JP2002509720A - 非マルトース生成エキソアミラーゼ類及び澱粉の劣化を遅延することへのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、澱粉の有害な劣化を遅延することへの非マルトース生成エキソアミラーゼの使用に関する。さらに、本発明はバチルス・グラウジからの新規の非マルトース生成エキソアミラーゼにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、タンパク質類、特に澱粉を分解することかできるタンパク質類に関
する。 特に、本発明は、澱粉の有害な劣化を遅延することができるタンパク質の使用
に関する。 有害な劣化（retrogradation）過程、たとえば老化（staling）は、典型的に は、澱粉基材、特に水性澱粉懸濁液の加熱及び冷却の後に生じ、そしてゲル化さ
れた澱粉の徐々の規則状態への転位のためである。

【０００２】 さらに具体的には、本発明は、アミロペクチンの有害な劣化を遅延することが
できるタンパク質の使用に関する。 さらに特別には、本発明は、ベーキングされたパン生成物を調製するためへの
タンパク質の使用、及びそのベーキングされたパン生成物自体にも関する。 さらに特別には、本発明は、ベーキングされた澱粉質のパン生成物の劣化の遅
延にも関する。

【０００３】 さらに特定には、本発明は、パンドウに非マルトース生成エキソアミラーゼを
添加することを含んで成る、劣化を遅延又は低下せしめた、ベーキングされた澱
粉質のパン生成物の製造方法にも関する。 本発明はまた、非マルトース生成エキソアミラーゼを含んで成る、ドウ及びベ
ーキングされた澱粉質のパン生成物のための改良された生成物にも関する。

【０００４】発明の背景 澱粉はアミロペクチン及びアミロースを含んで成る。アミロペクチンは、枝分
かれした及びブッシュ様構造を形成するα−（１→６）結合を通して枝分かれ点
で一緒に連結される短いα−（１→４）−D−グルカン鎖を有する高度に枝分か れされた炭水化物ポリマーである。平均的に、20〜25のα−（１→４）結合され
たグルコース残基ごとに１つの枝分かれ点が存在する。対照的に、アミロースは
、枝だなしのα−（１→４）−D−グルカン単位から主に成る線状構造である。 典型的には、澱粉は、約75％のアミロペクチン分子及び約25％のアミロース分子
を含む。

【０００５】 より具体的には、線状マルト−多糖類は、α−（１→４）結合により連結され
る２〜10単位のα−D−グルコピラノースから構成される。それらの性質、たと えば低甘味性、高い水保持機能及びスクロース結晶化の阻止[1]のために、それ らの化合物は食品産業への可能性ある用途を有する。しかしながら、３以上の重
合程度（すなわち、DP＞３）を有するマルト−オリゴ糖の多量の調製は、短調で
退屈であり、且つ費用が高い。

【０００６】 バックグラウンド情報として、次のものを列挙する：DP1＝グルコース、DP2＝
マルトース、DP3＝マルトトリオース、DP4＝マルトテトラオース、DP5＝マルト ペンタオース、DP6＝マルトヘキサオーズ、DP7＝マルトヘプタオース、DP8＝マ ルトオクタオース、DP9＝マルトノナオース、及びDP10＝マルトデカオース。 特定の長さのマルト−オリゴ糖を生成する微生物酵素の発見は、多量のそれら
のオリゴ糖の生成を可能にする[２]。

【０００７】 アミラーゼは、澱粉においてα−D−（１→４）O−グリコシド結合を分解する
、ヒドロラーゼとして分類される澱粉−分解酵素である。一般的に、α−アミラ
ーゼ（E. C. 3. 2. 1. 1, α−D−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ は、ランダム態様で澱粉分子内のα−D−（１→４）O−グルコシド結合を分解す
るエンド−作用酵素として定義される[３]。

【０００８】 対照的に、エキソ−作用性アミロース分解酵素、たとえばβアミラーゼ（E. C
. 3. 2. 1, α−D−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）、及びいくつか
の生成物−特異的アミラーゼは、基質の非還元末端から澱粉分子を分解する[４]
。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（E. C. 3. 2. 2. 20, α−D−グルコシ
ドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（E. C. 3. 2. 1. 3, α−D−（１ →４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、及び生成物−特異的アミラーゼは、澱
粉から特定の長さのマルト−オリゴ糖を生成することができる。

【０００９】 特定のDPのマルト−オリゴ糖を生成するいくつかのアミラーゼ、たとえばクレ
ビシェラ・プネウモニア（Klebsiella pneumonia）[5, 6]、バチルス・スブチリ
ス（Bacillus subtilis）[7], B. サーキュランスG−６（B. circulans G-6）[8
]、B.サーキュランスF-2 [9]、及びB.カルドベロックス（B. caldovelox）[11,
12]が、これまで同定されている。マルトペンタオース−生成アミラーゼは、B. リケニホルミス（B. licheniformis）584 [13] 及びプロイドモナスspp. (Pseud
omonas spp.) [14, 15] において検出されている。さらに、マルトテトラオース
−生成アミラーゼが、シュードモナス・スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）NRRL
B-3389 [16, 17]、バチルスsp. MG-4 [14] 及びシュードモナスsp. IMD353 [19
] から、及びマルトトリオース−生成アミラーゼが、ストレプトミセス・グリセ
ウス（Streptomyces griseus）NA-468 [20] 及びB. スブチリス[21] から報告さ
れている。

【００１０】 EP−B1−298,645号は、遺伝子工学技法を用いて、シュードモナス・スツゼリ 又はP. サッカロフィラ（P. saccharophila）のエキソ−マルトテトラヒドロラ ーゼを調製するための方法を記載する。 アメリカ特許第5,204,254号は、好アルカリ性細菌（DSM5853）の天然の及び遺
伝子的に修飾されたエキソ−マルトペンタヒドロラーゼを記載する。

【００１１】 高いpHで活性な非常に少数の生成物−特異的アミラーゼが同定されている。同
定されているそれらの例は、マルトヘキサノースを生成するバチルスsp. H−167
[22, 23]、マルトペンタオースを生成する細菌単離物（163−26、DSM5853）[24]
、マルトテトラオース及びより小さなマルト−オリゴ糖を生成するバチルスsp.
IMD370 [25]、及び延長された加水分解期間、マルトテトラオースに転換された 澱粉からマルトヘキサオースを最初に生成したバチルスsp. GM8901 [26] からの
アミラーゼを包含する。

【００１２】 水の存在下で加熱された澱粉粒質物は、ゲル化と呼ばれる規則不規則転移を受
け、ここで液体が膨潤粒質物により取られる。ゲル化温度は、異なって澱粉で変
化し、そして天然の修飾されていない澱粉に関しては、それらの生物学的な源に
依存する。 冷却は、澱粉濃度に依存して、ゲル化された相を粘弾性ペースト又は弾性ゲル
に転換する。この工程の間、アミロース及びアミロペクチン鎖は、より規則化さ
れた構造を形成するために再会合する。時間の経過に従って、会合がより形成さ
れ、そしてそれらはさらにより規則的に成る。アミロペクチン鎖DP−15−20の会
合が熱可逆性擬似結晶構造を導くと思われる。

【００１３】 有害な劣化の結果、ペースト又はゲルシステムの水保持能力が、ゲルテキスチ
ャー及びダイエット性質に重要に関係して変更される。 ベーキングされたパン生成物の品質が貯蔵の間、徐々に劣化することは知られ
ている。パンの中味は柔軟性及び弾性を失い、そして堅く且つ脆くなる。このい
わゆる劣化は、非晶性状態から擬似結晶状態に、ベーキングの間ゲル化される澱
粉の転移であることが理解されている、主に澱粉の有害な劣化のためである。パ
ンの中味の堅さの上昇はしばしば、パンの劣化過程の測定値として使用される。

【００１４】 あらたにベーキングされたパンの冷却に基づいて、アミロース画分は、時間の
経過に従って、劣化し、網状構造を進行せしめる。この過程は、それが低い程度
の堅さ及び改良されたスライスシング特性を有する所望のパン中心構造を創造す
ることにおいて有益である。アミロペクチンの徐々の結晶化が、ベーキングの後
、数日間、ゲル化された澱粉顆粒内で生じる。この過程において、アミロペクチ
ンは、澱粉顆粒が埋封されているアミロース網状構造を強化すると思われる。こ
の強化は、パン中心の高められた硬性を導く。この強化がパン劣化の主な原因の
１つである。

【００１５】 アミロペクチンの有害な劣化又は結晶化の割合は、アミロペクチンの側鎖の長
さに依存する。これによれば、穀物アミロペクチンは、穀物アミロペクチンより
も長い平均側鎖を有する、エンドウ又はジャガイモからのアミロペクチンにより
も遅い速度で劣化する。

【００１６】 これは、11以下のDP、すなわち重合の程度の平均鎖長を有するアミロペクチン
がまったく結晶化しない、アミロペクチンゲルシステムからの観察により支持さ
れる。さらに、DP6−9の非常に短い鎖の存在が、たぶん立体的妨害のために、周
囲の長い側鎖の結晶化を阻害すると思われる。それにより、それらの短い鎖は、
強い反−有害な劣化効果を有すると思われる。これによれば、アミロペクチン劣
化は、DP14−24を有する側鎖のモル画分に直接的に比例し、そしてDPG6−9を有 する側鎖のモル画分に反比例する。

【００１７】 小麦及び他の穀類においては、アミロペクチンの外部側鎖は、DP12−19の範囲
である。従って、アミロペクチン側鎖の酵素加水分解は、それらの結晶化傾向を
著しく低めることができる。 グルコース生成及びマルトース生成エキソ−アミラーゼ、たとえばグルコース
を開放することによって澱粉を加水分解するアミログリコシダーゼ、及び非還元
鎖末端からマルトースを開放することによって澱粉を加水分解するマルトース生
成エキソアミラーゼ又はβ−アミラーゼを用いることによって、パンの劣化を遅
延することは、当業界において知られている。

【００１８】 これに関しては、Jakubczykなど. (Zesz. Nauk. Sck. Gl. Gospod Wiejsk. Wa
rzawie, Technol. Reino-Spozyw, 1973, 223-235)が、アミログルコシダーゼが 小麦粉をベーキングすることによって得られたパンの劣化を遅延することができ
ることを報告している。 JP−62−79745号及びJP−62−79746号は、それぞれ、バチルス・ステアロサー
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）及びバチルス・メガテリウム（Bac
illus megateriumu ）により生成されるβ−アミラーゼの使用がパンを包含する
澱粉食品の劣化の遅延において効果的であることを言及している。

【００１９】 EP−A412,607号は、ゲル化の前、不活性化されない、熱安定性エキソアミラー
ゼのドウへの添加により劣化性質を遅延しているパン生成物の生成方法を開示す
る。アミログリコシダーゼ及びβ−アミラーゼのみが、使用される適切なエキソ
アミラーゼとして列挙されている。エキソアミラーゼは、アミロース及びアミロ
ペクチンの非還元末端からグルコース又はマルトースを分解することによって、
ベーキングの間、アミロペクチン成分の結晶化性質を選択的に変性することがで
きる量で存在する。EP−A−412, 607号によれば、エキソアミラーゼは、アミロ ースの結晶化性質に対し実質的な影響を及ぼさないで、アミロペクチンの結晶化
性質を選択的に低める。

【００２０】 EP−A−494,233号は、α−形状で存在し、そしてゲル化の前、不活性化されて
いないマルトースを開放するために遅延された劣化性質を有する、ベーキングさ
れた生成物の生成工程へのマルトース生成エキソアミラーゼの使用を開示する。
バチルス株NCIB11837からのマルトース生成α−アミラーゼのみが特別に開示さ れる。明らかに、マルトース生成エキソアミラーゼは、段階的に、多糖鎖の非還
元末端からのα−マルトース単位を除去することによって、澱粉における（１→
４）−α−グルコシド結合を加水分解する。

【００２１】 従って、従来技術は、一定のグルコース生成エキソアミラーゼ及びマルトース
生成エキソアミラーゼが、アミロペクチン側鎖の短縮を通してアミロペクチンの
有害な劣化傾向を選択的に低めることによって、非劣化効果を提供することがで
きることを教授する。 それにもかかわらず、澱粉生成物、特にベーキングされた生成物、より特定に
はパン生成物の有害な劣化を遅延するための、たとえば老化を遅延するための、
異なった及び効果的な、好ましくはより効果的手段を提供する必要性がまだ存在
する。

【００２２】発明の要約 本発明は、有害な劣化特性が遅延する澱粉生成物の製造方法を提供する。 本発明はまた、本発明の方法において有用である酵素も提供する。 本発明の酵素はアミラーゼ酵素である。より具体的には、本発明の酵素は非マ
ルトース生成エキソアミラーゼ酵素である。 非マルトース生成エキソアミラーゼが、ベーキングされた生成物における老化
を遅延するためにはもちろんのこと、澱粉生成物の有害な劣化を遅延するために
これまで使用されたことはないことが注目されるべきである。

【００２３】 従って、本発明の第１の観点によれば、アミロペクチンの側鎖の非還元末端か
ら４〜８個のD−グルコピラノシル単位から主として成る１又は複数の線状マル トオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を加水分解することができる非マルトー
ス生成エキソアミラーゼを澱粉基材に添加することを含んで成る澱粉生成物の製
造方法が提供される。 澱粉基材への非マルトース生成エキソアミラーゼの添加は、澱粉生成物の加熱
の間、及び/又はその後に行うことができる。 従って、本発明の第２の観点によれば、本発明の方法により得られる、ベーキ
ングされた生成物が提供される。

【００２４】 従って、本発明の第３の観点によれば、ドウのための改良された組成物が提供
され；ここで前記組成物は非マルトース生成エキソアミラーゼ、及び少なくとも
１つの追加のドウ成分又はドウ添加材を含んで成る。 従って、本発明の第４の観点によれば、澱粉生成物の有害な劣化を遅延するた
めに澱粉生成物への非マルトース生成エキソアミラーゼの使用が提供される。 従って、本発明の第５の観点によれば、新規非マルトース生成エキソアミラー
ゼが提供される。 本発明のそれらの及び他の観点は、請求の範囲に提供される。さらに、本発明
のそれらの及び他の観点、並びにそれらの好ましい観点が下記に提供され、そし
て論じられる。

【００２５】一般的な定義 従って、本発明は、澱粉基材、特に澱粉ゲルの有害な劣化を遅延することがで
きるタンパク質の使用に関する。 １つの好ましい観点においては、本発明は、澱粉の劣化を遅延することができ
るタンパク質の使用に関する。 もう１つの観点においては、本発明は、澱粉基材、たとえば澱粉ゲルの有害な
劣化を遅延することができるタンパク質の使用に関する。 本発明によれば、用語“澱粉”とは、澱粉自体、又はその成分、特にアミロペ
クチンを意味する。 本発明によれば、用語“澱粉基材”とは、澱粉を含んで成るいずれかの適切な
基材を意味する。

【００２６】 用語“澱粉生成物”とは、澱粉を含むか、又は澱粉に基づくか、又は澱粉に由
来するいずれかの生成物を意味する。 好ましくは、澱粉生成物は、小麦粉から得られた澱粉を含み、又はその澱粉に
基づかれ、又はその澱粉に由来する。 用語“小麦粉”とは、本明細書において使用される場合、小麦粉又は他の穀物
の細かく粉砕された粉と同義語である。しかしながら、好ましくは、その用語は
、小麦自体から得られ、そして他の穀物からではない食料粉を意味する。従って
、及び特にことわらない限り、“小麦粉”とは、本明細書において使用される場
合、小麦粉自体を意味し、そして基材、たとえばドウに存在する場合も小麦粉を
意味する。

【００２７】 好ましい食料粉は、小麦粉又はライ麦粉、又はそれらの混合物である。しかし
ながら、他のタイプの食料粉、たとえば米、トウモロコシ、大麦及びアズキに由
来する食料粉を含んで成るドウもまた企画される。 好ましくは、澱粉生成物は、大麦生成物である。 より好ましくは、澱粉生成物は、パン生成物である。 さらにより好ましくは、澱粉生成物は、ベーキングされた澱粉質のパン生成物
である。

【００２８】 用語“ベーキングされた澱粉質のパン生成物”とは、粉砕された穀物に基づく
、及び食料粉、水及び発酵剤をドウ形成条件下で混合することにより得ることが
できるドウに基づくいずれかのベーキングされた生成物を言及することが理解さ
れる。しかしながら、追加の成分がそのドウ混合物に添加され得ることも、本発
明の範囲内である。

【００２９】 用語“アミラーゼ”は、その通常の意味においては、中でも、澱粉の分解を触
媒することが酵素を意味する。特に、それらは澱粉においてα−D−（１→４）O
−グリコシド結合を分解できるヒドロラーゼである。 用語“非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素”とは、最初、澱粉を実質的な
量のマルトースに分解しない酵素を意味する。非常に好ましい観点においては、
その用語はまた、最初、澱粉を実質的な量のマルトース及びグルコースに分解し
ない酵素を意味する。

【００３０】 本発明の前、非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素は、澱粉基材、特に澱粉
ゲルの有害な劣化を遅延することについて提案されたことはない。 本発明に従ってアミラーゼ活性を決定するための適切なアッセイは、後で提供
される。便利には、このアッセイは“アミラーゼアッセイプロトコール”と呼ば
れる。 従って、好ましくは、用語“非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素”とは、
本明細書に提供される“アミラーゼ活性プロトコール”に記載のような生成物測
定方法に従って分析される場合、前記酵素が最初、澱粉を実質的な量のマルトー
スに分解しないことを意味する。

【００３１】 好ましい観点においては、非マルトース生成エキソアミラーゼは、0.7単位の 量の前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、50mMの２−（N−モルホリノ） エタンスルホン酸及び2mMの塩化カルシウムを含む緩衝液1ml当たり10mgの予備煮
沸されたモチ状澱粉の水溶液4mlにおいて、50℃の温度でpH6.0で15分間インキュ
ベートされる場合、前記酵素が２〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意に はグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物を生
成し、その結果、前記加水分解生成物の少なくとも60重量％、好ましくは少なく
とも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％そして最も好ましくは少なく
とも85重量％が、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、 好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から構成 されることにより特徴づけることができる。

【００３２】 参照の容易さ及び本発明の目的のために、50mMの２−（N−モルホリノ）エタ ンスルホン酸及び2mMの塩化カルシウムを含む緩衝液1mlあたり10mgの予備煮沸さ
れたモチ状トウモロコシ澱粉の水溶液4mlにおいて、50℃の温度及びpH6.0で15分
間、0.7単位の量の非マルトース生成エキソアミラーゼをインキュベートする特 徴が、“モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験”として言及され得る
。

【００３３】 従って、好ましい非マルトース生成エキソアミラーゼは、２〜10個のD−グル コピラノシル単位及び任意にはグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖
から成る加水分解生成物を、モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験に
おいて生成する能力を有するものとして特徴づけられ；その加水分解の結果、前
記加水分解生成物の少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より
好ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも85重量％が、３〜
10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD
−グルコピラノシル単位から成る線状マルトオリゴ糖から成る。

【００３４】 モチ状トウモリコシ澱粉インキュベーション試験における加水分解生成物は、
２〜10個のD−グルコピラノシル単位の１又は複数の線状マルト−オリゴ糖及び 任意にはグルコースを含む。モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験に
おける加水分解生成物はまた、他の加水分解生成物も含むことができる。それに
もかかわらず、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の重 量％の量は、２〜10個のD−グリコピラノシル単位及び任意にはグルコースの１ 又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物の量に基づく。換言す
れば、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の重量％の量 は、２〜10個のD−グルコプラノシル単位の１又は複数の線状マルト−オリゴ糖 及びグルコース以外の他の加水分解生成物の量に基づかない。

【００３５】 加水分解生成物は、いずれかの適切な手段により分析され得る。たとえば、加
水分解生成物は、パルスされた電流滴定検出及びたとえば標準として、グルコー
ス〜マルトヘプタオースの既知の線状マルトオリゴ糖と共に、Dionex PA 100カ ラムを用いて、アニオン交換HPLCにより分析され得る。 参照の容易さ及び本発明の目的のために、パルスされた電流滴定検出及び標準
として、グルコース〜マルトヘプタオースの既知線状マルトオリゴ糖と共にDion
ex PA 100 カラムを用いて、アニオン交換HPLCによる加水分解生成物の分析特徴
は、“アニオン交換による分析”として言及され得る。もちろん、及びまさに示
されるように、他の分析技法及び他の特定のアニオン交換技法でも十分である。

【００３６】 従って、他方では、好ましい非マルトース生成エキソアミロースは、モチ状ト
ウモロコシ澱粉インキュベーション試験において、２〜10個のD−グルコピラノ シル単位及び任意にはグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る
加水分解生成物を生じさせる能力を有し、その結果、前記加水分解生成物の少な
くとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80
重量％そして最も好ましくは少なくとも85重量％が、３〜10個のD−グルコピラ ノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル 単位の線状マルトオリゴ糖から成ることを特徴とする。

【００３７】 本明細書において使用される場合、用語“線状マルト−オリゴ糖”とは、通常
、α−（１→４）結合により結合される、２〜10個のα−D−グルコプラノース 単位を意味するものとして使用される。 用語“P.サッカロフィラ（Pseudomonas sacharophila）から得ることができる
”とは、酵素がP.サッカロフィラから必ずしも得られる必要はないことを意味す
る。代わりに、酵素は組換えDNA技法の使用により調製され得る。

【００３８】 P.サッカロフィラから得ることができる酵素に関しての用語“その機能的同等
物”とは、その機能的同等物が他の源から得られることを意味する。機能的に同
等の酵素は異なったアミノ酸配列を有するが、しかし非マルトース生成エキソア
ミラーゼ活性を有するであろう。その機能的に同等の酵素は異なった化学構造及
び/又は化学式を有するが、しかし非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有 するであろう。その機能的に同等の酵素は、P.サッカロフィラから得られる非マ
ルトース生成エキソアミラーゼ酵素と正確に同じ非マルトース生成エキソアミラ
ーゼ活性を必ずしも有する必要はない。いくつかの用途においては、好ましくは
、機能的に同等の酵素は、P.サッカロフィラから得られる酵素と少なくとも同じ
活性プロフィールを有する。

【００３９】 用語“バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）から得ることができる”とは
、酵素がバチルス・クラウジから必ずしも得られる必要はないことを意味する。
代わりに、酵素は、組換えDNA技法の使用により調製され得る。 バチルス・グラウジから得ることができる酵素に関しての用語“その機能的同
等物”とは、その機能的同等物が他の源から得られることを意味する。機能的に
同等の酵素は異なったアミノ酸配列を有するが、しかし非マルトース生成エキソ
アミラーゼ活性を有するであろう。

【００４０】 その機能的に同等の酵素は異なった化学構造及び/又は化学式を有するが、し かし非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するであろう。その機能的に同
等の酵素は、バチルス・グラウジから得られる非マルトース生成エキソアミラー
ゼ酵素と正確に同じ非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を必ずしも有する必
要はない。いくつかの用途においては、好ましくは、機能的に同等の酵素は、バ
チルス・グラウジから得られる酵素と少なくとも同じ活性プロフィール（たとえ
ば、図7に示される反応性プロフィール）を有する。

【００４１】一般的な解説 本発明は、非マルトース生成エキソアミアーゼが澱粉生成物、たとえばベーキ
ングされた生成物において有害な劣化、たとえば老化（staling）を遅延し又は 低めることにおいて非常に効果的である驚くべき発見に基づかれている。 本発明者は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼが、グルース生成及
びマルトース生成エキソアミラーゼよりも、パンにおける有害な劣化、たとえば
老化を遅延することにおいてより効果的であり得ることを見出した。 有害な劣化の低下は、当業界において知られている標準の技法により測定され
得る。例によれば、いくつかの技法が、セクション標題“劣化の測定のためのア
ッセイ”において、後で示される。

【００４２】 本発明の研究において、本発明者は、十分な熱安定性を有する、十分な量の活
性の非マルトース生成エキソアミラーゼ、たとえばエキソ−マルトテトラヒドロ
ラーゼ（EC 3. 2. 1. 60）をドウ中に導入することによって、たとえば貯蔵条件
下で対照のパンの有害な劣化に比較して、低められた、多くの場合、十分に低め
られた有害な劣化を有するベーキングされた生成物が提供されることを見出した
。対照的に、非マルトース生成エキソアミラーゼの熱安定性に匹敵する熱安定性
を有するマルトース生成エキソアミラーゼの同じ量の活性を組み込むことによる
有害な劣化を低める効果は、有意に劣っている。

【００４３】 従って、非マルトース生成エキソアミラーゼの抗劣化効果は、マルトース生成
エキソアミラーゼのその効果よりもより効果的である。本発明者は、この差異が
一部、アミロペクチン側鎖が短くされる程度によるかも知れないと信じている。
本発明はまた、抗劣化効果が、マルトヘプタオース及び/又はマルトオクタオー ス及び/又はマルトへキソースを開放する本発明の非マルトース生成エキソアミ ラーゼを用いる場合、さらにより著しいことも信じている。

【００４４】 本発明の研究において、本発明者はまた、マルトヘキサオースを生成する高い
pHで活性な生成物−特異的アミラーゼを精製し、そして特徴づけた。このアミラ
ーゼは、バチルス・クラウジBT−21のアルカリ耐性株から単離された。 さらに、本発明者は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼを用いるこ
とによって得ることができる有害な劣化の遅延が非常に広範囲にわたって、用量
応答性であることを見出した。これは、かなり制限され、そして強く低下する用
量応答を有するマルトース生成エキソアミラーゼからの効果と対照的である。

【００４５】アミラーゼ 1つの観点において、本発明は、澱粉生成物、たとえば製パン製品を調製する ためへの一定のアミラーゼの使用を提供する。この観点においては、非マルトー
ス生成エキソアミラーゼであるアミラーゼは、澱粉生成物、特にベーキングされ
た澱粉質パン生成物の老化を遅延し、又は低める（すなわち、老化の速度を低め
る）。 好ましくは、アミラーゼは、単離された形で及び/又は実質的に純粋な形で存 在する。ここで、用語“単離された”とは、酵素がその天然の環境下で存在しな
いことを意味する。

【００４６】 上記に示されるように、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素は、
最初に、澱粉を実質的な量のマルトースに分解しない。 本発明によれば、非マルトース生成エキソアミラーゼは、アミロペクチンの側
鎖の非還元末端から、４〜８個のD−グルコピラノシル単位から主に成る線状マ ルトオリゴ糖を切り離すことができる。この特徴を有し、そして本発明への使用
のために適切である非マルトース生成エキソアミラーゼは、アミラーゼアッセイ
プロトコール（前記）に示されるモデル系におけるゲル化されたモチ状トウモロ
コシを加水分解するそれらの能力により同定される。

【００４７】 アミラーゼアッセイプロトコールにおける記載される条件下で15分間インキュ
ベートされる場合、本発明への使用のために適切である非マルトース生成エキソ
アミラーゼは、２〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意にはグルコースの １又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物を生成し、その結果
、その加水分解生成物の生成物パターンは、少なくとも60重量％、特に少なくと
も70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも
90重量％が、マルトース及びグルコース以外の澱粉加水分解生成物から成る。

【００４８】 本発明の好ましい観点に関しては、本発明への使用のために適切である非マル
トース生成エキソアミラーゼは、モチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試
験について記載される条件下で15分間インキュベートされる場合、前記加水分解
生成物をもたらし、その結果、その加水分解生成物は、少なくとも60重量％、特
に少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％そして最も好ましく
は少なくとも90重量％の、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオ リゴ糖、特に４〜８個のD−グルコピラノシル単位から成る線状マルトオリゴ糖 の生成物パターンを有する。

【００４９】 本発明のより好ましい観点においては、前記試験における前記加水分解生成物
は、少なくとも60重量％、特に少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも
80重量％そして最も好ましくは少なくとも85重量％の、４又は６個のD−グルコ ピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖の生成物パターンを有する。 本発明のより好ましい観点においては、前記試験における前記加水分解生成物
は、少なくとも60重量％、特に少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも
80重量％そして最も好ましくは少なくとも85重量％の、４個のD−グルコピラノ シル単位の線状マルトオリゴ糖の生成物パターンを有する。

【００５０】 本発明のより好ましい観点においては、前記試験における前記加水分解生成物
は、少なくとも60重量％、特に少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも
80重量％そして最も好ましくは少なくとも85重量％の、６個のD−グルコピラノ シル単位の線状マルトオリゴ糖の生成物パターンを有する。 好ましくは、非マルトース生成エキソアミラーゼは、その一次生成物をグルコ
ース、マルトース及びマルトトリオースに転換するように該生成物を実質的に加
水分解しない。その場合、前記一次生成物は、酵素に対してアミロペクチン非還
元鎖末端と基質として競争し、その結果、その抗−劣化効率を低められる。

【００５１】 従って、好ましくは、非マルトース生成エキソアミラーゼは、モチ状トウモロ
コシ澱粉インキュベーション試験に類似する条件下で（但し、15分間が300分に 延長され、そして本発明の便利さのために、この変性されたモチ状トウモリコシ
澱粉インキュベーション試験は“延長されたモチ状トウモロコシ澱粉インキュベ
ーション試験”と呼ばれる）、300分間インキュベートされる場合、前記加水分 解生成物をなお生成し、ここで前記加水分解生成物は、少なくとも50重量％、特
に少なくとも60重量％、より好ましくは少なくとも70重量％、そして最も好まし
くは少なくとも80重量％の４〜８個のD−グルコピラノシル単位の生成物パター ンを有する。

【００５２】 例によれば、本発明の方法において有用な非マルトース生成エキソアミラーゼ
は、それがモチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験において、２〜10個
のD−グルコピラノシル単位及び任意にはグルコースの１又は複数の線状マルト −オリゴ糖から成る加水分解生成物を生成する能力を有し、その結果、前記加水
分解生成物の少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好まし
くは少なくとも80重量％そして最も好ましくは少なくとも85重量％が、３〜10個
のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グ
ルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から成り、そして前記酵素がP.サッカ
ロフィラから得ることができるものであり、又はその機能的同等物であることに
より特徴づけられ得る。

【００５３】 さらなる例によれば、本発明の方法において有用なもう１つの非マルトース生
成エキソミラーゼは、それがモチ状トウモロコシ澱粉インキュベーション試験に
おいて、２〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意にはグルコースの１又は 複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分解生成物を生成する能力を有し、そ
の結果、前記加水分解生成物の少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重
量％、より好ましくは少なくとも80重量％そして最も好ましくは少なくとも85重
量％が、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましく は４〜８個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から成り、そして 前記酵素がバチルス・クラウジから得ることができるものであり、又はその機能
的同等物であり、そして前記酵素が約101,000Daの分子量を有し（ドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により推定される場合）、そして/又は 前記酵素がpH9.5及び55℃で最適活性を有することにより特徴づけられる。

【００５４】 好ましくは、本発明の使用のために適切である非マルトース生成エキソアミラ
ーゼは、ベーキングの間、活性であり、そして約55℃の温度で開始する澱粉顆粒
のゲル化の間及びその後、澱粉を加水分解する。非マルトース生成エキソアミラ
ーゼはより熱安定性であるほど、より長い時間、活性であり、そして従って、よ
り抗老化効果を提供するであろう。しかしながら、約85℃の温度以上でベーキン
グする間、非マルトース生成エキソアミラーゼは選択的に徐々に不活性化され、
その結果、ベーキング工程の後、最終のパンにおいて活性は実質的に存在しない
。

【００５５】 従って、好ましくは、本発明への使用のために適切な非マルトース生成エキソ
アミラーゼは、上記のようにして調製された、50mMのMES、2mMの塩化カルシウム
溶液（pH6.0）中、10mg/mlのモチ状トウモロコシ澱粉4mlを含む試験において、4
0, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85又は90℃で15分間インキュベートされ 、そして上記のようにして加水分解生成物の開放についてアッセイされる場合、
約45℃〜98℃の最適温度を有する。好ましくは、非マルトース生成エキソアミラ
ーゼの最適温度は55℃〜95℃であり、そしてさらにより好ましくは、60℃〜90℃
である。

【００５６】 低い熱安定性であることが見出され得る非マルトース生成エキソアミラーゼは
、より熱安定性になるようタンパク質工学を用いて改良され得、そして従って、
本発明への使用のために適切である。従って、タンパク質工学により一層熱安定
性になるよう変性された非マルトース生成エキソアミラーゼの使用が本発明によ
り包含される。

【００５７】 いくつかの非マルトース生成エキソアミラーゼがいくらかの程度のエンドアミ
ラーゼ活性を有することは知られている。多くの場合、このタイプの活性は減じ
られるか又は排除される必要がある。なぜならば、エンドアミラーゼ活性は、枝
分かれのデキストリンの蓄積のために、粘着性の又はゴム状のパンの中味（crum
b）を生成することによって、最終のパン生成物の品質におそらく負の効果を与 えるためである。

【００５８】 従って、好ましい観点においては、本発明の非マルトオース生成エキソアミラ
ーゼは、１単位のエキソアミラーゼ活性当たり0.5より少いエンドアミラーゼ単 位（EAU）を有するであろう。 好ましくは、本発明の使用のために適切である非マルトース生成エキソアミラ
ーゼは、１単位のエキソアミラーゼ活性当たり0.0５より少いEAUを有し、そして
より好ましくは、１単位のエキソアミラーゼ活性当たり0.01より少いEAUを有す る。 エンドアミラーゼ単位は、下記に示されるエンドアミラーゼアッセイプロトコ
ールにより決定され得る。

【００５９】 本発明への使用のために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼの例は、非
還元鎖末端から、それぞれマルトテトラオース、マルトペンタオース又はマルト
ヘキサオースの連続的な残基を除去するために、澱粉質多糖類の1, 4−α−グル
コシル結合を加水分解する、エキソーマルトテトラヒドロラーゼ（E. C. 3. 2.
1. 60）、エキソ−マルトペンタヒドロラーゼ及びエキソ−マルトヘキサヒドロ ラーゼ（E. C. 3. 2. 1. 98）を、包含する。

【００６０】 例としては、シュードモナス・サッカロフィラ及びP. スツゼリ（EP−0298645
B1）のエキソ−マルトテトラヒドロラーゼ、好アルカリ性グラム−陽性細菌（ア
メリカ特許第5,204,254号）及びシュードモナスsp. (Shidaなど., Biosci. Biot
echnol. Biochem., 1992, 56, 76-80)のエクソ−マルトペンタヒドロラーゼ、及
びバチルスsp. #707（Tsukamoto など., Biochem. Biophys. Res. Commun., 198
8, 151, 25-31）、B.サーキュランスF2（Taniguchi, ACS Symp., 1991, Ser. 45
8, 111-124）及びアエロバクター・アエロゲネス（Kainumaなど., Biochim. Bio
phys. Acta, 1975, 410, 333-346）のエキソ−マルトヘキサヒドロラーゼを列挙
することができる。

【００６１】 本発明への使用のために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼのもう１つ
の例は、好アルカリ性バチルス株、GM8901からのエキソアミラーゼである[28]。
これは、澱粉からマルトテトラオース、マルトペンタオース及びマルトヘキサオ
ースを生成する非マルトース生成エキソアミラーゼである。

【００６２】 さらに、本発明への使用のために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼは
また、非還元鎖末端から、それぞれマルトヘプタオース又はマルトオクタオース
の残基を除去するために、澱粉質多糖類における1, 4−α−グルコシド結合を加
水分解する、エキソ−マルトヘプタヒドロラーゼ又はエキソ−マルトオクタヒド
ロラーゼを包含する。エクソ−マルトヘプタヒドロラーゼ及びエキソ−マルトオ
クタヒドロラーゼは、野生型株をスクリーニングすることによって見出され得、
又はタンパク質工学により他の澱粉分解酵素から開発され得る。従って、非マル
トース生成エキソアミラーゼになるよう他の澱粉分解酵素からタンパク質工学に
より開発された非マルトース生成エキソアミラーゼもまた、本発明への使用のた
めに適切である。

【００６３】新規アミラーゼ 1つの観点においては、本発明はまた、本発明の澱粉生成物、たとえば製パン 生成物を調製するために適切である新規アミラーゼを提供する。本発明の新規ア
ミラーゼは、非マルトース生成エキソアミラーゼである。本発明の研究において
、本発明者は、食品、特に製パン生成物の調製に使用するためのドウの調製のた
めに適切であるこの新規アミラーゼを特性決定した。

【００６４】 従って、本発明はまた、非マルトース生成エキソアミラーゼを提供し、ここで
前記非マルトース生成エキソアミラーゼは、それがモチ状トウモロコシ澱粉イン
キュベーション試験において、２〜10個のD−グルコピラノシル単位及び任意に はグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る生成物を加水分解す
る能力を有し、その結果、前記加水分解生成物の少なくとも60重量％、好ましく
は少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％そして最も好ましく
は少なくとも85重量％が、３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオ リゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖 から成り、そして前記酵素がバチルス・クラウジから得ることができるものであ
り、又はその機能的同等物であり、そして前記酵素が約101,000Daの分子量を有 し（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動により推定される場合
）、そして/又は前記酵素がpH9.5及び55℃で活性の最適性を有することにより特
徴づけられる。

【００６５】 好ましくは、アミラーゼは、単離された形及び/又は実質的に純粋な形で存在 する。ここで、用語“単離された”とは、酵素がその天然の環境下に存在しない
ことを意味する。

【００６６】抗体 本発明の酵素はまた、たとえば標準技法の使用により、抗体を生成するために
も使用され得る。従って、本発明の個々の酵素に対する抗体が生成され得る。個
々の抗体は、発明の他の適切なアミラーゼ酵素をスクリーンするために使用され
得る。さらに、個々の抗体は本発明の酵素を単離するためにも使用され得る。

【００６７】 抗体の生成に関しては、種々の宿主、たとえばヤギ、ウサギ、ラット、マウス
、等が、免疫原性質を保持する、インヒビター又はそのいずれかの部分、変異体
、相同体、フラグメント又は誘導体、又はオリゴペプチドによる注射により免疫
化され得る。宿主種に依存して、種々のアジュバントが免疫学的応答を高めるた
めに使用され得る。そのようなアジュバントは次のものを包含するが、但しそれ
らだけには限定されない：フロイント、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウム
、及び界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリア
ニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーオール・リンペット（Keyhole limpet
）ヘモシアニン及びジニトロフェノール。BCG（バチルス・カルメト−グエリン ）及びコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）は、開発され
得る可能性ある有用なヒトアジュバントである。

【００６８】 酵素に対するモノクローナル抗体は、培養での連続細胞系による抗体分子の生
成を提供するいずれかの技法を用いて調製され得る。それらは次の技法を包含す
るが、但しそれらだけには限定されない：Koehler and Milstein (1975, Nature
256: 495-497) により最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトB−細胞ハイ
ブリドーマ技法（Kosbor など（1983）Immunol Today 4: 72; Cote など（1983 ） Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030）及びEBV−ハイブリドーマ技法（Co
le など（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc
. pp77-96）。

【００６９】 さらに、“キメラ抗体”の生成のために開発された技法、すなわち適切な抗原
特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためにヒト抗体遺伝子へのマウス抗
体遺伝子のスプライシングが使用さえ得る（Morrison など（1984）Proc. Natl.
Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger など（1984）Nature 312: 604-608; Ta
keda など. (1985) Nature 314: 452-454）。他方では、一本鎖抗体の生成につ いて記載される技法（アメリカ特許第4946779号）が、インヒビター特異的一本 鎖抗体を生成するために適合され得る。

【００７０】 抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ生成を誘発することによって、又
はOrlandiなど（1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837）及びWinter G
and Milstein C (1991; Nature 349: 293-299) に開示されるようにして、高い 特異的結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリー又はパネルをスクリーニン
グすることによって生成され得る。

【００７１】改良性組成物 示されるように、本発明の1つの観点は、澱粉生成物、特にドウ及び/又はドウ
から製造されるベーキングされた澱粉質パン生成物のための改良性組成物に関す
る。 改良性組成物は、本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼ及び少なくとも
1つの追加のドウ成分又はドウ添加剤を含んでなる。 本発明によれば、追加のドウ成分又はドウ添加剤は、上記に記載されるドウ成
分又はドウ添加剤のいずれかであり得る。

【００７２】 好都合には、その改良性組成物は、少なくとも１つの追加の成分又は添加剤と
共に混合される本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼを含んで成る乾燥微
紛組成物である。しかしながら、改良性組成物はまた、本発明の非マルトース生
成エキソアミラーゼ、及び水又は他の液体に溶解されているか又は分散されてい
る少なくとも１つの追加の成分又は添加剤を含んでなる溶液調製物であり得る。
改良性組成物中の酵素活性の量は、改良性組成物の一部を形成する追加の成分及
び添加剤の量及びタイプに依存するであろう。

【００７３】 任意には、改良性組成物は、特定のベーキングされた生成物を製造するための
乾燥成分及び添加剤のすべてを含む、完全混合物、いわゆるプレ−混合物の形で
存在することができる。

【００７４】澱粉生成物の調製 本発明の１つの観点によれば、その方法は、適切な非マルトース生成エキソア
ミラーゼ酵素、たとえば本明細書に示される新規の非マルトース生成エキソアミ
ラーゼ酵素の１つを、澱粉基材に添加することによって、澱粉生成物を形成する
ことを含んで成る。 澱粉基材がドウである場合、ドウは、穀物、水、本発明の非マルトース生成エ
キソアミラーゼ及び他の可能な成分及び添加剤を一緒に混合することによって調
製される。

【００７５】 追加の例によれば、澱粉生成物がベーキングされた澱粉質パン生成物（非常に
好ましい態様である）である場合、その技法は、ドウ形成条件下で、いずれか適
切な順序で、食料粉、水及び発酵剤を混合し、そしてさらに、適切な非マルトー
ス生成エキソアミラーゼ酵素を添加することを含んで成る。 膨化剤（leavening agent）は、化学膨化剤、たとえば炭酸水素ナトリウム、 又はサッカロミセス・セレビシアエのいずれかの株（パン酵素）であり得る。 非マルトース生成エキソアミラーゼは、いずれかのドウ成分、たとえば水又は
ドウ成分混合物と共に、又はいずれかの添加剤又は添加剤混合物と共に添加され
得る。

【００７６】 ドウは、ベーキング産業、又は食料粉ドウ基材の生成物を製造するいずれかの
他の産業において共通するいずれかの従来のドウ調製物により調製され得る。 澱粉質パン生成物、たとえば精白パン、篩分けされたライ麦粉及び小麦粉から
製造されたパン、ロールパン及び同様のものベーキングは、典型的には、180〜2
50℃の範囲のオーブン温度で、約15〜60分間、パン用ドウをベーキングすること
によって達成される。ベーキング工程の間、急な温度グラジェント（200→120℃
）が外部ドウ層において有力であり、ここでベーキングされた生成物の特徴的な
外皮が進行する。しかしながら、蒸気発生による熱消費のために、パンの中味の
温度がベーキング工程の最後で、100℃に接近する。

【００７７】 非マルトース生成エキソアミラーゼは、単独の活性成分として、又は１又は複
数の追加のドウ成分又はドウ添加剤と混合して酵素を含んで成る、液体調製物と
して、又は乾燥微紛組成物として添加され得る。 ベーキングされた生成物の性質をさらに改良し、そしてベーキングされた生成
物に特徴的な性質を付与するために、追加のドウ成分及び/又はドウ添加剤がド ウ中に導入され得る。典型的には、そのような追加の成分は、ドウ成分、たとえ
ば塩、穀粒、脂肪及び油、糖、ダイエット用繊維物質、粉乳、グルテン及びドウ
添加剤、たとえば乳化剤、他の酵素、親水コロイド、風味剤、酸化剤、鉱物及び
ビタミンを含むことができる。

【００７８】 乳化剤はドウ補強剤及びパン中味の軟化剤として有用である。ドウ補強剤とし
て、乳化剤は、残り時間に関する耐性及び加工の間、衝撃に対する耐性を提供す
ることができる。さらに、ドウ補強剤は、発酵時間における変化に対する所定の
ドウの耐性を改良するであろう。ほとんどのドウ補強剤はまた、ベーキングされ
た製品に耐性を与えるものからの体積の上昇を意味するオーブンスプリングを改
良する。最後に、ドウ補強剤は、レセピ−混合物に存在するいずれかの脂肪を乳
化するであろう。

【００７９】 モノグリセリドの特性を主に示すパン中味の軟化は、冷却に基づいて再結晶化
せず、そして従ってパン中味の堅さに寄与しないであろうアミラーゼとの不溶性
包含複合体の形成を導く澱粉のアミロース画分と乳化剤との間の相互作用に帰因
する。

【００８０】 追加のドウ添加剤として使用され得る適切な乳化剤は次のものを包含する：レ
シチン、ポリオキシエチレンステアレート、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリ
ド、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノ−
及びジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドのクエ
ン酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステ
ル、食用脂肪酸のスクロースエステル、ナトリウムステアロイル−２−ラクチレ
−ト、及びカルシウムステアロイル−２−ラクチレ−ト。

【００８１】 追加のドウ添加剤として有用である他の酵素は、例として、次のものを包含す
る：オキシドレダクターゼ、たとえばグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキ
シダーゼ、及びアスコルベートオキシダーゼ、たとえばリパーゼ及びエステラー
ゼ、並びにグリコシダーゼ様α−アミラーゼ、プルラナーゼ及びキシラナーゼ。
オキシドレダクターゼ、たとえばグルコースオキシダーゼ及びヘキソースオキシ
ダーゼは、ドウ補強剤及びベーキングされた生成物の体積の調節のために使用さ
れ、そしてキシラナーゼ及び他のヘミセルラーゼは、ドウ取り扱い性質、パン中
味軟化及びパン体積を改良するために添加され得る。リパーゼはドウ補強剤及び
パン中身軟化剤として有用であり、そしてα−アミラーゼ及び他の澱粉分解酵素
はパンの体積を調節し、そしてさらに、パン中味の堅さを低めるためにドウ中に
導入され得る。

【００８２】 添加される本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼの量は通常、kg穀物当
たり50〜100,000単位、好ましくはkg 穀物当たり100〜50,000単位の量で最終ド ウに存在する。本発明の有用な態様においては、その量はkg穀物当たり200〜20,
000単位の範囲である。 本明細書においては、１単位の非マルトース生成エキソアミラーゼは、この後
に記載されるように、50mMのMES, 2mMの塩化カルシウム溶液（pH6.0）中、10mg/
mlのモチ状トウモロコシ澱粉4mlを有する試験管において50℃でインキュベート される場合、１分当たり１μモルの還元糖に等しい加水分解生成物を開放する量
の酵素として定義される。

【００８３】アミラーゼにより調製される食品 本発明は、食品の製造への使用のための適切なアミラーゼを提供する。動物飼
料を包含する典型的な食品は、酪農製品、食肉製品、家禽製品、魚製品及び製パ
ン製品を包含する。 好ましくは、食品は製パン生成物、たとえば上記に記載される製パン生成物で
ある。本発明の範囲内に組み込まれる典型的な製パン（ベーキングされた）生成
物は、パン、たとえば一塊のパン、ロールパン、バン、ビザ生地、等、プレッツ
ェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー、等を包含する
。

【００８４】アミラーゼアッセイプロトコール 次のシステムが、本発明への使用のために適切である非マルトース生成エキソ
アミラーゼを特徴づけるために使用される。 初期のバックグラウンド情報によれば、モチ状トウモロコシアミロペクチン（
Roquette, France からWAXILYS 200 として得ることができる）は、非常に高い アミロペクチン含有率（90％以上）を有する澱粉である。 20mg/mlのモチ状トウモロコシ澱粉は、50mMのMES（２−（N−モルホリノ）エ タンスルホン酸）、２mMの塩化カルシウムの緩衝液（pH6.0）において３分間煮 沸され、そして続いて50℃でインキュベートされ、そして30分以内に使用される
。

【００８５】 １単位の非マルトース生成エキソアミラーゼは、上記に記載されるように、50
mMのMES, 2mMの塩化カルシウム溶液（pH6.0）中、10mg/mlのモチ状トウモロコシ
澱粉4mlを有する試験管において50℃でインキュベートされる場合、１分間当た り１μモルの還元糖に等しい加水分解生成物を開放する量の酵素として定義され
る。 還元糖は、標準としてマルトースを用い、及びBernfeld, Methods Enzymol.,
(1954), 1, 149-158のジニトロサリチル酸法又は還元糖を定量化するための当業
界において知られている他の方法を用いて測定される。

【００８６】 非マルトース生成エキソアミラーゼの加水分解生成物パターンは、上記のよう
にして調製された緩衝液中、10mg/ml のモチ状トウモロコシ澱粉4mlを有する試 験管において、0.7単位の非マルトース生成エキソアミラーゼを50℃で15又は300
分間、インキュベートすることによって決定される。反応は、試験管を煮沸水浴
に３分間浸すことによって停止された。

【００８７】 加水分解生成物は、パルスされた電流滴定検出、及び標準としてグルコース〜
マルトペプタオースの既知の線状マルトオリゴ糖と共に、溶離剤として酢酸ナト
リウム、水酸化ナトリウム及び水を用いて、Dionex PA100 カラムのアニオン交 換HPLCにより分析され、そして定量化される。マルトオクタオース〜マルトデカ
オースのために使用される応答因子は、マルトヘプタオースに関して見出された
応答因子である。

【００８８】エンドアミラーゼアッセイプロトコール 0.75mlの酵素溶液が、50mMのMES（２−（N−モルホリノ）エタンスルホン酸）
、2mMの塩化カルシウム溶液（pH6.0）中、0.5％（w/v）のAZCL−アミロース（Me
gazyme, Ireland から入手できるアズリン架橋されたアミロース）6.75mlと共に
50℃でインキュベートされる。5, 10, 15, 20及び25分後、それぞれ1.0mlの反応
混合物が、４％（w/v）のTRIS（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）か ら成る停止溶液4.0mlに移される。

【００８９】 停止されたサンプルは、Whatman No.1フィルターを通して濾過され、そして59
0nmでのその光学密度が蒸留水に対して測定される。アッセイされる酵素溶液が 希釈され、その結果、得られる光学密度は時間の線状関数である。光学密度対時
間についての直線の傾斜が使用され、g当たり100エンドアミラーゼ単位（EAU） を有するものとして定義される、標準GRINDAMYL（商標）A100 (Danisco Ingredi
ents から入手できる) に対するエンドアミラーゼが計算される。

【００９０】劣化（老化を包含する）の測定のためのアッセイ 本発明の非マルトース生成エキソアミラーゼの抗老化効果の評価のために、パ
ン中味の堅さが、Instrn 4301 Universal Food Taxture Analyzer 又は当業界に
おいて知られている類似する装置により、ベーキングの1, 3及び７日後、測定さ
れ得る。

【００９１】 当業界において従来使用され、そして本発明の非マルトース生成エキソアミラ
ーゼの澱粉劣化に対する効果を評価するために使用されるもう１つの方法は、DS
C（示差走査熱量）に基づかれる。それにより、酵素と共に又は酵素なしで（対 照）ベーキングされたモデルシステムドウからのパン中味における劣化されたア
ミロペクチンの溶融エントロピーが測定される。記載される例に適用されるDSC 装置は、20〜95℃、１分当たり10℃の温度グラジエントで作動するMettler-Tole
do DSC820 である。サンプルの調製のためには、10〜20mgのパン中味が計量され
、そしてMetler-Toledo アルミニウムパンに移され、次に密封される。

【００９２】 記載される例に使用されるモデルシステムドウは、本発明の非マルトース生成
エキソアミラーゼと共に又はそれを伴わないで、標準の小麦粉及び最適量の水を
含む。それらは、それぞれ６又は７分間、Brabender Farinographにより10又は5
0gで混合される。ドウのサンプルが、蓋付きのガラス試験管（15×0.8cm）に配 置される。それらの試験管は、33℃で30分間のインキュベーションから開始して
、続いて1.1℃/分のグラジエントで33℃から95℃まで、水浴においてのベーキン
グ工程にゆだねられ、そして最終的に95℃で５分間インキュベートされる。続い
て、試験管が、DSC分析の前、20℃でサーモスタットにおいて貯蔵される。

【００９３】要約 要約すれば、本発明は、アミロペクチンの非還元鎖末端から４〜８個の範囲の
D−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を 加水分解し、そして好ましくは、十分な程度の熱安定性を有する非マルトース生
成エキソアミラーゼが、ベーキングされた生成物における有害な劣化を遅延し、
又は低めるのに非常に効果的である驚くべき発見に基づかれている。

【００９４】寄託 次のサンプルが、1999年３月12日、公認された寄託機関DSMZ（Deutsche Samml
ung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH of Mascheroder Weg 1b, D-3
8124 Braunschweig）に、ブダペスト条約に従って寄託された：BT−21 DSM番号
DSM12731。 本発明はまた、それらの寄託物及びそれを含んで成る具体物から誘導でき、そ
して/又は発現できる配列、及びその活性フラグメントも包含する。

【００９５】 〔実施例〕 例−セクションA例１ ．シュードモナス・サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの発 酵及び生成 1.1生成 ： P.サッカロフィラ株IAM No. 1544を、IAM Culture Collection, Inst. Of Mlo
ecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo, Japan から得た。

【００９６】 前記菌株の発酵を、２Lの使用体積を有するApplikon ADIの３Lの生物反応器に
おいて、次の条件下で行った： 温度： 30℃ 撹拌速度： 1000rpm 通気 １体積空気/１体積培地/分 pH： 2Mの水酸化ナトリウム及び10％（w/v）の塩酸による調節によ る一定のpH7.4

【００９７】 培地： Bacto Trypton 20g/l Bacto Yeast 抽出物 20g/l 澱粉 20g/l Na₂HPO₄・2H₂O 5.6g/l KH₂PO₄ 1.5g/l。 １日の発酵の後、発酵ブイヨンを遠心分離し、そして濾過し、細胞を除いた。
細胞フリーブイヨンにおける非マルトース生成エキソアミラーゼの活性は、上記
のようにして決定される場合、５単位/mlであった。

【００９８】1.2 P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの精製： P.サッカロフィラの非マルトース生成エキソアミラーゼを、200mMの硫酸ナト リウム、50mMのトリエタノールアミン、2mMの塩化カルシウムを含むA−緩衝液（
pH7.2）を含む、150mlのPhenyl Sepharose FF低サブカラム（Pharmacia, Sweden
） を用いて、疎水性相互作用グロマトグラフィーにより、部分的に精製した。濾過 された発酵ブイヨン（500ml）を、200mMの硫酸ナトリウムによりpH7.2に調節し 、そしてカラム上に負荷した。非マルトース生成エキソアミラーゼを、A−緩衝 液中、直線的に低下する硫酸ナトリウムグラジエントにより遊離した。エキソア
ミラーゼ活性を含む画分をプールした。

【００９９】 プールされた画分を水により３倍に希釈し、そしてさらに、50mMのトリエタノ
ールアミン、5mMの塩化カルシウムから成るA−緩衝液（pH7.5）により平衡化さ れた150mlのQ−Sepharose FF (Pharmacia) カラム上でのアニオン−交換クロマ トグラフィーにより精製した。非マルトース生成エキソアミラーゼを、A−緩衝 液中、０〜１Mの塩化ナトリウム直線グラジエントにより溶離した。エキソアミ ラーゼ活性を含む画分をプールした。この部分的に精製された調製物を、下記試
験のために使用した。それは、アミラーゼ活性について染色されたポリアクリル
アミドゲル電気泳動システムにおいて試験される場合、14.7単位/mlの活性及び わずか１つのアミラーゼ活性の結合を有した。

【０１００】1.3 P. サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの特徴化 ： 最初に、P.サッカロフィラのエキソ−アミラーゼ（PS4と呼ばれる）をコード する遺伝子のDNA配列が、Zhouなど（Zho JH, Baba T, Takano T, Kobayash S, A
rai Y (1989) FEBS Lett 1989 Sep 11; 255 (1): 37-41 "Nucleotide sequence
of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas sacchrophila"）により 公開されている。さらに、前記DNA配列は、受託番号X16732としてGenBankから入
手できる。

【０１０１】 本発明者は、質量分光計（MALDI−TOFF）によれば、精製されたPS4酵素のMWが
57500±500D（配列からの理論的MWによれば、57741Dである）であることを決定 した。 PS4の最適温度及びpHは、Zhouなど（Zhon JH, Baba T, Takano T, Kobayashi
S, Arai Y (1992) Carbohydr Res 1992 Jan; 223: 255-61 "Properties of the
enzyme exzyme expressed by the Pseudomonas saccharophila maltotetrahydro
lase gene (mta) in Escherichia coli"）によれば、45℃及びpH6.5である。

【０１０２】 非マルトース生成エキソアミラーゼの加水分解パターンを、上記のようにして
、10mg/mlのモチ状トウモロコシ澱粉4mlを有する試験管において、0.7単位の部 分的な精製された非マルトース生成エキソアミラーゼを50℃で15又は300分間イ ンキュベートすることによって生成される加水分解生成物を分析することによっ
て決定した。

【０１０３】 15分及び300分後に検出される加水分解生成物のパターンは、表１に示されて おり、そしてP.サッカロフィラが本発明において定義されるような非マルトース
生成エキソアミラーゼを生成し、そしてこの酵素が、それぞれ、15分及び30分の
加水分解の後、85.8重量％及び93.0重量％を占める有力な生成物としてマルトテ
トラオースを開放することを示す。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】例２ ．P. サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼのベーキング試験 ベーキング試験を、P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの抗
固化効果を試験するために設定した。Danish Toast Bread のためのレセピーを 使用した。それは、食料粉（2000g）、乾燥酵母（30g）、糖（30g）、塩（30g）
及び水（400g Brabender Units (BU)のドウコンシステンシーに対応する約1200g
＋使用される乾燥酵母を補足するための追加の水60g）を含み、そしてそれらを 、遅い速度で２分間及び早い速度で12分間、Hobartミキサー（モデルA−200）に
おいて混合する。

【０１０６】 ドウ温度は、混合の最後で26℃である。ドウを30℃で10分間、放置し、この後
、ドウを750gのドウ部分に分割する。そのドウ部分を、33℃の温度及び85％の相
対湿度で試験キャビネットにおいて５分間、放置する。次に、ドウ部分を、次の
設定でGlimek成形機（タイプLR−67）上で成形し：１：４、２：２、３：１４及
び４：１２、この後、成形されたドウ部分を、ベーキング用缶に移し、そして33
℃の温度及び85％の相対湿度で50分間、試験キャビネットにおいて試験する。最
終的に、試験されたドウ部分を、Wachtel オーブン（モデルAE416/38COM）にお いて、220℃の温度で40分間、10秒間の蒸気を伴ってベーキングする。

【０１０７】 P.サッカロフィラ非マルトースエキソアミラーゼの部分的に精製された調製物
を、食料粉１kg当たり1470単位で、導入されるドウに添加した。ベーキングした
後、非マルトース生成エキソアミラーゼを有するか又は有さないパンを20℃に冷
却し、そしてその後、プラスチックバックにおいて20℃で貯蔵した。堅さを、ベ
ーキングの後３日目、1つのパンからの10枚のスライスの平均として及び7日目、
２個のパンからのそれぞれ10枚のスライスの平均として、それぞれ３日目、Inst
ron 4301 Universal Food Texture Analyzer により決定した。表２は、酵素を 有するパンにおいて低い堅さが、両日で観察されたことを示す。

【０１０８】

【表２】

【０１０９】 表３は、７日目、P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼの抗固
化効果が95％の信頼レベルで統計学的に有意であることを示す。

【表３】

【０１１０】 The StatAdvisor: ANOVA表は、次の２種の成分に７日目での堅さの変動を分ける：グループ間成 分及びグループ内成分。この場合、72.0に等しいF−比率は、グループ内推定値 に対するグルループ間推定値の比率である。F−試験のP−値は0.05以下であるの
で、95.0％の信頼レベルで、１つの酵素レベルからもう１つの酵素レベルでの平
均堅さ間に統計学的に有意な差異が存在する。平均が他の平均と有意に異なるか
どうかを決定するためには、Tabalar Options の列挙からMaltiple Range Test を選択すること。

【０１１１】例３ ． 次のことは、E.コリMC1061におけるシュードモナス・サッカロフィラからの非
マルトース生成エキソアミラーゼをコードするmta遺伝子の本発明のクローニン グ及び発現を記載する。 この観点においては、P.サッカロフィラIAM1520を、2mlのLB培地において増殖
し、そして細胞を、20,000xgで10分間の遠心分離により収穫した。全DNAを、わ ずかに変更されたminiprep プロトコールを用いて単離した。細胞を、300μlの 再懸濁緩衝液（50mMのトリス−HCl、pH8.0：10mMのEDTA；100μg/mlのRNアーゼA
）に再懸濁し、この後、細胞を、Fastprep FP120 (BIO101; California)を用い て粉砕した。

【０１１２】 粉砕に続いて、300μlの溶解緩衝液（200mMのNaOH；１％のSDS）及び300μlの
中和緩衝液（3.0Mの酢酸カリウム、pH5.5）を添加した。20.000xgで、4℃で15分
間の遠心分離の後、上清液を集め、そして0.6体積のイソプロパノールを添加し た。DNAを、4℃で、20,000xgでの30分間の遠心分離により沈殿せしめ、70％エタ
ノールにより洗浄し、そして100μlのTE（10mMのトリス−HCl, pH8.0, 1mMのEDT
A）に再溶解した。

【０１１３】 PCR増幅のために、次の４種の異なったPCRプライマーを企画した： ＃１ ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC 位置213−233 ＃２ GCT CCT GAT ACG ACA GCG 位置2403−2386 ＃３ GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC CCG 位置663−683 ＃４ TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T 位置2258−2238

【０１１４】 前記位置は、GenBank 受託番号X16732号に見出されるmtaについての配列に関 する。上方の番号のプライマーはまず、アンチセンスプライマーであり、そして
その配列は相補的配列である。鋳型DNAに対して相補的でないヌクレオチドは太 字で示され、そして導入された制限部位は下線で示される。プライマー#3は、ユ
ニークNco1部位を導入し、そしてプライマー#4はBamHI部位を導入し、この部位 は、発現ベクターpBAD/gIII (Invitrogen) における次のクローニングのために 使用される。

【０１１５】 第１のPCR増幅を、次のプライマーの組み合わせ：反応１：2190bpのフラグメ ントを付与する#1＋#2を用いて、製造業者の説明書及び次の増幅プロトコールに
従って、Expand DNA ポリメタ−ゼ（Boehringer Mannheim; Germany）、及び鋳 型としての50〜150ngのゲノムIAM 1520 DNAを用いて行った：35サイクルの間94 ℃で２分（94℃で1分、58℃で２分、72℃で２分）、及び最終的に、72℃で５分 。

【０１１６】 2190bpのフラグメントを、“gene Clean Kit (BIO 101; California)を用いて
、ゲルから単離した。そのフラグメントを、上記と同じ増幅プロトコールを用い
て、第２のPCRにおいて、次のプライマーの組み合わせを用いて、鋳型DNAとして
使用した： 反応２：1605bpのグラグメントを付与する#3＋#4．

【０１１７】 1605bpのフラグメントを精製し、そして製造業者の説明書に従って、PCR−BLU
NTベクター（Invitrogen）中にクローン化した。そのクローン化されたフラグメ
ントの配列を、普遍及び逆プライマー及び４種のラベルされた内部プライマーを
用いて、単一色素配列決定技法及びALF配列決定機（Pharmacia；Sweden）により
配列決定することによって確かめた：

【０１１８】 CAT CGT AGA GCA CCT CCA 999-982 GAT CAT CAA GGA CTG GTC C 1382-1400 CTT GAG AGC GAA GTC GAA C 1439-1421 GAC TTC ATC CGC CAG CTG AT 1689-1780 前記位置は、GenBan受託番号X16732号に見出されるmtaについての配列を示す 。上方の番号のプライマーはまず、アンチセンスプライマーであり、そしてその
配列は相補的配列である。

【０１１９】 配列を確かめた後、mta遺伝子を発現ベクターpBAD/gIII（Invitroge）中にク ローン化した。Mta 遺伝子は、BamHIによる消化、続いてクレノウフラグメント によるブラント化及びNcoIによる消化によりpCR−BLUNTから開放し、そして1620
bpのフラグメントを精製した。発現ベクターpBAD/gIIIをNcoI及びPmeIにより消 化し、そして精製した。連結の後、得られる発現構造体を用いて、E.コリMC1061
細胞を形質転換し、そしてタンパク質を、pBAD/gIIIマニュアル（Invitrogen） に従って発現した。

【０１２０】例４ ．澱粉劣化に対する非マルトース生成及びマルトース生成エキソアミラーゼ の効果の比較 サツマイモβ−アミラーゼ（EC 3. 2. 1. 2; 製品番号A7005号としてSigmaか ら得ることができる）は、澱粉の非還元末端からマルトースを開放するマルトー
ス生成エキソアミラーゼである。 このマルトース生成エキソアミラーゼの熱安定性は、50mMのクエン酸ナトリウ
ム、５mMの塩化カルシウム溶液（pH6.5）において45〜75℃の温度で15分間イン キュベートした後、残留活性により示されるように、P.サッカロフィラ非マルト
ース生成エキソアミラーゼの熱安定性に類似する（表４）。

【表４】 澱粉劣化に対する両酵素の効果を、“Assys for measurement of retrogradat
ion and staling”に記載されるように、モデルシステムドウからのベーキング され、そして貯蔵された生成物のDSC分析により試験した。この試験に関しては 、“アミラーゼアッセイプロトコール”に従ってアッセイされた、485単位のP. サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼ及び735単位のサツマイモβ −アミラーゼをドウに使用した。ドウを、50mMのクエン酸ナトリウム、５mMの塩
化カルシウム溶液（pH6.5）30.7ml又は添加される酸素、及び50gの標準デンマー
ク小麦粉（Danisco 98022）から調製した。

【０１２１】 ７日間の貯蔵の後、劣化されたアミロペクチンの量を、その溶融エントロピー
を測定することによって定量化した。統計学的分析によれば、両酵素は澱粉劣化
を有意に低め（表５）；すなわちP.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミ
ラーゼは、７日目、劣化されたアミロペクチンの量を86％（1.77 J/g）に低め、
ところがサツマイモβ−アミラーゼは、それを96％（1.96 J/g）に低めることが
見出された。結論的には、P.サッカロフィラ非マルトース生成エキソアミラーゼ
は、比較できる熱安定性のマルトース生成アミラーゼよりも、劣化及び老化を低
めるために、明らかにより効果的である。

【０１２２】

【表５】

【０１２３】 この表は、平均が他の平均と有意に異なるかどうかを決定するために、複数の
比較方法を利用する。アウトプットの低部半分は、個々の対の平均間の推定され
る差異を示す。星印は３個の対に続いて配置され、これは、それらの対が95.0％
の信頼レベルで統計学的に有意な差異を示すことを示唆する。平均間を区別する
ために現在使用される方法は、Fisher's最少有意差異（LSD）方法である。

【０１２４】例−セクションB 材料及び方法： 材料：コーンからのアミロペクチン及びアミロース、コーン澱粉、カルボキシ
メチルセルロース（CMC）、ウシ血清アルブミン（BSA）、デキストラン、プルラ
ン、マルトース、マルトトリオース、及びマルトテトラオース〜マルトデカオー
スの混合物を、Sigma Chemical Co., St. Louis, USAから得た。可溶性澱粉を、
Merck, Darmstadt, Germany から得た。酵素抽出物及びトリプトンは、Difco La
boratories, Detroit, USAから得られた。

【０１２５】 Neue Allgemeine Reisgesellschaft mbH, Hamburg, Germany からの完全な玄 米が使用された。医薬品種のα−、β−及びγ−シクロデキストリンは、Wacker
Chemie Danmark Aps, Glostrup, Denmark から得られた。マルトテトラオース は、前記のようにして調製された[32]。すべての化学物質は、特にことわらない
限り、分析用銘柄のものであった。 B.クラウジBT−21の単離：前記株は、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorg
anismen and Zellkulturen GmbH, Braunshweig, Germany）により同定された、A
ssens, Denmark により集められた土壌サンプルから単離される。

【０１２６】 酵素の生成：B.クラウジBT−21を、ジャガイモからの2.0％可溶性澱粉トウモ ロコシからのアミロペクチン、コーン澱粉又は完全な玄米、0.5％酵母抽出物、0
.5％トリプトン、0.1％KH₂PO₄, 0.1％Na₂HPO₄, 0.02％MgSO₄・7H₂O, 0.02％ CaC
l₂・2H₂O 及び0.1％(NH₄)₂ SO₄から成る最適化された液体培地において増殖させ
た。オートクレーブの後、無菌Na₂CO₃溶液を添加し、１％の最終濃度にした（約
pH10）。グリセロール中の胞子懸濁液（−80℃で貯蔵される）を用いて、100ml の実際の培地を接種し、そして200rpmでの振盪インキュベーターにおいて45℃で
18時間インキュベートした（New Brunswick Scientific, Edison, N.J., USA） 。

【０１２７】 この培養物2mlを用いて、200mlの培地を有する振盪フラスコを接種し、そして
振盪インキュベーターにおいて45℃でインキュベートした。アリコートを規則的
な間隔で採取し、そして600nmでのODを測定し、培地における菌類の増殖を決定 した。サンプル（4ml）を、9600rpmで4℃で10分間、遠心分離し、そしてpH及び アミラーゼ活性を決定した。すべての増殖実験は三重反復して行われた。平均値
（X＝(Σⁿ _i=1X_i)/m）及び標準偏差値（std.＝√(Σⁿ _i=1(X_i-X)/(n-1))を決定し た。

【０１２８】 生成物−特異的アミラーゼの精製：完全な玄米上でのB.クラウジBT−21の52時
間の増殖の後、細胞及び完全な米穀粒を、9600rpm及び4℃での15分間の遠心分離
により細胞外流体（1000ml）から除いた。生成物−特異的アミラーゼを、エポキ
シ−活性化されたセファロース6Bマトリックス（Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden）にβ−シクロデキストリンを共有結合することによって調製された親和
性ゲルを用いて精製した[33]。細胞外細胞−フリー上清液を、12gのゲルと共に 、4℃で１時間、振盪しながらインキュベートした。

【０１２９】 次に、上清液を、9600rpm及び4℃で10分間の遠心分離により除去した。結合さ
れなかったタンパク質を、50mMのリン酸緩衝液（pH8.0）75mlによりゲルを洗浄 し、続いて遠心分離することによって除去した。洗浄段階を７度反復した。結合
されたタンパク質を、10mMのα―シクロデキストリンを含む50mMの燐酸緩衝液（
pH8.0）45mlにより溶出し、続いて遠心分離した。溶出段階は４回反復された。 α−シクロデキストリンを、β−及びγ−シクロデキストリンはBradford (1976
)のタンパク質決定方法を妨害するので、酵素の溶出のために使用した[34]。

【０１３０】 次に、α−シクロデキストリンを、4℃で撹拌しながら、10mMのトリエタノー ルアミン（pH7.5）5Lに対する透析（６〜８kDaのSpectra/Por透析膜、The Spedt
rum Companies, Gardena, CA, USA）により除去した。緩衝液を２時間後に交換 し、続いてさらに12時間、透析した。透析バッグをCMCに配置し、サンプルを濃 縮した。10mlを、FPLC−システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いて、Hi
Trap Qカラム（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に適用した。

【０１３１】 タンパク質を、10mMのトリエタノールアミン（pH7.5）25mlにより1.0ml/分の 速度で、続いて、10mMのトリエタノールアミン（pH7.5）中、20mMのNaClのグラ ジエントにより溶出した。酵素を0.5MのNaClにより溶出した。タンパク質の含有
率を、BIO−RAD Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を
用いてBradford, (1976)の方法[34]により評価した。BSAを標準として利用した 。

【０１３２】 ゲル電気泳動：15μlのサンプルを、[35]により記載されるようにして、天然 のトリス−グリシンゲル（10％）により分析した。次に、ゲルを、pH6.5での50m
Mのリン酸緩衝液に配置し、そして30分間、振盪した。１％（w/v）の可溶性澱粉
溶液を、ゲルと共に45分間、振盪しながらインキュベートした。緩衝溶液により
洗浄した後、ゲルをヨウ素溶液（4mMのI₂, 160mM のKI）と共にインキュベート し、そして緩衝液により脱色した。脱色されバンドは、澱粉加水分解活性を示し
た。

【０１３３】 SDS−PAGE（10％）を、[36]に従って行い、続いて銀染色[37]した。SDS−PAGE
広範囲分子量標準（Bio-Rad Laboratories, hercules, CA, USA）を用いた。 酵素アッセイ：0.1Mの硼酸緩衝液（pH10.0）中、2mlの可溶性澱粉溶液（1.25 ％）を、0.5mlの酵素溶液と共に45℃で２時間インキュベートした。反応を、そ の混合物を10分間、煮沸することによって停止した。還元糖の形成を、CuSO₄/ビ
シンコネート アッセイ[38]により決定し、そして形成されるmMマルトース同等
物として計算した。１単位の活性は、pH10.0及び45℃で１分当たり１μモルのマ
ルトース同等物を生成する酵素の量に対応する。

【０１３４】 酵素特徴化：温度最適値の決定のために、精製された酵素を、0.1Mの硼酸緩衝
液（pH10.0）（0.5mMのCaCl₂を含むか又は含まない）中、１％の最終濃度の可溶
性澱粉において、30℃〜90℃の温度で15分間インキュベートした。温度安定性の
決定を、5mMのCaCl₂を含む50mMのグリシン−NaOH緩衝液（pH9.5）において、精 製された酵素を30分間、30, 40, 50, 60, 70, 80及び90℃でインキュベートする
ことによって行った。

【０１３５】 残留活性を、50mMのグリシン−NaOH緩衝液（pH9.5）中、１％の最終濃度の可 溶性澱粉において、加熱処理された酵素を、55℃で15分間インキュベートするこ
とによって決定した。PH最適値を、異なった緩衝液中、１％の最終濃度の可溶性
澱粉において、精製された酵素を55℃で15分間インキュベートすることによって
決定した。使用される緩衝液は、50mMのクエン酸塩（pH4.0〜6.0）、50mMのトリ
ス−マレエート（pH6.5〜8.5）及び50mMのグリシン−NaOH（pH9.0〜11.0）であ った。

【０１３６】 I₂−KI溶液（0.02％のI₂及び0.2％のKI）を、Fuwa、1954[39]に従って調製し た。澱粉−ヨウ素青色形成を、次の変法により二重反復して測定した。サンプル
500μlを、異なった時間間隔で、可溶性澱粉の酵素加水分解から回収した。次に
、250μlのHCl及び250μlのI₂−KI溶液を添加し、そして混合した。脱イオン水 （4.0ml）を添加し、そして混合を反復した。青色の形成を、600nmで分光光学的
に測定した。

【０１３７】 精製された酵素による異なった基質の加水分解を、ジャガイモからの可溶性澱
粉、トウモロコシからのアミロペクチン、デキストラン、プルラン（１％）、ア
ミロース（0.1％）、及び10mMのα−、β−及びγ−シクロデキストリンにより 試験した。基質を、5mMのCaCl₂を含む、50mMのグリシン−NaOH緩衝液（pH9.5） に溶解し、そして精製された酵素を添加した（505mU/ml）。種々の基質を55℃で
インキュベートし、そしてサンプルを下記のようにして分析した。

【０１３８】 精製された酵素によるマルト−オリゴ糖の加水分解を、2mMの最終濃度でマル トース、マルトトリオース及びマルトテトラオースにより、及びマルトテトラオ
ース〜マルトドテカオースの混合物（5mM）により試験した。マルト−オリゴ糖 を、5mMのCaCl₂を含む50mMの硼酸緩衝液（pH9.5）に溶解し、そして精製された 酵素を添加した（147mU/ml）。基質を55℃でインキュベートし、そしてサンプル
を異なった時間間隔で採取した。反応を10分間の煮沸により停止し、そしてサン
プルを下記のようにして分析した。

【０１３９】 加水分解生成物の分析：加水分解生成物を、パルスされた電流滴定検出を有す
る高性能アニオン交換クロマトグラフィー（HPAEC−PAD）を用いて検出した。Ca
rboPac PA-1カラム（Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA）を、100mMのNa
OH中、30分間にわたっての0〜60％の1.0Mの酢酸ナトリウムグラジエント及びDio
nex DX-300又はDX-500システム上での1.0ml/分の流速と共に使用した。澱粉加水
分生成物を、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース
、マルトペンタオース及びマルトヘキサオースとそれらの保持時間とを比較する
ことによって同定した。相同の線状マルト−オリゴ糖の保持時間は、重合の程度
と共に上昇するので、中間DPの線状マルト−オリゴ糖は容易に同定され得る[40,
41]。

【０１４０】 結果及び論議： B.グラウジBT−21の同定：その脂肪酸組成によれば、前記菌株は、バチルス属
に対する類似性を示した。16SrDNAの部分配列決定は、B.クラウジに対して99.4 ％の類似性を示した。アルカリ耐性株の生理学的性質がこの同定を確認した。 B.グラウジBT−21によるアミラーゼ活性の生成：ジャガイモからの可溶性澱粉
、コーン澱粉、トウモロコシ及び玄米からのアミロペクチンは、基材において異
なったレベルの細胞外アミラーゼ活性をもたらした。

【０１４１】 コーン澱粉は、ジャガイモ澱粉に比較してより脂質を含み、そしてリンを含ま
ないが、トウモロコシからのアミロペクチンは、α−D−（１→６）O−グリコシ
ド結合を含む高い枝分かれ鎖構造を有する。それらの３種のタイプの澱粉は、加
熱ゲル化の後、酵素のために入手でき、ところが完全な玄米は米穀粒に封入され
る低い入手可能性の澱粉を含む。異なった澱粉基質を含む液体培養物の細胞外流
体におけるアミラーゼ活性が図１に示される。最高の澱粉分解活性が基質として
完全な玄米により得られた。これは、低い入手可能性澱粉基質の存在がB.クラウ
ジBT−21による細胞外澱粉分解活性の高められた生成をもたらした。

【０１４２】 類似する結果が、酵素の精製の前、細胞外流体から除去することが困難である
小麦ふすまにより得られた。炭素源、たとえばガラクトース、グリコーゲン及び
イヌリンはこれまで、B.リケニホルミスによるアミラーゼ生成のために適切であ
るものとして報告されており[27]、そして可溶性澱粉がB.ステアロサーモフィラ
スによるアミラーゼの生成のために最良の基質として見出された[28]。しかしな
がら、それらの研究のどれも、低い入手可能性の澱粉基質を包含していない。 生成物−特異的アミラーゼの精製：酵素を、β−CD Sepharose 6Bによる親和 性クロマトグラフィー、続くアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した（
表６）。

【０１４３】

【表６】

【０１４４】 活性染色された天然のPAGEは、細胞外流体における３種の澱粉分解活性の存在
を示した。生成物−特異的酵素を、β−CD親和性クロマトグラフィー、続くアニ
オン−交換クロマトグラフィー処理の後、他の澱粉分解活性から完全に分離した
。精製された酵素調製物のSDS−PAGEは、生成物−特異的アミラーゼが相同性に 精製され、そして約101kDaの見掛け分子量を有することを示した。シクロデキス
トリン セファロース6B親和性グロマトグラフィーによる他のアミラーゼの除去
の後、最終精製段階としてα−アミラーゼの精製のためにこれまで使用して来た
[29]。8.7％の酵素回収率、及び生成物−特異的アミラーゼのために得られた18.
5の精製因子は、それらの著者により報告される値に類似した。

【０１４５】 生成物−特異的アミラーゼの特徴化：精製された酵素は、pH9.5での活性の最 適値を示し（図２）、そしてその活性のための最適温度は、5mMのCaCl₂の存在下
で、又は不在下で55℃であった（図３）。5mMのCaCl₂の存在下でpH9.5での酵素 の熱安定性が図４に示される。55℃以上の温度で、酵素は、30分のインキュベー
ション期間の間、その最大活性の75％を失った。マルトヘキサオース[23]、マル
トペンタオース[24]及びマルトテトラオース[25]を形成する５種の他の生成物−
特異的アミラーゼはまた、アルカリpH最適性を示す。

【０１４６】 それらの酵素の分子量は、59, 73及び80kDa[23], 180kDa[24]及び97kDa[26]で
あることが推定され、そしてB.グラウジBT−21からの生成物−特異的アミラーゼ
は101kDaの推定分子量を示した。生成物−特異的アミラーゼ及びα−アミラーゼ
は、50〜65kDaの範囲の低い分子量を示す[3, 16, 17, 19及び21]。約55℃の温度
適度は、上記生成物−特異的アミラーゼについて報告される最適度に類似した[2
3, 24及び26]。

【０１４７】 精製された生成物−特異的アミラーゼは、低いDPの主な初期生成物として、１
時間のインキュベートの後、可溶性澱粉を、主にマルトヘキサオース及びマルト
ペンタオース（合計の加水分解された生成物の52％及び19％）に加水分解した（
図５）。２時間のインキュベーションの後、マルトヘキサオースの量、及び４時
間後、マルトペンタオースの量は低下し、そしてマルトテトラオース、マルトト
リオース、マルトース及びグルコースの量は低下した。それらの生成物は延長さ
れた加水分解の後、蓄積し、このことは、それらがさらに加水分解されなかった
ことを示す。

【０１４８】 24時間の澱粉加水分解の後、マルト−オリゴ糖の量は３％であり、マルトヘキ
サオースの量は（３％）マルトヘキサオース、（４％）マルトペンタオース、（
41%）マルトテトラオース、（13％）マルトトリオース、（16％マルトース及び （４％）グルコースであった。30分の澱粉加水分解の後に得られる、パルスされ
た電気滴定検出を有する高性能アニオン−交換クロマトグラフィー（HPAEC−PAD
）形跡は（図６）、マルトヘキサオース（DP6）よりも大きな澱粉加水分解生成 物が不在であることを示す。マルトヘキサオース−形成生成物−特異的アミラー
ゼによる可溶性澱粉の加水分解の時間経過研究はまた、マルトヘキサオースが加
水分解の初期段階において、選択的に生成されたことも示す[23]。

【０１４９】 Kimなど（1995）[26]は、マルトテトラオース−形成生成物−特異的アミラー ゼによる澱粉の１時間の加水分解の後の初期加水分解生成物が主にマルトヘキサ
オース（54％）であり、続いてマルトテトラオース及びマルトースの量の徐々の
上昇が存在し、そしてマルトヘキサオースの量が低下したことも見出した。20時
間後、マルト−オリゴ糖の組成が、0.6％のマルトヘキサオース、1.3％のマルト
ペンタオース、53.2％のマルトテトラオース、8.3％のマルトトリオース、27.6 ％マルトース及び９％のグルコースに変化した。 澱粉加水分解の間、酵素の作用のモードをさらに試験するために、異なった基
質を、精製された酵素と共にインキュベートした（表７）。

【０１５０】

【表７】

【０１５１】 澱粉は、アミロース（20〜30％）及びアミロペクチン（80〜70％）から構成さ
れる。アミラーゼはα−D−（１→４）O−グルコシド結合された線状グルカンで
あり、そしてアミロペクチンは分子におけるα−D−（１→６）O−グリコシド結
合の存在のために枝分かれ鎖のグルカンである。生成物−特異的アミラーゼは容
易に、アミロペクチンを加水分解し、それは、可溶性澱粉（７％及び17.8％）及
びアミロース（6.3％及び20％）に比較して、マルトペンタオース（9.2％）及び
マルトヘキサオース（24.8％）の形成により示された。

【０１５２】 酵素は、プルラン、すなわちマルトトリオースを鎖から構成されるα−（１→
６）O−グリコシド結合グルカン、又はデキストラン、すなわち０〜３個の主鎖 単位に結合される技を有するα−（１→６）O−グリコシド結合グルカンを加水 分解しなかった。α−、β−又はγ−シクロデキストリン、すなわち6.7及び８ 個のグルコース単位から構成される環状マルト−オリゴ糖はまた、24時間のイン
キュベーションの後でさえ、加水分解されなかった。

【０１５３】 デキストランに基づいて得られた結果は、α−（１→６）O−グリコシド結合 が生成物−特異的アミラーゼにより分解されなかったことを示した。プルランに
対する活性の欠失は、生成物−特異的アミラーゼが３個のグルコース単位に続く
α−（１→６）O−グルコシド結合を回避することができず、又は３個のグルコ ース単位のいずれかを結合し得ないことを示した。α−、β−又はγ−シクロデ
キストリンに対する加水分解の欠失は、生成物−特異的アミラーゼがエキソタイ
プの分解機構により澱粉を加水分解したことを示した[30]。HPAEC−PAD形跡（図
６）はまた、DP6よりも長い澱粉加水分解生成物が不在であるので、エキソータ イプの分解機構を示した。

【０１５４】 可溶性澱粉に対する酵素分解作用をさらに試験するために、澱粉−ヨウ素青色
形成を、還元糖の生成に対してプロットした（図７）。曲線の傾斜は、澱粉分解
澱粉加水分解の有力な型の分解機構を示す[31]。エンド−作用性酵素は、エキソ
−作用性酵素に比較される小さな値を有する傾斜を生成するであろう。傾斜の小
さな値は、A.オリザエからのα−アミラーゼにより示される、ランダム澱粉分解
活性による澱粉−ヨウ素青色複合体の早い還元の結果である（傾斜は−61である
）。P.スツゼリからの細胞外酵素調製物は、大きな傾斜値により示される有力な
エキソ−作用分解機構のための証拠を示した（傾斜は−13である）。精製された
生成物−特異的アミラーゼは、エキソ−活性を示す、−６に傾斜値を示した。

【０１５５】 生成物−特異的アミラーゼによる、低いDPを有する基質の加水分解の作用のモ
ードを、そのような基質と共にインキュベートすることによって試験した。マル
トース、マルトトリオース及びマルトテトラオースは、精製されたB.クラウジBT
−21アミラーゼにより加水分解されなかった。これは、それらの生成物が蓄積し
、そして従って、加水分解の最終生成物として見なされる、可溶性澱粉に対して
得られる結果を確認する。

【０１５６】 DP4〜DP10のマルト−オリゴ糖の混合物に対する生成物−特異的アミラーゼ活 性を、時間経過実験により研究した。HPAEC−PADにより得られるピーク領域の変
化は、マルト−オリゴ糖の形成又は加水分解に対応する。マルトヘキサオース（
DP6）の形成、及びDP7, DP8, DP9及びDP10の量の同時低下が、酵素のマルトヘキ
サオース形成能力を確認した。しかしながら、定常状態条件が達成され、そして
澱粉加水分解により見出されるようなDP6のさらなる分解が加水分解の７日後で さえ、検出されなかった。DP６の濃度は、澱粉加水分解で得られる濃度よりも低
く、そしてこのことは、一定量のマルトヘキサオースが生成するマルトテトラオ
ース及びマルトースの形成のために必要とされた。

【０１５７】 B.クラウジBT−21生成物特異的アミラーゼによる澱粉加水分解は、２段階工程
に類似することが見出された。この工程は、主にマルトヘキサオース及び少量の
マルトペンタオースへの澱粉の初期加水分解を包含し、それらは、集中的な加水
分解の後、蓄積する主要マルトテトラオース及びマルトースにさらに加水分解さ
れた。マルトテトラオース及びマルトースへの第２加水分解段階は、濃度依存性
が進行する第２段階のための調節体と思われるので、大きな基質のマルトヘキサ
オースへの予備加水分解により制限されると思われた。

【０１５８】 ベーキング実験： ベーキング実験を、生成物−特異的アミラーゼにより行った。ドウを、10gの 標準デンマークの小麦粉（Danisco 98078）、及び40単位の酵素（セクションBの
材料及び方法に記載されるように、45℃及びpH10でアッセイされる）を有さない
（対照）又は有する、0.2MのNaOH−グリシン緩衝液（pH10）6.2mlにより調製し 、ベーキングし、そして“劣化及び老化の測定のためのアッセイ”に従って、貯
蔵の後、DSCにより分析した。表８に示されるように、酵素は、それが有意な抗 老化効果有することを示すベーキングの７日後に見出される劣化されるアミロペ
クチンの量を有意に低める。

【０１５９】

【表８】

【０１６０】 ベーキングの後、凍結されたベーキングされた生成物のパン中味サンプルを、
蒸留水により抽出し（1gのベーキングされた生成物/10gの水を、１時間撹拌し、
そして遠心分離した）、そして上記のようにしてHPAEC−PADにより分析し、ドウ
のベーキングの間、酵素により形成される澱粉加水分解生成物を検出した。対照
に対する、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及び
マルトヘプタオースの蓄積が、この酵素の活性の結果として見出された。

【０１６１】発明の要約 本発明は製パン製品を製造するための方法、及びそのような方法への使用のた
めに適切なアミラーゼを開示する。 本発明の好ましい態様は、次の番号付けされた文章により示される。 １．遅延された老化性質を有するベーキングされた澱粉質パン生成物を製造す
る方法が提供され、ここで前記方法は、ベーキング工程の間、アミロペクチンの
側鎖の非還元末端から、４〜８個のD−グルコピラノシル単位から主に成る線状 マルトオリゴ糖を分解することによって、澱粉を加水分解することができる有効
量の非マルトース生成エキソアミラーゼのドウ成分、ドウ添加物又はドウへの添
加を含んで成る。

【０１６２】 ２．前記食料粉が小麦粉又はライ麦粉、又は小麦粉及びライ麦粉の混合物であ
る前記１の方法。 ３．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、kg食料粉当たり50〜100,000 単位、好ましくはkg食料粉当たり100〜50,000単位の範囲で存在する量で添加さ れる前記１又は２の方法。 ４．前記非マルトース生成エキソアミラーゼがkg食料粉当たり200〜20,000単 位の範囲で存在する量で添加される前記３の方法。

【０１６３】 ５．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当た
り0.5以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有する前記
１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当た
り0.05以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有する前 記１〜４のいずれかに記載の方法。 ７．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラーゼ活性当た
り0.01以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有する前 記１〜４のいずれかに記載の方法。

【０１６４】 ８．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、0.7単位の量の前記非マルト ース生成エキソアミラーゼが、50mMの２−（N−モルホリノ）エタンスルホン酸 及び2mMの塩化カルシウムを含む緩衝溶液1ml当たり10mgの予備煮沸されたトウモ
ロコシ澱粉の水溶液4mlにおいて、50℃の温度で、pH6.0で15分間インキュベート
される場合、それが、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、よ
り好ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％の、グ
ルコース、マルトース、及び３〜10個のD−グルコピラノシル単位の線状マルト オリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ 糖から成る加水分解生成物を生成することを特徴として、ここで前記加水分解生
成物は、パルスされた電流滴定検出、及び標準としてグルコース〜マルトヘプタ
オースの既知の線状マルトオリゴ糖と共にDionex PA100カラムを用いてアニオン
交換HPLCにより分析される前記１〜４のいずれかに記載の方法。

【０１６５】 ９．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記８記載の条件下でインキ
ュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、それが少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ま
しくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトテト
ラオースを生成する前記８の方法。 １０．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記８記載の条件下でイン
キュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析さ
れる場合、それが少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好
ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトペ
ンタオースを生成する前記８の方法。

【０１６６】 １１．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記８記載の条件下でイン
キュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析さ
れる場合、それが少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好
ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトヘ
キサオースを生成する前記８の方法。 １２．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、前記８記載の条件下でイン
キュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析さ
れる場合、それが少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好
ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルヘプ
タオースを生成する前記８の方法。

【０１６７】 １３．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして前記加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析
される場合、それが少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より
好ましくは少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルト
オクタオースを生成する前記８の方法。 １４．少なくとも1つの乳化剤がドウ成分、ドウ添加剤又はドウに添加される 請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。

【０１６８】 １５．前記乳化剤が、レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、食用脂肪
酸のモノ−及びジグリセリド、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドの酢酸エス
テル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノ
−及びジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノ−及びジグリセリド
のジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のスクロースエステル、ナトリウムス
テアロイル−２−ラクチレ−ト及びカルシウムステアロイル−２−ラクチレ−ト
から成る群から選択される前記14の方法。

【０１６９】 １６．少なくとも１つの追加の酵素が、ドウ成分、ドウ添加剤又はドウに添加
される前記１〜４のいずれかに記載の方法。 １７．前記追加の酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、オキ
シドレダクターゼ及びプロテアーゼから成る群から選択される前記16の方法。 １８．ベーキング工程の間、アミロペクチンの側鎖の非還元末端から、４〜８
個のD−グルコピラノシル単位から主として成る線状マルトオリゴ糖を分解する ことによって、澱粉を加水分解できる非マルトース生成エキソアミラーゼ、少な
くとも1つの追加のドウ成分又はドウ添加剤から成るドウから製造されるドウ及 びベーキングされた澱粉質パン生成物のための改良生成物。

【０１７０】 １９．前記非マルトース生成エキソアミラーゼがエキソアミラーゼ活性１単位
当たり0.5以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有する
前記18の改良性組成物。 ２０．前記非マルトース生成エキソアミラーゼがエキソアミラーゼ活性１単位
当たり0.05以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有す る前記18の改良性組成物。 ２１．前記非マルトース生成エキソアミラーゼがエキソアミラーゼ活性１単位
当たり0.01以下のエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有す る前記18の改良性組成物。

【０１７１】 ２２．0.7単位の量の前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、50mMの２− （N−モルホリノ）エタンスルホン酸及び2mMの塩化カルシウムを含む緩衝溶液1m
l当たり10mgの予備煮沸されたモチ状トウモロコシ澱粉の水溶液4mlにおいて、50
℃の温度で、pH6.0で15分間インキュベートされる場合、それが、少なくとも60 重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％及
び最も好ましくは少なくとも90重量％の、グルコース、マルトース、及び３〜10
個のD−グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−
グルコピラノシル単位の線状マルトオリゴ糖から成る加水分解生成物を生成する
ことを特徴として、ここで前記加水分解生成物は、パルスされた電流滴定検出、
及び標準としてグルコース〜マルトヘプタオースの既知の線状マルトオリゴ糖と
共にDionex PA100カラムを用いてアニオン交換HPLCにより分析される前記18の改
良性組成物。

【０１７２】 ２３．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは
少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトテトラオー
スを生成する前記22の改良性組成物。 ２４．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは
少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトペンタオー
スを生成する前記22の改良性組成物。

【０１７３】 ２５．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは
少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトヘキサオー
スを生成する前記22の改良性組成物。 ２６．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは
少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトヘプタオー
スを生成する前記22の改良性組成物。

【０１７４】 ２７．前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、請求項８記載の条件下でイ
ンキュベートされ、そして加水分解生成物が請求項８記載のようにして分析され
る場合、少なくとも60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは
少なくとも80重量％及び最も好ましくは少なくとも90重量％のマルトオクタオー
スを生成する前記22の改良性組成物。 ２８．乳化剤及びヒドロコロイドから成る群から選択された少なくとも１つの
添加剤を含んで成る前記19〜27のいずれかに記載の改良性組成物。 ２９．少なくとも1つの乳化剤がドウ成分、ドウ添加剤又はドウに添加される 前記28の改良性組成物。

【０１７５】 ３０．前記ヒドロコロイドが、アルギネート、カラゲニン、ペクチン及び植物
ガムから成る群から選択される前記28の改良性組成物。 ３１．セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ及
びプロテアーゼから成る群から選択された少なくとも1つの追加の酵素を含んで 成る前記19〜30のいずれかに記載の改良性組成物。 ３２．請求項１〜17のいずれか１項記載の方法により得ることができるベーキ
ングされた澱粉質パン生成物。

【０１７６】 本明細書に言及されるすべての出版物は、引用により組み込まれる。本発明の
記載される方法及びシステムの種々の修飾及び変更は、当業者に明らかであり、
そして本発明の範囲内で行われるであろう。本発明は特定の好ましい態様で記載
されて来たが、本発明はそのような特定の態様に限定されるものではない。実際
、生化学又は関連する分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記
載される態様の種々の修飾は、本発明の範囲内で行われる。

【０１７７】参考文献 [1]. K.H. Park, Food Sci. Ind. 25 (1992) 73-82. [2]. M. Okada and T. Nakakuki, Oligosaccharides: production, propertie
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【図面の簡単な説明】

【図１】 図１．45℃で２％澱粉基質において培養されたB.クラウジBT−21の液体培養物
における細胞外澱粉分解活性（mU/ml）。◆は可溶性澱粉、●はアミロペクチン 、黒三角はコーン澱粉、黒四角は完全な玄米。バーは標準偏差を示す。

【図２】 図２．生成物−特異的アミラーゼの活性に対するpHの効果。55℃でのpHの効果
。

【図３】 図３．生成物−特異的アミラーゼの活性に対する温度の効果。5mMのCaCl₂を伴
って〔黒四角〕又はCaCl₂を伴わないで〔□〕、pH9.5での温度の効果。

【図４】 図４．5mMのCaCl₂を伴って、pH9.5での上昇する温度でのインキュベーション 後、生成物−特異的アミラーゼの残留活性として試験される熱安定性。

【図５】 図５．55℃及びpH9.5で、１％の可溶性澱粉及び5mMのCaCl₂と共に、生成物− 特異的アミラーゼ（505mU/ml）をインキュベートすることによって形成される生
成物（mM）。○グルコース、×マルトース、□マルトトリオース、黒三角マルト
テトラオース、●マルトペンタオース、黒四角マルトヘキサオース。

【図６】 図６．PH9.5及び55℃で１％可溶性澱粉と共に生成物−特異的アミラーゼ（505
mU/ml）をインキュベートすることによって得られるHPAEC−PAD形跡。A)酵素を 含まない可溶性澱粉、B)酵素と共に30分間インキュベーション。

【図７】 図７．既知の澱粉分解作用のアミラーゼに比較して、B.クラウジBT−21生成物
−特異的アミラーゼのエンド−及びエキソ−活性の決定。青色形成（最大の％）
が、mMマルトースの生成に対してプロットされる。曲線の傾斜は、エンド−又は
エキソ−活性の有力性を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月２７日（２０００．６．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ラスムッセン，プレベン デンマーク国，デーコー−4070 キールケ ヒリンエー，ベーゲゴールスバイ １ (72)発明者 デュエダール−オレセン，レネ デンマーク国，デーコー−9220 アールボ ルウ エスト，ダムストレーデ 77 (72)発明者 ツィンマーマン，ボルフガンク デンマーク国，デーコー−9200 アールボ ルウ エスト アレルプバイ ５ Ｆターム(参考） 4B032 DB01 DK51 DL08 4B050 CC03 DD02 FF09E FF11E LL02 4B064 AF04 AF12 CA21 CC03 CC24 CD19 DA10

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 澱粉生成物の製造方法であって、アミロペクチンの側鎖の非
   還元末端から４〜８個のD−グルコピラノシル単位から主として成る１又は複数 の線状マルトオリゴ糖を切り取ることによって澱粉を加水分解することができる
   非マルトース生成エキソアミラーゼを澱粉基材に添加することを含んで成る方法
   。
2. 【請求項２】 前記澱粉基材が食料粉を含んで成り、前記食料粉が小麦粉も
   しくはライ麦粉、又はそれらの混合物である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、50〜100,000単 位/kg食料粉、好ましくは100〜50,000単位/kg食料粉、より好ましくは200〜20,0
   00単位/kg食料粉の範囲の量で添加される請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが単位エキソアミラ
   ーゼ活性当たり0.5より少いエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活
   性を有し、好ましくは単位エキソアミラーゼ活性当たり0.05より少いエンドアミ
   ラーゼ単位（EAU）のエンドアミラーゼ活性を有し、より好ましくは単位エキソ アミラーゼ活性当たり0.01より少いエンドアミラーゼ単位（EAU）のエンドアミ ラーゼ活性を有する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、モチ状トウモロ
   コシ澱粉インキュベーション試験において、２〜10個のD−グルコピラノシル単 位及び任意にはグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水分
   解生成物を生成する能力を有し、その結果、少なくとも60重量％、好ましくは少
   なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％そして最も好ましくは少
   なくとも85重量％の前記加水分解生成物が、３〜10個のD−グルコピラノシル単 位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル単位の線 状マルトオリゴ糖から成ることをさらに特徴とする請求項１〜４のいずれか１項
   記載の方法。
6. 【請求項６】 少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましく
   は少なくとも80％そして最も好ましくは少なくとも85％の前記加水分解生成物が
   、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオール、マルトヘプ
   タオース又はマルトオクタオースである請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましく
   は少なくとも80％、及び最も好ましくは少なくとも80％の前記加水分解生成物が
   マルトテトラオースである請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記酵素がシュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomonas
   sacharophila）から得られるもの又はその機能的同等物である請求項７記載の方
   法。
9. 【請求項９】 前記加水分解生成物の少なくとも60％、好ましくは少なくと
   も70％、より好ましくは少なくとも80％そして最も好ましくは少なくとも85％が
   マルトへキサオースである請求項６記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記酵素が、バチルス・グラウジ（Bacillus clausii）か
    ら得られるもの又は機能的同等物である請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記酵素が、約101,000Da（ドデシル硫酸ナトリウムポリ アクリルアミド電気泳動により推定される場合）の分子量を有する請求項１０記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 前記酵素が、pH9.5及び55℃で最適活性を有する請求項１ ０又は１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記澱粉生成物がドウである請求項１〜１２のいずれか１
    項記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記澱粉生成物がベーキングされたドウである請求項１〜
    １３のいずれか１項記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記澱粉生成物がベーキングされた澱粉質のパン生成物の
    調製のためのものである請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記澱粉生成物がベーキングされる請求項１〜１５のいず
    れか１項記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６記載の方法により得られるベーキングされた生
    成物。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１７のいずれか１項記載の非マルトース生成エ
    キソアミラーゼ、及び少なくとも１つの追加のドウ成分又はドウ添加剤を含んで
    成る、ドウのための改良性組成物。
19. 【請求項１９】 約101,000Da（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ ド電気泳動により推定される場合）の分子量、及び/又はpH9.5及び55℃で最適活
    性を有する、バチルス・クラウジから得られる非マルトース生成エキソアミラー
    ゼ又はその機能的同等物。
20. 【請求項２０】 前記非マルトース生成エキソアミラーゼが、モチ状トウモ
    ロコシ澱粉インキュベーション試験において、２〜10個のD−グルコピラノシル 単位及び任意にはグルコースの１又は複数の線状マルト−オリゴ糖から成る加水
    分解生成物を生成する能力を有し、その結果、前記加水分解生成物の少なくとも
    60重量％、好ましくは少なくとも70重量％、より好ましくは少なくとも80重量％
    そして最も好ましくは少なくとも85重量％が、３〜10個のD−グルコピラノシル 単位の線状マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のD−グルコピラノシル単位の 線状マルトオリゴ糖から成ることをさらに特徴とする請求項１９記載の非マルト
    ース生成エキソアミラーゼ。
21. 【請求項２１】 澱粉生成物の劣化を遅延するために前記澱粉生成物への非
    マルトース生成エキソアミラーゼの使用。
22. 【請求項２２】 本明細書に及び請求項１に実質的に記載されるような方法
    、改良性組成物、酵素又は使用。