columna HiTrap Q (5 ml
empaquetada previamente, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)
utilizando un sistema de FPLC (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las
proteínas se eluyeron a la velocidad de 1,0 ml/min con 25 ml de
trietanolamina 10 mM pH 7,5 seguido de un gradiente de NaCl 20
mM/min en trietanolamina 10 mM a pH 7,5. La enzima se eluyó con NaCl
0,5 M. El contenido de proteína se estimó mediante el
procedimiento de Bradford, (1976) [34] utilizando el ensayo de
proteína BIO-RAD (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos). Se utilizó como
estándar BSA.
Electroforesis de gel. -Se analizaron
muestras de 15 \mul mediante gel de tris-glicina
nativo al 10%, según se ha descrito en [35]. A continuación el gel
se colocó en un regulador de fosfato 50 mM a pH 6,5 y se agitó
durante 30 min. Se incubó una solución de almidón soluble al 1%
(p/v) con el gel mientras se agitaba durante 45 minutos. Después
del lavado en la solución reguladora, se incubó el gel con una
solución de yodo (I_{2} 4 mM, KI 160 mM) y se decoloró con el
regulador. Las bandas desteñidas indicaron la actividad de
hidrólisis del almidón.
Se llevó a cabo una SDS-PAGE
(10%) según [36] seguida de una tinción de plata [37]. Se utilizó
un estándar de peso molecular de intervalo ancho de
SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA, Estados Unidos).
Ensayo de la enzima. - Se incubaron dos ml
de solución de almidón soluble (1,25%) en regulador de borato 0,1 M
pH 10,0 con 0,5 ml de solución de enzima durante 2 h a 45ºC. La
reacción se paró mediante la ebullición de la mezcla durante 10 min.
La formación de azúcares reductores se determinó con el ensayo de
CuSO_{4}/bicinchonato [38] y se calculó como equivalente formado
de maltosa mM. Una unidad de actividad correspondió a la cantidad
de la enzima que produjo 1 \mumol de equivalente de maltosa/min a
pH 10,0 y 45ºC.
Caracterización de la enzima. - Para la
determinación del óptimo de temperatura, se incubó la enzima
purificada en una concentración final de almidón soluble al 1% en
regulador de borato 0,1 M pH 10,0 (con o sin la adición de
CaCl_{2} 5 mM) durante 15 min a temperaturas de 30ºC a 90ºC. Se
llevó a cabo la determinación de la estabilidad de la temperatura
mediante la incubación de la enzima purificada en regulador de
glicina-NaOH 50 mM pH 9,5 que contenía CaCl_{2} 5
mM durante 30 min a 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 y 90ºC. Se
determinó la actividad residual mediante incubación de la enzima
tratada mediante calor en una concentración final de almidón
soluble al 1% en regulador de glicina-NaOH 50 mM pH
9,5 a 55ºC durante 15 min. El pH óptimo se determinó mediante la
incubación de la enzima purificada en una concentración final de
almidón soluble al 1% en reguladores diferentes a 55ºC durante 15
min. Los reguladores que se utilizaron fueron citrato 50 mM (pH 4,0
a 6,0), tris-maleato 50 mM (pH 6,5 a 8,5), y
glicina-NaOH 50 mM (pH 9,0 a 11,0).
Se preparó una solución de
I_{2}-KI (I_{2} 0,02% y KI 0,2%) según Fuwa,
1954 [39]. La formación de color azul almidón-yodo
se midió en duplicados con las modificaciones siguientes. Se
extrajo de la hidrólisis enzimática del almidón soluble una muestra
de 500 \mul a diferentes intervalos de tiempo. A continuación se
añadieron 250 \mul de HCl y 250 \mul de solución
I_{2}-KI y se mezclaron. Se añadió agua
desionizada (4,0 ml) y se repitió la mezcla. Se midió
espectrofotométricamente la formación de un color azul a 600
nm.
Se ensaya la hidrólisis de diferentes sustratos
mediante la enzima purificada se ensayó con almidón soluble de
patata, amilopectina de maíz, dextrán, pullulan (1%), amilosa
(0,1%), y \alpha-, \beta- y
\gamma-ciclodextrinas 10 mM. Se disolvieron los
sustratos en regulador de glicina-NaOH 50 mM con
CaCl_{2} 5 mM a pH 9,5 y se añadió la enzima purificada
(505 mU/ml). Se incubaron a 55ºC diversos sustratos y las
muestras se extrajeron a diferentes intervalos de tiempo. La
reacción se paró mediante la ebullición durante 10 min y las
muestras se analizaron según se describe a continuación.
Se ensayó la hidrólisis de los
maltooligosacáridos mediante la enzima purificada con maltosa,
maltotriosa, y maltotetraosa en una concentración final de 2 mM y
una mezcla de maltotetraosa a maltodecaosa (5 mM). Los
maltooligosacáridos se disolvieron en regulador de borato 50 mM con
CaCl_{2} 5 mM a pH 9,5 y se añadió la enzima purificada (147
mU/ml). Se incubaron a 55ºC los sustratos y las muestras se
extrajeron a diferentes intervalos de tiempo. La reacción se paró
mediante la ebullición durante 10 min y se analizaron las muestras
según se describe a continuación.
Análisis de los productos de hidrólisis.-
Los productos de hidrólisis se detectaron utilizando cromatografía
de intercambio aniónico de elevada resolución con detección
amperométrica de impulsos (HPAEC-PAD). Se utilizó
una columna CarboPac PA-1 (Dionex Corporation,
Sunnyvale, CA, Estados Unidos) con un gradiente de acetato de Na 1,0
M de 0 a 60% durante 30 min en NaOH 100 mM y una velocidad de
flujo de 1,0 ml/min en un sistema Dionex
DX-300 o DX-500. Los productos de
hidrólisis del almidón se identificaron por comparación de sus
tiempos de retención con glucosa, maltosa, maltotriosa,
maltotetraosa, maltopentaosa y maltohexaosa. Ya que los tiempos de
retención de los maltooligosacáridos lineales homólogos aumentan
con el grado de polimerización, se pudieron identificar fácilmente
los maltooligosacáridos lineales del intermedio de DP [40, 41].
Identificación de B. clausii
BT-21. - Según su composición de ácidos grasos,
la cepa mostró similitud al género Bacillus. Una
secuenciación parcial del 16SrADN mostró una similitud del 99,4% a
B. clausii. Las propiedades fisiológicas de la cepa
tolerante al álcali confirmaron esta identificación.
Producción de la actividad de la amilasa
mediante B. clausii BT-21.- El almidón soluble
de patata, almidón de maíz, amilopectina de maíz y arroz integral
entero resultaron en niveles diferentes de actividad de amilasa
extracelular en el medio. Mientras, el almidón de maíz contiene más
lípidos y no fósforo comparado con la amilopectina de almidón de
patata de maíz posee una estructura elevadamente ramificada que
contiene enlaces O-glucosídicas
\alpha-D-(1\rightarrow6). Estos tres tipos de
almidón son accesibles para las enzimas después de la
gelatinización por calor, mientras el arroz integral entero contiene
un almidón menos accesible encapsulado en los granos de arroz. Las
actividades de amilasa en el fluido extracelular de cultivos
líquidos con los sustratos de almidón diferentes se muestran en la
Figura 1. La actividad amilolítica más elevada se obtuvo con arroz
integral entero como sustrato. Esto indica que la presencia de un
sustrato de almidón menos accesible resultó en un incremento de la
producción de actividades amilolíticas extracelulares mediante
B. clausii BT-21. Se obtuvieron resultados
similares con salvado de trigo, que fue sin embargo difícil de
eliminar del fluido extracelular antes de la purificación de la
enzima. Las fuentes de carbono tales como galactosa, glucógeno e
inulina se han publicado anteriormente como adecuadas para la
producción de amilasa mediante B. licheniformis [27] y se ha
encontrado el almidón soluble como el mejor sustrato para la
producción de una amilasa mediante B. stearothermophilus
[28]. Sin embargo, ninguno de estos estudios ha incluido un
sustrato de almidón menos accesible.
Purificación de la amilasa específica de
producto.- Se purificó la enzima mediante cromatografía de
afinidad con \beta-CD Sepharose 6B seguida de
cromatografía de intercambio aniónico (Tabla 6).
La actividad de la PAGE nativa teñida indicó la
presencia de actividades
3-amilolíticas en el fluido extracelular. La enzima
específica de producto se separó completamente de las otras
actividades amilolíticas después de la cromatografía de afinidad
\beta-CD seguida de cromatografía de intercambio
aniónico. La SDS-PAGE de la preparación de la
enzima purificada indicó que la amilasa específica de producto se
ha purificado hasta la homogeneidad y posee un peso molecular
aparente de aproximadamente 101 kDa. La cromatografía de afinidad de
ciclodextrina Sepharose 6B se ha utilizado anteriormente para la
purificación de una \alpha-amilasa como una etapa
de purificación final después de la eliminación de otras amilasas
mediante cromatografía de intercambio aniónico [29]. La
recuperación de la enzima de 8,7% y el factor de purificación de
18,5 obtenido para la amilasa específica de producto fueron
similares a los valores publicados por estos autores.
Caracterización de la amilasa específica de
producto.- La enzima purificada mostró un óptimo de actividad a
pH 9,5 (Figura 2) mientras la temperatura óptima para su actividad
fue a 55ºC con o sin la presencia de CaCl_{2} 5 mM (Figura 3). La
termoestabilidad de la enzima a pH 9,5 en presencia de CaCl_{2} 5
mM se muestra en la Figura 4. A temperaturas superiores a 55ºC, la
enzima pierde el 75% de su actividad máxima durante un periodo de
incubación de 30 min. Las cinco otras amilasas específicas de
producto que forman maltohexaosa [23], maltopentaosa [24], y
maltotetraosa [26] muestran asimismo un óptimo de pH alcalino. El
peso molecular de estas enzimas se estimó que era 59, 73 y 80 kDa
[23], 180 kDa [24] y 97 kDa [26] mientras la amilasa específica de
producto de B. clausii BT-21 mostró un peso
molecular estimado de 101 kDa. La mayoría de las amilasas
específicas de producto y de las \alpha-amilasas
muestran un peso molecular inferior en el intervalo de
50-65 kDa [3, 16, 17, 19 y 21]. El óptimo de
temperatura de aproximadamente 55ºC fue similar a los publicados
para las amilasas específicas de producto anteriores [23, 24 y
26].
La amilasa específica de producto purificada
hidrolizó almidón soluble después de 1 h de incubación
principalmente a maltohexaosa y maltopentaosa (52% y 19% del total
de productos hidrolizados) como los productos iniciales principales
de bajo DP (Figura 5). Después de 2 h de incubación, la cantidad de
maltohexaosa y después de 4 h la cantidad de maltopentaosa
disminuyó mientras aumentaron las cantidades de maltotetraosa,
maltotriosa, maltosa y glucosa. Estos productos se acumularon
después de una hidrólisis prolongada indicando que ya no se
hidrolizaron más. Después de 24 h de hidrólisis del almidón, las
cantidades de maltooligosacáridos fueron maltohexaosa (3%),
maltopentaosa (4%), maltotetraosa (41%), maltotriosa (13%), maltosa
(16%) y glucosa (4%). La exploración de la cromatografía de
intercambio aniónico de elevada resolución con detección
amperométrica de impulsos (HPAEC-PAD) obtenida
después de 30 min de hidrólisis del almidón (Figura 6) muestra que
los productos de hidrólisis de almidón mayores que la maltohexaosa
(DP6) estaban ausentes. Un estudio del curso del tiempo de la
hidrólisis del almidón soluble mediante amilasa específica de
producto que forma la maltohexaosa ha mostrado asimismo que la
maltohexaosa se produjo preferentemente en la etapa inicial de la
hidrólisis [23]. Kim et al (1995) [26] encontró que el
producto de hidrólisis inicial después de 1h de hidrólisis del
almidón con una amilasa específica de producto que forma
maltotetraosa fue principalmente maltohexaosa (54%) seguida de un
incremento gradual en las cantidades de maltotetraosa y maltosa
mientras la cantidad de maltohexaosa disminuyó. Después de 20 h, la
composición de maltooligosacáridos había cambiado a 0,6% de
maltohexaosa, 1,3% de maltopentaosa, 53,2% de maltotetraosa, 8,3% de
maltotriosa, 27,6% de maltosa y 9% de glucosa.
Para examinar además el modo de acción de la
enzima durante la hidrólisis del almidón, se incubaron diferentes
sustratos con la enzima purificada (Tabla 7).
Los almidones se componen de amilosa
(20-30%) y amilopectina (80-70%). La
amilosa es un glucano lineal unido mediante enlace
O-glucosídico
\alpha-D-(1\rightarrow4), mientras la
amilopectina es un glucano ramificado debido a la presencia de
enlaces O-glucosídicos
\alpha-D-(1\rightarrow6) en la molécula. La
amilasa específica de producto hidrolizó más fácilmente la
amilopectina indicada por la formación de maltopentaosa (9,2%) y
maltohexaosa (24,8%) comparada con el almidón soluble (7% y 17,8%) y
amilosa (6,3% y 20%). La enzima no hidrolizó pullulan, un glucano
unido por enlace O-glucosídico
\alpha-(1\rightarrow6) compuesto de un esqueleto de
maltotriosa, o dextrán, un glucano unido por enlace
O-glucosídico \alpha-(1\rightarrow6) con
ramificaciones unidas a 0-3 de las unidades de
cadena del esqueleto. Las \alpha-, \beta- y
\gamma-ciclodextrinas, maltooligosacáridos
cíclicos compuestos de 6, 7 y 8 unidades de glucosa no se
hidrolizaron incluso después de 24 h de incubación.
Los resultados obtenidos sobre dextrán indicaron
que no se pudieron escindir enlaces O-glucosídicos
\alpha-(1\rightarrow6) por la amilasa específica de producto.
La falta de actividad sobre pullulan indicó que la amilasa
específica de producto no pudo saltar enlaces
O-glucosídicos \alpha-(1\rightarrow6) próximos a
las tres unidades de glucosa o atacar cualquiera de estas tres
unidades de glucosa. La falta de hidrólisis sobre \alpha-,
\beta-, o \gamma-ciclodextrinas indicó que la
amilasa específica de producto hidrolizó el almidón mediante un
mecanismo de escisión del tipo exo [30]. La exploración de
HPAEC-PAD (Figura 6) indicó asimismo un mecanismo
de escisión del tipo exo, ya que los productos de hidrólisis del
almidón mayores que DP6 estuvieron ausentes.
Para examinar adicionalmente la acción de
escisión de la enzima sobre almidón soluble, la formación de color
azul de almidón-yodo se representó contra la
producción de azúcares reductores (Figura 7). La pendiente de la
curva indica el tipo dominante del mecanismo de escisión de la
hidrólisis del almidón amilolítico [31]. Una enzima que endoactúa
producirá una pendiente con un valor más pequeño comparado con la
enzima que exoactúa. Un valor pequeño de la pendiente es el
resultado de una reducción rápida del complejo de color azul
almidón-yodo debido a la actividad amilolítica
aleatoria, indicada por la \alpha-amilasa de A.
oryzae (la pendiente es -61). La preparación de enzima
extracelular de P. stutzeri mostró la evidencia para un
mecanismo de escisión exoactuante dominante indicado por un valor
de pendiente mayor (la pendiente es -13). La amilasa específica de
producto mostró un valor de pendiente de -6, indicando actividad
exo.
Se examinó el modo de acción de la hidrólisis de
los sustratos con DP bajo mediante la amilasa específica de
producto mediante la incubación con tales sustratos. La maltosa, la
maltotriosa y la maltotetraosa no se hidrolizaron mediante la
amilasa de B. clausii BT-21 purificada. Esto
confirma los resultados obtenidos sobre almidón soluble, es decir
estos productos se acumulan y por lo tanto se consideran como
productos finales de la hidrólisis.
Se estudió la actividad de amilasa específica de
producto sobre una mezcla de maltooligosacáridos de DP4 a DP10
mediante un experimento de curso de tiempo. El cambio de las áreas
de pico obtenido mediante HPAEC-PAD correspondió a
la formación o a una hidrólisis de maltooligosacáridos. La
formación de maltohexaosa (DP6) y la disminución simultánea en la
cantidad de DP7, DP8, DP9 y DP10 confirmó la capacidad formadora de
maltohexaosa de la enzima. Sin embargo, se alcanzaron las
condiciones de estado constante y no se detectó la degradación
adicional de DP6 según se encontró mediante la hidrólisis del
almidón incluso después de 7 días de hidrólisis. La concentración de
DP6 fue mucho más baja que la obtenida en la hidrólisis del almidón
e indicó que se requirió una cierta cantidad de maltohexaosa para la
formación de maltotetraosa y maltosa para continuar.
Se encontró que la hidrólisis del almidón
mediante la amilasa de producto específica de B. clausii
BT-21 se parecía a un procedimiento de dos etapas.
Este procedimiento incluyó una hidrólisis inicial de almidón a
maltohexaosa principalmente y pequeñas cantidades de maltopentaosa,
que se hidrolizaron adicionalmente a maltotetraosa y maltosa
principalmente acumuladas después de una hidrólisis extensiva. La
segunda etapa de hidrólisis a maltotetraosa y maltosa pareció que
estaba limitada por la hidrólisis preliminar del sustrato mayor a
maltohexaosa, ya que la dependencia de la concentración se parece a
un regulador para que continúe la segunda etapa.
Se llevó a cabo un experimento de horneado con la
amilasa específica de producto. Se prepararon las masas con 10 g de
harina de trigo Danish estándar (Danisco 98078) y 6,2 ml de
regulador NaOH-glicina 0,2M, pH 10 sin (control) o
con 40 unidades de la enzima (ensayada a 45ºC y pH 10 según se ha
descrito en Materiales y Procedimentos de la Sección B), horneadas
y analizadas mediante DSC después del almacenamiento según
"Ensayos para la medición de la retrogradación y del
envejecimiento". Según se muestra en la Tabla 8 la enzima reduce
significativamente la cantidad de amilopectina retrogradada
encontrada en el día 7 después de hornear lo que indica que posee
un efecto antienvejecimiento significativo.
Se han extraído las muestras de miga de los
productos congelados horneados después del horneo con agua destilada
(1 g de producto horneado/10g de agua, agitado durante 1 h y
centrifugado) y se han analizado por HPAEC-PAD según
se ha descrito anteriormente para detectar los productos de la
hidrólisis del almidón formados por la enzima durante el horneo de
las masas. Relativo al control de acumulación de maltotetraosa,
maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa se encontró como
resultado de la actividad de esta enzima.
Se describe un procedimiento para la preparación
de productos de panificación, además de amilasas adecuadas para la
utilización en tal procedimiento.
A continuación se presentan las formas de
realización preferidas, a través de los siguientes párrafos
numerados.
1. Procedimiento para la preparación de un
producto de panificación harinoso horneado que posee propiedades de
envejecimiento retardadas que comprende la adición a los
ingredientes de la masa, aditivos de la masa o la masa de una
cantidad eficaz de una exoamilasa no maltogénica capaz de hidrolizar
el almidón mediante la escisión de maltooligosacáridos lineales que
constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo a partir de los extremos no
reductores de las cadenas secundarias de amilopectina durante el
procedimiento de horneado.
2. Procedimiento según el párrafo 1, en el que la
harina es harina de trigo o harina de centeno o mezclas de harina
de trigo y harina de centeno.
3. Procedimiento según el párrafo 1 ó 2, en el
que la exoamilasa no maltogénica se añade en una cantidad que está
en el intervalo de 50 a 100.000 unidades por kg de harina,
preferentemente de 100 a 50.000 unidades por kg de harina.
4. Procedimiento según el párrafo 3, en el que la
exoamilasa no maltogénica se añade en una cantidad que está en el
intervalo de 200 a 20.000 unidades por kg de harina.
5. Procedimiento según cualquiera de los párrafos
1-4, en el que la exoamilasa no maltogénica posee
una actividad endoamilasa inferior a 0,5 unidades de endoamilasa
(EAU) por unidad de actividad exoamilasa.
6. Procedimiento según cualquiera de los párrafos
1-4, en el que la exoamilasa no maltogénica posee
una actividad endoamilasa inferior a 0,05 unidades de endoamilasa
(EAU) por unidad de actividad exoamilasa.
7. Procedimiento según cualquiera de los párrafos
1-4, en el que la exoamilasa no maltogénica posee
una actividad endoamilasa inferior a 0,01 unidades de endoamilasa
(EAU) por unidad de actividad exoamilasa.
8. Procedimiento según cualquiera de los párrafos
1-4, en el que la exoamilasa no maltogénica se
caracteriza porque, cuando una cantidad de 0,7 unidades de dicha
exoamilasa no maltogénica se incuba durante 15 minutos a una
temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg
de almidón de maíz ceroso hervido previamente por ml de solución
reguladora que contiene ácido
2-(N-morfolin)etanosulfónico 50 mM y cloruro
de calcio 2 mM, produce por lo menos 60%, preferentemente por lo
menos 70%, más preferentemente por lo menos 80% y más
preferentemente por lo menos 90% en peso de los productos de
hidrólisis que consisten en glucosa, maltosa y maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, de maltooligosacáridos lineales
que constan de 4 a 8 unidades de D-glucopiranosilo
analizándose los productos de hidrólisis por HPLC de intercambio
aniónico utilizando una columna Dionex PA 100 con detección
amperométrica de impulsos y con maltooligosacáridos lineales
conocidos de glucosa a maltoheptaosa como estándares.
9. Procedimiento según el párrafo 8, en el que la
exoamilasa no maltogénica se caracteriza porque, cuando se incuba
bajo las condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de
hidrólisis se analizan según se cita en el párrafo 8, produce por
lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente
por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90% de
maltotetraosa.
10. Procedimiento según el párrafo 8, en el que
la exoamilasa no maltogénica se caracteriza porque, cuando se
incuba bajo las condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos
de hidrólisis se analizan según se cita en el párrafo 8, produce por
lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente
por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90% de
maltopentaosa.
11. Procedimiento según el párrafo 8, en el que
la exoamilasa no maltogénica se caracteriza porque, cuando se
incuba bajo las condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos
de hidrólisis se analizan según se cita en el párrafo 8, produce por
lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente
por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90% de
maltohexaosa.
12. Procedimiento según el párrafo 8, en el que
la exoamilasa no maltogénica se caracteriza porque, cuando se
incuba bajo las condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos
de hidrólisis se analizan según se cita en el párrafo 8, produce por
lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente
por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90% de
maltoheptaosa.
13. Procedimiento según el párrafo 8, en el que
la exoamilasa no maltogénica se caracteriza porque, cuando se
incuba bajo las condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos
de hidrólisis se analizan según se cita en el párrafo 8, produce por
lo menos 60%, preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente
por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90% de
maltooctaosa.
14. Procedimiento según cualquiera de los
párrafos 1 a 4, en el que por lo menos un emulsionante se añade a
los ingredientes de la masa, aditivos de la masa o la masa.
15. Procedimiento según el párrafo 14, en el que
el emulsionante se selecciona de entre el grupo que consiste en
lecitina, estearato de polioxietileno, mono- y diglicéridos de
ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido acético de mono- y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido láctico
de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de
ácido cítrico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles,
ésteres de ácido diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de
ácidos grasos comestibles, ésteres de sacarosa de ácidos grasos
comestibles, estearoíl-2-lactilato
de sodio y estearoíl-2-lactilato de
calcio.
16. Procedimiento según cualquiera de los
párrafos 1 a 4, en el que por lo menos una enzima adicional se
añade a los ingredientes de la masa, aditivos de la masa o la
masa.
17. Procedimiento según el párrafo 16, en el que
la enzima adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en
una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una oxidorreductasa y
una proteasa.
18. Composición mejoradora para la masa y los
productos de panificación harinosos horneados preparados a partir
de la masa que comprende una exoamilasa no maltogénica capaz de
hidrolizar almidón mediante la escisión de maltooligosacáridos
lineales, que constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, de los extremos no reductores de
las cadenas secundarias de amilopectina durante el procedimiento de
horneado, y por lo menos un ingrediente de la masa o un aditivo de
la masa adicionales.
19. Composición mejoradora según el párrafo 18,
en la que la exoamilasa no maltogénica posee una actividad
endoamilasa inferior a 0,5 unidades de endoamilasa (EAU) por unidad
de actividad exoamilasa.
20. Composición mejoradora según el párrafo 18,
en la que la exoamilasa no maltogénica posee una actividad
endoamilasa inferior a 0,05 unidades de endoamilasa (EAU) por
unidad de actividad exoamilasa.
21. Composición mejoradora según el párrafo 18,
en la que la exoamilasa no maltogénica posee una acitividad
endoamilasa inferior a 0,01 unidades de endoamilasa (EAU) por
unidad de actividad exoamilasa.
22. Composición mejoradora según el párrafo 18,
caracterizada porque, cuando se incuba una cantidad de 0,7 unidades
de dicha exoamilasa no maltogénica durante 15 minutos a una
temperatura de 50ºC a pH 6,0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg
de almidón de maíz ceroso hervido previamente por ml de solución
reguladora que contiene ácido
2-(N-morfolin)etanosulfónico 50 mM y cloruro
de calcio 2 mM, produce por lo menos 60%, preferentemente por lo
menos 70%, más preferentemente por lo menos 80%, y más
preferentemente por lo menos 90% en peso de los productos de
hidrólisis que consisten en glucosa, maltosa y maltooligosacáridos
lineales de tres a diez unidades de
D-glucopiranosilo, de maltooligosacáridos lineales
que constan de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, analizándose los productos de
hidrólisis mediante HPLC de intercambio aniónico utilizando una
columna Dionex PA 100 con detección amperométrica de impulsos y con
maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a maltoheptaosa
como estándares.
23. Composición mejoradora según el párrafo 22,
en la que la exoamilasa no maltogénica, cuando se incuba bajo las
condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de hidrólisis se
analizan según se cita en el párrafo 8, produce por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 90% de maltotetraosa.
24. Composición mejoradora según el párrafo 22,
en la que la exoamilasa no maltogénica, cuando se incuba bajo las
condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de hidrólisis se
analizan según se cita en el párrafo 8, produce por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 90% de maltopentaosa.
25. Composición mejoradora según el párrafo 22,
en la que la exoamilasa no maltogénica, cuando se incuba bajo las
condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de hidrólisis se
analizan según se cita en el párrafo 8, produce por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 90% de maltohexaosa.
26. Composición mejoradora según el párrafo 22,
en la que la exoamilasa no maltogénica, cuando se incuba bajo las
condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de hidrólisis se
analizan según se cita en el párrafo 8, produce por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 90% de maltoheptaosa.
27. Composición mejoradora según el párrafo 22,
en la que la exoamilasa no maltogénica, cuando se incuba bajo las
condiciones citadas en el párrafo 8 y los productos de hidrólisis se
analizan según se cita en el párrafo 8, produce por lo menos 60%,
preferentemente por lo menos 70%, más preferentemente por lo menos
80% y más preferentemente por lo menos 90% de maltooctaosa.
28. Composición mejoradora según cualquiera de
los párrafos 19 a 27 que comprende por lo menos un aditivo
seleccionado de entre el grupo que consiste en emulsionantes e
hidrocoloides.
29. Composición mejoradora según el párrafo 28,
en la que el emulsionante se selecciona de entre el grupo que
consiste en lecitina, estearato de polioxietileno, mono- y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de ácido acético
de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de
ácido láctico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles,
ésteres de ácido cítrico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos
comestibles, ésteres de ácido diacetiltartárico de mono- y
diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ésteres de sacarosa de
ácidos grasos comestibles,
estearoíl-2-lactilato de sodio, y
estearoíl-2-lactilato de calcio.
30. Composición mejoradora según el párrafo 28,
en la que el hidrocoloide se selecciona de entre el grupo que
consiste en un alginato, un carragenano, una pectina y una goma
vegetal.
31. Composición mejoradora según cualquiera de
los párrafos 19 a 30 que comprende por lo menos una enzima
seleccionada de entre el grupo que consiste en una celulasa, una
hemicelulasa, una xilanasa, una oxidorreductasa y una proteasa.
32. Producto de panificación harinoso horneado
que se puede obtener mediante un procedimiento según cualquiera de
los párrafos 1 a 17.
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Claims (28)
1. Procedimiento para la preparación de un
producto de panificación que comprende añadir a un medio de almidón
una exoamilasa no maltogénica que es capaz de hidrolizar el almidón
mediante la escisión de uno o más maltooligosacáridos lineales, que
constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, de los extremos no reductores
de las cadenas secundarias de la amilopectina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la exoamilasa no maltogénica posee una actividad endoamilasa
inferior a 0,5 unidades de endoamilasa (EAU) por unidad de
actividad exoamilasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el medio de almidón comprende harina, en el que la harina
es harina de trigo o harina de centeno o mezclas de las
mismas.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la exoamilasa no maltogénica proporciona en un ensayo
de incubación de almidón de maíz ceroso un producto de hidrólisis o
productos de hidrólisis que comprenden uno o más maltooligosacáridos
lineales de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo
y opcionalmente glucosa, de tal modo que por lo menos 60% en peso
de los maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa consisten
en maltooligosacáridos lineales de tres a ocho unidades de
D-glucopiranosi-
lo.
lo.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos el 60% del
producto de hidrólisis es maltotetraosa, maltopentaosa,
maltohexaosa, maltoheptaosa o maltooctaosa.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos el 60% del
producto de hidrólisis es maltotetraosa.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que la enzima se puede obtener a partir de Pseudomonas
saccharophila.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que la enzima se codifica mediante una secuencia de ADN que
comprende un número de registro de entrada del GenBank X16732.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que por lo menos el 60% del producto
de hidrólisis es maltohexaosa.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la enzima se puede obtener a partir de Bacillus
clausii.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10,
en el que la enzima posee un peso molecular de aproximadamente
101.000 Da (según se ha estimado mediante electroforesis de
poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio).
12. Procedimiento según la reivindicación 9, 10 u
11, en el que la enzima posee un óptimo de actividad a pH 9,5 y
55ºC.
13. Procedimiento para la preparación de un
producto de panificación, que comprende:
(a) proporcionar una exoamilasa no maltogénica
que hidroliza el almidón mediante la escisión de uno o más
maltooligosacáridos lineales que constan predominantemente de
cuatro a ocho unidades de D-glucopiranosilo, de los
extremos no reductores de las cadenas secundarias de la
amilopectina;
(b) mezclar dicha exoamilasa no maltogénica con
harina, agua y agente fermentador bajo las condiciones de formación
de la masa; y
(c) hornear la masa.
14. Producto de panificación obtenido mediante un
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
15. Utilización de una exoamilasa no maltogénica
en un producto de panificación para retrasar el envejecimiento del
producto de panificación.
16. Composición mejoradora para la masa, en la
que la composición comprende una exoamilasa no maltogénica según
las reivindicaciones 1 a 12, y por lo menos un ingrediente de masa
o aditivo de masa adicionales.
17. Masa que comprende un medio de almidón y una
exoamilasa no maltogénica que es capaz de hidrolizar el almidón
mediante la escisión de uno o más maltooligosacáridos lineales que
constan predominantemente de cuatro a ocho unidades de
D-glucopiranosilo, de los extremos no reductores de
las cadenas secundarias de la amilopectina.
18. Masa según la reivindicación 17, en la que la
exoamilasa no maltogénica posee una actividad endoamilasa inferior
a 0,5 unidades de endoamilasa (EAU) por unidad de actividad
exoamilasa.
19. Masa según la reivindicación 17 ó 18, en la
que el medio de almidón comprende harina de trigo.
20. Masa según la reivindicación 17, 18 ó 19, en
la que la exoamilasa no maltogénica proporciona en un ensayo de
incubación de almidón de maíz ceroso un producto de hidrólisis o
productos de hidrólisis que comprenden uno o más maltooligosacáridos
lineales de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo
y opcionalmente glucosa, de tal modo que por lo menos el 60% en
peso de los maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades de
D-glucopiranosilo y opcionalmente glucosa consisten
en maltooligosacáridos lineales de tres a ocho unidades de
D-glucopiranosilo.
21. Masa según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 20, en la que por lo menos el 60% del producto de hidrólisis
es maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa, maltoheptaosa o
maltooctaosa.
22. Masa según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 21, en la que por lo menos el 60% del producto de hidrólisis
es maltotetraosa.
23. Masa según la reivindicación 22, en la que la
enzima se puede obtener a partir de Pseudomonas
saccharophila.
24. Masa según la reivindicación 22 ó 23, en la
que la enzima se codifica por una secuencia de ADN que comprende el
número de registro de entrada del GenBank X16732.
25. Masa según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 21, en la que por lo menos el 60% del producto de hidrólisis
es maltohexaosa.
26. Masa según la reivindicación 25, en la que la
enzima se puede obtener a partir de Bacillus clausii.
27. Masa según la reivindicación 25 ó 26, en la
que la enzima posee un peso molecular de aproximadamente 101.000 Da
(según se ha estimado mediante electroforesis de poliacrilamida de
dodecilsulfato de sodio).
28. Masa según la reivindicación 25, 26 ó 27, en
la que la enzima posee un óptimo de actividad a pH 9,5 y 55ºC.
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